ABSTRAKT. KLÍČOVÁ SLOVA Fytoestrogeny, ekvol, sójové boby, mléko, mléčné výrobky

1

2

ABSTRAKT Fytoestrogeny jsou v posledních letech velice intenzivně studovány, protože vykazují rozličné farmakologické účinky na zdraví člověka. Bylo např. prokázáno, že fytoestrogeny snižují riziko výskytu některých typů rakoviny (prsu, prostaty nebo střeva), působí v organismu jako antioxidanty a ovlivňují aktivitu některých enzymů. Kromě toho byla prokázána také řada pozitivních účinků sójových fytoestrogenů na zdravotní stav žen v menopauze, jako je např. snížení rizika kardiovaskulárních onemocnění aterosklerózy nebo osteoporózy. Různě technologicky upravené sójové boby jsou významnou součástí krmných dávek zvláště pro vysokoprodukční dojnice, protože jsou cenným zdrojem energie a vysoce kvalitního proteinu i přes jejich možný negativní vliv na reprodukční procesy. Fytoestrogeny přijaté v krmné dávce jsou v bachoru dojnic hydrolyzovány a spolu s jejich metabolity jsou v tenkém střevě vstřebávány do krve. Z těla pak mohou být vyloučeny především močí nebo mlékem. Z tohoto pohledu se kravské mléko může stát zdrojem fytoestrogenních látek, především ekvolu v humánní výživě. Naproti tomuto, některé výsledky výzkumu poukazují na možná potenciální rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravě na zdravotní stav člověka. U některých věkových (kojenci a malé děti) a skupinových (vegetariáni) kategorií může být příjem fytoestrogenů v potravě nežádoucí. Podle názoru většiny odborníků příznivý vliv na lidské zdraví převažuje nad možnými riziky. Přesto však rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravinách není možné přehlížet, a proto fytoestrogeny zůstávají i nadále aktuálním problémem na poli vědeckého výzkumu.

KLÍČOVÁ SLOVA Fytoestrogeny, ekvol, sójové boby, mléko, mléčné výrobky

3

ABSTRACT Phytoestrogens are very intensively studied in recent years because they show different pharmacological effects on human health. For example, it was demonstrated that phytoestrogens reduce the risk of certain cancers (breast, prostate or colon), act as antioxidants in the body and affect the activity of certain enzymes. In addition, also it was demonstrated number of positive effects of soybean phytoestrogens on the health status of women in the menopause, such as reducing the risk of atherosclerotic cardiovascular disease or osteoporosis. Various technologically processed soy beans are important part of the feed rations mainly for high-lactating dairy cows, because they are a valuable source of the energy and highquality protein, despite their negative effect on reproductive performance. Phytoestrogens consumed from the feed rations are hydrolyzed in the rumen of dairy cow and together with their metabolites are absorbed in the small intestine into the blood. They can be excreted from the body in urine or milk. From this perspective, cow's milk may become a source of phytoestrogens substances, especially equol in the human nutrition. On the other hand, some research results suggest possible potential risks associated with phytoestrogens intake in the diet on human health. At the some age (infants and young children) and group (vegetarians) categories may be dietary intake of phytoestrogens undiserable. According to most experts, a beneficial effect on human health prevail the potential risks. However, the risks associated with phytoestrogens intake in food can not be ignored and therefore phytoestrogens are still actual problem in the field of scientific research.

KEYWORDS Phytoestrogens, equol, soy beans, milk, milk products

4

WATZKOVÁ, J. Sledování exprese fytoestrogenů do mléka a mléčných výrobků. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2014. 101 s. Vedoucí dizertační práce doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc..

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem dizertační práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Dizertační práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího dizertační práce a děkana FCH VUT.

…………………………… podpis studenta

Poděkování Doc. Ing. Jiřině Omelkové, CSc. touto cestou děkuji za odborné vedení. Dále RNDr. Mileně Vespalcové, Ph.D. a Mgr. Ing. Ludmile Křížové, Ph.D. děkuji za získání velmi cenných zkušeností a znalostí, přátelský přístup, ochotu a trpělivost. Velké poděkování patří také mojí rodině a přátelům. 5

OBSAH 1

ÚVOD .................................................................................................................................................... 8

2

TEORETICKÁ ČÁST ......................................................................................................................... 9 2.1

FENOLOVÉ SLOUČENINY .................................................................................................................... 9 2.1.1 2.1.1.1

Isoflavony...................................................................................................................................... 11

2.1.1.2

Biologické účinky fytoestrogenů ................................................................................................... 13

2.1.2

U zvířat.......................................................................................................................................... 14

2.1.2.2

U člověka ...................................................................................................................................... 15

2.1.3.1

2.1.4

2.3

Hlavní zdroje fytoestrogenů ................................................................................................. 17 Sója luštinatá (Glycine max (L.) Merr.) ........................................................................................ 17

Zdravotní účinky fytoestrogenů ........................................................................................... 19

2.1.4.1

Účinky fytoestrogenů u zvířat ....................................................................................................... 19

2.1.4.2

Účinky fytoestrogenů u člověka .................................................................................................... 20

2.1.4.3

Účinky fytoestrogenů u rostlin ...................................................................................................... 22

FAKTOTY OVLIVŇUJÍCÍ OBSAH FYTOESTROGENŮ .............................................................................

22

2.2.1

Fytoestrogeny v krmivu........................................................................................................ 22

2.2.2

Fytoestrogeny v potravinách ............................................................................................... 22

ANALÝZA FYTOESTROGENŮ ............................................................................................................ 24 2.3.1 2.3.1.1

2.3.2 2.3.2.1

2.4

Metabolismus fytoestrogenů ................................................................................................ 14

2.1.2.1

2.1.3

2.2

Fytoestrogeny ...................................................................................................................... 10

Extrakce a separace fytoestrogenů ...................................................................................... 24 Extrakce pevnou fází ..................................................................................................................... 24

Detekce a kvantifikace fytoestrogenů................................................................................... 25 Vysoce účinná kapalinová chromatografie .................................................................................... 27

SHRNUTÍ POZNATKŮ A ZÁVĚR.......................................................................................................... 28

3

CÍL PRÁCE ........................................................................................................................................ 30

4

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................................. 31 4.1

FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1) ..............................................................................................

4.1.1

Odběry a zpracování vzorků krmiv ...................................................................................... 33

4.1.2

Odběry a zpracování vzorků mléka...................................................................................... 33

4.1.3

Technologické zpracování mléka ......................................................................................... 34

4.1.3.1

Technologický postup výroby sýrů ............................................................................................... 35

4.1.3.2

Technologický postup výroby jogurtů ........................................................................................... 35

4.1.4

4.2

6

31

Výpočty ................................................................................................................................ 35

4.1.4.1

Míra prostupu isoflavonů do mléka ............................................................................................... 35

4.1.4.2

Statistické vyhodnocení dat ........................................................................................................... 36

POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2) .............................................................................................

36

4.2.1

Odběry a zpracování vzorků krmiv ...................................................................................... 39

4.2.2

Odběry a zpracování vzorků mléka...................................................................................... 39

4.2.3

Technologické zpracování mléka ......................................................................................... 40

4.2.4

4.3

Výpočty ................................................................................................................................ 40

4.2.4.1

Míra prostupu isoflavonů do mléka ............................................................................................... 40

4.2.4.2

Statistické vyhodnocení dat ........................................................................................................... 40

ANALYTICKÁ ČÁST .......................................................................................................................... 40 4.3.1

Materiál ............................................................................................................................... 40

4.3.1.1

Laboratorní vybavení .................................................................................................................... 40

4.3.1.2

Chemikálie .................................................................................................................................... 41

4.3.1.3

Přístroje ......................................................................................................................................... 41

4.3.1.4

Software ........................................................................................................................................ 41

4.3.2

Analýzy vzorků krmiv a zbytků krmiv ................................................................................... 42

4.3.2.1

Stanovení základního obsahu živin ............................................................................................... 42

4.3.2.2

Stanovení fytoestrogenů – daidzein, genistein a glycitein ............................................................. 47

4.3.3

Analýzy vzorků mléka a mléčných výrobků .......................................................................... 48

4.3.3.1

Stanovení základních složek ......................................................................................................... 48

4.3.3.2

Stanovení fytoestrogenů – daidzein, genistein, glycitein a ekvol .................................................. 51

VÝSLEDKY A DISKUSE ................................................................................................................. 53

5 5.1

5.2

FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1) ............................................................................................. 53 5.1.1

Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka .................................................................. 53

5.1.2

Zdánlivá návratnost isoflavonů ........................................................................................... 57

5.1.3

Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka .............................. 57

POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2) ............................................................................................. 63 5.2.1

Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka .................................................................. 63

5.2.2

Zdánlivá návratnost isoflavonů ........................................................................................... 66

5.2.3

Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka .............................. 67

5.3

SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR.......................................................................................................... 71

5.4

PŘEHLED GRAFICKY ZPRACOVANÝCH DAT (EXP. 1) ........................................................................ 73

5.5

DOPLŇKOVÁ GRAFICKÁ PŘÍLOHA (EXP. 1)....................................................................................... 75

5.6

PŘEHLED GRAFICKY ZPRACOVANÝCH DAT (EXP. 2) ........................................................................ 77

5.7

DOPLŇKOVÁ GRAFICKÁ PŘÍLOHA (EXP. 2)....................................................................................... 79

6

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ .................................................................................................. 81

7

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ...................................................................... 95

8

VĚDECKÁ ČINNOST ....................................................................................................................... 97 8.1

PUBLIKACE ...................................................................................................................................... 97

8.2

UŽITNÉ VZORY A FUNKČNÍ VZORKY ................................................................................................ 98

8.3

POSTERY.......................................................................................................................................... 99

8.4

ÚČAST NA ODBORNÝCH KONFERENCÍCH ..........................................................................................

8.5

PROJEKTOVÁ ČINNOST ................................................................................................................... 100

99

7

1 ÚVOD Fytoestrogeny jsou již několik let velice intenzivně studovány pro své farmakologické účinky na zdraví člověka. Bylo např. prokázáno, že fytoestrogeny snižují riziko výskytu některých typů rakoviny (prsu, prostaty, střeva), působí v organismu jako antioxidanty a ovlivňují aktivitu některých enzymů [1, 2]. Kromě toho byla prokázána také řada pozitivních účinků sójových fytoestrogenů na zdravotní stav žen v menopauze, jako je např. snížení rizika kardiovaskulárních onemocnění [3], aterosklerózy [4] nebo osteoporózy [5]. Značná pozornost je věnována především ekvolu, metabolitu daidzeinu, který sám o sobě vykazuje výrazné antikarcinogenní účinky [6]. Ekvol je u člověka produkován z daidzeinu bakteriální mikroflórou ve střevě, nicméně tuto schopnost má pouze asi třetina západní populace [6]. Různě technologicky upravené sójové boby jsou významnou součástí krmných dávek zvláště pro vysokoprodukční dojnice, protože jsou cenným zdrojem energie a vysoce kvalitního proteinu [7] i přes jejich možný negativní vliv na reprodukční procesy či dočasnou neplodnost krav [8]. Fytoestrogeny přijaté v krmné dávce jsou v bachoru dojnic hydrolyzovány a spolu s jejich metabolity jsou v tenkém střevě vstřebávány do krve. Z těla pak mohou být vyloučeny především močí [9, 10] nebo mlékem [11]. Z tohoto pohledu se kravské mléko může stát zdrojem fytoestrogenních látek, především ekvolu v humánní výživě. Naproti tomuto, některé výsledky výzkumu poukazují na možná potenciální rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravě na zdravotní stav člověka. U některých věkových (kojenci a malé děti) a skupinových (vegetariáni) kategorií může být příjem fytoestrogenů v potravě nežádoucí [12]. Podle názoru většiny odborníků, kteří se věnují této problematice, příznivý vliv na lidské zdraví převažuje nad možnými riziky. Přesto však rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravinách není možné přehlížet, a proto fytoestrogeny zůstávají i nadále aktuálním problémem na poli vědeckého výzkumu.

8

2 TEORETICKÁ ČÁST Látky s estrogenními účinky byly z rostlin izolovány poprvé v roce 1928, pouze několik let poté, co byly izolovány z těl savců [13]. Poprvé v roce 1946 v Austrálii byl pozorován výskyt estrogenních sloučenin v rostlinách [14], ve spojení se specifickým problémem chovu zvířat na jetelových pastvinách, známým jako "jetelová nemoc". Látky způsobující tyto endokrinní poruchy byly později označeny jako fytoestrogeny a původní myšlenky tak odstartovaly výzkum zaměřený na jejich bližší identifikaci a specifikaci [15]. Od té doby se došlo k poznání, že fytoestrogeny jsou v rostlinné říši velice rozšířené. V závislosti na vývoji však přetrvává určitá nepřesnost v označování pojmu fytoestrogen. Na jedné straně se vyskytují tendence připisovat estrogenům všechny farmakologické účinky rostlin na reprodukci, zatímco na druhé straně je problém vysvětlit zřejmý nedostatek klinických příznaků odvíjejících se od fytoestrogenů, které se zdají být takřka všudypřítomné. Část těchto nesrovnalostí pramení z nedostatečného respektování skutečnosti, že rostliny mohou obsahovat látky jiné, než jsou estrogeny, které však mohou působit na reprodukci zvířat. Například nedávno izolovaný 6-methoxybenzoxazolinon z klíčící pšenice není sám o sobě estrogenem, ale stimuluje sekreci estradiolu z živočišných vaječníků, což vyvolává známky estrogenního účinku [13]. V následující kapitole je tedy blíže popsán chemický původ fytoestrogenů a formy, ve kterých se mohou běžně vyskytovat, stejně tak biologické účinky, které jsou na základě své chemické povahy schopny vykazovat.

2.1

FENOLOVÉ SLOUČENINY

Fenolové sloučeniny představují s více než osmi tisíci zástupci jednu z nejpočetnějších a nejrozšířenějších skupin rostlinných látek [16]. Jedná se o sekundární metabolity rostlin, pro které je charakteristický aromatický kruh nesoucí jeden nebo více hydroxylových substituentů [16, 17]. Jejich obsah v potravinách závisí na genetických faktorech (na druhu a odrůdě rostliny, stupni zralosti) a vnějších (environmentálních) faktorech (světlo, teplota, živiny, pesticidy apod.) [17]. Některé fenoly jsou významná přírodní barviva (např. chinony, lignany, flavonoidy, xanthony), dále pak látky vonné (např. některé jednoduché fenoly a deriváty hydroxyfenolových kyselin, kumariny) a chuťové (např. kondenzované třísloviny flavolany), jež jsou buď primárními složkami některých silic, nebo vznikají jako sekundární aromatické látky při zpracování potravin (působením mikroorganismů [18] a při termických procesech) [19]. Fenolové sloučeniny nacházející se jako součást potravin rostlinného původu vykazují pestrou škálu biologických účinků. Oceňují se zejména jejich antimikrobiální a antioxidační vlastnosti. Některé fenolové sloučeniny jsou však také toxické. Závažná je jejich fototoxicita a především jejich estrogenní a karcinogenní účinky. Karcinogenní účinky vykazují díky své fototoxicitě některé kumariny, vlastnosti estrogenů mají některé lignany, isoflavonoidy (isoflavony a příbuzné pterokarpany) a prenylflavonoidy, které vykazují rovněž antikarcinogenní účinky. Ostatní fenolové sloučeniny, např. lignany, taniny, stilbeny 9

a flavonoidy a mnohé další fenolové látky, vykazují široké spektrum dalších biologických účinků [20]. Mezi fenolové sloučeniny patří také nesteroidní součásti rostlin – fytoestrogeny („phyto-“ znamená rostlina; „-estrogen“ estrogenní aktivita) [21], které se svou chemickou strukturou a biologickou aktivitou podobají estradiolu (Obr. 1), lidskému estrogenu [22].

Obr. 1: Struktura estradiolu [23]

2.1.1 Fytoestrogeny V současné době je známo několik desítek látek s estrogenními účinky vyskytujících se ve více než 300 druzích rostlin. Mezi tyto látky řadíme také fytoestrogeny, které se obvykle dělí do několika skupin [24, 25, 26]. Mezi 4 hlavní skupiny patří [20, 27]:  Isoflavony jsou subtypem isoflavonoidů. Nejvíce prostudované isoflavonoidy jsou daidzein a genistein. Získávají se převážně z luštěnin. Mohou existovat, jako glykosidy a aglykony. Ve formě aglykonů jsou snadno vstřebávány epitelovými buňkami intestinálního traktu.  Prenylflavonoidy (chalkony a flavanony) se nachází ve zralých samičích květenstvích (šišticích) chmele otáčivého (Humulus lupulus). Jejich množství závisí na klimatických podmínkách a odrůdě chmele. V poslední době se sledují jejich estrogenní a karcinogenní účinky. Nejdůležitější sloučeninou je chalkon xanthohumol, který nevykazuje estrogenní aktivitu a flavanon isoxanthohumol, který z něj vzniká konverzí v kyselém prostředí při záhřevu.  Pterokarpany jsou skupinou modifikovaných isoflavonoidů vyskytujících se v malém množství v bobovitých rostlinách i v rostlinách několika dalších čeledí. Typicky se zde jako fytoalexiny uplatňují při ochraně proti patogenům. Jejich důležitými prekurzory jsou isoflavony daidzein a formononetin. Hlavním zástupcem je kumestrol, jehož hlavními zdroji jsou slupky sójových bobů. Kumestrol je také hlavním estrogenem většiny pícnin - vojtěška (Medicago sativa), sója luštinatá (Glycine max), hrách setý (Pisum sativum), fazol obecný (Phaseolus vulgaris) a cizrna beraní (Cicer arietinum).  Lignany jsou skupinou fenolových sloučenin, řazených mezi tzv. fenylpropanoidy, složky rostlin odvozené od koniferylalkoholu a dalších skořicových alkoholů. 10

Nejvýznamnějšími estrogenními sloučeninami jsou secoisolariciresinol (SECO) a matairesinol (MAT). Tyto sloučeniny velmi snadno v savčím intestinálním traktu přechází na enterodiol a enterolakton, které vykazují estrogenní účinky. Jejich metabolická přeměna probíhá u savců relativně snadno. 2.1.1.1 Isoflavony Fytoestrogeny (třída isoflavonoidy, podtřída isoflavony) se řadí do skupiny flavonoidních látek [28] vykazujících různé biologické účinky. Výskyt isoflavonoidů, kterých je známo asi 200, se prakticky omezuje na luštěniny (čeleď bobovitých, Fabaceae), kam náleží např. sója luštinatá (Glycine max). V menším množství se isoflavonoidy vyskytují také v některých dalších rostlinných čeledích, např. laskavcovitých (Amaranthaceae), kosatcovitých (Iridaceae), morušovníkovitých (Moraceae) a růžovitých (Rosaceae). Hlavími představiteli isoflavonoidních látek jsou isoflavony (sloučeniny isomerní s isoflavony). Isoflavony a některé jejich deriváty se řadí mezi toxické látky, neboť vykazují estrogenní účinky (Obr. 2). Některé isoflavony vykazují také antimikrobiální a další biologické účinky [20].

Obr. 2: Porovnání struktury estradiolu (lidský estrogen) a isoflavonu (sekundární rostlinná látka ze sóje) 2.1.1.1.1 Forma isoflavonů Sója obsahuje tři hlavní isoflavonové fytoestrogeny. Daidzein (7,4-dihydroxyisoflavon), který je nejaktivnějším estrogenním isoflavonem, genistein (7,4-dihydroxy-6methoxyisoflavon) a v malém množství také glycitein (7,4´-dihydroxy-6-methoxyisoflavon) [29]. Chemická struktura těchto látek je uvedena v tabulce 1. Z dalších jsou to biochanin A, (5,7-dihydroxy-4´-methoxyisoflavon) a formononetin (7-hydroxy-4´-methoxyisoflavon). Naklíčené boby obsahují jako jeden z hlavních isoflavonů formononetin. Prekurzorem daidzeinu, formononetinu a glyciteinu je flavanon liquiritigenin (7,4-dihydroxyflavanon), prekurzorem genisteinu a biochaninu A je naringerin (5,7,4-dihydroxy-flavanon) [20]. Isoflavony se vyskytují převážně, jako 7--D-glykosidy. Glykosidem daidzeinu je daidzin, genisteinu genistin a glyciteinu glycitin [20]. Ve všech potravinách na bázi sóji jsou však tyto látky přítomny ve formě aglykonu (nekonjugované formy) nebo jako -glykosidy (konjugované formy), jak je uvedeno v tabulce 1 [28, 30]. Kromě těchto sloučenin se v menším množství vyskytují i acetylderiváty glykosidů, které jsou produkty dekarboxylace 11

příslušných malonylesterů [20]. Malonyl a acetyl glukosidy se vyskytují v menší míře, jelikož jsou velice citlivé na teplo, a proto se rychle formují na více stabilní -glykosidy [31]. Isoflavony se liší od ostatních flavonoidních látek tím, že boční aromatický B cyklus je připojen na pyronový systém v poloze 3, nikoliv v poloze 2, jak je to běžné u klasických flavonoidů. A právě tato strukturní změna významně mění biologickou aktivitu těchto látek [32]. Tab. 1: Struktura isoflavonů a jejich glykosidů [28, 33] Aglykon

R1

R2

R3

Daidzein

–H

–H

–OH

Genistein

–OH

–H

–OH

Glycitein

–H

–OCH3 –OH

Formononetin

–H

–H

–OCH3

Biochanin A

–OH

–H

– OCH3

Glukosid

R4

R5

R6

Daidzin

–H

–H

–H

Genistin

–H

–H

–H

Glycitin

–H

–OCH3 –H

Acetyldaidzin

–H

–H

–COCH3

Acetylgenistin

–OH

–H

–COCH3

Acetylglycitin

–H

–OCH3 –COCH3

Malonyldaidzin

–H

–H

–COCH2COOH

Malonylgenistin

–OH

–H

–COCH2COOH

Malonylglycitin

–H

–OCH3 –COCH2COOH

2.1.1.1.2 Výskyt isoflavonů Celkový obsah isoflavonů v sójových bobech se pohybuje v širokých rozmezích od zhruba 0,13 % do 0,42 %, v mouce jich bývá kolem 0,2 %, v sójových izolátech asi 0,06-0,10 % a v koncentrátech 0,07 %. Aglykony se dokonce vyskytují v kyselých hydrolyzátech sójových šrotů typu polévkového koření. Obsah jednotlivých isoflavonů a jejich derivátů v sójových bobech a sójových výrobcích je uvedeno v tabulce 2 [20]. Estrogenní isoflavony se kromě sóje vyskytují také v dalších rostlinách, ale v podstatně menším množství. Např. v semenech podzemnice olejné se nachází asi 0,50 mg/kg daidzeinu a 0,83 mg/kg genisteinu (volných i vázaných jako glykosidy aj. deriváty), v semenech slunečnice 0,08 mg/kg daidzeinu a 0,14 mg/kg genisteinu, v semenech máku 0,18 a 0,07 mg/kg těchto isoflavonů. Formononetin je také hlavním isoflavonem některých pícnin. Např. v jeteli lučním (Trifolium pratense) z čeledi bobovitých (Fabaceae) bývá v množství 1-30 g/kg sušiny. Minoritní isoflavony pícnin jsou rovněž sloučeniny genistein, daidzein a biochanin A [20].

12

Tab. 2: Obsah isoflavonů a jejich derivátů v sójových bobech a sójových výrobcích v mg/kg [20] Glukosid

Produkt

Malonát

Aglykon

Acetát

Dain

Gein

Glin

Da

Ge

Gl

Dain

Gein

Glin

234

326

60

10

11

19

121

290

58

-

-

-

-

-

-

-

-

-

637

888

66

28

30

22

690

1756

72

147

407

41

4

22

19

261

1023

57



137

34

11

36

25

18

88

-

-

-

-

-

-

-

88

301

49

63

136

53

Koncentrát



18

31

0

0

Tofu

25

84

8

46

Tempeh

2

65

14

0

96

-

-

Boby Mouka Izolát

Miso

Dain

Gein

Glin

2

25

-

-

5

33



1

32

36

6

0

33

-

-

-

-

-

20

100

39

74

215

46

23

0



0



1

0

52

12

159

108

0

8

1

29

137

193

24

255

164

0

11

0

0

18

34

93

15

-

-

-

-



19 0

0

-

2 1

-

0

72 123 21 271 183 54 22 11  stopy; Da – daidzein; Ge – genistein; Gl – glycitein; Dain – daidzin; Gein – genistin; Glin – glycitin

2.1.1.1.3 Reakce a změny Isoflavony přecházejí prakticky beze změn z bobů do sójové mouky. Při namáčení sójových bobů dochází zhruba ke ztrátě 11 % isoflavonů výluhem, ztráty při vaření činí asi 50 % původního obsahu. Asi 40 % isoflavonů se ztrácí při extrakci alkáliemi během výroby bílkovinných izolátů. V kyselých hydrolyzátech sójových šrotů jsou přítomny pouze hydrolýzou vzniklé aglykony isoflavonů [20]. 2.1.1.2 Biologické účinky fytoestrogenů Estrogeny jsou pro organismus zároveň užitečné i škodlivé. Endogenní estrogen savců estradiol je nezbytný pro normální vývoj a reprodukci organismu a ovlivňuje také další důležité děje související s imunitním systémem, centrální nervovou soustavou aj. Současně je však dáván do souvislosti s rakovinou mléčných žláz, konečníku a asi také prostaty [20]. Účinky dalších estrogenů jsou stále předmětem diskusí. Fytoestrogeny sice vykazují o několik řádů nižší estrogenní aktivitu než estradiol, ale vzhledem k množství, v jakém se konzumují, jsou zřejmě příčinou neplodnosti u samců a potratů u samic skotu [20]. U žen živících se potravou bohatou na fytoestrogeny byly pozorovány nepravidelnosti menstruačního cyklu. Na druhé straně byla u populace s vysokým příjmem isoflavonů ze sóje (v některých asijských zemích) pozorovány menší incidence rakoviny prsu a rakoviny prostaty u mužů. Fytoestrogeny obecně účinkují aditivně. Je-li hladina endogenních (steroidních) estrogenů nízká (běžně u zvířat), fytoestrogeny se spolu s nimi váží na příslušné 13

receptory. Je-li hladina steroidních estrogenů vysoká (běžně u žen), působí fytoestrogeny antagonisticky (jako antiestrogeny) [20]. Isoflavony vykazují kromě estrogenní aktivity také poměrně značnou antioxidační aktivitu, která však vyžaduje přítomnost dvou hydroxylových skupin (na C-7 a C-4), jako má daidzein, který je proto nejaktivnějším oxidantem. Aktivita aglykonů je vyšší než aktivita glykosidů, obecně však isoflavony vykazují nižší antioxidační aktivitu než odpovídající flavony. Isoflavony jsou hlavní měrou zodpovědné také za svíravou a hořkou chuť sójových výrobků [20].

2.1.2 Metabolismus fytoestrogenů Schopnost produkovat metabolity fytoestrogenů závisí na kolonizaci střeva určitými bakteriálními kmeny, které jsou však přítomny pouze asi u 30–50 % lidské populace [34, 35, 36, 37, 38]. U zvířat je však schopnost produkovat tyto metabolity běžná [39]. Potraviny živočišného původu tedy mohou v podobě tzv. funkční potraviny představovat zdroj metabolitů fytoestrogennů pro humánní výživu, především pak ekvolu (metabolitu daidzeinu), který vykazuje významné biologické účinky [26]. Metabolismus fytoestrogenů u zvířat a člověka je blíže popsán níže. 2.1.2.1 U zvířat Metabolismus fytoestrogenů byl poměrně dobře popsán u různých druhů zvířat včetně ovcí a skotu [10]. V průběhu trávení přijaté rostlinné potravy jsou daidzein a genistein přeměňovány bachorovými mikroorganismy na ekvol a p-ethylfenol (Obr. 3) [40]. Metabolit p-ethylfenol je biologicky neaktivní [10] a ekvol naopak vykazuje značné estrogenní účinky [41]. Také dva prekurzory isoflavonů přítomné v červeném jeteli, jmenovitě biochanin A a formononetin (Obr. 3) [42], jsou metabolizovány v bachoru přežvýkavců na genistein resp. daidzein. Formononetin v bachoru přežvýkavců (stejně i při silážování krmiv a v zažívacím traktu člověka, neboť se nachází také v moči žen po konzumaci výrobků ze sóje) přechází působením bakterií po hydrolýze cukru na aglykon a dále via daidzein na estrogenní produkt ekvol (7,4-dihydroxyisoflavan). Z ekvolu vzniká částečně O-demethylangolensin (O-DMA). Jako vedlejší produkt vzniká z formononetinu angolensin a 4-methylekvol, ze kterého vzniká vedlejší cestou ekvol. Ekvolu vzniká zhruba 70 %, z 5-20 % se tvoří O-demethylangolensin, minoritním produktem je 4-methylekvol a angolensin. Biochanin A se rozkládá na genistein, ten na dihydrogenistein, z něhož vzniká 4-ethylfenol a další jednoduché produkty. Tyto sloučeniny se vylučují močí [20].

14

Obr. 3: Isoflavony a jejich metabolity [33] Mnoho studií u zvířat, zahrnujících myši, krysy, křečky, krávy, prasata, ovce, psy, opice a šimpanze [39, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50] naznačily, že všechna zvířata mají schopnost produkovat ekvol. Málo studií hodnotilo u zvířat produkci O-DMA, jako je tomu u lidí. Např. v několika studiích [43, 47, 51] měřili produkci O-DMA v plazmě, výkalech a moči opic a šimpanzů, ale zdá se, že je produkován ve výrazně menším množství než ekvol [47]. 2.1.2.2 U člověka Biologická aktivita fytoestrogenů u člověka není doposud plně známa, ale jednotlivé glykosidy zcela jistě nejsou estrogenně aktivní [33]. Glykosidy jsou rychle hydrolyzovány na estrogen-aktivní aglykony, buď jako výsledek výroby a přípravy sójových potravin nebo jako výsledek metabolismu střevní mikroflóry [30]. Genistein je dále metabolizován ve střevě na neaktivní p-ethylfenol, a daidzein na ekvol, dihydrodaidzein a O-DMA [52]. Metabolit daidzeinu  ekvol, může mít významné biologické účinky, má vysokou antioxidační aktivitu v porovnání s jinými fytoestrogeny a je často přítomen ve vysoké koncentraci v krvi a moči lidí. Metabolická cesta je shrnuta v obrázku 4 [26].

15

Obr. 4: Absorpce, metabolismus a exkrece isoflavonoidů [26] Ačkoliv fytoestrogeny mohou být měřeny v moči, plasmě, výkalech, spermatu, žluči, slinách a mateřském mléku, koncentrace jejich metabolitů se velmi liší mezi jednotlivci dokonce i po regulování kvantity potravinových doplňků [53]. Je to díky mnoha faktorům, jako např. střevní mikroflóra, užívání antibiotik, střevní onemocnění, odlišné pohlaví a doprovodný dietní příjem [34, 54, 55]. Mnohé studie prokázaly značné rozdíly mezi jednotlivci, přibližně 30-50 % populace je schopno produkovat z daidzeinu ekvol [34, 35, 36, 37, 38] a přibližně 80-90 % O-DMA [36, 38, 56]. Zvláštní skupinu tvoří malé děti s nedostatečně vyvinutou střevní mikroflórou, které nejsou schopny produkovat z daidzeinu ekvol ani O-DMA [57, 58]. Metabolismus daidzeinu může být snadno ovlivnitelný mnoha bakteriemi, např. Clostridium sp. [59] a Eubacterium ramulus [60, 61] metabolizujícími daidzein na O-DMA in vitro. Dále ekvol může být nalezen v sójovém mléku fermentovaném některými druhy Bifidobacterií [62]. Také další bakterie, jako Escherichia coli, Bacteroides ovatus, Ruminococcus productus a Streptococcus intermedius [63] mohou ovlivnit metabolismus 16

daidzeinu. Nicméně, lidské střevní bakterie zodpovědné za metabolismus daidzeinu nebyly doposud zcela identifikovány.

2.1.3 Hlavní zdroje fytoestrogenů Isoflavony jsou taxonometricky rozšířeny v přírodě jen úzce, a to především v rostlinách vikvovitých (Viciaceae) [64]. Jejich nejbohatším zdrojem je sója luštinatá, jejíž konzumace je rozšířena v zemích Asie, hlavně v Číně a Japonsku [24] a v malém množství také v zemích západní populace, jako jsou severní Amerika a Evropa [65, 66]. V České republice se fytoestrogeny v přírodě vyskytují nejvíce v červeném jeteli (Trifolium pratense) a vojtěšce v době květu a v jejich naklíčených semenech [24]. Dále se fytoestrogeny vyskytují v některých léčivých rostlinách, jako je kručinka barvířská (Genista tinctoria) a janovec metlatý (Sarothamnus scoparius) [64]. Důležitým a tradičním zdrojem fytoestrogenů jsou také různé druhy ploštičníku, červená vinná réva, obilniny, rýže, jahody, rybíz, česnek, lékořice, datle, káva, mateří kašička a pyl. Fytoestrogeny jsou fytoalexiny, které jsou tvořeny v hostitelské rostlině při odezvě na fyziologické nebo biologické podněty a mají vlastnosti, které zvyšují přežití rostliny (tzn. protiplísňové, antimikrobiální a antioxidační). Z tohoto důvodu koncentrace sójových fytoestrogenů značně roste v období stresu (např. snížená vlhkost) a je značně ovlivněna klimatickými podmínkami okolního prostředí (teplota, množství srážek, období sklizně, úrodnost půdy aj.). Mezi další faktory ovlivňující jejich koncentraci patří také typ kultivaru, ataky škůdců a choroby rostlin, které se mohou v průběhu růstu rostliny vyskytnout. Stejně tak i posklizňové vlivy, jako je uskladnění a následné techniky zpracování mohou ovlivnit koncentraci fytoestrogenů u rostlin [67]. V potravinářských výrobcích se fytoestrogeny nachází v sójových výrobcích, rostlinných olejích (hlavně ve lněném oleji), celozrnném pečivu, ale též v pivu (více fytoestrogenů pochází ze sladu než z chmelu), červeném víně a burbonu [24]. Fytoestrogeny jsou také významnou součástí potravy prostřednictvím doplňků stravy [32]. V České republice je na trhu řada preparátů obsahujících fytoestrogeny (např. Isoflavone, Estrovone, Menoflavon), které jsou v mnohých případech obohaceny i přídavkem vitaminů a minerálů [24]. 2.1.3.1 Sója luštinatá (Glycine max (L.) Merr.) Sója luštinatá (Obr. 5) je kulturní rostlina pocházející z jihovýchodní Asie (Číny). Podle různých zdrojů je původ sóji datován asi do období 1000-2000 let př. n. l. Do Evropy a Ameriky se dostala v 18. století. Na počátku se využívala převážně jako krmivo pro hospodářská zvířata. Později začala být využívána v potravinářském průmyslu (potravinářský olej, proteinové výrobky a zelenina) a jako surovina pro průmysl (barviva, inkousty, lepidla a pěny) [68]. Botanicky je sója jednoletá, krátkodenní bylina, vysoká asi 1 m, hustě ochlupená a dosti rozvětvená s trojčetnými listy a malými bílými až fialovými květy. Plody jsou lusky s několika vejcovitými, lesklými, obyčejně žlutými semeny (Obr. 5). Vedle 35 % bílkovin, 18-20 % tuků, 14-25 % sacharidů, vlákniny, popelovin a lecitinu rostlina obsahuje tři hlavní isoflavonové fytoestrogeny daidzein, genistein a glycitein [29]. 17

Výjimečné postavení sóji mezi luštěninami je dáno chemickým složením semen. Semena jsou potravinou a jedním z nejlevnějších zdrojů bílkovin ve světě a obsahují 15 až 25 % oleje, který je složen zejména z esterů kyseliny linolové (50 %), olejové (25-30 %) a linoleové (210 %) a menší množství kyseliny stearové, palmitové a arachidonové. Ze sacharidů sója obsahuje sacharosu a nestravitelné oligosacharidy rafinosu a stachytosu. Z vitamínů jsou v sóji ve významném množství vitamíny skupiny B a E, z minerálních látek pak vápník, hořčík a železo [69]. Dále sója obsahuje významné sekundární metabolity (flavony, isoflavony, kumestrany a lignany).

Obr. 5: Sója luštinatá (Glycine max (L.) Merr.) 18

2.1.4 Zdravotní účinky fytoestrogenů Fytoestrogeny jsou látky, které se dostávají do organismu přímo s rostlinnou stravou nebo jako metabolity látek rostlinného původu. Mají mírnou estrogenní aktivitu, jsou obecně rozpustnější než estrogeny a nekumulují se ve tkáních. I při relativně nízké aktivitě (cca 1000krát menší než aktivita estradiolu) mohou fytoestrogeny účinně působit v organismu. Při dostatečném perorálním podávání fytoestrogenů může být jejich hladina v séru až 10.000krát vyšší než hladina endogenních estrogenů (E2) [24]. Mnoho prací z poslední doby dokládá, že konzumace potravin (krmiv) s obsahem sóji bohaté na sójové fytoestrogeny má vliv na zdraví člověka i zvířat. 2.1.4.1 Účinky fytoestrogenů u zvířat Vliv fytoestrogenů na zdravotní stav zvířat je intenzivně sledován v souvislosti s reprodukcí, kdy dochází především k poruchám říjového cyklu [70]. Bližší informace, stejně tak i o účincích na produkci, jsou uvedeny dále v textu. 2.1.4.1.1 Účinky na reprodukci Mnohá pozorování prokázala negativní vliv sójových fytoestrogenů na samice zvířat. Bylo např. potvrzeno, že samice zvířat žijící v zajetí a krmená sójou nemohou zabřeznout. Déle také, že ovce pasoucí se na určitém druhu červeného jetele jsou neplodné. Všechny tyto závěry vedly k úvaze, že vysoký obsah fytoestrogenů v těchto rostlinách působí u vyšších živočichů, jako endogenní estrogeny [71]. Woclawek-Potocka s kolektivem ve své studii [8] zjistili, že sójové fytoestrogeny a jejich metabolity vystupují v organismu krav jako faktory narušující endokrinní prostředí a způsobují tak poruchy v reprodukčních procesech a dočasnou neplodnost krav. Fytoestrogeny mohou působit antagonisticky nebo agonisticky k endogenním estrogenům [72]. Ovlivňují průběh říjového cyklu u přežvýkavců tím, že ovlivňují syntézu prostaglandinů [70]. Inhibice produkce endogenních estrogenů může vést k poruchám vývoje folikulů [73]. Podle vědeckého kolektivu Woclawek-Potocky [74] fytoestrogeny a jejich aktivní metabolity narušují u skotu poměr prostaglandinů PGE2 k PGF2α, což ve svém důsledku vede k nefyziologické produkci luteolytických hormonů během estrálního cyklu a v březosti. Fytoestrogeny mohou rovněž inhibovat sekreci luteotropního hormonu (LH) v hypofýze, to pak vede ke snížení produkce progesteronu, které pak může u březích zvířat zapříčinit zvýšený výskyt abortů [75]. Mohou se projevit inhibice sekrece živočišných estrogenů, tím je narušena ovulace, pohyb vajíček ve vejcovodu, vzniká nepravá říje nebo nepravá březost a objevují se degenerativní změny pohlavního ústrojí. Dostavují se nepravidelné intervaly mezi říjemi, dlouhodobá říje (nymfomanie), nadměrná sekrece hlenu, překrvení děložní sliznice, na vaječnících se objevují cystické znetvořeniny folikulu, současně se zvyšuje kontrakce dělohy a vejcovodu. Snižuje se transport vajíček a omezuje se možnost oplodnění. Stupeň působení estrogenu na organizmus se liší podle jednotlivých zvířat, přijaté dávky a doby expozice. Celkově lze říci, že za spoluúčasti i dalších faktorů zapříčiňujících výše uvedené projevy, tyto látky mohou vykázat určité riziko [32]. 19

2.1.4.1.2 Účinky na produkci Mladé porosty rostlin (např. jetele lučního) s vysokou fytoestrogenní aktivitou vykazují galaktogenní účinky, zvyšuje se jak množství mléka, tak jeho tučnost, zvyšuje se také množství prolaktinu produkovaného hypofýzou, nezabřezlým jalovicím se na pastvě mocně vyvíjí vemeno, beranům se účinkem formononetinu prodlužují prsní bradavky a dokonce se objevuje tekutina připomínající mléko [32]. 2.1.4.2 Účinky fytoestrogenů u člověka U člověka byla pozorována řada pozitivních účinků sójových fytoestrogenů v souvislosti s přijatou potravou. Bylo prokázáno, že isoflavony vyskytující se ve vysokých koncentracích v tělních tekutinách, ovlivňují metabolismus pohlavních hormonů a biologické aktivity, stejně jako intracelulární a steroidní metabolické enzymy, syntézu proteinů, růstový faktor, maligní buněčné proliferace, angiogenezi, transport vápníku, Na+/K+ATPázu, buňky hladké svaloviny cév, oxidaci lipidů, imunitní systém a diferenciaci buněk. Tyto vědecké závěry tvoří z těchto látek silné kandidáty v boji proti rakovině, ale i jiným degenerativním onemocněním, jako je ischemická choroba srdeční a možná i osteoporóza [1, 76]. Fytoestrogeny snižují riziko rakoviny prsu [2] a působí v organismu jako antioxidanty. Kromě toho byla prokázána také řada pozitivních účinků sójových fytoestrogenů na zdravotní stav u žen v menopauze, jako je např. snížení rizika kardiovaskulárních nemocí [3, 77], rakoviny [78], atherosklerózy [4] nebo osteoporózy [5]. 2.1.4.2.1 Isoflavonoidy a epidemiologie rakoviny prsu Myšlenka, že isoflavonoidy ze sójových výrobků mohou zabránit rakovině prsu [35, 79, 80] vedla k četným studiím vedoucím k rozluštění této hypotézy [1]. Isoflavonoidy v plazmě či moči, jsou dobré biomarkery příjmu sójových výrobků, i když jejich přítomnost vždy nemusí nutně znamenat, že se jedná o složky účinné, v prevenci rakoviny prsu. Je pravděpodobné, že některé sloučeniny jednají ve shodě s isoflavonoidy, a že složení stravy s ohledem na mastné kyseliny, živočišné a rostlinné bílkoviny, sacharidy a vlákninu také hrají důležitou roli v léčbě rakoviny prsu [81, 82]. V roce 1996 bylo prokázáno, že vysoký příjem tofu, sójových proteinových výrobků s vysokým obsahem isoflavonů u Asio-Američanů snížil riziko rakoviny prsu u sledovaných pre- i post- menopauzálních žen [83]. V souvislosti s přijatou potravou byli sledováni také vegetariáni, kteří ve srovnání s všežravci, mají prokazatelně vyšší úroveň isoflavonoidů v plazmě i moči [84] a riziko vzniku onemocnění pak může být z tohoto důvodu potlačeno. Obdobný projev byl potvrzen také u šimpanzů držených v zajetí, kteří jsou velmi odolní proti rakovině prsu a zároveň vylučují ohromná množství isoflavonoidů močí [85], přičemž relativní množství ekvolu jsou velmi vysoká. 2.1.4.2.2 Isoflavonoidy a epidemiologie rakoviny prostaty I přes stejný výskyt karcinomů prostaty v Japonsku i západních zemích, je úmrtnost v Japonsku s ní spojována nízká. V roce 1985 byla provedena studie, při které se sledovaly fytoestrogeny v moči Japonských obyvatel žijících v obci mimo Kyoto. Byly detekovány velmi vysoké koncentrace isoflavonoidů, které zastavují růst latentní rakoviny, což mohlo pozitivně ovlivnit tehdejší nízkou úmrtnost na rakovinu prostaty [81, 86].

20

Z epidemiologických studií je zřejmé, že např. tuk a maso prokazují pozitivní a obiloviny negativní asociaci v souvislosti s úmrtností na rakovinu prostaty [87]. Nižší riziko vzniku rakoviny prostaty bylo zjištěno u mužů Adventistů [88], kteří mají vysokou spotřebu fazolí, čočky, hrachu a některých druhů sušeného ovoce (všechny potravinové zdroje flavonoidů) a u mužů, kteří měli japonské předky konzumující hodně rýže a tofu [89]. Epidemiologické studie ukazují, že faktory životního prostředí, jako je strava v pozdějších letech může podstatně ovlivnit pravděpodobnost vzniku klinicky zjistitelné rakoviny prostaty [90]. Porovnáním stravy bohaté na sóju, nízký obsah tuku a minimální množství zvířecího proteinu a západní stravy bylo prokázáno jasně zvýšené riziko rakoviny prostaty. Podle zjištěných výsledků je koncentrace isoflavonoidů v moči a plazmě mužů žijících v severní a střední Evropě nízká, v plazmě Finů je průměrná hodnota pro genistein a daidzein asi 5 nmol/l. 2.1.4.2.3 Fytoestrogeny a epidemiologie rakoviny tlustého střeva V roce 1984 bylo zjištěno, že fytoestrogeny mohou mít ochranné účinky v souvislosti s rakovinou tlustého střeva [80] a v pozdějších letech to bylo také potvrzeno. U vegetariánů byla nejvyšší koncentrace zjištěna 9,2 nmol ekvolu na gram výkalů. Bylo prokázáno, že všechny fytoestrogeny byly nekonjugované a biologicky aktivní. Několik dalších experimentálních studií na hlodavcích a buněčných studií názor, že fytoestrogeny mohou snížit riziko rakoviny tlustého střeva [1, 91], také podpořila. 2.1.4.2.4 Fytoestrogeny a epidemiologie ischemické choroby srdeční Ischemická choroba srdeční (ICHS) je typická západní nemoc a strava hraje důležitou roli v jejím vývoji. V asijských zemích je její výskyt mnohem nižší než v Evropě nebo USA. Účinek sóji přijaté potravou na snížení plazmatických lipidů [92] byl dobře znám již dříve. Četné studie prokázaly snížené riziko kardiovaskulárních chorob u žen léčených po menopauze estrogeny, které vykazují příznivý vliv na hladiny lipidů plazmy a riziko infarktu myokardu. Logickým důsledkem toho je, že to mohou být fytoestrogeny sóji, které jsou alespoň částečně příčinou možného preventivního účinku sóji s ohledem na ICHS [81]. Nedávné studie naznačují, že isoflavony jsou hlavně odpovědné za pozitivní účinky [93]. Nízký výskyt ICHS v zemích jako je Japonsko, s vysokým příjmem sóji, tuto hypotézu potvrzuje. 2.1.4.2.5 Fytoestrogeny u dětí Skutečný obsah isoflavonů v dětské stravě obsahující sóju nebyl doposud příliš dobře prostudován. Tyto potraviny jsou vyráběny ze sójových izolátů, které obsahují isoflavony genistein a daidzein. Setchell a kol. ve své studii [94] pozorovali obsah fytoestrogenů dvou typů kojenecké výživy ze sójového mléka: ProSobee  17,1 mg/g daidzeinu a 21,8 mg/g genisteinu a Isomil  19,1 mg/g daidzeinu a 22,6 mg/g genisteinu. Irvine s kol. [95] došli k závěru, že množství sójových potravin doporučených výrobci pro dětskou výživu poskytne příjem fytoestrogenů (na kg tělesné hmotnosti) přibližně 3krát až 5krát větší než množství daidzeinu a genisteinu, které narušuje menstruační cyklus premenopauzálních žen [96]. Metabolismus isoflavonů u kojenců není dobře sledovaný vzhledem k etické povaze, a proto je obtížné provádět metabolické studie na kojencích, ale např. ve studii syntézy 21

cholesterolu u kojenců Cruz a kol. [57] zjistili, že kojenci krmení potravou obsahující sóju vylučují podstatně větší množství isoflavonů močí než děti krmené mateřským nebo kravským mlékem. To znamená, že dítě krmené potravou obsahující sóju absorbuje a vylučuje dietární fytoestrogeny. Biologická dostupnost isoflavonů se může lišit mezi sójovým a mateřským mlékem, protože isoflavony jsou v mateřském mléce ve formě glukuronidových konjugátů, zatímco v sójovém mléce, jako glykosidové konjugáty [97]. Některé výsledky výzkumu poukazují na možná potenciální rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravě kojenců a malých dětí, kde může být příjem fytoestrogenů v potravě nežádoucí [12]. 2.1.4.3 Účinky fytoestrogenů u rostlin U rostlin je funkce fytoestrogenů odlišná od úlohy estrogenů u živočichů. Netýká se funkce rozmnožovací, ale u rostlin plní funkci ochrannou a obrannou. Posilují imunitu rostliny, mají antioxidační vlastnosti, chrání rostlinu před patogeny – mají vlastnosti antiparazitární, antivirové, antibakteriální a fungistatické. Brání tvorbě nových cév (angiogenezi), což je vlastnost důležitá v boji se zhoubnými nádory [71].

2.2

FAKTOTY OVLIVŇUJÍCÍ OBSAH FYTOESTROGENŮ

Obsah fytoestrogenů v krmivu i potravinách je ovlivňován mnoha fyzikálními, chemickými i mechanickými faktory, které jsou součástí technologických postupů při jejich zpracování. Dochází k trvalému snižování fytoestrogenů nebo k jejich chemické přeměně [22, 32].

2.2.1 Fytoestrogeny v krmivu Významným faktorem ovlivňujícím koncentraci isoflavonů přijatých krmivem je proces zpracování základní suroviny. Např. při sušení jetelů nebo vojtěšek se snižuje hladina isoflavonů až o 80 % (mezní hodnota), protože pomalé mortální procesy navozují rozklad těchto látek (o flavonoidech je známo, že jsou při sušení relativně málo stabilní a rozkládají se v důsledku účinku polyfeloxidásového systému). Naopak při horkovzdušném sušení do 100 °C zůstává zachována prakticky plná aktivita. Látky zůstávají v píci jak ve formě aglykonu, tak ve formě glykosidu, ty se rozkládají až v zažívacím traktu zvířat. Silážováním se estrogenní aktivita zvyšuje o desítky až stovky procent, estrogenní aktivita siláže je nerovnoměrná v rámci silážních jam a kromě toho může přetrvat relativně dlouhou dobu (může docházet ke vzniku látek de novo, stejně tak jako v bachorovém systému prežvýkavců). Příjem takovéhoto typu krmiva pak může u zvířat vyvolat hyperestrogenizmus [32].

2.2.2 Fytoestrogeny v potravinách Ať už jsou isoflavony považovány za zdraví prospěšné nebo škodlivé, jejich teplotní stabilita je zcela jistě klíčovým faktorem ke stanovení podmínek zpracování a stanovení trvanlivosti sledovaných produktů. Je všeobecně akceptováno, že isoflavony se neničí záhřevem, ale že naměřené ztráty isoflavonů jsou spíše předmětem jejich konverze v jiné

22

formy [30, 98, 99, 100, 101]. Tento názor je založen především na porovnání profilu isoflavonů odlišných sójových potravin, vzhledem k uvažovanému hlavnímu kroku zpracování. Např. Coward a kol. [102] popsali, že většina asijských a amerických sójových produktů, které hodnotili (např. tofu), kromě zředěných (sójové mléko, sójový sýr), měla podobný obsah celkových isoflavonů, jako sójové boby (s výjimkou sójové omáčky, alkoholem extrahovaných sójových proteinových koncentrátů, izolátů sójových proteinů a jejich derivátů). V nefermentovaných potravinách byly isoflavony přítomny téměř výhradně ve formě glukosidů, zatímco ve fermentovaných potravinách velká část isoflavonů byla přítomna ve formě nekonjugované. Byl také potvrzen následek hydrolýzy glukosidické vazby -glukosidázou v závislosti na působení fermentačních mikroorganismů [103]. Barnes a kol. [31] zaznamenali, že hlavní isoflavonové formy nalezené v odlišných sójových potravinách, jsou: odtučněná sójová moučka – především malonyl- formy, sójová melasa a tofu – téměř výlučně -glukosidy, sójová mouka a izolované sójové proteiny – významné množství acetylforem. Protože acetyl-glukosidy jsou prakticky nepřítomny v sójových extraktech, ale jsou ve velkém množství přítomny v pečené mouce, konstatovali, že acetyl glukosidy jsou formovány dekarboxylací malonyl glukosidů v průběhu procesu sušení využitém k výrobě tohoto produktu. Podobné výsledky byly posány také v další studii [104], ve které navíc popsali i vliv pečení a smažení. Ve všech případech nenašli významné změny ve složení celkových isoflavonů, ale prokázali, že malonyl-glukosidy klesaly, zatímco byl odpovídající nárůst -glukosidů v případě pečení nebo nárůst acetyl-glukosidů a aglykonů v případě smažení. Z předcházející diskuse plyne, že koncentrace celkových isoflavonů není změněna podmínkami termického procesu a častá přeměna malonyl-glukosidů na acetyl-glukosidy nebo -glukosidy je možná v rámci vnitřní konverze (Obr. 6), ačkoliv mohou vznikat i další reakce, především ve studiích, kde vnitřní konverze nebyla ekvimolární. Tato hypotéza může být ale neplatná, pokud jsou isoflavony zahřívány k vyšším teplotám či delší dobu, než je tomu za běžných výrobních podmínek [22].

Obr. 6: Souhrn chemických změn uvedených v literatuře, které odpovídají za vnitřní konverze mezi různými skupinami isoflavonů při tepelném zpracování [22]

23

2.3

ANALÝZA FYTOESTROGENŮ

Sójové boby byly poprvé použity ke stanovení obsahu isoflavonů před více než 50 lety, přičemž genistin byl izolovaný v krystalické formě z 90% methanolového extraktu a kyselá hydrolýza ukázala možnost detekce také genisteinu, jeho aglykonu. První zprávou, která prezentovala kvantitativní data koncentrace isoflavonů publikoval Naim s kol. v roce 1974 [105]. Od této doby, mnoho dalších vědecko-výzkumných týmů vyprodukovalo velké množství studií založených na stanovení isoflavonů v sójových bobech a v dalších luštěninách. Publikované studie poukazují převážně na obrovskou variabilitu a složení mezi odlišnými sójovými produkty, jejich funkci a specifickou odlišnost v závislosti na geografických a environmentálních podmínkách, stejně jako i vlivu zpracovatelského průmyslu [106].

2.3.1 Extrakce a separace fytoestrogenů Zástupci třídy flavonoidů se v potravinách vyskytují převážně ve směsi glykosidů a esterů glykosidů. Ačkoliv byly doposud identifikovány pouze některé sacharidové konjugáty isoflavonů, je velice pravděpodobné, že existují i další formy. Analýzy těchto látek vyžadují komplikované procedury zahrnující vhodné extrakční a separační kroky, které předcházejí vlastní detekci a kvantifikaci. Převážně, v případě konjugátů, jsou mnohdy isoflavony extrahovány z potravin (především sójového původu) pomocí horkého polárního rozpouštědla, jako je methanol nebo acetonitril, buď prostým mícháním či s využitím techniky Soxhletovy extrakce. Tyto metody vedou k identifikaci aglykonů a konjugátů βgykosidů, jako hlavních složek extrakce. Další konjugáty glykosidů, jako např. 6‘‘-O-acetyla malonyl- glykosidy, byly také identifikovány. Jednodušší cestou vedoucí k analýze isoflavonoidů je hydrolýza konjugátů a následné stanovení aglykonů. Rozdíly mezi odlišnými rozpouštědly a enzymatickou či kyselou hydrolýzou isoflavonů byly úspěšně pozorovány v několika studiích, přičemž nejčastěji byly použity následující enzymy: glukosidázy (např. z mandlí), β-glukuronidázu z Helix pomatia, sulfatázu a další enzymy nebo také celulázy z plísně Aspergillus niger [106]. Příprava vzorku často zahrnuje také další postupy, jako je extrakce vhodným rozpouštědlem, centrifugace a velice často také odpaření rozpouštědla a zpětné rozpuštění v konečném rozpouštědle. Jelikož analýzy isoflavonů jsou často používány pro vzorky tradičních sójových potravin, plazmy a moči, pak aplikace stávajících metod na nové produkty často vyžaduje modifikace a další kroky purifikace, jakými je např. technika extrakce pevnou fází (SPE). 2.3.1.1 Extrakce pevnou fází Extrakce pevnou fází (Solid Phase Extraction – SPE) je v současné době často používaná technika dostupná pro rychlou a selektivní přípravu vzorku. Její podstatou je zachycení molekul látky a tuhém sorbentu, přes který protéká vzorek. Při extrakci se využívá chemických vlastností molekul, které v důsledku mezimolekulárních interakcí ulpívají na sorbentu. Proto lze extrakci pevnou fází nazvat také chemická filtrace.

24

SPE nabízí mnoho výhod oproti tradičním separačním technikám, mezi které patřila především extrakce v soustavě kapalina – kapalina, a to především dobrou selektivitu a úsporu organických rozpouštědel. Základem této techniky je upotřebení kolonek na jedno použití o nejrůznějších velikostech a náplních sorbentů. Princip SPE techniky je následující [107]:  kapalný vzorek je veden přes SPE kolonku a sloučeniny jsou ze vzorku zachyceny materiálem sorbentu v koloně  nežádoucí příměsi mohou být z kolonky selektivně odstraněny promytím vhodně zvolenými rozpouštědly  nakonec mohou být z kolonky žádoucí analyty znovuzískány elučním rozpouštědlem v podobě vysoce čistého extraktu, který má často podstatně vyšší koncentraci analytu než měl původní vzorek Alternativně může být extrakční kolonka vybrána k tomu, aby zadržovala příměsi ze vzorku, ale analytům dovolila projít. Sorbenty jsou tvořeny částicemi velikosti v průměru 50 m a kladou odpor protékající tekutině. Jsou v kolonce uzavřeny fritami z polyethylenu, případně oceli nebo polytetrafluorethylenu. Průtok kapalin vedených přes kolonku urychlujeme třemi metodami (Obr. 7):  vakuem na výstupu z kolonky  tlakem na vstupu z kolonky  centifugací

Obr. 7: Zajištění průtoku SPE kolonkou [107]

2.3.2 Detekce a kvantifikace fytoestrogenů Isoflavony byly ve značné části publikovaných studií separovány pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s reverzní fází (HPLC-RP) s využitím gradientové eluce, přičemž mobilní fáze byla tvořena převážně směsí methanolu nebo acetonitrilu a vhodné kyseliny nebo pufru. Setchell a kol. [94] ve své studii porovnali citlivost a spolehlivost UV, elektrochemické a termosprejové ionizace hmotnostní detekce u HPLC extraktu potraviny sójového původu. Hmotnostní detekce ve vybraném monitorovaném iontovém modu měla 25

stonásobně lepší citlivost než UV detekce. Značné výhody byly u hmotnostní detekce zaznamenány také v přesnější identifikaci stanovovaných komponent. Fluorescence a elektrochemická detekce prokázaly zvýšení citlivosti obvykle používaných UV detekčních metod. Barnes s kol. [31] poukázal na identifikaci sójových isoflavonů a jejich konjugátů pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí (HPLC-MS). Liggins a kol. [108] představili metodu pro extrakci a kvantifikaci daidzeinu a genisteinu z potravy založenou na plynové chromatografii s hmotnostní detekcí se selektivním sledováním iontů (GC-MS-SIM) a Aussenac s kol. [109] prezentoval ve své studii výsledky kapilární zónové elektroforézy analýzy isoflavonů sójového extraktu [106]. Mezi nejvíce používané instrumentální techniky bezesporu patří vysoce účinná kapalinová chromatografie s UV detekcí (HPLC-UV), ačkoliv patří mezi jedny z nejméně citlivých technik [110]. Např. plynová chromatografie (GC) je více pracná a je aplikována pouze na aglykony. Vysoce účinná kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrofotometrií (HPLC-MS) často vyžaduje velmi podobné přípravné procedury, ale je více nákladná a ne vždy je k dispozici. Wang a kol. [27] konstatovali, že vysoce účinná kapalinová chromatografie s reverzní fází spojená s UV detekcí prostřednictvím detektoru s diodovým polem (RP-HPLC-UV/DAD) je vhodná technika pro vzorky potravin obsahující více než 50 ppm nebo 200 nM fytoestrogenů a velikost vzorku menší než 1 g nebo 1 ml. Zvolení vhodné HPLC procedury a metody přípravy vzorku je těžký úkol. Tabulka 3 shrnuje některé z často používaných procedur pro analýzu isoflavonů. Tab. 3: Reverzní fáze vysoce účinné kapalinové chromatografie (RP-HPLC) s detekčními metodami UV analýzy pro sójové isoflavony v sójových výrobcích a potravních doplňcích [22]

Kolona, eluce C18, 250 x 4,6 mm, gradientová C18, 150 x 3,9 mm, gradientová C8, 220 x 4,6 mm, gradientová C18, 250 x 4,6 mm, gradientová C18, 250 x 3 mm, isokratická

Vnitřní standard THB Flavon Fluorescein

Equilenin

O-17G

C18, 250 x 4,6 mm nebo C18, 53 x 4,6 mm, gradientová

Apigenin

Analyzovaný materiál

Extrakční činidlo

Sójové potraviny

53% acetonitril

a doplňky

s HCl

Sójové potraviny a doplňky Tradiční sójové potraviny Doplňky isoflavonů

a extrakty Kravské mléko Izolát a koncentrát sójového proteinu

12 isoflavonů

80% methanol

12 isoflavonů

80% methanol

12 isoflavonů Daidzin, genistin,

80% methanol

daidzein, genistein

70% methanol

60% acetonitril

THB  2,4,4´-trihydroxydeoxybenzoine; O-17G  estradiol 17 glukuronid

26

Sledované látky

Daidzein, genistein, ekvol 12 isoflavonů

2.3.2.1 Vysoce účinná kapalinová chromatografie Vysoce účinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) se řadí, jak je uvedeno výše, mezi nejčastěji používané metody při separaci fytoestrogenů. Vyniká vysokou účinností, dobrou opakovatelností a robustností. Tato metoda je vhodná pro dělení netěkavých a polárních látek, jejichž analýza příbuznou plynovou chromatografií bývá často obtížná. HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi. K dělení dochází v separační koloně, která obsahuje stacionární fázi (sorbent) a mobilní fázi (eluent). Rozdílné analyty (dělené látky) mají rozdílnou afinitu ke stacionární fázi. Různé analyty podléhají různé distribuci (rozdělování) mezi mobilní a stacionární fází. Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány) [111]. Princip separace látek v koloně je patrný z obrázku 8.

Obr. 8: Princip separace (dělení) látek v koloně HPLC [111] Kapalinový chromatograf se skládá ze zásobníku mobilní fáze, směšovacího zařízení, vysokotlaké pumpy, injektoru, kolony, termostatu kolony, detektoru a vyhodnocovacího zařízení. Schematické znázornění zapojení jednotlivých komponent je znázorněno na obrázku 9.

27

Obr. 9: Schematické znázornění principu měření na HPLC [111] Detektory v HPLC se volí vždy tak, aby byly selektivní pro analyty a málo citlivé na mobilní fázi. Princip nejčastěji používaných detektorů, využívaných k detekci fytoestrogenů je následující [112]: Spektrofotometrický detektor (UV/VIS) Měří absorbanci eluátu v oblasti vlnových délek od 190 do 800 nm. Velikost odezvy je dána Lambert-Beerovým zákonem, který vyjadřuje vzájemný vztah mezi tloušťkou absorbující vrstvy, koncentrací absorbující složky a velikostí absorpce, tj. absorbance. Nejčastějším typem je detektor s diodovým polem (Diode Array Detector – DAD) Hmotnostně spektrofotometrický detektor Detekuje ionty, které vznikají ionizací analytů. Prvním krokem je převod analytů rozpuštěných v mobilní fázi na ionty v plynné fázi. V dalším kroku se ionty analyzují, tj. určuje se poměr hmotnosti k náboji (m/z). Iontové zdroje pracují za atmosferického tlaku, analyzátory za vakua. Tento detektor je univerzální a zároveň vysoce selektivní, citlivý. Umožňuje identifikaci analytů na základě jejich hmotnostních spekter.

2.4

SHRNUTÍ POZNATKŮ A ZÁVĚR

Jak již bylo v literárním přehledu uvedeno, rozsáhlý intenzívní výzkum účinku isoflavonů na zdraví člověka prováděný v posledních desetiletích se zabýval rozličnými farmakologickými a antioxidačními vlastnostmi těchto složek [1, 2, 3, 4, 5, 76, 77, 78]. Účinek isoflavonů však není stále jednoznačný. Podle posledních zjištění se ukazuje, že účinnost isoflavonů přinejmenším z části závisí na schopnosti přeměňovat daidzein na ekvol [10]. V publikovaných studiích in vitro bylo prokázáno, že ekvol má významné biologické účinky [26] a je více bioaktivní než jeho zdrojová forma daidzein  má vyšší estrogenicitu [113, 114], je účinnější antioxidant [115, 116] a vykazuje antiandrogenní vlastnosti [117]. Kromě toho, ekvol má vyšší hladiny volné efektivní frakce cirkulující v humánním séru [118] a pomalejší odbourávání v plazmě ve srovnání s daidzeinem [119]. Jak již bylo uvedeno dříve, schopnost přeměňovat daidzein na ekvol u člověka závisí na kolonizaci střeva určitými

28

bakteriálními kmeny, které jsou však přítomny pouze asi u 30–40 % lidské populace (tzv. producenti ekvolu) [34, 35, 36, 37, 38]. Jako alternativní strategie, která by umožnila i zbývající části populace, tzv. neproducentům ekvolu, využívat zdraví prospěšné účinky ekvolu se jeví jeho orální podávání. Ačkoli již byly izolovány bakteriální kmeny podílející se na přeměně daidzeinu na ekvol [62, 63, 120, 121] a v zahraničí je již komerčně dostupný preparát obsahující ekvol vyrobený pomocí bakterie Lactococcus garvieae (SE5-OH), je možné jako potenciální zdroj ekvolu využít i některých potravin živočišného původu, protože na rozdíl od člověka, u zvířat je schopnost produkovat ekvol po příjmu isoflavonů běžná [39]. I když bylo zjištěno, že fytoestrogenní látky, zejména ekvol a daidzein mohou být distribuovány do různých tkání těl přežvýkavců, kravské mléko je pravděpodobně nejvhodnější potravinou živočišného původu, která může být cíleně upravena tak, aby mohla být potenciálním zdrojem ekvolu pro humánní výživu v podobě tzv. funkční potraviny. Zdrojem ekvolu v kravském mléce v našich podmínkách mohou být již zmíněné krmné komponenty z jetele červeného (Trifolium pratense) nebo ze sóje luštinaté (Glycine max (L.) Merr.) [24, 29, 64]. Hladina ekvolu v mléce krav krmených jetelem červeným se může pohybovat od 14 do 643 μg/l v závislosti na příjmu isoflavonů z krmné dávky [122, 123, 124, 125, 126]. Při zkrmování sójových komponent jsou dosahovány mnohem nižší hladiny ekvolu v mléce a to v rozmezí 14 až 77 μg/l [Křížová a kol. (nepublikovaná data), 127], odpovídající a úměrné příjmu (podílu) sójových komponent v krmné dávce dojnic. Např. jetel červený je hojně využíván v ekologických chovech, v mléce produkovaném na ekologických farmách můžeme tedy očekávat vyšší hladiny isoflavonů, zvláště pak ekvolu, ve srovnání s mlékem z chovů konvenčních [124, 125, 128], kde je jako zdroj isoflavonů využívána sója nebo produkty z ní. Počet studií zaměřených na problematiku sójových isoflavonů je omezený a doposud rovněž nebyla dostatečně popsána ani kvantitativní stránka prostupu sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic a následně až do mléčných výrobků. Z tohoto pohledu byla tato dizertační práce zaměřena na zmapování prostupu fytoestrogenů do mléka a mléčných výrobků, u dojnic krmených krmnou dávkou cíleně obohacenou o fytoestrogeny, s důrazem na ekvol.

29

3 CÍL PRÁCE Cílem této dizertační práce bylo vypracování návrhů, realizace a vyhodnocení dvou experimentů na laktujících dojnicích:  Fyziologický experiment (Exp. 1) byl tvořen kontrolní (skupina K) a pokusnou skupinou (skupina S) dojnic. Krmná dávka pokusných zvířat byla v tomto experimentu, v případě skupiny K, bez obsahu sójových fytoestrogenů, zatím co v případě skupiny S byla cíleně obohacena zdrojem fytoestrogenních látek ve formě extrudované plnotučné sóji.  Poloprovozní experiment (Exp. 2) byl tvořen kontrolní (skupina K) a pokusnou skupinou (skupina E) dojnic. Krmná dávka pokusných zvířat byla v tomto experimentu, v případě skupiny K, bez obsahu sójových fytoestrogenů, zatím co v případě skupiny E byla cíleně obohacena zdrojem fytoestrogenních látek ve formě doplňku 40% sójového extraktu. Na základě vypracovaných návrhů byly oba experimenty provedeny, za současného zajištění správného dávkování pokusné složky do krmné dávky a její následný příjem pokusnými zvířaty. Během realizace obou experimentů byly průběžně odebírány vzorky krmiv a mléka a bylo zajištěno jejich prvotní zpracování. Vzorky krmiv byly následně použity na stanovení obsahu základních živin. Stanovení obsahu fytoestrogenů v krmivu byl zajištěn Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze. Vzorky mléka byly použity na stanovení obsahu základních složek ve spolupráci s Československou společností chovatelů, a.s. (laboratoří pro rozbory mléka, Brno). Technologické zpracování mléka bylo provedeno společností MILCOM a.s., Praha. Stanovení obsahu fytoestrogenů a jejich metabolitů v mléku a mlékárenských výrobků během technologického zpracování byl zajištěn Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze. Všechny výsledky k oběma experimentům byly následně zpracovány v souvislosti se zmapováním prostupu fytoestrogenních látek metabolismem pokusných zvířat (laktujících dojnic) do mléka a následně i mléčných výrobků a vyhodnoceny v rámci této dizertační práce.

30

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Tato dizertační práce byla zaměřena na zmapování exprese fytoestrogenů z krmiva do mléka a mléčných výrobků prostřednictvím fyziologického (Exp. 1) a poloprovozního (Exp. 2) experimentu na laktujících dojnicích. Krmná dávka dojnic byla, u pokusných skupin dojnic, cíleně obohacena zdrojem fytoestrogenních látek ve formě extrudované plnotučné sóji (v případě Exp. 1, ve skupině S) či 40% extraktu sójových isoflavonů (v případě Exp. 2, ve skupině E). Práce byla vypracována ve spolupráci s Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o., Rapotín v rámci projektu Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování, jehož poskytovatelem je Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT, Projekt č. 2B08073) a dále pak ve spolupráci s Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze a společností MILCOM a.s., Praha, partnery řešitelského týmu projektu.

4.1

FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1)

Experiment byl proveden na 4 laktujících dojnicích Holštýnského plemene s ruminální kanylou (Obr. 10), s průměrnou užitkovostí 18,5 ±1,7 kg/d, které byly rozděleny do dvou skupin po 2 kusech – kontrolní skupina (skupina K) a pokusná skupina (skupina S). Experiment probíhal ve 2 periodách, každá v délce 14 dní s rotací. Každá perioda byla tvořena přípravným obdobím (10 dní) a experimentálním obdobím (4 dny). V 1. periodě byly dojnice č. 1 a 2 v kontrolní skupině (skupina K) a dojnice č. 3 a 4 ve skupině pokusné (skupině S), v následující periodě se úroveň pokusného faktoru vyměnila (viz schéma experimentu v tabulce 4). Dojnice byly krmeny krmnou dávkou složenou z kukuřičné siláže (63,3 %), vojtěškového sena (11,5 %) a doplňkové krmné směsi (25,2 %). Doplňková krmná směs pro kontrolní skupinu (skupina K) byla tvořena extrahovaným řepkovým šrotem (28,2 % doplňkové krmné směsi), zatímco doplňková krmná směs pro pokusnou skupinu (skupina S) byla cíleně obohacena o zdroj fytoestrogenů  extrudovanou plnotučnou sóju (33,6 % z doplňkové krmné směsi). Složení doplňkové krmné směsi pro obě skupiny je uvedeno v tabulce 5. Krmná dávka byla propočtena tak, aby denní příjem fytoestrogenů u jednotlivých dojnic byl stejný. Před zahájením vlastního experimentu byl proveden návyk na daný typ krmné dávky v délce 1 týdne. Ruminální kanyly sloužily pro stanovení rychlosti pasáže tekuté složky tráveniny v bachoru pomocí tekutého markeru Cr-EDTA, který byl kontinuálně infudován pomocí infuzní pumpy do bachoru. Tyto výsledky nebyly předmětem zájmu této dizertační práce, a proto nejsou dále v textu uvedeny.

31

Obr. 10: Ustájení pokusných zvířat během fyziologického experimentu (Exp. 1) Tab. 4: Schéma uspořádání fyziologického experimentu (Exp. 1) Dojnice

Perioda I.

II.

1

S

K

2

S

K

3

K

S

4

K

S

K – kontrolní skupina (skupina K), kontrolní krmná dávka; S – pokusná skupina (skupina S), krmná dávka s doplňkem extrudované plnotučné sóji

32

Tab. 5: Složení doplňkové krmné směsi u fyziologického experimentu (Exp. 1) (g/kg sušiny) Komponenty

K

S

Ječmen

266

266

Oves

266

266

-

336

Řepkový extrahovaný šrot

282

-

Řepkový olej

10,5

-

Řepné řízky cukrovarnické

150

96

Krmná sůl (NaCl)

5,5

4

Bolifor DCP

7,5

14

Mletý vápenec (CaCO3)

10,5

11,6

Krmná soda (NaHCO3)

1

4,5

Fosforečnan hořečnatý (MgP)

-

0,9

Směs-S minerály

0,5

0,5

Směs-S vitamíny

0,5

0,5

Extrudovaná plnotučná sója

K – kontrolní skupina (skupina K), kontrolní krmná dávka; S – pokusná skupina (skupina S), krmná dávka s doplňkem extrudované plnotučné sóji

4.1.1 Odběry a zpracování vzorků krmiv Během celého experimentu byl sledován příjem krmiva, případné zbytky byly evidovány. V každé periodě byly odebrány vzorky jednotlivých krmiv tj. siláž, seno, doplňkové krmné směsi, řepkový extrahovaný šrot, plnotučná extrudovaná sója a případných zbytků (1 směsný vzorek za periodu od každé dojnice). Vzorky krmiv a zbytků byly vysušeny při teplotě 55 °C po dobu 24 hod., pomlety (1 mm) a analyzovány na obsah základních živin (sušina, dusíkaté látky, tuk, popel, hrubá vláknina, neutrálně detergentní vláknina, acidodetergentní vláknina) a obsah fytoestrogenů (daidzein, genistein, glycitein), podrobný postup je uveden níže.

4.1.2 Odběry a zpracování vzorků mléka Mléčná užitkovost byla sledována během celého experimentu. Odběr vzorků mléka byl prováděn denně při ranním a večerním dojení v průběhu experimentálního období. Odběr mléka pro technologické zpracování (cca 10 l od každé dojnice) byl proveden po sloučení večerního a ranního mléka 1x v každé periodě. Množství mléka požadovaného pro pilotní výrobu mlékárenských výrobků, tj. cca 20 l bylo řešeno slučováním mléka vždy od dvou dojnic v každé skupině. Vzorky mléka, dle potřeby stanovení, byly zpracovány v následujícím režimu: a) Vzorky na stanovení základních složek byly odebírány v objemu 30 ml mléka do speciálních vzorkovnic obsahujících Brononopol (2-bromo-2-nitropropane-1,3diol) a byly následně zchlazeny na teplotu 6 °C a analyzovány na obsah sušiny, 33

bílkovin, tuku, kaseinu, laktózy, močoviny a počet somatických buněk (viz dále v textu). b) Vzorky na stanovení obsahu fytoestrogenů a jejich metabolitů (daidzein, genistein, ekvol) byly odebírány v objemu 10 ml mléka a byly ihned po odběru zamraženy a uchovány pro analýzy. c) Vzorky určené na technologické zpracování (jogurt, sýr) byly odebírány v objemu 1012 l od každé dojnice po sloučení ranního a večerního mléka, mléko bylo zchlazeno na teplotu 6 °C a při této teplotě bylo převezeno do experimentálního výrobního pracoviště MILCOM a.s., uchováno do druhého dne a následně zpracováno dle postupu uvedeného níže.

4.1.3 Technologické zpracování mléka Exprese fytoestrogenních látek do mléka a změn jejich zastoupení během formování, zrání a skladování mlékárenských výrobků byla studována na 2 mlékárenských výrobcích - sýru s dohřívanou sýřeninou a bílém jogurtu. Při modelových pilotních výrobách bylo zpracováváno vždy cca 20 l mléka od pokusných i od kontrolních dojnic, které umožní souběžnou výrobu sýra s dohřívanou sýřeninou i výrobu bílého jogurtu. Během technologického zpracování, které probíhalo na pracovišti MILCOM a.s., byly odebírány vzorky na stanovení obsahu fytoestrogenních látek a pro běžné mikrobiologické a chemické analýzy podle níže uvedeného přehledu. První fáze zpracování mléka byla společná pro oba výrobky. Dovezená mléka od dvojice kontrolních nebo pokusných dojnic byla spojena a mléko bylo odstředěním zbaveno mechanických nečistot a souběžně byly odebrány vzorky odstředěného mléka a smetany pro stanovení fytoestrogenních látek. Odstředěné mléko a smetana byly opět spojeny, promíchány a na rozbory byly odebrány vzorky plnotučného mléka před a po šetrné pasteraci 65 °C, 30 min. Z takto připraveného mléka byly vyrobeny sýry a jogurty. U jogurtů byly provedy odběry vzorků na obsah fytoestrogenních látek po výrobě a na konci skladování (po jednom měsíci). Při výrobě sýrů byl proveden odběr vzorků syrovátky odpadající při výrobě a odběry vzorků ze sýrů po výrobě a na konci zrání ve stáří 90 dní. Vzorky byly průběžně testovány. Přehled odběru vzorků mléka/mlékárenských výrobků během technologického zpracování: a) vzorek dovezeného mléka sloučeného od 2 dojnic b) vzorek syrového odstředěného mléka c) vzorek syrové smetany d) vzorek plnotučného mléka před pasterací e) vzorek plnotučného mléka po pasteraci f) vzorek jogurtu po výrobě – po 24 hodinách g) vzorek syrovátky z výroby sýra h) vzorek sýru po výrobě i) vzorek jogurtu na konci skladování (1 měsíc) j) vzorek sýru na konci zrání a skladování (90 dní)

34

4.1.3.1 Technologický postup výroby sýrů Při vypracování návrhu technologického postupu výroby se vycházelo z požadavku na co nejjednodušší systém použitých čistých mlékařských kultur (ČMK), které by samy o sobě mohly svými vlastnostmi ovlivnit vlastní pokusné výroby. Byl proto navržen technologický postup výroby nízkodohřívaných lisovaných sýrů s použitím klasické mesofilní smetanové kultury FD (MILCOM a.s., Česká republika). Tomuto systému a požadavku na dostatečné prokysání sýrů bylo nutno přizpůsobit vlastní technologický postup výroby sýrového zrna, lisování a formování mladých sýrů i solení sýrů. Na základě výsledků těchto ověřovacích pokusů byl navržen následující technologický postup výroby: Mléko vždy od 2 dojnic v každé skupině bylo spojeno, odstředěním (EleCrem 1, Elecrem, Francie) zbaveno mechanických nečistot a pasterováno při teplotě 65 °C po dobu 30 min. Pro výrobu sýrů bylo odváženo 5 kg mléka, přidán nasycený roztok chloridu vápenatého (1,5 ml), 1 % smetanové kultury FD a při teplotě 32-33 °C bylo mléko zasýřeno přídavkem tekutého syřidla o síle 1:15000. Doba od přídavku ČMK po odtažení syrovátky byla 80-90 minut. 1/3 syrovátky byla odtažena a bylo přidáno 1/3 prací vody. Dosoušení sýrového zrna bylo 40-50 minut při teplotě 37-38 °C. Po skončení dosoušení byla směs sýrového zrna se syrovátkou vypuštěna do lisovacích forem a 1 hodinu při stoupajícím tlaku byly sýry lisovány. Doba solení sýrů byla upravena na 3,5 hodiny (20% roztok NaCl, pH 5,25). 4.1.3.2 Technologický postup výroby jogurtů Při ověřovacích výrobách kysaného mlékárenského výrobku se při návrhu technologického postupu výroby vycházelo z požadavku na omezení přísad do výrobku typu želatina, škrob, sušené mléko, ovocná složka tak, aby byl vyloučen potenciální vliv těchto surovin. K výrobě bylo použito pasterované mléko bez úpravy jeho tučnosti a byl testován přídavek ČMK. Na základě výsledků pokusných výrob byla zvolena kultura KAN IV (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, MILCOM a.s., Česká republika) a tato kultura byla použita i při všech pokusných i kontrolních výrobách. Odstředěné (EleCrem 1, Elecrem, Francie) pasterované mléko (65 °C, 30 min.) bylo vytemperováno na teplotu 37 °C, zaočkováno 1% jogurtové kultury KAN IV a po promíchání bylo dávkováno po 180 ml do sterilních lahviček s twist-off uzávěry a umístěno do vysrážení v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 16-18 hod. Po vysrážení byly jogurty přeneseny do termostatu s teplotou 6,5 °C a skladovány po dobu 1 měsíce. Po výrobě a po skladování byly odebrány vzorky pro stanovení fytoestrogenních látek.

4.1.4 Výpočty V rámci této dizertační práce byla vypočtena míra prostupu daidzeinu, genisteinu a glyciteinu do mléka a veškeré naměřené výsledky byly statisticky vyhodnoceny dle níže uvedených rovnic. 4.1.4.1 Míra prostupu isoflavonů do mléka Míra prostupu isoflavonů do mléka je různá a závisí především na příjmu isoflavonů z krmiva, tj. závisí na složení krmné dávky. Pro vyjádření a kvantifikaci míry prostupu 35

jednotlivých isoflavonů do mléka se používá termín „apparent recovery“ (tj. zdánlivá návratnost), který vyjadřuje podíl mezi isoflavony jedné metabolické skupiny vyloučenými v mléce a přijatými v krmné dávce [123]. Míra prostupu daidzeinu do mléka (μg/mg) = ∑daidzeinu a ekvolu vyloučených v mléce (μg/kg) / ∑daidzeinu přijatého v KD (mg/kg) Míra prostupu genisteinu do mléka (μg/mg) = ∑genisteinu vyloučeného v mléce (μg/kg) / ∑genisteinu přijatého v KD (mg/kg) Míra prostupu glyciteinu do mléka (μg/mg) = ∑glyciteinu vyloučeného v mléce (μg/kg) / ∑glyciteinu přijatého v KD (mg/kg)

4.1.4.2 Statistické vyhodnocení dat Získaná data byla statisticky vyhodnocena s využitím GLM (generalized linear model) modelu za pomoci Statgraphics 7.0 package (Manugistics Inc., and Statistical Graphics Corporation, Rockville, Maryland, USA), podle následující rovnice: Yijkl = μ + Ti + Cj + Pk + Dl + εijkl kde: μ = průměr souboru, Ti = vliv faktoru (i = 2), Cj = vliv dojnice (j = 4), Pk = vliv periody (k = 2), Dl = den odběru vzorku (l = 4) a εijkl = reziduální chyba. Statistické hodnocení nebylo provedeno u dat získaných během technologického zpracování mléka, protože byly získány pouze dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2).

4.2

POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2)

Experiment byl proveden na farmě soukromého zemědělce, Lenky Tesařové v Míšovicích, na 12 laktujících dojnicích (1. – 5. laktace, 26. týden laktace) s průměrnou užitkovostí 22,7 3,04 kg/d, které byly rozděleny do dvou skupin po 6 kusech – kontrolní skupina (skupina K) a pokusná skupina (skupina E), podle užitkovosti tak, aby průměrná užitkovost ve skupinách byla obdobná (Obr. 11). Experiment probíhal ve 2 periodách, každá v délce 11 dní s rotací. Každá perioda byla tvořena přípravným obdobím (7 dní) a experimentálním obdobím (4 dny). V 1. periodě byly dojnice č. 1 až 6 v kontrolní skupině a dojnice č. 7 až 12 ve skupině pokusné, v následující periodě se úroveň pokusného faktoru vyměnila (viz schéma experimentu v tabulce 6). Dojnice byly vazně ustájeny a individuálně krmeny krmnou dávkou složenou z kukuřičné siláže, vojtěškového sena a doplňkové krmné směsi. Doplňková krmná 36

směs pro kontrolní skupinu (skupina K) neobsahovala sójové komponenty, zatímco směs pro pokusnou skupinu (skupina E) obsahovala 40% extrakt sójových isoflavonů (Soybean isoflavones, Vita-Solar Biotechnology Co., Ltd., Čína) v množství 2,4 g/kg doplňkové krmné směsi (tj. počítáno na denní příjem 3 g isoflavonů). Před zahájením vlastního experimentu byl proveden návyk na daný typ krmné dávky v délce 1 týdne. Složení krmné dávky a složení doplňkové krmné směsi je uvedeno v tabulce 7 a 8.

Obr. 11: Ustájení pokusných zvířat během poloprovozního experimentu (Exp. 2)

37

Tab. 6: Schéma uspořádání poloprovozního experimentu (Exp. 2) Dojnice

Perioda I.

II.

1

E

K

2

E

K

3

E

K

4

E

K

5

E

K

6

E

K

7

K

E

8

K

E

9

K

E

10

K

E

11

K

E

12

K

E

K – kontrolní skupina (skupina K), kontrolní krmná dávka; E – pokusná skupina (skupina E), krmná dávka s doplňkem 40% sójového extraktu

Tab. 7: Složení krmné dávky u poloprovozního experimentu (Exp. 2) (kg/ks a den, v původní hmotě) Komponenty

K

E

Kukuřičná siláž

30

30

Vojtěškové seno

3

3

Doplňková krmná směs

8

8

K – kontrolní skupina (skupina K), kontrolní krmná dávka; E – pokusná skupina (skupina E), krmná dávka s doplňkem 40% sójového extraktu

38

Tab. 8: Složení doplňkové krmné směsi u poloprovozního experimentu (Exp. 2) (g/kg sušiny) Komponenty

K

E

Pšenice

250

247,6

Ječmen

200

200

Kukuřice

100

100

Lněné semeno

30

30

Sladový květ

40

40

Klíčky kukuřice

40

40

Extrahovaná slunečnice neloupaná

50

50

Výlisky dýně

250

250

Krmná sůl (NaCl)

5

5

Mletý vápenec (CaCO3)

20

20

Oxid hořečnatý (MgO)

1

1

Krmná soda (NaHCO3)

1

1

Bolifor MCP-F

12

12

Směs-S minerály

0,5

0,5

Směs-S vitamíny

0,5

0,5

-

2,4

40% sójový extrakt isoflavonů

K – kontrolní skupina (skupina K), kontrolní krmná dávka; E – pokusná skupina (skupina E), krmná dávka s doplňkem 40% sójového extraktu

4.2.1 Odběry a zpracování vzorků krmiv Během celého experimentu byl sledován příjem krmiva, případné zbytky byly evidovány. V každé periodě byly odebrány vzorky jednotlivých krmiv tj. siláž, seno, doplňkové krmné směsi, řepkový extrahovaný šrot, plnotučná extrudovaná sója a případných zbytků (1 směsný vzorek za periodu od každé dojnice). Vzorky krmiv a zbytků byly vysušeny při teplotě 55 °C po dobu 24 hod., pomlety (1 mm) a analyzovány na obsah základních živin (sušina, dusíkaté látky, tuk, popel, hrubá vláknina, neutrálně detergentní vláknina, acidodetergentní vláknina) a obsah fytoestrogenů (daidzein, genistein, glycitein), podrobný postup je uveden níže.

4.2.2 Odběry a zpracování vzorků mléka Mléčná užitkovost byla sledována během celého experimentu. Odběr vzorků mléka byl prováděn denně při ranním a večerním dojení v průběhu experimentálního období. Odběr mléka pro technologické zpracování (cca 10 l v každé skupině) byl proveden z ranního mléka 1x v každé periodě. Vzorky mléka, dle potřeby stanovení, byly zpracovány stejným způsobem, jako u fyziologického experimentu (Exp. 1). 39

4.2.3 Technologické zpracování mléka Exprese fytoestrogenních látek do mléka a změn jejich zastoupení během formování, zrání a skladování mlékárenských výrobků byla opět, jako v předchozím fyziologickém experimentu (Exp. 1), studována na 2 mlékárenských výrobcích  sýru s dohřívanou sýřeninou a bílém jogurtu. Technologické zpracování mléka, odběry a zpracování vzorků probíhaly na pracovišti MILCOM a.s. za stejných podmínek. Během technologického zpracování bylo opět odebíráno 11 typů vzorků, dle přehledu odběru vzorků uvedeného výše (Exp. 1).

4.2.4 Výpočty V rámci této dizertační práce byla vypočtena míra prostupu daidzeinu, genisteinu a glyciteinu do mléka a veškeré naměřené výsledky byly statisticky vyhodnoceny dle níže uvedené rovnice. 4.2.4.1 Míra prostupu isoflavonů do mléka Míra prostupu isoflavonů do mléka byla proveden stejně, jako v případně fyziologického experimentu (Exp. 1), podle Steinshamn a kol. [123]: 4.2.4.2 Statistické vyhodnocení dat Získaná data byla statisticky vyhodnocena s využitím GLM modelu (generalized linear model) za pomoci Statgraphics 7.0 package (Manugistics Inc., and Statistical Graphics Corporation, Rockville, Maryland, USA), podle následující rovnice: Yijkl = μ + Ti + Cj + Pk + Dl + εijkl kde: μ = průměr souboru, Ti = vliv faktoru (i = 2), Cj = vliv dojnice (j = 12), Pk = vliv periody (k = 2), Dl = den odběru vzorku (l = 4) a εijkl = reziduální chyba. Statistické hodnocení nebylo provedeno u dat získaných během technologického zpracování mléka, protože byly získány pouze dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2).

4.3

ANALYTICKÁ ČÁST

Tato část dizertační práce je souhrn použitého materiálu a analýz, které byly provedeny při zpracování odebraných vzorků během fyziologického i provozního experimentu na laktujících dojnicích.

4.3.1 Materiál 4.3.1.1 Laboratorní vybavení Při odběru, zpracování a rozboru vzorků bylo použito běžné laboratorní sklo a vybavení.

40

4.3.1.2 Chemikálie Krmiva a zbytky krmiv: Při zpracování a rozboru vzorků byly použity běžné, laboratorně dostupné chemikálie dle zavedených metodik Výzkumného ústavu pro chov skotu, s.r.o., Rapotín a dále chemikálie dle Nařízení komise (ES) č. 152/2009 [129] pro užité metody. Krmiva a zbytky krmiv (HPLC-DAD): Při přípravě vzorků a k identifikaci a kvantifikaci byly použity běžné, laboratorně dostupné chemikálie dle zavedených metodik Vysoké školy chemicko-technologické v Praze a dále daidzein, čistota ≥ 98 % (Sigma-Aldrich, Německo); genistein, čistota ≥ 95 % (Sigma-Aldrich, Německo); glycitein, čistota ≥97% (HPLC) (SigmaAldrich, Německo); ekvol, čistota ≥ 99 % (Fluka, Německo) aj. Mléko: Při zpracování a rozboru vzorků byly použity běžné, laboratorně užívané chemikálie a dále chemikálie dle zavedených metodik společnosti MILCOM a.s., Praha. Mléko (UPLC-MS/MS): Při přípravě vzorků a k identifikaci a kvantifikaci byly použity běžné, laboratorně dostupné chemikálie dle zavedených metodik Vysoké školy chemickotechnologické v Praze a dále daidzein, čistota ≥ 98 % (Sigma-Aldrich, Německo); genistein, čistota ≥ 98 % (Sigma-Aldrich, Německo); glycitein, čistota ≥97% (HPLC) (Sigma-Aldrich, Německo); ekvol, čistota ≥ 99 % (Sigma-Aldrich, Německo) aj. 4.3.1.3 Přístroje Krmiva a zbytky krmiv: Analýzy vzorků krmiv a zbytků krmiv byly provedeny na přístrojích Výzkumného ústavu pro chov skotu, s.r.o., Rapotín DIGESTION SYSTEM 20, 1015 Digester (Tecator, Švédsko); SOXTEC SYSTEM 1040 Extraction Unit (Tecator, Švédsko); Kjeltec Auto 1030 Analyzer (Tecator, Švédsko); Fibertec (Tecator, Švédsko). Krmiva a zbytky krmiv (HPLC-DAD): Při identifikaci a kvantifikaci byly použity běžná, laboratorně dostupná zařízení a dále chromatografický systém pro HPLC HP 1200 (Hewlett Packard, USA); DAD detektor (Hewlett Packard HP 1200, USA); analytická kolona Discovery C18, 15 cm × 3 mm × 5 μm (SUPELCO) (Sigma-Aldrich, Německo); předkolona Discovery Guard column C18 2 cm  4 mm  5 µm (SUPELCO) (Sigma-Aldrich, Německo) aj., která jsou majetkem Vysoké školy chemicko-technologické v Praze. Mléko: Bentley FTS/FCM (Bentley Instruments Inc., USA); UREAKVANT 4 Analyzer (AGROSLUŽBY Olomouc, s.r.o., Česká republika); Bentley Somacount 150 (Bentley Instruments Inc., USA). Mléko (UPLC-MS/MS): Analýzy mléka byly provedeny Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o., Rapotín ve spolupráci s Českomoravskou společností chovatelů, a.s. v Laboratoři pro rozbor mléka, Brno. Při identifikaci a kvantifikaci byly použity běžná, laboratorně dostupná zařízení a dále kapalinový chromatograf ACQUITY UPLCTM (Waters, USA); analytická kolona Acquity BEH C18 (50 × 2,1 mm; 1,7 µm) (Waters, USA); hmotnostní spektrometr AB SCIEX QTRAP® 5500 (Kanada) aj., která jsou majetkem Vysoké školy chemicko-technologické v Praze. 4.3.1.4 Software V průběhu získávání a zpracování dat byly použity tyto softwary: MS Office 2002, Windows XP (Microsoft, USA); Statgraphics 7.0 package (Manugistics Inc., and Statistical 41

Graphics Corporation, Rockville, Maryland, USA); HP Chemstation (Hewlett Packard, USA); XcaliburTM (Finnigan Corp., USA) aj.

4.3.2 Analýzy vzorků krmiv a zbytků krmiv Během analýz vzorků krmiv a zbytků krmiv byl stanoven základní obsah živin a obsah fytoestrogenů  daidzeinu, genisteinu a glyciteinu. 4.3.2.1 Stanovení základního obsahu živin Stanovení obsahu fytoestrogenů v krmivech a zbytcích krmiv bylo provedeno ve spolupráci s Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o., Rapotín. Jako základní živiny byly laboratorně stanoveny: sušina, dusíkaté látky, tuk, popel, hrubá vláknina, neutrálně detergentní vláknina a acidodetergentní vláknina. Netto energie pro laktaci byla stanovena výpočtem. Sušina Sušina vzorku byla stanovena sušením při teplotě 103 °C po dobu 4 hodin a vypočtena dle vzorce: Sušina (%) = [hmotnost vysušeného vzorku (g) / navážka vlhkého vzorku (g)] . 100 Dusíkaté látky Obsah dusíkatých látek v krmivech byl stanoven dle Nařízení komise (ES) č. 152/2009 [129] na základě stanovení obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla. Vzorek byl mineralizován v prostředí kyseliny sírové a přítomnosti katalyzátoru, za vysoké teploty, během které organicky vázaný dusík přítomný ve formě různých funkčních skupin byl převeden na amoniak, který zůstal vázán ve formě síranu amonného. Kyselý roztok byl následně alkalizován roztokem hydroxidu sodného a pomocí vodní páry byl ze síranu amonného uvolněn amoniak, který byl v plynné formě dále kondenzován a jímán do předlohy s kyselinou boritou a indikátorem a následně titrován roztokem kyseliny chlorovodíkové. Mineralizace: Mineralizace vzorků byla prováděna pomocí DIGESTION SYSTEM 20, 1015 Digester (Tecator, Švédsko), jak je znázorněno na obrázku 12. Do mineralizační baňky byl navážen 0,5-1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Bylo přidáno vhodné množství katalyzátoru (KJELTABS CK, 2 tablety, 1 tableta = 3,5 g K2SO4 a 0,4 g Cu2SO4.5 H2O), 1012 ml kyseliny sírové a několik granulí pemzy, vše bylo zamícháno. Baňka byla vložena do mineralizačního bloku předehřátého na 420 °C. Zahřívání bylo odpovídající, pokud došlo k zuhelnatění hmoty, vroucí kyselina kondenzovala na stěnách baňky a nedocházelo však k přehřívání stěn baňky a k ulpívání organických částic na stěnách baňky. Výsledný roztok byl čirý a získal světle zelené zabarvení. Celý proces mineralizace trval 1 hodinu, potom se vše nechalo vychladnout. Destilace, titrace: V dalším kroku byla použita destilačně-titrační jednotka Kjeltec Auto 1030 Analyzer (Tecator, Švédsko). Opatrně bylo přidáno 75 ml vody, aby došlo k úplnému rozpuštění sulfátů. Předloha s obsahem 25-30 ml roztoku kyseliny borité (10 g/l) byla umístěna pod otvor kondenzátoru tak, že jeho vývod byl ponořen pod hladinu přebytku roztoku kyseliny borité. Destilační jednotka byla upravena na dávkování 50 ml roztoku 42

hydroxidu sodného (m/v: 40 %). Destilační jednotkou byl oddestilován amoniak uvolněný přidáním roztoku hydroxidu sodného. Destilát byl jímán do roztoku kyseliny borité. Množství destilátu záviselo na množství dusíku ve vzorku. Obsah předlohy byl titrován standardním odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové (0,10 mol/l). Pro stanovení bodu ekvivalence byla použita kolorimetrická detekce, do roztoků kyseliny borité byla přidána methylčerveň (7 ml roztoku methylčerveně/l) a bromokresol (10 ml roztoku bromokresolové zeleně/l). Obsah dusíkatých látek (% hm.) = (V0 − V1) . c . 1,4 . 6,25 / m kde: m = hmotnost zkoušeného vzorku (g) c = koncentrace standardního odměrného roztoku HCl (mol/l) V0 = spotřeba HCl na slepou zkoušku (ml) V1 = spotřeba HCl na zkušební vzorek (ml)

Obr. 12: Stanovení obsahu dusíkatých látek: A – mineralizace, B – vzorky po mineralizaci, C – destilace, titrace. Tuk Obsah tuku byl stanoven dle Nařízení komise (ES) č. 152/2009 [129], metodou na stanovení přímo extrahovatelných tuků, která je použitelná pro krmiva rostlinného původu. Vzorek byl extrahován petroletherem (bromové číslo muselo být menší než 1 a zbytek po odpaření menší než 2 mg/100 ml). Rozpouštědlo bylo oddestilováno a zbytek byl vysušen a zvážen. Pro stanovení byl použit SOXTEC SYSTEM 1040 Extraction Unit (Tecator, Švédsko), viz obrázek 13, s textilními patronami o výšce 7 cm a průměru ± 3cm.Do extrakční patrony bylo naváženo 5 g vzorku s přesností na 1 mg a patrona byla uzavřena tukuprostou vatou. Patrona byla umístěna do extrakčního přístroje a extrahovalo se šest hodin petroletherem. Petroletherový extrakt byl jímán do suchého, předem zváženého extrakčního kelímku. Rozpouštědlo bylo oddestilováno, zbytek v baňce byl vysušen 1,5 hodiny v sušárně (9598 °C). Vzorek po vychladnutí v exsikátoru byl zvážen a sušen dalších 30 minut, aby se 43

zajistila konstantní hmotnost tuku (rozdíl mezi dvěma následujícími váženími musel být maximálně 1 mg). Hmotnost zbytku po extrakci byla vyjádřena, jako % tuku ve vzorku.

Obr. 13: Stanovení obsahu tuku Popel Popel byl stanoven dle Nařízení komise (ES) č. 152/2009 [129]. Do spalovacího kelímku, který byl předem zahřát na teplotu 550 °C, ochlazen a zvážen, se s přesností na 1 mg navážilo 5 g vzorku. Potom byl kelímek vložen na topnou desku a postupně zahříván, až látka zuhelnatila. Spalovací kelímek byl vložen do muflové pece zahřáté na 550 °C a byl spalován 3 hodiny. Kelímek byl vložen do exsikátoru a po vychladnutí byl ihned zvážen. Následně se spaloval dalších 30 minut, aby se zajistilo, že je dosažená hmotnost popela konstantní (úbytek hmotnosti mezi dvěma váženími nesměl být větší než 1 mg). Hmotnost vzorku byla vypočtena po odečtení hmotnosti kelímku. Výsledek byl vyjádřen, jako procento vzorku. Hrubá vláknina (Crude Fiber – CF) Hrubá vláknina byla stanovena dle Nařízení komise (ES) č. 152/2009 [129], za pomoci zařízení z obrázku 14, Fibertec (Tecator, Švédsko). Zvolená metoda umožňuje stanovit v krmivu organické látky, které neobsahují tuk, jsou nerozpustné v roztoku kyseliny a louhu a jsou běžně nazývány vláknina. Vzorek byl v případě potřeby odtučněn a postupně vystaven působení vroucímu roztokem kyseliny sírové a hydroxidu draselného o přesně stanovené koncentraci. Zbytek byl oddělen filtrací přes skleněný filtrační kelímek, promyt, vysušen, zvážen a spálen při teplotě 475-500 °C. Úbytek váhy po spálení odpovídal obsahu vlákniny ve zkoušeném vzorku. Do skleněného filtračního kelímku byl navážen 1 g upraveného vzorku s přesností na 1 mg, kelímek byl připojen k zahřívací jednotce a poté k hydrolyzační nádobce. Do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku bylo nalito 150 ml vroucího roztoku kyseliny sírové (0,13 mol/l). Během 5 minut se směs zahřála k varu a intenzivně byla vařena přesně 30 minut. Přes vypouštěcí ventil byla odsáta kyselina sírová za použití vakua přes filtrační kelímek a zbytek byl třikrát promyt ve 30 ml horké vody, vždy po úplném odsátí kapaliny z kelímku. Vypouštěcí ventil byl následně uzavřen, přidalo se 150 ml vroucího roztoku hydroxidu

44

draselného (0,23 mol/l) do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku. Kapalina byla přivedena během 5 minut k varu a intenzivně byla vařena přesně 30 minut. Filtrace a promývání byly zopakovány, jako po varu s kyselinou sírovou. Po skončení promývání a odsávání byl odpojen filtrační kelímek se svým obsahem a připojen ke studené extrakční jednotce. Za použití vakua byl zbytek ve filtračním kelímku třikrát promyt ve 25 ml acetonu, promývání bylo vždy do úplného odsátí acetonu. Filtrační kelímek byl vysušen do konstantní hmotnosti v sušárně při teplotě 130 °C. Po každém vysušení a ochlazení v exsikátoru byl vždy rychle zvážen. Filtrační kelímek byl vložen do muflové pece a spalován při 475-500 °C nejméně 30 minut do konstantní hmotnosti (úbytek hmotnosti mezi dvěma váženími nesměl být větší než 2 mg). Po každém spalování a ochlazení nejprve v peci a potom v exsikátoru byl vzorek zvážen. Obsah vlákniny (%) = (m0 - m1) . 100 / m kde: m = hmotnost vzorku (g) m0 = úbytek hmotnosti po spálení při vlastním stanovení (g) m1 = úbytek hmotnosti po spálení při slepé zkoušce (g)

Obr. 14: Stanovení obsahu vlákniny Neutrálně detergentní vláknina (Neutral Detergent Fibre – NDF) Neutrální detergentní vláknina byla stanovena na základě ČSN EN ISO 16472 [130] za pomoci zařízení Fibertec s úpravou vzorku alfa-amylázou. Působením neutrálně detergentního činidla společně s alfa-amylázou dojde u krmiv k odstranění snadno rozpustných proteinů, tuků, cukrů, škrobů a pektinů a jako obsah NDF se stanoví zbytek buněčných stěn rostlinných pletiv (celulóza, hemicelulóza a lignin). Navážka a odtučnění: Vzorky s neznámým obsahem tuku byly předběžně odtučněny. Do filtračního kelímku bylo naváženo 1 g vzorku krmiva (mo) s přesností 0,050 g, kelímek 45

byl umístěn do studené extrakční jednotky a bylo přidno 10 až 20 ml acetonu, který byl ponechán, aby volně protékl po dobu nejméně 5 min. Během té doby byl obsah kelímku 3 krát promíchán. Tento postup byl opakován 4 krát, pak byl aceton pomocí vakua odsát, kelímek se vzorkem byl ponechán stát volně na vzduchu nejméně 10 min, aby se odstranily stopy acetonu. Hydrolýza neutrálně detergentním činidlem: Do filtračních kelímků s navážkou vzorku bylo přidáno 0,5 g g bezvodého siřičitanu sodného a kelímky byly umístěny do horké jednotky hydrolyzačního přístroje. Do každého z nich bylo přidáno 100 ml neutrálně detergentního činidla roztok A  ve 150 ml vody bylo rozpuštěno 14,6 g Chelatonu III (sodná sůl kyseliny etylediaminotetraoctové) a 6,8 g tetraboritanu sodného (dekahydrát), roztok B – ve 100 ml vody bylo po ohřátí rozpuštěno 11,5 g hydrogenfosforečnanu sodného (dodekahydrát); roztoky A a B byly smíchány a doplněny vodou na objem 700 ml, za stálého míchání a mírného zahřívání bylo v roztoku rozpuštěno 30 g laurylsulfátu sodného, přidáno 10 ml 2-ethoxyethanolu pro snížení pěnění a objem byl upraven 950 ml; takto upravený roztok byl ponechán stát do druhého dne, pak bylo upraveno pH na 6,9 až 7,1 a doplněn na objem 1000 ml a kelímky byly promíchány pomocí zpětného tlaku, což je důležité hlavně u škrobnatých krmiv. Následně bylo přidáno 50 l tepelně stálé alfa-amylázy, k promíchání byl opět použit zpětný tlak a během 10 min byl přiveden k mírnému varu. Var trval 1 h, v případě pěnění byly stěny trubice opláchnuty minimálním množství neutrálně detergentního činidla. Filtrace: Po ukončení hydrolýzy bylo činidlo odfiltrováno za použití mírného vakua, bylo přidáno 30 ml horké vody a 2 ml standardizovaného amylázového roztoku, směs se promíchá pomocí zpětného tlaku přístroje a po 60 s bylo činidlo odsáto. Bylo přidáno opět 30 ml horké vody, která byla po 3 min až 5 min opět odsáta. Pokud byla filtrace obtížná, byly přidány další 2 ml amylázového roztoku. Když byl zbytek na filtru průsvitný a filtrace byla stále obtížná, upustí se od třetího promývání, v případě ucpání byl použit mírný zpětný tlak. Kelímky byly přemístěny do studené jednotky, bylo přidáno 10 ml acetonu, obsah byl promíchán pomocí zpětného tlaku a po 3 min až 5 min byl aceton odsát. Tento postup byl opakován 3 krát. Po závěrečném odsátí acetonu byl kelímek ponechán stát volně na vzduchu nejméně 10 min, aby došlo k odstranění stop acetonu. Sušení a spálení: Kelímek byl sušen minimálně 6 h v sušárně při 105 °C. Po vychladnutí v exsikátoru a zvážení (m1) byl kelímek vložen do muflové pece a spalován 5 h při 500 °C. Po vychladnutí v exsikátoru byl kelímek opět zvážen (m2). Obsah NDF (%) = 100 . (m1 - m2) / m0 kde: m1 = hmotnost filtračního kelímku s vysušeným hydrolyzačním zbytkem (g) m2 = hmotnost filtračního kelímku s popelem (g) mo = hmotnost navážky vzorku (g)

46

Acidodetergentní vláknina (Acid Detergent Fibre – ADF) Kyselá detergentní vláknina byla stanovena na základě ČSN EN ISO 13906 [131] za pomoci zařízení Fibertec, jako lignocelulózový zbytek buněčných stěn rostlinných pletiv, který se stanoví vážkově po kyselé hydrolýze vzorku krmiva v prostředí kyselého roztoku cetyltrimetylamonium bromidu. Do předem vysušeného filtračního kelímku byl navážen 1 g vzorku krmiva (mo) s přesností 0,001 g a kelímek byl umístěn do horké jednotky hydrolyzačního přístroje. Bylo přidáno 100 ml acidodetergentního činidla (20,0 g CTAB v 0,5 mol/l H2SO4), obsah byl přiveden pod zpětným chladičem k varu a vařen přesně 60 min. Potom byl var přerušen, obsah kapaliny se za použití sníženého tlaku odpustil přes filtrační kelímek a pevný podíl byl promyt 3 krát asi 30 ml horké vody, vždy až do úplného odsátí kapaliny. Potom byl filtrační kelímek vyjmut a umístěn do studené jednotky hydrolyzačního přístroje, kde byl za použití sníženého tlaku promýván 2 krát asi 5 ml acetonu. Po odpaření acetonu byl kelímek sušen minimálně 6 h v sušárně při 105 °C. Po vychladnutí v exsikátoru a zvážení (m1) byl kelímek vložen do muflové pece a spalován při 525 °C po dobu 5 h. Po vychladnutí v exsikátoru byl kelímek opět zvážen (m2). Obsah ADF (%) = 100 . (m1 - m2) / m0 kde: m1 = hmotnost filtračního kelímku s vysušeným hydrolyzačním zbytkem (g) m2 = hmotnost filtračního kelímku s popelem (g) mo = hmotnost navážky vzorku (g) Netto energie pro laktaci (Net Energy for Lactation – NEL) Netto energie (NE) krmiva se vypočítává z obsahu metabolizovatelné energie (ME) vynásobené koeficientem využití ME, přičemž výpočet obsahu NE předpokládá stanovení obsahu brutto energie (BE) a metabolizovatelné energie (ME) použitého krmiva. Vzorec pro výpočet netto energie laktace: NEL = ME . [0,4632 + 0,24 . q] kde: q = koeficient metabolizovatelnosti energie, q = ME / BE 4.3.2.2 Stanovení fytoestrogenů – daidzein, genistein a glycitein Stanovení obsahu fytoestrogenů v krmivech a zbytcích krmiv bylo provedeno partnerským pracovištěm Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze. Byly použity metodické postupy dle metodické příručky „Sójové isoflavony v krmné dávce laktujících dojnic a jejich prostup do mléka“ [132]. Reprezentativní část vzorku krmiv a zbytků krmiv byla lyofilizována, homogenizována a extrakcí směsí methanol/voda na ultrazvukové lázni byl stanoven obsah isoflavonů (daidzeinu, genisteinu a glyciteinu). Obsah celkového daidzeinu, genisteinu a glyciteinu byl stanoven po hydrolýze 0,6 M kyselinou chlorovodíkovou v 98% ethanolu a extrakty byly přečištěny metodou SPE na kolonkách Oasis HLB. 47

Identifikace a kvantifikace byla provedena metodou vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) s detekcí diodovým polem (DAD). K identifikaci vzorků byl použit chromatografický systém HPLC HP 1200 (Hewlett Packard, USA) a DAD detektor (Hewlett Packard HP 1200, USA) s analytickou kolonou s reverzní fází C18 (Discovery C18, 15 cm × 3 mm × 5 μm, SUPELCO) s C18 předkolonou (Discovery Guard column C18, 2 cm × 4 mm × 5 µm, SUPELCO) za podmínek – doba analýzy vzorku: 12 min, objem nástřiku: 10 l, teplota kolony 45 °C a průtok mobilní fáze: 0,7 ml/min. Mobilní fázi tvořila směs roztoku A – 0,1% vodný roztok kyseliny octové a B – Methanol, na základě gradientové eluce. Retenční časy sledovaných analytů při daných vlnových délkách byly následující: daidzein – 8,7 (248 nm), glycitein – 9,5 (260 nm), genistein – 10,8 (258 nm). Identifikace analytů byla prováděna porovnáním retenčního času ve standardu a v analyzovaném vzorku (Obr. 15) a konfirmována absorpčním spektrem. Kvantitativní vyhodnocení bylo založeno na metodě kalibrační přímky.

Obr. 15: Ukázka chromatogramu směsného standardu isoflavonů (daidzein 5 µg/ml, glycitein 5 µg/ml, genistein 5 µg/ml) a chromatogram extraktu vzorku sóji (daidzein 8 µg/ml, glycitein 3 µg/ml, genistein 12 µg/ml)

4.3.3 Analýzy vzorků mléka a mléčných výrobků Během analýz vzorků mléka mléčných výrobků byly stanoveny základní složky mléka a obsah fytoestrogenů  daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a ekvolu. 4.3.3.1 Stanovení základních složek Jako základní složky mléka, které současně zahrnují i kontrolu mléčné užitkovosti dojnic, byly, ve spolupráci s Českomoravskou společností chovatelů, a.s. (Laboratoř pro rozbory mléka, Brno - Tuřany), laboratorně stanoveny: Sušina/tukuprostá sušina, bílkoviny, tuk, kasein, laktóza, močovina a počet somatických buněk.

48

Sušina Sušina mléka byla stanovena, jako podíl zbývající po vysušení 5 ml vzorku v hliníkovém kelímku (s asi 20 g vysušeného křemenného písku), po 3 hodinách sušení při 102-105 °C. Sušina (%) = [hmotnost vysušeného vzorku (g) / navážka vlhkého vzorku (g)] . 100 Tukuprostá sušina Tukuprostá sušina byla stanovena, jako součet hlavních složek mléka a konstanty představující obsah minerálií a odvození na základě lokálních zkušeností Českomoravskou společností chovatelů, a.s. Obsah bílkovin, tuku a laktózy Obsah bílkovin, tuku a laktózy byl stanoven infračerveným absorpčním analyzátorem Bentley FTS/FCM (Bentley Instruments Inc., USA), viz obrázek 16, který měří množství absorbovaného světla vazbami chemických skupin typických pro příslušný analyt (Tab. 9). Jednalo se tedy o nepřímou metodu měření.

Obr. 16: Stanovení obsahu bílkovin, tuku a laktózy

49

Tab. 9: Stanovení základních složek mléka infračerveným absorpčním analyzátorem Složka

Množství absorbovaného světla

Bílkoviny

sekundárními amidovými skupinami peptidických vazeb (při g/100g 6460 nm)

Tuk

karbonylovými skupinami esterových vazeb glyceridů (při 5730 g/100g nm) a CH2 a CH3 skupinami řetězců mastných kyselin (při 3480 nm)

Laktóza

hydroxylovými skupinami disacharidů (při 9610 nm)

g/100g

Kasein

na základě dlouhodobých zkušeností Českomoravské společnosti chovatelů, a.s.

g/100g

Jednotky

Obsah močoviny Obsah močoviny byl stanoven pomocí specifické enzymaticko-konduktometrické metody, pomocí zařízení UREAKVANT 4 Analyzer (AGROSLUŽBY Olomouc, s.r.o., Česká republika, Obr. 17). Je to metoda, při které je močovina obsažena v mléce enzymaticky (fixovaná ureáza) štěpena v prostoru během průtoku mléka reaktorem (enzymový vodivostní biosenzor) na rozkladné produkty, které zvyšují bazální elektrickou konduktivitu. Rozsah této změny byl snímán vodivostními čidly umístěnými před a za reaktorem. Hodnota uvedeného rozdílu byla kalibrována podle známých koncentrací močoviny v připravených mléčných laboratorních standardech (v mg/100 ml mléka; pro přepočet močoviny na mmol / litr mléka se hodnota zjištěná v mg/ 100 ml dělí šesti). Referenční standardy byly 12, 24, 36, 48 a 60 mg močoviny na 100 ml mléka. Kontrolní vzorek na mléčné bázi byl zbaven nativní močoviny a ureolytické aktivity a adjustován na hodnotu 30 mg močoviny na 100 ml mléka arteficiálním přídavkem močoviny.

Obr. 17: Stanovení obsahu močoviny

50

Počet somatických buněk Počet somatických buněk v syrovém mléce byl stanovován pomocí fluoro-optoelektronické metody, Bentley Somacount 150 (Bentley Instruments Inc., USA, Obr. 18). Testované mléko bylo po smíchání s tlumivým a barvícím roztokem naneseno v tenkém filmu na rotující disk v podobě "nekonečného pásu" nebo nastříknuto, jako průtočný paprsek do kapiláry. Obarvená buněčná jádra ve filmu nebo paprsku, emitují po vybuzení světelné záření, které bylo registrováno detektorem, jako elektronický impuls, který byl po zesílení a filtraci pomocí diskriminačních hladin zachycen, jako přítomnost somatické buňky. Jejich počet byl odečítán v tisících v 1 ml mléka.

Obr. 18: Stanovení počtu somatických buněk 4.3.3.2 Stanovení fytoestrogenů – daidzein, genistein, glycitein a ekvol Stanovení obsahu fytoestrogenů v mléku a mléčných výrobcích bylo provedeno partnerským pracovištěm Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze. Byly využity metodické postupy dle uplatněné certifikované metodiky „Stanovení fytoestrogenních látek v biologickém materiálu a mléčných výrobcích“ [133]. Obsah fytoestrogenů byl sledován v tomto materiálu: mléko syrové, odstředěné, plnotučné, mléko před pasterací a po pasteraci, smetana, syrovátka, sýr po výrobě, sýr na konci zrání, jogurt po výrobě, jogurt na konci skladování Reprezentativní část vzorku tvrdého sýra byla lyofilizována, homogenizována a pomocí acetonu byly vysráženy bílkoviny. Obdobně byly vysráženy také bílkoviny u rozmražených a homogenizovaných vzorků mléka, smetany a jogurtu. Po protřepání a odstředění byl aceton odpařen na rotační vakuové odparce a ke vzorku v srdcové baňce byl přidán acetátový pufr (pH 5) a enzym β-glukuronidasy/sulfatasy (H. pomatia). Enzymový hydrolyzát byl následně extrahován ethylacetátem a organické podíly byly po vymražení zbytků tuku odstředěny na rotační odstředivce. Horní vrstva (bez tuku) byla odebrána, odpařena a odparek byl rozpuštěn v 50 % methanolu pomocí ultrazvuku. 51

Identifikace a kvantifikace byla provedena metodou ultra-účinné kapalinové chromatografie (UPLC) ve spojení s tandemovým hmotnostním spektrometrem (MS/MS) s využitím chrysinu, jako vnitřního standardu. K identifikaci vzorků byl požit přístroj ACQUITY UPLC™, Waters s analytickou kolonou s reverzní fází typu ACQUITY, BEH C18 (50 x 2,1 mm; 1,7 µm), Waters za podmínek – doba analýzy vzorku: 9 min, objem nástřiku: 2 l, teplota kolony 35 °C a teplota autosampleru: 10 °C. Mobilní fázi tvořila směs roztoku A – 0,1% vodný roztok kyseliny octové a B – Methanol, na základě gradientové eluce. Retenční časy sledovaných analytů byly následující: daidzein  3,42, glycitein  3,58, ekvol  3,77, genistein  3,99 a vnitřní standard (chrysin)  4,98 min (Obr. 19). Detailní informace ke stanovení obsahu fytoestrogenů v mléku a mléčných výrobcích vč. parametrů hmotnostní spektrometrie jsou uvedeny ve výše citované publikaci [133]. XIC of -MRM (15 pairs): 240.9/119.0 Da ID Sample 4 (std 50) of vzorky mleko a mlecne vyrobky 09 .wif f

5.5e4 5.0e4

4.5e4 4.0e4

Intensity, cps

3.5e4

3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4

1.0e4 5000.0 0.0

1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 Time, min

Obr. 19: Ukázka chromatogramu směsného standardu isoflavonů (daidzein, genistein, glycitein a ekvol) o koncentraci 50 ng/ml a vnitřního standardu (chrysin) o koncentraci 10 ng/ml

52

5 VÝSLEDKY A DISKUSE V rámci této dizertační práce byly zpracovány výsledky dvou experimentů, fyziologický (Exp. 1) a poloprovozní (Exp. 2) experiment, provedených v rámci projektu č. 2B08073 Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování, který byl za podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT) řešen v letech 2008-2011, ve spolupráci tří výzkumných pracovišť, jejichž role byla následující: Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín – koordinátor projektu, jehož úkolem byla příprava metodik a vlastní provádění experimentů na dojnicích, odběry a prvotní zpracování vzorků pro všechny účastníky projektu, základní analýzy krmiv, zbytků krmiv, mléka, bachorové tekutiny, krevní plazmy, výkalů a moči, statistické vyhodnocení experimentů a interpretace zjištěných výsledků. MILCOM a.s., Praha – účastník projektu, se podílel na přípravě metodik experimentů na dojnicích, jehož hlavním úkolem bylo technologické zpracování mléka na sýry s nízkodohřívanou sýřeninou a jogurty, odběr a prvotní zpracování vzorků během technologického zpracování, vyhodnocení průběhu technologického zpracování mléka a také podíl na interpretaci zjištěných výsledků. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze – účastník projektu, se podílela na přípravě metodik experimentů na dojnicích, jehož hlavním úkolem byly analýzy výše uvedených vzorků na obsah fytoestrogenních látek a také podíl na interpretaci zjištěných výsledků. Výsledky prezentované v této dizertační práci byly tedy řešeny s využitím dostupných metod a přístrojů pod Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o., Rapotín, ve spolupráci s Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze a společností MILCOM a.s., Praha.

5.1

FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1)

V rámci fyziologického experimentu byl u pokusných zvířat sledován příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka. Dále byla vypočtena zdánlivá návranost isoflavonů, která určuje míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka pokusných zvířat. Změny v obsahu isoflavonů byly sledovány během technologické zpracování mléka, tedy v mléku syrovém/odsředěném, smetaně, plnotučném mléku před/po pasteraci, jogurtu po výrobě/na konci skladování, syrovátce a sýru po výrobě/na konci zrání.

5.1.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka Příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem isoflavonů je uveden v tabulce 10. Příjem sušiny, popele, dusíkatých látek, tuku a NEL ve skupině K byl nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05). Celkový denní příjem hrubé vlákniny, NDF a ADF nebyl pokusným zásahem ovlivněn (P0,05).

53

Tab. 10: Průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S) Ukazatel

Jednotky

K

S

SEM

kg/d

16,8*

17,8*

0,21

Popel

kg/d

1,2*

1,4*

0,02

CF

kg/d

3,0

3,1

0,06

NDF

kg/d

5,9

6,2

0,11

ADF

kg/d

3,3

3,4

0,06

NL

kg/d

9,5*

10,7*

0,23

Tuk

kg/d

0,5*

0,6*

0,01

NEL

MJ/d

97,2*

103,7*

1,52

Daidzein

mg/d

1,0*

438,7*

7,62

Genistein

mg/d

0,8*

681,8*

11,44

Glycitein

mg/d

1,0*

164,2*

5,18

CELKEM

mg/d

2,9*

1284,7*

24,24

Sušina Příjem živin

Příjem isoflavonů

CF (Crude fiber) – hrubá vláknina; NDF (neutral detergent fibre) – neutrálně detergentní vláknina; ADF (Acid detergent fibre) – acidodetergentní vláknina; NL – dusíkaté látky; NEL (Net energy of lactation) – netto energie laktace; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05

Široká škála sójových produktů, hojně využívaná k výživě laktujících dojnic, je považována za zdroj vysoce kvalitního proteinu a energie [7]. Sójové produkty jsou však bohaté také na obsah isoflavonů, jejichž koncentrace se v těchto produktech pohybuje v rozmezí 1,2-4,2 mg/g sušiny [72, 134]. Extrudovaná plnotučná sója použitá v tomto experimentu obsahovala 377,9 mg/kg daidzeinu, 558,2 mg/kg genisteinu a 129,6 mg/kg glyciteinu, tj. celkem 1065,7 mg/kg isoflavonů. Naše hodnoty se pohybují na dolní hranici výše uvedeného rozmezí, ale v porovnání s prací Třináctý a kol. [135], který provedl ve své studii experiment se stejným typem krmiva, byly námi zjištěné koncentrace isoflavonů vyšší. V literatuře však bylo prokázáno, že obsah isoflavonů v sóji je variabilní v závislosti na kultivaru, růstu, environmentálních faktorech, stresových podmínkách, skladování a následném zpracování [67, 127, 136]. Denní příjem daidzeinu, genisteinu a glyciteinu byl, dle předpokladu, ve skupině K nižší ve srovnání s pokusnou skupinou S (P<0,05). Denní příjem celkových isoflavonů ve skupině K byl zanedbatelný (2,9 mg/d), zatímco ve skupině S činil 1284,7 mg/d. Avšak v porovnání s prací Třináctý a kol. [135], celkový denní příjem isoflavonů u skupiny S byl v našem 54

experimentu nižší, což může být způsobeno nižším poměrem extrudované plnotučné sóji v krmivu. Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce je uvedena v tabulce 11. Mléčná užitkovost ve skupině K byla nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05), užitkovost dojnic vyjádřená ve 4% FCM však nebyla pokusným zásahem ovlivněna (P0,05). Obsah tuku v mléce byl obdobný v obou skupinách, ve skupině K i skupině S (P0,05). Obsah bílkovin a kaseinu byl ve skupině K vyšší ve srovnání s pokusnou skupinou S (P<0,05). Naopak, obsah laktózy a močoviny byl ve skupině K nižší než ve skupině S (P<0,05). Ačkoliv mléčná užitkovost ve skupině K byla signifikantně nižší v porovnání se skupinou S, mléčná užitkovost vyjádřená ve 4% FCM naznačovala pouze trend k nižším hodnotám. Námi zjištěné výsledky jsou v souladu s prací Kudrna a Marounek [137] nebo Komprda a kol. [138], kteří také ve svých studiích nezaznamenali rozdíl v mléčné užitkovosti u dojnic krmených řepkovým šrotem v porovnání s extrudovanou plnotučnou sóju. Vzhledem k dosažené rozdílné užitkovosti v obou skupinách (ve skupině K i skupině S), nebyl zjištěn průkazný rozdíl u denní produkce tuku, proteinu a kaseinu (P0,05). Denní produkce laktózy byla ve skupině K nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05). Rozdíl v koncentraci isoflavonů (daidzeinu a genisteinu) v mléce mezi skupinou K a skupinou S nebyl průkazný (P>0,05), numericky vyšší hodnoty u skupiny S byly však zaznamenány, jak u daidzeinu (36,5 vs. 40,3 g/l), tak i u genisteinu (170,6 vs. 175,8 g/l). Naproti tomu, denní produkce daidzeinu byla průkazně nižší ve skupině K v porovnání se skupinou S (P<0,05) a tentence k vyšším hodnotám u skupiny S byla zaznamenána také u genisteinu. Koncentrace glyciteinu a ekvolu v mléce, stejně tak i denní produkce těchto složek, byla ve skupině K nižší než ve skupině S (P<0,001). Ačkoliv celková koncentrace isoflavonů v mléce nebyla signifikantní, pouze tendence k vyšším hodnotám ve skupině S (P=0,08), denní produkce isoflavonů byla ve skupině K průkazně nižší (4134,9 g/d) než ve skupině S (5021,8 g/d, P<0,01).

55

Tab. 11: Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S) Ukazatel

Jednotky

K

S

SEM

Dojivost

kg/d

17,6*

19,5*

0,48

4% FCM

kg/d

19,0

20,9

0,68

Tuk

g/kg

45,1

44,9

1,05

Bílkovina

g/kg

36,5*

34,4*

0,19

Kasein

g/kg

29,1*

27,4*

0,15

Laktóza

g/kg

46,5*

47,9*

0,21

mg/100 ml

16,5*

19,4*

0,49

Tuk

g/d

798

872

32,90

Bílkovina

g/d

639

672

16,44

Kasein

g/d

508

534

13,04

Laktóza

g/d

816*

934*

23,68

Mléčná užitkovost

Močovina Produkce složek mléka

Koncentrace isoflavonů v mléce Daidzein

µg/l

36,5

40,3

1,88

Genistein

µg/l

170,6

175,8

8,36

Glycitein

µg/l

23,4***

27,9***

0,77

Ekvol

µg/l

3,6***

15,6***

1,08

CELKEM

µg/l

234,1

259,6

9,88

Produkce isoflavonů v mléce Daidzein

µg/d

643,9*

776,9*

33,72

Genistein

µg/d

3008,6

3396,2

144,37

Glycitein

µg/d

417,1***

543,2***

19,58

Ekvol

µg/d

65,2***

305,5***

21,92

CELKEM

µg/d

4134,8**

5021,8**

219,59

FCM (= Fat-corrected milk) mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství tuku, tj. 4%; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001

Koncentrace isoflavonů v mléce je v souladu s publikací Třináctý a kol. [135]. Nicméně, na základě předchozích studií, koncentrace ekvolu byla nižší, než bylo předpokládano. Možným vysvětlením těchto rozdílů by mohly být degradační změny probíhající v bachoru. Metabolická aktivita ananerobních bakterií bachoru je velmi závislá na změně pH, redoxním

56

potenciálu, anaerobních podmínkách a teplotě uvnitř bachoru [139, 140, 141], proto např. tyto faktory společně se způsobenými rozdíly v technologické úpravě sóji mohou ovlivnit úroveň degradace isoflavonů v bachoru. Nízká hladina isoflavonů v mléce byla detekována, stejně jako v předchozí studii Třináctý a kol. [135], také u kontrolní skupiny (skupiny K), ačkoliv celkový příjem isoflavonů v této skupině byl velmi nízký (pouze 2,9 mg/d). Jak již bylo však uvedeno dříve, složení mikrobiální populace bachoru je velice široké, v bachoru jsou tři skupiny mikroorganismů (bakterie, prvoci a houby), přičemž počet bakteriálních druhů dosahuje hodnot 300-400 [142], a je závislé na mnoha faktorech. V tomto případě, v závislosti na dlouhodobém podávání standardní krmné dávky dojnicím, před provedením experimentu, mohlo dojít k selekci určitého druhu mikroorganismů, které zapříčinily zvýšený nárůst isoflavonů v mléce i na úkor nízkého příjmu. Podobná zjištění (výskyt isoflavonů v mléce při zanedbatelném dietárním příjmu isoflavonů) však byla zmíněna i v jiných pracech [122, 135, 143].

5.1.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů V tabulce 12 je vypočtena tzv. apparent recovery (tj. zdánlivá návratnost) určující míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic obou skupin. Zdánlivá návratnost daidzenu, genisteinu a glyciteinu ve skupině K se pohybovala v řádu stovek až tisíců, zatímco ve skupině S dosahovala velmi nízkých hodnot (P<0,001). Podobné výsledky byly však zaznamenány také v již dříve publikovaných studiích [122, 123, 144], které se zabývaly zdánlivou návraností fytoestrogenů z červeného jetele. Steinshamn a kol. [123] potvrdil, že míra prostupu isoflavonů z krmiva do mléka je vyšší při nízkém příjmu než při vyšším příjmu celkových isoflavonů. Tab. 12: Zdánlivá návratnost isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S) Ukazatel

Jednotky

K

S

SEM

Návratnost daidzeinu

µg/mg

670,7***

2,5***

26,07

Návratnost genisteinu

µg/mg

3568,5***

5,0***

160,79

Návratnost glyciteinu

µg/mg

393,5***

3,9***

13,00

SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; *** hodnoty se průkazně liší P<0,001

5.1.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka V předchozích letech bylo publikováno několik studií zabývajících se sledováním koncentrace isoflavonů v různých rostlinách a potravinách rostlinného původu [145, 146, 147, 148]. Nicméně, studií zabývajících se prostupem isoflavonů z krmiva do mléka laktujících dojnic je poměrně málo, většina z těchto prací používá, jako zdroj isoflavonů, krmiva z jetele červeného nebo bílého. Bylo zjištěno, že obsah isoflavonů v mléce kolísá v závislosti na mnoha faktorech, kterými jsou mimo jiné složení krmné dávky nebo roční období. Tak např. koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmnou dávkou založenou na červeném 57

jeteli se může pohybovat v rozmezí 14-643 g/l, v závislosti na příjmu isoflavonů [12, 122, 123, 124, 125, 128], zatímco koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmivem sójového původu byla 55 g/l [135]. Nebo např. koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmnou dávkou založenou na různé zralosti či počtu sklizně u červeného jetele se může pohybovat v rozmezí hodnot 458-643 g/l [122]. King s kol. [12] také zaznamenal rozdílné koncentrace ekvolu (45-293 g/l) ve vzorcích mléka z několika různých australských farem, přičemž nejvyšší hodnoty byly ve vzorku ze západní austrálie, odebraného na jaře, když dominantní část pastvy tvoří na isoflavony bohatý jetel. Obsah isoflavonů ve vzorcích mléka odebraných během technologického zpracování je znázorněn na obrázku 20. Obsah celkových isoflavonů v mléce syrovém 47,6 g/l, odstředěném 43,5 g/l a smetaně 49,4 g/l ve skupině K byl obdobný, jako u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (skupina S; 45,4 g/l v mléce syrovém, 50,2 g/l v mléce odstředěném a 47,7 g/l ve smetaně). Pozn.: Statistické hodnocení u dat získaných během technologického zpracování mléka nebylo provedeno, protože byly získány pouze dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2).

Obr. 20: Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Publikovaných dat vztahujících se k obsahu isoflavonů v mléčných produktech je nedostatek, ale např. Kuhnle s kol. [149] analyzoval 115 vzorků potravin živočišného původu a jim odpovídající vegetariánské náhražky na obsah celkových fytoestrogenů a ekvolu. Na základě této studie byl zjištěn nízký obsah isoflavonů a ekvolu ve všech vzorcích mléka a komerčně dostupných mléčných výrobcích s vyjímkou másla, ve kterém ekvol nebyl zjištěn. Celkový obsah isoflavonů v jejich studii u syrového a odstředěného mléka, smetany a jogurtu byla značně nižší než koncentrace isoflavonů sledovaná v našem experimentu u kontrolní 58

skupiny (skupina K). Avšak koncentrace ekvolu v produktech sledovaných v jejich studii byla vyšší v porovnání s kontrolní skupinou (skupina K), ale naopak nižší než u pokusné skupiny (skupina S), v tomto experimentu. Na obrázku 21-22 je uveden vliv tepelného ošetření mléka (pasterace mléka), výroby a skladování jogurtů. Na základě předchozích studií bylo potvrzeno, že isoflavony nejsou tepelně labilní, tedy že nepodléhají rozkladu vlivem tepelného zpracování, ale mohou vlivem vysokých teplot přecházet v jiné formy [99, 101, 150]. Ztráty isoflavonů zaznamenané během tepelného zpracování byly často přisuzovány ztrátám způsobeným uvolnění isoflavonů např. do vody, ve kterém byla daná potravina vařena [30, 98, 99, 100, 101]. Pasterizace, která v tomto experimentu probíhala při 65 °C po dobu 30 min., neměla žádný vliv na jednotlivé isoflavony ani ve skupině K či skupině S. Podobné výsledky publikovali King a kol. [12] pro ekvol a genistein v mléku dojnic krmených červeným jetelem po pasterizaci, ačkoliv v publikaci nebyly blíže specifikovány podmínky pasterizace. Také Uzzan a kol. [150] a autoři Uzzan a Labuza [22] neshledali žádný vliv na obsah daidzeinu, genisteinu a glyciteinu v isoflavony obohaceném mléce při záhřevu na 72, 121, 140 a 140 °C po dobu 120, 24, 2 a resp. 20 sec.

Obr. 21: Vliv pasterace mléka na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol V průběhu fermentace jogurtovou kulturou byl zaznamenán pokles v pH u obou sledovaných skupin, u skupiny K i skupiny S (z 6,55 na 4,18 resp. z 6,53 na 4,20). Pokles pH byl totožný v obou skupinách. V dostupné literatuře nebyla nalezena studie sledující změny obsahu isoflavonů během fermentace a skladování isoflavony obohacené mléčné produkty. V několika studiích [62, 150, 151] byl však sledován vliv fermentace na sójové produkty 59

s odlišnými kmeny bakterií a vliv následného skladování fermentačních produktů především se zaměřením na -glukosidázovou aktivitu sledovaných bakteriálních kmenů a zhodnocením konverze isoflavonových glukosidů na aglykony, které jsou u člověka mnohem rychleji absorbovány a to ve větším množství než isoflavonové glykosidy [152]. V této studii celková koncentrace isoflavonů v jogurtu po záhřevu na 37 °C po dobu fermentace 16-18 h poklesla z 239,6 na 239,2 g/l u skupiny K, zatímco u skupiny S byl zaznamenán pokles z 246,5 na 237,2 g/l. Tyto závěry jsou v souladu s dalšími studiemi Chen a kol. [151], Tsangalis a kol. [62] nebo King a Bignell [153], kteří uvedli, že ztráty v celkovém obsahu isoflavonů jsou způsobeny hydrolytickým odštěpením glukosy z glukosidů, které přispívají k množství isoflavonů, jako glukosidové formy. Podobně, Tsangalis s kol. [62] zaznamenal signifikantní ztráty v obsahu celkových isoflavonů během fermenatce sójového mléka, kde došlo pouze k enzymatické hydrolýze glukosidů isoflavonů. Koncentrace ekvolu během fermentace mírně vzrostly u obou sledovaných skupin (ze 4 na 6 g/l u skupiny K a z 26,7 na 26,8 g/l u skupiny S). I když dostupných dat k objasnění tohoto jevu je nedostatek, nedávné studie prokázaly, že ekvol se může ve fermentovaných produktech vyskytovat, jako výsledek fermentace několika bakterálních kmenů. Např. Tsangalis a kol. [62] zaznamenali ekvol v sójovém mléce fermentovaném Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium longum-a a Bifidobacterium animalis. V této studii, jogurtové kultury pravděpodobně přispěly ke zvýšení koncentrace ekvolu přeměnou daidzeinu na ekvol. Koncentrace isoflavonů po jednoměsíčním skladování jogurtu mírně poklesla v obou skupinách (z 239,2 na 236,4 g/l u skupiny K, z 237,2 na 231,1 g/l u skupiny S). Podobné výsledky byly publikovány skupinou Otieno a kol. [154] pro sójové mléko fermentované Bifidobacterium animalis a skladované 8 týdnů při 4 °C. Tento pokles je způsoben pravděpodobně rozkladnými reakcemi glukosidů isoflavonů (daidzin, genistin a glycitin), které nejsou během skladování stabilní, na aglykony (daidzein, genistein a glycitein) a následně vznikem jejich metabolitů [155]. Genistein je metabolizován na 6'-hydroxy-Odesmethylalgolensin, 2,4,6-trihydroxybenzoovou kyselinu a p-ethylfenol, zatímco hlavními metabolity daidzeinu jsou O-desmethylalgolensin a ekvol [156, 157].

60

Obr. 22: Vliv výroby a skladování jogurtu na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Vliv výroby a zrání sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na obsah jednotlivých isoflavonů je znázorněn na obrázku 23. Z celkového množství 5 kg pasterizovaného mléka, použitého pro výrobu sýra, bylo připraveno 0,68 kg ve skupině K a 0,67 kg sýra ve skupině S. Sýr po výrobě obsahoval 576,0 a 581,9 g/kg sušiny a 14,4 a 14,3 g/kg solí (pro skupinu K resp. skupinu S). Koncentrace jednotlivých isoflavonů (daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a ekvolu) v syrovátce byla 43,3; 156,4; 12,1 a 4,3 g/l ve skupině K a 42,3; 151,2; 13,2 a 11,3 g/l ve skupině S. Celková koncentrace isoflavonů v syrovátce pak byla 216,1 vs. 218 g/l (u skupiny K vs. skupiny S). Poměrně vysoká koncentrace isoflavonů v syrovátce však odpovídá výsledkům z dostupné literatury, které potvrzují, že i isoflavony během zpracování sóji přechází alespoň částečně do syrovátky nebo melasy, které mohou být dalším využitelným zdrojem bohatým na isoflavony [101, 158]. Během srážení bílkovin mléka byl zaznamenán pokles pH z původních 6,44 a 6,42 (pH mléka před srážením) na 6,08 a 6,10 (pH sýra po zpracování) u skupiny K a skupiny S. Hodnoty pH sýra stanovené na začátku (1 den) a na konci (90 den) zrání bylo 5,17 a 5,40 u skupiny K a 5,20 a 5,35 u skupiny S, v tomto pořadí. Změna pH byla patrná u obou skupin (u skupiny K i skupiny S). Vzhledem k tomu, že nebyly v dostupné literatuře dohledány studie, které by se zabývaly vlivem zpracování a zrání sýrů na koncentraci isoflavonů, diskuse těchto výsledků byla velice obtížná. Nicméně, např. Kuhnle a kol. [149] uvádí, že koncentrace celkových isoflavonů u 27 odlišných typů sýra vyrobeného různými výrobci se pohybovala v rozmezí 1-17 g/100 g a koncentrace ekvolu 1-14 g/100 g, což je srovnatelné s výsledky v této dizertační práci. Během 90 dnů zrání došlo k vyššímu poklesu koncentrace celkových isoflavonů u skupiny K (z 98,7 na 54,1 mg/kg; tedy cca o 45 %) v porovnání se skupinou S (ze 78,1 na 54,6 61

mg/kg; tedy cca o 30 %). Ačkoliv ztráty isoflavonů během zrání byly u obou skupin poměrně vysoké (daidzein cca o 44 vs. 33 %, genistein cca o 48 vs. 27 %, glycitein cca o 43 vs. 25 % a ekvol cca o 46 vs. 34 %, pro skupinu K vs. skupinu S), koncentrace jednotlivých isoflavonů, především pak ekvolu, jsou v isoflavony obohacených sýrech stále vysoké (16 mg/kg ve skupině S) a mohou být zdrojem ekvolu v lidské výživě.

Obr. 23: Vliv výroby a zrání sýra na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Přehled graficky zpracovaných dat pro fyziologický experiment (Exp. 1) je uveden v tabulce 16. Souhrnné porovnání obsahu sledovaných složek a celkového obsahu isoflavonů v rámci jednotlivých technologických kroků pro kontrolní (skupina K) i pokusnou (skupina S) skupinu je znázorněno na obrázku 28-30. Výsledky fyziologického experimentu, které vznikly ve spolupráci Výzkumného ústavu pro chov skotu, s.r.o., Rapotín, Vysoké školy chemicko-technologické v Praze a společností MILCOM a.s., Praha, v rámci projektu Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování, jehož poskytovatelem je Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT, Projekt č. 2B08073) byly publikovány formou recenzovaných vědeckých článků [159, 160].

62

5.2

POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2)

V rámci poloprovozního experimentu byl u pokusných zvířat sledován příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka. Dále byla vypočtena zdánlivá návranost isoflavonů, která určuje míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka pokusných zvířat. Změny v obsahu isoflavonů byly sledovány během technologické zpracování mléka, tedy v mléku syrovém/odsředěném, smetaně, plnotučném mléku před/po pasteraci, jogurtu po výrobě/na konci skladování, syrovátce a sýru po výrobě/na konci zrání.

5.2.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka Z doposud publikované literatury bylo zjištěno že, absorpce, biotransformace, metabolismus a biologická dostupnost isoflavonů je závislá na několika faktorech, např. na imunologickém stavu, stádiu gravidity či aktuálních podmínkách v trávicím traktu. Podle studií Cohen a kol. [161] či Nielsen a Williamson [162] absorpce a biologická dostupnost isoflavonů u člověka závisí na složení střevní mikroflóry, době zdržení v zažívacím traktu, obsahu vlákniny aj. Stejné faktory však ovlivňují také absorpci, biotransformaci a metabolismus isoflavonů u pokusných zvířat. Například složení mikrobiální populace bachoru je velice široké, v bachoru se vyskytují tři skupiny mikroorganismů (jak bakterie, prvoci, tak i houby), přičemž počet bakteriálních druhů dosahuje hodnot 300-400 [142] a je závislé na mnoha dalších faktorech. Několik předchozích studií také dokládá, že dlouhodobé zkrmování krmiva s vysokým obsahem sóji může narušovat reprodukční cyklus skotu, a to tím, že mění poměr mezi PEG2 a PGF2, což může způsobovat ranou embryonální mortalitu nebo zvyšovat počty inseminací nutných k zabřeznutí (inseminační index) [163, 164, 165, 166]. V druhé periodě našeho experimentu byla z pokusného sledování vyřazena dojnice č. 4 ze zdravotních důvodů (akutní mastitida). V tabulce 13 je uveden průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a příjem isoflavonů. Příjem sušiny a živin nebyl pokusným zásahem ovlivněn. U obou skupin (skupiny K i skupiny E) bylo dojnicím podáváno ve stejném množství stejné krmivo, které bylo ve skupině E doplněno 40% sójovým extraktem isoflavonů (Soybean isoflavones, Vita-Solar Biotechnology Co., Ltd., Čína), který byl zdrojem isoflavonů v krmné dávce pokusné skupiny (0,24 % v doplňkové krmné směsi). Tento 40% sójový extrakt isoflavonů obsahoval 9,6 mg/g daidzeinu, 0,4 mg/g genisteinu a 1,5 mg/g glyciteinu. Celkové množství isoflavonů v komerčně dostupném extraktu bylo 419,4 mg/g. Množství extraktu bylo vypočteno tak, aby celkový denní příjem isoflavonů v krmné dávce dosahoval 3 g. Toto množství bylo voleno s ohledem na denní příjmy isoflavonů dosahované v předchozích experimentech, kde byla jako zdroj isoflavonů použita různě technologicky upravena sója [132, 135]. Denní příjem isoflavonů ve skupině E byl 4616,8 mg. Tato hodnota byla výrazně vyšší než denní příjmy dosažené v obou výše uvedených pracích [132, 135]. Stejně tomu bylo i u kontrolní skupiny K, kde denní příjem isoflavonů dosahoval dokonce 541,8 mg. Příjem celkových isoflavonů (daidzenu a genisteinu) ve studii Třináctý a kol. [135] dosahoval hodnot 3297 mg/d v pokusné skupině (skupině E) dojnic krmených extrudovanou plnotučnou sójou 63

a 58 mg/d v kontrolní skupině (skupině K) dojnic krmených extrudovanými řepkovými pokrutinami. Pravděpodobným vysvětlením této skutečnosti je nepředpokládaný výskyt isoflavonů v kontrolní doplňkové krmné směsi, který se v jednotlivých odebraných vzorcích (vzorky byly odebírány v každé periodě) blížil k 140 mg/kg. Protože obě krmné směsi (u skupiny K i skupiny E) měly stejné složení základních surovin (viz kapitola 4.2 Poloprovozní experiment (Exp. 2), Tab. 8), je možné, že se na celkové denní expozici isoflavonů u skupiny E rovněž podílely, alespoň z části i další krmné komponenty. Tab. 13: Průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E) Ukazatel

Jednotky

K

E

SEM

kg/d

18,5

18,6

0,05

Popel

kg/d

1,4

1,4

0,02

CF

kg/d

2,9

2,9

0,04

NDF

kg/d

5,8

5,8

0,05

ADF

kg/d

3,6

3,6

0,02

NL

kg/d

3,0

3,0

0,04

Tuk

kg/d

0,9

0,9

0,04

NEL

MJ/d

118,6

118,7

0,04

Daidzein

mg/d

227,6*

1993,4*

221,2

Genistein

mg/d

154,4*

968,7*

149,4

Glycitein

mg/d

159,8*

1654,7*

153,8

CELKEM

mg/d

541,8*

4616,8*

524,4

Sušiny Příjem živin

Příjem isoflavonů

CF (Crude fiber) – hrubá vláknina; NDF (neutral detergent fibre) – neutrálně detergentní vláknina; ADF (Acid detergent fibre) – acidodetergentní vláknina; NL – dusíkaté látky; NEL (Net energy of lactation) – netto energie laktace; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05

Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce je uvedena v tabulce 14. Mléčná užitkovost (P>0,05) a užitkovost dojnic vyjádřená ve 4% FCM (P>0,05) nebyly pokusným zásahem ovlivněny. Obsah tukuprosté sušiny, bílkovin a kaseinu byl vyšší ve skupině K ve srovnání se skupinou E (P<0,05). Obsah tuku, laktózy a močoviny nebyl pokusným zásahem ovlivněn (P>0,05). Denní produkce jednotlivých složek mléka byla vyšší ve skupině K než ve skupině E (P<0,05). V dostupné literatuře nebyly doposud publikovány žádné práce, které by se zabývaly možností využití extraktů sójových isoflavonů ve výživě laktujících dojnic, se kterými by bylo možné naše výsledky porovnat. 64

Tab. 14: Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E) Ukazatel

Jednotky

K

E

SEM

kg/d

23,8

23,3

0,20

kg/d

23,4

22,5

0,49

Tukuprostá sušina

g/kg

85,7*

84,9*

0,15

Tuk

g/kg

38,7

37,5

0,59

Bílkovina

g/kg

32,1*

31,6*

0,18

Kasein

g/kg

25,3*

24,7*

0,13

Laktóza

g/kg

47,9

47,6

0,19

mg/100 ml

29,4

28,7

0,42

Tukuprostá sušina

kg/d

2,04*

1,97*

0,02

Tuk

g/d

926,6*

879,1*

15,09

Bílkovina

g/d

762,7*

732,2*

7,53

Kasein

g/d

597,9*

571,6*

5,57

Laktóza

g/d

1138,0*

1106,6*

10,13

Mléčná užitkovost Dojivost 4% FCM

#

Močovina Produkce složek mléka

Koncentrace isoflavonů v mléce Daidzein

µg/l

14,7

15,4

0,74

Genistein

µg/l

34,7

32,4

1,66

Glycitein

µg/l

4,5*

14,4*

0,91

Ekvol

µg/l

14,5*

76,8*

3,32

CELKEM

µg/l

68,4

139,0

6,62

Produkce isoflavonů v mléce Daidzein

µg/d

347,51

358,0

18,17

Genistein

µg/d

827,5

752,5

39,15

Glycitein

µg/d

94,3*

331,8*

23,41

Ekvol

µg/d

284,2*

1769,0*

79,55

CELKEM

µg/d

1553,5

3211,3

160,28

FCM (= Fat-corrected milk) mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství tuku, tj. 4%; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05

65

Koncentrace a celková denní produkce daidzeinu a genisteinu nebyla pokusným zásahem ovlivněna (P>0,05). Co se týče daidzeinu, koncentrace zjištěné v našem experimentu v obou skupinách, skupině K i skupině E, odpovídaly hodnotám zjištěným skupinou Třináctý a kol. [135]. Naproti tomu Flachowsky s kol. [127], který ve své práci použil jako zdroj isoflavonů odtučněný sójový šrot v různých hladinách, detekovali nízké hladiny daidzeinu (1,1 mikrog/kg) na konci periody s hladinou 30 % odtučněného sójového šrotu v sušině krmné dávky. Podle Falchowského a kol. [127] jsou vzniklé rozdíly způsobené různou úrovní metabolismu daidzeinu bachorovými mikroorganismy. Koncentrace genisteinu byla v obou skupinách (ve skupině K i skupině E) obdobná, stejné hodnoty zaznamenal i Třináctý a kol. [135] rovněž v obou sledovaných skupinách. Podobná zjištění publikoval i Flachowsky s kol. [127], který zjistil hladiny genisteinu ve všech sledovaných skupinách a udával, že podíl genisteinu z celkových isoflavonů v mléce se pohyboval v rozmezí 48,5-89,8 %. V našem pokusu byl podíl genisteinu z celkových isoflavonů na úrovni 50,7 % u skupiny K a 23,3 % u skupiny E, zatímco ve studii Třináctý a kol. [135] byly podíly genisteinu z celkových isoflavonů také vyšší, a to 68,3 % u skupiny kontrolní (skupiny K) a 34,6 % u skupiny pokusné (skupiny E). Obsah glyciteinu a ekvolu a také celková denní produkce glyciteinu, a zvláště pak ekvolu, byla ve skupině K nižší než ve skupině E (P<0,05). Tyto závěry jsou v souladu jak s výstupy z předchozího fyziologického experimentu, tak i s dalšími pracemi zaměřenými na transfer sójových isoflavonů do mléka [127, 135]. Koncentrace ekvolu v našem pokuse (76,8 g/l) byla výrazně vyšší než v obou uvedených studiích, kde obsah ekvolu v mléce byl 54,8 g/l [135] nebo se pohyboval v rozmezí 14,5 až 61,1 g/kg v závislosti na podílu sójových komponent v krmné dávce [127]. Koncentrace isoflavonů v mléce byla detekována, stejně jako v předchozí studii Třináctý a kol. [135] a v Exp. 1, také u kontrolní skupiny (skupiny K). Byla však vyšší než v obou zmíněných literárních odkazech a odpovídala zvýšenému příjmu isoflavonů ve skupině K. Flachowsky s kol. [127], který rovněž zjistil nízké hladiny isoflavonů v kontrolním mléce, které dosahovaly hodnot 82,5 a 66,6 g/kg) však soudí, že u zvířat dochází k deponování isoflavonů, které je delší než 21 dní.

5.2.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů V tabulce 15 je stejně jako v předchozím experimentu vypočtena tzv. apparent recovery (tj. zdánlivá návratnost) určující míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic. Rozdíl mezi skupinami v míře prostupu isoflavonů do mléka dojnic byl vysoce průkazný (P0,0001). Apparent recovery u daidzeinu a ekvolu, tj. isoflavonů jedné metabolické skupiny, byla ve skupině E na úrovni 1,1 µg/mg, což odpovídá hodnotám publikovaným pro plnotučnou extrudovanou sóju (1,3 µg/mg) [135]. Flachowsky a kol. [127] porovnávali míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic v závislosti na příjmu isoflavonů. Co se týče prostupu daidzeinu a ekvolu, vypočetl apparent recovery v rozmezí 2,0; 4,4 a 2,2 µg/mg ve skupinách s 10, 20 a 30 % odtučněného sójového šrotu v krmné dávce, což jsou vyšší hodnoty, než jaké byly dosaženy v našem experimentu. Flachowsky a kol. [127] zjistili, že míra prostupu isoflavonů do mléka se snižuje se zvyšujícím se příjmem isoflavonů podle následujícího vztahu: y = (-0,0001 . x) + 0,0006 (kde R2=0,6903). Vzhledem k tomu, že v našem pokuse

66

byl příjem isoflavonů mnohem vyšší, jsou naše výsledky v souladu i s posledně zmíněnou prací. Tab. 15: Zdánlivá návratnost isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E) Ukazatel

Jednotky

K

E

SEM

Návratnost daidzeinu a ekvolu

µg/mg

55,5***

1,1***

1,87

Návratnost genisteinu

µg/mg

119,0***

0,8***

7,05

Návratnost glyciteinu

µg/mg

6,2***

0,2***

0,48

SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; *** hodnoty se průkazně liší P<0,001

5.2.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka Jak již bylo uvedeno výše (viz výsledky a diskuse k Exp. 1), v dostupné literatuře bylo doposud publikováno jen málo prací, které by se věnovaly problematice transferu sójových isoflavonů z krmiva do mléka a problematice změn v obsahu isoflavonů během technologického zpracování kravského mléka. Vliv doplňku sójového extraktu, jako dalšího možného zdroje isoflavonů do krmné dávky laktujících dojnic na koncentraci isoflavonů v mléku a z něj vyrobených mléčných produktů nebyl doposud sledován. Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (skupina K) či krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (skupina E) je znázorněn na obrázku 24. Pozn.: Statistické hodnocení u dat získaných během technologického zpracování mléka nebylo provedeno, protože byly získány pouze dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2). Na obrázku 25-26 je uveden vliv tepelného ošetření mléka (pasterace mléka) a vliv výroby a skladování jogurtů na změny v obsahu isoflavonů. V souladu s dostupnou literaturou [12, 22, 150] po provedení šetrné pasterace (65 °C, 30 min.) nebyly zjištené výrazné rozdíly v obsahu jednotlivých isoflavonů v obou skupinách s výjimkou ekvolu ve skupině E, kde byl zjištěn cca 20% pokles. Bez dalšího ověření tohoto výsledku prozatím nelze říct, proč k poklesu ekvolu došlo. Jedním z možných vysvětlení by mohla být přeměna v jinou formu, jak naznačují studie Uzzan a kol. [150], Jackson a kol. [99] nebo Grun a kol. [101]. V průběhu fermentace při výrobě jogurtů byl zaznamenán pokles v pH u obou sledovaných skupin, skupiny K i skupiny E (z 4,37 na 4,17 resp. z 4,52 na 4,22). Pokles pH, zaznamenaný mezi vzorky po výrobě a po měsíčním skladování, byl totožný v obou skupinách, stejně jako v předchozím fyziologickém experimentu.

67

Obr. 24: Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Obr. 25: Vliv pasterace mléka na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

68

Celková koncentrace isoflavonů v jogurtu během fermentace (16-18 h. při 37 °C) poklesla z 73,8 na 43,8 ng/ml ve skupině K a z 147,2 na 76,9 ng/ml ve skupině E. Tyto závěry jsou v souladu s výsledky z předchozího fyziologického experimentu, ve kterém byl také zaznamenán pokles celkových isoflavonů po fermentaci u obou sledovaných skupin. Podobně také Chen a kol. [151], Tsangalis a kol. [62] nebo King a Bignell [153] ve svých studiích uvedli, že ztráty v celkovém obsahu isoflavonů jsou způsobeny hydrolytickým odštěpením glukosy z glukosidů, které přispívají k množství isoflavonů, jako glukosidové formy. Koncentrace celkových isoflavonů po jednoměsíčním skladování jogurtu vzrostly v obou skupinách (u skupiny K i skupiny E). Koncentrace celkových isoflavonů po výrobě vzrostla během měsíčního skladování z 43,8 na 56,6 ng/ml ve skupině K a z 76,9 na 124,4 ng/ml ve skupině E. Tento výsledek je v rozporu s naším předpokladem i s výsledky získanými během fyziologického experimentu, proto není možné činit jakékoli závěry, pokud nebude tato problematika dále prozkoumána.

Obr. 26: Vliv výroby a skladování jogurtu na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Vliv výroby a zrání sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na obsah jednotlivých isoflavonů je znázorněn na obrázku 27. Z celkového množství 5 kg pasterizovaného mléka bylo vyrobeno 0,51 kg sýra ve skupině K a 0,52 kg sýra ve skupině E. Sýr po výrobě obsahoval 59,43 a 60,77 g/kg sušiny a 22,30 a 20,25 g/kg solí ve skupině K a skupině E, v tomto pořadí. Stejně jako v předchozím pokuse bylo zjištěno, že část isoflavonů se během výroby uvolnila do odtékající syrovátky. Koncentrace jednotlivých isoflavonů daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a ekvolu v syrovátce byla 12,4; 29,6; 1,1 a 6,1 ng/ml ve skupině K a 17,0; 33,0; 12,7 a 75,5 ng/ml ve skupině E. Celková koncentrace isoflavonů v syrovátce pak byla 49,2 resp. 138,2 ng/ml. Poměrně vysoká koncentrace isoflavonů v syrovátce však odpovídá 69

výsledkům jak z předchozího fyziologického experimentu, tak i výsledkům z dostupné literatury [101, 158]. Během srážení bílkovin mléka byl zaznamenán pokles pH z původních 6,57 a 6,05 (pH mléka před srážením) na 6,0 a 5,95 (pH sýra po zpracování) u skupiny K a skupiny E. Hodnota pH sýra stanovená na začátku (1 den) a na konci (90 den) zrání byla 5,21 a 5,44 u skupiny K a 5,14 a 5,50 u skupiny E, v tomto pořadí. Změna pH byla patrná u obou skupin (u skupiny K i skupiny E), stejně jako v předchozím fyziologickém experimentu. Během 90 dnů zrání sýrů došlo k poklesu koncentrace celkových isoflavonů u skupiny K (z 218,3 na 184,0 ng/g, tedy cca o 16 %) i skupiny E (z 1153,1 na 913,6 ng/g; tedy cca o 21 %). Pokles hodnot, mezi sýrem po výrobě a po skladování, byl zaznamenán také u jednotlivých isoflavonů  daidzeinu (9 vs. 11 %), genisteinu (18 vs. 19 %), glyciteinu (11 vs. 14 %) i ekvolu (18 vs. 23 %, pro skupinu K resp. skupinu E), jak je zřejmé z obrázku 27. Výsledky jsou v souladu s dostupnou literaturou a také v souladu s naším předpokladem, že během zrání dojde k poklesu koncentrace isoflavonů v důsledku rozkladných reakcí glukosidů isoflavonů, které jsou během skladování nestabilní [155].

Obr. 27: Vliv výroby a zrání sýra na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Přehled graficky zpracovaných dat pro poloprovozní experiment (Exp. 2) je uveden v tabulce 17. Souhrnné porovnání obsahu sledovaných složek a celkového obsahu isoflavonů v rámci jednotlivých technologických kroků pro kontrolní (skupinu K) i pokusnou (skupinu E) skupinu je znázorněno na obrázku 31-33.

70

5.3

SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR

V mnoha předešlých studiích [167, 168, 169, 170, 171, 172] bylo prokázáno, že fytoestrogeny jsou biologicky aktivní již v nízkých koncentracích a díky svým výrazným estrogenním účinkům mohou ovlivňovat léčbu některých tipů rakoviny, kardiovaskulárních onemocnění, osteoporózy, symptomů menopauzy, obezity, cukrovky 2. typu aj. Avšak množství isoflavonů, které je konzumováno běžnou stravou západní populace se pohybuje v rozmezí 1-2 g/d. Naopak, v asijských zemích je denní konzumace isoflavonů výrazně vyšší, 11-47 mg/d [173]. Příčinou těchto značných rozdílů jsou sójové produkty, které obsahují vysoké hladiny isoflavonů (0,2-6,5 mg/ml) a jsou hojně konzumovány právě v asijských zemích [174]. U západní, především americké populace však bylo prokázáno, že se na celkovém příjmu isoflavonů rovněž podílí konzumace kravského mléka a mléčných výrobků [175]. Pokusy z posledních let pak naznačují, že kravské mléko je pravděpodobně nejvhodnější potravinou živočišného původu, která může být cíleně upravena tak, aby mohla být potenciálním zdrojem isoflavonů pro humánní výživu [122, 123, 135] v podobě tzv. funkční potraviny. Cílem této dizertační práce bylo na základě provedených experimentů popsat transfer sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic. Jako zdroj isoflavonů byla použita plnotučná extrudovaná sója (Exp. 1) a 40% extrakt sójových isoflavonů (Exp. 2). Dalšími vedlejšími sledovanými ukazateli byly změny v obsahu isoflavonů v mléce v průběhu technologického zpracování na bílý jogurt a sýr s nízkodohřívanou sýřeninou. Po zařazení obou výše zmiňovaných sójových komponent do krmné dávky laktujících dojnic jsme zaznamenali zvýšené hladiny isoflavonů, především pak metabolitu ekvolu v mléce. Námi zjištěné koncentrace isoflavonů v mléce odpovídají hodnotám publikovaným v literatuře, kde jako zdroj dietárních isoflavonů byla použita sója nebo sójové produkty, ale jsou mnohem nižší, než jakých bylo dosaženo s využitím krmiv na bázi jetele červeného nebo bílého. Z kvantitativního hlediska naše pokusy potvrdily, že míra prostupu isoflavonů do mléka se snižuje se zvyšujícím se příjmem isoflavonů v krmné dávce. Pro přesné zmapování kvantitativního aspektu transferu sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic bude potřeba provést další studie, přičemž klíčový je především metabolismus isoflavonů v bachoru. Jako vhodný zdroj isoflavonů je pro tyto účely možné využít sójových extraktů isoflavonů, které umožňují přesnější modelování stanovených hladin dietárního příjmu a rovněž by mohly umožnit i namodelovat vyšší příjmové hladiny, blízké příjmům dosahovaným např. při zkrmování jetele červeného, kterých s běžnými sójovými komponentami nelze dosáhnout. Z kvalitativního hlediska stojí za zmínku zjištění, že nejen mléko, ale i mléčné výrobky mohou být produkovány, jako cíleně obohacované o isoflavony, i když během technologického zpracování může docházet ke změnám právě v obsahu isoflavonů. Zajímavým produktem z tohoto pohledu je i syrovátka, do níž se část isoflavonů během výroby sýrů vyloučí. V dostupné literatuře dosud tyto aspekty nebyly dostatečně popsány a také výsledky našich pokusů mají svá omezení (monitoring technologického zpracování proběhl v omezeném rozsahu), a proto jsou potřebné další studie pro podrobnější zdokumentování změn v obsahu isoflavonů, včetně možných konverzí mezi jednotlivými formami (glykosidy, aglykony, malonyl- a acetyl- deriváty aj.) během technologického zpracování mléka. 71

Závěrem lze říci, že volbou vhodné krmné strategie lze dosáhnout žádoucích hladin ekvolu v kravském mléce, případně mléčných výrobcích, které tak mohou být považovány za potenciální zdroj ekvolu v humánní výživě a to zvláště pro tzv. neproducenty ekvolu, pro které se takto otevírá možnost k využívání zdravotních benefitů spojených s konzumací isoflavonů v potravě. Znalostí týkajících se kvantitativní stránky přenosu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic je však možné využít i naopak, tj. pro cílenou produkci potravin živočišného původu bez obsahu isoflavonů pro specifické kategorie spotřebitelů (např. kojenci, lidé s určitým zdravotním omezením), jejichž zdravotní stav nebo zdravý vývoj by mohl příjem isoflavonů v potravě negativně ovlivnit.

72

5.4

PŘEHLED GRAFICKY ZPRACOVANÝCH DAT (EXP. 1)

Tab. 16: Vliv pasterace mléka, výroby a skladování jogurtu a sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Exp. 1 Ukazatel

Jednotky

K

S

Mléko syrové

µg/l

47,6

45,4

Mléko syrové odstředěné

µg/l

43,5

50,2

Smetana syrová

µg/l

49,4

47,7

Mléko před pasterizací

µg/l

52,9

48,2

Mléko po pasterizaci

µg/l

50,8

47,3

Jogurt po výrobě

µg/l

50,8

49,5

Jogurt po skladování

µg/l

51,3

48,2

Syrovátka

µg/l

43,3

42,3

Sýr po výrobě

mg/kg

32,1

17,5

Sýr po skladování

mg/kg

18,0

11,7

Mléko syrové

µg/l

143,8

147,1

Mléko syrové odstředěné

µg/l

157,4

148,1

Smetana syrová

µg/l

156,5

150,1

Mléko před pasterizací

µg/l

170,4

154,9

Mléko po pasterizaci

µg/l

169,4

156,1

Jogurt po výrobě

µg/l

167,6

145,1

Jogurt po skladování

µg/l

165,8

147,6

Syrovátka

µg/l

156,4

151,2

Sýr po výrobě

mg/kg

30,5

21,1

Sýr po skladování

mg/kg

15,8

15,5

Mléko syrové

µg/l

13,2

16,1

Mléko syrové odstředěné

µg/l

14,1

15,4

Smetana syrová

µg/l

16,9

22,8

Mléko před pasterizací

µg/l

15,7

18,4

Mléko po pasterizaci

µg/l

15,4

16,4

Jogurt po výrobě

µg/l

14,8

15,8

Jogurt po skladování

µg/l

13,6

14,8

Daidzein

Genistein

Glycitein

73

Ukazatel

Jednotky

K

S

Syrovátka

µg/l

12,1

13,2

Sýr po výrobě

mg/kg

30,5

15,1

Sýr po skladování

mg/kg

17,3

11,4

Mléko syrové

µg/l

4,1

25,4

Mléko syrové odstředěné

µg/l

4,0

27,4

Smetana syrová

µg/l

3,3

18,1

Mléko před pasterizací

µg/l

4,4

27,9

Mléko po pasterizaci

µg/l

4,0

26,7

Jogurt po výrobě

µg/l

6,0

26,8

Jogurt po skladování

µg/l

5,7

20,5

Syrovátka

µg/l

4,3

11,3

Sýr po výrobě

mg/kg

5,6

24,3

Sýr po skladování

mg/kg

3,0

16,0

Mléko syrové

µg/l

208,7

234,0

Mléko syrové odstředěné

µg/l

219,0

241,1

Smetana syrová

µg/l

226,1

238,7

Mléko před pasterizací

µg/l

243,4

249,4

Mléko po pasterizaci

µg/l

239,6

246,5

Jogurt po výrobě

µg/l

239,2

237,2

Jogurt po skladování

µg/l

236,4

231,1

Syrovátka

µg/l

216,1

218,0

Sýr po výrobě

mg/kg

98,7

78,1

Sýr po skladování

mg/kg

54,1

54,6

Ekvol

Isoflavony CELKEM

74

5.5

DOPLŇKOVÁ GRAFICKÁ PŘÍLOHA (EXP. 1)

Obr. 28: Obsah daidzeinu, genisteinu a glyciteinu v mléce před pasterizací/po pasterizaci, smetaně, v jogurtu po výrobě/po skladování, v sýru po výrobě/po zrání: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Exp. 1

75

Obr. 29: Obsah ekvolu v mléce před pasterizací/po pasterizaci, smetaně, v jogurtu po výrobě/po skladování, v sýru po výrobě/po zrání: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Exp. 1

Obr. 30: Obsah celkových isoflavonů v mléce před pasterizací/po pasterizaci, smetaně, v jogurtu po výrobě/po skladování, v sýru po výrobě/po zrání: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Exp. 1

76

5.6

PŘEHLED GRAFICKY ZPRACOVANÝCH DAT (EXP. 2)

Tab. 17: Vliv pasterace mléka, výroby a skladování jogurtu a sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na koncentraci isoflavonů: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Exp. 2 Ukazatel

Jednotky

K

E

Mléko syrové

ng/ml

13,9

14,1

Mléko syrové odstředěné

ng/ml

11,8

13,3

Smetana syrová

ng/ml

14,1

19,6

Mléko před pasterizací

ng/ml

13,9

19,6

Mléko po pasterizaci

ng/ml

17,8

15,6

Jogurt po výrobě

ng/ml

11,3

10,7

Jogurt po skladování

ng/ml

14,3

13,8

Syrovátka

ng/ml

12,4

17,0

Sýr po výrobě

ng/g

43,7

59,1

Sýr po skladování

ng/g

39,8

52,8

Mléko syrové

ng/ml

36,1

32,6

Mléko syrové odstředěné

ng/ml

27,4

31,7

Smetana syrová

ng/ml

39,6

48,8

Mléko před pasterizací

ng/ml

33,3

48,4

Mléko po pasterizaci

ng/ml

46,9

35,2

Jogurt po výrobě

ng/ml

29,3

27,9

Jogurt po skladování

ng/ml

33,2

28,1

Syrovátka

ng/ml

29,6

33,0

Sýr po výrobě

ng/g

89,2

84,5

Sýr po skladování

ng/g

73,1

68,7

Mléko syrové

ng/ml

41,8

13,15

Mléko syrové odstředěné

ng/ml

1,1

13,0

Smetana syrová

ng/ml

1,0

13,0

Mléko před pasterizací

ng/ml

1,3

16,6

Mléko po pasterizaci

ng/ml

1,5

14,9

Jogurt po výrobě

ng/ml

1,1

6,2

Jogurt po skladování

ng/ml

2,7

12,0

Daidzein

Genistein

Glycitein

77

Ukazatel

Jednotky

K

E

Syrovátka

ng/ml

1,1

12,7

Sýr po výrobě

ng/g

13,4

152,8

Sýr po skladování

ng/g

11,9

131,9

Mléko syrové

ng/ml

7,3

76,9

Mléko syrové odstředěné

ng/ml

5,9

77,3

Smetana syrová

ng/ml

5,4

72,9

Mléko před pasterizací

ng/ml

7,2

102,2

Mléko po pasterizaci

ng/ml

7,6

81,5

Jogurt po výrobě

ng/ml

2,1

32,1

Jogurt po skladování

ng/ml

6,4

70,5

Syrovátka

ng/ml

6,1

75,5

Sýr po výrobě

ng/g

72,0

856,7

Sýr po skladování Isoflavony CELKEM

ng/g

59,2

660,2

Mléko syrové

ng/ml

99,1

136,8

Mléko syrové odstředěné

ng/ml

46,2

135,3

Smetana syrová

ng/ml

60,1

154,3

Mléko před pasterizací

ng/ml

55,7

186,8

Mléko po pasterizaci

ng/ml

73,8

147,2

Jogurt po výrobě

ng/ml

43,8

76,9

Jogurt po skladování

ng/ml

56,6

124,4

Syrovátka

ng/ml

49,2

138,2

Sýr po výrobě

ng/g

218,3

1153,1

Sýr po skladování

ng/g

184,0

913,6

Ekvol

78

5.7

DOPLŇKOVÁ GRAFICKÁ PŘÍLOHA (EXP. 2)

Obr. 31: Obsah daidzeinu, genisteinu a glyciteinu v mléce syrovém/odstředěném/před pasterizací/po pasterizaci, smetaně, v jogurtu po výrobě/po skladování, v sýru po výrobě/po zrání: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Exp. 2

79

Obr. 32: Obsah ekvolu v mléce syrovém/odstředěném/před pasterizací/po pasterizaci, smetaně, v jogurtu po výrobě/po skladování, v sýru po výrobě/po zrání: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Exp. 2

Obr. 33: Obsah celkových isoflavonů v mléce syrovém/odstředěném/před pasterizací/po pasterizaci, smetaně, v jogurtu po výrobě/po skladování, v sýru po výrobě/po zrání: K  u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E  u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Exp. 2

80

6 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ [1] [2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

Adlercreutz H., Mazur W.: Phyto-oestrogens and Western diseases. Annals of Medicine, 1997, 29, pp. 95-120. ISSN: 0785-3890. Lu L.J., Anderson K.E., Grady J.J., Nagamani M.: Effects of an isoflavonefree soy diet on ovarian hormones in premenopausal women. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2001, 86, pp. 3045-3052. ISSN: 0021-972X. Vanharanta M., Voutilainen S., Lakka T.A., van der Lee M., Adlercreutz H., Salonen J.T.: Risk of acute coronary events according to serum concentrations of enterolactone: a prospective population-based casecontrol study. The Lancet, 1999, 354, pp. 2112-2115. ISSN: 0140-6736. Horiuchi T., Onouchi T., Takahashi M., Ito H., Orimo H.: Effect of soy protein on bone metabolism in postmenopausal Japanese women. Osteoporos International, 2000, 11, pp. 721-724. ISSN: 0937-941X. Picherit C., Coxam V., Bennetau-Pelissero C., Kati-Coulibaly S., Davicco M. J., Lebecque P., Barlet J. P.: Daidzein is more efficient than genistein in preventing ovariectomy-induced bone loss in rats. Journal of Nutrition, 2000, 130, pp. 16751681. ISSN: 0022-3166. Sathyamoorthy N., Wang T.T.Y.: Differential effects of dietary phyto-oestrogens daidzein and equol on human breast cancer MCF-7 cells. European Journal of Cancer, 1997, 33, pp. 2384-2389. ISSN: 0959-8049. Chouinard P.Y., Le´Vesque J., Girard V., Brisson G.J.: Dietary Soybeans Extruded at Different Temperatures: Milk Composition and In Situ Fatty Acid Reactions. Journal of Dairy Science, 1997, 80, pp. 2913-2924. ISSN: 0022-0302. Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Korzekwa A., Piskula M.K, Wiczkowski W, Depta A., Skarzynski D.J.: Soybean-Derived Phytoestrogens Regulate Prostaglandin Secretion in Endometrium During Cattle Estrous Cycle and Early Pregnancy. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 189-199. ISSN: 1535-3702. Woclawek-Potocka I., Korzekwa A., Piskula M., Skarzynski D.J.: Role of soy derived phytoestrogens in prostaglandin synthesis in the bovine endometrium. Biology of Reproduction (Special Issue), 2004, 194, abstract 443. ISSN: 0006-3363. Setchell K.D.R., Brown N.M., Lydeking-Olsen E.: The Clinical Importance of the Metabolite Equol – A Clue to the Effectiveness of Soy and Its Isoflavones. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3577-3584. ISSN: 0022-3166. Adlercreutz H., Fotsis T., Bannwart C., Mäkelä T., Wähälä K., Brunow G., Hase T.: Assay of lignans and phatoestrogens in urine of women and in cow´s milk by GC/MS (SIM). Todd JFJ, ed. Advances in mass spectrometry. Proceedings of the 10th International Mass Spectrometry Konference, 1985. Chichester, UK: J Wiley. ISSN: 0277-7037. King R.A., Mano M.M., Head R.J.: Assessment of isoflavonoid concentrations in Australian bovine milk samples. Cambridge University Press, 1998, 65, pp. 479-489. ISSN: 1751-7311. 81

[13]

[14]

[15]

[16] [17]

[18]

[19] [20] [21]

[22]

[23] [24] [25] [26] [27]

[28]

82

Turcan P.: Včelí produkty, fytoestrogeny a jejich využití v lécbe klimakteria. Atestační práce k atestaci II. Stupně v oboru gynekologie a porodnictví. Gynekologickoporodnické oddělení SZZ Krnov I. P. Pavlova 9, 794 01 Krnov, Praha 2002. Bennetts H.W., Underwood E.J., Shier F.L.: Specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal, 1946, 22, pp. 2-12. ISSN: 1751-0813. Mustonen E.A., Jokela T., Saastamoinen I., Taponen J., Taponen S., Saloniemi H., Wähälä K.: High serum S-equol content in red clover fed ewes: the classical endocrine disruptor is a single enantiomer. Environmental Chemistry Letters, 2006, 3, pp. 154159. ISSN: 1610-3653. Urquiaga I., Leighton F.: Plant Polyphenol Antioxidants and Oxidative Stress. Biol. Res., 2000, 33 (2), pp. 55-64. Manach C., Scalbert A., Morand Ch., Rémésy Ch., Jiménez L.: Polyphenols: food sources and bioavailability. Journal of Clinical Nutrition, 2004, 79 (5), pp. 727-747. ISSN: 0002-9165. Barcelo S., Gardiner J.M., Gescher A., Chipman, J.K.: CYP2E1-mediated mechanism of anti-genotoxicity of the broccoli constituent sulforaphane. Carcinogenesis, 1996, 17, pp. 277-282. ISSN: 0143-3334. Velíšek, J.: Chemie potravin 2. Tábor: OSSIS, 2002, 303 s. ISBN 80-86659-01-12 Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin II., Ossis, Tábor 2009, 644 s. ISBN 978-8086659-16-9. Martin J.H.J., Crotty S., Warren P., Nelson P.N.: Does an apple a day keep the doctor away because a phytoestrogen a day keeps the virus at bay? A review of the anti-viral properties of phytoestrogens. Phytochemistry, 2007, 68, pp. 266-274. ISSN: 00319422. Uzzan M., Labuza T.P.: Critical Issues in R&D of Soy Isoflavone–enriched Foods and Dietary Supplements. Journal of Food Science, 2004, 69 (3), pp. 77-86. ISSN: 17503841. Moravcová J., Kleinová T.: Fytoestrogeny ve výživě - přinášejí užitek nebo riziko? Chemické Listy, 2002, 96, s. 282–289. ISSN: 1213-7103. Kaprál A., Fait T.: Estrogeny v životním prostředí a jejich význam v klimakterické medicíně. Praktická gynekologie, 2003, 4, s. 10-13. ISSN: 1801–8750 . Cos P., De Brudne T., Pieters L., Vlietinck A.J.: Phytoestrogens: recent developments. Planta Medica, 2003, 69, pp. 589-599. ISSN: 0032-0943. Rishi, R.K.: Phytoestrogens in health and illness. Indian Journal of Pharmacology, 2002, 34, pp. 311-320. ISSN: 0253-7613. Wang Y., Kumar R., Wagner M.B., Chen J., Mishra M., Joyner R.W.: Regulation of transient outward current in human atrial myocytes by protein tyrosine kinase pathway. Journal of Cardiovascular Electrophysiology, 2002, 13, pp. 927-35. ISSN: 1540-8167. Shimoni E.: Stability and Shelf Life of Bioactive Compounds during Food Processing and Storage: Soy Isoflavones. Journal of food science, 2004, 69 (6), pp. 160-166. ISSN: 1750-3841.

[29]

[30]

[31]

[32]

[33]

[34]

[35]

[36]

[37]

[38]

[39]

[40]

[41]

Kudou S., Fleury Y., Welti D., Magnolato D., Uchida T., Kitamura K., Okubo K.: Malonyl isoflavone glycosidesin soybean seeds (Glycine max Merrill). Agricultural and Biological Chemistry, 1991, 55, pp. 2227. ISSN: 0002-1369. Setchell K.D.R.: Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones. American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 68 (Suppl.), pp. 1333S-46S. ISSN: 0002-9165. Barnes S., Kirk M., Coward L.: Isoflavones and their conjugates in soy foods: extraction conditions and analysis by HPLC-mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42, pp. 2466-2474. ISSN: 0021-8561. Opletal L., Šimera B.: Toxické látky přírodního původu (sekundární metabolity rostlin a hub) v surovinách pro výrobu krmiv a možnost jejich stanovení. Vědecký výbor výživy zvířat. Praha, červen 2006. Bingham S.A., Atkinson C., Liggins J., Bluck L., Coward A.: Review article: Phytooestrogens: Where are we now? British Journal of Nutrition, 1998, 79, pp. 393-406. ISSN: 0007-1145. Hutchins A.M., Slavin J.L., Lampe J.W.: Urinary isoflavonoid phytoestrogen and lignan excretion after consumption of fermented and unfermented soy products. Journal of the American Dietetic Association, 1995, 95, pp. 545-551. ISSN: 00028223. Akaza H., Miyanaga N., Takashima N., Naito S., Hirao Y., Tsukamoto T., Mori M.: Is daidzein non-metabolizer a high risk for prostate cancer? A case-controlled study of serum soybean isoflavone concentration. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2002, 32, pp. 296-300. ISSN: 1465-3621. Kelly G.E., Joannou G.E., Reeder A.Y., Nelson C., Waring M.A.: The variable metabolic response to dietary isoflavones in humans. Proceeding of the Society for Experimentyl Biology and Medicine, 1995, 208, pp. 40-43. ISSN: 1525-1373. Lampe J.W., Karr S.C., Hutchins A.M., Slavin J.L.: Urinary equol excretion with a soy challenge: influence of habitual diet. Proceeding of the Society for Experimentyl Biology and Medicine, 1998, 217, pp. 335-339. ISSN: 1525-1373. Arai Y., Uehara M., Sato Y., Kimira M., Eboshida A., Adlercreutz H., Watanabe S.: Comparison of isoflavones among dietary intake, plasma concentration and urinary excretion for accurate estimation of phytoestrogen intake. Journal of Epidemiology, 2000, 10, pp. 127-135. ISSN: 2165-7459. Lundh T.: Metabolism of estrogenic isoflavones in domestic animals. Proceedinf of the Society Experimentyl Biology and Medicine, 1995, 208, pp. 33-39. ISSN: 15251373 . Lundh T.J.O., Pettersson H., Marinsson K.A.: Comparative levels of free and conjugated plant estrogens in blood plasma and cattle fed estrogenic silage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38, pp. 1530-1334. ISSN: 0021-8561. Setchell K.D.R., Bordello S.E., Hulme P., Axelson M.: Nonsteroidal estrogens of dietary origin: possible roles in hormone-dependent disease. American Journal of Clinical Nutrition, 1984, 40, pp. 569-578. ISSN: 0002-9165.

83

[42] [43]

[44]

[45]

[46]

[47]

[48]

[49]

[50]

[51]

[52] [53] [54]

[55]

84

Bradbury R.B., White D.E.: Estrogens and related substances in plants. Vitamins & Hormones, 1954, 7, pp. 207-233. ISSN: 0083-6729. Adlercreutz H., Musey P.I., Fotsis T., Bannwart C., Wähälä K., Mäkelä T., Brunow G., Hase T.: Identification of lignans and phytoestrogens in urine of chimpanzees. Clinica Chimica Acta, 1986, 158, pp. 147-154. ISSN: 0009-8981. Juniewicz P.E., Pallante M.S., Moser A., Ewing L.L.: Identification of phytoestrogens in the urine of male dogs. The Journal of Steroid Biochemistry, 1988, 31, pp. 987-994. ISSN: 0960-0760. Monfort S.L., Thompson M.A., Czekala N.M., Kasman L.H., Shackleton C.H., Lasley B.L.: Identification of a non-steroidal estrogen, equol, in the urine of pregnant macaques: correlation with steroidal estrogen excretion. The Journal of Steroid Biochemistry, 1984, 20, pp. 869-876. ISSN: 0960-0760. Blair R.M., Appt S.E., Bennetau-Pelissero C., Clarkson T.B., Anthony M.S., Lamothe V., Potter S.M.: Dietary soy and soy isoflavones have gender-specific effects on plasma lipids and isoflavones in golden Syrian f(1)b hybrid hamsters. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3585-3591. ISSN: 0022-3166. Blair R.M., Appt S.E., Franke A.A., Clarkson TB.: Treatment with antibiotics reduces plasma equol concentration in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Journal of Nutrition, 2003, 133, pp. 2262-2267. ISSN: 0022-3166. Ohta A., Uehara M., Sakai K., Takasaki M., Adlercreutz H., Morohashi T., Ishimi Y.: A combination of dietary fructooligosaccharides and isoflavone conjugates increases femoral bone mineral density and equol production in ovariectomized mice. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 2048-2054. ISSN: 0022-3166. Brown N.M., Setchell K.D.: Animal models impacted by phytoestrogens in commercial chow: implications for pathways influenced by hormones. Lab. Incest., 2001, 81, pp. 735-747. Lamartiniere C.A., Wang J., Smith-Johnson M., Eltoum I.E.: Daidzein: bioavailability, potential for reproductive toxicity, and breast cancer chemoprevention in female rats. Toxicological Sciences, 2002, 65, pp. 228-238. ISSN: 1096-0929. Bayer T., Colnot T., Dekant W.: Disposition and biotransformation of the estrogenic isoflavone daidzein in rats. Toxicological Sciences, 2001, 62, pp. 205-211. ISSN: 1096-0929. Anderson J.J.B., Anthony M., Messina M., Garner S.C.: Effects of phyto-estrogens on tissues. Nutrition Research Reviews, 1999, 12, pp. 75-116. ISSN: 0954-4224. Murkies A.L., Wilcox G., Davis S.R.: Phytoestrogens. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 1998, 83, pp. 297-303. ISSN: 0021-972X. Adlercreutz H., Hockerstedt K., Bannwart C.: Effect of dietary components, including lignans and phytoestrogens, on enterohepatic circulation and liver metabolism of estrogens and on sex hormone binding globulin (SHBG). The Journal of Steroid Biochemistry, 1987, 27, pp. 1135-44. ISSN: 0960-0760. Hutchins A.M., Lampe J.W., Martini M.C., Campbell D.R., Slavin J.L.: Vegetables, fruits and legumes: Effect on urinary isoflavonoid phytoestrogen and lignan excretion.

[56]

[57]

[58]

[59]

[60]

[61]

[62]

[63]

[64]

[65]

[66]

Journal of the American Dietetic Association, 1995, 95, pp. 769-74. ISSN: 00028223. Frankenfeld C.L., McTiernan A., Tworoger S.S., Atkinson C., Thomas W.K., Stanczyk F.Z., Marcovina S.M., Weigle D.S., Weiss N.S., Holt V.L., Schwartz S.M., Lampe J.W.: Serum steroid hormones, sex hormonebinding globulin concentrations, and urinary hydroxylated estrogen metabolites in post-menopausal women in relation to daidzeinmetabolizing phenotypes. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 88, pp. 399-408. ISSN: 0960-0760. Cruz M.L.A., Wong W.W., Mimouni F., Hachey D.L., Setchell K.D.R., Klein P.D., Tsang R.C.: Effects of infant nutrition on cholesterol synthesis rates. Pediatric Research, 1994, 35, pp. 135-140. ISSN: 0031-3998. Rowland I., Wiseman H., Sanders T., Adlercreutz H., Bowey E.: Metabolism of oestrogens and phytoestrogens: role of the gut microflora. Biochemical Society Transactions, 1999, 27, pp. 304-308. ISSN: 1470-8752. Hur H.G., Beger R.D., Heinze T.M., Lay J.O.Jr., Freeman J.P., Dore J., Rafii F.: Isolation of an anaerobic intestinal bacterium capable of clearing the C-ring of the isoflavonoid daidzein. Archives of Microbiology, 2002, 178, pp. 8-12. ISSN: 1432072X. Schoefer L., Mohan R., Braune A., Birringer M., Blaut M.: Anaerobic Ring cleavage of genistein and daidzein by Eubacterium ramulus. FEMS Microbiology Letters, 2002, 208, pp. 197-202. ISSN: 1574-6968. Blaut M., Schoefer L., Braune A.: Transformation of flavonoids by intestinal microorganisms. International Journal for Vitamin and Nutrition Research, 2003, 2, pp. 79-87. ISSN: 0300-9831. Tsangalis D., Ashton J.F., McGill A.E.J., Shah N.P.: Enzymic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by –glucosidaseproducing Bifidobacteria. Journal of Food Science, 2002, 67, pp. 3104-3113. ISSN: 1750-3841. Ueno T., Uchiyama S., Kikuchi N.: The role of intestinal bacteria on biological effects of soy isoflavones in humans. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 594S. ISSN: 00223166. Moravcová J., Vänttinen K.: Fytoestrogeny v kručince barvířské (Genista tinctoria) a janovci metlatém (Sarothamnus scoparius), Horticultural Science, 1999, 26, s. 63-68. ISSN: 0862-867X. Atkinson C., Skor H.E., Fitzgibbons E.D., Scholes D., Chen C., Wahala K., Schwartz S.M., Lampe J.W.: Overnight urinary isoflavone excretion in a population of women living in the United States, and its relationship to isoflavone intake. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2002, 11, pp. 253-260. ISSN: 1055-9965. Keinan-Boker L., Peeters P.H., Mulligan A.A., Navarro C., Slimani N., Mattisson I., Lundin E., McTaggart A., Allen N.E., Overvad K., Tjonneland A., Clavel-Chapelon F., Linseisen J., Haftenberger M., Lagiou P., Kalapothaki V., Evangelista A., Frasca G., Bueno-de-Mesquita H.B., van der Schouw Y.T., Engeset D., Skeie G., Tormo M.J., Ardanaz E., Charrondiere U.R., Riboli E.: Soy product consumption in 10

85

[67]

[68]

[69] [70]

[71] [72] [73]

[74]

[75]

[76]

[77] [78]

[79]

[80]

86

European countries: the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) study. Public Health Nutrition, 2002, 5, pp. 1217-1226. ISSN: 1368-9800. Chapin R.E., Stevens J.T., Hughes C.L., Kelce W.R., Hess R.A., Daston G.P.: Endocrine modulation of reproduction. Fundamental and Applied Toxicology, 1996, 29, pp. 1-17. ISSN: 0272-0590. Baines R.N.: Environmental & Animal Safety Dimensions to Developing Food Safety & Quality Assurance Initiatives in the United Kingdom, Michigan State University, 1999, 45, pp. 86. Dostálová, J.: Úroda, 2002, 50, s. 11-12. ISSN: 0139-6013. Goff A.K.: Steroid hormone modulation of prostaglandin secretion in the ruminant endometrium during the estrous cycle. Biology of Reproduction, 2004, 71, pp. 11-16. ISSN: 0006-3363. Vrzáňová M., Heresová J.: Fytoestrogeny. Interní medicína pro praktické lékaře, 2004, 1, s. 19-21. ISSN: 1212-7299. Kurzer M.S., Xu X.: Dietary phytoestrogens. Annual Review of Nutrition, 1997, 17, pp. 353-381. ISSN: 0199-9885. Rosselli M., Reinhard K., Imthurn B., Keller P.J., Dubey R.K.: Cellular and biochemical mechanisms by which environmental estrogens influence reproductive function. Human Reproduction Update, 2000, 6, pp. 332-350. ISSN: 1460-2369. Woclawek-Potocka I., Acosta T.J., Korzekwa A., Bah M.M., Shibaya M., Okuda K., Skarzynski DJ.: Phytoestrogens Modulate Prostaglandin Production in Bovine Endometrium: Cell Type Specificity and Intracellular Mechanisms. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 326-333. ISSN: 1535-3702. Hughes C.L.Jr., Kaldas R.S., Weisinger A.S., McCants C.E., Basham K.B.: Acute and subacute effects of naturally occurring estrogens on luteinizing hormone secretion in the ovariectomized rat. Reproductive Toxicology, 1991, 5, pp. 127-132. ISSN: 08906238. Adlercreutz C.H., Goldin B.R., Gorbach S.L., Hockerstedt K.A., Watanabe S., Hamalainen E., Adlercreutz C.H.: Epidemiology of phytoestrogens. Clinical Endocrinology and Metabolism, 1998, 12 (4), pp. 605-623. ISSN: 0021-972X. Lichtenstein A.H.: Soy protein, phytoestrogens and cardiovascular disease risk. Recent Advances Nutr. Sci., 1998, 10, pp. 1589-1592. Wu A.H., Ziegler R.G., Nomura A.M., West D.W., Kolonel L.N., Horn-Ross P.L., Hoover R.N., Pike M.C.: Soy intake and risk of breast cancer in Asians and Asian Americans. The American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 68, pp. 1437–1443. ISSN: 0002-9165. Adlercreutz H., Fotsis T., Heikkinen R., Dwyer J.T., Woods M., Goldin B.R., Gorbach S.L.: Excretion of the lignans enterolactone and enterodiol and of equol in omnivorous and vegetarian postmenopausal women and in women with breast cancer. The Lancet, 1982, 2, pp. 1295-1299. ISSN: 0140-6736. Adlercreutz H.: Does fibe-rich food containing snímal lignan precursors protect against both colon and breast cancer? An extension of the 'fiber hypothesis'. Gastroenterology, 1984, 86, pp. 761-764. ISSN: 0016-5085.

[81]

[82] [83]

[84]

[85]

[86] [87]

[88] [89]

[90]

[91] [92]

[93]

[94]

Adlercreutz H.: Western diet and Western diseases: some hormonal and biochemical mechanisms and associations. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 1990, 50 (supplement 201), pp. 3-23. ISSN: 0036-5513. Adlercreutz H.: Diet and sex hormone metabolism. Nutrition, Toxicity; and Cancer, Rowland IR (ed.), Boca Raton, FL: CRC Press, 1991, pp. 137-195. Wu A.H., Ziegler R.G., Horn-Ross P.L. et al.: Tofu and risk of breast cancer in AsianAmericans. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention, 1996, 5, pp. 901–906. ISSN: 1055-9965. Adlercreutz H., Fotsis T., Watanabe S. et al.: Determination of lignans and isoflavonoids in plasma by isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry. Cancer Detection and Prevention, 1994, 18, pp. 259-271. ISSN: 0361-090x. Musey P.I., Adlercreutz H., Gould K.G., Collins D.C., Fotsis T., Bannwart C., Makela T., Wahala K., Brunow G., Hase T.: Effect of diet on lignans and isoflavonoid phytoestrogens in chimpanzees. Life Science, 1995, 57, pp. 655-664. ISSN: 00243205. Adlercreutz H., Markkanen H., Watanabe S.: Plasma concentrations of phytooestrogens in Japanese men. The Lancet, 1993, 342, pp. 1209-1210. ISSN: 0140-6736. Rose D.P., Boyar A.P., Wynder E.L.: International comparison of mortality rates for cancer of the breast, ovary, prostate, and colon, and per capita food consumption. Cancer, 1986, 58, pp. 2363-2371. ISSN: 1097-0142. Mills P.K., Beeson W.L., Phillips R.L., Fraser G.E.: Cohort study of diet, lifestyle and prostate cancer in adventist men. Cancer, 1989, 64, pp. 598-604. ISSN: 1097-0142. Severson R.K., Nomura A.M.Y., Grove J.S., Stemmerman G.N.: A prospective study of demographics and prostate cancer among men of Japanese ancestry in Hawaii. Cancer Research, 1989, 49, pp. 1857-1860. ISSN: 1538-7445. Shimizu H., Ross R.K., Bernstein L. et al.: Cancers of the prostate and breast among Japanese and white immigrants in Los Angeles County. British Journal of Cancer, 1991, 63, pp. 963-966. ISSN: 0007-0920. Thompson L.U.: Flaxseed, lignans and cancer. In Cannane SC & Thompson LU (eds) Flaxseedin Human Nutrition, 1995. Champaign, IL: AOCS Press. Anderson J.W., Johnstone B.M., Cooknewell M.E.: Meta-analysis of the effects of soy protein intake on serum lipids. The New England Journal of Medicine, 1995, 333, pp. 276-282. ISSN: 0028-4793. Anthony M.S., Clarkson T.B., Bullock B.C., Wagner J.D.: Soy protein versus soy phytoestrogens in the prevention of diet-induced coronary artery atherosclerosis of male cynomolgus monkeys. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 1997, 17, pp. 2524-2531. ISSN: 1079-5642. Setchell K.D.R., Welsh M.B., Lim C.K.: High-performance liquid chromatographic analysis of phytoestrogens in soy protein preparations with ultraviolet, electrochemical and thermospray mass spectrometric detection. Journal of Chromatography, 1987, 386, pp. 315-323. ISSN: 0021-9673.

87

[95]

[96]

[97] [98]

[99]

[100]

[101]

[102]

[103] [104]

[105]

[106]

[107] [108]

88

Irvine C., Fitzpatrick M., Roberson I., Woodhams D.: The potential adverse effects of soybean phytoestogens in infant feeding. The New Zealand Medical Journal, 1995, 24, 108 (100), pp. 208-209. ISSN: 0028-8446. Cassidy A., Bingham S., Setchell K.D.R.: Biological effects of a diet of soy protein rich in isoflavones on menstrual cycle of premenopausal women. The American Journal of Clinical Nutrition, 1994, 60, pp. 333-40. ISSN: 0002-9165. Bieglmayer Ch., Mustafa G.: More Information on Phytoestrogens in Breast Milk. Clinical Chemistry, 1997, 43 (3). ISSN: 0009-9147. Frank A.A., Hankin J.H., Yu M.C., Maskarinec G., Low S.H., Custer L.J.: Isoflavone level in soy foods consumed by multiethnic populations in Singapore and Hawaii. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47, pp. 977-986. ISSN: 00218561. Grun I.U., Adhikari K., Li C., Li Y., Lin B., Zhang J., Fernando L.N.: Changes in the profile of genistein, daidzein, and their conjugates during thermal processing of tofu. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49, pp. 2839-43. ISSN: 00218561. Hendrich S., Murphy P.A.: Isoflavones: source and metabolism. In: Wildman REC, editor. Handbook of nutraceuticals and functional foods. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 2001. pp. 55-75. Jackson C.J.C., Dini J.P., Lavandier C., Rupasinghe H.P.V., Faulkner H., Poysa V., Buzzell D., DeGrandis S.: Effects of processing on the content and composition of isoflavones during manufacturing of soy beverage and tofu. Process Biochemistry, 2002, 37, pp. 1117-23. Coward L., Barnes N.C., Setchell K.D.R., Barnes S.: Genistein, daidzein, and their beta-glycoside conjugates: antitumor isoflavones in soybean foods from American and Asian diets. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993, 41, pp. 1967. ISSN: 0021-8561. Matsuura M., Obata A.: -glucosidases from soybeans hydrolyze daidzin and genistin. Journal of Food Science, 1993, 58, pp. 144-7. ISSN: 1750-3841. Coward L., Smith M., Kirk M., Barnes S.: Chemical modification of isoflavones in soyfoods during cooking and processing. The American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 68 (Suppl.), pp. 1486S-91S. ISSN: 0002-9165. Naim M., Gestetner B., Zilkah S., Birk Y., Bondi A.: Soybean isoflavones Characterization, determination, and antifungal activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1974, 22, pp. 806. ISSN: 0021-8561. Mazur W.: Phytoestrogens: Occurence in foods, and metabolism of lignans in man and pigs. Academic dissertation. University of Helsinki and Institute for Preventive Medicine, Nutrition and Cancor, Helsinky 2000. ISBN 951-45-9154-2. Klouda P.: Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava 2003, 132 s. ISBN 80-86369-07-2. Liggins J., Bluck L.J.C., Coward W.A., Bingham S.A.: Extraction and quantification of daidzein and genistein in food. Analytical Biochemistry, 1998, 264, pp. 1-7. ISSN: 0003-2697.

[109] Aussenac T., Lacombe S., Dayde J.: Quantification of isoflavones by capillary zone electrophoresis in soybean seeds: effects of variety and environment. The American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 68, pp. 1480S-1485S. ISSN: 0002-9165. [110] Wilkinson A.P., Wahala K., Wiliamson G.: Identification and quantification of polyphenol phytoestrogens in foods and human biological fluids. Journal of Chromatography B, 2002, 777, pp. 93-109. ISSN: 1570-0232. [111] Cvačka J.: Vysoko účinná kapalinová chromatografie, 3.11.2011 cit. 13. března 2011. Zdroj: http://web.natur.cuni.cz/~analchem/bosakova/hplc1.pdf. [112] Cvačka J.: Detekce ve vysoko účinné kapalinové chromatografii, 24.11.2010 cit. 13. března 2011. Dostupné na : http://web.natur.cuni.cz/~analchem/bosakova/hplc3.pdf. [113] Kostelac D., Rechkemmer G., Briviba K.: Phytoestrogens modulate binding response of estrogen receptors alpha and beta to the estrogen response element. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51 (26), pp. 7632-7635. ISSN: 0021-8561. [114] Muthyala R.S., Ju J.H., Sheng S., Williams L.D., Doerge D.R., Katzenellenbogen B.S., Helferich W.G., Katzenellenbogen J.A.: Equol, a natural estrogenic metabolite from soy isoflavones: convenient preparation and resolution of R- and S-equols and their differing binding and biological activity through estrogen receptors a and b. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, 12, pp. 1559-1567. ISSN: 0968-0896. [115] Turner R., Baron T.,Wolffram S., Minihane A.M., Cassidy A., Rimbach G., Weinberg P.D.: Effect of circulating forms of soy isoflavones on the oxidation of low density lipoprotein. Free Radical Research, 2004, 38, pp. 209-216. ISSN: 1071-5762. [116] Rimbach G., De Pascual-Teresa S., Ewins B.A., Matsugo S., Uchida Y., Minihane A.M., Turner R., Vafei Adou K., Weinberg P.D.: Antioxidant and free radical scavenging activity of isoflavone metabolites. Xenobiotica, 2003, 33, pp. 913-925. ISSN: 1366-5928. [117] Lund T.D., Munson D.J., Haldy M.E., Setchell K.D.R., Lephart E.D., Handa R.J.: Equol is a novel anti-androgen that inhibits prostate growth and hormone feedback. Biology of Reproduction, 2004, 70, pp. 1188-95. ISSN: 0006-3363. [118] Nagel S.C., vom Saal F.S., Welshons W.V.: Developmental effects of estrogenic chemicals are predicted by an in vitro assay incorporating modification of cell uptake by serum. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1999, 69, pp. 343-357. ISSN: 0960-0760. [119] Setchell K.D.R., Brown N.M., Lydeking-Olsen E.: The clinical importance of the metabolite equol - a clue to the effectiveness of soy and its isoflavones. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3577-3584. ISSN: 1541-6100. [120] Wang X.L., Kim H.J., Kang S.I., Kim S.I., Hur H.G.: Production of phytoestrogen Sequol from daidzein in mixed culture of two anaerobic bakteria. Microbiology, 2007, 187, pp. 155-160. ISSN: 1350-0872. [121] Decroos K. Vanhemmens S., Cattoir S., Boon N., Verstraete W.: Isolation and characterization of an equol producing mixed microbial culture from a human faecal sample and its activity under gastrointestinal conditions. Archives of Microbiology, 2005, 183, pp. 45-55. ISSN: 1432-072X.

89

[122] Mustonen E.A., Tuori M., Saastamoinen I., Taponen J., Wähälä K., Saloniemi H., Vanhatalo A.: Equol in milk of dairy cows is derived from forage legumes such as red clover. British Journal of Nutrition, 2009, 102, pp. 1552-1556. ISSN: 0007-1145. [123] Steinshamn H., Purup S., Thuen E., Hansen-Møller J.: Effects of clover-grass silages and concentrate supplementation on the content of phytoestrogens in dairy cow milk. Journal of Dairy Science, 2008, 91, pp. 2715-2725. ISSN: 0022-0302. [124] Hoikkala A., Mustonen E., Saastmoinen I., Jokela T., Teponen J., Saloniemi H., Wähälä K.: High levels of equol in skimmed Finnish cow milk. Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51, pp. 782-786. ISSN: 1613-4125. [125] Purup S., Hansen-Møller J., Sejrsen K., Christensen L.P., Lykkesfeldt A.E., Leffers H., Skakkebǽk N.E.: Increased phytoestrogen content in organic milk and the biological importance. Newsletter from Danish Research Centre for Organic Farming, 2005, No. 2. Danish Research Centre for Organic Farming, Tjele, Denmark. [126] King R.A., Mano M.M., Head R.J.: Assessment of isoflavonoid concentrations in Australian bovine milk samples. Journal of Dairy Research, 1998, 65, pp. 479-489. ISSN: 0022-0299. [127] Flachowsky G.:, Hünerberg M., Meyer U., Kammerer D.R., Carle R., Goerke M., Eklund M.: Isoflavone concentration of soybean meal from various origins and transfer of isoflavones into milk of dairy cos. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2011, 6, pp. 449-456. ISSN: 1661-5751. [128] Antignac J.P., Cariou R., Le Bizec B., Andre F.: New data regarding phytoestrogens content in bovine milk. Food Chemistry, 2004, 87, pp. 275-281. ISSN: 0308-8146. [129] Nařízení komise (ES) č. 152/2009, ze dne 27. ledna 2009, kterým se stanoví metody odběrů vzorků a laboratorního zkoušení pro úřední kontrolu krmiv. L54/1-L54/130. [130] ČSN EN ISO 16472, ze dne 1. listopadu 2006. Krmiva - stanovení obsahu neutrálně detergentní vlákniny po úpravě vzorku amylázou (aNDF). [131] ČSN EN ISO 13906, ze dne 1. října 2011. Krmiva – stanovení obsahu acidodetergentní vlákniny (ADF) a acododetergentního ligninu (ADL). [132] Křížová L., Hadrová S., Schulzová V., Hajšlová J., Veselý A., Pavlok S.: Sójové isoflavony v krmné dávce laktujících dojnic a jejich prostup do mléka, metodická příručka, Agrovýzkum Rapotín s.r.o., 2011, s. 22. ISBN: 978-80-87592-03-8. [133] Hajšlová J., Schulzová V., Křížová L., Pavlok S.: Stanovení fytoestrogenních látek v biologickém materiálu a mléčných výrobcích, Upltněná certifikovaná metodika číslo: 2011/12-1, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 2011, s. 22. ISBN: 978-807080-805-4. [134] Holman P:. Evidence for health benefits of plant phenols: local or systemic effects? Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81, pp. 842-852. ISSN: 00225142. [135] Třináctý J., Křížová L., Schulzová V., Hajšlová J., Hanuš O.: The effect of feeding soybean-derived phytoestrogens on their concentration in plasma and milk of lactating dairy cows. Archives of Animal Nutrition, 2009, 63, pp. 1-11. ISSN: 1745-039X.

90

[136] Wang H.J., Murphy P.A.: Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in Iowa: effects of variety, crop year, and location. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42, pp. 1674-1677. ISSN: 0021-8561. [137] Kudrna V., Marounek M.: Feeding oilseed products to dairy cows. Journal of Animal and Feed Sciences, 2006, 15, pp. 36–69. ISSN: 1230-1388. [138] Komprda T., Dvořák R., Suchý P., Fialová M., Šustová K.: Effect of heat treated rapeseed cakes in dairy cow diet on yield, composition and fatty acid pattern of milk. Czech Journal of Animal Science, 2000, 45, pp. 325-332. ISSN: 1212-1819. [139] Křížová L., Richter M., Třináctý J., Říha J., Kumprechtová, D. The effect of feeding live yeast cultures on ruminal pH and redox potential In dry cows as continuously measured by a new wirelees device. Czech Journal of Animal Science, 2011, 56, pp. 37-45. ISSN:

[140]

[141]

[142]

[143]

[144]

[145]

[146]

[147]

[148]

[149]

1212-1819. Richter M., Křížová L., Třináctý J.: The effect of individuality of animal on diurnal pattern of pH and redox potential in the rumen of dry cows. Czech Journal of Animal Science, 2010, 55, pp. 401-407. ISSN: 1212-1819. Marden J.P., Bayourthe C., Enjalbert F., Moncoulon R.: A New Device for Measuring Kinetics of Ruminal pH and Redox Potential in Dairy Cattle. Journal of Dairy Science, 2005, 88, pp. 277-281. ISSN: 0022-0302. Edwards J.E., McEwan N.R., Travis A.J., Wallace R.J.: 16SrDNA library-based analysis of ruminal bacterial diversity. Antonie van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 2004, 86 (3), pp. 263-281. Watzková J., Křížová L., Pavlík A., Schulzová V., Hajšlová J., Lojza L.: The Effect of Soybean-Derived Phytoestrogens on Concentrations of Plasma Isoflavones, 15-keto13,14-dihydroprostaglandin F2 and Progesterone in Dairy Cows. Acta Vet. Brno, 2010, 79, pp. 537-544. ISSN 0001-7213. Andersen C., Weisbjerg M.R., Hansen-Møller J., Sejrsen K.: Effect of forage on the content of phyto-oestrogens in bovine milk. Animal, 2009, 3, pp. 617-622. ISSN: 1751-7311. Umphress S.T., Murphy S.P., Franke A.A., Custer L.J., Blitz C.L.: Isoflavone content of foods with soy additives Journal of Food Composition and Analysis, 2005, 18, pp. 533-550. ISSN: 0889-1575. Nurmi T., Mazur W., Heinonen S., Kokkonen J., Adlercreutz H.: Isoflavone content of the soy based supplements. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, 28, pp. 1-11. ISSN: 0731-7085. Liggins J., Bluck L.J.C., Runswick S., Atkinson C., Coward W.A., Bingham S.A.: Daidzein and genistein contents of vegetables. British Journal of Nutrition, 2000, 84, pp. 717-725. ISSN: 0007-1145. Liggins J., Bluck L.J.C., Runswick S., Atkinson C., Coward W.A., Bingham S.A.: Daidzein and genistein content of fruits and nuts. Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11, pp. 326-331. ISSN: 0955-2863. Kuhnle G.G.C., Delcaqulla C., Aspinall S.M., Runswick S.A., Mulligan A.A., Bingham S.A.: Phytoestrogen content of foods of animal origin: dairy products, eggs,

91

[150]

[151]

[152]

[153]

[154]

[155]

[156]

[157]

[158]

[159]

[160]

92

meat, fish, and seafood. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56 (21), pp. 10099-10104. ISSN: 0021-8561. Uzzan M., Nechrebeki J., Labuza T.P.: Thermal and storage stability of nutraceuticals in a milk beverage dietary supplement. Journal of Food Science, 2007, 72, pp. E109E114. ISSN: 0022-1147. Chen T.R., Su R.Q., Wei Q.K.: Hydrolysis of isoflavone phytoestrogens in soymilk fermented by Lactobacillus and Bifidobacterium cocultures. Journal of Food Biochemistry, 2010, 34, pp. 1-12. ISSN: 0145-8884. Izumi T., Piskula M.K., Osawa S., Obata A., Tobe K., Saito M., Kataoka S., Kubota A.Y., Kikuchi M.: Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and in higher amounts than their glucosides in humans. Journal of Nutrition, 2000, 130, pp. 1695-1699. ISSN: 0022-3166. King R.A., Bignell C.M.: Concentrations of isoflavone phytoestrogens and thein glucosides in Australian soya beans and soya foods. Australian Journal of Nutrition and Dietetics, 2000, 57, pp. 70-78. ISSN: 1032-1322. Otieno D.O., Ashton J.F., Shah N.P.: Stability of isoflavone phytoestrogens in fermented soymilk with Bifidobacterium animalis Bb12 during storage at different temperatures. International Journal of Food Science and Technology, 2006, 41, pp. 1182-1191. ISSN: 0950-5423. Coldham N.G., Darby C., Hows M., King L.J., Zhang A.Q., Sauer M.J.: Comparative metabolism of genistin by human and rat gut microflora: detection and identification of the end-products of metabolism. Xenobiotica, 2002, 32, pp. 45-62. ISSN: 00498254. Heinonen S., Wähälä K., Adlercreutz H.: Identification of isoflavone metabolites dihydrodaidzein, dihydrogenistein, 6'-OH-O-dma, and cis-4-OH-equol in human urine by gas chromatography-mass spectroscopy using authentic reference compounds. Analytical Biochemistry, 1999, 274, pp. 211-219. ISSN: 0003-2697. Adlercreutz H., Fotsis T., Bannwart C., Wähälä K., Makela T., Brunow G., et al.: Determination of urinary lignans and phytoestrogen metabolites, potential antiestrogens, and anticarcinogens in urine of women on various habitual diets. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1986, 25, pp. 791-797. ISSN: 0960-0760. Waggle D.H., Bryan B.A. (Inventors): Recovery of isoflavones from soy molasses. Protein Technologies International Inc., assignee. 2003 July, 10. U.S.Patent 2, 003,0129,263. Křížová L., Veselý A., Třináctý J., Schulzová V., Hurajová A., Hajšlová J., Kvasničková E., Havlíková Š.: Changes in isoflavones concentrations in cheese during processing and ripening. Acta universitatis agriculturae et silviculturae mendelianae brunensis, 2011, LIX (1), pp. 153-162. ISSN: 1211-8516. Křížová L., Třináctý J., Hajšlová J., Havlíková Š.: The effect of technological processing on the kontent of isoflavones in bovine milk and dairy products. Soybean – Aplicationas and Technology, 2011, Prof. Tzi-Bun Ng (Ed.), pp. 95-110. ISBN: 978953-307-207-4.

[161] Cohen L.A., Crespin J.S., Wolper C., Zang E.A., Pittman B., Zhao Z., Holt P.R.: Soy isoflavone intake and estrogen excretion patterns in young women: effect of probiotic administrativ. In Vivo, 2007, 21, pp. 507-512. ISSN: 1791-7549. [162] Nielsen I.L., Williamson G.: Review of the factors affecting bioavailability of soy isoflavones in humus. Nutrition and Cancer, 2007, 57, pp. 1-10. ISSN: 0163-5581. [163] Piotrowska K., Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Piskula M., Pilawski W., Bober A., Skarzynski D.J.: Phytoestrogens and thein metabolites inhibit the sensitivity of the bovine corpus luteum on luteotropic factors. Journal of Reproduction and Development, 2006, 52, pp. 33-41. ISSN: 0916-8818. [164] Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Korzekwa A., Piskula M., Wiczkowski W., Depta A., Skarzynski D.J.: Soy-bean derived phytoestrogens regulate prostaglandin secretion in endometrium during the estrous cycle and early pregnancy in cattle. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 189-199. ISSN: 1535-3702. [165] Woclawek-Potocka I., Okuda K., Acosta TJ., Korzekwa A., Pilawski W., Skarøyn´ski D.J.: Phytoestrogen metabolites are much more active than phytoestrogens themselves in increasing prostaglandin F2_ synthesis via prostaglandin F2_ synthase-like 2 stimulation in bovine endometrium. Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 2005, 78, pp. 202-217. ISSN: 1098-8823. [166] Woclawek-Potocka I., Acosta TJ., Korzekwa A., Bah M.M., Shibaya M., Okuda K., Skarzynski D.J.: Phytoestrogens modulace prostaglandin production in bovine endometrium: cell type specificity and intracellular mechanisms. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 326-333. ISSN: 1535-3702. [167] Low Y.L., Taylor J.I., Grace P.B., Dowsett M., Scollen S., Dunning A.M., Mulligan A.A., Welch A.A., Luben R.N., Khaw K.T., Day N.E., Wareham N.J., Bingham S.A.: Phytoestrogen exposure correlation with plasma estradiol in postmenopausal women in European Prospective Investigation of Cancer and Nutrition-Norfolk may involve diet-gene interactions. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2005, 14 (1), pp. 213-220. ISSN: 1055-9965. [168] Low Y.L., Dunning A.M., Dowsett M., Luben R.N., Khaw K.T., Wareham N.J., Bingham S.A.: Implications of gene-environment interaction in studies of gene variants in breast cancer: an example of dietary isoflavones and the D356N polymorphism in the sex hormone-binding globulin gene. Cancer Research, 2006, 66 (18), pp. 8980-8983. ISSN: 0008-5472. [169] Low Y.L., Dunning A.M., Dowsett M., Folkerd E., Doody D., Taylor J., Bhaniani A., Luben R., Khaw K.T., Wareham N.J., Bingham S.A.: Phytoestrogen Exposure Is Associated with Circulating Sex Hormone Levels in Postmenopausal Women and Interact with ESR1 and NR1I2 Gene Variants. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention,

2007, 16 (5), pp. 1009-1016. ISSN: 1055-9965. [170] Adlercreutz, H.: Phyto-estrogens and cancer. The Lancet Oncology, 2002, 3 (6), pp. 364-373. ISSN: 1470-2045. [171] Stark A., Madar Z.: Phytoestrogens: a review of recent findings. Journal of Pediatric Endocrinology & Metabolism, 2002, 15 (5), pp. 561–572. ISSN: 0334-018X.

93

[172] Bhathena S.J., Velasquez M.T.: Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition, 2002, 76 (6), pp. 11911201. ISSN: 0002-9165. [173] Arai Y., Watanabe S., Kimira M., Shimoi K., Mochizuki R., Kinae N.: Dietary intakes of flavonols, flavones and isoflavones by Japanese women and the inverse correlation between quercetin intake and plasma LDL cholesterol concentration. Journal of Nutrititon, 2000, 130, pp. 2243-2250. ISSN: 0022-3166. [174] Nielsen T.S., Purup S., Wärri A., Godschalk R.W., Hilakivi-Clarke L.: Effects of maternal exposure to cow's milk high or low in isoflavones on karcinogen-induced Maďary tumorigenesis among rat offspring. Cancer Prevention Research, 2011, 4 (5), pp. 1-8. ISSN: 1940-6215. [175] Frankenfeld C.L.: Dairy consumption is a signifiant correlate of urinary equol concentration in a representative samole of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition, March 9, 2011, pp. 1-8, doi: 10.3945/ajcn.111.011825. ISSN: 0002-9165.

94

7 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ SECO

Secoisolariciresinol

MAT

Matairesinol

O-DMA

O-demethylangolensin

ICHS

Ischemická choroba srdeční

Da

Daidzein

Ge

Genistein

Gl

Glycitein

Ek

Ekvol

Dain

Daidzin

Gein

Genistin

Glin

Glycitin

a kol. / s kol.

a kolektiv / s kolektivem (autorů)

tj.

to je

např.

například

resp.

respektive

SPE

Extrakce pevnou fází (Solid phase extraction)

HPLC

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (High performance liquid chromatography)

HPLC-RP

Vysoce účinná kapalinová chromatografie s reverzní fází (High performance liquid chromatography with reverse phase)

HPLC-UV

Vysoce účinná kapalinová chromatografie s UV detekcí (High performance liquid chromatogramy with ultraviolet detection)

HPLC-MS

Vysoce

účinná

kapalinová

chromatografie

s hmotnostní

spektrometrií (High performance liquid chromatography with mass spectrometry) RP-HPLC-UV/DAD

Vysoce účinná kapalinová chromatografie s reverzní fází s UV detekcí detektorem s diodovým polem (High performance liquid chromatography with reverse phase with ultraviolet detection by diode array detector)

GC

Plynová chromatografie (Gas chromatography)

GC-MS-SIM

Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií se selektivním sledováním iontů (Gas chromatography with mass spektrometry with selected ion monitoring)

RP-HPLC-UV/DAD

Vysoce účinná kapalinová chromatografie s detekcí diodovým polem (High performance liquid chromatography with diode array 95

detection) UPLC-MS/MS

Ultra účinná kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (Ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry)

Exp. 1

Fyziologický experiment

Exp. 2

Poloprovozní experiment

skupina K

Kontrolní skupina (kontrolní krmná dávka)

skupina S

Pokusná skupina Exp. 1 (krmná dávka s doplňkem extrudované plnotučné sóji)

skupina E

Pokusná skupina Exp. 2 (krmná dávka s doplňkem 40% extraktu práškových isoflavonů)

ČMK

Čistá mlékařská kultura

CF

Hrubá vláknina (Crude fiber)

NDF

Neutrálně detergentní vláknina (Neutral detergent fibre)

ADF

Acidodetergentní vláknina (Acid detergent fibre)

NEL

Netto energie laktace (Net energy of lactation)

SEM

Střední chyba průměru (Standard error of the mean)

P

Průkaznost (Probability)

4% FCM

Mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství tuku, tj. 4% (Fat-corrected milk)

PGE2, PGE2

Prostaglandiny PGE2, PGE2

LH

Luteotropní hormon

96

VĚDECKÁ ČINNOST

8 8.1 1.

2.

3. 4. 5.

6.

7. 8.

9. 10.

11.

12.

PUBLIKACE Křížová L., Svobodová J., Richter M., Homolka P., Hadrová S.: The effect of dietary soybean isoflavones on their concentration and total output in bovine milk. Advances in Animal Biosciences, Proceedings of the British Society of Animal Science (BSAS), March 2009, Southport, England, pp. 156. ISBN 978-0-906562-65-9, ISSN 20404700. Křížová L., Svobodová J., Pavlok S., Třináctý J., Nedělník J., Kocourek F.: Effect of Insect-protected maize silage (Bt-MON 810) on feeding value and digestibility of nutrients estimated with wethers. Slovak J. of Anim. Sci., 2009, 42 (3), pp. 125-130. ISSN 1337-9984. Svobodová J., Třináctý J., Křížová L.: Sójové fytoestrogeny ve výživě dojnic. Náš chov, 2009, 10, s. 55-56. ISSN 0027-8068. Svobodová J., Křížová L.: Výroční konference BSAS, Southport, Anglie, 30.3. – 1.4.2009. Výzkum v chovu skotu, 2009, 3, s. 88-89. ISSN 0139-7265. Svobodová J., Richter M., Kadlec R., Křížová L., Třináctý J.: Zařízení pro měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny. Výzkum v chovu skotu, 2009, 3, s. 8485. ISSN 0139-7265. Křížová L., Pavlok S., Svobodová J., Richter M., Doležal P.: Evaluation of nutritional quality, mycotoxins content and ensiling process of Bt-maize after artificial inoculation with selected Fusarium strains. Výzkum v chovu skotu, 2009, 51 (4), pp. 74-80. ISSN 0139-7265. Svobodová J., Třináctý J.: Setkání expertů na mléko v Berlíně. Zemědělec, 2009, 17 (51), s. 25. ISSN 1211-3816. Svobodová J.: Konference: "Potravinářský výzkum podporující vědecky založenou legislativu: příležitosti pro výrobce a spotřebitele". Výzkum v chovu skotu, 2009, 51 (4), s. 83-84. ISSN 0139-7265. Svobodová J., Třináctý J.: Setkání odborníků na mléko a mléčné výrobky v Berlíně. Náš chov, 2010, 70 (2), s. 62-65. ISSN 0027-8068. Křížová L., Třináctý J., Svobodová J., Richter M., Černý V., Jarošová A.: Efect of suplemental rumen-protected lysine, methionine or boths added to diet of lactating dairy cos on milk fatty acids profile. Acta Universitatis Mendelianae Brunensis, 2010, 58 (1), pp. 87-94. ISSN 1211-8516. Třináctý J., Křížová L., Svobodová J., Richter M.: The Effect of Feeding Live Yeast Cultures on Ruminal pH Continuously Measured by a New Wireless Device in Dry Cows. Proceedings of the International Scientific Conference on Probiotics and Prebiotics, 15-17 June 2010, Košice, Slovakia, pp. 182-183. ISBN 978-80-970168-45. Richter M., Svobodová J., Křížová L., Třináctý J., Homolka P.: Effect of duodenal infusions of leucine on milk yield and plasma amino acids in dairy cows. Czech J. Anim. Sci., 2010, 55 (9), pp. 351–358. ISSN 1212-1819. 97

13.

14. 15. 16.

17. 18.

19.

Watzková J., Křížová L., Pavlík A., Schulzová V., Hajšlová J., Lojza L.: The Effect of Soybean-Derived Phytoestrogens on Concentrations of Plasma Isoflavones, 15keto-13,14-dihydroprostaglandin F2 and Progesterone in Dairy Cows. Acta Vet. Brno, 2010, 79, pp. 537-544. ISSN 0001-7213. Watzková J., Třináctý J.: Problematika probiotik a prebiotik na mezinárodní konferenci. Náš chov, 2010, 70 (9), s. 5-6. ISSN 0027-8068. Watzková J., Křížová L., Říha J.: Je povědomí o mléku a mléčných výrobcích dostatečné? Náš chov, 2010, 70 (9), s. 60-62. ISSN 0027-8068. Třináctý J., Watzková J.: Cestovní zpráva z mezinárodní konference: „International Scientific Conference Probiotics and Prebiotics – IPC2010“. Výzkum v chovu skotu 2010, 52, 92. ISSN 0139-7265. Křížová L., Watzková J., Třináctý J., Richter M.: Pijeme dostatečné množství mléka? Zemědělec, 2010, 18 (37), s. 26. ISSN 1211-3816. Křížová L., Watzková J., Třináctý J., Richter M., Buchta M.: Rumen degradability and whole tract digestibility of flavonolignans from Milk thistle (Silybum marianum) seed expeller in dairy cows. Czech J. Anim. Sci. (přijato do tisku). ISSN 1212-1819. Watzková J., Říha J., Křížová L., Třináctý J.: Průzkum spotřebitelských postojů k mléku a mléčným výrobkům. Mlékařské listy, 2011, 121, s. 12-18. ISSN 1212950X.

A další z oblasti imobilizace biologicky aktivních látek: 20. Stloukal R., Watzková J.: Immobilization of biologically active compounds. Book of Abstracts, Biotech 2011 & 5th Czech-Swiss Symposium with Exhibition, Prague, 15-17 June 2011, pp. 41. ISBN 978-80-7080-782-8. 21. Stloukal R., Watzková J., Gregušová B.: Dye decolorization by laccase immobilized into polyvinylalcohol matrix. Proceedings 40th International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské Matliare, Slovakia, 27-31 May, 2013, p. 21. ISBN 978-80-89475-09-4.

8.2 1.

2.

3.

98

UŽITNÉ VZORY A FUNKČNÍ VZORKY Přihláška užitného vzoru PUV 2009-21097 – zápis UV 19728 (dne 15.6.2009). Název: Zařízení pro měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny; Původci: Richter M., Kadlec R., Třináctý J., Svobodová J.; Přihlašovatel: Agrovýzkum Rapotín, s.r.o. Přihláška funkčního vzorku 2009 (identifikační kód G-R-002/09). Zařízení pro měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny; Původci: Svobodová J., Richter M., Kadlec R., Křížová L., Třináctý J. Přihlašovatel: Agrovýzkum Rapotín, s.r.o. Přihláška funkčního vzorku 2010 (identifikační kód G-R-002/10). Zařízení pro měření hodnot pH bachorové tekutiny. Funkční vzorek; Původci: Křížová L., Richter M., Svobodová J., Třináctý J.; Přihlašovatel: Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.

8.3 1.

2.

3. 4.

POSTERY BSAS Southport, 2009 – Křížová L., Svobodová J., Richter M., Homolka P., Hadrová S.: The effect of dietary soybean isoflavones on their concentration and total output in bovine milk. IDF Berlín, 2009 – Třináctý J., Svobodová J., Křížová L., Vespalcová M.: Concentration and Output of Isoflavones and their Metabolites in Milk as Affected by Inclusion of Extruded Full-fat Soya into the Diet of Lactating Dairy Cows. NRC 2001 Brno, 2009 – Svobodová J., Křížová L., Šimůnek J.: Sójové fytoestrogeny ve výživě dojnic, prostup do mléka a jejich vliv na zdraví člověka. IPC Košice, 2010 – Třináctý J., Křížová L., Svobodová J., Richter M.: The Effect of Feeding Live Yeast Culturec on Ruminal pH Contunuously Measured by New Wireless Device in Dry Cows.

A další z oblasti imobilizace biologicky aktivních látek: 5. SSCHE Tantranské Matliare, 2013  Stloukal R., Watzková J., Gregušová B.: Dye decolorization by laccase immobilized into polyvinylalcohol matrix.

8.4

ÚČAST NA ODBORNÝCH KONFERENCÍCH

Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti

30. března – 1. dubna 2009 BSAS Annual conference Southport, Anglie British Society of Animal Science (BSAS) Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku

Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti

22. – 24. září 2009 IDF World Dairy Summit United Dairy World 2009 Berlín, Německo International Dairy Federation (IDF) Aktivní účast ve formě posteru

Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti

22. říjen 2009 Šlechtění a výživa dojnic s využitím NRC 2001 Brno, Česká republika Výzkumný ústav pro chovu skotu, s r.o. Člen organizačního výboru, aktivní účast ve formě posteru

Období Odborná konference

12. listopad 2009 Vliv výživy hospodářských zvířat na kvalitu živočišných produktů s důrazem na zdraví člověka Pohořelice, Česká republika Výzkumný ústav pro chovu skotu, s r.o.

Místo konání Organizace/pořadatel

99

Typ účasti

Aktivní účast ve formě přednášky na téma: "Alergenní látky v potravinách živočišného původu" a "Vliv výživy zvířat na kvalitu masa, vajec a mléka"

Období Odborná konference

15. – 17. červen 2010 International Scientific Conference Probiotics and Prebiotics – IPC2010 Košice, Slovensko Univerzita Pavla Josefa Šafárika v Košicích (UPJS) Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku

Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel

Typ účasti

8.5

27.  31. květen 2013 40th International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering  SSCHE2013 Tatranské Matliare, Slovensko Slovak Society of Chemical Engineering and Institute of Chemical and Environmental Engineering of Slovak University of Technology in Bratislava Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku

PROJEKTOVÁ ČINNOST

Značení CEP Název projektu Identifikační kód Poskytovatel Doba řešení Příjemce Řešitel

CEP11-MSM-LA-U/01:1 Spolupráce v rámci International Dairy Federation (IDF) LA328 MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (MŠMT) 1.3.2007 - 31.12.2010 Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Dr. Ing. Jiří Třináctý

Značení CEP Název projektu Identifikační kód Poskytovatel Doba řešení Příjemce Řešitel

CEP12-MSM-LA-U/01:1 Práce v British Society of Animal Science LA08040 MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (MŠMT) 4.1.2008 - 31.12.2011 Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Mgr. Ing. Ludmila Křížová, Ph.D.

Značení CEP Název projektu

CEP12-MSM-2B-U/01:1 Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování 2B08073 MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (MŠMT) 1.3.2008 – 31.12.2011

Identifikační kód Poskytovatel Doba řešení

100

Příjemce Řešitel

Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Mgr. Ing. Ludmila Křížová, Ph.D.

Název projektu

Developing the Next Generation of Biocatalysts for Industrial Chemical Synthesis BIONEXGEN 266025 EU Framework Programme 7 (FP7) KBBE.2010.3.3-02 Biotechnology for 'greening' the chemical industry – Industrial bioprocesses for fine and speciality chemicals and intermediates FP7-KBBE-2010-4 1.2.2011 – 31.1.2014 The University of Manchester Prof. Nicholas J. Turner

Akronym projektu Číslo projektu Poskytovatel Program

Výzva Doba řešení Příjemce Řešitel Název projektu Akronym projektu Číslo projektu Poskytovatel Program Výzva Doba řešení Příjemce Řešitel

Mastering Bioprocess Integration and Intensification Across Scales BIOINTENSE 312148 EU Framework Programme 7 (FP7) KBBE.2012.3.3-03: Mastering integration and intensification of bioprocesses FP7-KBBE-2012-6-singlestage 1.8.2012 – 31.1.2015 Technical University of Denmark Prof. John Woodly

101