Az imatinib protonálódásának, ciklodextrinbe és liposzómába épülésének egyensúlyi és szerkezeti jellemzése Doktori (PhD) értekezés Béni Szabolcs Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Dr. Noszál Béla egyetemi tanár, D. Sc.
Hivatalos bírálók:
Dr. Bányai István egyetemi tanár, D. Sc. Dr. Blaskó Katalin egyetemi docens, C. Sc.
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Török Tamás egyetemi tanár, D. Sc.
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Tóth Gábor egyetemi tanár, D. Sc. Dr. Idei Miklós D. Sc.
Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészi Kémiai Intézet Budapest, 2007
Tartalom
1 Bevezetés........................................................................................................................... 1 1.1 Célkitűzések ............................................................................................................... 2 2 Irodalmi előzmények ....................................................................................................... 3 2.1 Protein-kinázok .......................................................................................................... 3 2.1.1 A krónikus mieloid leukémia pathomechanizmusa ........................................ 5 2.2 Az imatinib................................................................................................................. 7 2.2.1 A racionális hatóanyagtervezéstől a farmakodinámiáig ................................. 7 2.2.2 Farmakokinetika, metabolizmus ................................................................... 11 2.2.3 Az imatinib rezisztencia................................................................................ 13 2.3 Sav-bázis egyensúlyok............................................................................................. 16 2.3.1 A pH fogalma, pH-skálák és pH-mérés üvegelektróddal.............................. 16 2.3.2 Protonálódási egyensúlyok makroszkopikus szintű leírása és vizsgálata....................................................................................................... 20 2.3.2.1
Makroállandók meghatározására használt módszerek áttekintése....................................................................................... 22
2.3.2.2
Potenciometriás titrálás vizes közegben ........................................ 22
2.3.2.3
Potenciometriás titrálás vizes-szerves oldószerelegyben............... 24
2.3.2.4
NMR-pH titrálás ............................................................................ 25
2.3.3 Protonálódási egyensúlyok csoportspecifikus leírása és vizsgálata....................................................................................................... 28 2.3.3.1
Mikroállandók meghatározására használt módszerek áttekintése....................................................................................... 31
2.3.3.2
Modellvegyületek bázicitásadatainak átvitele ............................... 32
2.3.3.3
Mikroállandók meghatározása optikai spektroszkópiával........................................................................... 32
2.3.3.4
Egyes csoportok protonfelvételének szelektív követése NMR-pH titrálással ........................................................................ 33
2.4 A ciklodextrinek....................................................................................................... 34 2.4.1 A ciklodextrinek történetének rövid áttekintése ........................................... 35 2.4.2 A ciklodextrinek felhasználása és gyógyszerészeti jelentősége.................... 36 2.4.3 A ciklodextrin-komplexek egyensúlyi és szerkezeti jellemzésének módszerei............................................................................... 38 2.4.3.1
Ultraibolya-látható spektrofotometria............................................ 39
2.4.3.2
Potenciometria ............................................................................... 40
2.4.3.3
Tömegspektrometria ...................................................................... 40
2.4.3.4
NMR spektroszkópia...................................................................... 41
2.5 A liposzómák ........................................................................................................... 43 2.5.1 A liposzómák gyógyszerészeti jelentősége................................................... 44 2.5.2 A liposzómák jellemzésére használt módszerek ........................................... 45 2.5.2.1
A liposzóma-membrán fizikai jellemzése...................................... 46
3 A kísérleti munkában felhasznált anyagok és módszerek ......................................... 50 3.1 Protonálódási állandók meghatározása .................................................................... 50 3.1.1 Anyagok ........................................................................................................ 50 3.1.2 Potenciometriás titrálások ............................................................................. 51 3.1.3
1
H NMR-pH titrálás in situ pH méréssel....................................................... 52
3.2 Ciklodextrinekkel való kölcsönhatás vizsgálata ...................................................... 53 3.2.1 Anyagok ........................................................................................................ 53 3.2.2 Potenciometriás titrálások ............................................................................. 53 3.2.3 Fázis-oldhatósági vizsgálatok ....................................................................... 54 3.2.4 Tömegspektrometria ..................................................................................... 54 3.2.5 NMR spektroszkópia..................................................................................... 54 3.3 Liposzómákkal való kölcsönhatások vizsgálata ...................................................... 55 3.3.1 Anyagok, liposzómák előállítása .................................................................. 55 3.3.2 Bezárási hatásfok meghatározása.................................................................. 56 3.3.3 DSC vizsgálatok............................................................................................ 56 3.3.4 ESR spektroszkópia ...................................................................................... 57
3.3.5 Fagyasztva-törés, transzmissziós elektronmikroszkópia .............................. 57 4 Az eredmények és értékelésük...................................................................................... 59 4.1 Protonálódási állandók meghatározása .................................................................... 59 4.1.1 A komponens vegyületek makro- és mikroállandóinak meghatározása ............................................................................................... 59 4.1.1.1
Potenciometriás titrálások .............................................................. 60
4.1.1.2
1
H NMR-pH titrálások ................................................................... 61
4.1.2 Az imatinib makro- és mikroállandóinak meghatározása............................. 68 4.1.2.1
Potenciometria vizes közegben...................................................... 68
4.1.2.2
Potenciometriás titrálás metanol-víz elegyben .............................. 69
4.1.2.3
1
H NMR-pH titrálás ....................................................................... 70
4.2 Az imatinib ciklodextrinekkel való kölcsönhatásának vizsgálata............................ 75 4.2.1 Fázis-oldhatósági vizsgálatok ....................................................................... 75 4.2.2 Potenciometriás titrálások ............................................................................. 77 4.2.3 Tömegspektrometriás vizsgálatok................................................................. 79 4.2.4
1
H NMR spektroszkópiás vizsgálatok........................................................... 80
4.2.4.1
1
4.2.4.2
2D NMR mérések .......................................................................... 84
H NMR titrálások ......................................................................... 80
4.3 Az imatinib liposzómákkal való kölcsönhatásának vizsgálata ................................ 86 4.3.1 A bezárási hatásfok meghatározása .............................................................. 86 4.3.2 Membránrigiditás vizsgálatok ESR spektroszkópiával................................. 87 4.3.3 Fázisátalakulási paraméterek meghatározása differenciál szkenning kalorimetriával ............................................................................. 91 4.3.4 Dinamikus fényszórásmérés, transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálatok ................................................................ 92 4.3.5 A fúzió igazolása ESR spektroszkópiával..................................................... 94 5 Következtetések, új tudományos eredmények ............................................................ 96 6 Irodalomjegyzék ............................................................................................................ 98
6.1 Az értekezés alapját képező közlemények............................................................... 98 6.2 Az értekezés témaköréhez kapcsolódó saját közlemény.......................................... 98 6.3 Más témákhoz kapcsolódó saját közlemények ........................................................ 98 6.4 Diplomamunka......................................................................................................... 98 6.5 Hivatkozott irodalmak jegyzéke .............................................................................. 99 7 Összefoglalás ................................................................................................................ 113 8 Summary ...................................................................................................................... 114 9 Köszönetnyilvánítás..................................................................................................... 115
1 Bevezetés A tudomány legnagyobb feladatai közé tartozik a daganatos megbetegedések gyógyítása. Szemben a korábbi medicinában használatos enziminhibitorokkal, melyek terápiás indexe jellemzően alacsony volt és súlyos mellékhatásokkal rendelkeztek, a pathobiokémiai mechanizmusok ismeretéből kiinduló modern, racionális hatóanyagtervezés a kórosan működő fehérjéket célozza meg, a sokkal szelektívebb terápiás hatás érdekében. Ezen új paradigmájú gyógyszerfejlesztés első és máig legnagyobb sikere volt a 2001-ben törzskönyvezett imatinib (Gleevec), amely a krónikus mieloid leukémiát okozó rendellenes tirozin-kináz szelektív inhibitora. Noha az imatinib biomedicinális közlemények tucatjaiban szerepel, e jelenleg gyógyszerkönyvekben még nem hivatalos heteroaromás vegyület fizikai-kémiai paramétereire nem találhatók megbízható adatok. Az ionizálható gyógyszermolekulák szervezetbeni sorsa nagymértékben függ töltéseloszlásuktól, amelyet a biológiai kompartment pH-ja határoz meg és néhány egyéb jellemzője (relatív permittivitás, hőmérséklet, stb.) befolyásol. A terápiás hatás molekuláris szintű megértéséhez szükséges a vegyület fizikai-kémiai paramétereinek, például protonálódási állandóinak úgy makroszkopikus, mint csoportspecifikus szintű ismerete. A kedvező farmakodinámiás tulajdonságok mellett megfelelő farmakokinetikai sajátságok is nélkülözhetetlenek a terápiás hatás eléréséhez. A felszívódást követően a hatóanyagnak át kell jutnia lipoid membránokon és megoszlási egyensúlyokban is részt vesz a sejt különböző permittivitású kompartmentjeiben. A lipofil membránokon történő penetráció a neutrális részecskére a legkedvezőbb, ugyanakkor ennek oldhatósága a legalacsonyabb. Hidrofób molekulák szolubilizálására elterjedten alkalmazzák a ciklodextrineket az iparban és a kutatásban egyaránt. A daganatos megbetegedések kezelésében gyógyszerszállító rendszerként az immunoliposzómák a leghatékonyabb hordozók közé tartoznak. Segítségükkel a szűk terápiás ablakkal rendelkező hatóanyagok dózisai csökkenthetők, ezáltal a kedvezőtlen mellékhatásokat minimalizálni lehet.
1
1.1 Célkitűzések Munkánk során célul tűztük ki az imatinib és két komponens vegyülete sav-bázis egyensúlyainak részletes jellemzését. A csoportspecifikus bázicitások meghatározására a potenciometriás méréseket 1H NMR-pH titrálásokkal egészítettük ki, in situ pH méréssel. A 2-nél kisebb pH értékek pontos meghatározását diklórecetsav NMR indikátor alkalmazásával terveztük megvalósítani. Célul tűztük ki továbbá a töltésmentes imatinib oldhatóságának növelését ciklodextrinek segítségével. A különböző mértékben protonált hatóanyag β-ciklodextrinnel kialakított szupramolekuláris kölcsönhatásait független analitikai technikák alkalmazásával terveztük jellemezni. A semleges, mono-, di- és trikationos imatinib random metilezett és natív β-ciklodextrinnel kialakuló zárványkomplexeinek stabilitási állandóit fázis-oldhatósági vizsgálattal, potenciometriával és 1
H NMR titrálással határoztuk meg. Célunk volt továbbá a daganatellenes hatóanyag liposzómákkal való molekuláris
kölcsönhatásainak vizsgálata. Imatinibet tartalmazó kis unilamelláris, valamint multilamelláris vezikulák előállítását terveztük, ezeket a bezárási hatásfok és a fázisátalakulási hőmérsékletek meghatározásával jellemeztük. ESR spektroszkópiával vizsgáltuk továbbá a töltésmentes, illetve monokationos imatinib részecskék vezikulák membránjára kifejtett hatásait.
2
2 Irodalmi előzmények Az irodalmi összefoglalás első részében a dolgozat alapjául szolgáló molekula, az imatinib által befolyásolt (patho)biokémiai folyamatokat tekintjük át, külön részt szentelve a hatóanyag fő indikációs területének számító krónikus mieloid leukémiának. Rövid jellemzést adunk a vegyület szerkezetéről, eddig ismert kémiai és biológiai kölcsönhatásairól, majd három önálló fejezetben foglaljuk össze a makroszkopikus és csoportspecifikus (mikroszkopikus) protonálódási egyensúlyok vizsgálatát,
a
ciklodextrinek
és
vendégmolekulák
közti
komplexképződési
folyamatokat és azok jellemzését, illetve a liposzómák és gyógyszervegyületek közti molekuláris kölcsönhatások vizsgálati lehetőségeit.
2.1 Protein-kinázok Az
extracelluláris
jelekre
adott
sejtválasz
kialakulásának
molekuláris
mechanizmusában alapvető szerepet játszik a reverzibilis fehérjefoszforiláció, amelyet protein-kinázok végeznek és foszfoprotein-foszfatázok szüntetnek meg [1]. Ezen foszfotranszferáz aktivitással rendelkező enzimek működését döntően intracelluláris mediátorok befolyásolják. A mediátorok között van olyan, amelynek minden további hatásáért az általa aktivált protein-kináz a felelős és van olyan is, amelynek
molekuláris
hatásmechanizmusában
a
fehérjefoszforiláció
nem
kizárólagos, de mégis alapvető fontosságú. A plazmamembránban elhelyezkedő receptorokkal rendelkező kémiai jelek vagy a fent említett mediátor(ok) segítségével aktiválják az adott jelpályát, vagy mediátor közbeiktatása nélkül, a kémiai jelreceptor komplex közvetlenül fehérjefoszforilációval aktiválja azt. Az aktivált, egymástól teljesen különböző jelpályarendszerek között kölcsönhatás, „cross-talk” van, mely információcsere molekuláris alapját szintén a fehérjefoszforiláció teremti meg [2,3]. A tudományterület fontosságát jól mutatja, hogy Edmond H. Fischer és Edwin G. Krebs 1992-ben Nobel-díjat kapott a foszforiláció biológiai szabályozó szerepének felismeréséért. A fehérjék foszforilációja az ATP γ-helyzetű foszfátcsoportjának áthelyezésével megy végbe (2.1. ábra), mely a fehérjéken található OH-csoportok közül csupán 3
bizonyos, az aminosavsorrend alapján meghatározott oldalláncot vagy oldalláncokat érint. A protein-kinázokat aszerint szokták csoportosítani, hogy a fehérjék valamely szerin, illetve treonin oldalláncának OH-csoportján hoznak létre foszfátészter kötést (protein-szerin/treonin-kinázok), vagy valamelyik tirozin oldallánc OH-csoportját foszforilálják (protein-tirozin-kinázok) 2.1. ábra. O
kináz protein-OH + ATP
protein
O
P
O
-
+ ADP
OH 2.1. ábra. A protein-kinázok sematikus működése
Jelenleg kilenc foszforilált aminosavat ismerünk, ezek közül a prokariótákban és alacsonyrendű eukariótákban megtalálható, hisztidin-kináz által létrehozott, savas közegben bomlékony foszforamidát kötést tartalmazó N-foszfo-hisztidin rendelkezik még jelentős biológiai regulátor funkcióval [4]. A protein-kinázok szerkezetét funkciójuk, regulációjuk, szubsztrátjaik különbözősége ellenére bizonyos fokú hasonlóság jellemzi. Az enzimek katalízisért felelős részében
mindig
megtalálható
egy
jellegzetes,
rövid,
glicinben
gazdag
aminosavszekvencia, amelyet egy lizin követ a megfelelő pozícióban, ez az ATP kötődésének helye (ATP-binding-pocket) [5]. A katalízisért felelős aktív centrum körüli szerkezet is nagyfokú homológiát mutat. Azok a protein-kinázok, amelyek igen sok különböző fehérje foszforilációját képesek ellátni, ún. specifitásdeterminánsok alapján ismerik fel szubsztrátjaikat. A specifitásdeterminánsok a foszforilálandó oldallánc szomszédságában elhelyezkedő, igen gyakran bázikus, vagy savas oldalláncú aminosavak. A protein-kinázok katalitikus aktivitása a legtöbb ismert esetben szigorúan szabályozott. Döntő fontossága van a szigorú szabályozásnak, ha figyelembe vesszük azt, hogy a szerin/treonin-kinázok a metabolikus utak szabályozásától a növekedés és a differenciálódás szabályozásáig mindenhol megtalálhatóak, a tirozin-kinázok pedig a sejtek szaporodásának szabályozásában töltenek be kulcsfontosságú szerepet [6]. A kinázok szabályozása allosztérikus úton, illetve foszforiláció/defoszforilácó útján történik. Mutációjuk, nem megfelelő szabályozásuk, rendellenes működésük súlyos
4
következményekkel járhat. A jelátviteli folyamatok zavarára vezethető vissza a legtöbb daganatos megbetegedés, a krónikus gyulladásos folyamatok többsége, de szerepe van a cukorbetegség kialakulásában is. Nem véletlen tehát, hogy a kutatás alatt álló protein célpontoknak mintegy 30%-át a protein-kinázok képviselik [7].
2.1.1 A krónikus mieloid leukémia pathomechanizmusa A krónikus mieloid leukémia (CML) a mieloproliferatív betegségek csoportjának legismertebb tagja, a csontvelői eredetű granulociták rosszindulatú, daganatos megbetegedése. A CML volt a rákos megbetegedések közül az első, melynek genetikai hátterét pontosan feltérképezték [8]. A bizonyos típusú leukémiákkal összefüggésbe hozható ún. Philadelphia kromoszóma 1960-as felfedezése áttörésnek számított a tumorbiológia számára [9]. Ennek az abnormális kromoszómának a felfedezése óta eltelt 40 év intenzív kutatómunkája tette lehetővé, hogy mára a krónikus mieloid leukémia gyógyszeresen jól kezelhető betegséggé „szelídült”. 1973-ban Rowley közleményében arról számolt be, hogy a Philadephia kromoszóma reciprok transzlokáció eredménye, melynek citogenetikai rövidítése: t(9;22) (q34;q11) [10]. Reciprok transzlokáció esetén homológ, vagy teljesen különböző, nem homológ kromoszómán legalább 1-1 töréspont keletkezik, a letört kromoszóma darabok kicserélődnek, majd az új helyen forrnak vissza. Ennek eredményeként két megváltozott kromoszóma jön létre, ami az esetek túlnyomó többségében nem okoz fenotípusos változást, ami azzal magyarázható, hogy csak az érintett gének helyzete változik, maguk a gének nem. A töréspontok általában a nem kódoló szakaszokra esnek, ugyanis a kódoló régiók aránya az emberi genomban mindössze 5-10%. Azokban az estekben, amikor a töréspont a génen belül van, az áthelyeződés során maga a gén sérül, így transzlációt követően terméke is hibás, eltérő funkciójú, mennyiségű vagy aktivitású, esetleg funkcióképtelen lesz, ami kóros jellegek megjelenéséhez, gyakran tumorképződéshez vezet. Krónikus mieloid leukémia esetén a reciprok transzlokáció a 9-es és 22-es kromoszómákat érinti, amelyek a 2.2. ábrán láthatók [11,12].
5
22. kromoszóma c-Bcr
9. kromoszóma c-Abl
p210 Bcr-Abl p185 Bcr-Abl Exonok Töréspontok CML-ben
Intronok
2.2. ábra. A Philadelphia kromoszóma létrejöttéhez vezető (9;22) transzlokáció génszintű következményei. Feketével a 22-es kromoszóma kódoló szakaszai (exon), pirossal a 9-es kromoszóma exonjai láthatók. A töréspontokat kék nyíl jelöli. A reciprok transzlokáció hatására két különböző tömegű protein (p210 és p185) keletkezhet, melyek egyaránt tirozinkináz aktivitással rendelkeznek.
A 9-es kromoszóma töréspontja az Abl protoonkogént kódoló szakaszban található, ami az Abelson murine leukemia vírus onkogénjének (v-Abl) humán megfelelője. Az Abl gén egy nemreceptor tirozin-kinázt kódol [13], a humán Abl tirozin-kináz két izoformában előforduló, 145 kDa molekulatömegű, jól szabályozott, sejtmagban működő enzim [14]. Szerepe van a sejtciklus szabályozásában [15], a genotoxikus stresszre adott sejtválaszban [16] és az integrinek által a sejt környezetéről közvetített információk továbbításában [17]. A 22-es kromoszóma töréspontja breakpoint cluster region-ban (Bcr) található [12]. A 160 kDa-os Bcr protein expressziója az Abl-hez hasonlóan jelentős mértékű [13], szerin/treonin-kináz aktivitással rendelkezik és befolyásolja több transzkripciós faktor aktivitását [18]. A transzlokációt követően a megrövidült 22-es kromoszómán (Philadelphia kromoszóma) kialakul a Bcr-Abl fúziós gén, majd transzláció után Bcr-Abl fúziós fehérje (alternatív splicing-nak köszönhetően két különböző móltömeggel, 2.2. ábra) keletkezik, amelynek nemcsak a mérete nagyobb az eredeti enziménél, hanem a tirozin-kináz aktivitása is. Ráadásul az enzim lokalizációja is megváltozik [19], az eredetileg nukleáris enzim kint marad a citoplazmában, s ezáltal más fehérjék is hozzáférhetőek lesznek számára, alapvetően befolyásolva és megváltoztatva a sejt működését [20]. A Bcr-Abl konstitutív tirozin-kináz malignitásban betöltött szerepe
6
rendkívül összetett, a CML progenitor sejtek csontvelői adhézióját csökkenti „megmenekítve” ezen sejteket a csontvelői szabályozás alól [21], folyamatosan „hamis” mitogén jeleket küld [22] és csökkenti az apoptózist is [23]. A CML gyógyszeres kezelésére 2001-ig a citosztatikumok közül a ribonukleozidreduktáz gátló hidroxiureát, a mieloszuppressziót előidéző busulphan-t, a 2-dezoxicitidin antimetabolitját, a citozin-arabinozidot valamint az immunmoduláns és antiproliferatív hatású interferon-α-t alkalmazták [24]. További alternatíva a terápiában az allogén csontvelő-transzplantáció és az antiszenz-oligonukleotidok által történő transzláció-szintű géncsendesítés [25]. 2001. május 10-én az FDA a CML kezelésére törzskönyvezte a Bcr-Abl tirozin-kináz szelektív gátlószerét: az imatinibet, ami áttörést jelentett a korábbi kezelések eredményeivel összehasonlítva [26,27].
2.2 Az imatinib 2.2.1 A racionális hatóanyagtervezéstől a farmakodinámiáig Az imatinib a racionális hatóanyagtervezés eddigi legsikeresebb vegyülete. Szerkezetét a 2.3. ábra szemlélteti. Szisztematikus neve: 4-(4-metil-piperazin-1ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-benzamid, sója Gleevec® néven van forgalomban kapszula és tabletta formában.
N
N
N CH3 HN
N N
HN
CH3 O
2.3. ábra. Az imatinib szerkezete
7
mezilát
A
krónikus
mieloid
leukémia
viszonylag
jól
tisztázott
etiológiájának
köszönhetően az 1980-as évek közepén megindulhatott a Bcr-Abl tirozin-kináz specifikus gátlószerének kifejlesztése. Ekkor már ismert volt néhány, az Abl-kináz aktivitását gátló kismolekula (úgy mint: az aril-vinilamidok, a 2-oxindol [28], néhány oxidált benzoizotiazolin alapvázzal rendelkező molekula és katekol-származék [29], a tirfosztinok [30,31], a herbimicin A [32] és a benzopiranonok [33]), azonban ezek vagy nem rendelkeztek kellő szelektivitással, vagy nem voltak kellően hatékonyak. Az első, hatásos vegyületcsaládot a svájci Ciba-Geigy gyógyszergyár (ma Novartis) kutatói közölték, akik 10 nM-os IC50-es értéket találtak a vérlemezke-eredetű növekedési faktor receptor tirozin-kináz (PDGFR) autofoszforilációját gátló fenilamino-pirimidinek körében [34]. Ez azt jelentette, hogy a hatóanyag 10 nM-os koncentráció esetén a kináz-aktivitást az eredeti aktivitás 50%-ára csökkentette. A fenilamino-pirimidin struktúra ezek után vezérmolekulaként („lead”) szolgált minden további szelektív, az ATP kötőhelyen ható tirozin-kináz gátló vegyület kifejlesztéséhez [35]. A tirozin-kinázok ATP kötőhelyének nagyfokú szekvenciahomológiája azonban a hatékony és szelektív ATP-kompetitív hatóanyagok kifejlesztésének lehetősége ellen szól. Az a tény azonban, hogy az ATP-kötődése igen gyenge, így az ATP kötőhelyen néhány aminosav megváltozása az amúgy is gyengén kötődő ATP kötődését nem, de az inhibitor aktivitását jelentősen befolyásolja, mégis reményt adott szelektív tirozin-kináz gátlók kifejlesztésének, amit később a kísérleti tapasztalatok alá is támasztottak [35]. Az imatinib is a fenilamino-pirimidin vezérmolekula kémiai módosításai után nyerte el szerkezetét (2.4. ábra).
8
N
Sejteken mérhető aktivitás fokozása
N
HN
N
N
N
Kináz-aktivitás növelése
N
N
N
HN
HN
2-fenilamino-pirimidin
HN
O
N
PKC aktivitás csökkentése
N
N CH3
Vízoldhatóság és biohasznosíthatóság növelése
HN
N
N
N CH3 HN
N HN
N
HN
CH3 O
O
2.4. ábra. Vezérmolekula optimalizáció, a racionális hatóanyagtervezés kulcslépései az imatinib fejlesztése során
Első lépésként a pirimidin-gyűrűhöz egy piridint kapcsoltak, ami a sejteken mérhető kináz gátló aktivitását fokozta, majd egy benzamid molekularészlet fenilgyűrűre történő bevitelének hatására ugrásszerűen megnőtt a kináz gátló hatása. Ez további, kedvezőtlen hatásokat is eredményezett, ugyanis a vegyület protein-kináz C (PKC, szerin/treonin kináz) gátló hatása is emelkedett. Szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatokból kiderült, hogy egy metilcsoport bevitele az anilin-típusú fenilgyűrűre a mérhető szint alá csökkenti a PKC gátló hatást (2.4. ábra). Ekkor már egy igen potens, az Abl-kinázra nagy szelektivitású vegyületcsaládot állítottak elő. Ezek a vegyületek azonban nem rendelkeztek megfelelő orális biohasznosíthatósággal és igen rosszul oldódtak vízben. Mindezek kiküszöbölésére, a racionális hatóanyagtervezés utolsó lépéseként nagy polaritású, N-metil-piperazin oldallánccal látták el a vegyületet [36]. Természetesen tökéletesen szelektív inhibitor előállítása gyakorlatilag lehetetlen. Ahogy azt a 2.1. táblázat is mutatja, az imatinib is hatással van az Abl kinázon kívül további tirozin-kinázokra is, többek között gátolja a c-Kit onkoproteint is, melynek fokozott expressziója gasztrointesztinális tumorok kialakulásához vezethet [37,38].
9
2.1. táblázat. Reprezentatív IC50 értékek néhány, az imatinib által gátolt fontos tirozinkinázra. * immunokomplex vizsgálat eredményei Enzim (tirozin-kináz)
Szubsztrát-foszforiláció IC50 [µM]
sejtes tirozin-foszforiláció IC50 [µM]
Ref.
Abl (humán)
0,025*
nincs adat
[39]
v-Abl (virális)
0,038
0,1-0,3
[40]
p210Bcr-Abl
0,025*
0,25
[40]
p185Bcr-Abl
0,025*
0,25
[41]
PDGFR α és β
0,38
0,1
[42]
c-Kit
0,41
0,1
[37]
A rendkívül alacsony Abl IC50 értéknek (azaz a nagy szelektivitásnak) magyarázatául szolgál az a tény, hogy az imatinib az Abl inaktív konformációjához kötődik [43] és sztérikus okok miatt nem képes kötődni az enzim aktív konformációjához. A kinázok szerkezeti változatossága gyakorlatilag csak az inaktív konformációjukban jelentkezik, míg aktív konformációjukban nem találunk jelentős különbségeket, így az inaktív konformációban kötődő, nagy szelektivitású gátlószer lesz a legspecifikusabb hatóanyag az adott kinázra. A 2.5. ábrán az imatinib:Abl komplex röntgenkrisztallográfiával meghatározott szerkezete látható [44]. Az enzim inaktív/aktív konformációváltozását a világoskékkel jelölt „aktivációs hurok” térállása befolyásolja. Aktív konformációban az aktivációs hurok N-terminális végén található igen konzervatív
381
Asp-382Phe-383Gly
(DFG) motívum (az ábrán arany színű) 381-es aszpartát (381Asp) oldallánca magnézium-iont köt, ami az ATP foszfátcsoportjával alakít ki kedvező elektrosztatikus kölcsönhatást, ezáltal az aktivációs hurok olyan térszerkezetet vesz fel, amely elfedi az aktív centrumot.
10
A
B
2.5. ábra. (A) Az imatinib (van der Waals felülete kékkel jelölve) kötődése az Abl enzim kináz doménjéhez (zöld). Világoskékkel az inaktív és aktív konformáció közti szerkezeti változatosságot okozó „aktivációs hurok”, arannyal a DFG motívum látható. (B) Sematikus kölcsönhatások az imatinib és az Abl kináz között. A nitrogénatomokat kék, az oxigéneket piros, a ként sárga szín jelzi, míg az imatinib alapvázának szénatomjai zöld, az aminosavak szénatomjai narancssárga színűek. A hidrogénhidakat szaggatott vonal jelzi.
Az imatinib ezzel szemben az inaktív konformációban kötődik az Abl-hez. Az imatinib piridin- és pirimidin-gyűrűje „elfoglalja” az ATP adeninjének kötőhelyét, míg a molekula többi része mélyen beékelődik a szerkezet hidrofób régiójába, kimerevítve ezzel az inaktív konformációt [44]. Molekuláris szinten ez annak a következménye, hogy az imatinib kötődése a DFG motívumban olyan változást okoz, melynek következtében az ATP-t kötő és helyére a
382
381
Asp kifordul korábbi térhelyzetéből,
Phe kerül. Amint azt a 2.5. ábra B részén láthatjuk, az imatinib 21
aminosavval alakít ki kölcsönhatást, és 6 közvetlen hidrogénhidat képez különböző oldalláncokkal. Legjelentősebb ezek közül a 318-as metionin nitrogénjén lévő hidrogén és az imatinib piridin nitrogénje közti kölcsönhatás, ami megfeleltethető az ATP purin gyűrűjében lévő N1-es nitrogén és a 318Met közti hidrogénhídnak. Napjainkban olyan gátlószerek kifejlesztése ill. klinikai tesztelése van folyamatban, amelyek mind az aktív ill. inaktív konformációban nagy affinitással kötődnek, mégis megőrzik kellő szelektivitásukat [45,46].
2.2.2 Farmakokinetika, metabolizmus A Gleevec® néven forgalomban lévő imatinib, mezilát sójaként 50 és 100 mg-os kapszula, illetve 100 és 400 mg-os filmbevonatú tabletta formájában érhető el a 11
betegek számára. Napi dózisa CML-ben felnőtt esetén 400-600 mg a leukémia különböző stádiumaitól függően, GIST-ben napi egyszeri 400 mg az elfogadott adag. Bizonyos körülmények között és csak rövid ideig 800 mg-ig növelhető a napi maximális bevitel. Gyermekek esetén a napi dózis 260 mg/m2-től 340 mg/m2-ig terjed a betegség adott stádiumának függvényében, de maximális adagja nem haladhatja meg a felnőtt maximális dózis értékét. A tablettát/kapszulát étkezés közben, bő folyadékkal célszerű bevenni a gasztrointesztinális mellékhatások csökkentése érdekében. Három éves kor alatti gyermekek nem szedhetik, hasonlóan a szoptatós anyákhoz ill. terhesség esetén csak abszolút indokolt esetben engedélyezett. Leggyakoribb mellékhatásai a fejfájás, hányinger,
hányás,
hasmenés,
izomfájdalom,
bőrkiütés,
folyadékretenció,
neutropénia, trombocitopénia és anémia. Gyógyszerinterakció a CYP3A4 izoenzimet gátló ill. indukáló ketokonazol, dexametazon, rifampicin, szimvasztatin és a CYP3A4 ill. CYP2D6 szubsztrátjaként szereplő ciklosporin és paracetamol hatóanyagokkal jelentkezhet. Orális adagolás esetén az imatinib felszívódása gyors, 1-2 óra alatt eléri csúcskoncentrációját a plazmában [47]. A hatóanyag abszorpciója nemcsak gyors, de tökéletes is, a véráramban szerkezete változatlan [48]. Terminális eliminációs féléletideje 18 óra, plazma csúcskoncentrációjának értéke 400 mg-os adagolásnál elérve az egyensúlyi vérszintet 2,6 ± 0,8 µg/ml ami legfeljebb 1,2 ± 0,8 µg/ml-re csökken, még így is meghaladva a tirozin-kináz gátláshoz szükséges in vitro 1 µM-os koncentrációt. Mindezen kedvező farmakokinetikai paraméterek teszik lehetővé a készítmény napi egyszeri, szájon át történő adagolását. A felszívódást követően, klinikailag releváns koncentrációviszonyok között az imatinib 95%-a plazmafehérjékhez kötődik, főként albuminhoz és α1-savas glikoproteinhez [49,50]. Megoszlási térfogata 435 liter, ami jelentős szöveti megoszlásra utal [51], ez alól csak a központi idegrendszer jelent kivételt [52]. Metabolizmusa a májban történik döntően a CYP3A4 és a CYP3A5 izoenzimek segítségével [26]. Metabolikus átalakulásának lehetséges útvonalai a 2.6. ábrán láthatók. Fő metabolitja az ábrán kiemeléssel jelölt N-demetil-imatinib, amely in
12
vitro és in vivo egyaránt hatásos vegyület, aktív metabolit 40 órás eliminációs féléletidővel [47,53,54].
N-oxidáció
N
N
N
hidroxiláció
CH3
hidroxiláció ill.
deaminálódás+oxidáció karbonsavvá
HN
laktám-képződés
N- és/vagy O-glükuronidáció N
N-oxidáció
N
HN
CH3 O
N-demetiláció
2.6. ábra. Az imatinib in vivo metabolizmusának 2007 márciusáig azonosított útvonalai. A fő metabolit az ábrán pirossal jelölt N-demetiláció eredményeként képződő N-demetilimatinib.
Az imatinib metabolitjai formájában ürül ki a szervezetből, túlnyomó részt a széklettel (a beadott teljes radioaktivitás 70%-a detektálható a székletben), és csekély mértékben (megközelítőleg 13%-a) a vizelettel. A székletben azonos mennyiségben mutatható ki az imatinib, a fő metabolitja, és további egyharmad részben a különböző oxidált származékok [55,56]. Az eliminációban fontos szerepe van az enterohepatikus körforgásnak is, ugyanis a vizeletben és a plazmában egyaránt kimutatható glükuronidok a székletből nem mutathatók ki, amit a vékonybélben lejátszódó mikrobiális dekonjugációnak tudnak be egyes szerzők [57]. A hatóanyag kedvező farmakokinetikai tulajdonságainak köszönhetően 98%-os biohasznosíthatósággal rendelkezik és ez az érték egyaránt független az alkalmazott gyógyszerformától és a dózis nagyságától.
2.2.3 Az imatinib rezisztencia Az imatinib bevezetése a klinikumba [26] látványos hematológiai (> 95%) és citológiai (> 75%) remisszióhoz vezetett, ezért az első választandó szer lett a CML kezelésében, évekkel meghosszabbítva a leukémiás betegek életét [58,59]. 2002-ben
13
a valaha történt legrövidebb idő alatt törzskönyvezték a nem műthető és/vagy metasztázisos gasztrointesztinális sztrómális tumorok kezelésére is [60]. A várakozásokat messze felülmúló eredményeket azonban kezdte beárnyékolni a rezisztencia megjelenése [61,62]. A legtöbb esetben az Abl tirozin-kináz domén pontmutációja okozza a rezisztenciát, legelterjedtebb a T315I mutáció, ahol a 315. pozícióban treonin helyett izoleucin található [63]. Ez a mutáció az összes ATP kompetitív Abl gátlószer rezisztenciájához vezethet. Génamplifikáció, a jelátviteli útvonal alsóbb tagjainak aktiválódása és a multidrug transzporterrel történő kölcsönhatás is okozhat imatinib hatástalanságot [64]. Leggyakrabban a leukémiás sejtekben overexpresszálódó P-glikoproteinek pumpálják ki a hatóanyagot a sejtből, kedvezőtlenül befolyásolva ezáltal a kezelés sikerességét. A P-glikoproteinek ciklosporinnal történő gátlása eredményre vezetett, imatinib rezisztens betegekben a két hatóanyag együttes alkalmazása csökkentette a kóros fehérvérsejtek számát. Az egyik legígéretesebb, imatinib-rezisztens CML-ben vizsgált II. klinikai fázisban lévő molekula a 2.7. ábrán látható, dasatinib (BMS-354825) [65]. Az imatinibtől eltérően, mind az aktív és inaktív Bcr-Abl enzim konformációhoz képes kötődni, ezáltal az imatinibnél megközelítően 260-szor hatásosabb gátlószere a kóros kináznak. Annak köszönhetően, hogy az imatinibtől eltérő módon kötődik az ATP kötőhelyhez, a 15 ismert Bcr-Abl mutáns közül 14-et képes gátolni [66]. A mutációk megjelenésével a racionális hatóanyagtervezésnek is lépést kellett tartania a sikeres terápia megőrzésének reményében, így született meg a ma már szintén klinika II. fázisban lévő nilotinib (AMN-107, 2.7. ábra) [65,67,68]. A nilotinib
szerkezetét
az
imatinib
szerkezetének
további
racionalizálásával
fejlesztették ki. Az N-metil-piperazinil oldalláncot metil-imidazolil csoportra cserélték, melynek eredményeként tovább nőtt a vegyület specifitása és apoptózisindukáló képessége [69]. A legsikeresebb vegyület a 2006-ban törzskönyvezett sunitinib (2.7. ábra), amely imatinib rezisztens gasztrointesztinális tumorok kezelésében mára standard hatóanyagnak számít, emellett vese-eredetű daganatokban is rendkívül hatásos [70].
14
N O
S NH
H N
N N
N
N N
N
nilotinib (AMN-107)
HN
OH
Cl
N
dasatinib (BMS-354825)
CF 3
O
N H
N
N
O NH F O
N H
N
N H
sunitinib (SU-11248)
2.7. ábra. 2007-ben törzskönyvezett, ill. klinikai vizsgálati fázisban lévő tirozin-kináz gátló gyógyszer(jelölt) vegyületek szerkezete.
Az utóbbi 5 év kutatási eredményeinek köszönhetően több, mint 50 olyan vegyület van klinikai vizsgálat alatt, mely kellő szelektivitással rendelkezik a jeltovábbítási terápiában kulcsszerepet betöltő kináz-kaszkád meghatározott tagjával szemben. Napjainkra egyre elfogadottabb az a tény, hogy a sikeres daganatellenes terápia nem, vagy nem kizárólag a rendkívüli szelektivitást mutató kinázinhibitorokkal érhető el. Figyelembe kell vennünk, hogy egy adott jeltovábbítási folyamat eredményes kiiktatásával, új, alternatív kommunikációs csatornák nyílnak meg a daganatos sejtekben, és a „hamis” proliferációs jel kifejti hatását, a kóros folyamat kontrollálatlanná válik. A XXI. század racionális hatóanyagtervezésének legnagyobb kihívása tehát olyan, több célponton ható kinázgátlók kifejlesztése, melyek a kinázok strukturális, kémiai és elektrosztatikus hasonlóságait és különbségeit aknázzák ki [71,72,73].
15
2.3 Sav-bázis egyensúlyok Jelen fejezetben többértékű savak és bázisok ionizációjának formális egyensúlyi leírását tekintjük át. A globális, makroszkopikus leírás keretében csak a felvett protonok számával foglalkozunk, a kötődés helyével nem. A csoportspecifikus vagy mikroszkopikus szintű leírásban valamennyi kötőhely protonaffinitását külön egyensúlyi állandóval jellemezzük [74,75,76].
2.3.1 A pH fogalma, pH-skálák és pH-mérés üvegelektróddal Kémiai egyensúlyok és reakciómechanizmusok kvantitatív leírására protikus oldószerekben szükség van egy, az oldat savasságát pontosan jellemző mérőszámra. Sørensen 1909-ben bevezetett „hidrogénion-exponensét” követően többféle pH-skála használata terjedt el és a pH egységes definíciója több évtizedes diszkusszió eredményeként tisztult le [77,78,79]. 1985-ben a IUPAC a következő két mérési utasítást ajánlotta a pH definíciójaként [78]:
E − ES1 k
(2.1)
E − ES1 pH(S2) − pH(S1) = pH(S1) + ( E − ES1 ) k' ES2 − ES1
(2.2)
pH = pH(S1) + pH = pH(S1) +
ahol pH, pH(S1) és pH(S2) rendre a mintára és a kalibrációhoz használt S1 és S2 standard pufferoldatokra vonatkozik (a 2.2 esetben pHS1 < pH < pHS2); E, ES1 és ES2 a méréshez használt, H+-ra reverzibilis cella potenciálkülönbsége ezekben az oldatokban, k = RT ln10 / F és k′ pedig a galváncella elméleti (nernsti) és gyakorlati meredeksége (utóbbit lásd alább). Ezen pH-definíció értelmezési és metrológiai hiányosságait a legfrissebb, 2002-es IUPAC-ajánlás küszöböli ki, amely a pH-t 0,01 hibahatáron belül a hidrogénion-aktivitás negatív logaritmusával azonosítja [79]. A hidrogénion aktivitásán alapuló skála: paH. A termodinamikai egyensúlyi
állandókat a komponensek a relatív aktivitásával írjuk fel. A pH hidrogénionaktivitáson alapuló definíciója:
paH = − log aH = − log
16
mHγ H mo
(2.3)
ahol mH a protonok molalitása, γH az aktivitási tényezőjük, m o = 1 mol/kg pedig a standardállapotot (γH = 1) kijelölő koncentrációegység, melyet a továbbiakban nem írunk ki. Standardállapotnak ez esetben a hidrogénionok hipotetikus 1 mol/kg molalitású oldatát választjuk, amelyről feltételezzük, hogy a H+-ra mégis „végtelen híg” oldatként viselkedik. Egyedi kationok (vagy anionok) aktivitási tényezője kísérletileg nem határozható meg, csak biner elektrolitok γ± közepes aktivitási tényezője mérhető átvitel nélküli galváncellával. A paH skálát rögzítő elsődleges standard pufferoldathoz a standard hidrogénelektródból és Ag/AgCl referenciaelektródból álló Harned-cellával [77] rendelik hozzá a pH(S) értékét. Ennek elektromos potenciálkülönbségét csökkenő KCl koncentráció mellett mérik és a p(aHγCl) ún. savassági függvényt zérus kloridtartalomra extrapolálják. A paH kiszámításához a klorid végtelen híg oldatra érvényes aktivitási tényezőjét a termodinamikán kívüli bővített Debye-Hückel egyenlettel közelítik, log γ Cl0 = −
AI 1/ 2 1 + aB( I / m o )
(2.4)
ahol az A és B Debye-Hückel állandók és az I ionerősség ismert mennyiségek, aB pedig 1,5 a Bates-Guggenheim konvenció [77] szerint. Az új IUPAC-ajánlás a (2.4) közelítés hibabecslését 0,01-nak adja meg, ezzel a pH-t SI-mértékegységekre visszavezethető (traceable) mennyiséggé teszi [79]. Akár elsődleges pufferoldatot, akár annak pH-jára visszavezethető [80] másodlagos standardot választunk a kalibrációhoz, a (2.1) egypontos hitelesítés során feltételezzük, hogy a használt elektród válaszfüggvénye termodinamikai k meredekségű. Ez a közelítés az üvegelektród esetében elméletileg nem támasztható alá [79], ezért a IUPAC a pH 0,02−0,03 bizonytalanságú méréséhez a (2.2) szerinti kétpontos kalibrációt, a 0,01 bizonytalanság eléréséhez pedig ötpontos kalibrációt, valamint az E °' és k ' elektródparaméterek lineáris regresszióval történő meghatározását javasolja [80]. A
gyakorlati
hidrogénelektród
(műveleti)
kezelése,
pH-skála.
ezért
a
A
gyakorlatban
pH-méréshez
körülményes
legtöbbször
üvegelektródot használunk, melynek tipikus celladiagramja a következő:
17
a
kombinált
Ag | AgCl | KCl(tel.) ¦ minta | üveg | belső ref. pH=7 | KCl(tel.) | AgCl | Ag
(2.5)
Itt ¦ oldatok csatlakozását (liquid junction) jelöli, ahol Ej diffúziós potenciál léphet fel [79,80]. Az üvegelektród válaszjelének másik sajátsága, hogy meredeksége a β elektromotoros hatékonysággal (electromotive efficiency, β < 1) kisebb a nernsti értéknél (k′ = β⋅k), ami a szilanol-disszociációs mechanizmusból elméleti úton is levezethető [81]. Mindezeket egybevéve az üvegelektród potenciálkülönbségére a következő kifejezés írható fel: E = E ° + E j + k ' paH = E °'+ k ' paH
(2.6)
Az egyenletből kitűnik, hogy paH mérése csak akkor lehetséges, ha Ej értéke a kalibráló és mintaoldatban azonos, más szóval különbségük, a ∆Ej reziduális oldatcsatlakozási potenciál zérus. ∆Ej bizonytalansága az oka annak, hogy a (2.1) vagy (2.2) egyenlet szerint standard pufferoldattal kalibrált üvegelektród egy ismeretlen mintában mért válaszjeléről (meter reading) általános esetben csak annyit mondhatunk, hogy az oldat savasságát jellemző, konvencionális mérőszám [82]. Az így kapott műveleti (vagy gyakorlati) pH értékek sok gyakorlati alkalmazás szempontjából kielégítőek, ám paH-val csak akkor esnek pontosan egybe, ha a minta összetétele (ionerőssége) annyira hasonló a kalibráló pufferoldatéhoz, hogy a két esetben fellépő Ej (hibahatáron belül) megegyezik. A hidrogénion koncentrációján alapuló skála: p[H]. A gyakorlati szempontból
fontos minták (például a vérszérum) ionerőssége bizonyos esetekben közel áll a kalibráló pufferekéhez (0,1−0,2 M), de attól jelentősen el is térhet. A bonyolult mátrixokban lejátszódó sav-bázis egyensúlyokat olyan oldatokban tanulmányozhatjuk, melyek ionerősségét teljesen disszociáló biner elektrolittal, ún. inert sóval (KCl, NaNO3, NaClO4,...) állítjuk a kívánt értékre [83]. Az inert só a minta komponenseinél (ligandum, fémion) sokkal nagyobb koncentrációban van jelen és azokkal (elvileg) semmilyen kémiai vagy fizikai (például ionasszociációs) kölcsönhatásba nem léphet [84]. Inert só jelenlétében lejátszódó egyensúlyok jellemzésekor az aktivitásmodellek korlátai miatt nem célszerű a „végtelen híg” oldat határesetét választani standardállapotnak. Helyette az inert só adott hőmérsékletű és ionerősségű oldatában
18
feltételezzük, hogy az aktivitási együtthatók egységnyiek (constant ionic medium reference state) [83] és koncentrációkat tartalmazó ún. sztöchiometrikus vagy látszólagos (conditional) egyensúlyi állandókat írhatunk fel [85]. Mivel ezek a protonnak is a koncentrációját tartalmazzák, meghatározásukhoz az üvegelektródot a p[H] ≡ –log [H+] skálára kell kalibrálni a következőkben ismertetett módszerek egyikével [82,85,86]. Az üvegelektród (2.6) válaszfüggvényében szereplő aH aktivitást fejezzük ki a [H+] és az y± közepes aktivitási együttható segítségével: E = E ° + E j + k ' paH = E ° + E j − k ' log y± + k ' p[H] = E °'+ k ' p[H]
(2.7)
Ha az ionerősséget inert só hozzáadásával a mérések során (közel) állandó értéken tartjuk, az aktivitási tényezők változása is elhanyagolható lesz, valamint a reziduális diffúziós potenciál is stabilizálódik a „konstans ionkörnyezetű” oldatokban. Ha ( E j − k ' log y± ) jó közelítéssel állandó, az E ° standardpotenciállal összevonható a cella E °' formálpotenciáljává. Az üvegelektród p[H] skálára kalibrálásának legelterjedtebb módszere az üres (blank) titrálás. Ekkor ismert koncentrációjú és térfogatú erős savat titrálunk faktorozott erős bázissal, így a titrálás minden pontjában kiszámítható a [H+] [85]. A mért E és számított p[H] adatpárokból súlyozott lineáris regresszióval az E °' és k′ elektródparaméterek meghatározhatók [87]. Ha nem mV egységben regisztráljuk az elektródválaszt, hanem előzetesen pufferkalibrációt hajtunk végre, a mért műveleti pH értékeknek egy A korrekciós tag levonásával adhatunk fizikai tartalmat [82,85]: p[H] = pH − A
(2.8)
Erősen savas (p[H] < 1,8) vagy lúgos (p[H] > 12) tartományban az üvegelektród válasza nem követi a lineáris (2.7) Nernst-egyenletet. Ennek oka a kiemelkedő mozgékonyságú H+ és OH- ionok egyre jelentősebb hozzájárulása a diffúziós potenciálhoz, valamint lúgos közegben az esetleges alkálihiba [77]. A diffúziós potenciálnak a [H+]- és [OH−]-val magyarázható részét a legtöbb szerző [88,89] a Biedermann-Sillén formulával [83] közelíti: E = E °'+ k ' p[H] + jH [H + ] + jOH K w [H + ]−1
19
(2.9)
Nehézvízben és H2O/D2O elegyekben alkalmazott savassági skálák. A IUPAC
nehézvízre is definiál elsődleges standard puffereket, melyek segítségével az üvegelektród a pD skálára kalibrálható [90]. A deutérium izotópeffektusa miatt a D2O ionszorzata, pK wD = − log([D + ][OD − ]) = 14,951 nagyobb, mint a könnyűvízé ( pK wH = 13,995; mindkettő 25 °C-on és 0 ionerősségnél) [91]. A laboratóriumi gyakorlatban viszont körülményes D2O-alapú pufferekkel dolgozni, ezért gyakran kalibrálják az elektródot könnyűvizes pufferekkel, majd a nehézvizes oldatban leolvasott értéket korrekció nélkül használják. Az így kapott pH* skálát pHD-vel is jelölik annak hangsúlyozására, hogy a standardállapot itt H2Oban definiált [92]. Kevesebb szerző foglalkozott a pH-skálát érintő kérdésekkel a H2O és D2O elegyeiben, noha például a 9/1 arányú H2O/D2O a biokémiai NMR spektroszkópia leggyakoribb oldószere. Több közlemény is megerősíti, hogy az üvegelektród E0 és k′ kalibrációs paraméterei lineárisan változnak a D2O móltörtjével [91,93].
2.3.2 Protonálódási egyensúlyok makroszkopikus szintű leírása és vizsgálata Többértékű savak, bázisok és amfolitok ionizációja egységesen tárgyalható, ha az egyensúlyokat a (konjugált) bázis protonfelvételének irányából szemléljük. Jelölje Lz egy ligandum protonálatlan, z töltésszámú formáját, amely n számú H+-t tud felvenni. Az i. asszociációs lépésre (i = 0, 1, ..., n−1) a következő egyenlet és látszólagos egyensúlyi állandó vonatkozik: H i −1Lz +i −1 + H +
H i Lz +i
K ic =
[H i Lz + i ] [H i −1Lz +i −1 ][H + ]
(2.10)
A látszólagos protonálódási állandók csak az adott hőmérsékleten és ionerősségnél érvényesek [85,94] és mérésükhöz az elektródot a p[H]-skálára kell kalibrálni. Pufferkalibráció esetén a hidrogénionok aktivitását tartalmazó, ún. vegyes (Brønsted) állandókhoz jutunk [85]: K imix =
[H i Lz +i ] [H i −1Lz + i −1 ]aH +
20
(2.11)
A továbbiakban a log Ki jelölés mindig a (2.10) egyenlet szerinti sztöchiometrikus állandókat értjük, melyek számértékben megegyeznek a megfelelő savi disszociációs állandók negatív logaritmusával: log Ki = pKa,n−i+1, ahol n a maximálisan felvehető protonok számát jelenti. A protonálódási makroegyensúlyokat összevont (kummulatív) állandókkal is jellemezhetjük: i
βi = ∏ Ki
(2.12)
j =1
A különböző protonáltsági fokú részecskék koncentrációösszege a ligandum cLz bemérési (analitikai) koncentrációjával egyenlő, n
n
i =0
i =0
cLz = [Lz ] + [HLz +1 ] + [H 2 Lz + 2 ] + ... + [H n Lz + n ] = ∑ [H i Lz + i ] = ∑ β i [Lz ][H + ]i
(2.13)
A (2.13) mérlegegyenlet jobb oldalán [Lz] kiemelhető és mindkét oldalt ezzel elosztva a Schwarzenbach által bevezetett α H függvényhez jutunk,
αH ≡
n cLz + + 2 + n = 1 + β [ H ] + β [ H ] + ... + β [ H ] = β i [H + ]i 1 2 n ∑ z [L ] i =0
(2.14)
A statisztikus termodinamika szemszögéből α H a nagykanonikus sokaság állapotösszege (más néven „binding polynomial”), amiből az egyensúlyi rendszer számos fontos makroszkopikus tulajdonsága levezethető. A HiLz+i makrorészecskék parciális móltörtje (relatív koncentrációja) az egyensúlyi elegyben a következő képlettel számítható ki: xH i Lz +i =
[H i Lz + i ] β i [H + ]i = cLz αH
(2.15)
Makroegyensúlyok leírásához igen szemléletes és hasznos fogalom még az nH Bjerrum-függvény [95], amely tetszőleges pH-ra megadja az egy ligandum által felvett protonok átlagos számát: nH ≡ xHLz+1 + 2 ⋅ xH 2 Lz+2 + ... + n ⋅ xH n Lz+n =
1
αH
n
∑ iβi [H + ]i = i =1
21
[H + ] ∂α H ∂ ln α H = (2.16) + α H ∂[H ] ∂ ln[H + ]
2.3.2.1
Makroállandók meghatározására használt módszerek áttekintése
Makroszkopikus protonálódási állandók meghatározására mindazon módszerek alkalmasak, melyekben a mért fizikai-kémiai mennyiség pH-függő változása a molekula H+-felvételével egyértelmű kapcsolatba hozható. A számos metodika közül az alábbiakban csak azokat tekintjük át, amelyek a jelen dolgozatban felhasználásra kerültek, a többi technika leírása megfelelő monográfiákban megtalálható [75,94].
2.3.2.2
Potenciometriás titrálás vizes közegben
Jannik Bjerrum disszertációjának megjelenése óta a pH-metriás titrálás a protonálódási (és komplexstabilitási) állandók meghatározásának klasszikus, igen pontos módszere [88,95,96]. A vizsgálandó vegyület (legtöbbször ismert mennyiségű erős savat is tartalmazó) oldatához kevertetés mellett adagoljuk egy erős bázis faktorozott mérőoldatának ismert térfogatait. A hígulást figyelembe véve a titrálás minden pontjára kiszámítható a még nem semlegesített H+ (vagy OH−) ionok összkoncentrációja ( cH + − cOH − ), a szabad H+ (OH−) ionok koncentrációját pedig a p[H]-n keresztül mérjük. Ezek különbsége adja a ligandum által felvett protonok számát, amint az a H+ és L anyagmérleg-egyenleteinek kombinálásával kifejezhető: cH + − cOH − = [H + ] − [OH − ] + cLz ⋅ nH
(2.17)
Ebből az egyenletből a pH-metriás titrálás korlátai is kiolvashatók. Az összkoncentrációkat úgy kell megválasztani, hogy a (2.17) mérlegegyenlet jobb oldalán a ligandum H+-felvételének járuléka domináns legyen, ez a 1,7−12 p[H]tartományban általában teljesül. Erősen savas (vagy lúgos) közegbe eső log K mérésekor viszont az összes H+ (vagy OH−) ion túlnyomó része szabadon van jelen és az oldat pufferkapacitásában nem a ligandum, hanem az oldószer dominál [96]. Ezt a szokásos 0,5−10 mM-nál nagyobb ligandumkoncentrációval ellensúlyozni lehet ugyan, de ekkor az ionerősséget nehezebb állandó értéken tartani. A szélsőséges p[H]-tartományba eső állandók méréséhez célszerűbb NMR-pH vagy UV-pH spektroszkópiás módszert választani [97].
22
A pH-metria másik hátránya, hogy csak nagytisztaságú és nemillékony anyagok vizsgálatára alkalmas. A vizsgált p[H]-tartományban ionizálódó szennyezők, esetleges sztereoizomerek vagy bomlástermékek c ⋅ nH járuléka nem különíthető el a mérendő anyagétól a kiértékelés alapjául szolgáló (2.17) egyenletben, közös puffertartomány(oka)t adnak [96]. Különösen a légköri CO2-ból keletkező karbonát zavarása nehezíti meg a mérést 1 mM-nál kisebb ligandumkoncentráció esetén, ami ellen inert gáz (N2 vagy argon) oldatba vagy oldat fölé vezetésével védekezünk. A potenciometriás titrálások kiértékelése során úgy finomítjuk az ismeretlen protonálódási állandókat, hogy a számított és mért mV-értékek eltérésének súlyozott négyzetösszege minimális legyen. A mért titrálási görbe a (2.17) mérlegegyenlet átrendezésével közvetlenül a Bjerrum-függvénnyé transzformálható:
nH =
cH + − cOH − − [H + ] + K v [H + ]−1 cLz−
(2.18)
Az nH = f(p[H]) ábrázolásból azonnal kitűnik, ha például egy savas oldatból kikristályosított vegyülettel együtt nemsztöchiometrikus mennyiségű erős savat viszünk be vagy az ismeretlen kristályvíztartalom miatt cLz a névlegessel nem egyezik [98]. Ilyenkor a protonálódási állandók torzítatlan becsléséhez az összkoncentrációk újraszámítására is szükség van a titrálási görbe deriváltjából vagy Gran szerinti linearizálásából [99,100] számított ekvivalenciapont(ok) alapján. A (2.18) egyenlet alkalmazásakor a p[H] < 3 (vagy p[H] > 11) értékek kis véletlen hibája is a Bjerrum-görbe alakjának jelentős torzulásához vezethet. Az nH szélesebb p[H]-tartományban alkalmazható, robosztusabb számítása válik lehetségessé, ha ugyanannál a p[H]-nál vesszük a ligandum titrálásakor és az üres titrálásban elfogyott mérőoldat-térfogatok különbségét, nH =
(V − Vbl ) p[ H ]=const ⋅ (cOH − + [H + ] − [OH − ]) nLz
+ N H,Lz
(2.19)
ahol a ligandumot N H,Lz protonos formában vittük oldatba (például dinátriumhidrogénfoszfátra N H,Lz = 1, kálium-dihidrogénfoszfátra pedig N H,Lz = 2).
23
A kétféle kiértékelés a kb. 3−11 p[H]-tartományban ekvivalens, a zavaró karbonát távollétében (vagy kellően nagy cL esetén) ugyanahhoz az nH vs. p[H] adatsorhoz vezet.
2.3.2.3
Potenciometriás titrálás vizes-szerves oldószerelegyben
Egy vegyület log K-ja potenciometriás titrálással való meghatározásának egyik feltétele, hogy a vegyület oldhatósága az egész vizsgált p[H]-tartományban legalább 5⋅10−4 M legyen [96]. Rosszabb oldhatóság és megfelelő kromofór csoport esetén a meghatározás elvégezhető UV-pH titrálással, megfelelő kromofór csoport hiányában viszont szükséges az oldhatóságot növelni szerves oldószerkomponens (cosolvent) hozzáadásával. Ez leggyakrabban metanol [101], de használható dimetil-szulfoxid (DMSO), dimetil-formamid, dioxán és acetonitril is [102]. Vízből és a szerves oldószerből különböző összetételű elegyek készülnek és mindegyikben meghatározzák a látszólagos log sK értéket* pH-metriával, majd ezeket 100% víztartalomra extrapolálva jutnak a vízben közvetlenül nem mérhető értékhez [94]. A szerves oldószereket protikus/aprotikus jelleg, savas/bázikus karakter, H-kötés donor/akceptor sajátság és polaritás szerint osztályozhatjuk. Közepes és nagy permittivitású oldószer(elegy)ekben jó közelítéssel feltételezhető az erős elektrolitok teljes disszociációja és a vizes oldatokra az előző oldalakon bemutatott elektródkalibrációs és log K számítási módszerek alkalmazásához csak az autoprotolízis állandó értékét kell módosítani [101,102]. Potenciometriás titrálások metanol-víz elegyekben. A kombinált üvegelektród
a vizes közeghez hasonlóan üres titrálással kalibrálható a ps[H]-skálára [102], feltéve, hogy a Gran-analízis igazolja az erős sav és erős bázis teljes disszociációját az oldószerelegyben. Hasonló szerkezetű vegyületek hasonlóan szolvatálódnak, ezért protonálódási állandóik egy kiválasztott oldószerelegy tetszőleges összetételére a vizes közegű logwK bázicitás lineáris függvényeként fejezhetők ki [103]: logs K = as ⋅ log w K + bs
*
(2.20)
Az sK és ps[H] szimbólumok s indexe arra utal, hogy a standardállapotot nem vízben, hanem az adott oldószerelegyben definiáljuk.
24
Az elegyek dielektromos állandójának és szerves oldószer tartalmának változásával a protonálódási állandók is változnak és a szerves oldószer tartalom csökkenés irányában közelítik a vízben érvényes értéket. Yasuda [104] és Shedlovsky [105] extrapolációs formulája (amely a víz aktivitásának csökkenését is figyelembe veszi) a legtöbb vegyületre egyenest ad, log s K + log[H 2 O] = a ⋅
1
εr
+b
(2.21)
így a vizes közegre érvényes állandó lineáris extrapolációval kapható meg [96,101,102]. A b meredekség negatív töltésű csoportok protonálódásakor pozitív, semleges csoportok esetén negatív vagy zérushoz közeli érték. Ez még annak eldöntésében is segíthet, hogy egy adott makroállandóhoz több, átfedően protonálódó csoportból melyiknek legnagyobb a hozzájárulása.
2.3.2.4
NMR-pH titrálás
Az NMR-pH titrálások elve. Egy NMR aktív mag ppm-ben mért δ kémiai
eltolódását a következő egyenlettel definiáljuk [106]:
δ≡
ν − ν ref σ −σ ⋅ 106 [ppm] = ref ≅ σ ref − σ ν0 1 − σ ref
(2.22)
ahol ν a kiválasztott mag és νref egy referenciaanyag magjának rezonanciafrekvenciája [Hz], σ és σref ugyanezek árnyékolási tényezője, ν0 pedig a használt spektrométer alapfrekvenciája [MHz] a mért magra. A protonálódás hatására a funkciós csoport körül csökken az elektronsűrűség, ezért a közeli NMR magok diamágneses árnyékolása, így kémiai eltolódása is megváltozik. Mivel a legtöbb kismolekula vízben a diffúziós limit közeli sebességgel cserél protont, ezek a reakciók pillanatszerűen gyorsak a „kémiai eltolódás” időskálán (fast-exchange regime): k >> |νL − νHL|, ahol νL és νHL a vizsgált NMR mag frekvenciája az átalakuló L és HL részecskefajtákban. Ilyenkor csak egy közös rezonanciajel
25
figyelhető meg a részecskék egyedi δL és δHL kémiai eltolódásainak* móltörtekkel súlyozott átlagánál [107,108,109]:
δ mért = δ L xL + δ HL xHL =
δ L + δ HL K [H + ] 1 + K [H + ]
(2.23)
Egy n számú proton felvételére képes ligandum protonálódásakor egy kiválasztott mag kémiai eltolódását a pH-függvényében a következő kifejezés adja meg:
δ
n
mért
= δ L xL + δ HL xHL + ... + δ H n L xH n L = ∑ δ H i L xH i L = i =0
1
αH
n
∑δ
Hi L
β H L [H + ]i i
(2.24)
i =0
K számú NMR-aktív mag kémiai eltolódását M pH-értéknél megmérve egy M x K méretű adatmátrixot kapunk, melynek kiértékelése általában a következő célfüggvény minimalizálásával történik: M
K
U = ∑∑ wm ,k ⋅ (δ m =1 k =1
mért m ,k
−δ
M
K
) = ∑∑ wm ,k ⋅ (δ
számított 2 m,k
m =1 k =1
n
mért m ,k
− ∑ δ H i L,k ⋅ β i ⋅ [H + ]i ) 2
(2.25)
i =0
ahol a wm,k = σ−2(δm,k) súlyozással a homo- és a heteromagok különböző pontosságú mérhetősége vehető figyelembe. Eredményül a log β (vagy log K) makroállandókat és a HiL részecskék egyedi kémiai eltolódását ( δ Hi L,k ) kapjuk meg minden vizsgált magra. Abban az esetben, ha a protonálódási lépések átfednek (log Ki − log Ki+1 < 3), az egyensúlyi állandókat legpontosabban a (2.25) egyenlet szerinti többváltozós nemlineáris regresszió szolgáltatja. Az NMR-pH profilokat (titrálási görbéket) egyenként illesztve ugyanis minden magra kissé eltérő log K értékekhez juthatunk [110,111,112]. Megjegyzendő azonban, hogy a δ H i L ⋅ β i szorzatok egymáshoz rendeltsége következtében ez sem jelent garanciát az állandók és kémiai eltolódások meghatározhatóságára [T1,D1]. Kísérleti szempontok. A szupravezető mágnesek térerejének növekedésével a
kémiai eltolódások egyre pontosabban mérhető mennyiséggé válnak [113,114], így a számított log K pontosságát egyre inkább a pH-mérés precizitása (± 0,02)
*
A kémiai eltolódás (frekvencia) mellett más NMR-paraméterek, így a csatolási állandók, vonalszélességek vagy a relaxációs idők is átlagolódnak a gyors kémiai kicserélődés határesetében, de protonálódási egyensúlyok követésére elsősorban a kémiai eltolódás változását használják, a továbbiakban csak ezzel foglalkozunk.
26
determinálja. Az NMR titrálások kivitelezésének több formája ismert, melyeket az alábbiakban mutatunk be. A munka- és anyagigényes egyedi minták módszere során az oldatok pH-ját nagyobb térfogatú, jól kevert oldatban mérjük és egyenként töltjük NMR csövekbe. Ugyanilyen jó precizitással mérhető a pH a Hägele és munkatársai által kifejlesztett kapcsolt technikával, ahol egy automata potenciometriás titrátort tefloncső és perisztaltikus pumpa segítségével átfolyó cellás NMR próbafejjel kötöttek össze, a titráló oldat adagolását és a spektrum(ok) felvételét is automatizálva [115]. Az egycsöves technikánál a titráló oldatot µl részletekben adagolják egyetlen NMR csőbe és a pH-t mikroelektróddal mérik a csőben, adekvát kevertetés nélkül meglehetősen pontatlanul. Az egycsöves titrálás során előnyösebb a pH in situ meghatározása egy, az oldatban jelenlévő indikátormolekulával. Az indikátor mért kémiai eltolódásából a pH a (2.23) egyenlet Henderson-Hasselbach típusú átrendezésével számítható ki, pH = log K Ind + log
mért δ Ind − δ HInd mért δ Ind − δ Ind
(2.26)
ha a δInd és δHInd határeltolódások, valamint log KInd értéke külön kísérletből pontosan ismert. A (2.26) egyenletből kapott pH pontosságát (hibaterjedésen keresztül) a kémiai eltolódások standard deviációja határozza meg, és a pH a [log KInd − 1, log KInd + 1] intervallumban számítható ki elfogadható pontossággal [116]. NMR indikátor használata már régóta elterjedt biológiai minták in situ pH mérésére [117], azonban Szakács és munkatársai olyan, öt indikátorból álló sorozatot állítottak össze, amely a teljes 0 < pH < 12 tartományt lefedi [116]. Megállapították, hogy a 0 és 1,8 közötti p[H]-értékeket a diklórecetsav indikátorral torzításmentesen és kisebb véletlen hibával lehet meghatározni, mint üvegelektróddal [116]. Ehhez pontosan kell ismerni a diklóracetát protonálódási állandóját, aminek meghatározására egy speciális NMR titrálást is kidolgoztak [97]. Fontos szempont végezetül olyan referensanyag választása az NMR titráláshoz, amely a vizsgált pH-tartományban nem változtatja ionizációs állapotát [118]. Ezért előnyösebb 1H vagy
13
C NMR titráláshoz a pH 5-nél inflexiót mutató nátrium 3-
27
(trimetilszilil)propionát-d4 (TSP) helyett a megfelelő szulfonátsó (DSS) használata, amely csak −6 alatti „pH-n” protonálódik [119]. Az NMR titrálás előnyei. Az NMR spektroszkópiás pKa mérés előnyei közé
tartozik, hogy a mérendő anyag pontos koncentrációját nem szükséges ismerni és esetleges szennyezők sem zavarnak, ha a rezonanciajelek hovatartozása egyértelműen eldönthető, és a vizsgálandó anyag a szennyezővel nem lép asszociációs vagy egyéb reakcióba. Az NMR gyengébb érzékenységét technikai újításokkal (növekvő térerejű, aktív árnyékolású mágnesek, hűtött mérőfejek) folyamatosan javítják a gyártók.
2.3.3 Protonálódási egyensúlyok csoportspecifikus leírása és vizsgálata Míg az eddig tárgyalt, makroszkopikus szintű leírásban csak a részecskék sztöchiometriai összetétele definiált, a mikroszkopikus modell a felvett protonok funkciós csoportokhoz tartozását is vizsgálja. Többértékű savak makroállandóinak felbontását az egyes kötőhelyek járulékaira elsőként Wegscheider közölte 1895-ben [120], a legtöbb alapfogalom bevezetése azonban Niels Bjerrum nevéhez fűződik [121]. Tekintettel arra, hogy jelen dolgozatban csak kétcsoportos molekulák mikroegyensúlyai szerepelnek, az alapvető összefüggéseket is két, átfedően protonálódó csoportot tartalmazó molekulán mutatjuk be.
28
Makroszkopikus protonálódási egyensúlyok:
L
K1
+
HL A
Mikroszkopikus protonálódási egyensúlyok:
2+
H2L
H
kA A
K2
k BA
L
AB
H
B
H
kB
B
kA B H
2.8. ábra. Kétcsoportos molekula makro- és mikroszkopikus protonálódási sémája
Jelölje A és B egy hipotetikus kétértékű ligandum funkciós csoportjait. A 2.8. ábráról leolvasható, hogy a HL+ makrorészecske két protonáltsági izomer, (mikrorészecske) formájában fordul elő az oldatban, melyeket a protonálódás helye szerint A vagy B jellel különböztetünk meg. [HL+ ] = [A] + [B]
(2.27)
A mikroszkopikus protonálódási séma összesen 22 = 4 mikrorészecskét tartalmaz, a mikrospeciáció ezek pH-függő koncentrációeloszlásának kiszámítását jelenti. A k (lépcsőzetes) mikroállandók egy adott funkciós csoport bázicitását jellemzik a másik (kettőnél több csoport esetén mindegyik) csoport adott protonáltsági állapotában. Például k A és k BA , az A csoport protonaffinitását számszerűsíti az L és B mikrorészecskékben:
kA =
[A] , [L][H + ]
k BA =
[AB] [B][H + ]
(2.28)
Egy kétértékű ligandumnak összesen 4 mikroállandója van, amelyek redundáns rendszert alkotnak. Ha a szabadentalpia-skála nullszintjének a kiindulási L formát tekintjük, akkor az AB mikrorészecske képződési szabadentalpiája a Hess-tétel értelmében független attól, hogy AB az alternatív L→A→AB vagy L→B→AB protonálódási útvonalon képződött-e.
29
A makro- és mikroállandók összefüggései a (2.27) és (2.28) egyenletekből vezethetők le [121]:
β1 = K1 = k A + k B
(2.29)
β 2 = K1 K 2 = k A k AB = k B k BA
(2.30)
A protonáltsági izomerek koncentrációaránya pH-független, amelyet protonizomerizációs vagy tautomerizációs állandónak neveznek: [A] k A [L][H + ] k A = = [B] k B[L][H + ] k B
(2.31)
Ezt a hányadost például a hőmérséklet vagy az oldószer változtatásával módosíthatjuk. Kétértékű példamolekulánkban az A és B csoport EAB párkölcsönhatási tényezője azt számszerűsíti, hogy B protonálódása hogyan változtatja meg az A kötőhely bázicitását és viszont [121]:
EAB ≡
kBA k AB = kA kB
(2.32)
A csoportok bázicitás-módosító kölcsönhatása történhet a szénláncon keresztül (statikus induktív effektus), ekkor nagysága a csoportokat elválasztó kötések számával csökken és négy nem-konjugált kötés felett elhanyagolhatóvá válik [121,122]. Flexibilis molekulákban elképzelhető téren át ható (elektrosztatikus, illetve hidrogénhidas) kölcsönhatás is, amely nagyobb kovalens távolságú csoportokat is összeköthet. Kismolekulákban az egyik kötőhely protonálódása a másik bázicitását általában csökkenti* (antikooperativitás, E < 1), hiszen ilyenkor az egész molekulában csökken az elektronsűrűség. Az A csoport protonaffinitását mérő mikroállandók szokásos sorrendje ezért k A > kBA . Ha a két mikroállandó között meghatározásuk hibáján belül nem tehető különbség, az A bázicitásának leírására egyetlen paraméter, a kA csoportállandó elegendő [122,123,124]:
*
Funkciós csoportok egymás bázicitását növelő kölcsönhatása, tehát protonok kooperatív kötődése még enzimek esetén is ritka. Ligandumok kooperatív kötődésére közismert példa a hemoglobin oxigénfelvétele.
30
k A ≡ k A = k BA
(2.33)
A protonáltsági izomerek átalakulása általában gyors kinetikával játszódik le, ezért összetett analitikai (spektroszkópiai) jelet szolgáltatnak [122]. Egyedi koncentrációjuk ritka kivételektől eltekintve [123] közvetlenül nem mérhető, a kísérleti adatokból kedvező esetekben az egyes csoportok pH-függő protonáltsági foka, f kapható meg. Az fA és fB mennyiségeket protonáltsági móltört függvényeknek is nevezik, mivel definíciójuk az adott csoporton protonált mikrorészecskék móltörtjeinek összege: f A ≡ xA + xAB =
k A [H + ] + k A k AB [H + ]2 k A [H + ] + β 2 [H + ]2 (2.34) [A] + [AB] = = A B + A B + 2 cL 1 + (k + k )[H ] + ( k k A )[H ] 1 + β1[H + ] + β 2 [H + ]2
f B ≡ xB + xAB =
[B] + [AB] k B [H + ] + k B k BA [H + ]2 k B [H + ] + β 2 [H + ]2 (2.35) = = cL 1 + (k B + k A )[ H + ] + (k B k BA )[H + ]2 1 + β1[H + ] + β 2 [H + ]2
ahol cL a ligandum bemérési/teljes (analitikai) koncentrációjával egyenlő,
cL=[L]+[A]+[B]+[AB]. A két csoport protonáltsági fok függvényeinek összege minden egyes pH-n megadja a ligandum protonáltsági fokát, azaz a Bjerrum függvényt ( nH ), ami csak β makroállandók függvénye:
β1[H + ] + 2β 2 [H + ]2 fA + fB = nH = 1 + β1[H + ] + β 2 [H + ]2
(2.36)
Ha tehát az nH függvényt (vagy a makroállandókat) ugyanolyan kísérleti
körülmények között független technikával, például potenciometriás titrálással meghatározzuk,
elegendő
egy
csoport
protonfelvételét
szelektíven
követni
valamilyen spektroszkópiával ahhoz, hogy a kétcsoportos molekula minden mikroállandóját meghatározzuk [125].
2.3.3.1
Mikroállandók meghatározására használt módszerek áttekintése
Makroszkopikus (potenciometriás, konduktometriás, kalorimetriás) titrálási görbékből további feltételezések nélkül nem lehet egyértelműen mikroállandókat számolni, mert a független mikroegyensúlyi paraméterek száma mindig meghaladja a makroállandókét. A feltételezések vonatkozhatnak rokon szerkezetű vegyületek 31
bázicitására (deduktív módszerek) vagy lehetnek spektroszkópiai természetűek, melyek lehetővé teszik az f csoportspecifikus protonfelvételi görbék kiszámítását a pH-függő spektrumparaméterekből.
2.3.3.2
Modellvegyületek bázicitásadatainak átvitele
Wegscheidertől származik az az elgondolás, hogy a –COOH és –COOCH3 hatása a vegyület egy másik csoportjának bázicitására közel azonos és jelentősen eltér a karboxilátétól, ezért egy dikarbonsav mikroállandói félésztereinek egyszerűbben mérhető makroállandóival közelíthetők [120]. Ezt a deduktív módszer ma is elengedhetetlenül szükséges, ha a protonáltsági izomerek koncentrációaránya szélsőséges [74]. Ilyenkor a minor mikrorészecske hozzájárulása bármilyen analitikai jelhez olyan csekély, hogy koncentrációjáról az egyébként csoportszelektív spektroszkópiai módszerekkel is csak nagy hibával kapható információ [89]. A karboxilcsoport „imitálására” a metilészteren kívül használtak még etilésztert és karboxamidot is, a primer amin modellezésére pedig acetamido-csoportot. A deduktív módszerek másik csoportja azon alapul, hogy egy molekula két csoportjának kölcsönhatási tényezőjét egy másik molekula (modellvegyület) hasonló molekularészében mért értékkel azonosítjuk [126,127]. A kölcsönhatási tényezők ugyanis jobban átvihetők egy adott vegyületcsalád tagjai között, mint maguk a mikroállandók [126,127,128].
2.3.3.3 Az
Mikroállandók meghatározása optikai spektroszkópiával 1960-es
évektől
terjedt
el
molekulaspektroszkópiai
módszerek
és
potenciometria kombinált alkalmazása csoportszelektív titrálási görbék közvetlen meghatározására. Ha egy protonálható csoport egyben a molekula kromofór része is, a pH-függő UV-látható spektrumsorozatban gyakran találhatunk olyan k hullámhosszt, ahol a fényelnyelést a többi donoratom H+-felvétele nem befolyásolja. A kromofór csoport protonáltsági foka ekkor a következő képlet szerint számítható ki: f (pH ) =
Akmért (pH ) − Ak ,L Ak ,H n L − Ak ,L
32
(2.37)
ahol Ak ,L és Ak ,H n L a csoport teljesen protonálatlan, illetve protonált állapotának megfelelő pH-nál mért abszorbanciaérték a szelektívnek feltételezett k hullámhosszon. Ezt a módszert elsősorban fenol-, tiol- és aromás aminocsoportok ionizációjának szelektív követésére használják [74,76]. Ha a molekula egynél több csoportjának protonálódása is hozzájárul a mért spektrális változáshoz, a szelektív hullámhossz(ak) kiválasztása problematikussá válhat. A mikrorészecskék koncentrációarányának eltolására ekkor az UV-pH titrálást különböző hőmérsékleteken vagy szerves oldószerkomponens jelenlétében hajtják végre [129]. Az így kapott spektrumsorozatból kedvező esetben rekonstruálni lehet az egyes mikrorészecskék egyedi spektrumát. Bizonyos funkciós csoportok disszociációjának szelektív követésére a pH-függő infravörös, Raman vagy fluoreszcencia spektroszkópia is felhasználható. Az NMR alkalmazhatósága azonban összehasonlíthatatlanul általánosabb, mivel 1H vagy
13
C
nuklidok minden szerves ligandumban megtalálhatók. NMR-pH titrálással határoztak meg
mikroállandókat
többek
között
aminosavakra,
oligopeptidekre
és
származékaikra, nukleozidokra, nukleotidokra, inozitol-foszfátokra, nyíltláncú és gyűrűs poliaminokra, illetve N-acetát/foszfonát/foszfinát származékaikra és a legkülönbözőbb gyógyszermolekulákra [125].
2.3.3.4
Egyes csoportok protonfelvételének szelektív követése NMRpH titrálással
Egy spinaktív mag σ árnyékolási tényezője, amely kémiai eltolódásának alapját képezi, formálisan három komponensre bontható:
σ = σ diam. + σ param. + σ egyéb
(2.38)
A diamágneses komponens σ diam. > 0 az elektronok árnyékolásának hatását írja le, ezért arányos a mag helyén mérhető elektronsűrűséggel. A paramágneses tag
σ param. < 0 az alacsony energiájú betöltetlen pályákra történő elektrongerjesztésekkel kapcsolatos. A (2.38) egyenlet utolsó tagja olyan hatásokat összesít, mint a térközeli csoportok mágneses anizotrópiája, az anizotróp C–X csoportok elektromos téreffektusa, van der Waals kölcsönhatások, szolvatációs vagy konformációs effektusok. 33
Az
1
H NMR spektroszkópiában a diamágneses árnyékolás mellett σ param.
jelentősége alárendelt, ezért a szénhez kötött, nem cserélődő hidrogének kémiai eltolódása jó indikátora lehet az ionizációval kapcsolatos elektronsűrűségváltozásnak. Kísérleti tény ugyanakkor, hogy egy csoport protonálódásának hatása alifás vegyületekben öt kötésen át a mérési hibát megközelítő mértékűre csökken. Egy k jelű vicinális hidrogén tehát szelektíven jelezheti egy funkciós csoport f protonáltsági fokát, ha öt kötés távolságon belül nincs további bázikus centrum és a kémiai eltolódást a vizsgált pH-tartományban a protonálódással összefüggő más effektus nem befolyásolja [130]: f (pH ) =
δ kmért (pH) − δ k ,L ∆δ kmért = δ k ,H L − δ k ,L ∆δ kmax
(2.39)
n
ahol az alsó indexek jelölése analóg a (2.37) egyenletben leírtakkal. Peptidek és fehérjék oldalláncaira gyakran teljesül ez a szelektivitás és a funkciós csoportok protonfelvétele „egyenként” tanulmányozható [76,114]. Aromás vegyületek π-elektronrendszere az ionizáció hatását négy kötésnél távolabbi protonokig is közvetítheti [125]. Mivel a hidrogének a molekula „külső peremén” helyezkednek el, a szolvatációs, konformációs vagy aggregációs változásokra is érzékenyebben reagálnak, mint a szénvázban található 13C izotópok.
2.4 A ciklodextrinek A ciklodextrinek (CD-k) ciklikus, nem redukáló oligoszacharidok, amelyek Dglükopiranóz egységekből épülnek fel α-(1,4)-glikozidos kötéseken keresztül. Az egyes CD-ket a felépítő glükóz egységek száma alapján nevezzük el, így 6, 7 ill. 8 egység esetén α-, β-, γ-CD-ket különböztetünk meg. A CD-ket alkotó glükopiranóz egységek egy csonkakúp-palást felületén helyezkednek el. A molekula belsejét alkotó üreg a hidrogén atomok és glikozidos oxigén-hidak révén enyhén apoláris tulajdonságú. A csonkakúp keskenyebb nyílását primer, míg a szélesebbet szekunder hidroxil csoportok határolják. A molekula két peremének poláris jellege miatt a CD-
34
k jól oldódnak vízben (kivéve a β-CD). A CD-k vázlatos szerkezetét a 2.9. ábra mutatja be [131].
OH
H
O
H
H
O OH
O OH HO
H
O HO
H
H H
OH
H
OH
H
H
OH
H
H O
H
HO
H
OH
H H
O
H
H
HO O
H
H
O
OH
OH H
O H H
H
HO
OH
O
H
HO
H
H H
H
H OH
O
HO
OH O
H
OH
O
H
H O
H
H
OH
2.9. ábra. A hét D-glükopiranóz egységből felépülő β-ciklodextrin szerkezeti sémája és 3D szerkezete felülnézetből. forrás: http://my.fit.edu/~nesnas/cycl.jpg
A CD-k glukózegységenként egy primer és két szekunder alkoholos hidroxil csoportot tartalmaznak (összesen 18, 21 ill. 24 szabad OH csoport α-, β- ill. γ-CD esetén), amelyek kitűnő lehetőséget nyújtanak a legkülönfélébb származékok előállítására. A CD-származékok esetében szubsztitúciós fokon azt értjük, hogy molekulánként átlagosan hány hidroxilcsoporton történt szubsztitúció. Manapság az irodalomban leírt ciklodextrin-származékok száma közel ezerre tehető. Alapvetően kétféleképpen
csoportosíthatjuk
őket:
a
szubsztituensek
száma
és
azok
ionizálhatósága alapján. Az előbbi esetben monofunkciós (szubsztitúciós fok=1), többfunkciós random (β-CD esetén 1 és 21 közötti szubsztitúciós fokú) vagy „izomertiszta”, egynemű (a szubsztitúciós fok egész szám) származékokról beszélünk. Ionizálható szubsztituens bevitelével pedig állandó vagy pH-függő töltéssel láthatjuk el a ciklodextrint. A legelterjedtebb származékok közül munkánk során a random metil β-CD-t (RAMEB) használtuk, ahol a szubsztituens csoport O-metil, a szubsztitúciós fok pedig 11-12 közötti.
2.4.1 A ciklodextrinek történetének rövid áttekintése A CD-ket először Villiers írta le, aki a burgonyakeményítő bakteriális emésztési folyamata során kikristályosodó anyagot cellulozinnak nevezte el. Több, mint egy évtizeddel később Schardinger elkülönített egy termofil baktériumot, amely képes 35
volt feloldani a keményítőt és abból kristályos „dextrinek”-et képezni. A Bacillus
macerans mikroorganizmus által előállított kristályos anyag két vegyület, az α- és βkristályos dextrin keveréke volt. A β-kristályos dextrin megegyezett a Villiers által megfigyelt cellulozinnal. Schardinger még nem ismerte a kristályos dextrinjeinek pontos szerkezetét, de felismerte azok zárványkomplexképző képességét [132]. A következő fontos állomás Freudenberg és munkatársai nevéhez fűződik, ők izolálták először tisztán a három, natív CD-t, és előbb feltételezték, majd bizonyították gyűrűs szerkezetüket. A glükózegységek pontos számát French és Rundle határozta meg. A CD-k keményítőből való képződésének mechanizmusára Freudenberg elképzelése bizonyult helyesnek, miszerint az amilóz helikális szerkezetét
kihasználva
a
bakteriális
ciklodextrin-transzglikozidáz
bizonyos
csavarmenetekben átglikozidálja a láncot, CD-gyűrűket képezve [132]. Az ígéretes és különleges tulajdonságú CD-k iránt a hatvanas-hetvenes években kezdett komolyabb tudományos érdeklődés mutatkozni a legkülönbözőbb iparágakban.
2.4.2 A ciklodextrinek felhasználása és gyógyszerészeti jelentősége A ciklodextrinek felhasználása, tekintettel a sokféle származékra és változatos alkalmazási területekre, napjainkban már nagyon sokrétű. A legnagyobb (tonnás) mennyiségben a RAMEB-et és a hidroxipropil-β-CD-t (HPβCD) használják fel. A RAMEB-et a festékiparban vízbázisú festékek, fakezelő oldatok előállítására, míg a HPβCD-t tisztító és kozmetikai szerekben hasznosítják. Az élelmiszeriparban különféle aromák főként β-CD-vel képzett komplexeit értékesítik, amelyek megnövelt vízoldhatósággal és kémiai stabilitással rendelkeznek. Az analitikai kémia elsősorban a kromatográfiás technikák területén alkalmazza széleskörűen a CD-ket és származékait, királis felismerő képességüknek köszönhetően. A gyógyszeriparban a vízben rosszul oldódó hatóanyagok molekuláris kapszulázására, ezáltal oldhatóságuk és biohasznosíthatóságuk fokozására, illékony hatóanyagok készítményeinek stabilizálására, illetve a hatóanyag helyi irritációinak kivédésére alkalmazzák a ciklodextrineket és azok származékait [131]. Jelenleg több, mint 30 olyan készítmény van forgalomban, amelyben a hatóanyag ciklodextrin-
36
zárványkomplexben található. A ciklodextrint tartalmazó gyógyszerformák szinte a teljes spektrumot lefedik, törzskönyvezett oldatok, infúziók, szemcseppek, orrsprayk, kenőcsök, tabletták és kúpok is találhatók, melyek a natív ciklodextrinek közül αés β-CD-t, a módosítottak közül metil-, 2-hidroxipropil-, szulfobutiléter-β-CD-t, ill. 2-hidroxipropil-γ-CD-t
tartalmaznak
szolubilizáló-
vagy
stabilizálószerként
[132,133,134,135]. Sokáig élt az az elképzelés, hogy a ciklodextrin tartalmú készítmények biohasznosíthatósága nem megfelelő a hatóanyag ciklodextrin kavitásából történő lassú felszabadulása miatt, azonban Stella és munkatársai bebizonyították, hogy a hatóanyag/ciklodextrin komplex képződési sebessége és disszociációja is általában diffúzió kontrollált [136]. Következésképpen a vízoldható hatóanyag/ciklodextrin komplex a hidratált epitélsejtek felszínénél jelentősen megnöveli az igen lipofil, vízben rosszul oldódó hatóanyag biohasznosíthatóságát, de jó vízoldhatóságú és permeabilitású hatóanyag esetén a biohasznosíthatóság csökkenését is okozhatja [137]. Számos oka van annak, hogy az alkalmazott ciklodextrin mennyiségét minimalizálni kell, többek között bizonyos CD-k toxicitása, formulálási nehézségek, izotonizálási problémák, nem utolsósorban pedig a termék ára az, ami határt szab a készítménybe kerülő CD mennyiségének [138]. Az alkalmazott CD-k koncentrációjának csökkentése viszont alacsonyabb komplexáltsági fokot eredményez, így különböző megoldásokat kellett keresni a komplexálás hatásosságának (gyakorlati szempontból a CD-k szolubiliáló hatásának) növelésére. Az egyik lehetőség a hatóanyag intrinsic oldhatóságának növelése ionizáció révén, ami megnövekedett komplexálódást eredményez. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy ionizált hatóanyagok általában kisebb stabilitású komplexet képeznek összehasonlítva töltésmentes formáikkal [139,140]. További lehetőség a sóképzés [141], polimerek [142], koszolvensek [143], fémkomplexek [144] és ionpár-képzés alkalmazása töltéssel rendelkező CD-k és a hatóanyag között [145].
37
2.4.3 A ciklodextrin-komplexek egyensúlyi és szerkezeti jellemzésének módszerei A ciklodextrin (CD) zárványkomplexének fizikai-kémiai paraméterekkel történő jellemzése egyaránt fontos az élelmiszeripartól az analitikán át a gyógyszerformulálásig. Egy L ligandum (vendégmolekula) és a CD egyensúlyi reakciójában képződő szupramolekuláris komplex kialakulását és a komplex stabilitását jellemző termodinamikai állandót a 2.40 egyenlet szemlélteti [146]:
iL + jCD
K CD j Li =
CD j L i
[CD j L i ] [L]i [CD] j
(2.40)
A zárványkomplex sztöchiometriáját i és j együtthatók egyértelműen meghatározzák. A legegyszerűbb és egyben leggyakoribb az 1 CD-ből és 1 vendégmolekulából felépülő komplex, de viszonylag gyakori az 1:2-es sztöchiometria is. Az irodalomban rendkívül változatos összetételekre is találunk példát [146 és hivatkozásai]. A zárványkomplex kialakulásának sztérikus és termodinamikai feltételei vannak. Ahhoz, hogy a CD részben vagy teljes egészében, kovalens kötés nélkül, pusztán másodrendű, fizikai kölcsönhatások segítségével magába foglalja a vendégmolekulát, alapvető kritérium a megfelelő sztérikus illeszkedés, azaz hogy a vendégmolekula bizonyos részlete, esetleg egésze képes legyen „bezáródni” a ciklodextrin üregébe. Bár az egyes ciklodextrin molekulák „magassága” gyűrűtagszámtól függetlenül egyforma, a belső átmérő és ezáltal az üreg térfogata behatárolja a lehetséges vendégmolekulák körét. A másik kritérium sem kevésbé fontos: megfelelő szabadentalpia-különbség megléte a hidratált reaktánsok (L és CD) és a képződő komplex(ek) között. Vizes oldatban a gyengén apoláris ciklodextrin-üregben nagy entalpiájú vízmolekulák foglalnak helyet. A kedvezőtlen poláris-apoláris kölcsönhatás eredményeként a víznél kevésbé poláris vendégmolekulák szubsztitúciója preferált. Vizes közegben, az alábbi termodinamikai folyamatok kedveznek a komplex kialakulásának: a vízmolekulák kiszabadulása az üregből, majd az általuk létrehozott nagyszámú hidrogénkötés létrejötte a többi oldószermolekulával. Ezzel egyidejűleg a hidrofób vendégmolekula és a poláris oldószer közötti kölcsönhatások
38
megszűnése, majd a ciklodextrin apoláris ürege és a hidrofób vendég között létrejövő másodlagos kötőerők, ezen belül is elsősorban van der Waals, hidrofób kölcsönhatások, illetve hidrogénhidak kialakulása. A ciklodextrin-komplexek stabilitásának számszerű jellemzésére (a protonálódási makroállandókhoz hasonlóan) mindazon módszerek alkalmasak, melyekben a mért fizikai-kémiai mennyiség változása egyértelmű kapcsolatba hozható a komplexképzéssel. Az alábbiakban csak azokat a metodikákat foglaljuk össze, amelyek jelen munkában is alkalmazásra kerültek.
2.4.3.1
Ultraibolya-látható spektrofotometria
Komplexstabilitási állandó meghatározása UV-látható spektrofotometriával a spektrumparaméterek megváltozásán alapul. Eltolódhat az elnyelési maximum helye, és megváltozhat a moláris abszorpciós együttható értéke is. Gyakran alkalmazott technika a lináris paraméterillesztést alkalmazó Benesi-Hildebrand módszer [147], ahol az adott hullámhosszon mért abszorbanciaváltozás reciprokát a vendégmolekula-koncentráció reciprokának függvényében ábrázolva 1:1-es komplex-sztöchiometria esetén egyenest kapunk. A tengelymetszet és az egyenes meredekségének hányadosából a stabilitási állandó egyszerűen meghatározható. A módszer hátránya, hogy csak olyan esetekben alkalmazható, amikor a CD-nek közvetlen hatása van a spektrumra. A legszélesebb körben alkalmazott módszer a Higuchi és Connors által kidolgozott fázis-oldhatósági vizsgálat [148]. Ennek során feleslegben és azonos oldattérfogatban
alkalmazott
vendégmolekula
különböző
mennyiségű
CD
hozzáadására bekövetkező oldhatóság-növekedését határozzuk meg spektrofotometriásan az egyensúly beállta után. Ha a vendégmolekula így mért (tipikusan szubmillimólos) összkoncentrációját a CD koncentráció függvényében ábrázoljuk, a kapott függvény információt nyújt a képződő komplex sztöchiometriájáról, sőt a meredekség és tengelymetszet értékéből a stabilitási állandó is kiszámolható. A módszer előnye, hogy a tengelymetszet megadja a vendégmolekula intrinsic oldhatóságát is CD-t nem tartalmazó oldószerben.
39
2.4.3.2
Potenciometria
A koordinációs kémia leggyakrabban alkalmazott módszere komplex egyensúlyok tanulmányozására, amennyiben a változás az oldat hidrogénion koncentrációjának változásával jár, a pH-potenciometriás titrálás [75]. CD-komplexek stabilitásának jellemzésére a pH-potenciometria csak abban az esetben alkalmazható, ha a vendégmolekula protolitikusan aktív vegyület és a konjugált sav és bázis eltérő stabilitású komplexet képez. Ilyen esetekben a CD jelenléte befolyásolja az erős bázissal titrált oldat egyensúlyi hidrogénion koncentrációját, ami a komplexstabilitás számításának alapját képezi. Napjainkra a potenciometria alkalmazhatósága nem korlátozódik csupán az ionizálható csoportot tartalmazó vendégmolekulák komplexstabilitásának meghatározására, mert az egyre nagyobb számban megjelenő szelektív elektródok segítségével ma már rutinszerűen elvégezhető pl. tetraalkil-ammóniumsók egyensúlyainak jellemzése [149], sőt kiszorításos potenciometriával akár különböző lánchosszúságú alkanolok CD komplexei is vizsgálhatók [150], ami a CD-k ipari méretű gyártásának optimalizálásában alkalmazásra is került.
2.4.3.3
Tömegspektrometria
Rendkívüli érzékenységének köszönhetően a tömegspektrometria (MS) is sikerrel alkalmazható zárványkomplexek szerkezetének és stabilitásának tanulmányozására [151]. A kezdeti nehézségek ellenére [152] mára validált, független technikákkal alátámasztott MS módszerek állnak rendelkezésre [153]. A nemkovalens gazdavendég komplexek tömegspektrometriás vizsgálata esetén minden esetben célszerű független módszerrel megbizonyosodni arról, hogy a gázfázisban detektált komplex valódi zárványkomplex, nem pedig egy elektrosztatikus addukttól származó, „hamis pozitív” jel [152]. A lágy elektrospray-ionizációnak (ESI) köszönhetően az oldatfázisban jelenlévő komplexek érintetlenül kerülhetnek az oldószermentes nagyvákuumba, ahol a
40
legváltozatosabb vendégmolekulák (gyógyszervegyületek, di- és tripeptidek) CDkomplexeire határoztak meg sztöchiometriai [154] és stabilitási [155] adatokat.
2.4.3.4
NMR spektroszkópia
Az NMR spektroszkópia az egyik legsokoldalúbban alkalmazható technika CDkomplexek oldatfázisú egyensúlyi és szerkezeti jellemzésére [156]. A ciklodextrinek, majd komplexeik vizsgálata a 60-as évek második felében kezdődött [157,158], a spektrométerek növekvő teljesítőképességének is köszönhetően. Az első NMR eredmények közt publikálták a különböző natív ciklodextrinek szekunder hidroxilcsoportjai között kialakuló hidrogénhidas szerkezetet, mellyel sikerült magyarázatot adni a β-CD kiugróan alacsony (0,013 M) oldhatóságára [131]. Már a korai vizsgálatok során meghatározták a ciklodextrinek 1H és 13C kémiai eltolódásait, analizálták a spinrendszereiket és konformáció-változásaikat, majd a 400 MHz-es és nagyobb térerejű készülékek, valamint a gradiens technikák elterjedésével lehetőség nyílt a különböző szubsztituált CD-k és komplexeik vizsgálatára is. A ciklodextrin-vendégmolekula rendszer egyensúlyi jellemzésére az ún „NMR shift titration” (röviden NMR titrálás) a leggyakrabban használt módszer. Általában a vendégmolekula egy vagy több NMR-aktív magján mérjük az egyre több CD adagolására bekövetkező kémiai eltolódás-változást ( ∆δ ). A ∆δ (vagy delta) vs. CD-koncentráció adatsor(ok)ból nemlineáris paraméterillesztéssel kapjuk a komplexstabilitási állandót [146,159]. Az állandó pontos meghatározásának érdekében a titrálást 0−80% komplexáltsági fokok közti intervallumban célszerű végrehajtani, ha az oldhatósági adatok ezt lehetővé teszik. A különböző gazda/vendég koncentrációarányoknál felvett 1H (ritkábban részecskék egyedi δ H
n
I n+
13
C) spektrumokban mért kémiai eltolódás a
és δ H In+ −CD kémiai eltolódásainak móltörtekkel súlyozott n
átlaga, ha a komplexképződési reakció megfelelően gyors az NMR időskálán:
δ mért = δ H I ⋅ xH I + δ H I i+
i
i+
i
i
i+
⋅ xH Ii+ −CD = − CD
δH I + δH I i
i+
i
i+
− CD
⋅ K H Ii+ −CD [CD] i
1 + K H Ii+ −CD [CD]
i
(2.41)
i
Az NMR titrálás előnye, hogy elvileg mind a vendégmolekula, mind a CD összes spinaktív magján egyszerre követhetjük a komplexképződés hatását, így egyetlen
41
titrálásból is több adatsor áll rendelkezésre K meghatározására. A módszernek jó kontrollja továbbá, hogy az egyes magokon mért kémiai eltolódás változásokat külön-külön kiértékelve, a látszólagos stabilitási állandók mennyire térnek el egymástól. Abban az esetben, ha az így meghatározott értékek több, mint 10 %-kal eltérnek, vagy szisztematikus trendet mutatnak, a feltételezett 1:1 sztöchiometria modellegyenletét
egy
további
egyensúlyi
folyamattal
kell
kiegészíteni
(leggyakrabban 2:1 komplex képződése esetén) [160]. Az NMR titrálások további előnye, hogy a többfunkciós, izomertiszta szubsztituált CD-k használatakor nagy térerejű készülékekkel minden egyes cukormolekula anizokrón jele megkülönböztethető, így főként aromás vegyületek CD-be történő foglalásakor a ciklodextrinek jelein mért változásokat is be lehet vonni a kiértékelésbe. A modern NMR pulzusprogramok segítségével a szupramolekulák 3D szerkezete is vizsgálható. A kétdimenziós mag-Overhauser hatás spektroszkópia (NOESY) [161] intramolekuláris keresztcsúcsai nem szimmetrikus CD-származékok jelasszignációjában és konformációik meghatározásában is hasznos információkat nyújtanak. A hagyományos NOE módszerek alkalmazhatóságát nagymértékben befolyásolja a molekulák korrelációs mozgása. A kritikus keresztrelaxációs idők egyaránt függnek az oldószer viszkozitásától, a rotációs korrelációs időtől (τc) és a spektrométer frekvenciájától. 500-600 MHz-es készüléken pozitív NOE-t (gyors mozgás, ωτc << 1) az 1000 Da alatti, míg negatívat (ωτc >> 1) csak a jóval 5000 Da fölötti mólsúlyú vegyületeknél várhatunk. A CD-k és komplexeik mérettartományában ωτc ≈ 1, ezért a NOESY kevéssé alkalmazható. A „rotating frame” Overhauser-hatás spektroszkópiában (ROESY) a keverési idő (mixing time) alatt spin-lock tér alkalmazásával érhető el, hogy a keresztrelaxáció nem a z-tengely mentén, hanem egy x,y-komponenseket is tartalmazó effektív tengely mentén (és a spektrométer alapfrekvenciájától eltérő ωeff
frekvenciánál) megy végbe, így
gyakorlatilag tetszőleges sebességű rotációs mozgásra (molekulaméretre) biztosított a ωτc << 1 feltétel, tehát a főátlóval ellentétes fázisú keresztcsúcs [162].
42
2.5 A liposzómák A biológiai membrán rendkívül komplex struktúra, a legkülönfélébb életfunkciók ellátására komplexitása teszi alkalmassá. Összetett funkciójukból eredően a biológiai membránok inhomogének és domén-struktúrával rendelkeznek, ami megnehezíti a különféle vegyületek (bio- és gyógyszermolekulák stb.) membránra kifejtett hatásának tanulmányozását. Ahhoz, hogy a különféle ágensek által okozott változásokat követni tudjuk, és a membránra ható szerek hatásmechanizmusát megismerhessük, célszerű a biológiai membránokat egyszerűbb felépítésű membránokkal modellezni. A modellezésre kínálnak lehetőséget a liposzómák. Elsőként Bangham és munkatársai írták le 1965-ben, hogy: „Az egyértékű kationok és anionok spontán kialakuló lecitin folyadékkristályon keresztüli diffúziója figyelemre méltóan hasonlít az ilyen ionok biológiai membránokon keresztüli diffúziójára” [163]. A liposzómák spontán szerveződő kolloidális részecskék, amelyekben a lipid kettősréteg a vizes fázis egy részét is magába zárja (2.10. ábra). Ebben a modellrendszerben, a citoplazmának a bezárt vizes fázis, a sejtmembránnak a liposzómamembrán felel meg. A liposzómáknak több csoportja létezik, melyek közül a sejtmembránok modellezésére kis unilamelláris (SUV), nagy unilamelláris (LUV) és multilamelláris liposzómát (MLV) használnak. A SUV-ok 30-100 nm, a LUV-ok 100-1000 nm átmérővel rendelkeznek, az MLV mérete szintén változó, átmérőjük legalább 100 nm, de a µm-es nagyságot is elérhetik.
43
(a)
(b)
2.10. ábra. (a) unilamelláris liposzómák sematikus rajza (b) multilamelláris és kis unilamelláris liposzómák keverékének elektronmikroszkópos felvétele
A liposzómák amellett, hogy a sejtmembránok biofizikai, strukturális és funkcionális tanulmányozásának eszközei, a gyógyszertechnológia legmodernebb vívmányai közé is tartoznak. Az 1970-es évek elején a liposzómákat, mint gyógyszerszállító rendszereket írták le [164] és kitartó kutatómunka eredményeként váltak alkalmassá enzimek, antibiotikumok, daganat- és gombaellenes hatóanyagok, örökítőanyag szállítására, bezárt antigének révén immunválasz kiváltására [165, 166]. A liposzomális gyógyszerforma sikere nagyrészt annak köszönhető, hogy komponensei a biológiai membránt alkotó, nem toxikus, nem immunogén, biológiailag lebomló lipidek.
2.5.1 A liposzómák gyógyszerészeti jelentősége A gyógyszerformulálás mindenkori feladata a meglévőknél kedvezőbb farmakokinetikai paraméterekkel rendelkező gyógyszerkészítmények fejlesztése, előállítása. A biztonságosabb gyógyszeralkalmazás érdekében törekszünk a terápiás index növelésére, a hatóanyagok szelektív célbajuttatására. A liposzómába zárt hatóanyagok terápiás alkalmazása számos előnnyel rendelkezik a hagyományos gyógyszerformákhoz képest. Irányított célbajuttatással a hatóanyag az érzékeny szövetekben halmozódik fel, így toxicitása csökkenthető. Erre példa a liposzómába zárt doxorubicin, melynek kardiotoxikus mellékhatása jóval kisebb a szabad formájú hatóanyagénál [166]. Liposzómák alkalmazásával a hatóanyagok szabaddá válása (liberációja) szabályozható, ezáltal egyenletesebb terápiás gyógyszerszint érhető el.
44
A gyorsan bomló hatóanyagok (pl. citozin-arabinozid) liposzómába zárásával biztosítani lehet a lebomlástól való védelmet is. A ciklodextrinekhez hasonlóan a liposzómák is sikerrel alkalmazhatók vízben rosszul oldódó hatóanyagok pl. a taxol vagy a ciszplatin lipofil származékainak szolubilizálására. A hatóanyag irányított célbajuttatása
a
liposzómák
felszínéhez
kovalensen
kötött
ligandumok
alkalmazásával valósítható meg, ha a ligandum a célsejt felszínén található receptorhoz szelektíven kötődik [167]. További fiziológiás és patológiás faktorok is hozzájárulhatnak ahhoz, hogy a vezikulákba zárt hatóanyagok a kívánt szövetben halmozódjanak fel. A tumorokban a kapillárisok permeabilitása nagyobb, mint a fiziológiás működésű szövetekben, így a liposzómák passzív transzport révén ott jelentősebben felhalmozódnak ill. a fertőzött, gyulladt szövetek hőmérséklete magasabb, mint az egészségeseké, ami a termoszenzitív liposzómák lokális alkalmazására nyújt lehetőséget.
2.5.2 A liposzómák jellemzésére használt módszerek A liposzomális gyógyszerkészítmények, számos előnyük ellenére, még mindig nem váltották be a hozzájuk fűzött reményeket. Ezt elsősorban a törzskönyvezett készítmények alacsony (bár napjainkban növekvő) száma is jelzi. Az első és talán legfontosabb ok a GMP irányelvek szerinti ipari méretekben történő előállításuk nehézsége és költsége. Emellett bonyolult feladatok elé állítja a gyártót az igen komplex szerkezetű gyógyszerszállító liposzómák (például a többféle, telített és telítetlen zsírsavláncú lipidből és változatos fehérjékből felépülő immuno-liposzómák) kedvezőtlen kölcsönhatásainak kivédése egymással, a hatóanyaggal és a szervezet különböző kompartmentjeiben lévő biomolekulákkal. Az előállított liposzómák jellemzésének egyik legalapvetőbb módszere a szuszpenzió diszperzitásának vizsgálata, a liposzómák méreteloszlásának meghatározása unilamelláris liposzómák esetén. A liposzómák dinamikus fényszórásméréssel meghatározott átlagos hidrodinamikai átmérője ill. annak időbeli változása fontos információ a készítmény fizikai stabilitása szempontjából. A méreteloszlás befolyásolja a szervekben történő eloszlást és a plazma farmakokinetikát egyaránt. Kontroll, hatóanyagot nem tartalmazó liposzómákkal való összehasonlításkor a hatóanyag
45
okozta méreteloszlás-változás esetleges fúzióra, aggregációra utalhat. A fizikai stabilitás további időfüggő jellemzője a bezárási hatásfok. Liposzóma szuszpenziók morfológiai jellemzésére sikerrel alkalmazható a fagyasztva törés után készített replika transzmissziós elektronmikroszkóppal történő vizsgálata.
2.5.2.1
A liposzóma-membrán fizikai jellemzése
A lipidmolekulák közötti gyenge másodrendű kémiai kötések teszik lehetővé a lipidek saját tengely körüli forgását, azok adott membránrétegben való laterális elmozdulását, valamint a kettős lipidrétegek közötti „flip-flop” mozgását is. Ez utóbbi transzmembrán-mozgás energiaigénye nagyobb, emiatt ritkábban valósul meg, mint a laterális diffúzió. Valamennyi molekuláris szintű mozgás együttesen eredményezi a membrán fluiditását, aminek megfelelő mértéke a biológiai membránok optimális működésének elengedhetetlen feltétele. A membrán fluiditását jelentősen befolyásolja a hőmérséklet. A fő fázisátalakulási hőmérséklet (Tf) alatt a membrán általában rigid, gél állapotú, e felett azonban fluiditás- és permeabilitás növekedést tapasztalunk, amely során folyadékkristályos állapot alakul ki. Ez az állapot a molekulák közti erők nagyságát vizsgálva a folyadékokkal, a meglévő rendezettség, valamint az optikai és mechanikai anizotrópia miatt a szilárd testekével rokon állapot. A fázisátalakulást kísérő fluiditásbeli változás a lipidek egyre intenzívebb, nagyobb sebességű mozgásának, az addig kompaktabb szerkezet rendezetlenebbé válásának tudható be, ami a zsírsavláncok közötti távolság növekedésével, a kettős réteg felszíni és térfogati növekedésével jár együtt. Differenciál szkenning kalorimetria (DSC). Multilamelláris vezikulák termo-
tróp viselkedésének tanulmányozására a DSC régóta használt módszer [168,169]. Az MLV szuszpenziók fűtése során két endoterm átalakulást figyelhetünk meg a termogrammon. Alacsonyabb hőmérsékleten az elő-fázisátalakulásnak (Telő) megfelelő széles, kis entalpiájú csúcs az amfipatikus tulajdonságú lipidmolekulák poláros fejcsoportjai közti kölcsönhatások megváltozására utal. Magasabb hőmérsékleten egy éles, nagyobb entalpiájú fő fázisátalakulásnak megfelelő endoterm csúcs a lipidmolekulák apoláros lánccsoportjai közötti kölcsönhatások megváltozására utal.
46
További jellemző paraméter a fő fázisátátalakulási hőmérséklet-tartomány félértékszélessége, melynek értéke a láncrészek közötti kooperativitással fordítottan arányos. Elektronspin rezonancia spektroszkópia (ESR). Az elektronspin rezonancia
spektroszkópia olyan molekulák és ionok, valamint környezetük vizsgálatára alkalmas, amelyek párosítatlan elektronspinnel rendelkeznek. A legtöbb molekula elektronszerkezete alapállapotban szingulett, minden betöltött molekulapályán két ellentétes spinű elektron helyezkedik el, így az eredő spin nulla. Ekkor, ha a pálya mágneses momentuma nulla, nincs eredő mágneses momentum sem, ezért nincs kölcsönhatás külső mágneses térrel. Vannak azonban olyan molekulák, amelyek már alapállapotban is egy vagy több párosítatlan spinű elektronnal rendelkeznek, így ESR-rel vizsgálhatók. A párosítatlan elektronokat tartalmazó molekulák közül az O2, NO, NO2 vizsgálata, az átmeneti fémek ionjai és komplexei közül pedig a Fe3+, Cr3+, Cu2+ [Fe(CN)6]3- rendszerek ESR vizsgálata stabilitásuknak köszönhetően széleskörű [170,171]. A kevésbé stabil szabad gyökök, gyökionok ESR irodalma szintén jelentős, de néhány speciális esettől eltekintve az ESR alkalmazhatóságának feltétele, hogy a gyökök élettartama legalább 1 µs legyen. Biológiai és modellmembránok párosítatlan elektront tartalmazó stabil, spinjelölő molekulákkal történő megjelölés után válnak alkalmassá ESR spektroszkópiás vizsgálatra [172]. A módszer segítségével információt kaphatunk a spinjelölő mozgási állapotáról, így közvetett módon környezetük tulajdonságairól is. A sejt- vagy modellmembránba spinjelölt zsírsavat, zsírsavésztert, illetve spinjelölt lipidet juttatva vizsgálható a membrán fluiditása, azaz a lipidek mozgási és forgási szabadsága, irányítottságuk, valamint a jelölő környezetének polaritása és mindezek változása a membrán lipidösszetételének és a liposzómába zárt hatóanyag minőségének függvényében. Leggyakrabban használt spinjelölők a (4,4-dimetil-1,3-oxazolidin-3-il)oxidanil (doxil) csoporttal ellátott sztearinsav és különböző foszfatidil-kolin származékok (2.11. ábra).
47
H3C O N
HOOC
H3C OH O
P
CH3 O
CH3
CH3 N+
CH3
O
O H3C
CH2
O N
HC O
CH3 O
CH3
O H2C O
CH3 O
2.11. ábra. A spinjelölő zsírsav (5-doxil-sztearinsav) és lipid (1-palmitoil-2-sztearoil-(5doxil)-glicero-3-foszfatidil-kolin) szerkezete
Spinjelölőt tartalmazó liposzóma szuszpenzió tipikus ESR spektruma látható a 2.12. ábrán. Az abszorpciós típusú spektrumnak jellemzői az intenzitás, a sávszélesség, a pozíció és a finomszerkezet, ezek hordozzák a vizsgálandó anyagra jellemző információt. Az intenzitás arányos a gyök, ill. a paramágneses anyag koncentrációjával, míg a sávszélesség a Heisenberg-féle bizonytalansági elv szerint a gerjesztett állapot élettartamával, a relaxációs idővel van összefüggésben. A membránfluiditás vizsgálatokhoz az 5-doxil spinjelölők esetén a spektrumból meghatározható külső csatolási állandóra (2Amax), míg 16-doxil spinjelölők esetén a h+1 és h0 jelamplitúdókra van szükség. A fenti spektrumparaméterek és a liposzómamembrán fluiditása közti összefüggés fizikai hátterének részletes tárgyalása nem része a dolgozatnak, összefoglaló irodalmakban megtalálható [173 és hivatkozásai]. Kvalitatív információt szolgáltat a 2Amax csatolási állandó változása, melynek csökkenése a membrán fluiditásának növekedését jelzi. A spin dipoláris kölcsönhatások által befolyásolt, a spektrum alacsonyabb terű csúcsának félértékszélessége (H1/2) pedig a spinjelölők egymáshoz viszonyított távolságáról nyújt információt.
48
2A 2Amax max
H1/2
H h+1 ho
2.12. ábra. Spinjelölt liposzóma preparátum tipikus ESR spektruma a kiértékeléshez használt külső csatolási állandó (2Amax), a h+1 és h0 jelamplitúdók és az alacsony terű csúcs félértékszélessége (H1/2)
49
3 A kísérleti munkában felhasznált anyagok és módszerek A kísérleti munka során használt anyagok és módszerek az eredmények c. fejezetnek megfelelően hármas tagolású, külön fejezetben tárgyalva a protonálódási állandók meghatározását, valamint az imatinib ciklodextrinekkel, illetve liposzómákkal való kölcsönhatásának jellemzését.
3.1 Protonálódási állandók meghatározása 3.1.1 Anyagok A protonálódási állandók meghatározásához használt alapvegyszereket (NaOH, NaCl,
KCl,
tömény
sósav)
faktoralapanyagokat
(KHftalát,
KHCO3)
és
pufferkomponenseket (cc. H3PO4, NaH2PO4 × 2 H2O, KH2PO4, jégecet, hangyasav, bórax) analitikai tisztaságban a Reanal, Sigma és Aldrich gyártóktól szereztük be. Az NMR-spektroszkópiához referensanyagként a 3-trimetilszilil-1-propánszulfonsav nátriumsóját (DSS, ≥99%, Fluka) használtuk, a minták pedig megfelelő térfogatszázalékban ≥99,8 atom% izotóptisztaságú D2O oldószerrel (Aldrich) készültek. NMR-pH indikátormolekulaként használtunk még diklórecetsavat (99%, Lancester), klórecetsavat (p.a., Sigma) és trisz(hidroximetil)aminometánt (Tris), (p.a., Sigma) is. A titrálások oldószereként 18,2 MΩ cm fajlagos ellenállású Millipore vizet használtunk, a kereskedelemből beszerzett anyagokat tisztítás nélkül használtuk. A keverékoldószerekben végzett potenciometriás titrálásokhoz metanolt (≥99,8%, Merck) alkalmaztunk. Az imatinibet és két komponens vegyületét (3.1. ábra) Varga Zoltán PhD hallgató (Semmelweis Egyetem Kooperációs Kutatóközpont) állította elő az E1 hivatkozás Experimental Section: Synthetic Chemistry részében leírtak szerint (a szintézis részletes bemutatása nem képezi jelen disszertáció tárgyát). A vegyületek jellemzésére és tisztaságának vizsgálatára NMR spektroszkópia, két különböző rendszerben alkalmazott LC-MS vizsgálat, valamint olvadáspont meghatározás és vékonyréteg-kromatográfia szolgált.
50
9 8
10
6 1
5
N 11
7 12
4N
N2
20
CH3
3 13
HN
15 14
16 17
19 18
30
28
22
34
32
26
24
10
6 1
37
CH3
O
8
5
N
33
25 9
35
N 31
21
HN
36
27
29
23
N 11
7 12
4N
N2
20
CH3
3 13
HN
30
28
15 14
27
29
16 21
H2N
17
19
22
26
24 25
18
36 35
N 31 34
32
N
33
37
CH3
O
NH2
23
21
3.1. ábra. Az imatinib és két komponens vegyületének szerkezete a dolgozatban használt számozással
3.1.2 Potenciometriás titrálások Az üvegelektródot minden mérési napon többször kalibráltuk p[H] skálára üres titrálással (HCl vs. KOH), majd a vizsgálandó vegyületet a kalibráláshoz használt alapoldatban titráltuk a protonálódási állandók meghatározása. Állandó ionerősségnél dolgoztunk és a mérőcella hőmérsékletét Polistat folyadéktermosztáttal (ColeParmer) 0,1 °C pontossággal szabályoztuk. A légköri CO2 távoltartására az oldat fölé N2 gázt vezettünk, amelyet előtelítés céljából az inert só oldatát tartalmazó gázmosón vezettünk át. A potenciometriás titrálások méretezését a Szakács Zoltán által kifejlesztett PROTCSIM programmal terveztük meg [174]. A pH-t, ionerősséget és
51
pufferkapacitást számító rutin a (2.16) mérlegegyenlet K számú ligandumra (mérendő anyag, pufferkomponensek, NMR indikátorok, ...) történő kiterjesztésén alapul, melyek egyedi protonáltsági foka (pl. savanyú só) egyszerűen megadható. A tervezéshez szükség van az összes ligandum protonálódási állandójának ismeretére (a mérendő anyagra közelítő vagy becsült log K elegendő). A PROTCSIM azzal tud többet a legtöbb irodalmi „pufferrecept-készítő” programnál, hogy tetszőleges számú, értékűségű és protonáltsági fokú ligandumot tud kezelni mindkét elegyítendő oldatban, melyek ezen kívül erős savat/bázist, illetve 1:1 sztöchiometriájú inert sót is tartalmazhatnak [174]. A mérésekhez a fiziológiás közegben releváns (0,15 M) ionerősséget és az NMR mérésekkel való összehasonlíthatóság végett 25,0 °C hőmérsékletet választottunk. A vizsgált vegyületek koncentrációja 1-10 mM volt az oldhatóságuknak megfelelően. Metrohm 6.0234.110 katalógusszámú kombinált üvegelektródot használtunk 1 µl névleges adagolási pontosságú és 0,1 mV mérési felbontású Metrohm 716 DMS Titrino autobürettához csatlakoztatva, amely meredekségvezérelt üzemmódban automatikusan felvette a titrálási görbét. A protonálódási makroállandó kiszámítása legkisebb négyzetek elvén alapuló illesztéssel, a PROTC [174] és a Refinement Pro 2.2 (Sirius Analytical Instruments Ltd.) programok felhasználásával történt.
3.1.3 1H NMR-pH titrálás in situ pH méréssel A potenciometriával megegyező, 0,15 M ionerősség mellett, 25,0 ± 0,1°C hőmérsékleten végeztük az egycsöves 1H NMR-pH titrálásokat in situ pH méréssel mindhárom vegyületre. Imatinib esetén 1-3 mM-nak megfelelő mennyiséget 0,05 M sósavban oldottunk, amely 0,096 M NaCl és 1 mM DSS mellett 2 mM-ban tartalmazta a következő indikátormolekulákat: diklórecetsav, klórecetsav, ecetsav és trisz(hidroximetil)aminometán (Tris). Így p[H] 1,70-es 0,15 M ionerősségű törzsoldatot készítettünk. A kapott oldat 0,7 ml-ét NMR csőbe vittük át, és az EGIS Nyrt. 500 MHz-es Varian Unity spektrométerén 1H NMR spektrumot vettünk fel a kiindulási oldatról. Ezután a csőben lévő mintához fecskendővel, kis (3–20 µl) részletekben {0,11 M NaOH, 0,12 M NaCl} összetételű titrálószert adagoltunk, majd
52
homogenizálás után újbóli spektrumfelvételek következtek. Az 1,70-es p[H]-nál savasabb oldatok 2 M vagy 6 M HCl µl mennyiségű adagolásával készültek a törzsoldatból. Mivel a minták nem tartalmaztak D2O-t, az 1H spektrumok felvétele spektrométer lock nélkül történt, a vízjel elnyomására pedig előtelítő (presaturation) pulzust alkalmaztunk [E1,175]. A komponens vegyületek NMR titrálását a fentiekkel azonos módon, az ELTE 250 MHz-es Bruker Avance DRX spektrométerén végeztük. A spektrumok feldolgozása a Mestre-C programmal történt [176], referenciaként a DSS szolgált, mely még igen erősen savas oldatban sem változtatja kémiai eltolódását. A p[H]-t az aktuális NMR indikátormolekula kémiai eltolódásából számítottuk a 2.26 egyenlet segítségével. Az NMR-pH adatsorok együttes kiértékelése az OPIUM programmal történt [177], míg a mikroállandók meghatározásához a munkacsoportunkban erre a célra fejlesztett C++-programot használtuk.
3.2 Ciklodextrinekkel való kölcsönhatás vizsgálata 3.2.1 Anyagok A 3.1.1 fejezetben felsorolt anyagokon kívül a β-CD-t és random metilezett származékát a Cyclolab Kft-től kaptuk.
3.2.2 Potenciometriás titrálások A 3.1.2. fejezetben már ismertetett automata titrátorral dolgoztunk állandó ionerősségnél (0,15 M) és hőmérsékleten (25,0 °C). Az elektródot 2 ml 0,005 M HCl faktorozott 0,005 M NaOH oldatának titrálásával kalibráltuk. A komplexstabilitási állandók meghatározásához 1-1,5 mM-nak megfelelő mennyiségű imatinibet 20% feleslegben vett HCl-ban oldottunk, majd termosztálás mellett, N2 áram alatt titráltuk 0,005 M NaOH oldattal. A titrálásokat 0-13 mM β-CD és 0-40 mM RAMEB jelenlétében megismételtük. A mért titrálási görbéket Barcza Lajos által írt nemlineáris paraméterillesztő szoftver segítségével értékeltük ki.
53
3.2.3 Fázis-oldhatósági vizsgálatok A β-CD-nek a semleges imatinib-bázisra kifejtett oldhatóságnövelő hatását Higuchi és Connors módszerével vizsgáltuk. Méréseinkhez 10,5 pH-jú Na2CO3 oldatot használtunk, amely biztosította az imatinib teljesen deprotonált formájának eléréséhez szükséges pH-t, de még nem volt elég lúgos a β-CD ionizációjának (pKa = 12,2) megindulásához. Feleslegben vett (2 mg) imatinib különböző β-CD koncentrációjú (0-13 mM) 1,00 ml-es szuszpenzióit 25,0 ± 0,5 ºC -on két napig rázattuk. Az egyensúly beállta után a mintákat szűrtük, majd az imatinib koncentrációját 256 nm-en spektrofotometriásan határoztuk meg Jasco V-550 készüléken.
3.2.4 Tömegspektrometria Az MS méréseket Perkin Elmer Sciex API 2000 hármas kvadrupól spektrométeren végeztük, elektrospray ionizációt alkalmazva. 300 ºC forrás hőmérsékletet és 5 kV mintafeszültséget (probe voltage) alkalmaztunk, pozitív ion üzemmódban. Nitrogént alkalmaztunk mind porlasztó-, mind függönygázként. 10 µl mintaoldatot {1 mM imatinib, 2 mM β-CD, acetát pufferben} injektáltunk és a spektrumot a 1001800 m/z tartományban regisztráltuk. Az ESI-MS kísérletben a komplexálatlan imatinib intenzív csúcsa 494 m/z-nél jelentkezett, a feltételezett komplexet 600 m/z − 1800 m/z tartományban vizsgáltuk.
3.2.5 NMR spektroszkópia A ciklodextrines 1H NMR titrálásokat 600 MHz-es Varian Inova spektrométeren végeztük. Annak érdekében, hogy a ciklodextrin csak az imatinibbel lépjen kölcsönhatásba, az irodalomból ismert metanolt használtuk belső referensként (δ = 3,34 ppm) [178]. A spektrumokat T = 25,0 ± 0,1 ºC-on, számított mennyiségű NaCl hozzáadásával I = 0,15 M mellett regisztráltuk. Minden titrálási pontban 1 mM imatinibet tartalmazó acetátpuffer, valamint 12 mM ciklodextrint és 1 mM imatinibet tartalmazó törzsoldat megfelelő arányú elegyítésével készítettünk mintát. A titrálásokat pH* = 5,4 és pH* = 3,5 oldatokban végeztük 10 V/V% D2O jelenlétében.
54
pH* = 5,4 oldatokban az imatinib monokationos (HI+) formájának részaránya 96%, míg pH* = 3,5-nél az 55%-ban jelenlévő dikationos forma (H2I2+) dominál az egyaránt 22−22 %-ban jelenlevő mono- (HI+) és trikationos (H3I3+) forma felett. Tekintettel az imatinib kedvezőtlen oldhatóságára, pH* = 5,4-nél koncentrációját mindkét törzsoldatban 0,2−0,5 mM-ra csökkentettük. A H2O jelének csökkentésére az előtelítés (presaturation) módszerét, vagy a kettős spin-echo alapján működő dpfgse pulzusprogramot alkalmaztuk. A titrálási görbékből az OPIUM-programmal számítottuk ki a stabilitási állandókat, valamint a különböző töltésű komplexnek megfelelő kémiai eltolódásokat. A zárványkomplex szerkezetének meghatározására 2D ROESY spektrumot készítettünk {1 mM β-CD, 2 mM imatinib, pH* = 5,4} D2O oldatban, 3-kHz spinlock teret alkalmazva 350 ms keverési idővel, 32 tranziens 256 inkrementummal.
3.3 Liposzómákkal való kölcsönhatások vizsgálata 3.3.1 Anyagok, liposzómák előállítása A 3.1.1 fejezetben felsorolt anyagokon kívül a liposzómák készítéséhez használt dipalmitoil-α-L-foszfatidilkolint (DPPC), a spinjelölő 5-doxil- (Dox-5) és 16-doxilsztearinsavat (Dox-16) a Sigmától, az 1-palmitoil-2-sztearoil-(5-doxil)-sn-glicero-3foszfatidil-kolint (Dox-5-PSPC) az Avanti Polar-Lipids-től vásároltuk. MLV-k előállítása. A multilamelláris liposzómák előállítása vékonyréteg hidra-
tációs technikával történt. 10,0 mg DPPC és 0,5 mg imatinib keverékét (kontroll minta esetén imatinib nélküli DPPC-t) abszolút etanolban (∼100 µl) oldottuk. A szerves oldószert nitrogénárammal távolítottuk el, majd az esetleges oldószermaradványok eltávolítása érdekében a mintákat kétszer 15 percig vákuumszivattyúra tettük és egy éjszakán át exszikkátorban tartottuk. A hidráló foszfátpufferek pH-ját 5,2 és 9,0-re állítottuk be. A vékony lipidfilmeket a DPPC fő fázisátalakulási hőmérséklete fölött ~ 50 oC-on 1,00 ml pufferben hidráltuk, így a kész szuszpenzió lipidkoncentrációja 10 mg/ml, imatinibet is tartalmazó liposzómák esetén a lipid/imatinib mólarány 13:1.
55
SUV-ok előállítása. Annak érdekében, hogy homogén méreteloszlású, egyetlen
kettős membránnal határolt, 100 nm-nél kisebb hidrodinamikai átmérőjű liposzómákat kapjunk, az előállított MLV-ket kétszer 10 perces ultrahangos kezelésnek vetettük alá Soniprep 150 MSE készüléken. Az alkalmazott ultrahang frekvenciája 20 kHz, a hullám amplitúdó 8 µm volt. A kezelést 50 °C-on végeztük, a kezelések között 10 perces szünetet tartottunk.
3.3.2 Bezárási hatásfok meghatározása Az egyaránt 1 mM imatinibet tartalmazó MLV-k és SUV-ok frissen készült szuszpenziójának 400 µl-ét 10 kDa-nál levágó Microcon YM-10 szűrőn (Millipore) keresztül Eppendorf centrifugában 20 percig szűrtük (11000 rpm fordulatszám). A szűrletben lévő, azaz a liposzómán kívüli imatinib mennyiséget spektrofotometriásan (Unicam 2 UV-látható spektrofotométer) 270 nm-en határoztuk meg. A bezárási hatásfok meghatározásához az 1 mM imatinibet tartalmazó hidrálópuffer szolgált referenciaként (100%), az imatinib lipidek nélküli alacsony vízoldhatósága miatt a hidrálópuffert és a szűrletet azonos mennyiségű etanollal hígítottuk.
3.3.3 DSC vizsgálatok A DSC vizsgálatokhoz alkalmas MLV szuszpenziót 10 mg lipid 50 µl hidráló pufferben történő diszpergálásával készítettük. A mintákat a megfelelő homogenitás elérése érdekében többször is lefagyasztottuk cseppfolyós nitrogénben, majd a fő fázisátalakulási hőmérsékletük fölé engedtük fel. Imatinibet is tartalmazó minták esetén a hatóanyagot a lipiddel együtt oldottuk abszolút etanolban, a lipid/imatinib mólarány 10/1 volt. Az MLV diszperziók 5-8 mg-ját 40 µl-es hermetikusan zárható alumínium kapszulákba helyeztük. A termogramokat Du–Pont 990 készüléken 25–50 o
C hőmérséklettartományban, 5 oC/perc fűtési sebességgel és 5 mV/cm érzékenység
mellett regisztráltuk. A fázisátalakulási hőmérsékletek meghatározása 3 párhuzamos kísérlet alapján történt.
56
3.3.4 ESR spektroszkópia Az ESR mérésekhez a minták készítése annyiban tért el az általánosan alkalmazott módszertől, hogy a különböző spinjelölőket (Dox-5, Dox-16, Dox-5-PSPC) a lipiddel és imatinibbel egyszerre oldottuk az etanolban úgy, hogy a spinjelölő/lipid mólarány 1/100 legyen a kész liposzómákban. Az előállított minta 20 µl-ét kvarckapillárisba tettük és egy speciális mintatartó segítségével az ESR-spektrométer mérőcellájában centráltan helyeztük el. A spektrumokat Bruker-EMX-6 online, Xsávú (9-10 GHz) spektrométerrel regisztráltuk. Az alkalmazott modulációs frekvencia 100 kHz, a modulációs amplitúdó pedig alkalmazott mérési hőmérséklettől és spinjelölőtől függően 0,3-2,0 Gauss volt. A spektrumokat adott hőmérsékleten 15 mW mikrohullámú teljesítmény mellett, 100 G-os ablakban, 167,77 ill. 335,5 s-os felvételi idővel, maximálisan 5,12 ms-os időállandót alkalmazva 2048 ponttal vettük fel. A minta hőmérsékletének mérésére egy ultravékony termoelemet használtunk, amit közvetlenül a mintába helyeztünk, a rezonátor közepétől mintegy 1,5 cm-re. A hőmérséklet változtatására egy speciális, zárt rendszerű, nitrogén-átáramoltatással működő szabályozó szolgált. A liposzómák hőmérsékletét a 2-50 °C hőmérséklettartományban változtattuk 0,1 °C-os pontossággal. A membránfluiditás jellemzésére Dox-5 és Dox-5-PSPC alkalmazása során a külső csatolási állandót (2Amax), Dox-16 esetén pedig az alacsonyterű és a centrális jelek amplitúdóinak hányadosát (h+1/h0) használtuk.
3.3.5 Fagyasztva-törés, transzmissziós elektronmikroszkópia A liposzómákat az általános előállítási eljárás szerint készítettük (lásd: 3.3.1. fejezet). A minták 1-2 µl-es részleteit azonos hőmérsékletű (25 oC) arany mintatartó lemezre cseppentettük, amiket azonnal cseppfolyós nitrogénnel hűtött, részben szilárd freonba merítve pillanatszerűen megfagyasztottunk. A minták törését −110 o
C-on Balzers típusú fagyasztva törő berendezéssel végeztük. A fagyasztva tört
felületet 30 s-on át −100 oC-on marattuk, majd 45o-os szögben egyirányú Pt/szén bevonattal láttuk el. A minta így készült replikáit desztillált vízbe történő merítéssel távolítottuk el a mintatartóról és hagyományos detergensek segítségével tisztítottuk.
57
A tisztított replikákat rézhálóra helyeztük és JEOL JEM-100 CX II típusú transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) vizsgáltuk.
58
4 Az eredmények és értékelésük 4.1 Protonálódási állandók meghatározása 4.1.1 A komponens vegyületek makro- és mikroállandóinak meghatározása A vizsgált származékok (melyek szerkezete az imatinib 21-es és 22-es atomjai közti savamidkötés formális bontásával vezethető le, 4.1. ábra), a sav-bázis egyensúlyok szempontjából az alapvegyület redukált csoportszámú analógjainak tekinthetők. 9 8
10
6 1
5
N 11
7
4N
N2
20
1
CH3
3 13
HN
15 14
27
29
36 35
N 31
21
H2N
22
O 23
17
34
32
26
24
33
25
16
19
30
28
12
N
37
CH3
2
18 21
NH2
4.1. ábra. A két komponens vegyület szerkezete, kiemeléssel a sav-bázis funkciós csoportok
A komponens vegyületek számozására a könnyebb összehasonlítás végett választottuk azt a módszert, hogy az imatinib megfelelő atomjai a származékokban ugyanazt a számot kapják. A modellvegyületek szisztematikus kémiai elnevezése: 4metil-N-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-il)-fenilén-1,3-diamin (1) illetve 4-(4-metilpiperazin-1-ilmetil)-benzamid (2). Az 1-es molekula 3 protonálható csoporttal rendelkezik: az imatinibben is meglévő fenilamino-pirimidin molekularészlettel (N2, N4 és N13), a piridingyűrű aromás nitrogénjével (N11), valamint az imatinibben protolitikusan inaktív savamidkötésben lévő, jelen vegyületben viszont bázikus primer aromás amin N21-es
59
nitrogénnel (4.1. ábra). A 2-es molekula az alapvegyület két bázikus csoportját hordozza: a piperazin gyűrű tercier N31-es és N34-es jelű nitrogénjeit.
4.1.1.1
Potenciometriás titrálások
Az 1-es modellvegyület oldhatósága 1 ill. 2 mM-os oldatának titrálását tette lehetővé a potenciometriával megbízhatóan vizsgálható 2 ≤ pH ≤ 12 tartományban, míg a 2-es vegyület esetén 10 mM-ban is elvégezhető volt a titrálás csapadékkiválás nélkül. Az elektród kalibrálására felvett erős sav/erős bázis titrálási görbét Gran módszerével linearizáltuk az ekvivalenciapont pontos lokalizálására [179], kiszámítottuk a lúgoldat nehezen kiküszöbölhető karbonátszennyezést (kb. 1%), valamint megállapítottuk az üvegelektród lineáris válaszjelének p[H] tartományát. A bővített Nernst egyenlet (2.9) paramétereit a PROTC program [174] segítségével határoztuk meg. A potenciometriás titrálásokból számított Bjerrum görbéket a 4.2. ábra mutatja.
Átlagosan kötött protonok száma, n H
2,5 1 2,0
1,5 2 1,0
0,5
0,0 2
3
4
5
6
pH
7
8
9
10
11
4.2. ábra. A két komponens vegyület potenciometriás titrálási görbéjéből számított Bjerrum görbék
Az ábráról leolvasható, hogy a pH = 2−12 tartományban mindkét vegyület 2 protont vesz fel, az 1-es molekula harmadik protonálódási lépése ennél savasabb oldatban játszódik le. A protonálódási makroállandók számításához szintén a
60
legkisebb négyzetek elve szerint nemlineáris paraméterillesztést végző PROTC programot alkalmaztuk. A potenciometriával meghatározott makroállandókat a 4.2 táblázatban foglaltuk össze. 4.2. táblázat. A komponens vegyületek potenciometriával meghatározott protonálódási makroállandói (T = 25,0 ± 0,01°C; I = 0,15 M)
4.1.1.2 1
vegyület
log K1
log K2
log K3
1
4,75 ± 0,01
3,72 ± 0,01
<2
2
7,95 ± 0,01
3,37± 0,02
−
1
H NMR-pH titrálások
H NMR-pH titrálás in situ pH méréssel. Az egycsöves titrálás során
alkalmazott in situ pH-mérésnek előfeltétele, hogy a megfelelő indikátormolekula
δInd és δHInd határeltolódásai, valamint log KInd protonálódási állandója pontosan ismertek legyenek, ugyanis a (2.26) egyenlet segítségével csak ezen paraméterek ismeretében számítható a titrálás tetszőleges pontján felvett NMR spektrumhoz tartozó pH. Az alábbi táblázatban foglaljuk össze a független potenciometriás mérésekkel meghatározott indikátor protonálódási állandókat, melyek jó egyezést mutatnak korábbi irodalmi adatokkal. 4.3. táblázat. Az indikátormolekulák protonálódási állandói, a megbízhatóan alkalmazható pH tartomány és a kémiai határeltolódások [ppm] (T = 25,0 ± 0,01°C; I = 0,15 M NaCl)
log KInd
alkalmazható pH-intervallum
δInd
δHInd
diklórecetsav
1,14
0 – 2,2
6,055
6,345
klórecetsav
2,70
1,6 – 3,8
4,049
4,280
ecetsav
4,51
3,6 – 5,6
1,907
2,086
Tris
8,13
7,0 – 9,2
3,509
3,733
pH indikátormolekula
61
A diklórecetsav esetében még pH = 0 esetén sem sikerült elérni a teljes protonálódást, így a következő meggondolásokat tettük. A korábban 1 M ionerősségre közölt log KInd = 1,06 ± 0,01 protonálódási állandót [97] a Davies-egyenlet [180] segítségével az általunk alkalmazott 0,15 M ionerősségre számítottuk át: log KInd = 1,14.
δHInd értékét pedig különböző ionerősségnél felvett spektrumok 1H NMR spektrumok összehasonlításával 6,328 ppm-ről 6,345 ppm-re korrigáltuk. Az indikátorok határeltolódásai a legkülönbözőbb vegyületek (1, 2, imatinib, valamint aminosavak és heterociklusok) NMR titrálásakor a kísérleti hiba (±0,002 ppm) határán belül maradtak. Ezzel bizonyítottnak tekintettük az indikátormolekulák alkalmazhatóságának azon feltételét is, miszerint semmilyen specifikus kölcsönhatás nem léphet fel a vizsgált vegyület és az indikátormolekula között. A 2-es modellvegyület 1H NMR-pH titrálása. A 4.3. ábrán a 2-es vegyület 250
MHz 1H NMR spektruma látható 4,80 pH-jú oldatban.
4.3. ábra. 2-es vegyület 250 MHz 1H NMR spektruma pH = 4,80 oldatban. A *-gal jelölt szingulettek az indikátormolekula klórecetsav (4,050 ppm) és tris (3,733 ppm) jelei.
62
10
pH
9
H25 H29
H26 H28
H30
10
H33 H32 H35 H36
9
8
8
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
H37
1
7,8
4,8
7,4
4,4
4
3,6
3,2
δ (ppm)
2,8
2,4
2
4.4. ábra. A 2-es vegyület 500 MHz-es 1H NMR-pH titrálási görbéi
A spektrum aromás tartományában a para-diszubsztituált vegyületekre jellemző AA’BB’ multiplett struktúra látható. A két nem-ekvivalens amid proton egy-egy széles szingulettet ad 8,1 és 7,3 ppm-nél pH < 7 oldatokban. Lúgos oldatban ezek a jelek teljesen eltűnnek a bázikus közegben gyorsan lejátszódó amid protonok cseréjének következtében. A spektrum alifás tartományában a piperazin metilénprotonjainak két, a konformációs mozgások miatt kiszélesedett szingulettje látható, melyek erősen savas ill. lúgos oldatokban egyetlen széles jellé olvadnak össze. A 4.4. ábra a 2-es vegyület szénkötésű protonjainak pH-függő kémiai eltolódásait ábrázolja. A 2.24 egyenlet kétcsoportos ligandumra felírt formájából, amely szerint egy adott mag kémiai eltolódása a különböző protonáltságú formák egyedi kémiai eltolódásainak móltörtekkel súlyozott átlaga, a móltörteket a K protonálódási állandó logaritmusa és a pH segítségével kifejezve az alábbi illesztőfüggvényhez jutunk: δ
mért
=
δL + δHL+ 10 logK1 − pH + δH L2+ 10 logK1 + logK 2 − 2 pH 1 + 10
logK1 − pH
2
+ 10
logK1 + logK 2 − 2 pH
(4.42)
A 4.42 egyenlet az összes szénkötésű hidrogénre érvényes. A potenciometriával mért makroállandókat konstans értéken tartva az OPIUM programmal végzett paraméterbecsléssel határoztuk meg a részecskék δL , δHL+ és δH L2+ egyedi kémiai 2
eltolódásait (lásd: 4.4 táblázat).
63
4.4. táblázat. A 2-es molekula különböző protonáltsági formáinak 1H NMR kémiai eltolódásai [ppm], valamint ezek változása a protonálódás hatására (T = 25,0 ± 0,01°C; I = 0,15 M NaCl)
δL
∆10δ
δ HL
∆21δ
δH L
H25, H29
7,805 (2)a
0,022 (3)
7,827 (2)
0,095 (3)
7,922 (2)
H26, H28
7.475 (2)
0,022 (3)
7,497 (2)
0,166 (3)
7,663 (2)
H30
3,615 (8)
0,15 (1)
3,768 (7)
0,81 (1)
4,579 (9)
H32, H36
2,49 (1)
0,35 (1)
2,84 (1)
0,87 (2)
3,71 (2)
H33, H35
2,48 (1)
0,76 (1)
3,24 (1)
0,44 (2)
3,68 (2)
H37
2,197 (8)
0,63 (1)
2,831 (7)
0,20 (1)
3,034 (9)
NMR-mag
a
+
2
2+
A zárójelben megadott hibabecslés az utolsó értékes jegyre vonatkozik
A protonálódás hatására bekövetkező kémiai eltolódás változások ( ∆10δ =
δ HL − δ L és ∆21δ = δH L − δHL ) a molekula protonálódási útvonaláról nyújtanak +
2+
2
+
információt. Minél közelebb helyezkedik el egy szénkötésű hidrogén a bázikus centrumhoz, kémiai eltolódása annál nagyobb változást szenved protonálódáskor [125]. 2-es vegyületünk esetében az első proton N34-es tercier nitrogénre történő felvétele a (log K1 = 7,95) a H33, H35 és az N-metil H37 magokon okozza a legnagyobb, 0,76 és 0,63 ppm kémiai eltolódás változást. A N31 protonálódása (log K2 = 3,37) a közeli H30-as és a H32, H36-os metiléneken hoz létre jelentős, ∆21δ = 0,81 ppm és 0,87 ppm változást. Az 1-es modellvegyület 1H NMR-pH titrálása. A 4.5. ábrán az 1-es vegyület
250 MHz-en felvett 1H NMR spektruma látható 4,10 pH-jú oldatban. A spektrum aromás tartománya még 250 MHz-en is döntően elsőrendű csatolási képet mutat, így az asszignáció könnyen elvégezhető.
64
9.00
8.50
8.00
7.50
4.5. ábra. 1-es vegyület 1H NMR spektruma pH = 4,10 oldatban.
Az 1-es vegyület 3 proton felvételére képes, így a titrálási adatok kiétékeléséhez a 2.24 egyenlet háromcsoportos ligandumra felírt formáját használjuk: δ
mért
=
δL + δHL+ 10 logK1 − pH + δH L2+ 10 logK1 + logK 2 − 2 pH + δH L3+ 10 logK1 + logK 2 + logK 3 −3pH 1 + 10
logK1 − pH
2
+ 10
logK1 + logK 2 − 2 pH
3
+ 10
logK1 + logK 2 + logK 3 −3pH
(4.43)
A számítás eredményeként megkapjuk a harmadik, potenciometriával nem meghatározható protonálódási állandó értékét: log K3 = 1,16 ± 0,03, illetve a HiL részecskék egyedi kémiai eltolódásait ( δ Hi L,k ) minden vizsgált magra (4.5. táblázat). A 4.6. ábrán látható NMR-pH titrálási görbéken két protonálódási lépcsőt különböztethetünk meg. A első szigmoid szakasz, amely minden NMR-pH titrálási profilon paramágneses irányú eltolódást mutat a 6 > pH > 2,3 intervallumban, az első két proton felvételét tükrözi. A 4.5. táblázat ∆δ értékeit felhasználva a két, átfedően protonálódó csoport protonálódási sorrendje is megállapítható. Az első proton felvétele az N21 amino csoporton történik, ezt legérzékenyebben a fenilgyűrű H19, H17 és H16-os hidrogénjei mutatják. A legnagyobb ∆21δ értékek a H8, H9, H10 és H12 hidrogéneken figyelhetők meg, melyek döntően a piridin N11-es nitrogénjének protonálódását érzékelik. Annak ellenére, hogy a fő protonálódási útvonal az N21→N11, az alternatív N11→N21 útvonal sem hagyható figyelmen kívül. Mivel az első két protonálódási lépés átfedő pH tartományban megy végbe, ezért K1 és K2 közvetlenül nem jellemzi a piridin N11 (P) és az amino N21 (A) csoportok egyedi bázicitását, a csoportspecifikus leíráshoz mikroállandókra van szükség.
65
H12
7,0
H10
H5 H8
H9
H6
19 H17 H16 H
H20
6,0 5,0
pH
4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 -1,0 9,4
9
8,6
8,2
7,8
δ (ppm)
7,4
7
6,6
2,4
2
4.6. ábra. Az 1-es vegyület 1H NMR-pH titrálási görbéi
4.5. táblázat. Az 1-es molekula különböző protonáltsági formáinak 1H NMR kémiai eltolódásai [ppm], valamint ezek változása a protonálódás hatására (T = 25,0 ± 0,01°C; I = 0,15 M NaCl)
proton
δL
∆10δ
δ HL
+
∆21δ
δH L 2
2+
δH L
∆32δ
3
3+
H5
8,376 (2)a 0,077 (7) 8,453 (5) 0,104 (7) 8,557 (2) 0,033 (4) 8,590 (3)
H6
7,25 (1)
0,09 (2)
7,34 (2)
0,17 (2)
7,510 (7) 0,10 (1)
H8
8,338 (6)
0,17 (1)
8,51 (1)
0,65 (1)
9,165 (5) 0,112 (9) 9,277 (7)
H9
7,565 (6)
0,14 (1)
7,70 (1)
0,53 (1)
8,228 (5) 0,077 (9) 8,305 (7)
H10
8,629 (6)
0,06 (1)
8,69 (1)
0,24 (1)
8,929 (5) 0,122 (9) 9,051 (7)
H12
9,024 (6)
0,09 (1)
9,11 (1)
0,29 (1)
9,401 (5) 0,121 (9) 9,522 (7)
H16
7,160 (6)
0,28 (1)
7,44 (1)
0,08 (1)
7,518 (5) 0,137 (9) 7,655 (7)
H17
6,705 (6)
0,44 (1)
7,14 (1)
0,12 (1)
7,265 (6) 0,24 (1)
7,502 (7)
H19
6,953 (6)
0,60 (1)
7,55 (1)
0,02 (1)
7,567 (6) 0,29 (1)
7,858 (8)
H20
2,132 (6)
0,15 (1)
2,28 (1)
0,04 (1)
2,318 (5) 0,050 (9) 2,368 (7)
a
7,609 (9)
A zárójelben megadott hibabecslés az utolsó értékes jegyre vonatkozik
66
A 4.7. ábra az 1-es komponens vegyület makro- és mikroszkopikus protonálódási egyensúlyait mutatja, ahol k A , k P , k PA és k AP mikroállandók a piridin és amino funkciókhoz rendelhetők. Ezen mikroállandók értékeinek meghatározásához szelektív protonálódási szenzormagokat kell kiválasztani. A piridin gyűrű aromás protonjai több, mint 9 kovalens kötés távolságra vannak az aminocsoport N21 nitrogénjétől, így bármelyikük szelektívnek tekinthető a piridin N11 protonálódásának követésére. A H9 kémiai eltolódásából a piridin nitrogén protonáltsági foka (fP) számítható, amely lehetővé teszi k P számítását a következő egyenlet segítségével: fP =
δHmért − δL, H 9 9 δH L2+ , H 9 − δL, H 9 2
10 log k − pH + 10 logK1 + logK 2 − 2 pH = 1 + 10 logK1 − pH + 10 logK1 + logK 2 − 2 pH P
(4.44)
A számítás log k P =4,07 értéket eredményezett. Ennek, valamint a potenciometriával meghatározott K makroállandók ismeretében a (2.28) és (2.29) egyenletek alkalmazásával kiszámíthatjuk a további 3 mikroállandót, melyeket a 4.6. táblázatban foglaltunk össze. A log k P mikroállandót a H8 vagy H10 kémiai eltolódásából is kiszámítottuk, az így kapott log k P értékek csak 0,01-dal térnek el a fenti kiértékelés eredményétől. A mikroállandók megbízhatóságának további ellenőrzésére k A mikroállandót is kiszámítottuk a H16, H17 és H19 NMR titrálási görbéiből melyenek eredményeként log k N értéke rendre 4,64, 4,65 és 4,71-nek adódott. Az amino és piridin nitrogének kölcsönhatási tényezőjének értéke, log k P - logk AP , illetve log k A - logk PA = 0,25 a csoportok közti gyenge kölcsönhatásra utal. Ez a
kölcsönhatás egyébként az imatinib alapvegyületben nem jelenik meg, hiszen az aminocsoport N21 nitrogénje imatinib esetén savamidkötésben van. Az NMR-rel meghatározott log K3 = 1,16 makroállandó jelentősen kisebb az első kettőnél, így a harmadik protonálódási lépés jó közelítéssel rendelhető egyetlen csoporthoz. A 4.5. táblázatban szereplő ∆32δ értékek közül kiemelkednek a H17 és H19 magokra mért értékek, eszerint az utolsó H+ felvétele az N13 szekunder amint érinti.
67
L
K1
HL P
9 8
1
4
N2
20
CH3
3 13
HN
2+
H2L
K3
3+
H3L
H
15 14
16
17
19 18
kA P
kP
N 11
7 12
N
K2
10
6 5
+
P F A
PA
L
H
k FPA
H
kA
NH2
PFA H H H
k PA
A H
21
4.7. ábra. Az 1-es vegyület makro- és mikroszkopikus protonálódási sémája. P a piridin N11, A az amino N21, F a fenilamino-molekularészletet jelöli
4.6. táblázat. Az 1-es molekula 1H NMR-pH titrálással meghatározott protonálódási mikroállandói (T = 25,0 ± 0,01°C; I = 0,15 M NaCl)
N11 mikroállandói
N21 mikroállandói
log k P
4,07 ± 0,04
log k A
4,65 ± 0,01
log k AP
3,82 ± 0,02
log k PA
4,40 ± 0,04
fenilamino-pirimidin F log k PA
1,16 ± 0,03
4.1.2 Az imatinib makro- és mikroállandóinak meghatározása 4.1.2.1
Potenciometria vizes közegben
Az imatinib pH-metriás titrálását 1-5 mM koncentrációknál végeztük el. A titrálásokból számított Bjerrum függvény a 4.8. ábrán látható, a meghatározott állandókat a 4.7. táblázat tartalmazza. Az első protonálódási állandó csak igen nagy bizonytalansággal volt meghatározható, ugyanis pH > 6,5 oldatban még 1 mM imatinib koncentráció esetén is csapadékkiválást tapasztaltunk, ami a Bjerrumgörbén is jól látható torzulást okoz. Mivel 7-nél magasabb protonálódási állandóval csak az imatinib és a 2-es komponens vegyület rendelkezik, így az imatinib log K1 makroállandója jó közelítéssel rendelhező a piperazin N34 atomjához.
68
Átlagosan kötött protonok száma, n H
4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 2
3
4
5
6
pH
7
8
9
10
11
4.8. ábra. Az imatinib potenciometriás titrálási görbéjéből számított Bjerrum-görbe
4.7. táblázat. Az imatinib potenciometriával meghatározott protonálódási makroállandói (T = 25,0 ± 0,1°C; I = 0,15 M) log K1
log K2
log K3
log K4
7,7 ± 0,1
3,88 ± 0,03
3,10 ± 0,02
>2
Az imatinib legsavasabb csoportjának protonálódási állandója – az 1 modellvegyülethez hasonlóan – pH-metriával csak nagy hibával határozható meg, ezért itt is 1
H NMR titrálást alkalmaztunk in situ pH méréssel.
4.1.2.2
Potenciometriás titrálás metanol-víz elegyben
A vizes közegű potenciometriás titrálás esetén tapasztalt csapadékkiválás az imatinib utolsó töltést okozó protonjának disszociációjakor következik be, hiszen a protonálatlan, töltésmentes forma oldhatósága a előlísérleteink alapján a millimólos koncentrációtartomány alatt van. A titrálást metanol-víz elegyekben megismételve viszont az imatinib szélesebb pH tartományban oldatban marad, így log K1 értéke feltehetően kisebb hibával határozható meg a Yasuda-Shedlovsky szerinti lineáris extrapoláció segítségével. A titrálásokat 28,0 m/m%, 34,4 m/m% és 43,3 m/m% metanoltartalomú elegyekben végeztük el. A 2.21 egyenlet alapján tiszta vizes közegre extrapolált érték log K1 = 7,51 ± 0,02. 69
9,30 9,25
logsK1 + log[H2O]
9,20 9,15 9,10 9,05 9,00 8,95 8,90 8,85 12
13
14
15
16
17
18
1/ε·1000
4.9. ábra. Yasuda-Shedlovsky extrapoláció az imatinib első protonálódási állandójának meghatározására. A három különböző metanoltartalmú oldatból a vizes közegre (1/ε·1000 = 12,829) extrapolált logsK1 + log[H2O] = 9,257, melyből log K1 = 7,51 ± 0,02
A vizes közegben is kellő pontossággal mérhető log K2 és log K3 értékét nem volt szükséges extrapolációval meghatározni, míg az igen alacsony log K4 érték az oldószerelegy dielektromos permittivitásának csökkenésével a pH-metriásan még nehezebben vizsgálható erősen savas tartományba tolódik. 1
4.1.2.3
H NMR-pH titrálás
Az imatinib NMR titrálását állandó 3 mM-os koncentrációnál, pH < 6 oldatokban végeztük, hogy elkerüljük a csapadékkiválást. A 4.10. ábrán az imatinib NMR spektrumának aromás és alifás tartománya látható 2 kiválasztott pH-n. A piperazin metiléncsoportjainak jelei 3 és 4 ppm közti tartományban az alapvonalig kiszélesedtek, így ezeket nem tudtuk bevonni a közös értékelésbe. pH H
H19
H12
H
8
H
10
H
Tris
H2O
H26 H28
H25 H29
5
16
H37
H6 H
9
H
ecetsav
17
H20
klórecetsav
H30
4,24
H12
H5 H10 H
H26 H28
H25 H29
H37
H6 19
H
8
ecetsav
Tris
H20
H16
H9
H17 klórecetsav
H30
1,56 9,6
9,2
8,8
8,4
8
δ (ppm)
7,6
7,2
6,8
4,8
4,4
4
3,6
3,2
δ (ppm)
2,8
4.10. ábra. Az imatinib 1H NMR spektruma pH=1,56 és pH=4,24 oldatokban
70
2,4
2
A többi szénkötésű proton pH-függő kémiai eltolódását a 4.11. ábrán mutatjuk be. A görbék kiértékelése során az egyszeresen protonált imatinib (HI+) részecske három lépcsős H+-felvételét vettük alapul. Az összes mag NMR-pH adatsorára történő szimultán nemlineáris regresszió során a pH-metriás titrálással meghatározott K2 és K3 makroállandókat rögzítettük, az ismeretlen log K4 paraméterre 1,71 ± 0,02 érték
adódott. A protonálódás fő útvonalának megállapításában segítséget nyújtó ∆δ értékeket, valamint a különböző HiIi+ részecskék egyedi kémiai eltolódásait a 4.8. táblázatban összesítettük.
7,0
7 H12
H10
19 H5 H8 H
6,0
H25 H29
H26 H9 H16 H17 H28 H6
H37
H30
H20
6 5
4,0
4
3,0
3
2,0
2
1,0
1
0,0
0
pH
5,0
-1,0
-1 9,6
9,2
8,8
8,4
8
δ (ppm)
7,6
7,2
6,8
4,8
4,4
4.11. ábra. Az imatinib 1H NMR-pH titrálási görbéi
71
4
3,6
3,2
δ (ppm)
2,8
2,4
2
4.8. táblázat. Az imatinib különböző protonáltságú formáinak 1H NMR kémiai eltolódásai [ppm], valamint ezek változása a protonálódás hatására (T = 25,0 ± 0,01°C; I = 0,15 M NaCl)
mag δ HL+
∆21δ
δH L 2
2+
∆32δ
δH L 3
3+
∆43δ
δH L 4
4+
H5
8,154 (6)a 0,35 (1) 8,500 (9)
0,03 (1) 8,528 (5)
0,017 (8)
8,544 (4)
H6
7,004 (6) 0,42 (1) 7,417 (9)
0,03 (1) 7,451 (5)
0,371 (8)
7,822 (4)
H8
8,105 (6) 0,90 (1) 9,000 (9)
0,14 (1) 9,140 (5)
0,182 (8)
9,322 (4)
H9
7,208 (6) 0,84 (1) 8,048 (9)
0,12 (1) 8,170 (5)
0,140 (8)
8,310 (4)
H10 8,341 (6) 0,47 (1) 8,815 (9)
0,08 (1) 8,893 (5)
0,153 (8)
9,046 (4)
H12 8,766 (6) 0,55 (1) 9,314 (9)
0,08 (1) 9,398 (5)
0,180 (8)
9,578 (4)
H16 7,113 (6) 0,23 (1) 7,345 (9)
0,09 (1) 7,433 (5)
0,125 (8)
7,558 (4)
H17 6,992 (6) 0,25 (1) 7,246 (9)
0,08 (1) 7,332 (5)
0,224 (8)
7,556 (4)
H19 7,833 (6) 0,04 (1) 7,868 (9)
-0,04 (1) 7,830 (5)
-0,053 (8) 7,777 (4)
H20 2,080 (6) 0,18 (1) 2,257 (9)
0,03 (1) 2,287 (5)
0,059 (8)
2,346 (4)
H25 7,628 (6) 0,27 (1) 7,900 (9)
0,09 (1) 7,992 (5)
0,022 (8)
8,013 (4)
H26 7,358 (6) 0,22 (1) 7,578 (9)
0,12 (1) 7,696 (5)
0,027 (8)
7,724 (4)
H37 2,850 (6) 0,07 (1) 2,917 (9)
0,12 (1) 3,034 (5)
0,011 (8)
3,045 (4)
H30 3,66 (1)
0,59 (1) 4,59 (1)
0,02 (1)
4,612 (9)
a
0,34 (1) 4,00 (2)
A zárójelben megadott hibabecslés az utolsó értékes jegyre vonatkozik A 4.12. ábra az imatinib protonálódási sémáját ábrázolja. Míg az első proton
felvétele a piperazin N34 atomjára történik (A jelű csoport), a következő proton koordinációjára két alternatív útvonal lehetséges. Az egyik a piridin N11 atomjának protonálódásával keletkező PA, a másik a piperazin N31 atomján protonált AB mikrorészecske keletkezéséhez vezet. A k AP mikroállandó meghatározásához H10 mag NMR-pH profilját választottuk, ez a hidrogén szelektívnek tekinthető a piridin N11 protonálódásának követésére. Az 1-es komponens vegyületnél már részletezett kétcsoportos számítási modell a 4.9. táblázatban bemutatott mikroállandókhoz vezetett. A H12 NMR-pH görbéjének kiértékelésével számított állandók hibahatáron belül megegyeztek a táblázatban feltüntetett értékekkel. A mikroállandók ismere-
72
tében megállapítható, hogy a piridin nitrogén (N11) 3,8-szer bázikusabb, mint a piperazin B jelű (N31) nitrogénje. Ez utóbbi állítás első pillantásra meglepőnek tűnhet, hiszen egy heteroaromás nitrogén bázicitás óriási irodalom tükrében nagyságrendekkel kisebb egy szekunder, aliciklusos nitrogénatoménál. Az N31 bázicitásának értelmezésekor azonban figyelembe kell venni a „szomszédságában”, ugyanazon a piperazingyűrűn elhelyezkedő, már protonált A jelű nitrogént, amelynek pozitív töltése a B-n történő újabb protonálódást, töltés-felhalmozódást elektrosztatikus okokból kedvezőtlenné teszi. Valójában tehát a k AB mikroállandó a B nitrogén bázicitását a protonált A csoport jelenlétében jellemzi. K1
I
HI
K2
+
H2I
2+
K3
H3I
3+
K4
H4I
4+
PA H 9 8
1
5
H
10
6
P kA
N 11
7 12
4N
N2
P F A B
20
CH3
3 13
HN
15 14
16
17
19 18 21 HN
22
30
28 27
29
26
24
L
k
A
A H
36
34
32
25
33
N
PAB H H H
B kA
35
N 31
k BPA
AB
k FPAB
PFAB H H H H
k PAB
H H
37
CH3
O 23
4.12. ábra. Az imatinib makro- és mikroszkopikus protonálódási sémája. P a piridin N11, A és B a piperazin N31 és N34 atomokat, F a fenilamino-molekularészletet jelöli
4.9. táblázat. Az imatinib 1H NMR-pH titrálással meghatározott protonálódási mikroállandói (T = 25,0 ± 0,1°C; I = 0,15 M NaCl)
N11 mikroállandói
N31 mikroállandói
log k AP
3,78 ± 0,02
log k AB
3,20 ± 0,02
P log k AB
3,78 ± 0,02
B log k PA
3,20 ± 0,02
fenilamino-pirimidin F log k PAB
1,71 ± 0,02
Az azonos csoport protonálódását leíró mikroállandók páronként megegyeznek, ami azt jelenti, hogy egyik csoport protonálódása sem csökkenti a kísérleti hibát meghaladó mértékben a másik csoport bázicitását, így ezek a mikroállandók egyúttal
73
csoportállandóknak tekinthetők. A gyakorlatilag zérus kölcsönhatási tényező nem csak a két báziscentrum (N11 és N31) egymástól való nagy kovalens távolságára utal, hanem egyúttal az imatinib merev szerkezetére is, hiszen hasonló távolságban lévő csoportok között flexibilis molekulákban 0,1–0,2 logaritmikus egység a kölcsönhatási tényezők értéke [181]. Az imatinib utolsó protonfelvétele a fenilaminoF pirimidin részlethez rendelhető, a megfelelő log k PAB mikroállandó gyakorlatilag
egybeesik a log K4 = 1,71 makroállandóval, hasonlóan az 1 vegyületre a 4.1.1.2 fejezetben részletezett legsavasabb állandóhoz. A makro- és mikroálladók ismeretében kiszámítható a különböző mértékben protonált részecskék eloszlása a szervezet eltérő pH-jú kompartmentjeiben. A vérben (pH 7,4) az imatinib 56 %-a monokationos (HI+) formában van jelen, a proton a piperazin A jelű (N34) csoportján található. A duodénum átlagos pH = 4,6-os értékén 83 %-ban a monokationos forma dominál, míg a fennmaradó részt a dikationos forma (H2I2+) két protonáltsági izomerje teszi ki. A gyomorban (pH 2), a trikationos (H3I3+, 63%) és a teljesen protonált H4I4+ (33%) részecskék vannak jelen. 1,0 0,9 0,8
Részecskemóltört
HI+
H4I4+
I
3+
H3I
0,7 0,6
H2I2+
0,5
PA2+
0,4 0,3 0,2
AB2+
0,1 0,0 0
1
2
3
4
pH
5
6
7
8
9
4.13. ábra. Az imatinib részecskeeloszlása
Több hipotézis látott napvilágot az imatinib és a Bcr-Abl onkogén közötti lehetséges elektrosztatikus és hidrogénkötéses kontakthelyekkel kapcsolatban [43,182,183]. Corbin és munkatársai modellje [182] H-kötést feltételez az Abl kináz
74
aktív* formájának Glu258 karboxilátja, valamint az inhibitor N34 atomja között. Összhangban ezzel a feltevéssel, az utóbbi csoport általunk mért nagy bázicitása (log K = 7,5) miatt fiziológiás körülmények között jelentős hányadban protonált, tehát hidrogénkötés-donor állapotban van. Egy kristályos komplex röntgenszerkezetében a piridil N11 atom az enzim Met318 amidprotonjának akceptoraként szerepel [43], míg a fenilamin N13 atom a Thr315-től fogad hidrogénkötést [183]. Mindkét molekularészlet protonálatlan, tehát a kölcsönhatáshoz megfelelő állapotban van fiziológiás körülmények között az általunk mért bázicitásadatok szerint.
4.2 Az imatinib ciklodextrinekkel való kölcsönhatásának vizsgálata Alacsony biohasznosíthatóságú, illetve csekély oldhatósággal rendelkező hatóanyagok esetén a különböző ciklodextrinek sikerrel alkalmazhatók akár a biohasznosíthatóság növelésére, akár az oldhatóság javítására. Imatinib esetén az utóbbi cél fontosabb, hiszen már a pH-metriás titrálás során kiderült, hogy töltésmentes formájának oldásához a víznél kisebb dielektromos állandóval rendelkező metanol-víz elegyekre volt szükség. A vendégmolekulát befogadó ciklodextrinek ismert méretét, ill. potenciometriás előkísérletek eredményeit figyelembe véve a β-ciklodextrint és annak random metilezett származékát választottuk ki vizsgálatainkhoz.
4.2.1 Fázis-oldhatósági vizsgálatok A neutrális imatinib bázis szolubilizációját β-CD adagolására a Higuchi-Connors módszerrel vizsgáltuk (lásd: 3.2.3 fejezet). A 4.14. ábrán bemutatott UV-spektrumok jól illusztrálják a növekvő ciklodextrin-koncentráció hatására bekövetkező oldhatóságnövekedést.
*
Más szerzők szerint az imatinib elsősorban az enzim inaktív formájához kötődik [44].
75
1,5 12,4 mM CD
Abszorbancia
1,3
10,5 mM CD 7,5 mM CD
1,0
5,1 mM CD
0,8
1,0 mM CD
0,5 0,3 0,0 205
230
255 280 305 hullámhossz (nm)
330
355
4.14. ábra. Különböző β-CD koncentrációk hatása az imatinib oldhatóságára
A szolubilizált imatinib-koncentráció abszorbancia adatokból történő kiszámításához egy kalibrációs egyenesre volt szükség. Ennek elkészítése azonban pH = 10,5nél problémába ütközik, mivel ilyen nagy pH értéknél a meghatározni kívánt koncentrációhoz képest egy nagyságrenddel magasabb koncentrációjú imatinib oldat oldhatósági okokból nem készíthető. A kalibráló egyenest ezért pH = 5 oldatban vettük fel, ahol az imatinib (HI+-forma) oldhatósága nagyságrendekkel kedvezőbb. A hiteles kalibrációhoz szükséges még, hogy az imatinib UV-spektruma ne különbözzön szignifikánsan pH = 5 és 10,5 értékeknél. Megállapítottuk, hogy a pH hatása az UV-spektrumra hibahatáron belül elhanyagolható, ami összhangban áll a 4.1.2 fejezetben részletezett eredményeinkkel, miszerint a piperazin N34 pH = 5 és 10,5 között lejátszódó protonálódása nem érinti a molekula kromofór csoportját. A kalibrációs egyenes segítségével így a pH = 10,5-nél mért abszorbancia-adatokat moláris koncentrációra konvertáltuk és a 4.15. ábrán látható fázis-oldhatósági diagramot kaptuk.
76
imatinib koncentráció (mM)
0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
CD koncentráció (M)
4.15. ábra. A szabad bázis imatinib fázis-oldhatósági diagrammja pH = 10,5
Az oldhatóság mintegy tízszeres növekedése a vizsgált koncentrációtartományban lineáris. A kapott egyenes (ún. AL-típusú görbe) egyértelműen bizonyítja a zárványkomplex 1:1 sztöchiometriáját [148]. A protonálatlan imatinib 1:1 sztöchiometriájú β-CD komplexének stabilitási állandóját a következő egyenlet segítségével
számíthatjuk ki a fázis-oldhatósági diagramból [148]: K I − CD =
tgα cI 0 (1 − tgα )
(4.45)
ahol cI0 a tengelymetszeten leolvasható töltésmentes imatinib intrinsic oldhatósága pH = 10,5-nél, tg α pedig az egyenlet meredeksége. A 4.45 egyenlet alapján számított log K I −CD = 3,18 ± 0,07 érték jól egyezik a hidrofób, aromás gyűrű(ke)t tartalmazó vendégmolekulák β-CD-nel képzett komplexeire publikált adatokkal. Az így meghatározott állandó értéke azonban nagy mértékben függ a tengelymetszet értékétől, így érzékeny a véletlen kísérleti hibákra, ezért megbízhatóságát független potenciometriás titrálással is ellenőriztük.
4.2.2 Potenciometriás titrálások A szolubilizáló hatású β-CD, illetve RAMEB négyszeres feleslege még 1 mM imatinibet tartalmazó oldatban is megakadályozta a protonálódási állandók meghatározásakor tapasztalt csapadékkiválást.
77
Savas, (pH = 2) imatinib oldatot CD jelenlétében titrálva 5 különböző protonáltsági állapotú imatinib léphet kölcsönhatásba a ciklodextrinnel. A teljesen protonált részecskének (H4I4+) a gazdamolekulával kialakított kölcsönhatását figyelmen kívül hagyhatjuk, mert móltörtje a tanulmányozott pH tartományban igen kicsi. Így minden egyes titrálási adatsorból 4 komplexstabilitási állandó határozható meg. A titrálási görbék kiértékeléséhez a mért [H+], valamint a gazda- és vendégmolekula analitikai koncentrációjának ismerete szükséges, melyekből számítógépes iterációval kapjuk a megfelelő stabilitási állandókat. A képződő komplexek sztöchiometriája mindkét alkalmazott ciklodextrin esetén alátámasztotta az 1:1-es CD:imatinib arányt, míg 2:1 sztöchiometriájú komplexek képződése a potenciometriás titrálások alapján sem valószínűsíthető. A számítási modellt definiáló egyensúlyi reakciókat részletesen a 184. irodalmi hivatkozás tartalmazza. A két ciklodextrin imatinib komplexeinek stabilitási állandóit a 4.10. táblázat foglalja össze. 4.10. táblázat. Az imatinib különböző protonáltságú formáinak potenciometriával meghatározott komplexstabilitási állandói β-CD-vel és RAMEB-bel (T = 25,0 ± 0,1°C; I = 0,15 M NaCl)
log K I − CD
log K HI + −CD
log K H I 2+ −CD
log K H I 3+ −CD
β-CD
3,09 ± 0,04
2,16 ± 0,10
2,57 ± 0,08
2,72 ± 0,06
RAMEB
2,95 ± 0,06
2,47 ± 0,09
2,18 ± 0,08
1,08 ± 0,08
2
3
A várakozásoknak megfelelően a legstabilabb komplex mindkét esetben a legkevésbé poláris, töltésmentes imatinibbel képződik, a CD-k belső, apoláris üregével kialakított másodlagos kölcsönhatásoknak köszönhetően. A β-CD-imatinib rendszerben mért KI-CD állandó jó egyezést mutat a fázisoldhatósági vizsgálat során kapott értékkel. A monokationos imatinib (HI+) egy nagyságrenddel kisebb stabilitási állandóval rendelkezik. A legtöbb irodalmi adattal ellentétben viszont az imatinib töltésének további emelésével a stabilitási állandók enyhe növekedése figyelhető meg. Ennek magyarázatára az 1H NMR titrálások diszkussziójánál térünk ki.
78
A random metilezett β-CD esetén, ahol a ciklodextrin-kónusz mindkét peremén apoláris metil-szubsztituensek találhatók, a stabilitási állandók értéke a vendégmolekula töltésének növekedésével a várakozásnak megfelelően alakul: fokozatosan csökken.
4.2.3 Tömegspektrometriás vizsgálatok A fázis-oldhatósági vizsgálattal megállapított és a potenciometriás titrálással is alátámasztott 1:1 komplex sztöchiometria további
megerősítésére
ESI-MS
vizsgálatot végeztünk. A tömegspektrum 100-600 m/z tartományában (4.16. ábra) megfigyelt imatinib báziscsúcs (494,2 m/z), valamint fő fragmenseinek (394,2 m/z, 247,8 m/z) azonosítása Marul közleménye [54] alapján történt. 3500 494,2
Intenzitás (önk. egység)
3000 2500 247,8
2000 1500
394,2
1000 500
0 100
200
300
m/z
400
500
600
4.16. ábra. Az imatinib-β-CD oldat pozitív módban felvett tömegspektrumának 100-600 m/z tartománya
A számunkra fontos 600-1800 m/z spektrumtartományt a legintenzívebb (1009,6 m/z) csúcsra normálva mutatja a 4.17. ábra. A spektrumban a csak gázfázisban meg-
figyelhető imatinib-dimer (987,6 m/z) és annak nátriumadduktja (1009,6 m/z) mellett a szabad β-CD nátriumadduktja (1157,2 m/z) is megjelenik. A spektrum második legintenzívebb csúcsa (815,2 m/z) a kétszeresen pozitív 1:1 komplexnek felel meg,
79
míg más összetételű zárványkomplex képződését a tömegspektrométer nagyvákuumában sem sikerült kimutatni. 100
1009,6
Relatív gyakoriság
80 815,2
60
1157,2
40 987,6
20
0 600
800
1000
1200
1400
1600
1800
m/z
4.17. ábra. Az imatinib-β-CD oldat pozitív módban felvett tömegspektrumának 600-1800 m/z tartománya
4.2.4 1H NMR spektroszkópiás vizsgálatok A pH-metriás titrálással meghatározott komplexstabilitási állandók értékei meglepő módon enyhe növekedést mutattak az imatinib protonálódásának előrehaladtával. Ezen szokatlan trend megerősítésére független 1H NMR titrálást végeztünk a monokationos (HI+) és a dikationos (H2I2+) imatinib/β-CD rendszerekben. A zárványkomplex szerkezetének jellemzésére ROESY technikát alkalmaztuk.
4.2.4.1
1
H NMR titrálások
A monokationos imatinib (HI+) stabilitási állandójának meghatározása. Az
imatinib oldhatóságának és protonálódási állandóinak ismeretében pH* = 5,4 oldatokban tanulmányoztuk a monokationos forma komplexstabilitását, ahol HI+ részecske móltörtje 0,96. A stabilitási állandó meghatározását számos tényező nehezítette ezen a pH-n. A potenciometriával meghatározott állandók alapján ez a részecske rendelkezik a legkisebb stabilitási állandóval, így a megfelelően magas komplexáltsági fok elérése
80
érdekében, tekintettel a β-CD alacsony oldhatóságára (13 mM), az imatinibet 0,2-0,5 mM közötti koncentrációban kellett alkalmazni. Ezen kívül ezred ppm pontosságal, reprodukálhatóan kellett az imatinib-hidrogének kémiai eltolódását meghatározni 90% H2O-t tartalmazó oldatokról készült spektrumokban (oldószerelnyomás!). Annak érdekében, hogy a megfigyelt kémiai eltolódás változások kizárólag a komplexképződést tükrözzék és egyéb (pl. sav-bázis) egyensúly ne torzítsa a megfigyelt ∆δ értékeket, acetátpufferben végeztük a titrálást, ahol az acetát metiljelének eltolódása érzékenyen jelezte volna az esetleges pH változást a titrálás során. A titrálási sorozat egy reprezentatív spektrumát mutatja a 4.18. ábra. H3, H6 β-CD
H1 β-CD
H2O az imatinib aromás protonjai
9.0 9,0
8.5 8,5
8.0 8,0
7.5 7,5
7.0 7,0
6.5 6,5
ppm
6.0 6,0
5.5 5,5
5.0 5,0
4.5 4,5
4.0 4,0
4.18. ábra. A monokationos (HI+) imatinib titrálásnak egy jellemző 1H NMR spektrumrészlete
Az imatinib aromás hidrogénjeire minden CD-koncentráció esetén meghatároztuk a komplexálódás okozta eltolódásokat, melyek egyöntetűen diamágneses eltolódást mutattak. A kiértékelésbe csak azokat a magokat vontuk be, amelyeken ∆δ értéke szignifikánsnak (>15 ppb) bizonyult. Ezen kritérium szerint a H16 (∆δ = 0,092 ppm); H25,29 (0,099 ppm); H26,28 (0,059 ppm); H10 (0,112 ppm), H9 (0,115 ppm) és H32,36 (0,076 ppm) magok jelezték legérzékenyebben a molekulakomplex kialakulását, közülük a H25,29 és H9 titrálási görbéje a 4.19. ábrán látható. A titrálási görbék szimultán kiértékelésével kapott log K HI + −CD = 2,20 ± 0,06 jó egyezést mutat a potenciometriásan meghatározott állandóval (2,16 ± 0,10, ld. 4.10. táblázat). A H25,29,
81
H26,28 és H16-on mért jelentős ∆δ értékek arra mutatnak, hogy az imatinib benzamid része valószínűleg érintett a komplexképzésben. 7,96
7,66
H25,29
7,95
9
7,64
7,94
7,63
7,93
δ [ppm]
δ [ppm]
H
7,65
7,92 7,91 7,90
7,62 7,61 7,60 7,59
7,89
7,58
7,88
7,57 7,56
7,87 0
5
10
15 20 c CD / c imatinib
25
0
30
5
10
15 20 c CD / c imatinib
25
30
4.19. ábra. A monokationos (HI+) imatinib a H25,29 és H9 protonjainak NMR titrálási görbéi, pirossal az OPIUM-mal illesztett görbe látható
A dikationos imatinib (H2I2+) stabilitási állandójának meghatározása. A pH*
3,5-nél végzett titrálást az imatinib kedvezőbb oldhatóságának köszönhetően 1 mM koncentrációnál végeztük el. A különböző CD koncentrációk mellett felvett spektrumok aromás tartományának egy részletét látjuk a 4.20 ábrán. CCD/Cimatinib
H25,29
H19
H26,28
H16
H17
H6
24
14
H9
8
4
0
8.0
7.8
7.6
δ [ppm]
7.4
7.2
4.20. ábra. A dikationos (H2I2+) imatinib 1H NMR spektrumának aromás tartománya különböző CD koncentrációk mellett
A kedvezőbb jel/zaj viszonynak is megfelelően a spektrumparaméterek kiszámítása is kisebb hibával terhelt. Legnagyobb ∆δ-t a H19 (∆δ = 0,134 ppm) és az amid HN21 (0,076 ppm) magok mutattak. Kiértékelésre alkalmas (∆δ >15 ppb) titrálási
82
görbéje a H5, H8, H12, H16, H19, H25,29 és HN21 protonoknak volt (ld. 4.21 ábra), az ezek szimultán regressziójával kapott log K H I 2+ −CD = 2,45 ± 0,02 érték megerősítette 2
a potenciometriával mért 2,57 ± 0,08 állandót, noha a mérés 3,5-ös pH-ján a monoés trikationos forma részaránya sem elhanyagolható (lásd: 4.13. ábra).
7,950
7,825
H25,29
H19
7,805 7,945
δ [ppm]
δ [ppm]
7,785 7,940
7,765
7,935
7,745 7,930
7,725
7,925
7,705 0
5
10
c CD / c imatinib
15
20
25
0
5
10
c CD / c imatinib
15
20
25
4.21. ábra. A dikationos (H2I2+) imatinib a két kiválasztott protonjának (H25,29 és H19) 1H NMR titrálási görbéi, pirossal az OPIUM-mal illesztett görbe látható.
A hasonló kísérleti körülmények között RAMEB hozzáadásával végzett NMR titrálások megerősítették a potenciometriával meghatározott stabilitási állandó értékét (4.11. táblázat), szignifikáns ∆δ értékeket a H12 (∆δ = 0,099 ppm); H25,29 (0,070 ppm) és H32,36 (0,046 ppm) magokra találtunk. 4.11. táblázat. Az imatinib különböző protonáltságú formáinak komplexstabilitási állandói β-CD-vel és RAMEB-bel (T = 25,0 ± 0,1°C; I = 0,15 M NaCl)
Gazda
Módszer
log K I −CD
log K HI + −CD
log K H I 2+ −CD
log K H I3+ −CD
β-CD
potenciometria
3,09 ± 0,04
2,16 ± 0,10
2,57 ± 0,08
2,72 ± 0,06
fázis-oldhatóság
3,18 ± 0,07 2,20 ± 0,06
2,45 ± 0,02
2,47 ± 0,09
2,18 ± 0,08
NMR titrálás RAMEB potenciometria NMR titrálás
2,95 ± 0,06
2,3 ± 0,1
83
2
3
1,08 ± 0,08
4.2.4.2
2D NMR mérések
Az imatinib/β-CD komplexben lévő hidrogének között fellépő kölcsönhatásokat pH* = 5,4-nél vizsgáltuk 2D ROESY NMR módszerrel. A spektrum 4.22. ábrán bemutatott részletén intramolekuláris keresztcsúcsot látunk a H30 (3,77 ppm) és a H26,28
(7,47
ppm)
imatinib
hidrogének
között.
A
zárványkomplexképzés
szempontjából fontosabb a H26,28 intermolekuláris keresztcsúcsa a ciklodextrin üregében elhelyezkedő H5 (3,80 ppm) és H3 (3,91 ppm) magokkal. Ezek a korrelációk nagyobb intenzitásúak, mint a vendégmolekula H25,29 (7,83 ppm) protonjaival kapottak, ami a komplex 4.23. ábrán látható geometriáját valószínűsíti. A javasolt szerkezettel összhangban van az imatinib H25,29 és a CD H6 metiléncsoportjának térközelségi keresztcsúcsa, valamint a H25,29-re mért ∆δ = 0,099 ppm érték. Figyelembe véve az imatinib polárisabb, és ezért jobban hidratált piridinopirimidin részét, a penetráció vélhetően a kónusz keskenyebb nyílásán keresztül megy végbe. Noha ez az inklúzió ritkábban megfigyelt iránya, az irodalomban találunk erre példát [187,188,189]. Az imatinib többi aromás hidrogénjén megfigyelt ∆δ értékek magyarázata kevésbé nyilvánvaló. Feltehetően a molekula merev
szerkezetének és aromás gyűrűi kiterjedt konjugációjának köszönhető, hogy a többi hidrogén is érzékenyen közvetíti a zárványkomplex kialakulását kísérő változásokat az elektronsűrűségben. További kémiai eltolódás-változást okozhat a téren keresztüli kölcsönhatás a vendégmolekula H9, H10, H16 hidrogénjei és a CD keskenyebb kónusza között, ezt azonban ROESY keresztcsúcsként nem sikerült igazolnunk. Tekintettel arra, hogy a random metilezett ciklodextrin üregében elhelyezkedő hidrogének jelei a spektrális átfedés miatt nem azonosíthatóak, nem próbálkoztunk ROESY kísérleteket végezni az imatinib-RAMEB komplex szerkezetének felderítésére.
84
25,29 Himatinib
26,28 Himatinib
F2, ppm 3.74
H30 imatinib
3.76 3.78
Hβ5-CD
3.80 3.82
Hβ6-CD
3.84 3.86 3.88
Hβ3-CD
3.90 3.92 3.94 3.96 3.98 7.85 7.80 7.75 7.70 7.65 7.60 7.55 7.50 7.45 F1, ppm
4.22. ábra. Az imatinib/β-CD komplex 2D ROESY spektruma pH* 5,4-nél
CH3 H
N
+
H O H
OH
N
C2
H
CH2
C1
C3
26,28
H
O
C4
H
H
H
H
C5
H
H
25,29
H O
NH
C6 O
H
H
NH N
CH3
N N
4.23. ábra. Az imatinib/β-CD komplexben kölcsönható molekularészek a 2D ROESY mérés alapján
85
4.3 Az imatinib liposzómákkal való kölcsönhatásának vizsgálata 4.3.1 A bezárási hatásfok meghatározása A liposzómába zárt imatinib mennyiségének meghatározásához különbségi módszert használtunk. A liposzómát nem tartalmazó filtrátum imatinib tartalmát mértük, így a bezárási hatásfokba egyaránt beleszámít a liposzóma belső oldatfázisában lévő, valamint a membránba ágyazott és az ahhoz asszociált hatóanyag mennyisége. A bezárási hatásfokot 1 mM imatinibet tartalmazó SUV-ok és MLV-k esetén pH 5,2 és 9,0-nél határoztuk meg (4.12. táblázat).
4.12. táblázat. Bezárási hatásfok a két különböző típusú liposzóma esetén az imatinib monokationos és töltésmentes formájára
pH = 5,2 (HI+)
pH = 9,0 (I)
SUV
60,0 ± 4,9 %
86,9 ± 2,3 %
MLV
25,6 ± 2,0 %
77,7 ± 2,7 %
Szignifikáns különbséget találunk a bezárási hatásfokokban mind a két liposzomális forma és pH-érték esetén. A kis unilamelláris liposzómák bezárási hatásfoka minden esetben nagyobb. Az eltérő pH-jú esetekben mind a SUV-ok, mind az MLV-k esetén nagyobb bezárási hatásfokot sikerült elérni magasabb pH-n. pH = 9,0 esetén az imatinib töltésmentes, apoláris formája az apoláris lipidláncokkal kedvező kölcsönhatásba léphet, szemben a pH = 5,2-nél töltéssel rendelkező, monokationos formával. A pH = 9,0-nél tapasztalt magasabb bezárási hatásfokok magyarázatául az imatinib nagyobb látszólagos megoszlási hányadosa és a lipidek jelenlétében megnövekedett oldhatósága szolgál.
86
4.3.2 Membránrigiditás vizsgálatok ESR spektroszkópiával Az ESR méréseket a minták öregedésének elkerülésére minden esetben előállításuk napján végeztük. A megfelelő kontroll és imatinibet tartalmazó liposzómák szintén azonos napon készültek és kerültek mérésre. Néhány reprezentatív spektrum látható a 4.24. ábrán.
2Amax e d u ti l p m a ev it lae R
Relatív amplitúdó
pH=9.0 pH=9,0
pH=5.2 pH=5,2
HH[gauss] [Gauss]
3360
3380
3400
3420
3440
3460
4.24. ábra. Kontroll (folytonos vonal) és 1 mM imatinibbel kezelt (szaggatott vonal) DPPC liposzómák jellemző ESR spektrumai. A kis unilamelláris liposzómák spinjelölése 1 mol% Dox-5 vegyülettel történt a megadott pH értékeknél. 2Amax a külső csúcsok távolsága, amely a membránfluiditást jellemzi.
A három alkalmazott spinjelölő közül a Dox-5 és Dox-5-PSPC esetében az ESRjelet szolgáltató nitroxid csoport párosítatlan p-elektronja a poláris fejcsoportok közelében helyezkedik el, míg a Dox-16 esetében a paramágneses molekularészlet az apoláris szénhidrogénlácok végénél található. Ezek segítségével mind a fejcsoport régió, mind a lipidláncok esetleges molekuláris kölcsönhatásai tanulmányozhatók. A 4.25. ábrán az ESR spektrumokból meghatározott 2Amax csatolási állandók hőmérsékletfüggése látható kontroll és 1 mM imatinibet tartalmazó MLV-k és SUVok esetén, Dox-5 jelölőt alkalmazva.
87
65
Csatolási állandó [G]
60
55 SUV kontroll
50
SUV 1 mM imatinib MLV kontroll
45
MLV 1 mM imatinib
40 0
10
20
30
40
50
Hőmérséklet [°C]
4.25. ábra. A külső csatolási állandó (2Amax) hőmérsékletfüggése pH=5,2-nél kontroll és imatinibet tartalmazó SUV-ok és MLV-k esetén
Az imatinibet tartalmazó mindkét típusú liposzóma membránjának merevsége megváltozott. SUV-ok esetén az imatinib jelentős fluiditás csökkenést okoz. Ezzel ellentétben a MLV-k membránján az imatinib azonos koncentrációja enyhe fluiditás növekedést idéz elő. A membrán fluiditásának megváltozása MLV-k esetén csak a DPPC-k előfázisátalakulási hőmérséklete (~35 oC) alatt figyelhető meg, míg az imatinib-SUV minták még a fő fázisátalakulás fölött is csökkent fluiditást mutatnak a kontrollhoz képest. Tekintettel a mérés ± 0,3 G hibahatárára, az imatinibnek a SUV-ok membránjára kifejtett hatása a 2−40 oC tartományban jelentős. Legszámottevőbb, 7−10 G csatolási
állandó-változás
a
DPPC-k
elő-fázisátalakulási
hőmérsékletének
környezetében (34−36 °C) regisztrálható. Lipidmembránok elő-fázisátalakulásának molekuláris hátterében a rendezett szénhidrogénláncok között melegítésre kialakuló ponthibák állnak. Az elő-fázisátalakulás Telő hőmérsékletén a ponthibák a membrán felszínén vonalhibákká rendeződnek és
egy redőzött („ripple”) struktúra alakul ki [185,186]. Ezen a hőmérsékleten a lipidmembrán még gél állapotban van, így a kialakult vonalhibák stabil, rendezett szerkezetet vesznek fel, melynek termodinamikai paraméterei jelentősen eltérnek az alacsonyabb, illetve magasabb hőmérsékleten kialakuló szerkezetekétől. A lipidek
88
forgási szabadsága, mozgásának térbeli korlátozottsága speciálisan a „ripple” struktúrának felel meg, majd a további melegítésre bekövetkező fő fázisátalakulás úgy értelmezhető, mint a hibahelyek olyan mértékű felszaporodása, ami már az előzőleg kialakult redőzött struktúrát is megszünteti. A kontrollként szolgáló kis unilamelláris liposzómák esetén a nagy görbületi sugár nem teszi lehetővé redőzött szerkezet (és ezáltal elő-fázisátalakulás) létrejöttét (4.25. ábra), az imatinib kezelés hatására tapasztalt változás azonban ettől eltérő membránszerkezet kialakulására utal. Összehasonlítva a kontroll és az imatinib tartalmú SUV-ok és MLV-k Telő tartományában a külső csatolási állandó változását, az elő-fázisátalakulás ellaposodását tapasztaljuk mindkét esetben. A megfigyelt változások hátterében a lipidek fejcsoportjai közti kölcsönhatások imatinib hatására történő megváltozásai állnak. Mivel a Dox-5 spinjelölő legérzékenyebben a fejcsoportokhoz közeli molekuláris mozgási szabadság változását jelzi, a 4.25. ábra SUV görbéinek lefutása egyértelműen az imatinib fejcsoportokkal kialakuló kölcsönhatására utal. A pH = 5,2-nél megfigyelt változásokat a poláris foszfatidil-kolin és a monokationos imatinib közti kedvező másodrendű kötések is elősegítik. Multilamelláris liposzómák esetén nem tapasztalunk ilyen változásokat, mert membránjuk szerkezete az egyetlen kettősréteggel határolt SUV-okéhoz képest kevésbé érzékeny a változásokra. Az ESR spektrumok hőmérsékletfüggése SUV-ok esetén olyan mértékű molekuláris mozgásbeli különbségeket mutat, melyek membránszerkezete az imatinib-MLV-hez hasonló, és ez a membrán-fluiditásbeli különbség még a fő fázisátalakulási hőmérséklet fölött is megmarad. MLV-k esetén a 2-35 °C intervallumban enyhe fluiditásnövekedést okoz az imatinib alkalmazása kontroll mintához képest. A tapasztalt membránfluiditás változások hasonló tendenciát mutatnak Dox-5-PSPC spinjelölővel történő mérések esetén. Az uni- és multilamelláris liposzómák imatinib kezelés utáni membránfluiditásai sokkal jobban hasonlítanak egymásra, mint a kezelés előtt, ami nem jelent szükségszerűen az azonos, esetünkben az unilamelláris liposzómákból esetlegesen kialakuló multilamelláris szerkezetet. A csatolási állandók hőmérsékletfüggésének hasonlósága csak a lipidek hasonló mozgási szabadságát jelenti. Az eltérő struktúrát bizonyítja 89
továbbá a kezelt SUV és MLV diszperziók ülepedési tulajdonsága is. Míg az MLV szuszpenzió igen rövid idő alatt szemmel is jól láthatóan ülepedik, a SUV-ok még két nap után is megtartják állandóságukat. A hatóanyag által előidézett változások nem csak pH-, de koncentráció-függőnek is bizonyultak (4.26. ábra). 8
Dox-5
7
Dox-5-PSPC pH=5,2
pH=9,0
Dox-5
pH=5,2
∆H [Gauss]
6 5 4 3 2 1 0 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Imatinib koncentráció [mM]
4.26. ábra. A csatolási állandó koncentráció- és pH-függése Dox-5 és Dox-5-PSPC-vel jelölt unilamelláris liposzómák esetén 21 °C-on. Folytonos vonal a Langmuir-modell illesztett görbéje.
A pH szerint különböző töltésű imatinibnek a MLV-k membránjára kifejtett hatása megegyezik a pH = 9,0 és 5,2 szuszpenziókban, míg unilamelláris liposzómák esetén a magasabb pH kifejezettebb fluiditáscsökkenést okoz (4.26. ábra). A 4.26. ábra az imatinib unilamelláris liposzómák membránjára kifejtett hatását ábrázolja Dox-5, Dox-5-PSPC spinjelölőkkel pH = 9,0 és 5,2 esetén 21 °C-on. A mérési hőmérséklet kiválasztásakor az alábbi szempontokat vettük figyelembe: kellően távol legyen az elő- és a fő-fázisátalakulási hőmérséklettől, hogy azok hatásait minimalizálhassuk, de mégis szignifikáns csatolási állandó különbség legyen a kontrollhoz képest. A 21 °C-on mért csatolási állandó különbségek alapján a membránfluiditásra gyakorolt hatás pH = 9,0-nél 2-3 szorosa a pH = 5,2-nél mért értéknek. A bezárási hatásfok meghatározásánál tapasztaltakkal összhangban, a töltésmentes forma membránra kifejtett rigidizáló hatása kifejezettebb, növekvő koncentrációja egyre rendezettebb, merevebb membránszerkezethez vezet. 90
A 2Amax csatolási állandó koncentrációfüggése lehetővé teszi Langmuir-típusú modellt alkalmazva látszólagos képződési/asszociációs állandók számítását két különböző pH és spinjelölő esetén. Dox-5 spinjelölővel pH = 5,2-nél 0,91 ± 0,16, míg pH = 9,0-nél egy közel kétszeres 1,79 ± 0,34 értéket mértünk. Dox-5-PSPC-t alkalmazva pH = 5,2-nél, az állandó értéke: 1,39 ± 0,16. Ezek az eredmények jó egyezést mutatnak a bezárási hatásfokkal, ami szintén egy megközelítően kétszeres bezárási/adszorpciós hatásfokot mutat pH = 9,0-en 5,2-höz képest.
4.3.3 Fázisátalakulási paraméterek meghatározása differenciál szkenning kalorimetriával A kontroll és imatinibet tartalmazó multilamelláris liposzóma diszperziók két különböző pH-n meghatározott fázisátalakulási hőmérsékleteit a 4.13. táblázat foglalja össze. 4.13. táblázat. MLV-k fázisátalakulási hőmérsékletei pH = 5,2 és 9,0 esetén.
Telő [oC]
Tfő [oC]
pH = 5,2
pH = 9,0
pH = 5,2
pH = 9,0
kontroll
37,9 ± 0,6
36,2 ± 0,1
42,1 ± 0,3
41,4 ± 0,1
imatinib-kezelt
32,8 ± 1,0
34,1 ± 0,4
41,1 ± 0,2
41,8 ± 0,1
Az imatinib mindkét pH-n szignifikáns csökkenést okoz az elő-fázisátalakulás hőmérsékletében. Miután számos irodalom a DPPC elő-fázisátalakulását a periodikus, fluid, lipid-vonalhibák megjelenésével azonosítja [168,185,186], melyek nincsenek jelen az elő-fázisátalakulás alatti hőmérsékleten és megszűnnek a főfázisátalakuláskor, így az esetünkben tapasztalt Telő csökkenése az imatinib lipidfejcsoportokkal kialakított kölcsönhatásaira utal. A már alacsonyabb hőmérsékleten is jelentkező vonalhibák ugyanis a fejcsoport régiók megnövekedett mobilitásának köszönhetően alakulhatnak ki. Ezzel ellentétben, az imatinib kezelés nem okoz szignifikáns változást a fő-fázisátalakulás hőmérsékletében, mely szintén alátámasztja az imatinib lipid-fejcsoportok
91
környékén történő membrán-lokalizációját, és így nem befolyásolja döntően a lipidláncok mozgását. DSC eredményeink jó egyezést mutatnak az ESR-mérésekkel, ahol Dox-5 spinjelölővel kimutatható membránfluiditás növekedést tapasztaltunk MLV-k esetén (4.25. ábra), míg a főként a lipidláncok mozgásáról információt nyújtó Dox-16-tal történt mérések nem mutattak eltérést a kontroll és imatinib tartalmú MLV-k között.
4.3.4 Dinamikus fényszórásmérés, transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálatok Amint az a 4.27. ábrán is látható, az imatinibet tartalmazó kis unilamelláris liposzómák nagymértékben különböznek a kontrolltól. Sokkal viszkózusabb, nagyobb turbiditású diszperzió alakul ki. A konzisztenciájában gélszerű, homogén rendszer nem ülepedik, szemben a spontán ülepedő MLV rendszerekkel, ahol rövid idő alatt áttetsző felülúszó jelenik meg. (a)
(b)
4.27. ábra. (a) frissen készített kontroll DPPC kis unilamelláris liposzóma. (b) 1 mM imatinibet tartalmazó, frissen készített kis unilamelláris liposzóma
A megváltozott szerkezet értelmezésére először a liposzómák méretét (átlagos hidrodinamikai átmérőjét) határoztuk meg dinamikus fényszórásméréssel. A pH = 9en meghatározott kontroll DPPC SUV-ok átlagos hidrodinamikai átmérője 51 ± 4 nm volt (4.28. ábra). 1 mM imatinib jelenléte azonban jelentősen, ~ 120−150 nm-re növelte az átmérőt, sőt egy, a mikrométer tartományba eső további csúcsot is tapasztaltunk az eloszlási görbén. Az eloszlási görbe alapján az imatinib hatására kialakuló aggregációt, vagy fúziót feltételeztünk.
92
rel. intenzitás
0,10
0,05
0,00 1
10 100 1000 hidrodinamikai s ugár [nm]
10000
4.28. ábra. Frissen készített imatinib mentes, kontroll DPPC kis unilamelláris liposzóma (piros) és 1 mM imatinibet tartalmazó SUV-ok (zöld) méreteloszlási diagrammja
A méreteloszlási diagram alapján látható, hogy az imatinibet is tartalmazó diszperzió sem a nagy unilamelláris, sem a multilamelláris liposzómákra nem hasonlít, a kialakult új szerkezet fúzió vagy aggregáció következménye. A lehetséges mechanizmus eldöntése érdekében a fagyasztva tört mintákat transzmissziós elektronmikroszkóppal is vizsgáltuk. A TEM felvételek segítségével vizuális információt kapunk a morfológiáról, a részecskék méretéről és méreteloszlásáról. Kis unilamelláris liposzómák esetén a fényszórásmérés alapján várt képet kaptuk. A liposzóma rendszer kis vezikulái domborodnak ki illetve mélyednek be a tört felszínbe (4.29. ábra). A kontroll minta méreteloszlása homogén, a vezikulák átlagos hidrodinamikai átmérője megfelel a fényszórásméréssel tapasztaltnak. Ezzel ellentétben az imatinibet is tartalmazó vezikulák elektronmikroszkópos képe eltérő. A sima felületű replika teljes felszínén apró, micellaszerű mintázatot látunk. A diszperzió morfológiája egy vegyes, micellákból és kis vezikulákból álló fúzió következtében kialakult mátrix szerkezetnek felel meg. A liposzómák átlagos mérete ~ 150 nm. A bezárási hatásfok meghatározása esetén is ez a sajátos imatinib-DPPC kölcsönhatás mutatkozik meg. Ellentétben sok irodalmi adattal, a bezárt hatóanyag mennyisége mindkét pH-n nagyobb volt unilamelláris, mint multilamelláris liposzómák esetén (4.12. táblázat). A kiugróan magas bezárási hatásfok magyarázatául az imatinib által kiváltott micellarizáció és fúzió következtében kialakuló mátrix szerkezet szolgál, mely a hatóanyag nagy részét magába zárja asszociátumként.
93
(a)
(b)
4.29. ábra. (a) kontroll (b) imatinib kezelt SUV fagyasztva tört mintájának elektronmikroszkópos képe
Fontos megjegyezni továbbá, hogy a kontroll SUV-ok tárolás hatására változtatják méretüket és lamellaritásukat. 3 napos tárolás után készült TEM felvételeken az unilamelláris liposzómák aggregáció és fúzió következtében teljesen átalakulnak multilamelláris vezikulákká. Ezzel ellentétben, az imatinibet is tartalmazó SUV-ok még 3 napos tárolás után sem mutatnak semminemű szerkezetbeli változást.
4.3.5 A fúzió igazolása ESR spektroszkópiával Az imatinib-DPPC rendszerben megfigyelt új szerkezet kialakulásának vizsgálatára további ESR méréseket végeztünk. Spin dipoláris kölcsönhatásoknak köszönhetően az ESR spektrum alacsonyterű csúcsának félértékszélessége (H1/2) arányosan változik a spinjelölők egymáshoz viszonyított távolságával. Minél közelebb találhatók a spinjelölők, annál nagyobb félértékszélességet regisztrálunk a spektrumban. Membránfúzió esetén a vezikulák „összeolvadnak” és egy folytonos kettősréteget alakítanak ki, míg aggregáció esetén sem a belső vizes fázis kiszabadulásával, sem a kettősmembránok integritásának megbomlásával nem kell számolnunk. Spinjelölt és spinjelölő mentes liposzómákat összekeverve az egyedi félértékszélességek ismeretében megkülönböztethetjük a fúziót az aggregációtól. Annak érdekében, hogy a vezikulák kettősmembránja közti, „flip-flop” mozgás hatására létrejövő spinjelölő-cserét minimalizáljuk, a nagyméretű Dox-5-PSPC-t alkalmaztuk. Spinjelölő mentes, 1 és 4 n/n%-ban Dox-5-PSPC-t tartalmazó kis
94
unilamelláris liposzómákat állítottunk elő. A méréseket 2°C-on végeztük, ezzel is csökkentve további, magasabb hőmérsékleten gyorsabban végbemenő membránátalakulásokat. Az 1%-ban spinjelölt mintában H1/2 = 2,66 G értéket mértünk, míg a négyszer „töményebb” kontrollban H1/2 értéke 3,36 G-nak adódott. 1 mM imatinibet is tartalmazó, 1 n/n%-ban spinjelölt minta spektruma nem különbözött szignifikánsan a kontrolltól (H1/2 = 2,85 G). Abban az esetben, ha spinjelölő mentes és 4 n/n%-ban spinjelölt mintát 3:1 arányban kevertük össze, a meghatározott 3,44 G félértékszélesség jó egyezést mutatott a 4 n/n%-ban spinjelölt mintában mért 3,36-os értékkel. Ez arra utal, hogy a mérés hőmérsékletén (2°C) nincs fúzió, a liposzómák megőrzik integritásukat. A két, különböző mértékben jelölt liposzóma preparátumot szintén 2°C-on, de 1 mM imatinib jelenlétében az előző arányban összekeverve szignifikáns csökkenést H1/2 = 2,73 G-t tapasztalunk. A megfigyelt csökkenés az imatinib hatására kialakuló Dox-5-PSPC-k homogén eloszlására utal, ami a vezikulák fúziójának és kisebb vezikulákra való hasadásának együttes eredménye. Az így nyert mintát közvetlenül a 2°C-on történő mérés után 41°C-ra melegítve nem tapasztaltunk további félértékszélesség változást, tehát az imatinib okozta változások már alacsony hőmérsékleten is teljesen végbementek.
95
5 Következtetések, új tudományos eredmények Doktori munkám során a daganatellenes imatinib molekuláris kölcsönhatásait vizsgáltuk. Az imatinib bázicitását makroszkopikus és csoportspecifikus szinten jellemeztük. Megállapítottuk, hogy a vegyület protonálódása dominánsan a N34, N11, N31, N13 sorrendben történik, ahol N11 és N31 bázicitása összemérhető, induktív kölcsönhatásuk viszont elhanyagolható, ezért protonaffinitásukat csoportállandókal írtuk le. Az 1H NMR titrálás diklórecetsav in situ pH szenzor használatával lehetőséget adott az erősen savas közegbe eső K4 makroállandó meghatározására is. A kisebb csoportszámú modellvegyületek bázicitása megerősíti az imatinib fenti protonálódási szekvenciáját. Eredményeink alapján ismertté vált a hatóanyag különböző töltésű formáinak pH-függő eloszlása, valamint azonosítható lett a Bcr-Abl onkogénnel hidrogénhidas, illetve elektrosztatikus kölcsönhatásba lépő bázikus centrumok protonáltsági állapota. A neutrális imatinib oldhatóságát tízszeresére sikerült növelnünk 12 mM β-ciklodextrin alkalmazásával. Független kísérleti módszerekkel jellemeztük az imatinib βciklodextrin és random metilezett származékának zárványkomplexét. A különböző technikákkal meghatározott komplexstabilitási állandók jó egyezést mutatnak. Mindkét ciklodextrin esetében a töltésmentes imatinib speciesszel alakul ki a legstabilabb komplex. Érdekes módon azonban a hatóanyag affinitása a β-ciklodextrinhez a vendégmolekula töltésszámának növekedésével enyhe minimumon megy át. A RAMEB esetén nem tapasztaltunk ilyen anomáliát, az állandók monoton csökkennek a vendégmolekula protonálódásának előrehaladtával. NMR ROESY kísérletből megállapítottuk, hogy az imatinib β-CD-be foglalt molekularészlete a pdiszubsztituált fenilcsoport. Az imatinib – β-CD komplex képződését és 1:1 sztöchiometriáját ESI+ tömegspektrometriás vizsgálattal a gázfázisban is igazoltuk. Várakozáson felüli mértékű kölcsönhatást sikerült kimutatnunk az imatinib, valamint DPPC-liposzómák membránja között. A hatóanyag a kis unilamelláris vezikulák membránját merevíti, multilamelláris vezikulák esetén viszont enyhe fluiditás-növekedést okoz. Mindkét fajta liposzóma esetén a bezárási hatásfok
96
jellegzetes pH-függést mutat, az apoláris, töltésmentes formára maximális. Ezzel összhangban a semleges és monokationos formák MLV-membránokra kifejtett hatása megegyezik, míg unilamelláris liposzómák esetén a magasabb pH kifejezettebb fluiditáscsökkenést okoz. A membránfluiditás-növekedés hátterében a lipidek fejcsoportjaival kialakított kölcsönhatás áll, míg a SUV-ok esetén észlelt csökkenés fúzió és micellarizáció eredménye, amelyet mind fényszórási, mind fagyasztva törést követő elektronmikroszkópos kísérleteink igazoltak.
97
6 Irodalomjegyzék 6.1 Az értekezés alapját képező közlemények E1.
Szakács Z., Béni Sz., Varga Z., Őrfi L., Kéri Gy., Noszál B. Acid-base profiling of imatinib (Gleevec) and its fragments. J. Med. Chem. 2005, 48, 249-255.
E2.
Béni Sz., Szakács Z., Csernák O., Barcza L., Noszál B. Cyclodextrin/imatinib complexation: Binding mode and charge dependent stabilities. Eur. J. Pharm. Sci. 2007, 30, 167-174.
E3.
Béni Sz., Budai M., Noszál B., Gróf P. Molecular interactions in imatinib-DPPC liposomes. Eur. J. Pharm. Sci. 2006, 27, 205-211.
6.2 Az értekezés témaköréhez kapcsolódó saját közlemény T1.
Szakács Z., Béni Sz., Noszál B. Resolution of carboxylate protonation microequilibria of NTA, EDTA and related complexones Talanta (közlésre benyújtva)
6.3 Más témákhoz kapcsolódó saját közlemények M1. Budai L., Hajdú M., Budai M., Gróf P., Béni Sz., B. Noszál, I. Klebovich, I. Antal Gels and liposomes in optimised ocular drug delivery: studies on ciprofloxacin formulations Int. J. Pharm. (közlésre elfogadva) M2. Deák K., Béni Sz., Völgyi G., Noszál B., Takács-Novák K. Physico-chemical profiling of ACE-inhibitor lisinopril: Acid-base properties J. Pharm. Pharmacol. (közlésre benyújtva) M3. Nagy K., Béni Sz., Kele P., Szakács Z., Bényei C. A., Noszál B., Kotschy A. Fluorescent sensing effected by conformational mobility Org. Lett. (közlésre benyújtva)
6.4 Diplomamunka D1.
Béni Szabolcs Szimmetrikus kelátorok protonálódási egyensúlyainak vizsgálata. Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet 2003.
98
6.5 Hivatkozott irodalmak jegyzéke 1.
Ádám V., Dux L., Faragó A., Fésüs L., Machovich R., Mandl J., Sümegi B. Orvosi biokémia. Medicina, Budapest, 2004
2.
Alberts B., Broy D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Wattson J. D. Molecuar biology of the cell. Gerland publishing Inc. New York and London 1994
3.
Fantl W. J., Johnson D. E., Williams L. T. Signalling by receptor tyrosine kinases. Annu. Rev. Biochem. 1993, 62, 453−481.
4.
Attwood P. V., Piggott M. J., Zu X. L., Besant P. G. Focus on phosphohistidine. 2007, Amino Acids, 32, 145−156.
5.
Vulpetti A., Bosotti R. Sequence and structural analysis of kinase ATP pocket residues. Il Farmaco 2004, 59, 759−765.
6.
Robinson D. R., Wu Y. M., Lin S. F. The protein tyrosine kinase family of the human genome. Oncogene 2000, 19, 5548−5557.
7.
Le Calvez H. Kinases in Cancer. The Translation Post 2005, 1, 1-5
8.
Deininger M. W. N., Goldman J. M., Melo J. V. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood 2000, 96, 3343−3356.
9.
Novell P. C., Hungerford D. A. A minute chromosome in human chronic, granulocytic leukemia. Science 1960, 132, 1497−1501.
10.
Rowley J. D. A new consistent chromosomal abnormality in chronic mielogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 1973, 243, 290−293.
11.
Bartram C. R., de Klein A., Hagemeijer A. Translocation of c-abl oncogene correlates with the presence of a Philadelphia chromosome in chronic mielocytic leukaemia. Nature 1983, 306, 277−280.
12.
Groffen J., Stephenson J. R., Heisterkamp N., de Klein A., Bartram C. R., Grosveld G. Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22. Cell 1984, 36, 93−99.
13.
Laneuville P. Abl tyrosine protein kinase. Semin. Immunol. 1995, 7, 255−266.
14.
Lugo T. G., Pendergast A. M., Muller A. J., Witte O. N. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products. Science 1990, 247, 1079−1082.
15.
Kipreos E. T., Wang J. Y. Differential phosphorylation of c-Abl in cell cycle determined by cdc2 kinase and phosphatase activity. Science 1990, 248, 217−220.
16.
Van Etten R. A. Cycling, stressed-out and nervous: cellular functions of c-Abl. Trends Cell Biol. 1999, 9, 179−186.
99
17.
Lewis J. M., Schwartz M. A. Integrins regulate the association and phosphorylation of paxillin by c-Abl. J. Biol. Chem. 1998, 273, 14225-14230.
18.
Montaner S., Perona R., Saniger L., Lacal J. C. Multiple signaling pathways lead to the activation of the nuclear factor kB by the Rho family of GTPases. J. Biol. Chem. 1998, 273, 12779−12785.
19.
Van Etten R. A., Jackson P., Baltimore D. The mouse type IV c-abl gene product is a nuclear protein, and activation of transforming ability is associated with cytoplasmic localization. Cell 1989, 58, 669−678.
20.
Kolibaba K. S., Druker B. J. Protein tyrosine kinases and cancer. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 1997, 1333, 217−248.
21.
Gordon M. Y., Dowding C. R., Riley G. P., Goldman J. M., Greaves M. F. Altered adhesive interactions with marrow stroma of haematopoietic progenitor cells in chronic myeloid leukaemia. Nature 1987, 328, 342−344.
22.
Puil L., Liu J., Gish G. Bcr-Abl oncoproteins bind directly to activators of the Ras signalling pathway. EMBO J. 1994, 13, 764−773.
23.
Bedi A., Zehnbauer B. A., Barber J. P., Sharkis S. J., Jones R. J. Inhibition of apoptosis by BCR-ABL in chronic myeloid leukemia. Blood 1994, 83, 2038−2044.
24.
Silver R.T., Woolf S. H., Hehlmann R., Appelbaum F. R., Anderson J., Bennett C., Goldman J. M., Guilhot F., Kantarjian H. M., Lichtin A. E., Talpaz M., Tura S. An evidence-based analysis of the effect of busulfan, hydroxyurea, interferon, and allogeneic bone marrow transplantation in treating the chronic phase of chronic myeloid leukemia: developed for the american society of hematology. Blood 1999, 94, 1517−1536.
25.
O’Brien S. G., Smetsers T. F. BCR-ABL as a target for antisense intervention. In: Stein CA, Krieg AM (eds.) Applied antisense oligonucleotide technology New York: Wiley-Liss, 1997, 207−230.
26.
Cohen M. H., Williams G., Johnson J. R., Duan J., Gobburu J., Rahman A., Benson K., Leighton J., Kim S. K., Wood R., Rothmann M., Chen G., Maung K. U., Staten A. M., Pazdur R. Approval Summary for Imatinib Mesylate Capsules in the Treatment of Chronic Myelogenous Leukemia. Clin. Cancer Res. 2002, 8, 935−942.
27.
Manley P. W., Cowan-Jacob S. W., Buchdunger E., Fabbro D., Fendrich G., Furet P., Meyer T., Zimmermann J. Imatinib: a selective tyrosine-kinase inhibitor. Eur. J. Cancer 2002, 38, 19−27.
28.
Buzetti F., Brasca M. G., Crugnola A., Fustinoni S., Longo A., Penco S., Dalla Zonca P., Comoglio P. M. Cinnamamide analogs as inhibitors of protein tyrosine kinases. Il Farmaco 1993, 48, 615−636.
29.
Spada A. P., Myers M. R. Small molecule inhibitors of tyrosine kinase activity. Expert Opin. Ther. Pat. 1995, 5, 805−817.
100
30.
Levitzki A. Tyrphostins: Tyrosine kinase blockers as novel antiproliferative agents and dissectors of signal transduction. FASEB. J. 1992, 6, 3275−3282.
31.
Anafi M., Gazit A., Zehavi A., Ben-Neriah A., Levitzki A. Tyrphostin-induced inhibition of p210(bcr-abl) tyrosine kinase activity induces K562 to differentiate. Blood 1993, 82, 3524−3529.
32.
Uehara Y., Murakami Y., Mizuno S., Kawai S. Inhibition of transforming activity of tyrosine kinase oncogenes by herbimycin A. Virology 1988, 164, 294−298.
33.
Geissler J. F., Roesel J. L., Meyer T., Trinks U. P., Traxler P., Lydon N. B. Benzopyranones and benzothiopyranones: A class of tyrosine protein kinase inhibitors with selectivity for the v-abl kinase Cancer Res. 1992, 52, 4492−4498.
34.
Zimmermann J., Buchdunger E., Mett H., Meyer T., Lydon N. B., Traxler P. Phenylamino-pirimidine (PAP) – derivatives: A new class of potent and selective PDGF-receptor autophosphorylation inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1221−1226.
35.
Zimmermann J., Buchdunger E., Mett H., Meyer T., Lydon N. B. Potent and selective inhibitors of the Abl-kinase: Phenylamino-pirimidine (PAP) – derivatives. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 187−192.
36.
Zimmermann J., Buchdunger E., Druker B. J. The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia. Blood 2005, 105, 2640−2653.
37.
Tuveson D. A., Willis N. A., Jacks T., Griffin J. D., Singer S., Fletcher C. D. M., Fletcher J. A., Demetri, G. D. STI571 inactivation of the gastrointestinal stromal tumor c-KIT oncoprotein: biological and clinical implications. Oncogene 2001, 20, 5054−5058.
38.
Heinrich M. C., Griffith D. J., Druker B. J., Wait C. L., Ott K. A., Zigler A. J. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood, 2000, 96, 925−932.
39.
Buchdunger E., Zimmermann J., Mett H., Meyer T., Miller M., Druker B. J. Lydon N. B. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2phenylaminopyrimidine derivative. Cancer Res. 1996, 56, 100−104.
40.
Druker B. J., Tamura S., Buchdunger E., Ohno S., Segal G. M., Fanning S. Zimmermann J., Lydon N. B. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat. Med. 1996, 2, 561−566.
41.
Beran M., Cao X., Estrov Z., Jeha S., Jin G., O'Brien S., Talpaz M., Arlinghaus R. B., Lydon N. B., Kantarjian H. Selective inhibition of cell proliferation and BCR-ABL phosphorylation in acute lymphoblastic leukemia cells expressing Mr 190,000 BCRABL protein by a tyrosine kinase inhibitor (CGP-57148). Clin. Cancer Res. 1998, 4, 1661−1672.
101
42.
Buchdunger E., Zimmermann J., Mett H., Meyer T., Muller M., Regenass U., Lydon N. B. Selective inhibition of the platelet-derived growth factor signal transduction pathway by a proteintyrosine kinase inhibitor of the 2-phenylaminopyrimidine class. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92, 2558−2562.
43.
Schindler T., Bornmann W., Pellicena P., Miller W. T., Clarkson B., Kuriyan J. Structural mechanism for STI-571 inhibition of Abelson tyrosine kinase. Science 2000, 289, 1938−1942.
44.
Nagar B., Bornmann W., Pellicena P., Schindler T., Veach D. R., Miller W. T., Clarkson B., Kuriyan J. Crystal Structures of the Kinase Domain of c-Abl in Complex with the Small Molecule Inhibitors PD173955 and Imatinib (STI-571). Cancer Res. 2002, 62, 4236−4243.
45.
Dorsey J. F., Jove R., Kraker A. J., Wu J. The pyrido[2,3-d]pyrimidine derivative PD180970 inhibits p210 Bcr-Abl tyrosine kinase and induces apoptosis of K562 leukemic cells. Cancer Res., 2000, 60, 3127–3131.
46.
Moasser M. M., Srethapakdi M., Sachar K. S., Kraker A. J., Rosen N. Inhibition of Src kinases by a selective tyrosine kinase inhibitor causes mitotic arrest. Cancer Res. 1999, 59, 6145–6152.
47.
Peng B., Lloyd P., Schran H. Clinical Pharmacokinetics of Imatinib. Clin. Pharmacokinet. 2005, 44, 879−894.
48.
Peng B., Hayes M., Resta D., Racine-Poon. A., Druker B. J., Talpaz M., Sawyers C. L., Rosamilia M., Ford J., Lloyd P., Capdeville R. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of imatinib in a phase I trial with chronic myeloid leukemia patients. J. Clin. Oncol. 2004, 22, 935−942.
49.
Lyseng-Williamson K., Jarvis B. Imatinib. Drugs 2001, 61, 1765−1774.
50.
Fitos I., Visy J., Zsila F., Mády G., Simonyi M. Selective binding of imatinib to the genetic variants of human α1-acid glycoprotein. Biochim. Biophys. Acta 2006, 11, 1704−1712.
51.
Peng B., Dutreix C., Mehring G., Hayes M. J., Ben-Am M., Seiberling M., Pokorny R., Cupdeville R., Lloyd P. Absolute bioavailability of imatinib (Glivec) orally versus intravenous infusion. J. Clin. Pharmacol. 2004, 44, 158−162.
52.
Petzer A. L., Gunsilius E., Hayes M., Stockhammer G., Duba H. C., Schneller F., Grünewald K., Poewe W., Gastl G. Low concentrations of STI571 in the cerebrospinal fluid: a case report. Brit. J. Haematol. 2002, 117, 623−625.
53.
Gschwind H. P., Pfaar U., Waldmeier F., Zollinger M., Sayer C., Zbinden P., Hayes M., Pokorny R., Seiberling M., Ben-Am M., Peng B., Gross G. Metabolism and disposition of imatinib mesylate in healthy volunteers. Drug Metab. Dispos. 2000, 33, 1503−1512.
102
54.
Marull M., Rochat B. Fragmentation study of imatinib and characterisation of new imatinib metabolites by liqid chromatography-triple-quadrupole and linear ion trap mass spectrometers. J. Mass Spectrom. 2006, 41, 390–404.
55.
Baker D. E. Imatinib mesylate. Rev. Gastroenterol. Disord. 2002, 2, 75−86.
56.
Nikolova Z., Peng B., Hubert M., Seiberling M., Keller U., Ho Y. Y., Schran H., Capdeville R. Bioequivalence, safety, and tolerability of imatinib tablets compared with capsules. Cancer Chemoth. Pharm.. 2004, 53, 433−438.
57.
Ramalingam S., Lagattuta T. F., Egorin M. J., Hayes M. J., Ramanathan R. K. Biliary Excretion of imatinib mesylate and its metabolite CGP 74588 in humans. Pharmacotherapy 2004, 24, 1232–1235.
58.
Kantarjian H., Sawyers C., Hochhaus A., Guilhot F., Schiffer C., GambacortiPasserini C., Niederwieser D., Resta D., Capdeville R., Zoellner U., Talpaz M., Druker B. Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia. N. Engl. J. Med. 2002, 346, 645−652.
59.
Kantarjian H. M., O’Brien S., Cortes J., Giles F. J., Rios M. B., Shan J., Faderl S., Garcia-Manero G., Ferrajoli A., Verstovsek S., Wierda W., Keating M., Talpaz M. Imatinib mesylate therapy improves survival in patients with newly diagnosed Philadelphia chromosomepositive chronic myelogenous leukemia in the chronic phase: comparison with historic data. Cancer 2003, 98, 2636−2642.
60.
Dagher R., Cohen M., Williams G., Rothmann M., Gobburu J., Robbie G., Rahman A., Chen G., Staten A. M., Griebel D., Pazdur R. Approval Summary: Imatinib Mesylate in the Treatment of Metastatic and/or unresectable malignant gastrointestinal stromal tumors. Clin. Cancer Res. 2002, 8, 3034−3038.
61.
Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. S., La Rosée P., Müller M. C., Lahaye T., Hanfstein B., Schoch C., Cross N. C. P., Berger U., Gschaidmeier H., Druker B. J., Hehlmann R. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia 2002, 16, 2190−2196.
62.
Shah N. P., Nicoll J. M., Nagar B., Gorre M. E., Paquette R. L., Kuriyan J., Sawyers C. L. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell 2002, 2, 117–125.
63.
Ricci C., Scappini B., Divoky V., Gatto S., Onida F., Verstovsek S., Kantarjian H. M., Beran M. Mutation in the ATP-binding pocket of the ABL kinase domain in an STI571-resistant BCR/ABL-positive cell line. Cancer Res. 2002, 62, 5995–5998.
64.
Özvegy-Laczka Cs., Hegedűs T., Várady Gy., Ujhelly O., Schuetz J. D., Váradi A., Kéri Gy., Őrfi L., Német K., Sarkadi B. High-affinity interaction of tyrosine kinase inhibitors with the ABCG2 multidrug transporter. Mol. Pharm. 2004, 65, 1485–1495.
65.
Jabbour E., Cortes J., Kantarjian H. Novel tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia. Curr. Opin. Oncol. 2006, 18, 578–583.
103
66.
Tokarski J. S., Newitt J. A., Chang C. Y. J., Cheng J. D., Wittekind M., Kiefer S. E., Kish K., Lee F. Y. F., Borzillerri R., Lombardo L. J., Xie D., Zhang Y., Klein H. E. The Structure of Dasatinib (BMS-354825) Bound to Activated ABL Kinase Domain Elucidates Its Inhibitory Activity against Imatinib-Resistant ABL Mutants. Cancer Res., 2006, 5790−5797.
67.
Golemovic M., Verstovsek S., Giles F. AMN107, a novel aminopyrimidine inhibitor of Bcr-Abl, has in vitro activity against imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. Clin. Cancer Res. 2005, 11, 4941–4947.
68.
Weisberg E., Manley P. W., Breitenstein W., Brüggen J., Cowan-Jacob., S. W., Ray. A., Huntly B., Fabbro D., Fendrich G., Hall-Meyers E., Kung A. L., Mestan J., Daley G. Q., Callahan L., Catley L., Cavazza C., Mohammed A., Neuberg D., Wright, R. D., Gilliland D. G., Griffin J. D. Characterization of AMN107, a selective inhibitor of native and mutant Bcr-Abl. Cancer Cell 2005, 7, 129–141.
69.
Verstovsek S., Golemovic M., Kantarjian H. AMN107, a novel aminopyrimidine inhibitor of p190 Bcr-Abl activation and of in vitro proliferation of Philadelphiapositive acute lymphoblastic leukemia cells. Cancer 2005, 104, 1230–1236.
70.
Goodman V. L., Rock E. P., Dagher R., Ramchandani R. P., Abraham S., Gobburu J. V. S., Booth B. P., Verbois S. L., Morse D. E., Liang C. Y., Chidambaram N., Jiang J. X., Tang S., Mahjoob K., Justice R., Pazdur R. Approval Summary: Sunitinib for the Treatment of Imatinib Refractory or Intolerant Gastrointestinal Stromal Tumors and Advanced Renal Cell Carcinoma. Clin. Cancer Res. 2007, 13, 1367–1373.
71.
Zachary A., Knight, K., Shokat M. Features of Selective Kinase Inhibitors. Chem. Biol. 2005, 12, 621–637.
72.
Kéri Gy., Őrfi L., Erős D., Hegymegi-Barakonyi B., Szántai-Kis Cs., Horváth Z., Wáczek F., Marosfalvi J., Szabadkai I., Pató J., Greff Z., Hafenbradl D., Daub H., Müller G., Klebl B., Ullrich A. Signal Transduction Therapy with Rationally Designed Kinase Inhibitors. Curr. Signal Transd. Ther. 2006, 1, 67–95.
73.
Klein S., Levitzki A. Signal Transduction Therapy for Cancer-Whither Now? Curr. Signal Transd. Ther. 2006, 1, 1–12.
74.
Noszál B. Acid-base properties of bioligands. In: Burger K. (Ed.) Biocoordination chemistry: coordination equilibria in biologically active systems. Ellis Horwood, Chichester, 1990, pp. 18–55.
75.
Beck M. T., Nagypál I. Chemistry of complex equilibria. Ellis Horwood Ltd., Chichester, 1990.
76.
Borkovec M., Jönsson B., Koper G. J. M. Ionization processes and proton binding in polyprotic systems: small molecules, proteins, interfaces and polyelectrolytes. In: Matijevic E. (Ed.) Surface and Colloid Science. Vol. 16. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2001. pp. 184–185, pp. 246–275, pp. 212–245, pp. 127–131.
104
77.
Bates R. G. Determination of pH: Theory and Practice. 2. kiadás, Wiley, New York, 1973. 2. fejezet
78.
Covington A. K., Bates R. G., Durst R. A. Definition of pH scales, standard reference values, measurement of pH and related terminology. Pure Appl. Chem. 1985, 57, 531– 542.
79.
Baucke F. G. K. New IUPAC recommendations on the measurement of pH – background and essentials. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 374, 772–777.
80.
Naumann R., Alexander-Weber Ch., Eberhardt R., Giera J., Spitzer P. Traceability of pH measurements by glass electrode cells: performance characteristic of pH electrodes by multi-point calibration. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 374, 778–786.
81.
Baucke F. G. K. Thermodynamic origin of the sub-Nernstian response of glass electrodes. Anal. Chem. 1994, 66, 4519–4524.
82.
Sigel H., Zuberbühler A. D., Yamauchi O. Comments on potentiometric pH titrations and the relationship between pH-meter reading and hydrogen ion concentration. Anal. Chim. Acta 1991, 255, 63–72.
83.
Biedermann G., Sillén L. G. Studies on the hydrolysis of metal ions. IV. Liquid junction potentials and constancy of activity factors in NaClO4-HClO4 ionic medium. Arkiv Kemi 1953, 5, 425–440.
84.
Anderegg G. The investigation of complex formation equilibria at constant ionic strength. Talanta, 1993, 40, 243–246.
85.
Irving H. M., Miles M. G., Pettit L. D. A study of some problems in determining the stoichiometric proton dissociation constants of complexes by potentiometric titrations using a glass electrode. Anal. Chim. Acta 1967, 38, 475–488.
86.
Gans P., O’Sullivan B. GLEE, a new computer program for glass electrode calibration. Talanta 2000, 51, 33–37.
87.
Leggett D. J. (Ed.) Computational methods for the determination of formation constants. Plenum Press, New York, 1986
88.
Avdeef A., Bucher J. J. Accurate measurements of the concentration of hydrogen ions with a glass electrode: calibrations using the Prideaux and other universal buffer solutions and a computer-controlled automatic titrator. Anal. Chem. 1978, 50, 2137– 2142.
89.
Gajda T., Henry B., Delpuech J.-J. Multinuclear NMR and potentiometric study on tautomerism during protonation and zinc(II) complex formation of some imidazolecontaining peptide derivatives. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1994, 157–164.
90.
Mussini P. R., Mussini T., Rondinini S. Reference value standards and primary standards for pH measurements in D2O and aqueous-organic solvent mixtures: New accessions and assessments. Pure Appl. Chem. 1997, 69, 1007–1014.
105
91.
Krezel A., Bal W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. J. Inorg. Biochem. 2004, 98, 161–166.
92.
Baucke F. G. K. Further insight into the dissociation mechanism of glass electrodes. J. Phys. Chem. B 1998, 102, 4835–4841.
93.
Glasoe P. K., Long F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. J. Phys. Chem. 1960, 64, 188–190.
94.
Albert A., Serjeant E. P. The determination of ionization constants. 3. kiadás, Chapman and Hall, London, 1984
95.
Bjerrum J. Metal ammine complex formation in aqueous solution. Dissertation. Haase, Copenhagen, 1941.
96.
Avdeef A. Physicochemical profiling (solubility, permeability and charge state). Current Topics Med. Chem. 2001, 1, 277–351.
97.
Szakács Z., Hägele G. Accurate determination of low pK values by 1H NMR titration. Talanta, 2004, 62, 819–825.
98.
Avdeef A., Kearney D. L., Brown J. A., Chemotti A. R. Jr. Bjerrum plots for the determination of systematic concentration errors in titration data. Anal. Chem. 1982, 54, 2322–2326.
99.
Gran G. Determination of the equivalence point in potentiometric titrations. Part II. Analyst 1952, 77, 661–671.
100. Rosotti F. J. C., Rosotti H. Potentiometric titrations using Gran plots. J. Chem. Educ. 1965, 42, 375–378. 101. Avdeef A., Comer J. E. A., Thomson S. J. pH-metric logP. 3. Glass electrode calibration in methanol-water, applied to pKa determination of water-insoluble substances. Anal. Chem. 1993, 65, 42–49. 102. Avdeef A., Box K. J., Comer J. E. A., Gilges M., Hadley M., Hibbert C., Patterson W., Tam K. Y. PH-metric log P 11. pKa determination of water-insoluble drugs in organic solvent-water mixtures. J. Pharm. Biomed. Anal. 1999, 20, 631–641. 103. Rived F., Canals I., Bosch E., Rosés M. Acidity in methanol-water. Anal. Chim. Acta 2001, 439, 315–333. 104. Yasuda M. Dissociation constants of some carboxylic acids in mixed aqueous solvents. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1959, 32, 429–432. 105. Shedlovsky T. The behaviour of carboxylic acids in mixed solvents. In: Pesce B. (Ed.) Electrolytes. Pergamon Press, New York, 1962, pp. 146–151. 106. Sohár P. Mágneses magrezonancia spektroszkópia. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1976. p. 40. pp. 40–44.
106
107. Gutowsky H. S., Saika A. Dissociation, chemical exchange and the proton magnetic resonance in some aqueous electrolytes. J. Chem. Phys. 1953, 21, 1688–1694. 108. Grunwald E., Loewenstein A., Meiboom S. Application of nuclear magnetic resonance to the study of acid-base equilibria. J. Chem. Phys. 1957, 27, 641–642. 109. Loewenstein A., Roberts J. D. The ionization of citric acid studied by the nuclear magnetic resonance technique. J: Amer. Chem. Soc. 1960, 82, 2705–2710. 110. Surprenant H. L., Sarneski J. E., Key R. R., Byrd J. T., Reilly C. N. Carbon-13 NMR studies of amino acids: chemical shifts, protonation shifts, microscopic protonation behavior. J. Magn. Reson. 1980, 40, 231–243. 111. Lachmann H., Schnackerz K. D. P-31 nuclear magnetic resonance titrations – simultaneous evaluation of all pH-dependent resonance signals. Org. Magn. Reson. 1984, 22, 101–105. 112. Frassineti C., Ghelli S., Gans P., Sabatini A., Moruzzi M. S., Vacca A. Nuclear magnetic resonance as a tool for determining protonation constants of natural polyprotic bases in solution. Anal. Biochem. 1995, 231, 374–382. 113. Govindaraju V., Young K., Maudsley A. A. Proton NMR chemical shifts and coupling constants for brain metabolites. NMR in Biomed. 2000, 13, 129–153. 114. Rabenstein D. L., Hari S. P., Kaerner A. Determination of acid dissociation constants of peptide side-chain functional groups by two-dimensional NMR. Anal. Chem. 1997, 69, 4310–4316. 115. Hägele G., Szakács Z., Ollig J., Hermens S., Pfaff C. NMR-controlled titrations: characterizing aminophosphonates and related structures. Heteroatom Chemistry, 2000, 11, 562–582. 116. Szakács Z., Hägele G., Tyka R. 1H/31P NMR pH indicator series to eliminate the glass electrode in NMR spectroscopic pKa determinations. Anal. Chim. Acta, 2004, 522, 247–258. 117. Moon R. B., Richards J. H. Determination of intracellular pH by 31P magnetic resonance. J. Biol. Chem. 1973, 248, 7276–7278. 118. Wishart D. S., Sykes B. D. Chemical shifts as a tool for structure determination. Methods Enzymol. 1994, 239, 363–392. 119. Koeberg-Telder A., Cerfontain H. Solutes in sulphuric acid. Part VI. A nuclear magnetic resonance study of organic sulphonic acids and 1H nuclear magnetic resonance standards; pKBH determination of sulphonic acids. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1975, 226–229. 120. Wegscheider R. Über die Affinitatsconstanten der mehrbasichen Sauren und der Estersauren. Monatsh. Chem. 1895, 16, 153–158.
107
121. Bjerrum N. Dissoziationskonstanten von mehrbasischen Säuren und ihre Anwendung zur Berechnung molekularer Dimensionen. Z. phys. Chem., 1923, 56, 219–242. 122. Noszál B. Group constant: a measure of submolecular basicity. J. Phys. Chem., 1986, 90, 4104–4110. 123. Zekri O., Boudeville P., Genay P., Perly B., Braquet P., Jouenne P., Burgot J. L. Ionization constants of ginkgolide B in aqueous solution. Anal. Chem., 1996, 68, 2598–2604. 124. Noszál B. Microspeciation of polypeptides. J. Phys. Chem. 1986, 90, 6345–6349. 125. Szakács Z., Kraszni M., Noszál B. Determination of microscopic acid-base parameters from NMR-pH titrations. Anal. Bioanal. Chem. 2004, 378, 1428–1448. 126. Santos M. A., Esteves M. A., Vaz M. C., Fraústo da Silva J. J. R., Noszál B., Farkas E. Microscopic acid-base equilibria of a synthetic hydroxamate siderophore analog, piperazine-1,4-bis(N-methylacetohydroxamic acid). J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 1997, 1977–1983. 127. Burger K., Sipos P., Véber M., Horváth I., Noszál B., Lőw M. Formation microequilibria of proton, calcium and magnesium complexes of the gammacarboxyglutamate ion and related compounds. Inorg. Chim. Acta, 1988, 152, 233–239. 128. Borkovec M., Spiess B. Microscopic ionization mechanism of inositol tetrakisphosphates. Phys. Chem. Chem. Phys. 2004, 6, 1144–1151. 129. D’Angelo J. C., Collette T. W. A method for the measurement of site-specific tautomeric and zwitterionic microspecies equilibrium constants. Anal. Chem. 1997, 69, 1642–1650. 130. Rabenstein D. L., Sayer T. L. Determination of microscopic acid dissociation constants by nuclear magnetic resonance spectrometry. Anal. Chem. 1976, 48, 1141– 1145. 131. Szejtli J. Cyclodextrins and their inclusion complexes Akadémiai Kiadó, Budapest 1982 132. Loftsson T., Duchene D. Cyclodextrins and their pharmaceutical applications. Int. J. Pharm. 2007, 329, 1–11. 133. Loftsson T., Brewster M. E., Másson M. Role of cyclodextrins in improving oral drug delivery. Am. J. Drug Deliv. 2004, 2, 261–275. 134. Loftsson T., Jarho P., Jarvinen T. Cyclodextrins in drug delivery. Expert. Opin. Drug Deliv. 2005, 2, 335–351. 135. Szejtli J. Past, present and future of cyclodextrin research. Pure Appl. Chem. 2004, 76, 1825–1845.
108
136. Stella V. J., Rajewski R. A. Cyclodextrins: their future in drug formulation and delivery. Pharm. Res. 1997, 14, 556–567. 137. Loftsson T., Konrádsdóttir F., Másson M. Influence of aqueous diffusion layer on passive drug diffusion from aqueous cyclodextrin solutions through biological membranes. Pharmazie 2006, 61, 83–89. 138. Loftsson T., Hreinsdóttir D., Másson M. Evaluation of cyclodextrin solubilization of drugs. Int. J. Pharm. 2005, 302, 18–28. 139. Loftsson T., Bodor N. Effects of 2-hydroxypropyl-β-CD on the aqueous solubility of drugs and transdermal delivery of 17β-estradiol. Acta Pharm. Nord. 1989, 1, 185–193. 140. Okimoto K., Rajewski R. A., Uekama K., Jona J. A., Stella V. J. The interaction of charged and uncharged drugs with neutral (HP-β-CD) and anionically charged (SBE7β-CD) β-cyclodextrins. Pharm. Res. 1996, 13, 256–264. 141. Granero G., Granero C., Longhi M. The effect of pH and triethanolamine on sulfisoxazole complexation with hydroxypropyl-β-CD. Eur. J. Pharm. Sci. 2003, 20, 285–293. 142. Loftsson T., Másson M. The effects of water soluble polymers on cyclodextrins and cyclodextrin solubilization of drugs. J. Drug Deliv. Sci. Tech. 2004, 14, 35–43. 143. Li P., Zhao L., Yalkowsky S. H. Combined effects of cosolvent and cyclodextrin on solubilization of nonpolar drugs. J. Pharm. Sci. 1999, 88, 1107–1111. 144. Yamakawa T., Nishimura S. Liquid formulation of a novel non-fluorinated topical quinolone, T-3912, utilizing the synergic solubilizing effects of the combined use of magnesium ions and hydroxypropyl-β-cyclodextrin. J. Control. Rel. 2003, 86, 101– 113. 145. Zia V., Rajewski R. A., Stela V. J. Effects of cyclodextrin charge on complexation of neutral and charged substrates: comparison of (SBE)7M-β-CD to HP-β-CD. Pharm. Res. 2001, 18, 667–673. 146. Connors K. A. The stability of cyclodextrin complexes in solution. Chem. Rev. 1997, 97, 1325–1357. 147. Benesi H. A., Hildebrand J. H. J. A spectrophotometric investigation of the interaction of iodine with aromatic hydrocarbons Am. Chem. Soc. 1949, 71, 2703–2707. 148. Higuchi T., Connors K. A. Phase-Solubility Techniques. Adv. Anal. Chem. Instrum. 1965, 4, 117–212. 149. Funasaki N., Neya S. Multiple complexation of didecyldimethylammonium bromide and cyclodextrins deduced from electromotive force measurements. Langmuir 2000, 16, 5343–5346.
109
150. Funasaki N., Nagaoka M., Hirota S. Competitive potentiometric determination of binding constants between α-cyclodextrin and 1-alkanols. Anal. Chim. Acta. 2005, 531, 147–151. 151. Dotsikas Y., Loukas Y. L. Efficient determination and evaluation of model cyclodextrin complex binding constants by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003, 14, 1123–1129. 152. Cunnif J. B., Vouros P. False positives and the detection of cyclodextrin inclusion complexes by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6, 437–447. 153. Zang H., Zang H., Jin W., Ding L. Determination of dissociation constants of cyclodextrin-ligand inclusion complexes by electrospray ionization mass spectrometry. Eur. J. Mass. Spectrom. 2006, 12, 291–299. 154. Lamcharfi E., Chulion S., Kerbal A., Kunesch G., Libot F., Virelizier H. Electrospray ionization mass spectrometry supramolecular chemistry: Characterization of noncovalent cyclodextrin complexes. J. Mass. Spectrom. 1996, 31, 982–986. 155. Kempen E. C., Brodbelt J. S. A method for the determination of binding constants by electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 2000, 72, 5411–5416. 156. Schneider H.-J., Hacket F., Rüdiger V. NMR Studies of Cyclodextrins and Cyclodextrin Complexes. Chem. Rev. 1998, 98, 1755–1785. 157. Casu B., Reggioni, M., Gallo G. G., Vigevani A. Hydrogen bonding and conformation of glucose and polyglucoses in dimethyl-sulphoxide solution. Tetrahedron 1966, 22, 3061–3083. 158. Thakkar A. L, Demarco P. V. Cycloheptaamylose inclusion complexes of barbiturates: correlation between proton magnetic resonance and solubility studies. J. Pharm. Sci. 1971, 60, 652–653. 159. Schneider H.-J., Kramer R., Simova S., Schneider U. Solvent and salt effects on binding constants of organic substrates in macrocyclic host compounds. A general equation measuring hydrophobic binding contributions. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 6442–6448. 160. Connors K. A. Binding Constants Wiley, New York, 1987 161. Neuhaus D., Williamson M. P. The Nuclear Overhauser Effect in Structural and Conformational Analysis, Wiley, 2000 162. Hwang T. L., Shaka A. J., Cross-relaxation without TOCSY: transverse rotating-frame Overhauser effect spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3157–3159. 163. Bangham A. D., Standish H. M., Watkins J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 1965, 13, 238–252. 164. Gregoriadis G. Liposome Technology I-III. CRC Press, London, 2000
110
165. Gregoriadis G. Drug entrapment in liposomes. FEBS Letters 1973, 36, 292–296. 166. Lasic D. D. Doxorubicin in sterically stabilized liposomes, Nature, 1996, 380, 561– 562. 167. Torchilin V. P. Drug Targeting. Eur. J. Pharm. Sci. 2000, 11, 81–91. 168. Janiak M. J., Small D. M., Shipley G. G. Nature of thermal pretransition of synthetic phospholipids: dimyristoyl- and dipalmitoyl-lecithin. Biochemistry 1976, 15, 4575– 4580. 169. Klajnert B., Janiszewska J., Urbanczyk-Lipkowska Z., Bryszewska M., Epand R. M. DSC studies on interactions between low molecular mass peptide dendrimers and model lipid membranes Int. J. Pharm. 2006, 327, 145–152. 170. Swartz H. M. Glockner J. F. Measurement of oxygen by EPRI and EPRS. In: Eaton, G. R., Eaton S. S,. Ohno K. eds. EPR imaging and in vivo EPR. Boca Raton, FL: 261– 290. CRC Press, 1991 171. Rhodes C. J. Electron spin resonance (some chemical applications). Ann. Rep. Prog. Chem. 2006, 102, 166–202. 172. Marsh D. Electron spin resonance: spin labels. In: Grell E. (Ed.) Molecular Biology Biochemistry and Biophysics Membrane Spectroscopy. (31) pp. 51–142. Springer, Berlin, 1981 173. Borbat P. P., Costa-Filho A. J., Earle K. A., Moscicki J. K., Freed J. H. Electron Spin Resonance in Studies of Membranes and Proteins. Science 2001, 291, 266–269. 174. Szakács Zoltán Sokfogú analitikai és biológiai kelátorok protonálódásának jellemzése részecskespecifikus paraméterekkel Doktori (PhD) értekezés Eötvös Loránd Tudományegyetem, Kémia Doktori Iskola 2005 175. Hore P. J. Solvent suppression in fourier transform nuclear magnetic resonance. J. Magn. Reson. 1983, 55, 283–300. 176. MestRe-C kiértékelő program, Verziószám: 3.5.1 Béta Internetcím: http://www.mestrec.com 177. Kyvala M., Lukes I. OPIUM kiértékelő program. Chemometrics ’95, Pardubice, 1995, Book of Abstracts, 63. oldal. Internetcím: http://www.natur.cuni.cz/~kyvala/opium.html 178. Tárkányi G., Quantitative approach for the screening of cyclodextrins by nuclear magnetic resonance spectroscopy in support of chiral separations in liquid chromatography and capillary electrophoresis Enantioseparation of norgestrel with α-, β- and γ-cyclodextrins. J. Chrom. A 2002, 961, 257–276. 179. Gran G. Determination of the equivalence point in potentiometric titrations. Part II. Analyst 1952, 77, 661–671.
111
180. Davies C. W. The extent of dissociation of salts in water. Part X. Dissociation Minima. J. Chem. Soc. 1945, 460–464. 181. Noszál B., Szakács Z. Microscopic protonation equilibria of oxidized glutathione J. Phys. Chem. B 2003, 107, 5074–5080. 182. Corbin A. S., Buchdunger E., Pascal F., Druker B. J. Analysis of the structural basis of specificity inhibition of the Abl kinase by STI571. J. Biol. Chem. 2002, 277, 32214– 32219. 183. Noble M. E. M. Endicott J. A., Johnson L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science 2004, 303, 1800–1805. 184. Csernák O., Buvári-Barcza Á., Samu J., Barcza L. Uncommon interactions of aliphatic dicarboxylic acids with cyclodextrins. J. Incl. Phenom. Macro. 2005, 51, 59–63. 185. Heimburg T. Mechanical aspects of membrane thermodynamics. Biochim. Biophys. Acta 1998, 1415, 147–162. 186. Heimburg T. A model for the lipid pretransition: coupling of ripple formation with the chain-melting transition. Biophys. J. 2000, 78, 1154–1165. 187. Bertholet P., Gueders M., Dive G., Albert A., Barillaro V., Perly B., Cataldo D., Piel G., Delattre L., Evrard B. The effect of cyclodextrins on the aqueous solubility of a new MMP inhibitor: phase solubility, 1H NMR spectroscopy and molecular modeling studies, preparation and stability study of nebulizable solution. J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2005, 8, 164–175. 188. Ali S. M., Maheshwari A., Asmat F., Koketsu M. Complexation of enalapril maleate with beta-cyclodextrin: NMR spectroscopic study in solution. Quim. Nova 2006, 29, 685–688. 189. Al Omari M. M., Zughul M. B., Davies J. E. D., Badwan A. A. Sildenafil/cyclodextrin complexation: stability constants, thermodynamics and guest host interactions probed by 1H NMR and molecular modeling studies. J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 41, 857– 865.
112
7 Összefoglalás A krónikus mieloid leukémia gyógyításának szuverén gyógyszereként 2001-ben bevezetett (Gleevec) hatóanyagát, az imatinibet vizsgáltuk a protonálódás, a ciklodextrinekkel és liposzómákkal való kölcsönhatás egyensúlyi és szerkezeti jellemzése céljából. A négyértékű bázis imatinib sav-bázis tulajdonságait potenciometriás és 1H NMR titrálásokkal vizsgáltuk. A vegyület legbázikusabb csoportja a fiziológiás tartományban protonálódó N-metil-piperazinil nitrogén. Csoportspecifikus állandóink szerint a második proton koordinációja 3,8-szor kedvezőbb a piridil nitrogénen, mint a már kationos piperazin másik nitrogénjén. A csak erősen savas közegben protonálódó fenilamino-pirimidin bázicitását az NMR titrálásból, diklórecetsav in situ pH szenzor használatával tudtuk pontosan meghatározni. Eredményeink alapján a szervezet bármely kompartmentjének pH-ján kiszámítható az imatinib részecskéinek koncentrációeloszlása. A neutrális imatinib oldhatóságát tízszeresére növeltük β-ciklodextrin alkalmazásával. A potenciometriás és NMR-titrálással, valamint fázisoldhatósági UV méréssel meghatározott komplexstabilitási állandók jó egyezést mutatnak. β-ciklodextrin és ennek random metilezett származéka (RAMEB) is a töltésmentes imatinib részecskével alakítja ki a legstabilabb komplexet. Érdekes módon a mono-, di- és trikationos formák affinitása a β-CD-hez növekszik, míg RAMEB komplexeik a várt csökkenő stabilitást mutatják. NMR ROESY kísérletből megállapítottuk, hogy az imatinib β-CD-be foglalt molekularészlete a p-diszubsztituált fenilcsoport. Várakozáson felüli erősségű kölcsönhatást sikerült kimutatnunk az imatinib, valamint DPPC-liposzómák membránja között. A hatóanyag a kis unilamelláris vezikulák (SUV) membránját merevíti, multilamelláris vezikulák (MLV) esetén viszont enyhe fluiditás-növekedést okoz. A semleges és monokationos imatinib MLV-membránokra kifejtett hatása megegyezik, ennek hátterében a lipidek fejcsoportjaival kialakított kölcsönhatás áll. SUV-ok esetén a membránfluiditás csökkenése fúzió és micellarizáció eredménye, amelyet mind fényszórási, mind fagyasztva törést követő elektronmikroszkópos felvételek megerősítenek.
113
8 Summary Equilibrium and structural aspects of protonation, cyclodextrin complex formation and liposomal interactions were studied for imatinib (Gleevec), the active ingredient against chronic myeloid leukemia, introduced in 2001. Acid-base properties of the tetravalent base imatinib were investigated by pHpotentiometric and 1H NMR-pH titrations. The N-methyl-piperazinyl nitrogen has been identified as the most basic site, protonating in the physiological pH range. The site-specific equilibrium constants quantitate that the second hydrogen ion is attached 3.8 times preferably to the pyridyl nitrogen than to the ”inner” nitrogen atom of the already cationic piperazine ring. Protonation of the phenylamino-pirimidine site occurs in highly acidic medium. The pertaining equilibrium constant could be accurately determined using dichloroacetic acid, as an in situ NMR-pH sensor molecule. The results allowed the calculation of concentration distribution for the variously protonated imatinib species at any pH value in aqueous solution or biological compartments. A tenfold increase in the solubility of neutral imatinib was achieved with the aid of β-cyclodextrin. Good agreement has been found between complex stability constants determined by pH-potenciometry, NMR-cyclodextrin titration and phasesolubility UV studies. Both β-CD and its random methylated derivative (RAMEB) were shown to form the most stable complex with the uncharged form of imatinib. Interestingly, the affinity of its mono-, di- and tricationic species to β-CD gradually increases in the respective order, while their RAMEB complexes exhibit the expected descending order of stability. The ROESY NMR spectrum suggests that the p-disubstituted phenyl ring of imatinib is included in the cavity of β-CD.
Unexpectedly significant interaction was detected between imatinib and the membrane of DPPC liposomes. The drug increases the membrane rigidity for small unilamellar vesicles (SUV), whereas a slight increase in membrane fluidity was observed for multilamellar vesicles (MLV). Effects of neutral and monocationic imatinib on MLV membranes are identical, due to their similar interactions with the head groups of lipids. The decrease in SUVs’ membrane fluidity is caused by fusion and micellarization, corroborated by both light scattering and freeze-fracture electron microscopy.
114
9 Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek, Dr. Noszál Béla tanszékvezető egyetemi tanárnak, diákkörös hallgató korom óta nyújtott töretlen szakmai támogatásáért és doktori munkám irányításáért. Megkülönböztetett köszönet illeti Dr. Szakács Zoltán egyetemi tanársegédet, barátomat, aki feltárta előttem a kutatómunka szépségeit és akitől a munkám során felmerülő problémákra mindig önzetlen segítséget kaptam. Köszönet illeti Dr. Őrfi László docenst és Varga Zoltán doktorandusztársamat az imatinib és származékainak szintéziséért. Köszönöm Dr. Gróf Pál docensnek és Dr. Budai Marianna gyakornoknak a liposzómák vizsgálatában nyújtott segítségét. Köszönöm Dr. Barcza Lajos egyetemi tanárnak és Csernák Orsolyának a ciklodextrinek vizsgálatában nyújtott segítségét. Hálával tartozom Takácsné Dr. Novák Krisztina egyetemi tanárnak és Völgyi Gergelynek a metanol-víz elegyben végzett potenciometriás mérésekért és Dr. Ludányi Krisztinának a tömegspektrometriás vizsgálatokért. Köszönöm Dr. Rohonczy Jánosnak (ELTE) és Dr. Kövesdi Istvánnak (EGIS Nyrt.) az NMR mérési lehetőségek biztosítását. Köszönöm az ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén oktató kollégáimnak és a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet valamennyi munkatársának a baráti, inspiráló atmoszférát. Végezetül külön köszönet illeti szüleimet és barátnőmet türelmükért és állandó támogatásukért.
115
