Az állatkísérletekbıl nyert eredmények extrapolációja emberre I: Gyulladásos és metabolikus kórképek állatkísérletes modelljei Rakonczay Zoltán SZTE ÁOK I. sz. Belgyógyászati Klinika
Modell • A rendszer/jelenség leírásának, megértésének az eszköze, a rendszerre/jelenségre vonatkozó ismereteinknek kifejezıje • Egyszerősített, a vizsgálat szempontjából lényegi tulajdonságait kiemelı mása • Összevetjük a forrásául szolgáló valóságos jelenséggel • Kísérletek útján végzünk megfigyeléseket • Fontos követelmény, hogy a modellel méréseket lehessen végezni Boros M (szerkesztı). Állatkísérletek az orvostudományban. Egyetemi jegyzet, 2007.
Modellalkotás célja • • • •
A valóság élethő ábrázolása A fajnak, reakcióinak tanulmányozása (pl. állatorvosi kutatás) Állati viselkedés kutatása Nem gyógyszerészeti készítmények tesztelése (pl. toxicitási vizsgálatok), gyógyszerek kipróbálása (pl. in vivo tesztek új gyógyszerek, vakcinák hatékonyságának kipróbálására, ún. fázis 2 vizsgálatok) • Oktatási cél (pl. hallgatók szakmai gyakorlatszerzése) • Általános orvostudományi cél (pl. AIDS, rosszindulatú daganatok kialakulásának kutatása, xenotranszplantáció lehetısége) • Biológiai, nem közvetlenül orvosi célú kutatás (pl. általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása, következtetések humán biológiai mechanizmusokra, vagyis az alapkutatás)
Modellalkotás elvei • szeparáció (a rendszert vagy jelenséget el kell különíteni a külsı világtól) • szelekció (a megvalósítandó cél szempontjából szelektálni kell a kölcsönhatások között) • gazdaságosság (a lehetıségek közül a legegyszerőbbnek kell lennie)
Boros M (szerkesztı). Állatkísérletek az orvostudományban. Egyetemi jegyzet, 2007.
A modell, mint hibaforrás • Ha egy komplex kérdés megközelítéséhez egyszerősített modelleket alkotunk, számos fontos tényezıt kell elhanyagolni a probléma tanulmányozhatóságának érdekében • Nem szabad általánosítani, generalizálni, és megfeledkezni a modellalkotáskor elhanyagolt tényezıkrıl (pl. in vitro vs. in vivo kísérletek, vagy a különbözı speciesekben kapott eredmények extrapolációja) • Fontos az elınyök és hátrányok ismerete! Boros M (szerkesztı). Állatkísérletek az orvostudományban. Egyetemi jegyzet, 2007.
Modellek az orvos-biológiai gyakorlatban 1. • In vivo (humán, állat – leggyakrabban rágcsálók) • Akut • Szubakut • Krónikus
• In vitro (ex vivo) – Egész szerv perfúziója (pl. izolált, perfundált szív, az ún. Langendorff-féle preparátum) – Szövet szuperfúzió – Primer sejttenyészet vizsgálata – Immortalizált sejtvonalak – Szubcelluláris vizsgálatok – Molekuláris vizsgálatok, gén, protein expresszió
• In silico
Modellek az orvos-biológiai gyakorlatban 2. • Spontán
• Indukált: pl. betegség kiváltás, sebészi beavatkozás, enzimgátlás, genetikai manipulációk • Negatív: kutya (atherosclerosis), majom (HIV), zsiráf (varicositas)
Miért van szükségünk állatkísérletes modellekre? • Pathomechanizmus vizsgálata (emberben a betegségek korai történései általában nem vizsgálhatóak) • Megelızés: diftéria (ló); járványos gyermekbénulás (nyúl, majom); bárányhimlı (majom); kanyaró (majom) • Terápiás lehetıségek kipróbálása (preklinikai vizsgálat) • Fejlesztés: minimálisan invazív sebészet (disznó); nyitott szívmőtét (kutya) • Jogi, etikai okok
Kísérletes modellek kívánatos kritériumai, elınyei • • • • • • • • • • •
Könnyen kivitelezhetı Költséghatékony Reprodukálható Különbözı súlyosságú kórforma is létrehozható Homogén súlyosságú csoportok Tetszıleges számban ismételhetıek Komplex folyamatok izolált elemeinek vizsgálata A kísérleti körülmények szabad változtathatósága Betegség különbözı szakaszainak vizsgálatára ad lehetıséget Idıbeli lefolyás könnyen vizsgálható Reprodukálja a humán betegség jellegzetes klinikai, laboratóriumi és szövettani jeleit
Kísérletes vizsgálatok – elvárások • Jellegzetes laboratóriumi eltérések • Jellegzetes szövettani eltérések kialakulása • Szövıdmények megjelenése (mortalitás)
Egyik modell sem tudja teljes mértékben reprodukálni a humán betegséget!
Gyulladásos kórképek állat modelljei
Gyulladás A szervezetet ért károsító behatásra kialakuló nem specifikus válaszreakció Kiváltó okai • Fizikai (trauma, idegentest, mőtét, égés, fagyás, besugárzás) • Kémiai • Biológiai (baktériumok, vírusok, gombák, protozonok) • Necrosist követıen • Immunológiai (autoimmun, immunkomplex mediált betegségek)
Lokalizáció alapján Lokalizált Generalizált
Idıbeni lefolyás alapján AkutKrónikus
A gyulladás folyamatának vizsgálására alkalmas gyakori állatmodellek Maga a gyulladás folyamatának vizsgálata (pl. fájdalom, rheológiai vizsgálatok, gyulladáscsökkentés lehetıségei) rágcsálókon
Akut modellek Szubakut modellek • Karragén (szulfatált poliszacharid) • Hisztamin • Ecetsav • Xilén • UV-erythema • Arachidonsav • Forbol mirisztát acetát • Oxazolon - indukálta akut gyulladás
Krónikus modellek
• Karragén indukálta granulóma modell
• Gyapot golyók által indukált granulóma
• Formalin indukálta
• Üvegrúd által indukált granulóma
Leggyakrabban használt szisztémás gyulladásos (szepszis) állatmodellek
Kardiológiában használatos leggyakoribb gyulladásos állatmodellek Atherosclerosis Myocarditis
Endocarditis Cardiomiopátia
• Sertések spontán hajlamosak rá, de potencírozható atherogén étrenddel
(szívbelhártya gyulladás, leggyakrabban bakteriális fertızés miatt)
(szívizom gyulladása, leggyakrabban vírusinfekció következtében)
• Nyulak: Atherogén étrenden tartva, de vannak spontán Egerek fertızése hypercholesterinaemiás Coxackie/ EMC törzsek is vírussal • Az atherogén étrend magas zsír és koleszterin tartalommal bír! • Egerek: Leggyakrabban transzgén állatok: ApoE knock out (KO), valamint LDL-R KO állatok
(Szívizom elfajulása veleszületett/szerzett okok következtében)
Aranyhörcsög hajlamos a Egér szívbillentyőinek veleszületett spontán roncsolása katéterrel, cardiomiopátiára valamint Staphylococcus aureussal való megfertızése
Pulmonológiában használatos leggyakoribb gyulladásos állatmodellek Egér és humán tüdı anatómiája különbözı!
Asthma bronchiale (a légutak reverzibilis szőkületével, a nyálkahártya ödémájával, a bronchiális simaizmok görcsével járó krónikus gyulladás) Spontán: macska, ló Patkány, tengerimalac, kutya, bárány: Szenzitizáció Ascaris antigénekkel Egér (BALB/c): Szenzitizáció ovalbumin (+adjuváns), házi por atka, csótány antigén, Aspergillus fumigatus, parlagfő antigénekkel DE: Egérben, patkányban nem alakul ki krónikus aszthma: immuntolerancia; rövid idejő magas allergén expozíció; hízósejtek, eozinofilok és IgE szerepe vitatott
Krónikus Obstruktív Tüdıbetegségek (COPD) (a légutak irreverzibilis szőkületével, a tüdıszövet pusztulásával, légzési elégtelenséggel járó krónikus gyulladás, amelyet humánban elsısorban a dohányzás okoz)
Pneumónia modellek Egerek intratracheális/ intranasalis fertızése különbözı kórokozókkal (Mycoplasma, Chlamydia, vírusok)
-cigarettafüst belégzéssel indukált modell Akut Légzési -VEGF, VEGF-R gátlásával apoptózist kiváltó modell (Th2 infl.) Elégtelenség -Elasztáz belégzéssel kiváltott modell (ARDS) -Éheztetéssel kiváltott modell modellek -Lipopoliszacharid (LPS) belégzéssel kiváltott modell Egérben: LPS; -KO egerek (mátrix metalloproteináz inhibitor fehérje, α1-antitripszin hiányos savak inhalációja, egértörzsek) VILI és hyperoxia
Nefrológiában használatos leggyakoribb gyulladásos állatmodellek Nephritis: a vese gyulladása (glomerulonephritis: általában autoimmun, pyelonephritis: általában fertızés, tubulointerstitiális nephritis: gyógyszerek/kórokozók)
Membranózus glomerulonephritis Hayemann nephritis: heterológ nyúl/ bárány antiszérum beadva proximális tubulus hámsejt antigénekkel
Cryoglobulinémiás nephritis Thymus stromális Lymphopoetin overexpresszáló egerek Egér hybridóma sejtek infúziója
Anti-GBM nephritis Egér, patkányban: Bárány/nyúl IgG-vel immunizáció, majd antiglomerulusbazálmembrán antitestek beinjektálása Lupus nephritis Spontán lupusos egértörzsek: Újzélandi fehér, Újzélandi fekete F1 egerek KO egerek pl: BIM; CD22; CD72
Mesangioproliferatív nephritis/ IgA nephritis/ HenochSchönlein purpurához társuló nephritis Anti-Thy1.1 monoclonalis ellenanyag iv. injekciója
Reumatológiában használatos leggyakoribb gyulladásos állatmodellek Reumatoid arthritis: Fıként az ízületeket érintı, de szisztémás autoimmun, krónikus gyulladásos megbetegedés
Experimentális arthritisek (intraartikuláris injekcióval)
•Kollagén-indukálta (egér, patkány) –
T-lymphocyták szerepe, methotrexat és dexamethason nem hatásos, anti-TNF-α kezelés
•Antigén/antitest-indukálta (egér) •Adjuváns-indukálta (patkány, egér) •Zymyosan (poliszacharid)-indukálta •Prisztán-olaj-indukálta (patkány) •Transzgén egerek használata (pl. TNF-α overexpresszáló egerek) •Ovalbumin-indukálta (nyúl) •Levegı-pouch-indukálta (egér, patkány)
Neurológiában használatos gyulladásos állatmodellek Sclerózis multiplex Ismeretlen eredető fehérállományt érintı gyulladásos megbetegedés Rágcsálókban modellbetegség neve: experimentális autoimmun/allergiás encephalomyelitis Autoimmun rágcsáló modell: Agy kivonat, myelin bázikus fehérje bejuttatása a rágcsálóba, a vér-agy gát megnyitása pertusszisz toxinnal Virális egér modellek: Semliki Forest Vírus, Theiler egér encephalomyelitis vírus Natalizumab farmakonkinetikai és farmakodinámiás tulajdonságai hasonlóak egérben és humánban, de emberben progresszív multifokális encephalopathia jelenhet meg.
Meningitis Streptococcus pneumoniae bejuttatása egerek középfülébe/ belsı fülébe
Encephalitis Egerek megfertızése Japán encephalitis vírussal (JEV) West-Nile vírussal (WNV)
Dermatológiában gyakran használatos gyulladásos állatmodellek Atópiás dermatitisz •Haptén-indukálta egér modell •Szuperantigén-indukálta egér modell •Étel túlérzékenységgelindukált modell •IL-4; IL-31; IL-18; Kaszpáz-1; Kimotriptáz C; Apolipoprotein C1 transzgén egerek •RELB; Katepszin E KO
Kontakt dermatitisz •Nikkel-szulfát •Fenol •Nátrium-laurylszulfát
Psoriasis Spontán mutáns egértörzsek: •Homozigóta asebia egerek •Flaky skin egerek •Chronicus proliferatív dermatitises egerek Génmódosított állatok: (Számtalan modell létezik) Pl: HLAB27/bmicroglobulin overexpresszáló patkány Xenotranszplantáció (beteg ember bırét immunhiányos egérre operálni)
Gasztroenterológiában használatos leggyakoribb gyulladásos állatmodellek • Gyulladásos bélbetegségek • Hepatitis • Pancreatitis • Peptikus fekély • Barrett oesophagus
IBD patogenezisében szerepet játszó faktorok Crohn betegség Th1 citokinek, interleukin (IL)-12, TNF-α, IFN-γ Lymphocyta+MΦ Colitis ulcerosa Th2 citokinek, IL5, IL-13 Lymphocyta+gran ulocyta Anti-TNF-α kezelés Hisamatsu et al., Pharmacol Ther. 2013; 137:283-97.
IBD modellek • Kémiailag- és hapténnel-indukált – dextran sulfate sodium (DSS) (Okayasu et al., 1990) – trinitrobenzene-sulfonic acid (TNBS) (Neurath et al., 1995) – oxazolone (Boirivant et al., 1998)
• Spontán-kifejlıdı - Senescence accelerated mouse prone (SAMP) 1/Yit • T-sejt transzfer CD4+CD45RBhighCD25− • Transzgenikus – interleukin-7 (IL-7)
• Immunregulátor KO – – – –
interleukin-10 (IL-10) interleukin-2 (IL-2) és IL-2 receptor alpha (IL-2Ralpha) T-cell receptor alpha (TCRalpha) dnKO (dominant negative TGFbetaRII + IL-10R2)
Hepatitisek gyakoribb okai • vírusok (HAV, HBV, HCV, stb.) • alkohol és gyógyszer • autoimmun májbetegségek • anyagcsere-betegségekhez társuló formák (nem alkoholos steatohepatitis, vas- és rézraktározási betegség) Kémiai indukció: széntetraklorid
Hepatitis modellállatok • Csimpánz (HCV) – nem használható kísérletre • Mókuscickány (HCV) • Kiméra xenograft egerek
Billerbeck et al., Curr Top Microbiol Immunol 2013
Akut pankreatitisz • • • •
A hasnyálmirigy hirtelen kialakuló gyulladása 80%-ban enyhe, ödémás lefolyású 20%-ban súlyos nekrotizáló forma jön létre Mortalitása magas (5-10%), ennek okai: – Korai: Citokin „vihar” miatt szisztémás szövıdmények: akut légzési elégtelenség (ARDS), akut veseelégteleség (ATN), véralvadási zavarok (DIC), kerigési elégtelenség – Késıi: Fertızések miatt szeptikus sokk
• A pathomechanizmus nem ismert • Nincs specifikus terápia
Akut pancreatitis etiológiája és patomechanizmusa • Alkohol • Biliaris eredet: kı, microlithiasis
Intracelluláris faktorok Ca2+ terhelés Szekréciós blokk Emésztıenzim aktiváció NF-κ κB aktiváció Gyulladásos mediátorok ER stressz ATP szint csökkenés Sejthalál
70-80%
Extracelluláris faktorok Neurális válaszok Vaszkuláris lézió Szisztémás immunválaszok Aktivált enzimek Keringı citokinek Szekunder infekció
Az akut pankreatitisz patogenezise SIRS (Szisztémás immunválasz) Terápiás ablak
A beteg felvétele Proinflammatorikus citokinek Többszervi elégtelenség 12
Fájdalom megjelenése
24
36
48
Idı (h)
60
72
94
Nem-invazív akut pancreatitis modellek • Kolecisztokinin (CCK)/cerulein-indukálta Patkány
Egér
2x20 µg/kg cerulein i.p.
10x50 µg/kg cerulein i.p.
Nem-invazív akut pancreatitis modellek • Bázikus aminosavak által indukált – L-arginin – L-ornitin – L-lizin
• CDE diéta-indukált – Fiatal nıstény egerek
• Alkohollal kiváltott? • Immun (toxinok, szérum)-mediált
Invazív akut pancreatitis modellek • • • •
Retrográd duktális injekció Zárt duodenenum kacs kialakítása Ductus ligáció és obstrukció Vaszkuláris (artéria vagy véna okklúzió)
Pallagi et al., Crit Care Med, 2013
Schleicher et al., Ann Surg, 2001
Akut pancreatitis modellek összehasonlítása (a jó és a rossz ) MODEL TYPE
CDE DIET (mouse)
AMINO ACID ARGININE (mouse/rat)
SECRETAGOGUE CERULEIN (mouse/rat)
BILE ACID DUCT INFUSION (mouse/rat)
RELEVANT INDUCTION EVENT
NO
NO
NO
? YES
LOBULAR & PATCHY PATHOLOGY
NO
NO
NO
YES
CONTROLLABLE SEVERITY
NO
YES IN RATS
YES
YES
SYSTEMIC TOXICITY
YES
YES
NO
NO
UNCONTROLLABLE LETHALITY
YES
YES IN MICE
NO
NO
KNOCK-OUT ANIMALS
YES
YES
YES
YES
IN VITRO CORRELATE
NO
YES
YES
YES
NEED FOR SURGERY AND ANESTHESIA
NO
NO
NO
YES
(ANIMAL)
Hegyi et al., The Pancreapedia, 2013
Krónikus Pancreatitis • A hasnyálmirigy állományának irreverzibilis pusztulása • Állandósult fájdalom, fogyás, emésztési, felszívódási zavarok • Gyakran az endokrin hasnyálmirigy is károsodik: Diabetes mellitus • Hasnyálmirigy rák kialakulásának kockázata fokozott - Acinusok atrófiája - Tágult ductusok, bennük fehérje és kálcium kövek - Interstitium fibrózis - Endokrin állomány „eltőnt”
Krónikus pancreatitis modellek • Spontán krónikus pancreatitis Wistar Bonn/ Kobori patkányokban • Transzgenikus egerek: – TGF-β 1 túlexpresszió – IL1β-t túlexpresszáló – R122H PRSS1 mutáns • Trinitrobenzene sulfonic acid intraduktális injekciója • Dibutyltin dichloride i.v. injekciója • 3.5 g/kg L-arginin napi injekciója 1-4 héten át • Tartós pancreas ductális hypertension • Alkoholos (Lieber-DeCarli) diéta kombinálva: – magas zsírtartalmú diétával – epevezeték és fı pancreas vezeték átmeneti okklúziójával Ethibloc-kal – két hétig napi 20 mg/kg cyclosporin A, 7. héten 4x20 ug/kg cerulein. – repetitív cerulein injekciókkal
Gasztroenterológiában használatos leggyakoribb gyulladásos állatmodellek Barrett oesophagus – reflux esophagitis (krónikus gyomornedv expozíció következtében létrejött hengerhám metaplázia a nyelıcsı laphámjában) – fokozott cc rizikó Patkány: esophagojejunosztómia, esophagoduodenosztómia, totál gasztrektómia Egér: Transzgén állatok (sex-determining region Y box 2, SOX2 KO) Cink-hiányos/deoxykólsavat tartalmazó diéta CC indukció: nitrózamin, ill. nitrózamin származékok adminisztrációja heteken át Kialakuló cc általában laphámmal kombinált
Peptikus fekély • Fizikai hatásokra kialakuló: immerziós stressz, immobilizációs stressz, elektromos shock • Mőtéti beavatkozással elıidézett: pylorus ligáció, I/R • Kémiai: pl. etanol, ecetsav, NSAID (pl. aszpirin, indometacin, ibuprofen), hisztamin, szerotonin, rezerpin • Biológiai: fogékony egerekben Helicobacter felis infekció
Egyszerő módszerek a gyulladás mértékének megállapítására • Laboratóriumi – szövetsúly – NF-κB aktiváció, citokin, kemokin expresszió (mRNS, fehérje) – gyulladásos fehérjék (pl. CRP) – mieloperoxidáz aktivitás
• Morfológiai (szövettan) – ödéma – nekrózis, apoptózis – gyulladásos infiltráció
„To date, there have been nearly 150 clinical trials testing candidate agents intended to block the inflammatory response in critically ill patients, and every one of these trials failed.”
Mi lehet a terápiás kudarc oka? • Fajbeli különbségek (sejtösszetétel, metabolizmus, génexpresszió) • Különbözı a betegség patogenezise, lefolyása • Inhomogén betegcsoport • Modell-specifikus hatás • Elı- vs. utókezelés • Farmakon dozírozás, toxicitás
Fehérvérsejtekben vizsgált genomikai válaszok összehasonlítása akut gyulladásos betegségekben Vizsgálat 1 egértörzsben és fehérvérsejtekben ! Törzsbeli immunválasz különbségek ismertek LPS dózisában 250x-s különbség, más a szenzitivitás; emberben i.v., egérben i.p. adagolás Betegségek idıbeli lefutása más emberben és egérben Terápiás intervenció hatása nem zárható ki Microarray eredmények validálása nem volt bemutatva Seok et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:3507-12.
Metabolikus kórképek modelljei
• Diabetes mellitus, hiperglikemia • Obesistas, hiperlipidemia • Hiperurikemia
Diabetes mellitus típusainak összehasonlítása
10-20%
80-90%
Diabetes mellitus (DM) modellek
Sakata et al., Exp Diabetes Res 2012. NOD: nonobese diabetic, BB: biobreeding, OLETF: Otsuka Long-Evans Tokushima fatty ISR: insulin receptor substrate
I. típusú DM modellek: NOD egér • • • • • • • •
Insulitis 4-5 hetes korban Kifejlett DM 12-14(-30) hetes korban Autoantitestek: inzulin, GAD, ICA Inzulin deficiencia: ált. enyhe(-súlyos) Enyhe ketoacidózis Asszociált sialadenitis, thyroiditis MHC régió érintettség Hímek 20-30%-ban alakul ki, nıstények 6080%-ban (korai insulitis mk. nemben megvan)
I. típusú DM modellek: BB patkány • • • • • • •
Betegség 12 (7-14) hetes korban alakul ki Autoantitestek: ICA (GAD, IAA?) Inzulin deficiencia: súlyos Súlyos ketoacidózis Asszociált thyroiditis MHC régió érintettség Hím/nıstény érintettség egyforma
Humán és állati DM közötti különbségek • Szigetsejtek – Sejtarchitektúra és összetétel (rágcsálókban a non-β sejtek a β-sejt tömegek körül helyezkednek el) – Proliferatív aktivitás – Károsodási hajlam – Amyloid formációs készség – Génexpresszió (HSPk, transzkripciós faktorok, GLUT1, GLUT2)
• Immunrendszer • Szövıdmények
Indukált diabetes modellek: stretozotocin • Nitrosurea származék (antibiotikum és antineoplasticum) • Glükózhoz hasonló struktúra • Befolyásolja a glükóz transzportot (GLUT2 – β sejtekben magas expresszió – szelektív toxicitás) • Alkilálószer (DNS szár törések) • Egyszeri nagy adag (toxicitás) vs. több kis adag (pl. 40 mg/kg 5 napon át) • I.v. vs. i.p. • Fogékony állatokban insulinopeniás diabetest okoz
Indukált diabetes modellek: alloxán
• Pirimidin származék • Felvétel GLUT2-n keresztül • Glükóz transzport mellett a glükokináz funkciót is gátolja • Thiolok jelenlétében ROS termelés
Obesitas modellek • Monogénes – KK-Ay mutáns aguti protein (melanocortin 4 receptor antagonista, egér) – ob/ob (leptin deficiens, egér) – db/db (leptin receptor defektus, egér) – fa/fa (Zucker rat, leptin receptor defektus)
• Poligénes – Goto Kakizaki (GK) rat ( inz. szekréció)
• Diéta-indukált (törzsbeli különbségek)
Hiperurikemia • Urikáz (utát oxidáz): humánban nincs • Urát + O2 + H2O → 5-hidroxiizourát + H2O2 → allantoin + CO2 • Urikáz gátlás: oxonát (kompetitív, gyorsan eliminálódik)
Összefoglalás • A betegségek modellezése egy „szükséges rossz” • A modellek nem tudják teljes mértékben reprodukálni a humán betegséget • A modellek NEM haszontalanok (ld. anti-TNF kezelés rheumatoid arthritisben és IBD-ben) • Fontos ismerni az adott modell elınyeit és hátrányait • Mértéktartóan következtessünk a humán kórfolyamatokra
