AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA GLUKOSIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL DAUN UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatasL)
PUBLIKASI ILMIAH Disusun sebagai salah satu syarat menyelesaikan Program Studi Strata I pada Fakultas Farmasi
Oleh: INNA RAMADHANI PUSPITAYANTI K 100 130 052
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA 2017
HALAMAN PERSETUJUAN
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA GLUKOSIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL DAUN UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas L) PUBLIKASI ILMIAH
oleh:
INNA RAMADHANI PUSPITAYANTI K 100 130 052
Telah diperiksa dan disetujui untuk diuji oleh:
Dosen Pembimbing
Dr. Muhtadi, M.Si NIK. 761
i
HALAMAN PENGESAHAN
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA GLUKOSIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL DAUN UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas L)
OLEH INNA RAMADHANI PUSPITAYANTI K 100 130 052
Telah dipertahankan di depan Dewan Penguji Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Pada hari Kamis, 19 Januari 2017 dan dinyatakan telah memenuhi syarat Dewan Penguji: (……..……..)
1. Ratna Yuliani, M.Biotech.St (Ketua Dewan Penguji)
(……………)
2. Azis Saifudin, Ph.D., Apt. (Anggota I Dewan Penguji)
(…………….)
3. Dr. Muhtadi, M.Si (Anggota II Dewan Penguji)
Dekan,
Azis Saifudin, Ph.D, Apt NIK. 956
ii
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam naskah publikasi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka. Apabila kelak terbukti ada ketidakbenaran dalam pernyataan saya di atas, maka akan saya pertanggung jawabkan sepenuhnya. .
Surakarta, 28 Desember 2016 Penulis
INNA RAMADHANI PUSPITAYANTI K 100 130 052
iii
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA GLUKOSIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL DAUN UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas L) UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA Inna Ramadhani Puspitayanti*, Muhtadi Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, *E-mail:
[email protected] Abstrak
Diabetes mellitus adalah penyakit yang menjadi sumber buruknya kesehatan di seluruh dunia. Salah satu pengobatan diabetes mellitus adalah dengan menghambat enzim αglukosidase. Obat antidiabetes sudah banyak digunakan untuk terapi, tetapi kebanyakan obat-obat antidiabetes dan insulin mempunyai efek samping yang lebih besar dibandingkan dengan obat tradisional. Daun ubi jalar sering dimanfaatkan sebagai obat antidiabetes tradisional. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase oleh ekstrak etanol daun ubi jalar ungu, nilai IC50 dan kinetika penghambatan enzim tersebut. Ekstrak etanol daun ubi jalar ungu diperoleh dengan cara maserasi serbuk daun ubi jalar ungu menggunakan etanol 96%. Uji penghambatan dibedakan menjadi reaksi dengan ekstrak dan reaksi tanpa ekstrak. Akarbosa menjadi kontrol positif. Hasil IC50 diperoleh dari regresi linear absorbansi vs konsentrasi ekstrak. Uji kinetika menggunakan reaksi inhibitor dan tanpa inhibitor. Konsentrasi ekstrak yang digunakan untuk uji kinetika adalah konsentrasi yang dapat menghambat enzim sebesar 50%. Absorbansi dari kedua uji tersebut dibaca pada panjang gelombang 400 nm menggunakan ELISA reader. Hasil penelitian diperoleh ekstrak etanol daun ubi jalar ungu dapat menghambat aktivitas enzim α-glukosidase dengan nilai rata-rata IC50 22,39 μg/mL. Hasil uji kinetika diperoleh jenis penghambatan sampel ini termasuk dalam tipe inhibisi campuran. Kata Kunci: daun Ipomoea batatas L., enzim α-glukosidase, IC50, kinetika penghambatan Abstract
Diabetes mellitus was a disease that was the source of the bad health on the world. One that could be used for the treatment of diabetes mellitus was by inhibiting the enzyme αglucosidase. Antidiabetic drug had been widely used for therapy, but most antidiabetic and insulin drugs had the larger side effect than traditional drugs. Sweet potato leaves often used as a traditional antidiabetic drugs. This study aimed to determine the activity of α-glucosidase enzyme inhibition by ethanol extract of purple sweet potato leaves, the IC50 value and the mechanism of the inhibition. The ethanol extract of purple sweet potato leaves was obtained by maceration of powder of plants using 96% ethanol. Inhibition test was divided into reactions with extracts and reaction without extract. Acarbose be a positive control. IC50 results obtained from linear regression of absorbance vs. concentration of the extract. While the kinetics testing was using the inhibitor reaction and without inhibitor. The consentration extract used to kinetics test is the concentration that could inhibit the enzyme by 50%.Both these tests measure the absorbance was read using ELISA reader. The study results obtained that ethanol extract of purple sweet potato leaves could inhibit enzyme α-glucosidase activity with an average IC50 value 22,39μg / mL. Result of kinetic test obtained that this inhibition sample type belongs to mixed-type inhibiton. Keywords: Ipomoea batatas L. leaves, enzyme α-glucosidase, IC50, inhibition kinetic.
1
1. PENDAHULUAN Diabetes melitus adalah suatu penyakit yang ditandai dengan penurunan sekresi dan atau resistensi insulin karena kelainan metabolik yang menyebabkan naiknya kadar glukosa darah (hiperglikemia) pada kondisi normal (Mun’im & Hanami, 2011). Menurut International Diabetes Federation, terdapat 10 negara dengan tingkat penderita diabetes mellitus paling tinggi yaitu China pada peringkat pertama, kemudian diikuti oleh India, USA, Brazil, Rusia, Meksiko, Indonesia, Jerman, Mesir dan Jepang. Indonesia menempati peringkat ke 7 dengan penderita diabetes melitus paling banyak (IDF, 2013). Enzim α-glukosidase adalah enzim yang berperan dalam pemecahan karbohidrat menjadi glukosa pada saluran pencernaan (Subroto, 2006). Enzim ini dapat meningkatkan kadar gula darah. Sehingga untuk mencegah naiknya gula darah maka dibutuhkan suatu inhibitor enzim α-glukosidase. Efek samping obat antihiperglilemik lebih besar daripada obat tradisional (Niwa et al., 2011). Selain itu, biaya yang mahal juga menjadi alasan dipilihnya pengobatan tradisional. Daun ubi jalar sering dimanfaatkan sebagai obat antidiabetes (Islam, 2006). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas enzim α-glukosidase oleh ekstrak etanol daun ubi jalar ungu yang dilihat dari nilai IC50 dan mengetahui kinetika penghambatannya. 2. METODE Penelitian yang dilakukan bersifat eksperimental yaitu untuk mengetahui aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase oleh ekstrak etanol daun ubi jalar ungu. 2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari mikroplate 96 sumuran (Iwaki), ELISA reader (ELX 800 Bio Tech), waterbath, mikropipet (Soccorex), inkubator (Memmert), vortex (Genie), timbangan analitik (Sartorius), rotary evaporator (Heidolp), pipet tetes, beker gelas (Pyrex), dan alat gelas lainnya. 2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya daun ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) yang diperoleh dari desa Regaloh kecamatan Tlogowungu kabupaten Pati, enzim α-glukosidase 10 unit/mL, buffer fosfat (pH 6,8), p-nitrofenil glukopiranosida (pNPG),
200 mM, tablet
acarbose®, serum bovin albumin, dimetilsulfoksida (DMSO), etanol 96%, HCl 0,1 N, NaOH 0,1 N, KH2PO4 0,2 N, microtube, aqua pro injection.
2
2.3 Jalannya Penelitian 2.3.1 Ekstraksi Serbuk simplisia sebanyak 350 gram diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan etanol 96% sebanyak 2,625 liter. Maserasi dilakukan selama 3x24 jam dengan pengadukan. Setelah itu maserat disaring dan dilakukan remaserasi sebanyak 2 kali. Filtrat dipekatkan menggunakan rotatory evaporator. Filtrat diuapkan diatas waterbath dan didapatkan ekstrak kental. 2.3.2 Penyiapan Larutan Sampel Larutan stok 4% dibuat dengan menimbang 200 mg sampel ekstrak yang dilarutkan dengan DMSO hingga 5 mL. Seri konsentrasi yang dibuat yaitu 12,5, 25, 50, 75, dan 100 ppm yang diambil dari larutan stok. 2.3.3 Uji Inhibisi Enzim Alfa Glukosidase : Tabel 1.Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase Blanko (tanpa ekstrak dan enzim)
C (tanpaekstrak)
S0 (tanpa enzim dengan ekstrak)
S1 (enzim dengan ekstrak)
-
-
1
1
1
1
-
-
49
49
49
49
Ekstrak (µL) DMSO (µL) Buffer (µL) Substrat
25
Buffer Enzim
25 -
Na2CO3 (µL)
100
25 25 Inkubasi 37°C selama 5 menit 25 25 Inkubasi 37°C selama 15 menit 100 100
25 25 100
Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 400 nm dengan ELISA reader 2.3.4 Penyiapan larutan akarbosa Tablet akarbosa sebanyak 4 digerus dan ditimbang 200 mg. Kemudian dilarutkan ke dalam buffer dan HCl 0,1 N dengan perbandingan 1:1hingga 5 mL dan disentrifuse. Berat akarbosa murni yang digunakan adalah 78,62 mg. Konsentrasi larutan stok akarbosa murni yaitu 1,5724%. Sistem reaksi penghambatan enzim α-glukosidase oleh akarbosa sama dengan sistem reaksi penghambatan enzim α-glukosidase oleh ekstrak.
3
2.3.5 Kinetika penghambatan α-glukosidase Seri konsentrasi substrat yang dibuat adalah 0,625; 1,25; 2,5; 5; 10 μM, absorbansi dibaca menggunakan ELISA reader panjang gelombang 400 nm Tabel 2. Sistem reaksi kinetika inhibisi S0 (tanpa ekstrak dengan enzim)
S1 (ekstrak dengan ekstrak)
Ekstrak (µL)
-
1
Buffer (µL) Substrat
49
49
25 25 Inkubasi 37℃ selama 5 menit 25 25 Inkubasi 37℃ selama 15 menit 100 100
Enzim Na2CO3 (µL) 2.4 Cara Analisis 2.4.1 Uji Inhibisi Enzim α-glukosidase
Analisis data dilakukan dengan cara menghitung persentase inhibisi α-glukosidase. Data yang diperoleh dari hasil pengukuran absorbansi dapat dihitung menggunakan persamaan : % Penghambatan =
(
) (
)
X 100 %
(1)
Keterangan : Absorbansi kontrol (DMSO) = tanpa sampel (kontrol-blanko) Absorbansi sampel uji = S1-S0 S1 = Absorbansi sampel dengan penambahan enzim S0 = Absorbansi sampel tanpa penambahan enzim Perhitungan IC50 menggunakan pesamaan regresi linier, konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu y. Nilai IC50 dapat dihitung dari persamaan y = bx + a dengan menggunakan rumus: IC50 =
(2)
(Sugiwati et al., 2009) 2.4.2 Uji Kinetika Penghambatan Enzim α-glukosidase Analisis data dilakukan dengan menghitung p-NP kemudian dari hasil p-NP digunakan untuk menghitung aktivitas enzim. Rumus perhitungan p-NP =
(3) 4
Keterangan : Nilai a dan b didapatkan dari regresi linear pada kurva baku p-NP, y = 0,0015x + 0,0826 Rumus perhitungan aktivitas enzim =
(4)
Keterangan : V = volume enzim yang digunakan untuk sistem reaksi T = waktu inkubasi 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Ekstraksi Metode yang digunakan untuk ekstraksi adalah maserasi, yaitu metode untuk pembuatan ekstrak dengan menggunakan pelarut yang disertai dengan pengadukan atau pengocokan yang dilakukan pada suhu ruang (Departemen Ksehatan RI, 2000). Simplisia yang digunakan untuk maserasi adalah sebanyak 350 gram dengan membutuhkan etanol 96% sebanyak 2,625 liter. Etanol 96% dipilih karena senyawa kimia yang diperoleh lebih banyak, sehingga etanol 96% terpilih sebagai pelarut untuk mengekstraksi bahan baku berupa sediaan herbal medicine (Arifianti et al., 2014). Bobot akhir ekstrak kental daun ubi jalar ungu yang diperoleh sebanyak 11,59%, yakni sebanyak 40,553 gram. 3.2 Uji Penghambatan Enzim α-glukosidase Konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam pengujian ini yaitu 12,5, 25, 50, 75, dan 100 ppm. Konsentrasi yang semakin meningkat maka daya inhibisi juga semakin meningkat. Persamaan regresi linear antara konsentrasi ektsrak dan daya inhibisi akan digunakan untuk menentukan nilai IC50. Aktivitas enzim α-glukosidase yang dapat dihambat sebesar 50% oleh konsentrasi inhibitor disebut dengan IC50. Penghambatan enzim α-glukosidase semakin baik jika nilai IC50 semakin kecil (Mohan et al., 2013) . Uji penghambatan ini menggunakan dua reaksi yaitu reaksi dengan menggunakan ekstrak (Si) dan reaksi tanpa mengguankan ekstrak (S0). Rata-rata nilai IC50 akarbosa dari pengujian ini adalah 36,25 μg/mL, sedangkan rata-rata nilai IC50 ekstrak daun ubi jalar ungu yaitu 22,39 μg/mL. Jika dilihat besarnya IC50 pada ekstrak daun ubi jalar ungu memiliki potensi untuk menghambat enzim α-glukosidase. Tabel 3. Data IC50 ekstrak daun ubi jalar ungu dan akarbosa Rata-rata IC50 Akarbosa (ppm)
36,25 μg/mL
Ekstrak (ppm)
22,39 μg/mL
5
Beberapa penelitian telah dilakukan mengenai daun ubi jalar sebagai inhibitor enzim α-glukosidase menghasilkan beberapa variasi nilai IC50. Penelitian yang dilakukan oleh Sirvastava et al (2015) menjelaskan bahwa fraksi air daun ubi jalar pada konsentrasi 100 μg/mL dapat menghambat αglukosidase sebesar 62,9% dan memiliki IC50 sebesar 53,00±1,20 μg/mL. Nilai IC50 tersebut lebih besar dibandingkan dengan nilai IC50 pada penelitian ini dikarenakan pada ekstrak lebih banyak senyawa yang terkandung di dalamnya. Nilai % inhibisi fraksi alkaloid kasar daun ubi jalar ungu pada konsentrasi 2% adalah 61,88% (Pamungkas et al., 2016). Hasil tersebut tidak berbeda jauh dengan penelitian ini pada konsentrasi 2% ekstrak daun ubi jalar ungu memiliki rata-rata % inhibisi sebesar 68,354 %. Pada penelitian ini tidak dilakukan uji identifikasi senyawa karena pada penelitian ini hanya berfokus sesuai tujuan yaitu melihat aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase. Flavonoid diketahui dapat menghambat aktivitas enzim α-glukosidase (Gu et al., 2015) dan terkandung dalam daun ubi jalar (Li et al., 2009). Menurut Zhang et al (2016) pada penelitiannya menunjukkan bahwa kuersetin-3-O-glikosida yang merupakan flavonoid terdapat dalam daun ubi jalar mempunyai nilai IC50 sebanyak 22,38 ± 1,73 μM yang nilinya hampir sama dengan rata-rata IC50 pada penelitian ini. Senyawa tersebut dihasilkan dari fraksi etil asetat dan dapat berpotensi sebagai antidiabetes (Zhang et al., 2016). Flavonoid juga terdapat dalam daun ubi jalar ungu. Hasil isolasi fraksi metanol dan butanol daun ubi jalar ungu teridentifikasi tiga senyawa flavonoid, yaitu kuersetin 3-O-β-D-sophoroside, kuersetin 3β-O-glukoside dan kuersetin (Lee et al., 2016). 3.3 Kinetika Inhibisi Enzim Alfa Glukosidase Uji kinetika dilakukan untuk menentukan jenis penghambatan dari inhibisi enzim α-glukosidase. Cara untuk menentukan jenis penghambatan melalui plot Lineweaver-Burk dengan menggunakan persamaan regresi linear y = ax + b, dimana y = 1/v dan x = 1/[S] (Murray et al., 2003). Inhibitor tidak mempengaruhi kecepatan maksimum rekasi (Vmax) jika1/[S] mendekati nol. Maka saat substrat pada konsentrasi yang tinggi, Vmax pada sistem dengan inhibitor. Konsentrasi ekstrak yang digunakan untuk menentukan kinetika inhibisi adalah pada konsentrasi 0,5% ekstrak daun ubi jalar ungu karena pada konsentrasi tersebut dapat menghambat sebesar 50,61% aktivitas enzim αglukosidase. Pada penelitian ini ekstrak daun ubi jalar ungu dalam menghambat enzim α-glukosidase mempunyai tipe campuran. Inhibition campuran (mixed-inhibition) adalah inhibitor yang mengganggu kedua langkah katalisis yaitu enzim yang bebas dan enzim yang berikatan dengan substrat (Illanes et al., 2008). Hal tersebut dapat dilihat dari kurva perpotongan garis antara inhibitor dan tanpa inhibitor yaitu berada diantara x dan y. Selain itu dapat dilihat dari nilai KAP, VAP, K dan V. KAP dan VAP adalah nilai Kmax dan Vmax pada sistem dengan inhibitor, sedangkan K dan V adalah nilai Kmax dan Vmax pada sistem tanpa inhibitor. Nilai KAP pada penelitian ini adalah 2,5 dan 6
VAP 500, sedangkan nilai K adalah 1,62dan V adalah 1250. Dari data tersebut dapat dilihat bahwa KAP > K, VAP < V (Illanes et al., 2008). Inhibisi tipe campuran pada penelitian ini dapat terjadi karena di dalam ekstak masih terdapat banyak senyawa kimia sehingga mekanisme penghambatan belum berfokus pada satu senyawa saja. Contoh inhibisi tipe campuran adalah inhibisi xantin oksidase oleh ion palladium (Mohan et al., 2013).
0,0120 y = 0,0053x + 0,0021 R² = 0,9922
0,0100 0,0080 1/V
0,0060 y = 0.0013x + 0.0008 R² = 0.975
0,0040
dengan inhibitor
0,0020
tanpa inhibitor
0,0000 -1
-0,5 0 -0,0020
0,5
1
1,5
2
1/S
Gambar 1. Grafik kinetika penghambatan enzim α-glukosidase
4. PENUTUP Kesimpulan yang dapat diambil bedasarkan penelitian ini adalah : Ekstrak etanol daun ubi jalar ungu dapat menghambat aktivitas enzim α-glukosidase dengan nilai IC50 lebih kecil dibandingkan akarbosa. Rata-rata nilai IC50 ekstrak etanol daun ubu jalar ungu adalah 22,39 μg/mL dan rata-rata IC50 akarbosa adalah 36,25 μg/mL. Tipe penghambatan enzim αglukosidase oleh ekstrak etanol daun ubi jalar ungu adalah inhibisi campuran. DAFTAR PUSTAKA Arifianti, L., Oktarina, R. D., and Kusumawati, I., 2014, Pengaruh Jenis Pelarut Pengektraksi Terhadap Kadar Sinensetin Dalam Ekstrak Daun Orthosiphon stamineus Benth, E-Journal Planta Husada, 2 (1). Departemen Kesehatan RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta. Gu, C., Zhang, H., Putri, C. Y., and Ng, K., 2015, Evaluation of α-Amylase and α-Glucosidase Inhibitory Activity of Flavonoids, International Journal of Food and Nutritional Science, 2 (6), 1–6. International Diabetes Federation, 2013, International Diabetes Federation Sixth Edition, Terdapat 7
di: www.idf.org/diabetesatlas. Illanes, A., Altamirano, C., and Wilson, L, 2008, Homogeneous Enzyme Kinetics, Dalam Enzyme Biocatalysis : Principles and Applicatioons, Springer. Islam, S., 2006, Sweetpotato ( Ipomoea batatas L .) Leaf : Its Potential Effect on Human Health and Nutrition, Journal of Food Science, 71. Lee C., Lee S., Chen C., Chen H., Kao M., Liu C., Chen J., Lai Y. and Wu Y., 2016, Characterization of Secondary Metabolites from Purple Ipomoea batatas Leaves and Their Effects on Glucose Uptake, Journal Molecules, 21, 1–14. Li, F., Li, Q., Gao, D., Peng, Y., Science, A., Zhan, J., and Zone, D., 2009, The Optimal Extraction Parameters and Anti-Diabetic Activity of Flavonoids from Ipomoea batatas Leaf, Afr. J. Traditional, CAM, 6 (2), 195–202. Mohan, C., Long, K. D., and Mutneja, M., 2013, An Introduction to Inhibitors and Their Biological Applications, EMD Millipore. Mun’im, A., and Hanami, E., 2011, Fitoterapi Dasar, PT. Dian Rakyat, Jakarta Murray, R., Granner, D. ., Mayes, P. ., and Rodwell, V., 2003, Ilustrated Biochemistry 26 th ed, New York: Mc Graw Hill. Niwa, A., Tajiri, T., and Higashino, H., 2011, Ipomoea batatas and Agarics blazei Ameliorate Diabetic Disorders with Therapeutic Antioxidant Potential in Streptozotocin Induced Diabetic Rats,J. Clin. Biochem. Nutr, 48 (3), 194–202. Pamungkas, D. D. A., Irmanida, B., and Suparto, I. H., 2016, Fraksi Alkaloid Daun Ubi Jalar Ungu (Ipomoea batatas var Ayumurasaki) Sebagai Inhibitor α-Glukosidase, Acta Pharmaciae Indonesia, 4 (1), 1–6. Sirvastava, A. K., Pal, S., Gautam, S., Mishra, A., and Maurya, R., 2015, Antihyperglycemic and Antidyslipidemic Potential of Ipomoea batatas Leaves in Validated Diabetic Animal Models, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 7 (7). Subroto, A., 2006, Ramuan Herbal untuk Diabetes Melitus, Depok: Penebar Swadaya. Sugiwati, S., Setiasih, S., and Afifah, E., 2009, Antihiperglycemic Activity of The Mahkota Dewa [ Phaleria macrocarpa ( Scheff .) Boerl .] Leaf Extracts as an Alpha-Glucosidase Inhibitor, Makara, Kesehatan, 13 (2), 74–78. Zhang, L., Tu, Z., Yuan, T., Wang, H., Xie, X., and Fu, Z., 2016, Antioxidants and a -glucosidase Inhibitors from Ipomoea batatas Leaves Identified by Bioassay-Guided Approach and Structure-Activity Relationships, FOOD CHEMISTRY, 208, 61–67.
8
