BAB II TINJAUAN PUSTAKA
A. Sediaan Apus Darah Tepi Tujuan pemeriksaan sediaan apus darah tepi antara lain menilai berbagai unsur sel darah tepi seperti eritrosit, leukosit, dan trombosit dan mencari adanya parasit seperti malaria, tripanosoma, microfilaria dan lain sebagainya. Sediaan apus yang dibuat dan dipulas dengan baik merupakan syarat mutlak untuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik. Dasar dari pewarnaan Romanowsky adalah penggunaan dua zat warna yang berbeda yaitu Azur B (Trimetiltionin) yang bersifat basa dan eosin y (tetrabromoflurescein) yang bersifat asam. Azur B akan mewarnai komponen sel yang bersifat asam seperti kromatin, DNA dan RNA. Sedangkan eosin y akan mewarnai komponen sel yang bersifat basa seperti granula eosinofil dan hemoglobin. Ikatan eosin y pada Azur B yang beragregasi dapat menimbulkan warna ungu, dan keadaan ini dikenal sebagai efek Romanowsky giemsa. Efek ini terjadi sangat nyata pada DNA tetapi tidak pada RNA sehingga menimbulkan kontras antara inti yang berwarna utnuk dengan sitoplasma yang berwarna biru. (Arjatmo Tjokronegoro, 1996). Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari kapiler atau vena, yang dihapuskan pada kaca obyek. Pada keadaan tertentu dapat pula digunakan darah EDTA. (Arjatmo Tjokronegoro, 1996).
Kriteria preparat yang baik: 1. Lebar dan panjangnya tidak memenuhi seluruh kaca benda sehingga masih ada tempat untuk pemberian label. 2. Secara granula penebalannya Nampak berangsur-angsur menipis dari kepala ke arah ekor. 3. Ujung atau ekornya tidak berbentuk bendera robek. 4. Tidak berlubang-lubang karena bekas lemak masih ada di atas kaca benda. 5. Tidak terputus-putus karena gerakan gesekan yang ragu-ragu. 6. Tidak terlalu tebal (karena sudut penggeseran yang sangat kecil) atau tidak terlalu tipis (karena sudut penggeserannya sangat besar). 7. Pewarnaan yang baik (Imam Budiwiyono 1995). Jenis Apusan darah: 1. Sediaan darah tipis Ciri-ciri sediaan apus darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal,morfologinya lebih jelas,dan perubahaan pada eritrosit dapat terlihat jelas 2. Sediaan darah tebal Ciri-ciri sediaan apus darah tebal yaitu lebih banyak membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tipis,jumlah selnya lebih banyak dalam satu lapang pandang,dan bentuknya tidak sama seperti dalam sediaan apus darah tipis.
B. Pewarnaan Sediaan Darah
Macam–macam pewarnaan menurut Romanowsky ada 4 yaitu Pewarnaan Wright’s stain,Pewarnaan Liesman,Pewarnaan May grunwald dan Pewarnaan giemsa. Prinsip pengecatan preparat darah : Sediaan apus darah difixaxi dengan methanol absolute selama 2-3 menit dan digenangi dengan zat warna giemsa yang sudah diencerkan dibiarkan selama 20-30 menit setelah itu dibilas dengan air ledeng dan dibiarkan sampai mengering (Arjatmo Tjokronegoro,1996) Kriteria kualitas pewarnaan yang baik 1. Makroskopis a) Sediaan darah kelihatan jernih dan transparan. b) Warna sel darah merupakan kombinasi warna –warna merah , ungu dan biru c) Bentuk ekor pada preparat tidak runcing d) Preparatnya tidak terputus –putus e) Preparatnya tidak berlubang -lubang 2. Mikroskopis a) Lapisan darah harus cukup tipis sehingga eritrosit-eritrosit dan leukositleukosit jelas terpisah satu dengan lainnya. b) Leukosit-leukosit tidak boleh menggerombol pada bagian terakhir dari hapusan c) Hapusan tidak boleh mengandung endapan cat d) Sel lekositnya tidak berlubang-lubang e) Sel lekositnya terwarnai semua
f) Sel lekositnya tidak pecah g) Sitoplasmanya terwarnai merah muda Faktor yang harus diperhatikan untuk mencapai pewarnaan yang baik 1) Kualitas dari stock giemsa yang digunakan standart mutu a) Stock giemsa yang belum tercemar air b) Zat warna pada giemsa masih aktif 2) Kualitas dari air pengencer giemsa a) Air pengencer harus jernih, tidak berbau b) Derajat keasaman pengencer hendaknya berada 6,8 – 7,2 perubahan ph pada larutan giemsa berpengaruh pada sel-sel darah 3) Kualitas pembuatan sediaan darah Ketebalan sel darah yang diwarnai mempengaruhi hasil pewarnaan, semakin berat Fixaxi akan semakin sukar bagi larutan giemsa menerobos plasma darah untuk mencapai sel darah merah untuk melakukan proses hemolisa. 4) Kebersihan sediaan darah Zat warna yang mengendap dipermukaan pada akhir pewarnaan tertinggal pada sel darah dan mengotorinya. Oleh karena itu pada akhir perwarnaan larutan giemsa harus dibilas dengan air yang mengalir. 5) Lakukan pewarnaan (Depkes RI, 1993)
Prosedur pewarnaan apusan darah 1.
Letakkan sediaan apus pada dua batang gelas di atas bak tempat pewarnaan
2. Fixaxi sediaan hapus dengan methanol absolute selama 2 – 3 menit
3. Genangi sediaan hapus dengan zat warna giemsa yang baru diencerkan. Larutan giemsa yang dipakai adalah 5% diencerkan dulu dengan larutan dapar yaitu larutan yang terdiri dari Na2HPO4 (Dinatrium Phospat ) KH2PO4 (Kalium Asam Phospat ), dan air suling. Biarkan selama 20 – 30 menit. 4. Bilas dengan air ledeng, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna. 5. Letakkan sediaan apus dalam rak dalam posisi tegak dan biarkan mengering. (Arjatmo Tjokronegoro, 1996).
C. Giemsa Giemsa adalah zat warna yang terdiri dari eosin dan metilen azur memberi warna merah muda pada sitoplasma dan metilen biru memberi warna biru pada inti lekosit. Ketiga jenis zat warna ini dilarutkan dengan metil alcohol dan gliserin. Larutan ini dikemas dalam botol coklat (100 – 500 – 1000 cc) dan dikenal sebagai giemsa stock yang ph 7. Giemsa stock harus diencerkan lebih dulu sebelum dipakai mewarnai sel darah. Elemen-elemen zat warna giemsa melarut selama 40 – 90 menit dengan air atau aquadest atau air buffer. Setelah itu semua elemen zat warna akan mengendap dan sebagian lagi balik ke permukaan membentuk lapisan tipis seperti minyak sebab itu stock giemsa tidak boleh tercemar air. (Depkes RI, 1993).
Pedoman pemakaian Giemsa
1. Giemsa stock baru boleh diencerkan dengan aquadest, air buffer atau air sesaat akan digunakan agar diperoleh efek pewarnaan yang optimal. 2. Encerkan giemsa sebanyak yang dibutuhkan, sebab bila berlebihan terpaksa harus dibuang. 3. Untuk mengambil stock giemsa dari botolnya, gunakan pipet khusus agar stock giemsa tidak dicemari. 4. Methanol dapat menarik air dari udara, sebab itu stock giemsa harus ditutup rapat dan tidak boleh sering dibuka. Pisahkan giemsa dibotol tetes atau botol kecil dari stock. 5. Pewarnaan giemsa adalah pewarnaan lambat, sehingga hasil baik bila menggunakan pewarnaan giemsa encer (5%). 6. Tolak ukur sebagai dasar perhitungan a. 1cc=20 tetes b. Seluruh permukaan kaca sediaan dapat ditutupi cairan sebanyak 1cc c. Berdasarkan tolak ukur ini dapat dihitung banyaknya giemsa encer yang harus dibuat sesuai denagn kebutuhan terutama bila melakukan pewarnaan 7. Takaran pewarnaan Untuk melakukan pewarnaan individu pada kegiatan stock giemsa 1 tetes tambah pengencer sepuluh tetes dengan lama pewarnaan 15 – 20 menit (giemsa 10%) atau stock giemsa 1 tetes ditambah pengencer 1 cc (20 tetes) dengan lama pewarnaan 45 – 60 menit (giemsa
8. Gunakan air pengencer yang mempunyai ph 6,8 – 7,2 dan yang paling ideal ph 7,2. (Depkes, 1993). Menguji mutu giemsa Apakah stock giemsa yang akan digunakan masih baik, perlu diadakan pengujian. Ada 2 cara menguji mutu giemsa: 1. Dilakukan pewarnaan 1 – 2 sel darah lalu diperiksa mikroskopis. Jika hasilnya sesuai dengan kriteria yang ada, berarti giemsa dan air pengencernya masih baik. Pengujian seperti ini perlu dilakukan setiap kali akan melakukan pewarnaan. 2. Dilakukan tes menggunakan kertas saring dan metil alkohol a. Meletakkan kertas saring di atas gelas supaya bagian tengah kertas saring tidak menyentuh sesuatu. b. Meneteskan 1 – 2 tetes stock giemsa pada kertas saring, menunggu sampai meresap dan melebar, kemudian meneteskan 3 – 5 tetes metil alkohol absolute dipertengahan bulatan giemsa satu persatu dengan jarak waktu beberapa detik, sampai garis tengah giemsa menjadi 5 – 7 cm maka akan berbentuk bulatan biru (metilen blue) di tengah, lingkaran cincin ungu (metilen azur) di luarnya serta lingkaran tipis warna merah (eosin) dipinggir sekali, jika warna ungu atau merah tidak terbentuk berarti giemsa sudah rusak dan tidak boleh dipakai lagi. (Depkes RI, 1993).
D. Kerangka Teori Lama pewarnaan
Apusan darah
Pewarna
Hasil pewarnaan sediaan apus darah
Keterangan: Hasil pewarnaan sediaan apus darah dipengaruhi oleh faktor lama pewarnaan, apusan darah, pewarna (jenis, kualitas, dll), sumber daya manusia (tingkat ketrampilan, pengecatan dll).
E. Kerangka Konsep Kualitas Giemsa
Hasil Pewarnaan
Keterangan: Kualitas giemsa mempengaruhi hasil pewarnaan pada sediaan apus darah. Kualitas giemsa dikatakan baik apabila giemsa dibuat baru dan dikatakan kurang baik
apabila giemsa yang dibuat sudah lama. Hasil pewarnaan dikatakan baik apabila lapisan darah cukup tipis sehingga eritrosit dan leukosit jelas terpisah satu dengan lainnya. Lekosit tidak boleh menggerombol pada bagian terakhir dari hapusan, hapusan tidak boleh mengandung endapan cat, bersih dari partikel zat warna giemsa,sel lekositnya tidak berlubang-lubang,sel lekositnya tidak pecah dan dikatakan kurang baik apabila lapisan darah tebal sehingga eritrosit dan lekosit tidak terpisah satu dengan lainnya, lekosit menggerombol pada bagian terakhir dari hapusan, hapusan mengandung endapan cat, terdapat partikel zat warna giemsa,sel lekositnya berlubang-lubang,sel lekositnya pecah.
