Acta fytotechnica et zootechnica Mimoriadne číslo Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitriae, 2009, s

Obsah

Martina OŠŤÁDALOVÁ a kolektív

Acta fytotechnica et zootechnica Mimoriadne číslo 2009

Acta fytotechnica et zootechnica – Mimoriadne číslo Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitriae, 2009, s. 525-530 STANOVENÍ KATALYTICKÉ AKTIVITY POLYFENOLOXIDÁZY VE VYBRANÝCH DRUZÍCH KOMERČNÍCH ČAJŮ DETERMINATION OF CATALYTIC ACTIVITY OF POLYPHENOL OXIDASE FROM COMMERCIAL SORTS OF TEAS 1

Martina OŠŤÁDALOVÁ 1, Vladimír PAŽOUT 1, Ivan STRAKA 2 Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce,Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 612 42 , Brno - Královo Pole 2 Odborný poradce, Revoluční 397, 664 53, Újezd u Brna

Abstract: Tea is a cultural beverage usually prepared with Camellia sinensis, L. leaves brewed in hot water. In last years tea consumption has increased, and so have the requirements on tea quality and sensorial value. Tea quality is significantly influenced by the presence of sensory active substances, and enzyme Polyphenol Oxidase also contributes to their formation in commercial teas. The aim of our work was to determine the Polyphenol Oxidase activity in commercial teas, which has the influence especially on tea sensorial properties, determines the degree and quality of tea leaves processing, and also keeps ability and stability of stored commercial tea sort. The enzyme activity was determined by UV-VIS spectroscopy method with the help of medium that consists of tyrosine in the presence of oxygen source, namely hydrogen peroxide in the environment suitable for activation of present enzyme. The enzyme catalytic activity is measured in mcatal per time unit (minutes) in 1 gram of tea. Our results confirmed presence of Polyphenol Oxidase in all sorts of our analyzed teas. We detected the highest value of catalytic activity of Polyphenol Oxidase in green teas and oolong teas (in average 2.395 – 3.393 mkatal/1 minute/ 1 gram of tea), whereas white and black tea reached at average the lowest activity of this enzyme (0.845 -1.428 mkatal/1 minute/ 1 gram of tea). Thus there was confirmed the dependence of the activity of Polyphenol Oxidase on the level and quality of technological processing, on manipulation frequency, and storage of commercial teas. Keywords: Tea, Polyphenol Oxidase, Enzyme catalytic activity, UV-VIS spektrophotometry

Čaj patří v poslední době k velmi užívaným nápojům dnešní populace. Jde o zpracované listy čajovníku čínského (Camellia sinensis. L.), procházející různým způsobem opracování, které určuje druh výsledného čaje. Jednou ze složek v čajových listech ovlivňující stupeň technologického opracování a výsledný druh čaje, je enzym polyfenoloxidáza. Polyfenoloxidáza je enzym, který je tvořen čtyřmi bílkovinnými řetězci, dnes již známé sekvence aminokyselin a ze čtyř atomů jednomocné mědi (Cu+). Přirozeně se nachází v rostlinných materiálech, kde je lokalizován v chloroplastech a v nich vázán na thylakoidní membrány. Polyfenoloxidáza katalyzuje dvě rozdílné, ovšem na sebe navazující oxidační reakce. Jde o hydroxylaci monofenolů na o-difenoly (kreolázová aktivita) a o oxidaci bifenylů na o-chinony (katecholázová aktivita) (Hodges, et.col, 2008; Miyawaki, 2006; Thipyapong, et.col., 2007). Jedná se tedy o oxidaci přítomných fenolů na chinony, což se projeví postupnou změnou barvy následkem samovolné polymerace vytvořených chinonů. Odborně je tato reakce nazývána enzymovým zhnědnutím, které nastává v důsledku fyziologických dějů v rostlině (zrání a stárnutí), poškození tkáně (stlačení, pořezání, potrhání) a patogenní infekcí (Gregory et.col., 1966; Vodrážka a.kol, 1998). Z výše uvedeného lze tedy konstatovat, že polyfenoloxidáza patří k významným látkám, které mají vliv na výslednou barvu hotového čaje a následně i čajového nálevu. Dále ovlivňuje stupeň opracování, zejména fermentaci čajů a katalyzuje syntézu řady bioaktivních látek, které nejen blahodárně působí na organizmus a zároveň jsou součástí aroma. Podle Hodgese et. col. (2008) a Sanga et. col. (2004) je možno ji využít k biosyntéze řady

525

Obsah



polymerních látek, které se uplatňují v biotechnologii čajů, tedy výroby čajových barviv zejména modifikovaných thearubigínů a theaflavinů, které zvyšují senzorickou hodnotu čajového nálevu (Hara, 2000). Cílem naší práce bylo na základně zjištěné aktivity polyfenoloxidázy určit stupeň kvality opracování jednotlivých druhů čajů a také zjistit možnost následné použitelnosti čajů k další biosyntéze čajových barviv a tak zvýšení barevnosti čajového nálevu pro další komerční využití. Materiál a metody K měření byl použit náhodný výběr 26 vzorků komerčních čajů od nejdostupnějších prodejců (zpracovatelů) v rámci České republiky (Oxalis, spol. s r.o., Slušovice; Mabroc-Czechia, s.r.o., Velké Meziříčí; Scivias, Telč; Spolek milců čaje, s.r.o., Praha (dále jen SMČ)) se zaměřením na bílý, zelený, oolong a černý (červený) čaj s rozdílným místem původu. Jejich seznam je uveden v tabulce č.1. Tabulka č. 1: Přehled všech analyzovaných vzorků komerčních čajů Vzorek č. (1)

Druh (2)

Zpracovatel (3)

Oblast (4)

Označení (5)

Čína Čína Čína Čína Čína Čína

B1 WB2 B3 SB4 JB5 B6

Vietnam Čína Indie Indie Ceylon Čína Japonsko

V3 Z2 ZD7 ZA6 D6 DZ7 ZS8

Čína Taiwan Čína Čína Čína

ZO1 F2 OS3 MO4 O6

Gruzie Čína Turecko Čína Keňa Indie Indie Indie

GČ1 KČ2 T1 BČ5 GFČ6 AČ7 DČ8 ČN

Bílý čaj (6) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26.

Pai Mu TAN White Monkey Shou Mei Silvery Strawberry China Jasmin, Dragon, Phoenix Snow Buds

Scivias Oxalis Oxalis Oxalis Oxalis Oxalis

Zelený čaj (7) Ché ngon So Oxalis Yunnan green Oxalis Darjeeling Green, SFTGFOP1 CH Oxalis Assam Green, Tea OP Oxalis Green Tea Mabroc- Czechia Ding duchy Fang SMČ Sencha Satsuma Oxalis Oolong čaj (8) Ti Kuan Yin Oxalis Formosa Fina Oolong Oxalis Se Zhong SMČ Milk Oolong Oxalis Shiu Yian Oxalis Černý čaj (9) Gruzie OP Oxalis Keemun Oxalis Turkey Scivias Black Cloud Oxalis Kenya, GFOP -I Millima Oxalis Assam Mangalam, BPS CL Oxalis Darjeeling Namring, Upper FTGFOP1 Oxalis Nilgiri Oxalis

Table no. 1: View of all analysis samples of commercial teas (1) Sample no., (2) Kind, (3) Processor, (4) Area, (5) Labeling, (6) White Tea, (7) Green tea, (8) Tea Oolong, (9) Black Tea

526

Obsah



Pro stanovení aktivity fenoloxidázy byla využita metoda UV-VIS spektroskopie za použití analyzátoru typu CECIL CE 7210 v pásmu vlnových délek 190 - 900 nm. Princip metody: Principem metody bylo měření aktivity enzymu pomocí jednoho z mnoha substrátů tyrozínu o dané koncentraci (0,001M) v přítomnosti donoru aktivního kyslíku, kterým je peroxid vodíku a to při vlnové délce 272,5 nm. Katalytickou koncentraci enzymu jsme vyjádřili jako množství směsi s enzymem (1 g čaje), které přemění jeden mol substrátu (tyrozínu) za jednotku času (minuty) při definovaných podmínkách (pH směsi 6 - 7, teplota laboratoře 20 oC) (Noviakov et. col., 1999). Postup stanovení katalytické aktivity polyfenoloxidázy: Bylo naváženo 1,0 g vzorku čaje, který byl zalit studenou vodou (podle potřeby od 300 ml do 1 000 ml). Ke vzorku bylo napipetováno 5 ml 0,001M tyrozínu a 10 ml 3% peroxidu vodíku a po 15 a 30 minutách byla měřena absorbance výluhu. Ve všech případech byla kontrolována maxima absorbce měřením absorpčního spektra v širším pásmu vlnových délek. Katalytickou koncentraci enzymu jsme vypočetli dle zvýšení optické absorbance při 275,5 nm dělené množstvím času potřebného ke zvýšení (15 minut), přičemž jsme brali v úvahu ředění vzorku vodou. Zvýšení optické absorbance jsme vyjádřili jako množství zreagovaného tyrozínu na základně kalibrační křivky a nebo přepočítávacího faktoru (čistý 0,001M roztok tyrozínu měl průměrnou optickou absorbanci 0,940). Zdá se nelogické, že působením katalytické aktivity polyfenoloxidázy v přítomnosti aktivního kyslíku (z peroxidu vodíku) nedochází ke snížení optické absorbance při 275,5 nm, ale naopak ke dvojnásobnému zvýšení. Je to způsobeno chemickou změnou hydroxyskupiny na ketoskupinu tyrozínu, kdy při oxidaci tyrozínu dochází ke dvojnásobnému zvýšení optické absorbance (Gregory et.col., 1966) Naměřené a vypočtené hodnoty katalytické aktivity byly následně uvedeny v přehledné tabulce, vyhodnoceny statistickými metodami (analýza rozptylu, Studentův test) a graficky zpřístupněny srozumitelným způsobem (Bedáňová, Večerek, 2007). Výsledky a diskuze Katalytické koncentrace polyfenoloxidázy u jednotlivých analyzovaných čajů, včetně statisticky vypočtených dat jsou uvedeny v tabulce (Tabulka č. 2).

527

Obsah



Tabulka č. 2: Katalytická aktivita polyfenoloxidázy u jednotlivých analyzovaných vzorků čaje v mkatal/1minutu/1 gram čaje Označ. (1)

Druh (2)

B1 WB2 B3 SB4 JB5 B6

Pai Mu TAN White Monkey Shou Mei Silvery Strawberry China Jasmin, Dragon, Phoenix Snow Buds t kritické (9) t vypočtené (10)

V3 Z2 ZD7 ZA6 D6 DZ7 ZS8

Ché ngon So Yunnan green Darjeeling Green, SFTGFOP1 CH Assam Green, Tea OP Green Tea Ding duchy Fang Sencha Satsuma

Směrodatná odchylka (5)

Rozptyl (6)

Variační koeficient (7)

0,845

0,535

0,286

63 %

Zelený čaj (11) 0,85 1,63 3,68 4,01 2,73 1,47

2,395

1,078

1,162

45 %

3,393

1,355

1,836

39 %

1,428

0,655

0,429

57 %

2,571 0,4049

Oolong čaj (12) 1,36 4,42 4,40

Ti Kuan Yin Formosa Fina Oolong Se Zhong Milk Oolong Shiu Yian t kritické (9) t vypočtené (10)

GČ1 KČ2 T1 BČ5 GFČ6 AČ7 DČ8 ČN

Aritmetický průměr (4)

3,182 0,0019

t kritické (9) t vypočtené (10)

ZO1 F2 OS3 MO4 RO6

mkatal/1 min/ 1 gram čaje (3) Bílý čaj (8) 1,81 0,95 0,52 0,10

4,303 0,2664

Gruzie OP Keemun Turkey Black Cloud Kenya, GFOP -I Millima Assam Mangalam, BPS CL Darjeeling Namring, Upper FTGFOP1

Nilgiri

t kritické (9) 2,571 t vypočtené (10) 0,3603 Celkový průměr všech čajů (14) Celková směrodatná odchylka všech čajů (15) Celkový rozptyl všech čajů (16) Variační koeficient všech čajů (17)

Černý čaj (13) 0,74 1,68 1,16 2,56 0,42 2,01 -

1,92 1,09 1,19 63 %

Table no. 2: Catalytic activity of Polyphenol Oxidase in samples of analysed Teas in mkatal/1 minute/ 1 gram of tea (1) Labelling., (2) Kind, (3) mkatal/1 minute/ 1 gram of tea, (4) Mean, (5) Standard Deviation, (6) Variance, (7) Variation coefficient, (8) White Tea, (9) t critical, (10) t calculated, (11) Green tea, (12) Tea Oolong, (13) Black Tea, (14) Total Mean of all teas, (15) Total Standard Deviation of all teas, (16) Total Variance of all teas, (17) Total Variation coefficient of all teas

Výsledky (Tabulka č. 2) potvrzují přítomnost polyfenoloxidázy v průměru ve všech druzích analyzovaných čajů. Potvrdilo se nám, že nejnižší katalytickou aktivitu enzymu vykazují bílé čaje (0,845 mkatal/1 min/g čaje), kdy u některých vzorků byla nulová (vzorek

528

Obsah



B1, WB2). Bílé čaje jsou oproti jiným druhům čajů vyrobeny z nerozvinutých lístků čajovníku, ve kterých je uvedený enzym neaktivní, popřípadě v minimálním množství. Jednou z možností vysvětlení tohoto nálezu může být i stabilita bílo-stříbrné barvy u dlouhodobě skladovaných bílých čajů. Druhou skupinou čajů s nižší aktivitou polyfenoloxidázy byly černé čaje (1,428 mkatal/1 min/g čaje). Kolektivy Matsuoa (2006) a Sangse (2004) ve svých pracích popisují významný výskyt sekundárních produktů fenolických látek u fermentovaných čajů, na jejichž vznik má výrazný vliv enzym polyfenoloxidáza. Tato skutečnost vede k minimalizaci aktivity daného enzymu a naopak ke vzrůstu těchto metabolitů, které mají výrazný význam např. v prevenci některých druhů karcigenního onemocnění. Díky výše popsanému jsme u černých čajů přepokládali nižší hodnoty tohoto enzymu nejen proto, že černé čaje jsou plně fermentované, ale i z důvodu tepelného ošetření po fermentaci, které zaručuje stabilitu a trvanlivost daného čaje. Nejvyšší hodnoty byly nalezeny u čajů typu oolong (3,393 mkatal/1min/g čaje) a následovně u zelených čajů (2,395 mkatal/1min/g čaje). Zelené čaje neprochází fermentačním procesem a oolong čaje jsou fermentovány jen částečně. U obou čajů při výrobě probíhá opět tepelné ošetření. Ovšem jak uvádí Miyawaki (2006), díky pevným vazbám enzymu ve struktuře rostlinného materiálu a tak jeho vyšší stabilitě, nedochází po tepelném ošetření v čajovém materiálu pravděpodobně k jeho úplné inaktivaci a působením kyslíku, zejména při manipulaci s čajem a nevhodném skladování, dochází k aktivaci enzymu a následnému stárnutí a nestabilitě čaje a čajového nálevu. Z výsledků statistické analýzy závěrečným Studentovým oboustranným t-testem vyplývá, že nebyl nalezen statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými skupinami čajů. Lze tedy přepokládat, že u námi analyzovaných čajů v průběhu technologického procesu, následkem fermentace i tepelného ošetření, nedošlo k vymizení aktivity polyfenoloxidázy. Přítomnost polyfenoloxidázy lze přičíst časté manipulaci a nevhodnosti skladovaní (zejména způsobem balení). Ovšem co se týče možných následných biotechnologických úprav těchto čajů s cílem umělé biosyntézy přidáváním různých obtížně definovaných směsí mono- a difenolů a připravit tak polymerní barviva, nemůžeme zatím ani prokázat, ovšem ani vyloučit. Proto se budeme zabývat hlubším studiem polyfenolických látek (včetně monofenolů) v komerčních čajích originálních výrobků a kontrolou zda-li jejich přidávání v průběhu následného skladování a manipulace nezpůsobilo nepřirozenou barvu čajů z důvodů jejich ekonomické atraktivity na trhu. Súhrn: Čaj je kulturní nápoj, připravovaný obvykle louhováním lístků rostliny čajovníku čínského (Camellia sinensis, L.) v horké vodě. Spotřeba čaje se dnes zvyšuje a tím se zvyšují i nároky na kvalitu a senzorickou hodnotu daných čajů. Kvalita čajů je ovlivněna hlavně obsahem senzoricky aktivních látek, k jejichž tvorbě přispívá v komerčních čajích i enzym fenoloxidáza. Cílem naší práce bylo stanovení aktivity enzymu polyfenoloxidázy u komerčních druhů čajů, která má vliv zejména na senzorické vlastnosti čaje, ovlivňuje stupeň a kvalitu zpracování čajových listů a také údržnost a stabilitu skladovaného druhu komerčního čaje. Aktivitu enzymu jsme stanovili metodou UV-VIS spektroskopie za pomocí substrátu, kterým je tyrozín v přítomnosti zdroje kyslíku tj. peroxidu vodíku v prostředí vhodném pro aktivaci přítomného enzymu. Katalytickou aktivitu enzymu měříme v milikatalech za jednotku času (minuty) v 1 gramu čaje. Naše průměrné výsledky potvrdili přítomnost polyfenoloxidázy ve všech druzích námi analyzovaných čajů. Nejvyšších hodnot aktivity enzymu jsme zjistili u čajů zelených a oolong (v průměru 2,395 – 3,393 mkatal/1 min/ 1 gram čaje). Naopak nejnižší aktivitu měly čaje bílé a černé (0,845 -1,428 mkatal/1 min/ 1 gram čaje). Tím jsme potvrdili

529

Obsah



možnou závislost aktivity fenoloxidázy na stupni a kvalitě opracování čajových listů a dále i závislost na četnosti manipulací a skladování hotových čajů. Klíčová slova: čaj, spektrofotometrie

polyfenoloxidáza,

katalytická

aktivita

enzymu,

UV-

VIS

Literatura [1] BEDÁŇOVÁ, I. - VEČEREK V. 2007. Základy statistiky pro studující veterinární medicíny. 1. vyd. Brno: VFU, 2007. 129 s. ISBN: 978-80-7305-026-9. [2] GREGORY, R. - BENDALL, D. 1966. The Purification and Some Properties of the Polyphenol Oxidase from tea (Camellia sinensis L.). In: Biochemistry Journal, vol. 101, 1966., p. 569 - 581. [3] HARA Y. 2000. Green tea:health benefits and applications. New York : Marcel Dekker, 2000. 252 p. ISBN: 0824704703. [4] HODGES, G.,R. - OBUCHOWITZ, J. P, (UNILEVER, Plc., UNILEVER, N.C., Hindustan UNILEVER, Ltd.). Patent Cooperation Treaty Application, June 2008, Patent No: WO08065007. [5] MIYAWAKI, M. 2006. Control of Polyphenol Oxidase and Pectin Methylesterase activities by ultra high pressure. Dissertation work. URL:http://research.wsulibs.wsu.edu:8080/dspace/bitstream/2376/457/1/M_Miyawaki_03310 6.pdf [6] MATSUO, Y.- TANAKA, T. - KOUNO, I. 2006. A new mechanism for oxidation of epigallocatechin and production of benzotropolone pigments. In: Tetrahedron, vol. 62, 2006, no.20, p. 4774 - 4783. [7] NOVIAKOV, D., A., et col. 1999. Inhibition of Tyrosinase by Green Tea Components. In: Life Sciences Including Pharmacology Letters, vol. 65, 1999, no.20, p. 241 - 246. [8]VODRÁŽKA Z. - RAUCH, P. - KÁČ, J. 1998. Enzymologie. 3. vyd. Praha: VŠCHT, 1998. 171 s. ISBN: 80-7080-330-4. [9] SANG, S., et. col. 2004. Enzymatic synthesis of tea theaflavin derivatives and their antiinflammatory and cytotoxic activities. In: Bioorganic and Medicinal Chemistry, vol. 12, 2004., no. 2, p.459 - 467. [10] SUBRAMANIAN, N., et. col. 1999. Role of Polyphenol Oxidase and Peroxidase in the Generation of Black Tea Theaflavins. In: Food Chemistry, vol. 47,1999, p. 3571 - 2578. [11] THIPYAPONG, P. et. col. 2007. Functional Analysis of Polyphenol Oxidases by Antisence/Sense Technology. In: Molecules, vol.12, 2007, p.1569 – 1595. ISSN:1420-3049. Kontaktní adresa : Ing. Martina Ošťádalová, Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce, Veterinární a farmaceutická univerzita, Palackého 1/3, 612 42, Brno, e-mail: [email protected]

530

Acta fytotechnica et zootechnica Mimoriadne číslo Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitriae, 2009, s

Recommend Documents