AKTIVITAS FRAKSI POLIFENOL BUAH DELIMA (Punica granatum L.) TERHADAP PEROKSIDASI LIPID DARAH TIKUS YANG DIINDUKSI PARASETAMOL HERYANI

AKTIVITAS FRAKSI POLIFENOL BUAH DELIMA (Punica granatum L.) TERHADAP PEROKSIDASI LIPID DARAH TIKUS YANG DIINDUKSI PARASETAMOL

HERYANI

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

ABSTRAK HERYANI. Aktivitas Fraksi Polifenol Buah Delima (Punica granatum L.) terhadap Peroksidasi Lipid Darah Tikus yang Diinduksi Parasetamol. Dibimbing oleh ANNA P. ROSWIEM dan EDY DJAUHARI PK. Buah delima (Punica granatum L.) dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan tertinggi daripada tumbuhan obat lain. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas polifenol buah delima terhadap peroksidasi lipid darah tikus yang diinduksi parasetamol. Sebanyak 22 tikus dibagi ke dalam 7 kelompok. Satu kelompok normal diinduksi akuades dan enam kelompok perlakuan diinduksi parasetamol (500 mg/KgBB) selama 34 hari. Kelompok kontrol positif pada perlakuan diinduksi Cursil®70 (13.3 mg/KgBB), dan kelompok lainnya masingmasing diinduksi fraksi polifenol dosis 13.3 mg/KgBB, 100 mg/KgBB, 250 mg/KgBB, dan 500 mg/KgBB pada 17 hari terakhir. Polifenol diekstrak dengan pelarut aseton:air:asam asetat (90:9.5:0.5). Lipid peroksida darah direaksikan dengan asam tiobarbiturat (TBA) 1% dan dianalisis dengan spektrofotometer pada λ=532 nm. Rendemen polifenol yang diperoleh adalah 36.2%. Induksi parasetamol selama 34 hari dapat meningkatkan konsentrasi lipid peroksida serum 120.66%. Perlakuan Cursil®70 dan fraksi polifenol 13.3 mg/KgBB menurunkan lipid peroksida 8.14% dan 10.45% dengan tidak signifikan (p=0.548). Sebaliknya, perlakuan fraksi polifenol 100 mg/KgBB, 250 mg/KgBB, dan 500 mg/KgBB mampu menurunkan konsentrasi lipid peroksida serum berturut-turut sebesar 18.18%, 33.23%, dan 41.84% (p<0.05).

ABSTRACT HERYANI. Polyphenol Fraction Activities of Pomegranate (Punica granatum L.) against Blood Lipid Peroxidation in Rats Induced by Paracetamol. Under the direction of ANNA P. ROSWIEM and EDY DJAUHARI PK. Pomegranate (Punica granatum L.) has been reported to have the higher antioxidant activities than other medicinal plants. The aim of this study was to investigate polyphenol fraction activities from pulp pomegranate against blood lipid peroxidation (TBARS) in rats induced by paracetamol. Twenty two rats were divided into 7 groups. One normal group induced aquades and six treatment groups induced paracetamol (500 mg/KgBW) during 34 days. Positive control group of treatment induced Cursil®70 (13.3 mg/KgBW), and another groups induced polyphenol fraction doses 13.3 mg/KgBW, 100 mg/KgBW, 250 mg/KgBW, and 500 mg/KgBW, respectively. Polyphenol were extracted by acetone:water:acetic acid (90:9.5:0.5). TBARS was reacted by thiobarbituric acid (TBA) 1% and analysed by spectrophotometer in λ=532 nm. Polyphenol yields have got 36.2%. Paracetamol inductions as long as 34th days increased TBARS levels 120.66%. The PC and FD13.3 decreased TBARS 8.14% and 10.45% not significantly (p=0.548). FD100, FD250, and FD500 decreased TBARS 18.18%, 33.23%, and 41.84% (p<0.05), respectively.

AKTIVITAS FRAKSI POLIFENOL BUAH DELIMA (Punica granatum L.) TERHADAP PEROKSIDASI LIPID DARAH TIKUS YANG DIINDUKSI PARASETAMOL

HERYANI

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

Judul Skripsi : Aktivitas Fraksi Polifenol Buah Delima (Punica granatum L.) terhadap Peroksidasi Lipid Darah Tikus yang Diinduksi Parasetamol Nama : Heryani NIM : G84062248

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Anna P. Roswiem, MS Ketua

Drs. Edy Djauhari PK, MS Anggota

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini sebagai salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Sains di Departemen Biokimia. Karya ilmiah ini berjudul Aktivitas Fraksi Polifenol Buah Delima (Punica granatum L.) terhadap Peroksidasi Lipid Darah Tikus yang Diinduksi Parasetamol. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Pebruari 2010 hingga Juni 2010 di Laboratorium dan Kandang Hewan Coba Biokimia, Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Anna P. Roswiem, MS dan Drs. Edy Djauhari PK., MS atas bimbingan, waktu, dan perhatiannya kepada penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilimiah. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua dan seluruh keluarga tercinta atas segala doa, dukungan, dan perhatiannya. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Dian Apriliana selaku rekan kerja, Sidik STK43, Renna Y. Vernanda, Umul Karimah, Akmal, Marsudi Siburian, Feni T. Asmoro, Donna Fujie RU., Farah Meutia, Bakuh Darminto, S.Si, Sitha A. Ihsan, Reza B. Permana, temanteman Biokimia lain, serta teman-teman satu kontrakan, khususnya Chandra C. Nugroho, Deden Miftahudin, dan Hizry Ramdani atas bantuannya selama penelitian dan penyusunan skripsi. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan informasi dan bermanfaat bagi semua.

Bogor, Agustus 2010

Heryani

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Subang pada tanggal 2 Juli 1988 dari ayah Jamarih dan ibu Rumsinah sebagai anak ke-6 dari enam bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Subang dan pada tahun yang sama penulis diterima di IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Tahun 2007 penulis diterima di Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) sebagai mayor. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif di berbagai organisasi kemahasiswaan. Tahun 2006-2007 penulis aktif di Ikatan Keluarga Muslim TPB (IKMT) sebagai sekretaris umum. Tahun 2007-2008 penulis aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) FMIPA sebagai staf Divisi Infokom. Di tahun yang sama, penulis juga aktif sebagai ketua Organisasi Mahasiswa Daerah (OMDA) Subang. Tahun 2008-2009 penulis aktif di Himpunan Profesi Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) sebagai staf Divisi Research and Development (RnD). Dilanjut pada tahun 2010 sebagai ketua Badan Pengawas CREBs dan pengurus utama Green Environment Biochemist Community (GENESIST). Selama perkuliahan, penulis pernah menjalani Praktik Lapangan (PL) di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN) dan menulis laporan ilmiah yang berjudul Identifikasi Gen Ketahanan Penyakit Blas pada Populasi Haploid Ganda Padi Gogo Hasil Persilangan Resiprokal Galur CT dan Bio46. Tahun 2009 penulis mengikuti program kreativitas mahasiswa bidang penelitian (PKMP) dan mendapatkan 5 besar PKMP terbaik tingkat IPB dengan judul Pemanfaatan Limbah Cair Terasi sebagai Sumber Energi Listrik Alternatif di Kabupaten Cirebon. Selain itu, penulis juga pernah menerima beasiswa Goodwill International tahun 2009-2010. Penulis juga aktif dari tahun 2009-2010 sebagai asisten praktikum Biokimia Umum untuk mahasiswa Departemen Biologi dan Departemen Teknologi Hasil Perairan, serta Biokimia Klinis dan Pengantar Penelitian Biokimia untuk mahasiswa Departemen Biokimia. Selain itu, di tahun 2010 penulis aktif sebagai asisten praktikum Biokimia untuk Keperawatan pada mahasiswa Akademi Keperawatan Bogor cabang DEPKES Bandung. Sebagai pengalaman profesi, penulis pernah mengajar privat Kimia Dasar tahun 2008 serta mengajar kelas dan privat materi pengayaan ujian akhir sekolah berstandar nasional (UASBN) di SD IT At-Taufiq tahun 2009-2010.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ..........................................................................................

ix

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................

ix

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................

ix

PENDAHULUAN ...........................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA Fisiologi Hati .............................................................................................. Hepatitis Toksik .......................................................................................... Parasetamol sebagai Stimulan Radikal Bebas .............................................. Oksidasi Lipid dan Analisisnya ................................................................... Buah Delima (Punica granatum L.) ........................................................... Polifenol .....................................................................................................

2 2 3 4 5 7

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat............................................................................................ Metode Penelitian .......................................................................................

8 8

HASIL DAN PEMBAHASAN Fraksi Polifenol Buah Delima ..................................................................... 9 Kondisi Hewan Coba .................................................................................. 10 Konsentrasi Lipid Peroksida Serum............................................................. 11 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ..................................................................................................... 15 Saran........................................................................................................... 15 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 15 LAMPIRAN ................................................................................................... 19

DAFTAR TABEL Halaman 1 Kondisi fisik buah delima pada berbagai kematangan ................................... 6 2 Kadar abu (%) dan mineral (mg/100 g) pada sari buah dan biji delima ......... 6 3 Komposisi kimia biji buah delima ................................................................ 6 4 Komposisi pakan standar tikus ..................................................................... 11

DAFTAR GAMBAR Halaman 1

Metabolisme parasetamol dosis normal dan dosis tinggi pada hati ............... 4

2

Peroksidasi lipid hati dan pembentukan kompleks TBA-MDA .................... 5

3

Buah delima (Punica granatum L.) ............................................................. 7

4

Struktur kimia punikalin dan punikalagin ..................................................... 7

5

Pengambilan darah dari jantung pada tikus Sprague Dawley ........................ 9

6

Bobot badan tikus masa adaptasi ................................................................. 11

7 Bobot badan tikus hari ke-0 hingga ke-17.................................................... 11 8 Bobot badan tikus hari ke-18 hingga ke-34 .................................................. 11 9 Konsentrasi lipid peroksida ......................................................................... 15

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1

Gambaran umum penelitian........................................................................ 20

2

Prosedur ekstraksi polifenol ....................................................................... 20

3

Rancangan perlakuan hewan coba .............................................................. 21

4

Pengukuran konsentrasi lipid peroksida ...................................................... 22

5 Bobot badan (BB) tikus masa adaptasi ....................................................... 23 6 Bobot badan (BB) tikus hari ke-0 hingga ke-17 .......................................... 24 7

Bobot badan (BB) tikus hari ke-17 hingga ke-34 ........................................ 25

8

Konsentrasi lipid peroksida serum tikus hari ke-0 ....................................... 26

9

Konsentrasi lipid peroksida serum tikus hari ke-18 ..................................... 27

10 Konsentrasi lipid peroksida serum tikus hari ke-35 ..................................... 28 11 Rekapitulasi data statistik ........................................................................... 29 12 Perhitungan dosis terapetik buah delima pada tikus .................................... 35

1

PENDAHULUAN Organ hati memiliki peranan yang sangat penting bagi manusia. Hati berfungsi dalam proses metabolisme zat-zat makanan, seperti karbohidrat, lipid, dan protein. Hati juga berfungsi dalam penyimpanan glikogen, trigliserida, Fe, dan Cu. Peranan hati lainnya adalah sebagai sistem mononuklear fagosit, detoksifikasi toksikan, serta fungsi sintesis dan ekskresi garam-garam empedu (Stockham & Scott 2008). Namun, berubahnya pola hidup yang tidak teratur dapat menyebabkan peningkatan perusakan hati, terutama oleh virus, bahan kimia alami atau sintetik yang merusak hati (hepatotoksik), alkohol, serta konsumsi obat-obatan dosis tinggi. Dalimartha (2005) menyebutkan bahwa hepatitis dapat terjadi akibat berbagai faktor tersebut. Hepatitis akibat obat atau toksin dapat digolongkan menjadi hepatotoksin direct dan indirect, reaksi hipersensitivitas terhadap obat, serta idiosinkrasi metabolik. Hal ini ditambah dengan pengetahuan masyarakat yang kurang akan konsumsi obat-obatan dapat meningkatkan resiko timbulnya penyakit hepatitis. Konsumsi obat-obatan seperti parasetamol dalam dosis berlebih pada hewan dan manusia dapat mengakibatkan kerusakan hati (Lee 2003). Obat-obat lain yang dapat menyebabkan kerusakan hati adalah obat anastetik, antibiotik, antiinflamasi, antimetabolik dan imunosupresif, antituberkulosa, hormon-hormon, serta obat psikotropik. Kerusakan hati dapat didiagnosa oleh beberapa parameter biokimia, yaitu adanya peningkatan aktivitas enzim alanin aminotransferase (ALT), aspartat aminotransferase (AST), alkalin fosfatase (ALP), γ-glutamil transferase (GGT), glutation peroksidase (GPx), superoksida dismutase (SOD), katalase, laktat dehidrogenase, 5nukleotidase, bilirubin, dan TBA-reacting substance (TBARS) (Stockham & Scott 2008). Hepatitis secara umum timbul akibat inflamasi hati. Salah satu kondisi yang terjadi adalah oksidasi membran sel oleh radikal bebas, baik dari luar tubuh (eksogen) maupun hasil metabolisme tubuh (endogen). Konsumsi parasetamol dosis tinggi dapat menyebabkan kerusakan hati secara akut atau nekrosis. Hal ini terjadi karena pengikatan kovalen pada Nasetil-p-benzokuinonimina (NAPKI), senyawa radikal hasil oksidasi parasetamol, dengan gugus –SH pada protein membran yang menghasilkan nekrosis sel dan peroksidasi lipid yang diinduksi oleh penurunan jumlah glutation (Murugesh et al. 2005).

Peroksidasi lipid membran sel sebenarnya dapat ditangkap oleh antioksidan. Tubuh manusia sendiri memiliki berbagai senyawa antioksidan, baik antioksidan enzimatik, seperti superoksida dismutase (SOD), katalase, dan peroksidase; maupun antioksidan non enzimatik seperti glutation tereduksi (GSH) (Stockham & Scott 2008). Namun, jika akumulasi radikal meningkat, tubuh membutuhkan asupan senyawa antioksidan dari luar yang mampu melindungi dan memperbaiki jaringan hati. Senyawa ini disebut sebagai hepatoprotektor (Dalimartha 2005). Berbagai senyawa antioksidan yang berpotensi sebagai hepatoprotektor telah banyak diteliti. Batubara (2003) dan Adji (2004) menyebutkan bahwa saponin dari akar kuning (Archangelisia flava L. Merr) dan kurkumin dari Curcuma xanthorhiza Roxb. dapat menghambat peningkatan konsentrasi lipid peroksida, serta menurunkan aktivitas ALT dan AST pada tikus Sprague Dawley yang diinduksi parasetamol. Antioksidan lain diantaranya adalah Silimarin dari Silybum marinum dan ekstrak metanol Berberis tinctoria L. (Murugesh et al. 2005), antioksidan ekstrak air dan metanol 70% daun sangitan (Rustandi 2006), rebusan daun sirih merah (Windyagiri 2006), ekstrak air rosella (Aryadi 2009), serta alkaloid dan isoflavon bunga Sphaeranthus indicus (Tiwari & Khosa 2010). Antioksidan memainkan peranan penting dalam mengikat radikal bebas dan mencegah amplifikasi senyawa radikal. Hingga saat ini aktivitas senyawa antioksidan tertinggi terdapat pada buah delima (Punica granatum L.), lebih tinggi daripada anggur merah dan teh hijau, dengan komponen tanin hydrolizable yang berperan dalam 92% aktivitas antioksidan dalam buah (Malik et al. 2005). Pengaruh pemberian ekstrak (antiokidan) buah delima terhadap kesehatan telah banyak diteliti, di antaranya adalah dapat memberikan efek antiarterosklerosis (Aviram et al. 2000), mereduksi stres oksidatif (Aviram et al. 2000; de Nigris et al. 2005), antihipertensi (Aviram & Dornfeld 2001), antidiabetes (Das et al. 2001; Huang et al. 2005), antimutagenik (Negi 2003), antikardiak fibrosis (Huang et al. 2005), anti-aging (Kumar et al. 2009), serta antikanker prostat (Malik et al. 2005; Seeram et al. 2005), antikanker kulit (Afaq et al. 2005), antikanker paru-paru (Khan et al. 2007), dan antikanker kolon (Khan 2009). Di sisi lain, Murthy et al. (2002) menyebutkan bahwa ekstrak metanol dari kulit buah delima, mengandung banyak katekin, memberikan efek

2

hepatoprotektor pada tikus galur Wistar. Oleh karena itu, aktivitas hepatoproteksi fraksi polifenol buah delima terhadap peroksidasi lipid darah perlu diteliti. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas polifenol buah delima terhadap peroksidasi lipid darah tikus yang diinduksi parasetamol dosis 500 mg/KgBB, dengan hipotesis fraksi tersebut dapat menurunkan kadar lipid peroksida darah. Potensi yang diperoleh akan dibandingkan secara langsung dengan Cursil®70 (obat hepatitis) dosis 13.3 mg/KgBB. Metode yang digunakan untuk mengukur konsentrasi lipid peroksida serum tikus adalah metode asam tiobarbiturat (TBA) dengan spektrofotometer pada λ=532 nm (Yagi 1994). Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi potensi polifenol buah delima sebagai hepatoprotektor dan dapat dijadikan sebagai obat hepatitis alternatif.

TINJAUAN PUSTAKA Fisiologi Hati Hati merupakan organ tubuh yang besar, kompleks, dan terdapat di dalam rongga perut kanan atas, di bawah diafragma kanan, dan dilindungi tulang iga kanan bawah. Organ ini berwarna coklat tua dan berbobot antara 12001600 g atau sekitar 2.5% dari bobot total orang dewasa. Organ ini terbagi menjadi dua lobus, dengan lobus kanan yang besarnya enam kali dari bagian kirinya. Setiap lobus terdiri atas ribuan lobulus yang merupakan unit fungsional. Setiap lobulus terdiri atas sel-sel hepatosit yang berbentuk kubus dan tersusun melingkar mengelilingi vena sentralis. Di antara lobulus (interlobular) terdapat saluran empedu dan kapiler (sinusoid) yang merupakan cabang vena porta dan arteria hepatika (Dalimartha 2005). Sinusoid dibatasi oleh sel Kupffer yang merupakan sistem retikuloendotelial dan mempunyai fungsi serupa dengan sel makrofag (Kaplan & Pesce 2010). Hati memiliki peran penting dalam metabolisme tubuh, yaitu metabolisme karbohidrat, protein, dan lipid yang dikirim oleh vena porta setelah diabsorbsi dari usus. Hati dapat menyintesis lebih dari 1000 protein plasma, seperti albumin dan globulin secara de novo dari asam amino esensial dan non esensial. Hati juga dapat menyintesis asam lemak, trigliserida, kolesterol, apolipoprotein, lipoprotein, dan kolesterol ester dalam fosfolipid. Beberapa bahan hasil metabolisme ini dapat tersimpan dalam hati, seperti

glikogen, trigliserida, Fe, dan Cu (Stockham & Scott 2008). Fungsi hati lainnya adalah detoksifikasi toksikan dan radikal bebas, yaitu melalui reaksi konjugasi dengan beberapa senyawa yang dihasilkan di dalam hati, seperti glutation, asam glukuronat, glisin, dan asetat. Hati mempunyai sistem ekskresi, dengan mengubah senyawa toksikan yang liposoluble menjadi hydrosoluble yang diekskresikan melalui urin, cairan empedu, ataupun lewat usus. Hati juga berperan sebagai organ pertahanan tubuh, yaitu dengan adanya sel Kupffer yang mempunyai kemampuan memfagositosis sel-sel tua, partikel atau benda asing, sel tumor, bakteri, virus, dan parasit di dalam hati (Dalimartha 2005; Stockham & Scott 2008). Hati memiliki kapasitas cadangan yang besar, yaitu hanya dengan 10%-20% jaringan hati yang masih berfungsi ternyata sudah cukup untuk mempertahankan hidup pemiliknya. Kemampuan regenerasi jaringan yang mati cukup besar sehingga akan cepat digantikan dengan yang baru (Dalimartha 2005). Sel hati mempunyai bentuk ultrastruktur yang mencerminkan bahwa sel terlibat dalam berbagai fungsi metabolik yang luas. Sel ini mengandung berbagai enzim, beberapa diantaranya penting untuk diagnostik karena dialirkan ke pembuluh darah vena dan aktivitasnya dapat diukur sehingga dapat menunjukkan adanya penyakit hati atau tingkat keparahannya (Ganong 2002). Enzim-enzim tersebut diantaranya adalah aspartat aminotransferase (AST), alanin aminotransferase (ALT), alkalin fosfatase (ALP), γ-glutamintransferase (GGT), laktat dehidrogenase, dan 5-nukleotidase. Konsentrasi keenam enzim ini meningkat dalam beberapa macam kerusakan hati, seperti hepatitis kronis, sirosis, alkoholik, dan tumor hati (Kaplan & Pesce 2010; Stockham & Scott 2008). Selain itu, produk peroksidasi lipid, TBA-reacting substance (TBARS), juga teralirkan ke pembuluh vena (Stockham & Scott 2008). Hepatitis Toksik Hepatitis merupakan suatu respon hati terhadap perangsangan dari luar yang bersifat merusak, umumnya berupa peradangan yang bisa berlanjut ke nekrosis. Hepatitis menurut etiologinya dibagi menjadi dua, yaitu hepatitis infeksius dan hepatitis non infeksius atau hepatitis toksik. Hepatitis infeksius dapat disebabkan oleh virus hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, dan hepatitis F. Di sisi lain, hepatitis toksik dapat

3

disebabkan oleh bakteri, parasit, obat-obatan, alkohol, kegemukan, dan lainnya (Dalimartha 2005). Penderita hepatitis yang disebabkan oleh senyawa toksik dan obat-obatan ini memiliki tanda-tanda yang mirip dengan penyakit hepatitis lainnya (Anderson & Cockayne 1993). Hepatitis berdasarkan tingkat keparahannya ada yang bersifat akut dan dapat meningkat menjadi kronis. Keduanya merupakan jenis penyakit dengan pasokan obat yang terbatas. Hal tersebut terjadi karena penyebab, mekanisme, dan perkembangan penyakit hati yang beragam, tingkat respon pasien rendah, efek samping cukup besar, serta biaya terapi yang mahal sehingga sulit mencari obat yang ideal (Anderson & Cockayne 1993). Nabib (1987) menggolongkan penyebab timbulnya penyakit hepatitis toksik menjadi empat, yaitu (1) racun-racun kimia, seperti: tembaga, arsen, merkuri, kloroform, tetrakloroetanol, trinitrotoluena, tetrakloroetilena, dan karbon tetraklorida; (2) racun dari tanaman jenis Sereci, Aminskia, Phyllanthum, dan Leguminosa; (3) eksotoksin dan endotoksin mikroorganisme; serta (4) racun metabolik. Konsumsi obat-obatan seperti parasetamol dalam dosis berlebih pada hewan dan manusia juga dapat mengakibatkan kerusakan hati (Lee 2003). Senyawa yang dapat menyebabkan gangguan pada jaringan hati akibat efek toksik pada hati dengan dosis berlebih dan/atau dalam jangka waktu yang lama disebut sebagai hepatotoksin. Hepatotoksin dapat menyebabkan hepatitis, tergantung pada dosis pemberian, interval waktu pemberian yang singkat antara pencernaan obat dan reaksi perlawanan, serta kemampuan untuk menimbulkan perubahan yang sama pada jaringan hati (Dalimartha 2005). Berdasarkan mekanismenya terhadap perusakan hati, hepatotoksin dibagi menjadi dua macam, yaitu hepatotoksin intrinsik dan ekstrinsik. Hepatotoksin intrinsik merupakan hepatotoksin yang dapat diprediksi, tergantung pada dosis dan melibatkan mayoritas individu yang menggunakan obat dalam jumlah tertentu. Rentang waktu antara mulainya dan timbulnya kerusakan hati sangat bervariasi, dari beberapa jam sampai beberapa minggu. Salah satu contohnya adalah parasetamol (acetaminophen) yang menyebabkan nekrosis hati yang dapat diprediksi pada pemberian over dosis. Di sisi lain, hepatotoksin ekstrinsik atau idiosinkratik merupakan hepatotoksin yang tidak dapat diprediksi. Hepatotoksin ini terkait dengan hipersensitivitas atau kelainan

metabolisme. Respon dari hepatotoksin ini tidak dapat diprediksi dan tidak tergantung pada dosis pemberian. Tahap inkubasi toksin ini bervariasi, tetapi biasanya bermingguminggu atau berbulan-bulan. Contohnya seperti sulfonamid, isoniazid, halotan, dan klorpromazin (Gibson 1991). Parasetamol sebagai Stimulan Radikal Bebas Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol merupakan obat yang berkhasiat analgetik anatipiretik non narkotik turunan para aminofenol. Parasetamol cepat diserap secara sempurna oleh saluran pencernaan dan tersebar ke seluruh cairan tubuh. Konsentrasi tertinggi berada pada plasma darah setelah 1-3 jam masuk ke dalam tubuh. Sebanyak 25% parasetamol berada terikat dengan protein (Lee 2003). Parasetamol dapat menyebabkan kerusakan hati apabila dikonsumsi 7.5 gram sekaligus. Pada pemakaian lebih dari 15 gram sekaligus akan menyebabkan nekrosis atau kematian sel hati (Dalimartha 2005). Dosis parasetamol yang diinduksikan berbeda-beda, tergantung pada spesiesnya. Dosis 500 mg/KgBB pada tikus Sprague Dawley mampu membuat kerusakan membran sel hepatosit selama 14 hari (Hastuti 2008), sedangkan dosis untuk tikus galur Wistar adalah 750 mg/KgBB (Murugesh et al. 2005). Secara keseluruhan, dosis parasetamol 2 g/KgBB 14 hari mampu merusak hati tikus putih Rattus norvegicus (Balamurugan et al. 2008). Pada dosis normal, parasetamol yang masuk ke dalam tubuh akan mengalami biotransformasi di dalam hati dengan mekanisme konjugasi (metabolisme fase II) dengan glukuronat sebanyak 40%-67%, sulfonat 20-46%, serta <5%-nya adalah sistein, beberapa metabolit terhidroksilasi dan terdeasetilasi. Hasil reaksi konjugasi ini menghasilkan senyawa yang larut air (hydrosoluble) dan tidak toksik sehingga dapat disekresikan melalui urin (Lee 2003). Pada keadaan over dosis, sisa parasetamol akan dibiotransformasi oksidatif oleh sitokrom P-450 (metabolisme fase I) sehingga membentuk suatu metabolit elektrofil N-asetilp-benzoikuinonimina (NAPKI) yang bersifat hepatotoksik dan reaktif. NAPKI kemudian akan bereaksi dengan biomolekul penyusun membran sel hati, seperti fosfolipid dan protein bergugus –SH. Detoksifikasi NAPKI diawali oleh konjugasi dengan glutation tereduksi (GSH) menjadi asam merkapturat yang bersifat hydrosoluble non toxic dan dapat diekskresikan oleh ginjal (Gambar 1A).

4

Jika laju pembentukan NAPKI lebih besar dari laju detoksifikasi oleh GSH, maka akan terjadi oksidasi berbagai biomolekul penyusun membran seperti lipid atau gugus SH pada protein (Murugesh et al. 2005). Proses ini menyebabkan kandungan GSH hati <30% dari normalnya, sehingga NAPKI berikatan dengan makromolekul protein sel hati membentuk senyawa semikuinon. Senyawa ini akan mereduksi O2 menjadi O2•, kemudian membentuk senyawa radikal bebas lagi yang sejenis, yaitu radical oxygen species (ROS). ROS akan mengoksidasi fosfolipid secara berantai yang disebut oksidasi lipid. Hal ini mengakibatkan kerusakan sel hati sampai timbul nekrosis hati, yaitu terjadinya gangguan integritas membran plasma, keluarnya isi sel, dan timbulnya respon inflamasi (Gambar 1B). Respon ini menyebabkan banyak sel yang mati (Gibson & Sket 1991) yang ditandai dengan peningkatan ALT dan AST, bilirubin, alkalin fosfatase, gamma glutamil transferase, serta dehidrogenase laktat pada serum selama 24 jam setelah pemberian (Firmansyah 2006).

Oksidasi Lipid dan Analisisnya Reaksi peroksidasi lipid terbagi atas reaksi inisiasi, propagasi, dan terminasi. Peroksidasi lipid dimulai dengan pemisahan sebuah atom hidrogen dari gugus metilena (-CH2-) pada polyunsaturated fatty acids (PUFA) oleh radical oxygen species (ROS). Reaksi ini menghasilkan radikal karbon pada PUFA. Radikal karbon distabilkan melalui suatu pengaturan ulang ikatan rangkap menghasilkan pembentukan diena terkonjugasi. Dalam keadaan aerobik, diena ini bereaksi dengan O2 membentuk radikal peroksi lipid (-CHOO•-). Radikal peroksi lipid ini dapat juga menghilangkan atom hidrogen dari gugus metilena (-CH2-) molekul lipid lain yang berdekatan, khususnya dengan adanya logam Cu atau Fe menyebabkan terjadinya reaksi autokatalitik. Radikal peroksi bergabung dengan atom H dari -CH2- lipid lain menghasilkan hidroperoksida lipid (-CHOOH-) dan radikal karbon lain (-CH•-). Tahap ini disebut propagasi. Selanjutnya radikal peroksi lipid akan membentuk lipid peroksida. Tahap

Fenolsulfotransferase

UDP-glukuronosiltrasferase Glukuronida

Asetaminofen EKSKRESI

EKSKRESI Sitokrom P450

Glutation Glutation S-transferase

N-asetil-pbenzokuinonimina NAPKI

merkaptat

Asetaminofen Sitokrom P450 Jika <30% glutation normal Kematian sel

merkaptat

NAPKI

NAPKI

Gambar 1 Metabolisme parasetamol. (A) dosis normal, (B) dosis tinggi pada hati (Kavalci et al. 2009).

5

terminasi terjadi akibat reaksi peroksi radikal dengan α-tokoferol, senyawa lipofilik pada membran sel (Hall & Bosken 2009). Sebelum tahap terminasi, radikal peroksi lipid (-CHOO•-) dapat mengalami proses transformasi menjadi peroksida siklik lalu siklik endoperoksida dari PUFA jenis arakidonat atau asam eikosapentanoat (Hall & Bosken 2009). Reaksi ini berlanjut hingga membentuk produk sekunder, yaitu malonaldehida (MDA). Oleh karena itu, lipid peroksida dapat dianalisis dengan adanya MDA yang direaksikan dengan asam tiobarbiturat (TBA) (Yagi 1994). Metode asam tiobarbiturat digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidasi suatu senyawa. Metode ini dilakukan secara langsung berdasarkan pengukuran produk utama atau sekunder dari reaksi oksidasi lipid. Prinsip metode TBA merupakan proses autooksidasi dari asam linoleat yang menghasilkan TBAreacting substances (TBARS), seperti malondialdehida (MDA). TBA bereaksi dengan gugus karboksilat dari MDA melalui penambahan nukleofilik membentuk kompleks MDA-TBA dalam suasana asam. Satu molekul MDA berikatan dengan dua molekul TBA menghasilkan produk yang berwarna sehingga dapat dikuantifikasi melalui spektrofotometri pada λ=532 nm (Gambar 2) (Yagi 1994). Metode TBA mempunyai tingkat kepekaan yang tinggi pada radikal bebas dan mudah diaplikasikan untuk sampel dalam berbagai macam tahap oksidasi. Senyawa lain pun dapat bereaksi dengan TBA, seperti glukosa, sukrosa, asam amino, dan urea dalam konsentrasi yang sangat rendah. Metode TBA ini prinsip awalnya adalah pemurnian lipid peroksida dari senyawa-senyawa lain, kemudian diikat oleh TBA. Penambahan H2SO4 pada serum sampel berfungsi untuk memutuskan ikatan lipid dengan senyawa lain seperti protein. Penambahan fosfotungstat berfungsi mengendapkan protein serum. Proses sentrifugasi dilakukan untuk mengendapkan lipid bersama dengan protein. Pelet yang diperoleh merupakan kumpulan lipid peroksida. Penambahan TBA 1% ke dalam pelet harus dalam kondisi asam, yaitu untuk merenggangkan padatan pelet sehingga TBA dapat bereaksi dengan lipid peroksida. Proses dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu panas untuk mempercepat reaksi. Penambahan HCl hingga pH 1.7 dilakukan untuk menghilangkan sisa-sisa pengotor pada komponen lipid. Penambahan n-butanol : piridin (15:1) dilakukan untuk mengendapkan pengotor-

pengotor tersebut. Kemudian dilakukan sentrifugasi dan diperoleh supernatan berwarna merah keunguan yang merupakan kompleks lipid peroksida-TBA (Yagi 1994). Inisiasi radikal

Inisiasi:

Hidrogen alil

Alkil radikal Propagasi: Konjugat diena Radikal peroksil Lipid hidroperoksida Fe katalis Radikal peroksil Radikal alkoksil

Peroksida siklik

Endoperoksida siklik

A TBA bereaksi dengan MDA

B

Produk

Gambar 2 Peroksidasi lipid hati. (A) pembentukan MDA, (B) kompleks TBA-MDA (Hall & Bosken 2009). Buah Delima (Punica granatum L.) Pohon delima (Punica granatum L.) adalah perdu atau pohon kecil yang banyak tumbuh dan dipelihara di pekarangan penduduk Indonesia sebagai tanaman hias. Pohon ini memiliki kingdom Plantae, filum Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Rosidae, famili Lythracae, genus Punica, dan spesies Punica granatum Linn (Wiryowidagdo 2008). Buah delima (pulp) memiliki presentase sebesar 57.51% dari berat buah total, meliputi 63.58% sari buah (juice) dan 36.21% biji (seed). Kulit buah (peel) delima memiliki ketebalan yang tinggi dengan berat 29.84% dari berat buah tota (Tabel 1). Sari buah segar mengandung 84.57% air, 14.1% gula total, 1.05% protein, dan 0.33% kadar abu (Tabel 2).

6

Total protein, asam askorbat, lemak, dan komponen fenolik pada biji delima adalah 4.06%, 0.32%, 0.15%, dan 2.92% (Tabel 3) (Al-Maiman & Ahmad 2002). Asam amino yang terkandung diantaranya asam glutamat dan asam aspartat (Aviram et al. 2000). Di sisi lain, Li Y et al. (2006) juga melaporkan bahwa kulit buah delima (peel) memiliki kadar air 8.0±0.8% dan menghasilkan rendemen fenolik yang lebih besar dari pulp, yaitu 31.5±3.0%. Polifenol yang terlarut dalam sari buah sebanyak 0.2%-1.0% yang terdiri atas dua tipe, yaitu flavonoid jenis antosianin (8%-15%) dan

tanin jenis elagitanin (80%-90%). Antosianin (seperti delfinidin-3-glukosida, sianidin-3glukosida, sianidin-3,5-diglukosida, dan pelargonidin) berfungsi dalam memberikan warna merah pada buah. Tanin hydrolizable (seperti punikalin, pedunkulagin, punikalagin, galik, dan ester asam elagik pada glukosa) berperan dalam 92% aktivitas antioksidan dalam buah. Aktivitas antioksidan buah delima ini dilaporkan lebih tinggi daripada anggur merah dan teh hijau. Antioksidan ini juga berpotensi dalam mencegah peroksidasi lipid (Malik et al. 2005).

Tabel 1 Kondisi fisik buah delima pada berbagai kematangan Parameter

Belum matang Panjang (cm) 6.61±0.29 Diameter (cm) 3.54±0.15 Panjang/diameter 1.87±0.12 3 Volume (cm ) 126.74±20.02 Densitas buah 1.29±0.2 Bobot buah (g) 163.52±22.48 Bobot kulit (g) 48.34±12.21 % kulit 29.56 Bobot biji (g) 90.01±34.03 % biji 55.05 Bobot sari buah (g) 59.99±17.01 % sari buah 30.57 Sumber: Al-maiman & Ahmad (2002)

Kematangan Setengah matang Matang 6.67±0.28 6.55±0.28 3.61±0.25 3.67±0.22 1.87±0.13 1.79±1.84 161.02±48.61 156.74±29.86 1.20±0.1 1.38±0.2 193.82±49.44 216.50±42.88 54.43±9.0 69.01±15.33 28.08 31.87 111.95±31.37 129.27±28.21 57.77 59.71 68.76±20.93 81.03±16.72 30.32 32.88

Rata-rata 6.64±0.31 3.61±0.21 1.84±0.11 148.16±36.82 1.29±0.16 191.27±44.16 58.92±17.36 29.84 110.41±34.10 57.51 59.93±19.60 31.21

Tabel 2 Kadar abu (%) dan mineral (mg/100 g) pada sari buah dan biji delima Parameter

Belum matang

Sari buah (juice) Kadar abu 0.46±0.09 Cu 0.03±0.01 Fe 0.84±0.12 Zn 0.20±0.01 Mg 9.87±0.45 P 7.37±2.33 Na 37.8±10.3 Ca 38.2±9.27 K 309±9.27 Biji (seed) Kadar abu 0.29±0.03 Cu 0.06±0.01 Fe 2.37±0.01 Zn 0.22±0.00 Mg 7.39±0.44 P 5.16±0.08 Na 79.2±2.2 Ca 26.9±0.44 K 285±7.53 Sumber: Al-maiman & Ahmad (2002)

Kematangan Setengah matang Matang

Rata-rata

0.43±0.1 0.03±0.01 1.27±0.06 0.30±0.19 10.2±0.95 3.91±0.36 44.5±5.95 31.4±10.2 209±14.5

0.47±0.21 0.04±0.01 1.88±0.14 1.26±0.67 11.9±2.18 7.49±0.29 95.7±2.17 59.3±8.88 243±21.7

0.45±0.02 0.03±0.01 1.33±0.52 0.59±0.50 10.6±1.09 6.26±2.03 59.3±31.6 43.0±14.5 253±51.1

0.38±0.01 0.07±0.04 1.99±0.00 0.24±0.00 6.34±0.03 6.96±0.56 76.9±0.144 23.3±0.27 302±5.44

0.32±0.02 0.07±0.00 2.21±0.01 0.30±0.00 5.13±0.05 6.25±0.04 72.1±0.12 24.5±0.23 333±15.8

0.33±0.01 0.07±0.01 2.19±0.19 0.25±0.04 6.29±1.13 6.12±0.91 76.1±3.59 24.8±18.5 307±24.4

Tabel 3 Komposisi kimia biji buah delima Parameter

Belum matang Kadar air (%) 79.45±0.96 Protein (%) 3.99±0.4 Lemak (%) 0.2±0.0 Jenuh 18.6±3 Tidak jenuh 81.6±4.26 Asam askorbat (mg/100 g) 0.26±0.07 Komponen fenolik (mg/100 g) 3.65±0.17 Sumber: Al-maiman & Ahmad (2002)

Kematangan Setengah matang Matang 80.66±3.39 77.72±3.36 3.74±0.89 4.45±0.68 0.01±0.0 0.25±0.3 17.9±3.6 16.4±2 82.1±2.1 84.6±2.5 0.25±0.14 0.18±0.32 3.22±0.72 1.90±0.57

Rata-rata 79.28±2.89 4.06±0.26 0.15±0.10 17.5±1.02 82.8±17.96 0.23±0.11 2.92±0.19

7

Buah delima (Gambar 3) telah lama diformulasikan sebagai tanaman obat tradisional oleh masyarakat. Pada umumnya adalah sebagai obat antikanker. Semua khasiat sediaan delima ini disebabkan oleh kandungan berbagai senyawa antioksidan yang aktivitasnya sangat tinggi (Wiryowidagdo 2008). Pada akhir dekade ini, penelitian medis tentang komponen ekstrak buah delima seperti antioksidan, antikarsinogenik, dan antiinflamasi telah dipublikasikan dan difokuskan pada pengobatan dan pencegahan kanker, penyakit kardiovaskular, diabetes, infeksi bakteri, resistensi antibiotik, serta kerusakan kulit yang diinduksi radiasi UV. Beberapa potensi lain seperti pengobatan insomnia, infertilitas laki-laki, dan obesitas telah dikembangkan (Jurenka 2008). Namun, potensinya sebagai hepatoprotektor belum banyak diteliti.

mendonasikan atom hidrogen ke senyawa radikal membentuk intermediet radikal fenoksil. Senyawa intermediet radikal fenoksil relatif stabil sehingga tidak mampu lagi menginisiasi reaksi radikal selanjutnya (Nzaramba 2008). Aktivitas biologis yang tinggi pada senyawa fenolik ini terletak pada posisi dan jumlah gugus hidroksil (-OH). Reed et al. (2005) menambahkkan bahwa ester asam galik seperti punikalin (Gambar 4A) dan punikalagin (Gambar 4B) memberi aktivitas antioksidan tertinggi pada polifenol buah delima. Khasiat antioksidan polifenol umumnya berguna dalam pencegahan kanker, misalnya isoflavon pada hormone dependent cancer, mediasi reseptor estrogen pada kanker payudara, serta aktivitas antikanker lain. Polifenol juga berperan dalam proteksi penyakit kardiovaskular, seperti penurun kadar kolesterol dan aktivitas antioksidasinya. Potensi lainnya yang telah diketahui adalah antiosteoporosis, antiperadangan, obesitas, dan lain-lain (Andersen & Markham 2006). Kajian terhadap polifenol tidak hanya ditujukan pada peran biologisnya, tetapi lebih karena potensinya sebagai obat. Kini senyawa polifenol (flavonoid, terpenoid, dan steroid) telah diketahui selain memiliki aktivitas antioksidan, juga memiliki aktivitas hepatoproteksi pada tikus galur Wistar (Murugesh et al. 2005).

Gambar 3 Buah delima (Punica granatum L.). Polifenol Polifenol merupakan senyawa metabolit sekunder dari tumbuhan yang banyak tersebar di alam. Polifenol disintesis di dalam tumbuhan melalui dua lintasan, yaitu lintasan shikimat dan asetat. Lebih dari 8.000 struktur fenolik telah diketahui (Lu & Gökmen 2002). Struktur utama polifenol adalah difenilpropana yang mengandung dua cincin aromatik yang dihubungkan dengan tiga atom karbon, biasanya membentuk oksigen heterosiklik. Jenis molekul senyawa ini beragam, mulai dari yang paling sederhana seperti asam fenolik hingga bentuk polimer tinggi seperti tanin. Polifenol umumnya berkonjugasi dengan satu atau lebih gula pada gugus hidroksil atau atom karbon aromatik (Reed et al. 2005). Komponen fenolik bertindak sebagai antioksidan, yaitu terminator dari radikal bebas dan sebagai pengkelat ion logam redoks aktif. Ion logam ini memungkinkan peranannya untuk mengatalisis reaksi peroksidasi lipid. Antioksidan fenolik ini menghalangi oksidasi lipid dan molekul lain dengan cara

A

B

Gambar 4 Tanin buah delima. (A) punikalin, (B) punikalagin (Reed et al. 2005).

8

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam peneletian ini adalah tikus putih galur Sprague Dawley jantan (Pusat Studi Biofarmaka-IPB) dengan kondisi sehat berumur 8 minggu dan berat 140-180 g, pakan standar (Indofeed, Indonesia), buah delima (Lampung, Indonesia), parasetamol (Sanmol, Indonesia), dan Cursil®70. Selain itu beberapa pereaksi yang digunakan adalah 1,1,3,3-tetrametoksipropana 6 M, H2SO4 N/12 (Merck, Indonesia), asam fosfotungstat 10% (v/v) (Merck, Indonesia), TBA 1% (b/v) (Merck, Indonesia), aseton (Merck, Indonesia), H2O, asam asetat (Merck, Indonesia), butanol (Merck, Indonesia), piridin (Merck, Indonesia), dan HCl. Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah oven, penggiling, shaker orbital, uap putar, penangas air, desikator, neraca, spektrofotometer UV-Vis Genesys type, vortex, sentrifus klinis, mikrosentrifus, pH indikator, dan pH meter. Peralatan lainnya adalah labu ukur, Erlenmeyer, pipet tetes, pipet Mohr, pipet mikro, dan cawan porselin. Metode Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dalam beberapa tahap kegiatan, yaitu penentuan kadar air, ekstraksi polifenol buah delima, adaptasi hewan coba, perlakuan hewan coba, pengukuran konsentrasi lipid peroksida sebagai parameter kerusakan hati, serta analisis statistika. Sebelumnya dilakukan preparasi sampel, yaitu buah delima (pulp) di oven pada suhu 50°C selama enam hari. Setelah kering, dilakukan penggilingan hingga terbentuk serbuk simplisia. Sampel segar (pulp) dan simplisia kemudian diukur kadar airnya. Penentuan Kadar Air (AOAC 1995) Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105ºC selama 30 menit lalu didinginkan pada desikator dan ditimbang. Kadar air ditentukan dengan cara memasukkan 5 g sampel di dalam cawan porselin pada suhu 105ºC. Kemudian dilakukan pendinginan pada desikator sebelum ditimbang. Setelah 2 jam, bobot sampel dalam cawan porselin ditimbang, selanjutnya penimbangan dilakukan setiap 30 menit sekali hingga bobot konstan atau berbeda ≤ 0.0003 g. Penentuan kadar air dilakukan sebanyak 3 kali. Kadar air dapat dihitung menggunakan rumus:

W

= Bobot sampel (g)

W1 = Bobot (cawan + sampel) setelah dioven W2 = Bobot cawan kosong Ekstraksi Polifenol Buah Delima (Hayouni et al. 2007) Metode ekstraksi yang akan dilakukan adalah modifikasi metode ekstraksi satu tahap (batch mode). Setiap 25 gram serbuk buah delima dimaserasi dengan 250 mL aseton:air:asam asetat (90:9.5:0.5) pada shaker orbital dengan suhu ruang selama 24 jam. Ekstrak tersebut kemudian disaring dengan kertas saring. Metode diulang hingga warna ekstrak sama dengan warna pelarut awal. Filtrat dikumpulkan dan dirotavapor pada suhu 45ºC kondisi vakum hingga kering. Perlakuan Hewan Coba Hewan coba yang digunakan adalah tikus dengan galur Sprague Dawley. Hewan percobaan berjumlah 22 ekor dikelompokkan menjadi 7 kelompok dan masing-masing kelompok terdiri atas 3 ekor, kecuali kelompok normal (4 ekor). Tikus dikandangkan secara individu beralaskan sekam kayu. Tikus diberi pakan standar 20 g/ekor/hari pada tahap adaptasi dan ditingkatkan mejadi 25 g/ekor/hari pada tahap perlakuan dengan air minum secara ad libitum. Sebelum perlakuan, tikus diadaptasi selama 19 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan pola makan dengan pakan standar, serta membiasakan diri dengan lingkungannya. Tikus kelompok I merupakan kelompok normal (N) yang hanya diberi pakan standar selama penelitian dan dicekok akuades pada hari ke-0 hingga ke-34. Kelompok II atau kontrol positif (KP) yang menggunakan Cursil®70 (obat hepatitis) dengan dosis 13.3 mg/KgBB dari hari ke-18 hingga hari ke-34. Kelompok III adalah kelompok negatif (KN) yang dicekok parasetamol dosis 500 mg/KgBB pada hari ke-0 hingga ke-34. Kelompok IV (FD13.3), V (FD100), VI (FD250), dan VII (FD500) merupakan kelompok perlakuan yang dicekok dengan fraksi polifenol buah delima pada konsentrasi 13.3, 100, 250, dan 500 mg/KgBB dari hari ke-18 hingga hari ke-34. Kelompok II-VII secara bersamaan dicekok parasetamol 500 mg/KgBB dari hari ke-0 hingga hari ke-34. Pengukuran Konsentrasi Lipid Peroksida Serum (Yagi 1994) Pengambilan Serum Sampel. Darah tikus diambil dari pembuluh vena ekor (hari ke-0 dan ke-18). Sebelum darah diambil, tikus dipuasakan minimal 12 jam. Gunting dan ujung ekor tikus disterilkan terlebih dahulu dengan

9

alkohol 70%. Pemotongan dilakukan maksimal 5 mm dari ujung ekor dan ekor dibersihkan kembali dengan Betadine. Sampel darah yang diperoleh pada vial didiamkan pada kotak berisi es dan disimpan pada lemari pendingin selama semalam. Serum dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 rpm pada suhu selama 15 menit. Pengambilan darah pada hari ke-35 dilakukan dari jantung (Gambar 5). Persiapan Kurva Standar. Larutan stok pereaksi 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M diencerkan menjadi 0.9, 1.8, 2.7, 3.6, 4.5, dan 6.0 µM. Tiap-tiap larutan dipipet sebanyak 4 mL ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1.0 mL TBA 1% (b/v) dalam pelarut asam asetat 50% (v/v). Tahap selanjutnya tabung diinkubasi pada suhu 95°C selama 60 menit dan didinginkan dalam suhu kamar. Tabung yang telah dingin ditambah 1.0 mL air destilata serta 5 mL n-butanol:piridin 15:1 (v/v). Tabung ini selanjutnya dihomogenkan menggunakan vortex dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Lapisan atas (fasa organik) diambil dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada λ=532 nm. Pengukuran Sampel. Serum tikus diambil sebanyak 0.3 mL kemudian ditambah 1.2 mL H2SO4 1/12 N. Campuran dibiarkan 10 menit, selanjutnya diberi asam fosfotungstat 10% (v/v) sebanyak 0.15 mL dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang telah diperoleh dibuang, sedangkan peletnya ditambah 1.2 mL H2SO4 0.041 N dan 0.15 mL asam fosfotungstat 10% (v/v). Larutan ini disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Endapan yang diperoleh disuspensikan dalam 2.0 mL air destilata. Prosedur selanjutnya sama seperti yang dilakukan pada larutan standar (setengah resep). Sebelum penambahan 5 mL n-butanol : piridin pada sampel, dilakukan penambahan HCl sampai pH-nya berkisar 1.6-1.7. Analisis Data (Myers & Milton 1991) Data bobot badan diuji menggunakan uji-T menggunakan perangkat lunak SPSS Statistical Data Analysis seri 17. Data konsentrasi lipid peroksida yang diperoleh kemudian dimasukkan dalam uji analysis covarian (ANCOVA) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α = 0.05 menggunakan perangkat lunak statistical analysis system (SAS). Model rancangan tersebut adalah: Yij = µ + τi + βxij + εij Keterangan: yij = Respon pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

µ = Pengaruh rataan umum τi = Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1-7 βxij = Pengaruh kovarian (x) terhadap perlakuan ke-i dan ulangan ke-j εij = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1, 2, 3, 4 Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan.

Gambar 5 Pengambilan darah dari jantung pada tikus Sprague Dawley.

HASIL DAN PEMBAHASAN Fraksi Polifenol Buah Delima Sampel buah delima yang digunakan adalah delima matang yang berasal dari Lampung, Indonesia. Sebelum diekstrak, bulir buah delima segar (pulp) dan simplisia dilakukan pemeriksaan pendahuluan, yaitu penentuan kadar air total pada sampel basah dan sampel kering. Kadar air pada bulir segar (pulp) yang diperoleh adalah 83.11±0.067%. Nilai ini tidak berbeda dari hasil yang dilaporkan oleh AlMaiman dan Ahmad (2002) bahwa kadar air sari buah (juice) delima matang sebesar 83.65±0.4%, sedangkan kadar air dari biji (seed) delima matang sebesar 77.72±3.36%. Nilai kadar air sampel merupakan nilai yang relatif, bergantung pada ukuran, kematangan buah, tempat tumbuh, dan kondisi lainnya yang dapat mempengaruhi perbedaan kadar air serta komponen lainnya (Al-Maiman & Ahmad 2002). Di sisi lain, kadar air pada sampel kering atau simplisia adalah 12.02±0.37%. Hasil ini dapat dikatakan kurang baik karena kadar air serbuk yang lebih dari 10% tidak memungkinkan penyimpanannya dalam jangka waktu lama (AOAC 1995). Kadar air yang diperoleh pada penelitian ini kurang menguntungkan untuk menyimpannya dalam waktu yang lama karena memungkinkan tumbuhnya jamur. Selain itu, tingginya kadar air disebabkan oleh banyaknya kadar gula total dalam sampel, sekitar 14.1% dari bobot total buah (Al-Maiman & Ahmad 2002), sehingga simplisia mudah mengalami karamelisasi. Kadar gula tersebut makin meningkat seiring

10

dengan kematangan buah. Buah matang memiliki persentase gula lebih tinggi pada glukosa (53.4%) dan fruktosa (46.6%) (AlMaiman & Ahmad 2002). Nilai kadar air simplisia juga berpengaruh pada kadar rendemen polifenol yang terbentuk. Nilai kadar air 12.02±0.37% menunjukkan bahwa jumlah komponen selain air yang terkandung pada sampel sekitar 87.98% yang diantaranya terkandung komponen fenolik. Nilai kadar air ini tidak berbeda jauh dengan yang dilaporkan oleh Li Y et al. (2006) untuk sampel kering buah delima (pulp) sebesar 10.9±1.1%. Fraksi polifenol buah delima diperoleh dari modifikasi metode maserasi satu tahap (batch mode) dengan pelarut aseton:air:asam asetat (90:9.5:0.5) (Hayouni et al. 2007). Modifikasi yang digunakan adalah lama ekstraksi yang ditentukan oleh perubahan warna ekstrak hingga kembali ke warna awal pelarut (± 3 x 24 jam) yang dilakukan pada shaker orbital dengan kecepatan putar 120 rpm. Hal ini dimaksudkan untuk memperluas titik singgung antara pelarut dan serbuk kering buah delima sehingga proses ekstraksi polifenol berlangsung optimal. Rendemen atau fraksi polifenol diperoleh dari hasil pengonsentrasian semua fraksi organik pada rotary evaporator atau rotavapor pada suhu 45°C kondisi vakum. Dari kadar sampel kering ±87.98% diperoleh rendemen (fraksi) polifenol sebanyak 36.2%. Goli et al. (2004) menyebutkan bahwa banyaknya jumlah rendemen ekstrak bergantung pada pelarut dan metode ekstraksi. Metode ekstraksi batch mode dengan pelarut aseton:air:asam asetat (90:9.5:0.5) dilaporkan mampu menghasilkan total komponen fenolik tertinggi pada Quercus coccifera L. dan Juniperus phoenica L. dibandingkan dengan menggunakan pelarut lain, seperti etanol, metanol, atau etil asetat (Hayouni et al. 2007). Singh et al. (2002) telah mengekstraksi antioksidan buah delima dan kulit buah delima dari beberapa pelarut secara individu. Pelarut-pelarut tersebut meliputi metanol, aseton, atau air. Rendemen antioksidan maksimum diperoleh dari ekstrak metanol, 23.1±1.5%. Rendemen komponen fenolik buah delima yang diperoleh pada penelitian ini tergolong tinggi. Hal ini diduga oleh kemampuan kombinasi berbagai pelarut yang berbeda memberikan solubilitas yang lebih tinggi daripada pelarut individu. Rendemen ini lebih tinggi daripada rendemen antioksidan yang dilaporkan oleh Li Y et al. (2006) yang menggunakan kombinasi pelarut metanol, etanol, aseton, dan lain-lain dengan metode

yang telah dipatenkan pada Chinese Patent. Li Y et al. (2006) menyebutkan bahwa kadar air simplisia buah delima (pulp) sebesar 10.9±1.1%. Dengan kata lain, kandungan komponen non airnya sekitar 89.1% dan menghasilkan rendemen komponen fenolik sebesar 14.5±1.7%. Oleh karena itu, hal ini dapat dijadikan sebagai faktor koreksi dalam perbedaan aktivitas fraksi polifenol yang akan ditunjukkan pada uji in vivo. Hasil rendemen yang lebih tinggi pada penelitian ini diduga memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi pula dalam menurunkan peroksidasi lipid. Kondisi Hewan Coba Hewan coba sebelumnya dilakukan adaptasi selama 19 hari untuk menghindari resiko timbulnya stres selama proses transportasi serta menyeragamkan pola makan ataupun pola hidup dengan lingkungan baru. Selama tahap adaptasi, tikus hanya diberi pakan standar serta dilakukan penimbangan bobot badan secara berkala setiap hari. Pakan standar yang digunakan diperoleh dari PT. Indofeed dengan komposisi yang tidak berbeda jauh dengan normal laboratory diet (Tabel 4) (Anila & Vijayalakshmi 2003). Secara keseluruhan semua tikus mengalami peningkatan bobot badan sebesar 40.12%. Uji statistika menunjukkan peningkatan secara signifikan (p<0.05). Bobot badan tikus rata-rata pada awal adaptasi sebesar 161.88±8.77 g yang tidak berbeda nyata (FhitFα) (Gambar 6). Kenaikan bobot badan ini dipengaruhi oleh tingkat konsumsi pakan dan umur tikus yang berada dalam masa pertumbuhan (mature point), yaitu kurang dari 6 bulan. Umur tikus yang digunakan pada awal adaptasi adalah ±2 bulan. Kondisi ini menunjukkan tikus dalam keadaan sehat, tidak ada gangguan pertumbuhan, kalorinya tercukupi, serta tidak adanya zat toksikan dalam pakan (Lu 2006). Kondisi ini menjadi faktor yang penting agar dapat memperkecil nilai galat percobaan. Namun, bobot badan tikus pada penelitian ini pada umur yang sama lebih rendah ±70% dari yang dilaporkan oleh lembaga riset Ace Animal (2006). Menurut lembaga riset Ace Animal (2006), bobot badan tikus jenis Sprague Dawley pada usia 59-61 hari adalah 275-299 g, sedangkan bobot badan pada usia 70-77 hari sebesar 350-399 g. Perbedaan ini diduga disebabkan oleh perbedaan kadar protein dalam pakan, konsumsi pakan, atau pun faktor genetik yang berperan dalam peningkatan bobot badan.

11

Tabel 4 Komposisi pakan standar tikus Komposisi

PT. Indofeed (%) 18 6 6 8 0.8 1.05

Normal laboratory diet (%)* 21 5 4 8 1 0.6

Protein kasar Lemak Serat kasar Kadar abu Kalsium Fosfor Ekstrak 53 nitrogen bebas *Sumber: Anila & Vijayalakshmi (2003)

53

(Fhit
Gambar 6 Bobot badan tikus masa adaptasi. Perlakuan hewan coba dilanjutkan dengan induksi atau cekok parasetamol atau paraasetilaminofenol dosis tinggi (500 mg/KgBB) selama 34 hari kecuali pada kelompok normal. Efek stres akibat pencekokan terlihat jelas dari peningkatan BB tikus yang fluktuatif (Gambar 7). Gan (1980) menyatakan bahwa pemberian parasetamol dalam dosis berlebih dapat menimbulkan gejala-gejala anoreksia, mual, muntah, serta sakit perut yang terjadi dalam 24 jam pertama, dan dapat berlangsung terus menerus selama seminggu atau lebih. Gejalagejala inilah yang menyebabkan nafsu makan hewan coba menurun. Rata-rata BB tikus pada tahap ini meningkat 14.33 % secara nyata (p<0.05) dari 226.82±9.43 g menjadi 259.32±8.62 g dengan nilai BB tiap kelompok tidak berbeda nyata (Fhit
Gambar 7 Bobot badan tikus hari ke-0 hingga ke-17.

Gambar 8 Bobot badan tikus hari ke-18 hingga ke-34. Konsentrasi Lipid Peroksida Serum Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas polifenol buah delima terhadap peroksidasi lipid darah tikus yang diinduksi parasetamol dosis 500 mg/KgBB. Kondisi fisik hewan coba yang teramati pada tiap kelompok belum bisa menggambarkan kondisi fisiologis yang terjadi. Stockham dan Scott (2008) menyebutkan bahwa profil konsentrasi lipid peroksida atau TBA-reacting substances (TBARS) pada serum dapat menggambarkan kondisi hati akibat peroksidasi lipid oleh radikal yang teralirkan ke pembuluh vena. Hari ke-0 Kondisi kesehatan selama tahap adaptasi ini dapat mempengaruhi konsentrasi lipid

12

peroksida atau TBARS serum. Rataan konsentrasi TBARS pada hari ke-0 untuk semua tikus adalah 0.557±0.156 nmol/mL (p<0.05), dari rentang 0.023 nmol/mL hingga 0.76 nmol/mL dengan populasi 22 tikus. Hasil ini tidak berbeda dengan hasil penelitian Lavenia (2010) yang menunjukkan bahwa ratarata konsentrasi lipid peroksida serum tikus pada hari ke-0 adalah 0.586±0.177 nmol/mL. Konsentrasi TBARS pada kelompok N, KP, KN, FD13.3, FD100, FD250, dan FD500 berturut-turut adalah 0.451±0.315 nmol/mL, 0.620±0.133 nmol/mL, 0.605±0.135 nmol/mL, 0.547±0.022 nmol/mL, 0.547±0.072 nmol/mL, 0.583±0.098 nmol/mL, dan 0.583±0.149 nmol/mL (Gambar 9). Secara statistik, konsentrasi TBARS tiap kelompok ini tidak berbeda nyata (FhitFα) tidak selalu mempengaruhi konsentrasi TBARS serum. Myers dan Milton (1991) menyebutkan bahwa kondisi fisiologis awal yang bersifat kuantitatif (TBARS) disebut sebagai faktor kovarian yang dapat mempengaruhi keragaman nilai TBARS atau lipid peroksida selanjutnya. Konsentrasi lipid peroksida serum juga berbeda pada berbagai spesies. Misalnya lipid peroksida serum normal pada tikus jenis Rattus novergicus sebesar 2.99±0.11 nmol/mL (Mohamed et al. 2005), 3.41±0.57 nmol/mL pada jenis Wistar (Haidari et al. 2009), sedangkan pada manusia (lakilaki) normal sebesar 3.42±0.94 nmol/mL (Yagi 1994). Hari ke-18 Setelah tahap adaptasi, 17 hari selanjutnya tikus dicekok parasetamol dosis 500 mg/KgBB kecuali kelompok normal (N). Pemberian parasetamol ditujukan untuk meningkatkan radikal bebas yang dapat menginduksi aktivitas peroksidasi lipid (Muriel et al. 1992). Hasil penelitian menunjukkan konsentrasi TBARS

pada hari ke-18 mengalami peningkatan yang signifikan (p<0.05) dengan presentase yang berbeda pada tiap kelompok. Konsentrasi TBARS kelompok KP meningkat 52.58% menjadi 0.946±0.079 nmol/mL, sedangkan pada kelompok KN meningkat 63.14% menjadi 0.987±0.047 nmol/mL. Di sisi lain, konsentrasi TBARS kelompok FD13.3, FD100, FD250, dan FD500 berturut-turut mengalami peningkatan sebesar 81.9%, 72.94%, 71.36%, dan 62.26% dengan konsentrasi TBARS akhir masing-masing sebesar 0.995±0.088 nmol/mL, 0.946±0.068 nmol/mL, 0.999±0.075 nmol/mL, dan 0.946±0.118 nmol/mL. Meningkatnya konsentrasi lipid peroksida (TBARS) yang terukur menggambarkan kondisi perusakan hati yang terus berlangsung dan gagalnya mekanisme pertahanan antioksidan endogen dalam kehadiran radikal bebas yang berlebih (Balamurugan et al. 2008). Murugesh et al. (2005) menjelaskan bahwa parasetamol dalam dosis terapetik dapat dimetabolisasi dan didetoksifikasi oleh hati dengan cara glukuronidisasi dan sulfasi sehingga dapat diekskresi melalui ginjal. Tetapi, ketika parasetamol sudah berada dalam dosis toksik, senyawa ini dikonversi ke dalam bentuk N-asetil-p-benzokuinonimina (NAPKI). NAPKI merupakan bentuk elektrofilik intermediet yang lebih toksik dan reaktif, hasil oksisdasi kompleks enzim sitokrom P450. NAPKI secara cepat bereaksi dengan glutation (GSH) dan mengawali penghabisan 90% total GSH pada sel dan mitokondria, sehingga mengakibatkan kematian hepatoseluler dan disfungsi mitokondria. Interaksi NAPKI dan GSH membetuk konjugat GSHacetaminophen, metabolit dengan kereaktifan yang lebih tinggi (Reszka et al. 2004). Selain itu, Nagy et al. (2007) menjelaskan induksi parasetamol dosis tinggi menyebabkan kematian sel hepatosit secara apoptosis maupun nekrosis.

Gambar 9 Konsentrasi lipid peroksida serum. ( ) hari ke-0, ( ) hari ke-18, dan ( ) hari ke-35.

13

Berbeda dengan kelompok lain, kelompok normal (N) tidak diberi perlakuan pencekokan parasetamol, tetapi dicekok akuades sebagai kontrol. Namun konsentrasi TBARS serum yang terukur mengalami peningkatan 62.75% pada hari ke-18 menjadi 0.734±0.079 nmol/mL. Peningkatan ini diduga disebabkan oleh kondisi stres oksidatif tikus akibat pencekokan akuades, yaitu stres elektron pada fosforilasi oksidatif membran dalam mitokondria menghasilkan jumlah anion peroksida (O2•-) yang tinggi sehingga meningkatkan peroksidasi lipid membran (Balamurugan et al. 2008). Namun jika konsentrasi TBARS keenam kelompok yang diinduksi parasetamol dibandingkan dengan kelompok normal, konsentrasi TBARS dianggap tidak berbeda nyata (Fhit
kontinuitas induksi parasetamol. Konsentrasi ini 86.19% lebih tinggi dari kondisi normal dan 120.66% meningkat selama 34 hari induksi. Konsentrasi TBARS yang terus meningkat ini didukung oleh teramatinya nekrosis sel atau kerusakan organ hepatosit akibat parasetamol secara anatomi dengan adanya bercak-bercak pada hati dan bilur steatosis yang tipis (Ariadini 2007). Hal ini diduga karena pada kelompok ini hanya diberi pakan standar, sehingga kurang cukup untuk mendapat antioksidan ataupun asupan nutrisi lain yang dapat menangkal radikal bebas ataupun regenerasi sel akibat induksi parasetamol. Peningkatan konsentrasi lipid peroksida yang terjadi juga menggambarkan kondisi stres oksidatif pada sel hepatosit. Kondisi ini terjadi akibat aktivitas NAPKI dan konjugat GSHacetaminophen yang dapat meningkatkan pembentukan reactive oxygen species (ROS) seperti anion superoksida (O2•-), radikal hidroksil (•OH), dan hidrogen peroksida (H2O2), serta reactive nitrogen species (RNS) seperti nitrit oksida (•NO) dan peroksi nitrit. Jumlah ROS dan RNS yang meningkat dapat menyerang berbagai molekul biologis, seperti DNA, protein, dan fosfolipid yang mengawali proses peroksidasi lipid, nitrasi tirosin, dan pengurangan berbagai antioksidan enzim (Tiwari & Khosa 2010). Kontradiksi dari kelompok KN adalah kelompok kontrol positif (KP) dan kelompok fraksi. Tikus kelompok KP diinduksi Cursil®70 dosis 13.3 mg/KgBB pada hari ke-18 hingga ke-34. Cursil®70 merupakan salah satu obat komersil yang mengandung ekstrak kurkumin dan silimarin yang berfungsi sebagai hepatoprotektor. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi TBARS serum menurun sebesar 8.14%, (p>0.05) yaitu 0.869±0.039 nmol/mL. Hasil ini juga dapat menjelaskan pendugaan kondisi hati tikus yang sedang mengalami perbaikan dan regenerasi sel walaupun belum optimal karena masih tinggi 21.03% dari konsentrasi normal. Penurunan 8.14% konsentrasi lipid peroksida ini tidak lepas dari aktivitas kurkumin dan silimarin. Senyawa kurkumin yang terserap sebagian besar termetabolisme menjadi glukuronida-kurkumin, glukuronidadihidrokurkumin, dan glukuronidatetrakurkumin. Pulla dan Lokesh (1994) menyatakan bahwa kurkumin dapat menurunkan peroksidasi lipid pada mikrosom hati tikus, membran eritrosit, dan homogenat otak. Kandungan silimarin yang terdapat pada Cursil®70 merupakan ekstrak terstandardisasi dari biji Silybum marianum L. (Gaertn.).

14

Ekstrak silimarin mengandung campuran flavonolignan dan berbagai fraksi kimia yang belum diketahui dengan jelas. Silibin, komponen terbanyak pada silimarin dapat menstimulasi sintesis fosfatidilkolin dan meningkatkan aktifitas kolinfosfat sitidil transferase pada hati tikus kondisi normal dan kondisi setelah intoksikasi oleh galaktosamina. Fraksi polifenolik pada silimarin juga mampu memodifikasi profil lipoprotein plasma dan menghambat perkembangan perlemakan hati pada tikus. Silimarin dapat meningkatkan biosintesis protein hepatosit dan mempercepat regenerasi sel hati yang rusak. Silimarin juga mampu menurunkan secara nyata aktivitas γglutamil transpeptidase (GGT), alanin aminotransferase (ALT), dan aspartat aminotransferase (AST) serum pada hati yang rusak (Tedesco et al. 2004). Profil konsentrasi TBARS serum kelompok fraksi polifenol menjadi parameter penting yang menjadi tujuan utama dalam penelitian ini. Vidal et al. (2003) menyebutkan bahwa LD50 pada ekstrak hidroalkoholik fenolik buah delima yang dicobakan pada mencit berkisar antara 565-945 mg/KgBB dengan nilai tengah 731 mg/KgBB. Jadi, nilai dosis terapetik yang boleh dipakai adalah <511.7 mg/KgBB pada tikus (Lampiran 12). Dosis yang digunakan per BB tikus adalah 13.3 mg/kg (FD13.3), 100 mg/kg (FD100), 250 mg/kg (FD250), dan 500 mg/kg (FD500). Tikus kelompok fraksi diinduksi fraksi polifenol pada hari ke-18 hingga ke-34. Setelah pemberian fraksi, konsentrasi TBARS kelompok FD13.3, FD100, FD250, dan FD500 berturut-turut menurun sebesar 10.45%, 18.18%, 33.23%, dan 41.84%. Namun berdasarkan uji statistik, penurunan TBARS pada kelompok FD13.3 tidak berbeda nyata (p=0.5482) yang sebanding dengan penurunan yang ditunjukan oleh KP. Konsentrasi TBARS akhir pada FD13.3 adalah 0.54±0.022 nmol/mL. Hanya KP dan FD13.3 yang dikelompokan dalam satu kelompok yang sama pada uji lanjut Duncan. Hal ini menunjukkan bahwa dosis FD13.3 memberikan respon yang sama dengan KP (Cursil®70) yang menggambarkan belum adanya perbaikan kerusakan membran sel hepatosit secara nyata. Hasil pengamatan juga menunjukan penurunan konsentrasi TBARS semakin besar seiring dengan peningkatan dosis. Uji statistik menunjukkan bahwa kelompok FD100, FD250, dan FD500 mampu menurunkan konsentrasi TBARS secara nyata (p<0.05). Respon penurunan TBARS terbaik ditunjukkan oleh dosis FD500 (500 mg/KgBB) (p<0.0001)

sebesar 41.84% dari 0.946±0.118 nmol/mL menjadi 0.55±0.457 nmol/mL. Konsentrasi akhir ini lebih rendah 23.4% dari konsentrasi TBARS kelompok normal. Aktivitas ini diduga disebabkan oleh kemampuan polifenol buah delima dalam menangkal radikal bebas (parasetamol) dalam dosis yang sama (500 mg/KgBB) dan kemampuannya untuk menginduksi regenerasi sel hepatosit (Nzaramba 2008). Jika fraksi polifenol dosis 500 mg/KgBB ini dikonsumsi oleh manusia (70 Kg), maka setiap harinya kira-kira manusia harus mengonsumsi 3.5 g fraksi polifenol buah delima atau 9.67 g simplisia buah delima. Dikarenakan 100 g simplisia pada penelitian ini diperoleh dari 5 buah delima, maka konsumsi setengah buah delima tiap hari untuk masyarakat diduga sebanding dengan dosis 500 mg/KgBB dalam menurunkan peroksidasi lipid hati. Kemampuan fraksi polifenol buah delima dalam menurunkan konsentrasi lipid peroksida menunjukkan bahwa komponen-komponen polifenol buah delima berperan sebagai hepatoprotektor. Beberapa komponen fenolik buah delima seperti isomer punikalagin, turunan asam elagik, dan antosianin (delfinidin, sianidin, serta 3-glukosida dan 3,5-diglukosida pelargonidin) mampu menangkal radikal bebas dan menginhibisi peroksidasi lipid secara in vitro (Gil et al. 2000; Noda et al. 2002). Komponen polifenol terbanyak yang secara signifikan berkontribusi dalam aktivitas antioksidasi adalah α- dan β- punikalagin. Beberapa komponen lain adalah elagitanin, asam elagik, antosianin, dan flavonoid. Reed et al. (2005) menambahkkan bahwa ester asam galik seperti punikalin dan punikalagin member aktivitas antioksidan tertinggi pada polifenol buah delima. Li Y et al. (2006) juga melaporkan bahwa ekstrak buah delima dan ekstrak kulit buah delima mengandung total fenolik, flavonoid, proantosianidin, dan asam askorbat yang teramati sebagai penangkap dan pencegah superoksida anion (O2•-), hidroksil radikal (•OH), dan peroksil radikal. Superoksida anion (O2•-) merupakan spesies radikal bebas yang digenerasikan secara berkala oleh beberapa proses seluler, meliputi sistem transport elektron pada membran dalam mitokondria dan mikrosom. Laju generasi O2•ini diperparah oleh aktivitas NAPKI dan konjugat GSH-acetaminophen yang dapat meningkatkan pembentukan berbagai ROS yang dapat menimbulkan peroksidasi lipid. Dosis FD250 (250 mg/KgBB) juga memberikan respon yang baik (p=0.0002) dengan penurunan konsentrasi lipid peroksida

15

(TBARS) sebesar 33.23% dari 0.999±0.075 nmol/mL menjadi 0.667±0.03 nmol/mL. Penurunan ini dianggap sangat berbeda nyata (p<0.01). Respon lain juga ditunjukkan oleh dosis FD100 (100 mg/KgBB), tetapi tidak lebih baik dari dosis FD250 dan FD500. Dosis FD100 dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida secara nyata (p=0.0250 atau 0.01
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Induksi parasetamol meningkatkan konsentrasi lipid peroksida serum sebesar 35.12%. Fraksi polifenol buah delima dosis 13.3 mg/KgBB memiliki respon yang sama dengan Cursil®70 dalam menurunkan peroksidasi lipid sebesar 10.45% dan 8.14% (p>0.05). Fraksi dosis 100 mg/KgBB, dosis 250 mg/KgBB, dan 500 mg/KgBB mampu menurunkan konsentrasi lipid peroksida serum berturut-turut 10.45%, 18.18%, dan 33.23% (p<0.05) pada tikus yang diinduksi parasetamol. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk menguji parameter hepatoproteksi lain, seperti aktivitas enzim ALT, AST, ALP, GGT, SOD, katalase, GPx, GSH, dan bilirubin. Ulangan perlakuan perlu diperbanyak untuk memperkecil nilai keragaman. Dosis parasetamol perlu ditingkatkan agar memberi perbedaan yang nyata terhadap kelompok

normal. Lama perlakuan induksi fraksi juga perlu diperpanjang untuk mengetahui waktu optimal dalam memberikan efek hepatoproteksi. Desain percobaan untuk mengetahui potensi pencegahan dan uji aktivitas fraksi polifenol secara in vitro perlu dilakukan sebagai bahan perbandingan.

DAFTAR PUSTAKA Ace

Animal. 2006. Sprague Dawley. [terhubung berkala]. http://www. aceanimal.com/SpragueDawley.htm. [02 Mei 2010].

Adji P. 2004. Daya antioksidasi saponin akar kuning (archangelisia flava L. Merr.) sebagai mekanisme hepatoproteksi pada tikus yang diinduksi parasetamol [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Afaq F, Saleem M, Krueger CG, Reed JD, Mukhtar H. 2005. Anthocyanin and taninrich pomegranate fruit extract modulates MAPK and NfkappaB pathways and inhibits skin tumorigenesis in CD-1 mice. Int J Cancer 113: 423-433. Al-Maiman SA, Ahmad D. 2002. Changes in physical and chemical properties during pomegranate (Punica granatum L.) fruit maturation. Food Chem 76: 437-441. Anila L, Vijayalakshmi NR. 2003. Antioxidant action of flavonoids from Mangifera indica and Emblica officinalis in hypercholesterolemic rats. Food Chem 83: 569-574. Andersen M, Markham KR. 2006. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications. Boca Raton: CRC Pr. Anderson SC, Cockayne S. 2003. Clinical Chemistry Concepts and Aplication Revised Edition. New Castle: Saunders. Ariadini SW. 2007. Aktivitas superoksida dismutase dan patologi anatomi pada hati tikus dengan perlakuan parasetamol dan suplemen kelapa kopyor [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

16

[AOAC Association Official Analytical Chemists]. 1995. Official Methods of Analysis. Ed ke-16. Washington DC: Association Official Analytical Chemists. Aryadi Q. 2009. Potensi ekstrak air rosella sebagai hepatoprotektor pada tikus yang diinduksi parasetamol [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Aviram et al. 2000. Pomegranate juice consumption reduces oxidative stress, atherogenic modifications to LDL, and platelet aggregation: studies in human and in atherosclerotic apolipoprotein Edeficient mice. Am J Clin Nutr 71: 10641076. Aviram M, Domfeld L. 2001. Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure. Atherosclerosis 158: 195-198. Balamurugan M, Parthasarathi K, Ranganathan LS, Cooper EL. 2008. Hypothetical mode of action of earthworm extract with hepatoprotective and antioxidant properties. J Zhejiang Univ Sci B 9: 141147. Barnes J, Paget B. 1964. Evaluation of Drugs Activities: Pharmacometrics. New York: Mosby. Batubara I. 2003. Saponin akar kuning (Archaengelisia flava (L.) Merr.) sebagai hepatoprotektor: ekstraksi, pemisahan, dan bioaktivitasnya [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Dalimartha S. 2005. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Hepatitis. Jakarta: Penebar Swadaya.

Firmansyah M. 2006. Khasiat hepatoproteksi ekstrak daun sangitan (Sumbucus javanica Reinw.ex Blume.) pada tikus putih galur Sprague Dawley yang diberi parasetamol [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Gan S et al. 1980. Farmakologi dan Terapi. Ed ke-2. Jakarta: UI Pr. Ganong F. 2002. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Ed ke-20. Djauhari HM, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Review of Medical Physiology. Gibson GG, Sket P. 1991. Pengantar Metabolisme Obat. Aisyah BI, penerjemah. Jakarta: UI. Terjemahan dari: Drugs Metabolism. Gil MI, Tomas-Barberan FA, Hess-Pierce B, Holcroft DM, Kadeer AA. 2000. Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phhenolic composition and processing. J Agri and Food Chem 48: 4581-4589. Goli AH, Baregar M, Sahari MA. 2004. Antioxidant activity and total phenolic compounds of pistachio (Pistachia vera) hull extract. Food Chem 92: 521-525. Haidari F, Keshavarz SA, Rashidi MR, Shahi MM. 2009. Orange juice and hesperetin supplementation to hyperuricemic rats alter oxidative stres markers and xanthine oxidoreductase activity. J Clin Biochem Nutr 45: 285-291. Hall ED, Bosken JM. 2009. Measurement of oxygen radicals and lipid peroxidation in neural tissues. Neuroscience 10: 17001716.

Das et al. 2001. Studies on the hypoglycaemic activity of Punica granatum seed in streptozotocin induced diabetic rats. Phytother Res 15: 628-629.

Hastuti S. 2008. Aktivitas enzim transaminase dan gambaran histopatologi hati tikus yang diberi kelapa kopyor pascainduksi parasetamol [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

De Nigris et al. 2005. Beneficial effects of pomegranate juice on oxidation-sensitive genes and endothelial nitric oxide synthase activity at sites of perturbed shear stress. Proc Natl Acad Sci 102: 4896-4901.

Hayouni EA, Abedrabba M, Bouix M, Hamdi M. 2007. The effect of solvents and extraction method on the phenolic contents and biological activities in vitro of Tunisian Quercus coccifera L. and

17

Juniperus phoenicea L. fruit extracts. Food Chem 105: 1126-1134. Huang et al. 2005. Anti-diabetic action of Punica granatum flower extract: Activation of PPAR-gamma and identification of an active component. Toxicology Applications in Pharmacology 207: 160-169. Huang et al. 2005. Pomegranate flower extract diminishes cardiac fibrosis in Zucker diabetic fatty rats: modulation of cardiac endothelin-1 and nuclear factor-kappa B pathways. J Cardiovasc Pharmacol 46: 856-862. Jurenka J. 2008. Therapeutic application of pomegranate (Punica granatum L.): a review. Alt Medicine Review 13: 1-17. Kaplan LA, Pesce JA. 2010. Clinical Chemistry: Theory Analysis and Correlation. Ed ke-5. New York: Mosby. Kavalci C, Kavalci G, Sezenler E. 2009. Acetaminophen poisioning: case report. Int J Toxicol 6: 385-392. Khan N, Afaq F, Kweon MH, Kim K, Mukhtar H. 2007. Oral consumption of pomegranate fruit extract inhibits growth and progression of primary lung tumors in mice. Cancer Res 67: 3475-3482.

Li Y et al. 2006. Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract. Food Chem 96: 254-260. Lu EP, Gökmen V. 2002. Organic acids and phenolic compounds in pomegranates (Punica granatum L.) grown in Turkey. J Food Comp and Analysis 15: 567-575. Lu F. 2006. Toksikologi Dasar: Asas, Organ sasaran, dan Penilaian Risiko. Nugroho, penerjemah. Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk Assesment. Malik et al. 2005. Pomegranate fruit juice for chemoprevention and chemotherapy of prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA 102: 14813-14818. Mohamed MA, Marzouk MSA, Moharram FA, El-Sayed MM, Baiuomy AR. 2005 Phytochemical constituents and hepatoprotective activity of Viburnum tinus. Phytochemistry 66: 2780-2786. Muriel P, Garciapina T, Perez-Alvarez V, Murelle M. 1992. Silymarin protect against paracetamol-induced lipid peroxidation and liver damage. Drug Chem Toxicol 1: 163-171.

Khan SA. 2009. The role of pomegranate (Punica granatum L.) in colon cancer. J Pharm Sci 22: 346-348.

Murthy KNC, Jayaprakasha GK, Singh RP. 2002. Studies on antioxidant activity of pomegranate peel extract using in vivo models. J Agri and Food Chem 50: 47914795.

Kumar S, Maheshwari KK, Singh V. 2009. Protective effects of Punica granatum seeds extract against aging and scopolamine induced cognitive impairments in mice. Afr J Trad 1: 49-56.

Murugesh KS, Yeligar VC, Maiti BC, Maiti TK. 2005. Hepato protective and antioxidant role of Berberis tinctoria Lesch leaves on paracetamol induces hepatic damage in rats. IJPT 41: 64-69.

Lavenia A. 2010. Penghambatan peroksidasi lipid oleh ekstrak kulit batang mahoni (Swietenia macrophylla King) pada tikus hiperurisemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Myers RH, Milton J. 1991. A First Course In The Theory of Linear Statistical Models. Boston: PWS-KENT Pub.

Lee WM. 2003. Drug-induced hepatotoxity. Nutr Engl J Med 349: 74-85. Lenny S. 2006. Senyawa Flavonoid, Fenilflavonoid, dan Alkaloida. Medan: USU.

Nabib R. 1987. Patologi Khusus Veteriner. Ed ke-2. Bogor: Laboratorium Patologi Jurusan Parasitologi dan Patologi Fakultas Kedokteran Veteriner IPB. Nagy G, et al. 2007. Acetaminophen induces ER dependent signaling in mouse liver. Arch Biochem and Biophysics 459: 273279.

18

Negi PS, Jayapraksha GK, Jena BS. 2003. Antioxidant and antimutagenic activities or pomegranate peel extract. Food Chem 80: 393-397. Noda Y, Kaneyuki T, Mori A, Packer L. 2002. Antioxidant activities of pomegranate peel extract using in vivo models. J Agri and Food Chem 50: 166-171. Nzaramba MN. 2008. Relationships among antioxidants, phenolics, and specific gravity in potato cultivars, and evaluation of wild potato species for antioxidants, glycoalkaloids, and anti-cancer activity on human prostate and colon cancer cells in vitro [disertasi]. Texas: Texas A&M University. Pulla RA, Lokesh BR. 1992. Studies on spice principles as antioxidants in the inhibition of lipid peroxidation of rat liver microsomes. Mol Cell Biochem 111: 117124. Reed JD, Krueger CG, Vestling MM. 2005. MALDI-TOF mass spectrometry of oligomeric food polyphenols. Phytochemistry 66: 2248-2263.

punicalagin, ellagic acid, and a total pomegranate tanin extract are enhanced in combination with other polyphenols is found in pomegranate juice. J Nutr Biochem 16: 360-367. Singh RP, Murthy KNC, Jayaprakasha GK. 2002. Studies on yen entioxidant activity of pomegranate peel and seed extract using in vitro models. J Agri and Food Chem 50: 81-86. Stockham SL, Scott MA. 2008. Fundamentals of Clinical Veterinary Pathology. Iowa: Iowa State University Pr. Tedesco D et al. 2004. Effects of silymarin, a natural hepatoprotector, in periparturient dairy cows. J Dairy Sci 87: 2239-2247. Tiwari KB, Khosa RL. 2010. Hepatoprotective and antioxidant effect of Sphaeranthus indicus against acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. J Trop Med 6: 1-11. Vidal A et al. 2003. Studies on the toxicity of Punica granatum L. (Punicaceae) whole fruit extract. J Ethnopharm 89: 295-300.

Reszka KJ et al. 2004. Acetaminophen stimulates the peroxidative metabolism of anthracyclines. Arch Biochemistry and Biophysics 427: 16-29.

Windyagiri A. 2006. Potensi hepatoprotektor air rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) pada tikus hiperglikemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Rustandi MI. 2006. Potensi antioksidasi ekstrak daun sangitan (Sambucus javanica Reinw. ex Blume) sebagai hepatoprotektor pada tikus [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Wiryowidagdo S. 2008. Delima (Punica granatum L.): Obat Tradisional Indonesia yang Merupakan Sumber Antioksidan. Jakarta: UI Pr.

Seeram et al. 2005. In vitro appropriate, apoptotic and antioxidant activities of

Yagi K. 1994. Free Radical in Diagnostic Medicine. Armstrong D, editor. New York: Plenum Pr.

19

LAMPIRAN

20

Lampiran 1 Gambaran umum penelitian Buah delima (pulp)

Analisis kadar air

Preparasi sampel

Serbuk/simplisia (simplisia)

Analisis kadar air

Ekstraksi polifenol Fraksi polifenol

Perlakuan ke hewan coba

Pengukuran lipid peroksida

Analisis data Lampiran 2 Prosedur ekstraksi polifenol (Hayouni et al. 2007) Buah delima (pulp) Oven 50°C selama 5 hari Sampel kering dihaluskan Serbuk/simplisia ekstraksi dengan aseton:air:asam asetat (90:9.5:0.5) Residu dipisahkan dari filtratnya Rotavapor filtrat Fraksi polifenol

21

Lampiran 3 Rancangan perlakuan hewan coba Tujuh kelompok tikus I Normal

II

III

Kontrol negatif

Kontrol positif

19 hari

Hari ke-0

Hari ke-0 s/d 17

Hari ke-17

IV Perlakuan FD13.3

V Perlakuan FD100

VI Perlakuan FD250

VII Perlakuan FD500

Adaptasi

Pengukuran lipid peroksida darah

Kelompok I: Pakan standar + cekok akuades Kelompok II-VII: Pakan standar + cekok parasetamol dosis 500 mg/KgBB

Pengukuran lipid peroksida darah

Kelompok I: Pakan standar + cekok akuades Kelompok II: Pakan standar + cekok parasetamol 500 mg/KgBB Kelompok III: Pakan standar + parasetamol 500 mg/KgBB + Hari ke-18 s/d 34 cekok Cursil 13.3 mg/KgBB Kelompok IV-VII: Pakan standar + parasetamol 500 mg/KgBB + cekok fraksi polifenol masing-masing dosis (13.3 mg/KgBB, 100 mg/KgBB, 250 mg/Kg BB, dan 500 mg/KgBB)

Hari ke-34

Pengukuran lipid peroksida darah

22

Lampiran 4 Pengukuran konsentrasi lipid peroksida (Metode Yagi 1994) Pembuatan kurva standar TMP 6 M pengenceran

Tabung 1 (0.9 µM)

Tabung 2 (1.8 µM)

Tabung 3 (2.7 µM)

Tabung 4 (3.6 µM)

Tabung 5 (4.5 µM)

Tabung 6 (6.0 µM)

Tiap larutan dipipet 4 mL + 1 mL TBA 1% 6 tabung reaksi + TBA 1% Inkubasi T=95⁰C, t=60 menit dinginkan 6 tabung reaksi dingin + 1 mL air destilata dan 5 mL butanol:piridin (15:1), vortex, sentrifugasi 3000 rpm, t=15 menit, didinginkan 6 Supernatan dari 6 tabung diukur pada λ=532 nm Pengukuran konsentrasi lipid peroksida sampel 0.3 mL serum + 1.2 mL asam sulfat 0.041 M, t=10 menit + 0.15 mL asam fosfotungstat 10%, t=5 menit, T=27⁰C, sentrifugasi 3000 rpm, t=20 menit pelet + 1.2 mL asam sulfat 0.041 M, t=10 menit + 0.15 mL asam fosfotungstat 10%, t=5 menit, T=27⁰C, sentrifugasi 3000 rpm, t=20 menit pelet Perlakuan sama dengan standar (1/2 resep), tetapi + HCl sampai pH 1.6-1.7 sebelum penambahan butanol:piridin

23

Lampiran 5 Bobot badan (BB) tikus tahap adaptasi BB (gram) hari keKelompok

N -18

-17

-16

-15

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

163

165

165

169

172

177

182

189

187

193

196

198

200

205

192

190

201

208

209

2

163

169

169

176

183

181

183

189

182

191

200

199

205

204

208

204

203

208

200

3

137

139

140

148

156

162

169

178

177

186

195

192

192

212

214

210

213

219

220

4

159

165

167

175

176

176

183

190

191

191

200

200

205

182

192

181

197

199

206

155.5

159.5

160.25

167

171.75

174

179.25

186.5

200.5

200.75

201.5

196.25

203.5

208.5

208.75

6.1373 12.997

11.24

13.175 6.8069 8.1854 8.3815

Normal

Rataan SD

Kontrol Positif (KP)

12.477 13.796 13.598 13.038 11.4419 8.2865 6.8496 5.6862 6.0759 2.9861 151

154

157

164

165

167

170

180

177

181

186

183

190

193

193

190

194

195

199

150

158

165

171

173

179

183

190

192

194

206

206

214

201

222

221

226

225

230

3

157

163

169

183

188

187

191

198

194

197

208

209

219

221

218

221

225

231

234

205

211

210.67

215

217

221

152.67 158.33 163.67 172.67 175.333 177.67 181.33 189.33 187.67 190.67 3.7859 4.5092 6.1101

9.609 11.6762 10.066 10.599 9.0185 9.2916 8.5049 12.166 14.224 15.503 14.422 15.716 17.898 18.193 19.287 19.157

181

185

193

192

194

201

208

207

207

219

206

226

203

235

222

239

239

235

2

144

138

141

152

154

155

160

168

169

176

184

186

199

200

204

206

215

221

225

3

163

167

172

182

184

188

195

202

203

215

214

217

221

227

226

230

228

235

240

161.67

162

166

203

215.33

210

175.67 176.667

179

185.33 192.67

17.039 21.932 22.605 21.221 20.0333

21

22.143 21.572 20.881 20.599

18.93

221.67 219.33 227.33 231.67 233.33

15.716 14.364 14.799 15.948

12.22

12.014 9.4516 7.6376

163

164

164

167

169

179

180

177

180

187

188

193

195

198

180

195

199

201

2

183

183

188

197

199

198

205

209

210

209

224

224

228

235

216

228

239

244

247

3

159

162

168

175

177

180

185

192

191

193

203

201

210

215

216

211

221

224

228

215

210

166.33 169.33 173.33 178.67

181

182.33 189.67 193.67 192.67

14.468 11.846 12.858 16.803 16.3707 14.64

194

204.67 204.33 210.33

13.614 14.572 16.563 14.526 18.556

18.23

17.502

20

206.33 218.33 222.33 225.33

10.392 24.338 22.121 22.546 23.116

1

151

145

163

163

170

173

166

185

183

185

193

194

199

202

207

205

208

212

217

2

183

184

185

192

194

196

198

208

202

207

218

216

225

233

236

231

233

241

241

165

170

174

184

183

190

195

197

197

199

206

210

219

219

221

225

229

226

236

194

197

3 rataan

166.33 166.33

174

179.67 182.333 186.33 186.33 196.67

SD

16.042 19.757

11

14.978 12.0139 11.93

205.67 206.67 214.33

218

221.33 220.33 223.33 226.33 231.33

17.673 11.504 9.8489 11.136 12.503 11.372 13.614 15.524 14.503 13.614 13.429 14.503 12.662

1

157

150

165

169

173

175

179

187

186

190

196

197

205

210

198

196

216

223

227

2

164

175

180

187

192

192

197

191

203

207

217

214

218

227

230

219

231

237

235

3

140

142

158

172

177

180

185

192

179

193

206

199

214

218

225

221

224

232

235

187

190

rataan

153.67 155.67 167.67

SD

SD

199.33 205.67

157

SD

rataan

193

1

rataan

FD500

199.33 207.67

178

SD

FD250

200

1

rataan

FD100

3.594

2

SD

FD13.3

2.63

1

rataan

Kontrol Negatif (KN)

184.25 190.25 197.75 197.25

12.342 17.214

11.24

176

180.667 182.33

189.33 196.67 206.33 203.33 212.33 218.33 217.67

212

223.67 230.67 232.33

9.6437 10.0167 8.7369 9.1652 2.6458 12.342 9.0738 10.504 9.2916 6.6583 8.5049 17.214 13.892 7.5056 7.0946 4.6188

1

174

180

188

195

193

198

202

205

208

206

216

215

218

226

228

212

226

230

231

2

165

171

178

172

181

184

189

194

196

199

213

209

216

221

224

214

227

231

221

3

192

193

195

201

205

204

200

213

213

221

227

224

238

238

233

241

247

249

255

177

181.33

187

189.33

193

195.33

197

204

216

224

8.544

15.308

12

10.263

7

13.748 11.06

205.67 208.67 218.67

9.5394 8.7369

11.24

228.33 228.33 222.33 233.33 236.67 235.67

7.3711 7.5498 12.166 8.7369 4.5092 16.197 11.846 10.693 17.474

24

Lampiran 6 Bobot badan (BB) tikus hari ke-0 hingga ke-17 BB (gram) hari keKelompok

n 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

1

209

207

203

214

218

219

226

239

225

235

233

233

248

249

247

244

252

256

2

200

201

199

205

214

214

214

220

215

222

224

225

200

237

232

233

238

242

3

220

222

213

225

230

233

238

238

243

245

245

253

254

262

260

259

266

273

4

206

208

210

215

217

214

223

227

219

226

230

231

235

239

242

243

244

250

208.75

209.5

220

225.25

231

225.5

232

233

235.5

250

255.25

10.72

12.111

13.15

Normal (N)

rataan SD

Kontrol Positif (KP)

1

199

193

199

196

201

198

201

202

195

203

203

205

197

212

215

208

209

209

2

230

230

231

233

238

238

235

239

231

237

241

243

230

249

250

247

253

258

3

234

236

241

242

244

246

251

251

246

251

240

259

252

266

274

270

276

280

229

230.67

224

230.33

228

246

249

221

SD

231

233

233

244

242

243

255

252

257

250

270

272

271

274

272

2

225

224

233

214

233

237

241

247

236

240

241

249

249

255

256

254

259

249

3

240

239

239

239

244

242

246

249

248

253

255

258

250

265

266

266

267

273

235

228

233.33 231.67

236.67 237.33 243.67

246

242.33 249.33 249.33 254.67 249.67 263.33 264.67 263.67 266.67 264.67

7.6376 7.5056 3.4641 12.767 6.3509 4.5092 2.5166 3.6056 6.0277 8.1445 7.3711 4.9329 0.5774 7.6376 8.0829 8.7369 7.5056 13.577 1

201

200

210

210

211

210

214

213

211

211

213

218

212

228

221

221

225

227

2

247

243

245

246

253

241

256

259

246

253

254

257

257

262

262

262

262

271

3

228

229

231

233

240

241

246

247

245

253

256

258

263

266

268

269

270

269

225.33

224

234

239

241

244.33

244

252

228.67 229.67 234.67 230.67 238.67 239.67

23.116 21.932 17.616

18.23

21.502 17.898 21.939 23.861 19.925 24.249 24.269 22.811 27.875 20.881

1

217

214

217

218

222

222

229

229

225

230

2

241

219

230

235

245

241

251

253

255

257

236

238

244

242

250

252

255

259

255

239

238.33

245

247

245

12.662 12.662 13.503 12.342 14.933 15.177

14

3

231.33 223.67 230.33 231.67

SD

250.33 250.67 252.33 255.67 25.58

25.929 24.007 24.846 206

270

269

257

268

269

264

261

259

260

262

269

270

273

273

275

281

248.67

258.5

265

269

267

267

268.5

241.67

252

6.364

53.463 40.286

15.875 17.321 16.197 2.1213 4.2426

0

4.2426 8.4853

264

180

1

227

228

226

227

233

217

239

239

228

243

214

230

230

237

239

239

249

245

2

235

237

246

243

248

250

252

254

249

257

256

246

249

258

254

257

267

270

3

235

236

242

237

247

250

253

256

251

260

258

262

278

272

276

276

267

282

239

248

261

265.67

rataan

232.33 233.67

SD

SD

31.342 34.044 36.346

233

rataan

rataan

29.67

232

SD

FD500

27.61

235

rataan

FD250

235.67 226.33 242.33 246.33 241.67

1

SD

FD100

219.67 223.67 223.67 227.67 227.33

19.157 23.288 21.939 24.379 23.288 25.716 25.534 25.541 26.211 24.685 21.656 27.737 27.683

rataan

FD13.3

234.25 246.75 245.25 244.75

8.3815 8.8882 6.3966 8.1803 7.0415 8.9815 9.9121 9.1287 12.369 10.231 8.8318 12.152 24.171 11.442 11.644

rataan

Kontrol Negatif (KN)

206.25 214.75 219.75

238

235.67 242.67

249.67 242.67 253.33 242.67

246

252.33 255.67 256.33 257.33

4.6188 4.9329 10.583 8.0829 8.3865 19.053 7.8102 9.2916 12.741 9.0738 24.846

16

24.173 17.616

18.61

18.502 10.392 18.877

1

231

231

231

232

232

231

233

237

229

236

237

241

235

244

244

244

250

255

2

221

231

235

235

242

246

249

253

243

252

255

257

257

264

264

263

268

279

3

255

260

264

268

270

272

275

272

273

274

272

269

260

278

280

273

282

285

245

248

254

248.33

254

262

262.67

260

266.67

273

235.67 240.67 243.33

249.67 252.33

17.474 16.743 18.009 19.975 19.698 20.744 21.197 17.521

22.48

254.67 255.67 250.67

19.079 17.502 14.048

13.65

17.088 18.037 14.731 16.042 15.875

25

Lampiran 7 Bobot badan (BB) tikus hari ke-17 hingga ke-34 BB (gram) hari keKelompok

n 17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

1

256

258

235

241

249

246

250

243

244

250

250

254

258

243

258

268

273

276

2

242

242

252

256

263

251

264

260

254

260

265

269

272

262

273

254

257

261

3

273

276

265

274

285

280

287

279

290

287

288

297

298

281

294

292

300

305

4

250

252

234

240

246

247

251

246

252

247

257

260

261

245

257

255

260

262

rataan

255.25

257

246.5

256

263

257

260

261

265

270

270.5

267.25

272.5

276

SD

13.15

Normal (N)

Kontrol Positif (KP)

14.283 14.844 15.945 17.783 16.145 17.224 16.432 20.461 18.203 16.513 19.026 18.191 17.689 17.292 17.689 19.604 210

207

210

211

212

219

214

223

222

225

226

231

224

227

229

230

240

2

258

257

252

255

260

258

263

260

266

264

264

267

267

262

273

273

278

282

3

280

275

274

281

290

292

295

291

296

296

298

302

301

298

304

305

306

310

254

259

255

268

269

249

247.33 244.33 248.67 253.67

36.346 33.561 34.152 35.921 39.879

40.15

261.67 260.67 262.33

271.33 277.33

38.158 38.743 36.692 37.112 36.529 38.039 35.005 37.005 38.743 38.158 38.436 35.233

271

273

276

287

287

294

293

296

297

303

306

289

309

312

312

310

318

2

249

258

255

256

266

265

268

266

273

274

269

279

249

266

274

276

278

285

3

273

275

276

278

276

279

282

284

285

287

284

289

294

293

294

296

303

302

264.67

268

268

270

276.33

277

281.33

281

284.67

286

297

301.67

285.33 291.33 277.33 289.33 293.33 294.67

13.577 8.8882 11.358 12.166 10.504 11.136 13.013 13.748 11.504 11.533 17.039

13.65

24.664 21.733 19.009 18.037 16.823 16.503

1

227

228

215

219

221

226

220

225

227

225

223

226

215

219

226

226

222

231

2

271

267

262

267

272

272

264

265

276

276

271

283

287

275

282

280

283

298

3

269

278

272

275

285

285

288

280

286

283

284

293

293

280

287

290

287

298

265

258

265

265.33

264

275.67

rataan

255.67 257.67 249.67 253.67 259.33

261

257.33 256.67

SD

24.846 26.274 30.436 30.288 33.828

31

34.487 28.431 31.575

263

261.33 259.33 267.33 31.66

32.13

36.143 43.405 33.867 33.867 34.429 36.428 38.682

1

206

223

235

239

242

239

248

246

248

247

251

251

222

242

250

248

234

248

2

269

268

273

277

250

251

255

249

294

293

279

293

296

289

298

296

293

302

3

281

281

268

267

273

266

276

289

256

260

253

263

265

262

271

269

272

281

261

255

252

266

266.67

261

269

261

264.33

273

271

266.33

277

rataan

252

SD

257.33 258.67

259.67 261.33

40.286 30.436 20.648 19.698 16.093 13.528 14.572 24.007 24.576 23.714

15.62

21.633 37.162 23.587 24.062 24.062 29.905 27.221

1

245

242

241

247

250

251

255

252

260

257

251

253

222

225

235

235

240

240

2

270

268

256

263

273

266

276

270

277

280

273

276

277

269

272

275

279

283

3

282

282

279

275

291

269

286

287

280

287

300

301

306

300

305

307

310

317

265.67

264

rataan SD

FD500

266.33 261.33

272

SD

FD250

265

1

rataan

FD100

20.51

209

SD

FD13.3

272.25 257.75

1

rataan

Kontrol Negatif (KN)

252.75 260.75

18.877 20.298

258.67 261.67 271.33 19.14

262

272.33 269.67 272.33 274.67 274.67 276.67 268.33 264.67 270.67 272.33 276.33

280

14.048 20.551 9.6437 15.822 17.502 10.786 15.695 24.542 24.007 42.665 37.687 35.019 36.074 35.076 38.588

1

255

247

249

249

250

251

254

252

255

252

254

253

249

242

249

250

250

253

2

279

270

269

267

272

277

281

278

281

283

286

285

293

279

288

288

290

292

3

285

283

278

281

282

260

275

272

281

281

270

283

277

267

272

274

278

276

268

262.67

270

272

270

273.67

273

16

17.926 22.271 18.877 19.604 19.218 20.526 19.604

rataan

273

SD

15.875

266.67 265.33 265.67 18.23

267.33 272.33

14.844 16.042 16.371 13.204 14.177 13.614 15.011 17.349

262.67 269.67 270.67 272.67 273.67

26 33

Lanjutan Lampiran 11 Rekapitulasi data statistik Hasil uji ANCOVA lipid peroksida pada tahap adaptasi (x) dengan tahap perusakan hati (y) Dependent Variable: Y Source

DF

Sum of Squares

Mean Square

F Value

Pr > F

Model

7

0.19596358

0.02799480

4.02

0.0129

Error

14

0.09746629

0.00696188

Corrected Total

21

0.29342986

Parameter

Estimate

Standard Error

t Value

Pr > |t|

Intercept

0.7006184925

B

0.07020931

9.98

<.0001

PERL FD13.3

0.2549087841

B

0.06483644

3.93

0.0015

PERL FD100

0.2052665778

B

0.06482877

3.17

0.0069

PERL FD250

0.2555759423

B

0.06582532

3.88

0.0017

PERL FD500

0.2029337359

B

0.06581489

3.08

0.0081

PERL KN

0.2429860213

B

0.06655585

3.65

0.0026

PERL KP

0.2002431004

B

0.06710799

2.98

0.0099

PERL N

0.0000000000

B

.

.

.

X

0.0733809690

0.12507233

0.59

0.5667

Duncan's Multiple Range Test for Y Alpha Error Degrees of Freedom

Means with the same letter are not significantly different.

0.05 14

Error Mean Square

0.006962

Harmonic Mean of Cell Sizes

3.111111

Duncan Grouping

Mean

N

PERL

0.99900

3

FD250

0.99567

3

FD13.3

0.98800

3

KN

0.94633

3

KP

0.94633

3

FD500

A

0.94600

3

FD100

B

0.73375

4

N

A A A A A A A A A A

34 27

Lanjutan Lampiran 11 Rekapitulasi data statistik Hasil uji ANCOVA lipid peroksida pada tahap perusakan hati (x) dengan tahap induksi fraksi (y) Dependent Variable: Y Source

DF

Sum of Squares

Mean Square

F Value

Pr > F

Model

6

1.09848454

0.18308076

91.51

<.0001

Error

11

0.02200707

0.00200064

Corrected Total

17

1.12049161

Parameter

Estimate

Standar Error

t Value

Pr > |t|

Intercept

0.8842139238

B

0.15098194

5.86

0.0001

PERL FD13.3

0.0231264509

B

0.03733497

0.62

0.5482

PERL FD100

-.0946720256

B

0.03652074

-2.59

0.0250

PERL FD250

-.2011532934

B

0.03744731

-5.37

0.0002

PERL FD500

-.3190000000

B

0.03652071

-8.73

<.0001

PERL KN

0.4663365295

B

0.03710338

12.57

<.0001

PERL KP

0.0000000000

B

.

.

.

X

-.0160767071

0.15719309

-0.10

0.9204

Duncan's Multiple Range Test for Y

Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square

Means with the same letter are not significantly different.

0.05 11 0.002001

Duncan Grouping

Mean

N

PERL

A

1.33467

3

KN

B

0.89133

3

FD13.3

B

0.86900

3

KP

C

0.77433

3

FD100

D

0.66700

3

FD250

E

0.55000

3

FD500

B

28 35

Lanjutan Lampiran 11 Rekapitulasi data statistik ANOVA bobot badan awal adaptasi Sumber

db

Perlakuan 6

JK

KT

Fhit

1425.98 237.66 1.3256

ANOVA bobot badan hari ke-34

F(α,dbp,dbg)

Sumber

2.790465

db

Perlakuan 6

JK

KT

1697.33 282.8883 0.339176

Galat

15 2689.34 179.29

Galat

15 12510.67 834.0447

Total

21 4115.32

Total

21

ANOVA bobot badan hari ke-0 Sumber Perlakuan

db JK

KT

Fhit

6 177859.7 29643.28 4.7365

F(α,dbp,dbg) 2.790465

db

Perlakuan 6

JK

KT

15 0.512986 0.034199

Total

21 271737.1

Total

21 0.445045

ANOVA bobot badan hari ke-17 KT

Fhit

Galat

15 9226.75 615.1167

Total

21 10580.59

F(α,dbp,dbg) 2.790465

ANOVA TBARS serum hari ke-18

F(α,dbp,dbg)

Perlakuan 6 1353.841 225.6402 0.366825 2.790465

Fhit

0.067491 0.011249 0.328912

Galat

JK

2.790465

ANOVA TBARS serum hari ke-0 Sumber

15 93877.43 6258.495

db

F(α,dbp,dbg)

14208

Galat

Sumber

Fhit

Sumber Perlakuan

db JK

KT

F(α,dbp,dbg)

Fhit

6 2.405363 0.400894 2.158048

Galat

15 2.786503 0.185767

Total

21 5.191866

2.790465

Lampiran 12 Perhitungan dosis terapetik buah delima pada tikus 20 g 200 g Mencit Tikus 20 g Mencit 1.0 7.0 200 g Tikus 0.14 1.0 400 g Babi 0.08 0.57 1.5 kg Kelinci 0.04 0.25 2.0 kg Kucing 0.03 0.23 4.0 kg Monyet 0.016 0.11 12.0 kg Anjing 0.008 0.06 70.0 kg Manusia 0.0026 0.018 Sumber: Barnes & Paget (1964)

400 g Babi 12.25 1.74 1.0 0.44 0.41 0.19 0.1 0.031

1.5 kg Kelinci 27.8 3.9 2.25 1.0 0.92 0.42 0.22 0.07

2.0 kg Kucing 29.7 4.2 2.4 1.08 1.0 0.45 0.24 0.076

4.0 kg Monyet 64.1 9.2 5.2 2.4 2.2 1.0 0.52 0.16

12.0 kg Anjing 124.2 17.8 10.2 4.5 4.1 1.9 1.0 0.32

70.0 kg Manusia 387.9 56.0 31.5 14.2 13.0 6.1 3.1 1.0

Contoh perhitungan: LD50 = 731 mg/KgBB untuk mencit (Vidal et al. 2003) Faktor konversi LD50 dari mencit ke tikus = 7 Dosis terapetik = 10% (LD50 x Faktor konversi) = 10% (731 mg/KgBB x 7) = 511.7 mg/KgBB Jadi, dosis maksimum yang boleh dipakai pada tikus adalah 511.7 mg/KgBB