ANALISIS SEKUEN DNA YAMG TERLIBAT DAIAM PATUGENISITAS DAN PERANCANGAN PRIMER PCR SPESlF lK UNTUK Xanthomonas axonopodis pv. glycines
SEKOUH PASCASARJANA I NSTlTUTFPERTANIAN BOGQR 20M
E m PRATIWI. Analisis sekuen DNA yang terfibat dalam patugenisitas dan perancangan primer PCR spesif ik untuk Xanthomonas axonapodjs pv. glycines, Dibimbing oleh ANTQNlUS SUWANTQ (Ketua Kornisi Wrnbimbing), BUD1 TJAHJONO, MAGGY 7". SUHARTONO, APIJA MERYARIDINI, dan
M. MACHMUD
(Anggofa Komisi Psrnbimbing).
Xanfhomonas axunopodis pv . glycines (Xag) manyeba bkan penyakit pustul
bakteri pada kultivar-kuftivar kedelai yang rentan. Pemahaman terhadap rnakanisme patugenisitas dan interaksi antara tanaman kedetai dengan Xag sangat penting
untuk rnengembangkan strategi pengendatian penyakit. Panefitian ini bertujuan untuk: (i) rnanganalisis gen yang terlibat dalam patogenisitas Xag sebagai suatu
pendekatan dalam memahami mekanisrne patogenisitas pada Xag, dan (ii) rnerancang primer-primer PCR spesifik terhadap Xag.
Mu&# non-patogenik Xag M715 telafi dikanstnrksi dari Xag YR32 tipe liar rnalalui mutagenesis transposan rnenggunakan transpason turunan 375. Dari hasil analisis sekuen DNA diketahui bahwzl gen yang diinaktivasi alah transpuson pada mutan M715 rnenyandikan TunB-dependent m p f o r yang befperan dalam pengambilan kornpleks ~a*-sidetofor ka &lam sel.
lntroduksi plasmid yang
mengandung fragmen DNA dad gen patagenisitas Xag YR32 pada M715 rnsrnulihkan patogenisitas M715 secara parsial. Pada penelitian ini telah berbasil diklon fragmen DNA berukuran 1.8 kbPstl
dari genom Xag YR32, juga telah behasil dirancang dua primer PCR yang spesik terhadap Xag yaitu: primer EttyOl (5'-TTgCggCgATTg-3') dan primer EttyO2 (5'-
CgCATgCCATFg-3'). Arnplifikasi
DNA genorn Xag menggunakan kedua primer ini
menghasilkan satu arnplikan barukuran 436 bp.
Analisis hibridisasi Southern
terhadap lima patovar Xanfhamonas dan lima isolat Xag tipe liar asal Indonesia dan Taiwan menunjukkan bahwa gen patoganisitas ini sangat spesifik ierhadap Xag.
ABSTRACT
ETTY PRATIWI. Analysis of DNA sequence involved in pathogenicity and design of specific PCR primer for
Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Supervised by
ANTQNIUS SUWANTU (Chairman of advisor), BUD1 TJAHJQNQ, M G G Y 1".
SUHARTONO, ANJA MERYANDINI, and M. MACHMUD (Coadvisors).
Xanfhomonas axompodis pv, glycines (Xag) causes bacterial pustules an susceptible soybean cultivars.
Therefore, understanding on the? mechanism of
-
pathogenicity and soybean Xag interaction are paramount impartant to develop strategy far disease control and as a model system fur a similar phenomenon. The
objectives of this work are: (i) to identify pathogenicity gene(s) of Xag as an
approach to understand the mechanism underlying specific pathogsnicrty in this group of bacteria, and (ii) to design specific PCR primers for Xag. A non-pathogenic
Xag mutant derived from the wild type strain Xag YR32, designated M715, was constructed employing a mini-Tn5 transpusan. We have cloned a 1.8 kb-Pstl DNA
fragment from Xag YR32.
DNA sequence analysis indicated that the gene
inactivated by the transposon in M"7 5 encoded a TonB-dependent receptor which is invofved in uptake of ferric-siderophore into the cell. Introduction of a broad-host range plasmid harboring a corresponding DNA fragment from the Xag YR32 into MY15 restored, albeit partially, pathogenicity of the mutant. We have designed two
specific PCR primers for Xag, i.e., EttyOl (5'-TTgCggCgATTg-3') and EttyQ2 (5'CgCATgCCATTg-3'). Arnpfificatian af Xag genornic DNA employing these specific
primers generated a 436-bp amplimn.
Southern hybridization analysis of five
pathavars of Xanfhomonas and five wild types of Xag from Indonesia and Taiwan indicated that the pathogenicity gene was unique to Xag.
Saya mahasiswa Pascasarjana fnstitut Pertanian B q a r yang bsrtanda
tangan di bawah ini: Mama
: Etty Pratiwi
NRP
: 99.5127
Program Studi
: Biofogi
Sub Program Studi
: Mikrabialogi
rnenysrtakan bahwa disertasi saya yang berjudul:
"Analisis Sekuen DNA yang Tertibat dalam Patogenisitas dan Perancangan Primer PCR Spesifik untuk Xanfhomnes axonopodis pv, glycims"
adalah benar-benar hasil penelitian dan tulisan saya, seda disertasi ini M u m pernah dipublikasikan. Dernikian swat pernyataan in! dibuat dengan sebenar-benamya, tanpa ada
paksaan dari pihak mana pun juga.
Bogor, April 2004 Yang mernberi gemyataan,
ANALlStS SEKUEN DNA YANG TERLIBAT DAMM PATOGENISITAS DAN PERANCANGAN PRIMER PCR SPESlFlK UNTUK Xanthomonas axonopodis pv. glycines
Disertasi sebagai salah setu syarat untuk mernperoleh gelar
Doktor dalarn bidang Biologi (Mikrobiologi) pada Sekalah Pascasarjana, tnstitut Pertanian Bugor
SEKOMH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2004 .
: Analisis Sekuen DNA yang Tsrlibat dalarn Patugenisitas dan Perancangan Primer PCR Spesifik untuk Xantfromonas axunopodjs pv. gkcines
Nama Mahasiswa : ETTY PRATlWi
n
Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M-Sc.
Dr. Anja Mervandini, MS. Anggota
Ketua
Dr. Muhammad Machmud. M.Sc..APU. Anggota
RIWAYAT HtDUP Penufls dilahirkan di Puntianak pada tanggal 19 April 1963 sebagai anak sutung dad tiga bersaudara dari pasangan Amien Ractrman dan Vonny Amin.
Penulis rnenyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar hingga Sekolah Menengah Atas di Jakarta.
Pada tahun 1982 penulis diterima sebagai rnahasiswa lnstitut Pertanian Bogor (fPB) melalui jalur Proyek PeFintis I!.
Pada tahun 1986 penuiis iulus sebagai
Sajana Pertanian. Pada ttlhun 1996 penulis ditetima di Program Skrdi Biafogi pada Program Pascasajana IPB dan menamatkannya pada tahun 1999. Kesernpatan untuk melanjutkan ke program doktor pada program studi dan perguruan tinggi yang
sama diperaleh pada tahun 1999. Baasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari PAATP, &dan Litbang Departemen Pertanian Republik Indonesia. Penulis bekarja sebagai Panetiti di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknolagidan Surnberdaya Genetik Partanian (BRBiugen) sejak
tahun 199Q.
Bidang peneliian yang rnenjadi tanggufigjawab peneliti adalah
mikrobiolagi.
Selama rnengikuti Program 53 penulis berkesernpatan mendahmi teknik bialogi rnofekukr untuk Xsnthumnas di National Chung-Hsing University, Tatchung,
Taiwan pada April - Agustus 2000. Karya itmiah bejudul "A unique DNA sequense involved in pathogenesis of Xantfiomorras axonopodis pv. gfpims" tetah disajikan pada 8f" fntemational Congtess of Plant Pathology di Christchurch,
New Zealand
pada Februari 2003. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari disertasi penulis.
Syukur Alhamdulillsh atas segala rahmat dan hidayah A%ahS W , penulis
dapat rnanyelesaikan disertasi yang berjudul: "Analisis Sakuen DNA yang Terfibat dalam Patogenisitas dan Perancangan Primer PCR Spesifik unkrk Xanthomonas axonopadis pu. glycines". Selama pslaksanaan penelitian dan penulisan faparan penulis banyak mendapat bantuan dari bebagai pihak, baik bsfupa dana penelitian, saran
perbaikan, semangat rnaupun dm. Untuk itu penulis msnggunakan bagian in! untuk mengungkapkan rasa teFirna kasih kepada semua pihak yang telah memberi bantuan tersebut.
Dengan segala kerendahan hati dan rasa tulus, penuiis menghaturkan terima kasih yang tak temingga kepada Prof. flr. Ir, Antonius Swanto, M.Sc. atas segala
bimbingan yang sangat intensif dan luar biasa sejak penyusunan usulan penelitian,
pefaksanaan penelitian dan penulisan disertasi. Penulis merasa sangat beruntung dibimbing oleh beliau, karena sefain karena swat ilrnu, beliau juga rnerupakan figur ilmuwan yatlg patut diteladani.
Psnulis mendapat banyak pengalaman berharga.
Atas rekumendasi beliau, genulis mendapat kesempertan untuk memperfuas wawasan, serta mendatami teknik biotagi rnatekuler di fnstifufe of Mole3cuIarBidogy
-
National Chung-Hsing University, Taiwan dan Scottish Agricultural College (SAC), Edinburgh, Scotland.
%lama menjsdi bimbingan beliau, penulis berkesernpatan
menjadi asisten mata kuiiah Genetika Mikraba, Bialagi Keragarnan Bakteri, serta
dilibatkan sebagai pangajar dalam kegiatan "4'h/ntamaf/unafTminiw C o m e on Advances in Mu!ecuIar Bidogy Techniques to Assess Microbial Biadim~iw.
2
Untuk itu penulis berdoa semoga Altat S W mencatat dan mernbalas segata
Pada kesernpatan ini perkenankan pula penufis menyampaikan umpan
terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada: I.Dr. Ir. Bud#Tjahjono, M.Agr., selaku anggota kamisi pembirnbing dan Ketua RUT VII atas segala birnbingan dan biaya peneiitian yang telah bliau berikan. Tidak henti-hentinya kliau memberi .dorangan kepada pnulis untuk
rnenyetasaikan psnulisan disertasi.
2, Prof. Dr, Ir, Mtrggy T. Suhartono, selaku anggota kornisi pembimbing dan Kapala Lab. Mikrabiolugi dan Biakimia PAW Bioteknotagi IPB tempat pnulis malakukan awal penelitian. Sebagai searang ilmuwan dengan sikap keibuannya
yang rnenyentuh, beliau banyak memberi masukan dan dorongan dalam rnanulis disertasi. 3. Dr. Anja Meryandini, M.S., selaku anggata kurnisi pembimbing atas saran birnbingan dan diskusi yang rnenarik selarna penulis metakukan penalitian. 4. Dr. Fn, Machmud, M,Sc,, APU,, selaku angggata kamisi pembimbing atas segala
saran, koreksi yang sangat teliti dan kessmpurnaan penulisan disertasi ini. 5. Prof. Yi-Hsiung Tseng, atas segala dana, fasilitas, dan birnbingan selarna
penul is mernperdalarn teknik bialogi molekuter Xanthomonas di Institute of Molecular Biology - National Chung-Hsing University, Taiwan. 6. Dr, Rob Hading, afas segala fasilitas dan bantuail selarna penulis rnelakukan
skrining plasmid tekombinan pernbawa gen patogenisitas Xag di Scottish Agricultural Cuttege (SAC), Edinburgh, Scatland.
3
Tanpa ingin mengabailran beberapa nama, ucapan terima kasih juga penulis sarnpaikan kepada:
1. Sekretafis 8adan LitbanglKetua Komisi Pembinaan Tenaga Kerja Departernen Perhnian yang telah rnemberikan kesernpatan kepsda psnutis untuk menyelesaiktan Program Doicfor di Sekolah Pascasarjana lnstitut Pertanian
Bogor,
2. Pimpinan Proyek PAATP Badan Li@ang Pertanian, Departernen Pertanian atas
segala bantuan dana pendidikan yang diberikan selama penulis menyelesaikan studi. 3. Kapala Balai Bsar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan
Surnberclaya Genetik Pertmian (BE-Biagen) yaw telah rnencalonkan dan rnemberikan kesernpatan kepada penulis untuk menernpuh pendidikan di
Sekolah Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor. 4. Direktur dan staF Southeast Asian Regional Centm for Tmpjcal Biology
(SWMEO-BIUTRQP) atas sarana maupun fasilitas laboratoriurn,ternpat penulis melakukan konstruksi plasmid rekornbinan, pangujian-pengujian mutan, dan bioesei kotiledon.
5. Sernua rskan-rekan mahasiswa satu bimbingan: lrawan Tan, Diana Waturangi,
Dinamelh Wahyuningnrrn, Ni Nyoman Tri Puspaningsih, Widanami, Yogiara, Esti Puspitasari, Andi Khaeruni, Pieter Riupasa, Selly Salma, Numasanah, Annitaqwa, Yuliasari tsrnail, Cecilia Seumahu, Any Fitriani; adik-adik rnahasiswa
S-7, serta Bapak Husen Sarnhari. Panulis mengucapkan terirna kasih atas bantuan dan persahabatan yang baik sslama peiaksanaan penelitian di
Laboratorium Biologi Malekular SEAMEO-BIOTROP.
4
Ungkapan terirna kasih yang tulus dan setinggi-tingginya pgnulis sampaikan
kepada suamiku tercinta Ir. Nanang Hadadi, M.Sc, serta anak-anakku tersayang Lukman Adi Prananto dan Vinnyssa Anindh dan kedua orang-tuaku atas segala
dua, kasih sayang, dukungan, waktu, pengertian dan pengarbanannya yang sangat luar biasa.
Kepada semua pihak yang telslh rnembantu dan tembutkan namanya, penulis uapkan terirna kasih atas segata banhannya.
Semaga bantuan ini
senantiam mendapat:imbalan yang setimpal dari Allah SWT. Amin.
Sugar, April ZOU4 Etty Pmtiwi
1.8. Uji Komplementasi ................................................... 1.9. Kanjugasi Tiga Tetuua ................................................ 1.10. Efektroporasi .......................................................... 1.1 1. Bioesei Patogenisitas pada Kotitedan Kedelai ............... 2. Perancangan Primer-primer Spesifik Terhadap Xag ............... 2.1. Uji Spesifisitas PCR .................................................. IV. HASlL DAN PEMBAHASAN ......................................................
A . Anatisis Gen yang Terfibat datarn Patogenisitas Xag .................. 1. Hibridisasi terhadap Bebrapa Patovar Xanthomonas ........... 2 . Posisi Gen pat XAG pada Xag Y R32 ................................. 3 . Kloning Gen pat XAG ..................................................... 4 . Pemetaan Plasmid pEPHl1 ............................................ 5 . Sekuen DNA dan Analisis Gen pat XAG ............................ 6. Analisis Gen Knack Out (Double Cmssover Recombination)... 7 . Uji Komplernentasi M7?5 ............................................... 8 . Bioesei Kotitedon Hasil Uji Komplementasi Xag M735 ..........
8. Perancangan Primer-primer PCR yang Spesifik terhadap Xag ..... 1. Posisi Penyisipan f ransposan pada Mutan Xag M715 .......... 2. Amplifikasi DNA Pengapit Tfansposan dengan hverse PCR ... 3 . Hibridisasi terhadap Beberapa Patovar Xanthomonas ........... 4 . Perancangan Primer PCR ................................................ 5 . Spesifitas Primer PCR ................................................... V . KESIMPUUN DAN SARAN
...................................................... A . Kesirnpulan ...................................................................... 8. Saran ...............................................................................
VI . DAFTAR PUSTAKA .................................................................
DAFTAR TABEL
1.
Gafurgalur bairteri dan plasmid yang digunakan dalarn penelitian........
2.
Hasit pngujian patogenisitas dengan bioesei kotiledon ...... ................
18
58
DAFTAR GAM8AR
t.
lokasi dan susunan protein-protein transrnernbtan Tans-ExbBExbD pada rnembran sitoplasma E. coli (Braun f 995) ..................
12
Hasil esei patagenisitas dengan bioesei kotiledon. Xag tipe liar rnenimbulkan gejala kuning klaratik, sedangkan Xag An715 nonpatogenik tidak rnenimbulkan gejala kuning klaratik, Umur kotifedon 7 hari, umur biakan 24 jam pada media Y DC padat, inkubasi 28-30% selama 5 hari (Rukayadi 1998) ........................
14
4.
Analisis patugenisitaslkaraMerisasigen patugenisitas Xag ...........
22
5.
Elektrofaresis DNA genorn beberapa patovar Xanfhomonas y ang didigesti dengan Psff (A). Hasil hibridisasi Southern untuk rnengetahui posisi gen yang terlibat dalam patagenisitas bekrapa patavar Xanfhomunas menggunakan fragrnen 0,7 kb (pAAO1EmRl) sebagai gefacak (0) ...................................................
36
Elektroforesis DNA genorn Xag yang didigesti sempurna dengan berbagai enzirn restriksi (A). Hasil hibridisasi Southern untuk rnengetahui pasisi gen yang terlibat patagenisitas pada Xag YR32 menggunakan pAAOl-EmRI sebagai pelacak (B) .....................
37
ElektrufaresisDNA genorn beberapa isalat:X, axonopodis pv. glycines dari Indonesia dan Taiwan yang didigesti dengan Psfl (A). Hasil hibridisasi Southern menggunakan fragrnen DNA pengapit transpuson 0.7kb (pAAOt- EcoRl) sebagai pelacak ...................
39
Strategi konstruksi plasmid pembawa gen yang terlibat dalam patogenisitas Xag YR32 ........................................................
40
Elektraforesis hasil arnplifikasi PCR beberapa plasmid rekarnbinan pEPH1 I dengan primer EQO1 dan Ern02 menggunakan DNA pofymerase terrnostabil prodrrksl Qiagen GmbH (Germany) pada suhu pelekatan primer 5U°C ....................................................
41
2.
6.
7.
8. 9.
24.
Perbedaan gejala kuning klarotik mutan M715 komplernentasi pada hari ke-5 dan hari ke-la setelah inakulasi ...................................
25.
Elektroforesis DNA genom Xag M7 15 yang didigesti dengan beberapa enzirn restriksi (A). Hasii hibridisasi Southern untuk mengetahui posisi peny isipan transgoson pada mutan Xag M715 rnenggunakan pUC4K sebagai pelacak (8).................................
26.
Situs PsA pada DNA pengapit transpason mutan Xag M715 ...........
27.
Arnplifikasi DNA pengapit transpusan pada rnutan Xag M175-Pstl dengan teknik fnvorse PCR, rnenggunakan primer Km-Tn903 dan M I 3-F.., .............................................................................
28.
Sekuen salah satu fragrnen DNA pengapit transpuson ..................
29.
Hasil keluaran atau output perancangan primer PCR EttyOl dan EWU2 menggunakan prugram Primer3 (hhttp:ilwww.iustbiu.com) .....
30.
Elektroforesis hasil arnplifikasi PCR DNA genom beberapa patovar Xanthomonas dengan primer EttyOj-€tyO2, rnenggunakan DNA polymerase termustabit dari Qiagen GmbH (Germany) pada suhu pelekatan primer 45OC ............................................................
31.
Elektrufuresishasil arnplifikasi PCR DNA genorn beberapa patovar Xanthomonas dangan primer Et€yO1-Etty 02, rnenggunakan DNA plymerase termostabil dari Finnzyrnes OY (Finland) pada suhu peiekatan primer 45% ......................... ... ............................
32.
Peirjajaran atau alignment protein sistem sekresi tipe II dari Xac (X. a. pv. citH str. 306)dan Xag (X. a. pv. glyci~esY R32)....................
33.
Elektruforesis hasil arnplifikasi PCR DNA genom beberapa patovar Xanthomanas dengan primer EttyU t -Etty02, rnenggunakan DNA polymerase termostabil produksi Qiagen GmbH (Germany) dan Finnzyrnes OY (Finland) pada suttu pelekatan primer 5U0C ............
xvii
DAFTAR UMPXRAN
1. 2. 3.
4.
Hasil analisis wkuen gen yang tedibat patogenisitas X. axonopadis pv. glycines (1793 nt) rnenggunakan program BWSTN 2.0 ............
82
Hasil analisis sekuen gen yang terlibat patogenisitas X. axonopodis pv. glycines (nt 1100-1 6QO)menggunakan program BUSTN 2.0...
85
Open Reading Fmme (ORE) gen iroM penyandi TunB-depncjent receptor pada GenSank AEO ii700 ..........................................
84
Open Reading Fmme (ORF) gen xcsN psnyandi type fl secretion sysf8mpmt~inNpadaG~nBankAEQ11699 .................................. 88
