AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN BIOAUTOGRAFI EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH KAKAO (Theobroma cacao L.) TERHADAP Streptococcus mutans DAN Escherichia coli
NASKAH PUBLIKASI
Oleh:
MUHAMMAD RIO BURHANUDIN K 100 090 106
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2013
PENGESAHAN NASKAH PUBLIKASI
AKTIWAS AIITIBAKTERI DAN BIOAUTOGRAFI EKSTRAK ETANTOL KIILIT BUAH KAKAO (Theobroms cacao L.) TERIIADAP Streptococcus mulans DAi\t Escherichia coli
w#xrRro
Brrrt
fl ,1;" K ro&Silosr06Yi il
;$"u'
h",riui.Orn
'' ",
lf-:"*
,i;
Oisahkan
2 lQmin ._q :,n22 ;ilqA ^eoi; i:"\,hq:tlff"dd:,$I4
'"'-$[ffi&-""ic ffiSi*iiE" li'e'*;:-qt*-,
IkaTrisharyuo-,r Pembimbing Utama
r*
M.Farm., Apt
Pem bim bing.Pendamping
Apt
Rima Munawaroh, M.Sc., ApL
Mahasiswa
Muhammad Rio Burhanudin
AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN BIOAUTOGRAFI EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH KAKAO (Theobroma cacao L.) TERHADAP Streptococcus mutans DAN Escherichia coli ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND BIOAUTOGRAPHY OF ETHANOL EXTRACT OF KAKAO HUSK BEAN (Theobroma cacao L.) AGAINTS Streptococcus mutans AND Escherichia coli Muhammad Rio Burhanudin, Peni Indrayudha dan Rima Munawaroh Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl.Ahmad Yani Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta 57102 Email :
[email protected] ABSTRAK Salah satu tanaman tropis yang banyak mengandung polifenol adalah kakao (Theobroma cacao L.). Kulit buah kakao belum banyak dimanfaatkan. Polifenol diketahui memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol kulit buah kakao terhadap Streptococcus mutans dan Escherichia coli. Ekstraksi menggunakan maserasi dengan pelarut etanol 96%. Metode disk difusi (Kirby Bauer) digunakan dalam uji aktivitas antibakteri. Seri konsentrasi yang digunakan dalam pengujian terhadap bakteri Streptococcus mutans adalah 0,5 mg/disk, 1 mg/disk, 1,5 mg/disk, 2 mg/disk, dan 2,5 mg/disk. Pada bakteri Escherichia coli digunakan seri konsentrasi 1 mg/disk, 2 mg/disk, 3 mg/disk, 4 mg/disk dan 5 mg/disk. Bioautografi digunakan untuk mengetahui golongan senyawa yang aktif sebagai antibakteri dengan terlebih dahulu dilakukan KLT dengan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak n-heksan : etil asetat : metanol (12:7:1) v/v/v. Ekstrak memiliki aktivitas terhadap bakteri Streptococcus mutans dengan diameter zona hambat 9±0,0 mm pada konsentrasi 2,5 mg/disk. Hasil KLT menunjukkan ekstrak mengandung fenolik, terpenoid, kumarin dan flavonol. Bioautografi kontak yang dilakukan menunjukkan bahwa senyawa yang beraktivitas sebagai antibakteri adalah fenolik. Kata kunci
: Theobroma cacao L, antibakteri, Streptococcus mutans, Escherichia coli, bioautografi ABSTRACT
One of tropical plant that contain polifenol excessively is cacao (Theobroma cacao L.).The husk has not been widely used. The polifenol are known have antibacterial properties. This aims of the experiment is to know the antibacterial activity of etanol extract of kakao husk againts Streptococcus mutans and Escherichia coli. The extraction carried out with maceration procedure and etanol 96% as a solvent. Disk diffusion (Kirby Bauer) methode performed to know antibacterial activity of extract. Series of concentration agains Streptococcus mutans was 0,5 mg/disk, 1 mg/disk, 1,5 mg/disk, 2 mg/disk, dan 2,5 mg/disk. Concentration series againts 1
Escherichia coli was 1 mg/disk, 2 mg/disk, 3 mg/disk, 4 mg/disk dan 5 mg/disk. Bioautography used to determine the class of the active compound as antibacterial that beforehanded by TLC with silica gel GF 254 nm as solid phase and n-hexane : etylacetate : metanol (12:7:1)v/v/v as mobile phase. The extract have antibacterial activity againts Streptococcus mutans with diameter of inhibition zone was 9±0,0 mm at concentration 2,5 mg/disc. TLC show that the extract contain phenolic, terpenoid, coumarin and flavonol. The contact bioautography conducted showed that the extract have phenolic compound that act as antibactery. Keyword
: Theobroma cacao L, antibactery, Streptococcus mutans, Escherichia coli, bioautography
PENDAHULUAN WHO menyatakan bahwa penyakit infeksi mulut merupakan masalah yang penting dalam dunia kesehatan. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut guna meningkatkan kualitas kesehatan masyarakat di seluruh dunia terutama di bidang kesehatan mulut (Petersen, 2005). Salah satu bakteri penyebab penyakit mulut adalah Streptococcus mutans (Pieralisi et al, 2009; Srikanth et al., 2008). Streptococcus mutans merupakan bakteri Gram positif yang umum ditemukan di mulut. Pada pasien dengan penyakit periodontitis kronis, terjadi peningkatan yang signifikan terhadap jumlah bakteri tersebut daripada keadaan normal tanpa penyakit periodontitis (Contardo, 2011). Dunia juga memberi perhatian terhadap Escherichia coli, karena bakteri ini sering menimbulkan beberapa penyakit serius. Beberapa penyakit yang sering ditimbulkannya adalah urinary tract infections, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia, diare, dan hemorrhagic colitis (ISDH, 2008; Panganiban, 2012; Radji, 2005). Penelitian dilakukan untuk mengeksplorasi senyawa alternatif dari tanaman yang memiliki aktivitas antibakteri. Salah satu tanaman yang digunakan sebagai objek penelitian adalah kakao. Kakao merupakan tanaman tropis yang banyak dibudidayakan untuk kepentingan komersial. Tanaman ini berasal dari Amerika Selatan dan Amerika Tengah. Suku Maya, Aztec dan Indian telah terlebih dahulu mengenal, membudidayakan dan menggunakan tanaman ini untuk digunakan sebagai alat barter, campuran dalam makanan, minuman maupun dalam pengobatan (Wahyudi et al., 2008). Saat ini kakao banyak digunakan dalam produk makanan, minuman, kosmetik dan farmasi (PPKKI, 2004). Bagian yang umum digunakan dalam pembuatan produk tersebut adalah biji buahnya, sedangkan kulit buah banyak digunakan sebagai pakan ternak.
2
Kulit kakao memiliki kandungan polifenol yang tinggi (Arlorio et al., 2008; Han et al., 2010). Kandungan polifenol tersebut antara lain adalah asam sinamat, tanin, pirogalol, kuersetin, resorsinol dan epikatekin-3-galat (Fapohunda dan Afolayan, 2012). Senyawa mayor yang terdapat dalam kulit kakao adalah (-)-epikatekin dan asam phidroksibenzoat (Arlorio et al., 2008). Komponen fenolik diketahui memiliki aktivitas sebagai antioksidan, antiradikal, antikarsinogenik (Wollgast & Anklam, 2000 cit Arlorio et al., 2008) dan aktivitas sebagai antimikroba ditunjukkan oleh penelitian Osawa et al. (1990). Sel yang menghasilkan polifenol dalam kakao banyak terdapat pada jaringan kotiledon dan jaringan parenkim buah kakao (Elswer et al., 2010). Ekstrak kulit kakao memiliki kemampuan untuk membersihkan plak yang disebabkan oleh bakteri (Srikanth et al., 2008). Plak yang terakumulasi di mulut dapat menyebabkan terjadinya karies gigi pada anak-anak, periodontitis atau penyakit mulut yang lain (Hirao, 2010). Senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri pada tanaman tersebut adalah prosianidin (Gazzani et al., 2011), katekin dan turunannya (Friedman et al, 2006; Si et al., 2006), serta kuersetin (Cushnie dan Lamb, 2005). Sartini et al. (2007), menunjukkan ekstraksi kulit buah kakao dengan aseton : air (7:3) dan etanol 70%. Hasil menunjukkan bahwa kedua ekstrak tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan menggunakan metode difusi agar. Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian tersebut adalah Escherichia coli, Salmonella Thyposa, Staphylococcus aureus, dan Streptococcus mutan (Sartini et al., 2007). Golongan polifenol yang bersifat polar dapat diekstraksi dengan pelarut alkohol seperti etanol (Andersen dan Markham, 2006). Maka, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang aktivitas antimikroba ekstrak etanol 96% kulit buah kakao terhadap bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli. Pelarut etanol 96% selain menyari senyawa polar, juga menyari senyawa semi polar, bahkan dapat menyari senyawa yang nonpolar (Andersen dan Markham, 2006; Tiwari et al., 2011). METODE PENELITIAN Alat
: Bejana maserasi, pengaduk kayu, penangas air, cawan porselen, vacum rotary
evaporator (Heidolph EH-B®), neraca analitik (Precisa®), object glass, deck glass, penjepit, ose, mikroskop (Olympus®), pipet tetes, autoklaf, oven (MEMERT®), inkubator (MEMERT®), batang pengaduk, cawan petri, mikropipet, blue tips, yellow
3
tips, spreader glass, LAF (Astari Niagara International®), api bunsen, bejana kromatografi, pipa kapiler, pinset. Bahan : Bakteri Escherichia coli dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta, bakteri Streptococcus mutans dari Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, cat gram A, cat gram B, cat gram C dan cat gram D, aquadest dan formalin 1%, kulit buah kakao (dari daerah Kartasura, Kab. Sukoharjo) kering, etanol 96% teknis, blank paper disc (Oxoid®), disk kloramfenikol (Oxoid®), pelarut Dimetyl Sulfoxide (Merck®), suspensi bakteri, Nutrien agar (Oxoid®), media Mueller Hinton (MH) (Oxoid®), media Brain Heart Infusion (BHI) (Oxoid®), NaCl (Merck®), alkohol 70%, akuades steril, silika gel GF254, nheksan : etil asetat : metanol (12 : 7 : 1) v/v/v dengan grade pro analysis, reagen semprot sitroborat, FeCl3, Dragendorf dan Liebermann Burchard (LB). Cara Penelitian Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Penyiapan Bahan Kulit buah didiamkan dahulu selama 5 hari . Buah utuh diambil kulitnya dan dicuci bersih dengan air mengalir, dikeringkan kemudian bahan ditumbuk kasar. Pembuatan ekstrak Seribu g serbuk kasar kulit buah kakao ditempatkan dalam bejana maserasi dan ditambahkan etanol 96% sebanyak 7,5 liter sampai simplisia terendam semua. Maserasi dilakukan selama 3 hari sambil sesekali diaduk. Setelah 3 hari, dilakukan penyaringan maserat dengan dengan kain flannel bersih sehingga didapatkan filtrat etanol. Remaserasi dilakukan dengan perlakuan yang sama pada ampas yang telah disaring. Filtrat etanol yang didapat, dikumpulkan dan kemudian dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator dan penangas air dan akan diperoleh ekstrak kental kulit buah kakao. Penyiapan inokulum bakteri Bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli diambil dari stok bakteri dengan menggunakan ose steril sebanyak satu massa ose dari stok suspensi bakteri. Ose digoreskan pada media MH dengan metode streak plate, setelah itu diinkubasi pada 37o C selama 18-24 jam.
4
Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan mengambil satu ujung ose biakan (3-5 koloni bakteri), kemudian disuspensikan dalam media Brain Heart Infusion steril sebanyak 5 mL dan diinkubasi selama 2-6 jam pada 35o C. Hasilnya diambil dengan mikropipet sebanyak 200 µL dan disamakan kekeruhannya dengan standard Mc Farland 1,5 X 108 CFU/mL dengan penambahan normal salin atau NaCl 0,9%. Konsentrasi bakteri ini yang akan digunakan dalam pengujian. Pembuatan larutan uji Pembuatan larutan stok Larutan stok dibuat dengan melarutkan 5000 mg ekstrak ke dalam 10 mL DMSO 100%, sehingga diperoleh konsentrasi 50%. Pembuatan seri konsentrasi Konsentrasi 50% larutan stok ekstrak dibuat seri konsentrasi 5%; 10%; 15%; 20% dan 25% untuk uji bakteri Streptococcus mutans. Larutan stok tersebut diambil 100 µL, 200 µL, 300 µL, 400 µL , 500 µL dan diencerkan sampai 0,5 mL dengan DMSO 30%. Untuk bakteri uji Escherichia coli digunakan seri konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40% dan 50% yang diencerkan dengan DMSO 100%. Masing-masing seri konsentrasi diambil sebanyak 10 µL kemudian diteteskan pada paper disc dan dibiarkan mengering. Uji aktivitas antibakteri Sebanyak 20 mL media MH cair yang telah steril diukur dalam gelas ukur steril dan dituang ke dalam cawan petri steril, kemudian dibiarkan memadat dan diinokulasi bakteri dengan konsentrasi 1,5 X 108 CFU/mL sebanyak 200 µL. Paper disc yang telah diberi seri konsentrasi ekstrak kulit kering kakao diletakkan di atas media yang telah diinokulasi dengan bakteri. Kemudian diinkubasi pada 37o C selama 24 jam. Dihitung diameter zona hambat tiap seri konsentrasi ekstrak dan dibandingkan terhadap kontrol. Kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol (30 µg/disk). Sedangkan kontrol negatif adalah larutan DMSO 100% untuk bakteri Escherichia coli dan DMSO 30% untuk bakteri Streptococcus mutans. Uji kandungan senyawa dengan kromatografi lapis tipis Penyiapan uji KLT Larutan uji dibuat dalam konsentrasi 25% v/v dengan menimbang ekstrak kulit kering kakao sebanyak 250 mg dalam 1 mL pelarut etanol : air ( 1 : 1) v/v.
5
Pemilihan dan optimasi fase gerak Fase gerak yang digunakan untuk melakukan elusi adalah n-heksan : etil asetat : metanol (12 : 7 : 1) v/v/v. Elusi Sebelum melakukan elusi, bejana kromatografi dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak yang akan dipakai dalam elusi. Plat silika GF254 diaktifkan dengan di oven pada suhu 110o C selama 1 jam. Kemudian sampel yang berupa ekstrak etanol kulit kakao ditotolkan sebanyak 5 µL pada lempeng plat KLT dan dibiarkan mengering. Setelah kering dimasukkan plat pada bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase gerak. Mulut bejan diolesi dengan vaselin sebelum ditutup. Setelah elusi selesai, plat diambil dan dikeringkan sampai fase gerak yang ada pada plat menguap dan mengering. Bioautografi Plat KLT yang telah selesai dilakukan elusi ditempelkan pada media MH yang telah diinokulasi dengan bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli, masingmasing sebanyak 200 µL kemudian dibiarkan selama 20 menit. Plat diambil dan kemudian media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C. Analisis Data Uji antibakteri Uji antibakteri dengan metode difusi diamati aktivitas antibakterinya dengan mengukur diameter zona hambat yang dihasilkan ekstrak etanol kulit buah kakao. Analisis kandungan ekstrak etanol kulit buah Theobroma cacao L. Analisis kandungan ekstrak etanol kulit buah kakao menggunakan KLT. Plat yang sudah dielusi dideteksi dengan sinar tampak, UV 254 nm, UV 366 nm dan disemprot dengan pereaksi semprot, antara lain sitroborat yang dilanjutkan pengamatan pada UV 366 nm untuk deteksi golongan senyawa flavonoid, FeCl3 untuk deteksi fenol, pereaksi Lieberman-Burchard untuk deteksi terpenoid dan Dragendorf untuk deteksi alkaloid (Wagner dan Bladt, 1996). Warna bercak yang ditimbulkan dihitung hRf-nya dan dibandingkan dengan pustaka. Analisis bioautografi Aktivitas antibakteri dapat diketahui dengan mengamati zona jernih yang merupakan zona hambat. Zona jernih yang terjadi karena adanya difusi golongan senyawa aktif antibakteri dari plat KLT ke media MH yang telah diinokulasi bakteri.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakaukan dengan mencocokkan ciri-ciri morfologis dengan pustaka yaitu “Flora of Java” karangan Backer dan van den Brink, 1965 dan “An Integrated System of Classification of Flowering Plant” karangan Cronquist, 1981. Tanaman yang digunakan sebagai bahan penelitian adalah spesies Theobroma cacao L. Ekstraksi Metode yang digunakan dalam ekstraksi kulit buah kakao adalah maserasi. Metode ini dipilih karena kemudahan dan kesederhanaan dalam pengerjaannya, tetapi metode ini memiliki kelemahan yaitu terlalu memakan waktu dan kurang efektif dalam menyari zat aktif (Sarker, 2006) . Cairan penyari yang digunakan dalam proses ekstraksi adalah etanol 96%. Etanol 96% dipilih karena memiliki beberapa kelebihan antara lain relatif aman, memiliki efek pengawetan, memliki kemampuan menyari zat-zat yang bersifat polar hingga semipolar, seperti golongan polifenol dan triterpenoid (Andersen dan Markham, 2006; Tiwari et al, 2011). Selain itu, kadar etanol yang tinggi dapat mudah menguap sehingga menguntungkan dalam proses pengeringan ekstrak (Tiwari et al, 2011). Proses maserasi diulang dua kali (remaserasi) dengan tujuan untuk melarutkan senyawa yang belum terekstraksi sempurna. Kulit buah kakao kering sebanyak 1000 g menghasilkan ekstrak kental seberat 48,26 g sehingga diperoleh rendemen sebesar 4,83%. Uji Aktivitas Antibakteri Metode yang digunakan dalam pengujian antibakteri adalah difusi disk. Metode ini cocok digunakan untuk mengetahui sensitivitas bakteri terhadap zat aktif yang ada dalam ekstrak. Zat aktif ekstrak akan berdifusi secara pasif ke media yang diinokulasi bakteri. Zona bening mengindikasikan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri. Zona ini memiliki dua macam jenis yaitu radikal dan irradikal. Konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam pengujian terhadap Streptococcus mutans adalah 0,5 mg/disk, 1 mg/disk, 1,5 mg/disk, 2 mg/disk dan 2,5 mg/disk. Sedangkan untuk bakteri Escherichia coli digunakan konsentrasi 1 mg/disk, 2 mg/disk, 3 mg/disk, 4 mg/disk, dan 5 mg/disk. Pelarut ekstrak digunakan DMSO (Dimetil Sulfoksida) 100% untuk bakteri E.coli dan DMSO 30% untuk S.mutans. Pengujian terhadap bakteri S.mutans digunakan DMSO 30% sebagai pelarut ekstrak, dikarenakan 7
DMSO 100% memiliki zona hambat terhadap S.mutans. Pengujian menggunakan disk antibiotik kloramfenikol 30 mg/disk sebagai kontrol positif dan disk yang berisi pelarut ekstrak sebagai kontrol negatif. Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak etanol kulit buah kakao memiliki aktivitas terhadap S.mutans dan tidak memiliki aktivitas terhadap E.coli. Hal ini dibuktikan dengan adanya zona hambat radikal pada pengujian terhadap S.mutans dan tidak ditemukan zona hambat pada E.coli. Konsentrasi terkecil penghambatan S.mutans ditemukan pada konsentrasi 0,5 mg/disk dengan diameter zona hambat rata-rata 6,66 mm berupa zona radikal. Penghambatan terbesar pada konsentrasi 2,5 mg/disk dengan diameter zona hambat rata-rata adalah 9 mm berupa zona radikal. Ekstrak etanol kulit buah kakao tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E.coli, sebab dinding sel bakteri Gram negatif mampu menghasilkan membran biofilm, membran ini dapat menghalangi fagositosis dan menghalangi penetrasi oleh ekstrak. Hal ini yang menyebabkan bakteri Gram negatif seperti E.coli kurang sensitif terhadap senyawa antibakteri. Ekstrak etanol kulit buah kakao memiliki aktivitas antibakteri yang jauh lebih kecil terhadap kedua bakteri jika dibandingkan dengan antibiotik kontrol. Tabel 1. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol kulit buah kakao terhadap Streptococcus mutans dan Escherichia coli (n = 3). Seri Streptococcus mutans Escherichia coli Konsentrasi Diameter zona hambat* ± SD Diameter zona hambat* ± SD (mg/disk) 6,66 ± 0,58** X 0,5 7,42 ± 0,38** 6,00 ± 0,0 1 7,83 ± 0,76** X 1,5 8,00 ± 0,50** 6,00 ± 0,0 2 9,00 ± 0,00** X 2,5 X 6,00 ± 0,00 3 X 6,00 ± 0,00 4 X 6,00 ± 0,00 5 6,00 ± 0,00 6,00 ± 0,00 Kontrol Negatif 17,17 ± 1,26** 26,83 ± 0,29** Kontrol Positif * : Diameter zona hambat termasuk diameter disk. ** : Zona hambat radikal. X : Tidak dilakukan pengujian.
Aktivitas antibakteri ekstrak aseton kulit buah segar kakao memiliki potensi yang lebih kecil daripada ekstrak etanol kulit buah keringnya. Diameter zona hambat yang dihasilkan dari ekstrak aseton tersebut adalah 8 ± 0,3 mm pada konsentrasi 2,5 mg/disk terhadap bakteri S.mutans dan tidak memiliki aktivitas pada bakteri E.coli (Hidayati, 2013). Zona hambat yang dihasilkan lebih kecil daripada ekstrak etanolnya
8
dimungkinkan karena senyawa yang terekstraksi lebih sedikit karena bahan yang digunakan juga lebih sedikit. Penelitian Sartini et al. (2007) menunjukkan kulit kakao yang dimaserasi dengan etanol 70% menghasilkan zona hambat pada Escherichia coli dan Streptococcus mutans. Zona hambat paling besar yang dihasilkan terhadap E.coli dan S.mutans berturut-turut 8,15 mm dan 8,95 mm dengan konsentrasi ekstrak tiap disk 1 mg/disk. Perbedaan pada hasil uji dengan bakteri Escherichia coli dapat disebabkan karena perbedaan tempat tumbuh tanaman, cairan penyari yang digunakan. Kromatografi Lapis Tipis Bercak yang telah dielusi dengan fase gerak n-heksan : etilasetat : metanol (12:7:1) dideteksi dengan sinar UV (254 nm dan 366 nm) dan pereaksi semprot yang spesifik. Deteksi alkaloid dengan pereaksi Dragendorf akan menghasilkan bercak berwarna cokelat (Harbone, 1996). Senyawa fenolik dapat dideteksi dengan pereaksi FeCl3 dimana akan dihasilkan bercak berwarna hitam, merah, hijau, ungu dan biru. Sedangkan pereaksi LB digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid dan akan memberikan warna merah (Wagner dan Bladt, 1995). Beberapa flavonoid dapat dideteksi dengan pereaksi sitroborat. Hasil penyemprotan dengan pereaksi tersebut kemudian dipanaskan selama 5 menit pada 110o C dan menghasilkan warna kuning. Hasil identifikasi ekstrak etanol kulit kakao dengan fase gerak n-heksan : etil asetat : metanol (12:7:1) v/v/v mengandung senyawa fenolik, terpenoid, flavonol dan kumarin. Senyawa tersebut ditemukan pada Rf 0,0 dan 0,96 yang ditandai dengan bercak warna hitam dan warna abu-abu dengan intensitas warna yang rendah setelah disemprot dengan FeCl3 untuk masing-masing bercak. Hasil dari penyemprotan dengan pereaksi Dragendorff menghasilkan bercak berwarna cokelat pada Rf 0,0. Hasil ini menunjukkan tidak adanya alkaloid dalam ekstrak. Senyawa flavonol terdapat pada Rf 0,06 dan 0,98. Senyawa terpenoid pada 0,74; 0,8 dan 0,85. Penyemprotan dengan sitroborat tidak menunjukkan adanya flavonoid dalam ekstrak. Penyemprotan dengan pereaksi LB juga tidak menunjukkan adanya terpenoid setelah dilihat secara visual.
9
9
9 7 6 5
4 3
2
1
1 A
9
1 B
9 8 6 5
9
2 1
1 C
9
D
2 1 E
F
Gambar 5. Kromatogram ekstrak etanol kulit buah kakao dengan fase gerak n-heksan : etilasetat : metanol (12:7:1) v/v/v. Keterangan : A : Deteksi pada UV 254 nm. B : Deteksi pada UV 366 nm. C : Deteksi fenol dengan pereaksi semprot FeCl3. D : Deteksi alkaloid dengan pereaksi semprot Dragendorff. E : Deteksi flavonoid dengan pereaksi semprot sitroborat. F : Deteksi terpenoid dengan pereaksi semprot Liebermann-Burchard. Tabel 2. Hasil uji kromatografi lapis tipis terhadap ekstrak etanol kulit kakao dengan fase gerak n- heksan : etil asetat : metanol (12:7:1) dan fase diam Silica gel GF 254 (jarak elusi 6 cm). No Rf UV 254 UV 366 Pereaksi Semprot Senyawa Sitrobor Ber Dragend FeCl3 at – UV LB cak orf 366 1* 0,0 Pemadaman Hitam Hitam Cokelat Hitam Hitam Fenolik 2 0,06 Pemadaman Biru Biru Hitam Flavonol 3 0,11 Pemadaman 4 0,2 5 0,74 Merah Terpenoid 6 0,8 Merah Merah Terpenoid 7 0,85 Merah Merah Terpenoid 8 0,96 Pemadaman Hijau Abu abu Abu abu Biru Fenolik, kumarin 9 0,98 Cokelat Hijau Abu abu Flavonol * Pemisahan belum sempurna
Hasil identifikasi dengan pereaksi semprot menunjukkan ekstrak positif mengandung senyawa fenolik dan kumarin. Beberapa penelitian sebelumnya menyatakan bahwa dalam kulit kakao memiliki kandungan senyawa fenolik seperti senyawa fenolik yaitu tannin, asam sinamat, kuersetin resorsinol, epikatekin-3-galat, pirogalol (Fapohunda dan Afolayan, 2012) dan prosianidin (Gazzani et al., 2011).
10
Uji Bioautografi Uji bioautografi digunakan untuk mengetahui jenis senyawa yang dapat memberikan aktivitas antibakteri pada ekstrak. Metode yang digunakan dalam uji bioautografi adalah bioautografi kontak. Kelebihan dari bioautografi ini adalah mudahnya proses yang dilakukan. Sebelum dilakukan uji bioautografi dilakukan optimasi pelarut ekstrak. Hasil optimasi diperoleh pelarut yang dapat melarutkan ekstrak yaitu metanol : air (1:1) v/v. Konsentrasi ekstrak yang dibuat untuk uji bioautografi adalah 25%. Streptococcus mutans digunakan sebagai bakteri uji. Ekstrak yang telah dielusi dengan pelarut n-heksan : etil asetat : metanol (12:7:1) v/v/v ditempelkan pada media MH yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Dalam pengujian digunakan kontrol plat KLT yang telah dielusi dengan fase gerak.
Kontrol tersebut digunakan untuk
mengetahui fase gerak tersebut menghambat pertumbuhan bakteri atau tidak (Gambar 6). Hasil uji bioautografi didapat zona jernih pada bekas totolan. Hasil penyemprotan dengan reaksi semprot menunjukkan bahwa senyawa yang terdeteksi adalah senyawa fenolik.
Rf 0,0
Gambar 3. Hasil uji bioautografi ekstrak etanol kulit buah kakao terhadap Streptococcus mutans dengan fase gerak n-heksan : etilasetat : metanol (12:7:1) v/v/v. Keterangan : K : Kontrol plat KLT yang dielusi dengan fase gerak. S : Ekstrak yang telah dielusi dengan fase gerak.
Osawa et al. (1990)
menyatakan komponen fenolik memiliki aktivitas
antibakteri. Senyawa fenolik yang paling banyak ditemukan pada kulit buah kakao adalah (-)epikatekin (Arlorio et al., 2008). Senyawa yang tergolong dalam flavonoid ini memiliki aktivitas yang lebih besar pada bakteri Gram positif daripada Gram negatif 11
(Chusnie dan Lamb, 2005). Epikatekin memiliki aktivitas sebagai antibakteri (Preedy et al., 2011), semakin banyak kandungan epikatekin dalam ekstrak akan meningkatkan aktivitas antibakterinya (Smullen et al., 2007). Mekanisme penghambatan bakteri dapat terjadi karena katekin mampu merusak membran sel dari bakteri. Dua teori dapat digunakan dalam menerangkan hal ini. Pertama, senyawa dapat langsung melakukan penetrasi pada membran bakteri dan mengganggu fungsi penghalangan yang ada pada membran. Kedua, senyawa dapat mengakibatkan fusi pada membran yang membuat kebocoran pada material intramembran. Penelitian sebelumnya menyatakan membran dengan lipid bermuatan negatif seperti lipopolisakarida dapat mengahalangi kedua aksi tersebut. Bakteri Gram negatif memiliki lipopolisakarida, sehingga dapat diketahui bahwa Escherrichia coli lebih tahan terhadap pengaruh polifenol terutama golongan flavonoid yaitu katekin (Chusnie dan Lamb, 2005). KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat diperoleh kesimpulan bahwa : 1. Ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus mutans pada konsentrasi 0,5 mg/disk dan tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli sampai konsentrasi 5 mg/disk.
2. Ekstrak etanol kulit buah kakao memiliki kandungan senyawa fenolik, terpenoid, flavonol dan kumarin. Uji bioautografi menunjukkan bahwa senyawa fenolik dalam ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus mutans.
Saran Perlu dilakukan isolasi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) untuk dapat dikembangkan menjadi produk yang lebih berguna. DAFTAR ACUAN Andersen, O.M., dan Markham, K.R., 2006, Flavonoid, Chemistry, Biochemistry and Application, Hal. 2, CRC Press : United State.
12
Arlorio, M., Coïsson, J.D., Travaglia, F., Varsaldi, F., Miglio, G., Lombardi, G., Martelli, A., 2005, Antioxidant and Biological Activity of Phenolic Pigments from Theobroma Cacao Hulls Extracted with Supercritical CO2, Food Research Int., 38 : 1009-1014. Backer, C., A., and van den Brink, R., C., B., 1965, Flora of Java : Spermathopytes only Vol.I, 408, Noordhoff, Groningen, Netherland. Contardo, M.S., Diaz, N., Lobos, O., Padilla, C., Giacaman, R.A., 2011,Oral Colonization by Streptococcus mutans and its Association with Severity of Periodontal Disease in Adults, Rev. Clin. Periodoncia Implantol. Rehabil. Oral. 4 : 9 – 12. Cronquist, A., 1981, An Integrated System of Classification of Flowering Plants, 477, Columbia University Press : New York. Cushnie, T.P.T., Lamb, A.J., 2005, Antimicrobial Activity of Flavonoid, Int. Journ. of Antimicrobial Agent. 26 : 343 – 346. Doyle, M.E., Archer, J., Kaspar, C.W., Weiss, R., 2006, Human Illness Caused by E. coli O157:H7 from Food and Non-Food Sources, FRI (Food Research Institute), University of Wisconsin-Madison, Wisconsin-Madison : Amerika. Elwers, S., Zambrano, A., Rohsius, C., Lieberei, R., 2010, Histological Features of Phenolic Compounds in Fine and Bulk Cocoa Seed (Theobroma cacao L.), Jour of App. Bot. and Food Qual. 83 : 182 – 188. Fapohunda, S. O. & Afolayan A., 2012, Fermentation of Cocoa Beans and Antimicrobial Potentials of the pod Husk Phytochemicals, J Phys Pharm Adv. 2(3): 158-164. Friedman, M., Henika, P.R., Levin, C.E., Mandrell, R.E., Kozukue, N., 2006, Antimicrobial Properties of Tea Catechin and Theaflavin and Tea Extract againts Bacillus cereus, Jour of Food Protect. 69, 354 – 361. Gazzani, G., Daglia, M., Papetti, A., 2011, Food Component with Anticaries Activity, Biotechnologi, 23 (2010) : 1-7. Han, X., Shen, T., & Lou, H., 2007, Dietary Polyphenols and Their Biological Significance. Int. J. Mol. Sci. 8 (2007), 950-988. Harbone, J., B., 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, 49, IPB Press : Bandung. Hidayati, C., 2013, Aktivitas Antibakteri dan Bioautografi Ekstrak Aseton Kulit Buah Kakao terhadap Escherichia coli dan Streptococcus mutans, Skripsi, Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Hirao, C., Nishimura, E., Kamei, M., Ohshima, T., Maeda, N., 2010, Antibacterial of Cocoa on Periodontal Pathogenic Bacteria, J. Oral Biosc. 52 (3) : 283-291. 13
Indiana State Department of Health, 2009, Environmental Public Health, Diseases Involving Sewage, Indiana State Department of Health : Indiana. Matsumoto M, Tsuji M, Okuda J, Sasaki H, Nakano K, Osawa K., 2004, Inhibitory Effects of Cacao Bean Husk Extraction Plaque Formation in Vitro and in Vivo. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15154923 (diakses tanggal 11 April 2012). Panganiban, C.A., Reyes, R.B., Agojo, I., Armedilla, R., Consul, J.Z., Dagli, H.F., Esteban, L., 2012, Antibacterial Activity of Cacao (Theobroma Cacao Linn.) Pulp Crude Extract Against Selected Bacterial Isolates, Int. Peer Rev. Jour. Vol : 1. Pasiga, B., 2007, Efikasi Klinik Obat Kumur yang Mengandung Limbah Kulit Buah Kakao,http://elib.pdii.lipi.go.id/katalog/index.php/searchkatalog/byGroup/auth or/72087 (diakses tanggal 10 Juni 2012). Pieralisi, F.J.S., Rodrigues, M.R., Segura, V.G., Maciel, S.M., Ferreira, F.B.A., Garcia, J.E., and Poli-Frederico, R.C., 2010, Genotypic Diversity of Streptococcus mutans in Caries-Free and Caries-Active Preschool Children, Int. Jour. of Dent., 2010 : 824976. PPKKI (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia), 2004, Panduan Lengkap Budidaya Kakao, 3-13, PT AgroMedia Pustaka : Depok. Pratiwi, T. Sylvia, 2008, Mikrobiologi Farmasi, 150-160, 188-191, Erlangga : Jakarta. Preedy, V.R., Watson, R.R., Patel, V.B., 2011, Nuts and Seed in Health and Disease Prevention, 115, Elsevier, London. Radji, M., 2005, Buku Ajar Mikrobiologi Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran, 127, EGC : Jakarta. Sarker, S., D., Zahid, L., and Gray, A.,I., Natural Product Isolation, 32, Humana Press Inc. : Totowa. Sartini, Djide, M. N. & Alam, G., 2007, Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Limbah Kulit Buah Kakao Dan Pengaruhnya Terhadap Aktivitas Antioksidan Dan Antimikroba, Majalah Obat Tradisional, (online), (http://mot.farmasi.ugm.ac.id//files//18kulit%20buah%20cacao_Pak%20Alam.pdf , diakses tanggal 13 Januari 2012). Schrauzer, G.N., & DeVroey M.D., 2010, Healthy Chocolate Product-Comfort Foods and Diet Aids, Biological Trace Element Research Institute : California.
14
Smullen, J., Katsou, G.A., Foster, H.A., Zumbe, A., Storey, D.M., 2007, The antibacterial activity of Plant Extract Containing Polyphenol againts Streptococcus mutans, Caries Res, 41 (5), 342-349. Si, W., Gong, J., Sao, R., Kalab, M., Yang, R., Yin, Y., 2006, Bioassay-guided Purification and Identification of Antimicrobial Component in Chinese Green Tea Extract, Journal of Chromatography A. 1125, 204 – 210. Srikanth, R.K., Shashikiran, N.D., Reddy V.V., Subba., 2008, Chocolate Mouth Rinse: Effect on Plaque Accumulation and Mutans Streptococci Counts when Used by Children. J. Indian Soc. Pedod. Prevent Dent. Department of Pediatric Dentistry, College of Dental Sciences and Hospital : Davangere, India. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical Screening and Isolation : a Review, Internationale Pharmaceutica Sciencia, 1 : 98 – 106. Wagner, H., & Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis : A Thin Layer Chromatography, Second Ed, Springer : New York. Wahyudi, T., Panggabean, T.R., Pujiyanto, Yusianto, Zaenudin, Misnawi et al, 2008, Panduan Lengkap Kakao Manajemen Agribisnis dari Hulu Hingga Hilir, Hal.11, 47. Eds. Penebar Swadaya : Depok.
15
