Avidin – biotin rendszer
Avidin: 4 alegység, 16 400 Da 66 000 Da glikoprotein Green NM „Avidin” Adv Prot Chem 29 85 (1975) biotin kötőhely/alegység; CH kötőhely/alegység pI ~ 10 avidin – biotin 1.3*10-15 M (Trp, Lys kötőhely) stabilitás (8 M UREA, 3M Guanidin.HCl) nem-specifikus kötődés is Streptavidin „Streptomyces avidinii” 4 alegység, 60 000 Da protein biotin kötőhely/alegység pI 5 – 6 kisebb nem-specifikus kötődés
Biotin
D-biotin, (hexahidro-2-oxo-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-pentánsav) minden sejt, kis mennyiség kofaktor R (CO2 transzport) előfordulás: Lys ε-aminocsoport BIOCITIN hiánybetegség (1927, BOAS)
Konjugátumok O NH NH HOOC tartó
pentánsav
biotin
reaktív csoport
Szempontok kötőhelyek „mélysége” 9 Å biotin származék gyengébb kölcsönhatás
+
pl. iminobiotin
NH2 Br
-
NH NH HOOC
pH 4
S
Biotinálás -NH2, -SH, -C=O, -COOH, fotoreaktív
S
pH 1.5
O
-NH2
O
NH
NH NH
NH O
HOOC
S
S
D-biotin
H2N
+ 6-aminokapronsav
N
HÁROMFUNKCIÓS KONJUGÁTUM
O
N
13.5 A
R Aktív észter
O
O
O
O
BIOCITIN
HOOC
Karbodiimid
O
NH
R=H R = SO3Na
R
NHS-biotin Szulfo-NHS-biotin +
NH2 Br
O O
O
NH Szukcinimidil-6-(biotinamido)-hexanoát NHS-LC-biotin R = H, R = SO3Na 22.4 A
-
NH NH HOOC
O
S
O
O
HN
S
Iminobiotin N
S
O
NH O
R
S
O NHS-SS-BIOTIN
Affinitás kromatográfia
NH
24.3 A
-SH
a
O H N
N NH NH (CH2)4
O O MALEIMIDO
(CH2) 4 O
BUTÁN
O NH
S BIOTIN TIOÉTER KÖTÉS
pH 6.5-7.5
32.6 A
DMF/DMSO
BIOTIN-BMCC
H N
b S N
S
(CH2)2
NH NH (CH2)6
O
(CH2)4 O
2-piridilditio propionsavamid
O NH
S Biotin DISZULFID KÖTÉS
pH 7 EDTA DMF/DMSO
29.2 A
BIOTIN-HPDP
-CHO H N H2N
NH
(CH2)4 O
O
H N
O H2N
NH
NH
S
NH (CH2)5
(CH2)4 O
BIOTIN HIDRAZID
BIOTIN-LC-HIDRAZID
15.7 A
24.7 A
-COOH H N H2N
S
NH (CH2)5
(CH2)4 O
S
5-(biotinamido)pentilamin
O NH
O NH
Biokonjugátumok szintézise, a konjugátumok jellemzése, problémák A. 1)
Szintézis módszerek Reakciótípusok Egy-lépéses (single pot) két partner pl. direkt jelölés két partner + kapcsolószer pl. homobifunkciós reagens Két-lépéses két partner + kapcsolószer: első lépés: egyik partner + kapcsolószer második lépés: „aktivált” első partner + másik partner pl. heterobifunkciós reagens (MBS) homobifunkciós reagens (toluol-2,4-diizocianát, glutáraldehid)
Három lépéses 1. IgG
+
NH2
O N H
NH
IgG
N3
O
N H
PIRROL-α-ACILAZID
2. HSA
+
N
+
+
N
N
N
HSA
pH < 7
bis-diazo-p-fenilén diamin
3.
IgG
O
NH H N N
N N
Howard AN, Wild F: Br J Exp Pathol 38 640 (1957)
pl. immunokonjugátumok, immunotoxinok
N
HSA
N
N
+
N
N
Többlépéses IgG
NH2
Tx O
1.
N
+
(CH2)2
O O
NH
(CH2)2
S
2.
S
+
N SPDP
O IgG
S
NH2
Tx
S
O
NH
(CH2)2 O
N
N
3.
4.
HN IgG
NH
(CH2)2 O
S
S
S
S
Tx
(CH2)2 O
Tx
+
NH
DTT
(CH2)2 O
SH
2)
Reakciókörülmények reagens / kapcsolóágens megválasztása pH [reagens, funkciós csoport, partnerek funkciója] reakcióidő [30 perc - nap] fény [UV – látható] hő inoerősség [ionizáltság mértéke, konformáció] moláris arányok koncentráció oldékonyság oldószer
pl.
N-hidroxi szukcinimidek – hidrolízis STRATÉGIA – kis hőmérsékletfüggés – perc – óra – koncentráció 0.05-9 mM
10 perc pH 8.6 4-5 óra pH 7.0
B.
Analízis módszerek [kicsi – nagy, nagy – nagy] dialízis
– molekulatömeg – időtartam – molekulaméret – „csere” – molekulatöltés – oldószer UC – méret – hőmérséklet gélszűrés/GPC Sephadex, Bio-Gel P – méret különbség (alak!) – detektálási módszer (cpm, UV stb.) – eluens (oldékonyság, stabilitás) – molekulaméret - standardek HPLC elektroforézis – papír – gél (PAGE, AGAR) egy/két – detektálási módszerek dimenzió
méret
töltés
(Festés, cpm, UV, fluoreszcencia) (Funkcionális: enzimaktivitás, immunoreaktivitás)
C.
Komplikációk, problémák Heterogenitás – ennek jellemzése / oldékonyság reprodukálhatóság /specificitás, szelektivitás/ a szubsztitúció mértékének meghatározása (spektroszkópia, cpm, MS … stb.) stabilitás („polc”, oldat vs. idő, körülmények) – kémiai (pl. aggregálódás) – funkcionális (pl. enzim) immunogenitás / allergizáló hatás denaturáció biodisztribúció sejtbe jutás módja
Egy „arany”-os történet
Zsigmondy R (1905) kolloidális arany-sol (< 10 nm) Faulk WP, Taylor GM (1971) „immunogold” elektronmikroszkóp (Immunochemistry 8 1081-1083) blotting flow-cytometry hibridizáció (1990/1991)
1.
Monodiszperz arany-szuszpenzió előállítása HAuCl4
klóraranysav / K2CO3 oldat
Nacitrát aszkorbinsav
15 – 150 nm 6 – 15 nm
1983
foszfor
< 5 nm
1905
NaBH4
2 nm
1984
Σ Redukció: Au3+ Auo
2.
Protein – arany konjugátum
Ionos kölcsönhatás
Datív kötés Arany részecske
Hidrofób kölcsönhatás
Deryagin BV, Landau L (1941) ActaPhysiochim VRSS 14 633-662 Verwey EJW, Overbeck JTG (1948) „Theory of the stability of lyophobic colloids” Elsevier DVLO teória
Mechanizmus/előállítás
(kék)
+ Na+Clvagy puffer
Arany-szol (narancsvörös)
protein (narancsvörös)
követés: • színváltozás • λ = 580 nm változás
protein (2.5 – 40 µg)
Arany-szol (0.25 ml)
Abszorpció Horisberger M et al. Experienta 31 1147-49 (1975)
λ = 580 nm +10% NaCl
ellenőrzés
1 min
a) koaguláció λ = 580 nm ↑ b) nincs változás
Befolyásoló tényezők a protein töltésviszonyai pI az abszorpciós folyamat pH-ja
Gyakorlat próbák nincs univerzális protokol 10% többlet a fehérjéből, mint a minimum pI környezetében menjen a reakció
Előnyei láthatóvá tétel / mikroszkópia stabil (v.ö. fluorofór, kromofór) biztonságos (v.ö. radioizotóp) kvantitatív mérés
Ellis IO et al. J Histochem Cytochem 36 121-124 (1988)
Antitesttel fedett arany részecske
Lektinnel fedett felszín
Célsejt Arany részecske
BOG-Hansen TC et al. J Immunol Meth 22 293 (1978) Poliszacharid lánc
Glükoproteinek és glükolipidek
Extracelluláris
Sejtmembrán Intracelluláris
Specifikus kötődés a cukor felismerő egységhez
Az A fehérje fedi a részecske felszínét
Streptavidin adszorbeálva az arany felszínéhez
Arany részecske
Arany részecske
Az A fehérje kötődése az antitest Fc régiójához Antitest kötődése az antigénhez
Antitest kötődése az antigénhez
Szövet
Jemmenson R, Agre M J Histochem Cytochem 35 1277 (1987)
Biotinilált antitest
Szövet
Moreis RE, Saelinger CB J Histochem Cytochem 32 124-128 (1984)
