A VÍZBEFULLADÁST IGAZOLÓ IGAZSÁGÜGYI LABORATÓRIUMI MÓDSZEREK FEJLESZTÉSE Doktori (PhD) - értekezés
Rácz Evelin
Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Vezető: dr. Kovács L. Gábor, egyetemi tanár, akadémikus Készült a “Molekuláris patológiai és laboratóriumi vizsgálatok jelentősége az orvosi diagnosztikában és terápiában” c. program keretében Programvezető: dr. Miseta Attila, egyetemi tanár Témavezető: dr. Sipos Katalin, egyetemi docens
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Igazságügyi Orvostani Intézet Pécs, 2016.
1
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK
5
1. BEVEZETÉS
6
1.1 A vízbefulladás okainak statisztikai vizsgálata és annak nehézségei
6
1.2 A vízbefulladás, mint diagnózis felállításának problémái
8
1.3 A vízbefulladás igazolását célzó laboratóriumi módszerek
9
1.4 Az algák és a vízbefulladás kapcsolata
10
1.4.1 Diatómák
10
1.4.2 A vízbefulladás tényének bizonyítása: Diatóma teszt
12
1.4.3 Cianobaktériumok
16
2. CÉLKITŰZÉSEK
18
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
19
I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT MÓDSZERTANA
19
3.1 A vízbefulladások számának felmérése
19
3.2 Toxikológiai analízis
19
3.3 Statisztikai analízis
20
II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA MÓDSZERTANA
21
3.4 Mintakezelés
21
3.5 A vízbefulladás bizonyítására alkalmazott módszer, a diatóma teszt
21
3.5.1 Diatóma teszt I.: Savas emésztés
22
3.5.2 Diatóma teszt II.: Enzimatikus emésztés
22
3.5.3 Diatómák vizsgálata fordított plankton mikroszkóppal
22
3.6 Pikocianobaktériumok és pikoeukarióta algák azonosítása és elkülönítése vízmintában fluoreszcens mikroszkóppal
23
3.7 DNS izolálás és PCR
24
2
3.7.1 Fitoplankton DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből
24
3.7.2 Diatóma DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből
25
3.7.3 PCR
25
3.7.4 PCR kontrollok
28
4. EREDMÉNYEK
29
I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEI
29
4.1 A vízbefulladások számának felmérése Magyarország dél-dunántúli régiójában
29
4.1.1 Rizikófaktor: Életkor
30
4.1.2 Rizikófaktor: Véralkoholszint
32
4.1.3 Rizikófaktor: Kábítószer- és gyógyszerfogyasztás
35
4.1.4 Rizikófaktor: Évszakok
35
4.1.5 Rizikófaktor: Vízbefulladások helyszínei
36
4.1.6 Rizikófaktor: A vízbe kerülés oka
37
II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA EREDMÉNYEI
39
4.2 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott mikroszkópos módszer, a diatóma teszt 39 4.2.1 Vízminták vizsgálata fény- és fluoreszcens mikroszkóppal
39
4.2.2 Poszt mortem szövetminták mikroszkópos vizsgálata
43
4.3 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott molekuláris biológiai módszer
5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA
45
48
I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA
48
II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA
51
6. ÖSSZEFOGLALÁS
55
7. IRODALOMJEGYZÉK
56
8. PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA
64
I. A disszertáció alapjául szolgáló közlemények
64
II. Egyéb közlemények
64
3
III. Konferenciaszereplések
65
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
68
FÜGGELÉK
69
4
RÖVIDÍTÉSEK
BAC
Blood alcohol concentration (véralkohol koncentráció)
CBR
a dolgozatban alkalmazott, cianobaktériumokra specifikus primerek egyike
DIA
a dolgozatban alkalmazott, diatóma csoportokra specifikus primerek egyike
dNTP
dezoxi-nukleozid-trifoszfátok
EDTA
etilén-diamin-tetraecetsav
F
forward (primer)
HPLC-DAD
High-Performance Liquid Chromatography with DiodeArray
Detection
(diódasoros
detektorral
ellátott
nagyhatékonyságú folyadékkromatográf) HS-GC-FID
Headspace
gas
chromatograph
with
flame-ionization
detection (gőztér mintaadagolóval ellátott gázkromatográf lángionizációs detektorral) ICD-10/BNO-10
International
Classification
of
Diseases
(Betegségek
nemzetközi osztályozására szolgáló kódrendszer) ISZKI
Igazságügyi Szakértői és Kutató Intézetek
KSH
Központi Statisztikai Hivatal
O/N
„overnight”, azaz egy éjszakán át
PCR
Polymerase Chain Reaction (polimeráz láncreakció)
PLA
a dolgozatban alkalmazott primerek egyike
R
reverse (primer)
rbcL
ribulose-1,5-biphosphate carboxylase oxygenase gén
rRNS
riboszomális RNS
RUB
a dolgozatban alkalmazott, zöldalgákra specifikus primerek egyike
SDS
nátrium-dodecil-szulfát
SiO2
szilícium-dioxid
Tm
olvadási hőmérséklet
TRIS
Trisz[hidroximetil]-aminometán
WHO
World Health Organization 5
1. BEVEZETÉS A vízbefulladás definíció szerint (World Health Organization, 2005) részleges vagy teljes folyadékba merülés miatti légzéskárosodás eredményeképpen kialakuló halálok [1][2]. A WHO 2014-es adatai szerint évente világszerte 372 000 ember hal meg vízbefulladás miatt (ld. 1. ábra). Ez a 7%-át teszi ki az összes erőszakos halálesetnek, ezzel pedig a harmadik nem természetes módon bekövetkező erőszakos halálok a világon [1].
1. ábra Vízbefulladási ráta a világon 100.000 főre nézve. Forrás: http://www.who.int/
1.1 A vízbefulladás okainak statisztikai vizsgálata és annak nehézségei A vízbefulladás nem csak a természetes vizekben gazdag országok állandó, lokálisan megjelenő problémája: a váratlanul fellépő ökológiai (esőzések, árvizek, villámárvizek, cunami stb.) és emberi okokra (közlekedési baleset) visszavezethető katasztrófák nagyszámú halálos áldozatot követelnek világszerte. A vízbefulladásos halálesetek pontos számát nem csak az ilyen, sok halálesettel járó tömegszerencsétlenségek miatt nehéz nyomon követni; a vízbefúlások gyakran az alacsony és közepes jövedelemmel rendelkező országokban következnek be, ahol a víz az emberek mindennapi életének szoros részét képezi (közlekedés, munka, mezőgazdaság). Ezekben az országokban mind a statisztikai célú adatgyűjtés, mind a prevenciós programok bevezetése problémákba 6
ütközik [2][3]. Ezen kívül fontos megemlíteni, hogy kevés adatot ismerünk a nem balesetszerűen bekövetkező vízbefulladások számáról (pl. öngyilkosság, emberölés). Ennek egyik oka, hogy az International Classification of Diseases (ICD-10, Magyarországon BNO-10) kódok között a vízbefulladásnak csak az a verziója adható meg halálokként, amikor a vízbefulladás volt a tényleges halálok, és az nem valamilyen külső következmény hatása (pl. közlekedési baleset, öngyilkosság) [1][2]. Más európai országokhoz hasonlóan, kevés tanulmány ismert, amely a hazai vízbefulladásos esetek hátterével, okaival, a lehetséges megelőzési stratégiákkal foglalkozik [1][4]. A
Központi
Statisztikai
Hivatal
(KSH)
statisztikai
adatbázisából
(http://www.ksh.hu/) való lekérdezés alapján a vízbefulladások száma Magyarországon csökkenő tendenciát mutat: 1995-ben (n=259) több, mint kétszer annyian fulladtak vízbe, mint ahányan 2014-ben (n=126) (ld. 2. ábra és 1. táblázat) [5]. A vízijármű-balesetek száma Magyarországon elenyésző, ezek nagyrészt a Balaton és a Duna környékén bekövetkező transzport-, illetve sportbalesetek következményei [5][6].
Vízbefulladással kapcsolatos halálesetek számának évenkénti megoszlása Magyarországon (1995-2014) Adatok forrása: Központi Statisztikai Hivatal 350 300 250 200 150 100 50
0
2. ábra Vízbefulladások számának megoszlása Magyarországon 1995-2014 között.
7
Időszak 1995. év 1996. év 1997. év 1998. év 1999. év 2000. év 2001. év 2002. év 2003. év 2004. év 2005. év 2006. év 2007. év 2008. év 2009. év 2010. év 2011. év 2012. év 2013. év 2014. év
Vizijárműbalesetek (V90-V94)
3 5 5 2 3 3 1 6 4 9 6 11 1 3 4 5 2
Balesetszerű vízbefulladás vagy elmerülés (W65-W74) 259 249 216 301 259 231 186 214 206 180 192 213 191 159 177 203 156 131 123 126
1. táblázat Vízbefulladások számának megoszlása 1995-2014 között. Adatok forrása: www.ksh.hu
1.2 A vízbefulladás, mint diagnózis felállításának problémái A vízbefulladás a fulladásos halálnak egy olyan formája, amikor a légutakba és légzőnyílásokba került folyadék elzárja a levegő útját [1][7][8]. A vízbefulladásnak nem kritériuma, hogy az egész test vízbe merüljön, a halál olyan módon is bekövetkezhet, amikor csak az arc (csak az orr és a szájnyílás) merül folyadékba [9][10]. A vízből előkerült holttestek vizsgálatakor az igazságügyi orvostan gyakorlatában számos kérdés vetődik fel [11][12]. A legfontosabb annak eldöntése, hogy élő állapotban vízbe kerülésről, tehát vízbefulladásról van-e szó, vagy a holttest utólag került a vízbe, és a halál közvetlen oka a vízbefulladástól eltérő volt-e (vízbe merülést megelőzően
8
bekövetkezett halál más, pl. természetes okból vagy bűncselekmény leplezése) [7][9][10][11]. Megnehezíti a holttest vizsgálatát és a halál okának megállapítását az is, hogy esetenként az előrehaladott bomlás miatt a vízben talált holttesten lévő sérülések időbeli elkülönítése nem könnyű vagy egyáltalán nem is lehetséges: keletkezhettek élőben, közvetlenül a halál bekövetkezte előtt (pl. vízbeugráskor kemény tárgyakhoz ütődés során szerzett sérülés), vagy a holttest vízben való sodródásakor (pl. vízben úszó tárgyakhoz, vízi járművekhez ütődés, a mederben lévő kavicsok, sziklák okozta sérülések, vízi élőlények és járművek okozta sérülések) és a holttest partra juttatása során is (pl.: csáklyázás) [7][8][9][10]. Mivel a vízbefulladás diagnózisának felállítása kizárólag a bonclelet alapján sok esetben nehéz, ezért a boncleleten kívül más technikával is meg kell erősíteni a vízbefulladás tényét [7][9][13]. Az utóbbi évszázadban számos új módszer megalkotásával próbálkoztak, ezek némelyike specifikus az adott vízközeg típusára [14][15], ezért a legtöbbjük a gyakorlatban nem terjedt el [16]. A diatóma teszt a legrégebbi, és általánosan a mindennapi gyakorlatban alkalmazott módszer a bonclelet megerősítésére, ám ahogyan később látni fogjuk, számos korláttal rendelkezik [17][18][19].
1.3 A vízbefulladás igazolását célzó laboratóriumi módszerek Már a 20. század elején bizonyították állatkísérletekkel, hogy édesvízbe fulladáskor a diffúzióval és ozmózissal a szervezetbe nagy mennyiségben bejutó víz hemodilúciót, sósvízbe fulladáskor a vér koncentrálódását (hemokoncentráció) és elektrolit változást okoz a szervezetben [20][21]. A fentiekben nevesített folyamatokat kísérő elektrolitváltozásokra vonatkozó, mindennapos gyakorlatban alkalmazható metodika nincs. Ennek oka, hogy a halál után olyan fizikai-kémiai és biológiai változások (rothadás, autolízis) mennek végbe a szervezetben, amelyek torzíthatják az elektrolit-vizsgálatot, ezáltal csökkentik annak standardizálhatóságát [8]. Azparren és munkatársai számos tanulmányt jelentettek meg sósvízbe fulladás esetén a jobb és bal szívfél között regisztrálható stroncium (Sr) koncentráció különbség gyakorlati alkalmazhatóságáról, amelyről megállapították, hogy minden esetben nagyobb, mint 75 μg/l [14][15][22][23][24][25][26]. Ezzel a méréssel megerősíthető a vízbefulladás ténye, ezért kiegészítő módszerként jól alkalmazható a pozitív bonclelet mellett, ám édesvízbe fulladás esetén nem alkalmazható.
9
1.4 Az algák és a vízbefulladás kapcsolata Az algák az élővilág heterogén, polifiletikus, ubikvista csoportját alkotják. A legrégebben leírt cianobaktériumok korát 3,3-3,5 milliárd évre becsülik [27], míg az eddig leírt legkorábbi fonalas alga fosszília kora 1,6 milliárd év [28], így joggal nevezhetjük őket a Föld ősi szervezeteinek. Nemcsak az őskorban, hanem a jelenben is nagy hatással vannak világunkra: fotoszintetikus aktivitásuk révén a légköri oxigén és a szerves szén termelésében játszanak kiemelkedő szerepet [29][30]. Általánosan kijelenthető, hogy minden természetes, és a legtöbb mesterséges vízben előfordulnak algák – legyen szó csapvízről, talajvízről, sós- és édesvízről, álló- és folyóvízről. Léteznek olyan fajok, melyek az álló-, míg mások a folyóvizeket preferálják inkább, illetve néhány algafaj ritka jelzője, ún. indikátorszervezete a speciális környezeti körülményeknek. Már a 20. század végén felismerték, hogy ezek a vízben élő egy- és többsejtű szervezetek méretükből és élőhely-specifitásukból adódóan alkalmasak lehetnek a vízbefulladás igazságügyi orvostani igazolására [31]. A vízbefulladás bizonyítása során fontos az algák poszt mortem szervekben való jelenlétének igazolása, ezért célszerű inkább tágabb algacsoportok kimutatását megcélozni ahelyett, hogy egyes fajokra koncentrálnánk (akár mikroszkópos, akár molekuláris biológiai módszerrel). A diatómák ellenálló szilícium vázuk miatt megfelelő indikátorszervezetek erre a célra [32][33]. Vannak olyan esetek azonban, amikor a vízközeg kevés diatómát tartalmaz, vagy nem tartalmaz diatómát, ekkor célszerű más baktérium- és algacsoportok (cianobaktériumok, zöldalgák stb.) kimutatására fókuszálni. 1.4.1 Diatómák 1703-ban Lemna írta le az első diatóma fajokat, melyeket egy békaszőlő gyökerén figyelt meg [30]. A diatómák (másnéven kovamoszatok) unicelluláris, eukarióta mikroorganizmusok [30]. A kovamoszatok (Bacillariophyceae) a sárgásmoszatok (Heterokontophyta) törzsének egy osztálya, a fajok számát 30 és 100.000 közé teszik [34]. Ubikvista csoport, azaz édes- és tengervízben is élnek, ám nem csak vízben, hanem a levegőben, növényeken és a talajban is előfordulnak (diatómaföld) [29][30][35][36]. Színtesteket tartalmaznak és fotoszintetizálnak, mégis, egyes fajaik a tengerek mélyén folytatnak heterotróf életmódot [30]. Egyaránt ismertek lebegő életmódot folytató, valamint az aljzathoz, növényekhez 10
tapadó fajaik is, ez utóbbiak leginkább a folyókban fordulnak elő. Az aljzaton élő diatómák robusztusabb, nagyobb mérettartományba eső fajok, ezek az ún. bentikus diatómák.
A
B 3. ábra A Különböző diatómafajok Balatonból származó Lugol-oldatos vízmintában. Az ábrán látható Cymbella fajok 15-40 µm mérettartományba esnek, míg a B ábrán látható Cyclotella fajok általában 5-40 µm közötti méretűek. Képek készítésének helye: Balatoni Limnológiai Intézet; Olympus DP71, 1000x
11
Általánosan elmondható, hogy a folyókban a bilaterális szimmetriájú diatómák a jellemzőek, ezzel szemben a körsugaras szimmetriájú diatómák a tavakban nagyobb számban vannak jelen. Néhány diatóma mikroszkópos képe látható az 3.A és B ábrán. A diatómák azonosítását és elkülönítését (nem csak más algafajoktól, hanem egymástól is) a jól differenciát, szilícium-dioxidot tartalmazó sejtfaluk teszi lehetővé. Ez a sejtfal több részből áll: állandó alkotója két, bonyolultan formált, egymásba illő héj, amelyet valvának nevezünk. Ehhez a héjhoz kapcsolódhatnak kisebb-nagyobb függelékek, struktúrák (melyek száma elérheti akár az 50-et is) [29][30][37]. A valvák meghatározzák és szabályozzák a diatómák méretét: néhány μm-től kb. 3-500 μm-ig terjed a diatómák mérettartománya [38], habár leírtak 600 μm átmérőjű valvákat is (kultúrában) [30]. 1.4.2 A vízbefulladás tényének bizonyítása: Diatóma teszt A vízbefulladás igazolására már a 20. század eleje óta alkalmazott módszer a diatóma teszt. Revenstorf volt az első kutató, aki a vízbefulladás bizonyítására diatómák kimutatását alkalmazta, 1904-ben publikálta ezzel kapcsolatos tanulmányát (ebben megemlíti, hogy a diatómák jelenlétét vízbefulladás során a tüdőben Hofmann 1896-ban már megfigyelte) [8][31]. A diatóma teszt azon alapul, hogy vízbefulladáskor a fuldokló tüdejébe jutó, diatómákat és más baktériumokat, algákat tartalmazó víz a vérkeringésbe kerülve elszállítódik a szervekhez (ld. 4. ábra). Mivel a fuldoklás általában percekig tartó folyamat (sósvízben hosszabb ideig tart, mint édesvízben), az algáknak elég idejük van a vérárammal eljutni a szervekig, és ezáltal kimutathatók az agyban, vesében, májban, lépben és/vagy csontvelőben is [7][8][13][33][36][38][39][40][41][42][43]. Ha az adott személy nem élő állapotában kerül a vízbe (nem fuldoklik), úgy keringés hiányában a fentnevezett, vízben élő szervezetek a nagyvérköri keringésbe kapcsolt szervekhez nem jutnak el. Ebben az esetben negatív diatóma teszt eredmény várható. Fentieket kiegészítve, a diatómák (és más algák) jelenléte a tüdőben nem bizonyító erejű a vízbefulladás szempontjából, hiszen ezek az élőlények passzívan is bekerülhetnek a tüdőbe, azonban a vérkeringés hiányában a célszervekig eljutni nem tudnak (kivéve abban az esetben, ha a testüregek valamilyen ok miatt megnyílnak, pl. a holttest bomlása vagy sérülés miatt, ilyenkor a vízi organizmusok jelenléte nem bizonyítja a vízbefulladást) [8][13][39][43][44]. A tudomány jelenlegi állása szerint ép kültakaró esetén sem a diatómák, sem a méretben baktériumokhoz hasonló cianobaktériumok és más pikoalgák
12
nem jutnak el passzívan a célszervekhez (pl. agy, lép, máj, vese, csontvelő), amennyiben az vízben ázik [44].
holttest kerül a vízbe
élő állapotban vízbe kerülés
az algák (a vízzel együtt) bejutnak a tüdőbe
az algák az alveoláris membránon át a véráramba kerülnek
a vérkeringés segítségével eljutnak a szervekig
a szervek savas/enzimatikus emésztése utáni mikroszkópos vizsgálat (diatóma teszt)
a szövetekben nem figyelhetők meg diatóma vázak (kivéve: tüdő és emésztőrendszer)
a szövetekben diatóma vázak detektálhatóak
4. ábra A diatóma teszt szerepe a vízbefulladás orvosszakértői igazolására.
A diatóma teszt során a savas vagy enzimatikus módszerrel elemésztik a szövet minél nagyobb részét, ezáltal csak a kovamoszatok szilícium-dioxid (SiO2) vázai maradnak vissza, melyek fénymikroszkóppal detektálhatók és akár fajszintű azonosításra is alkalmasak [11][29][30][38][39][45][46][47]. Amennyiben ismert az adott földrajzi hely – egyéb környezeti tényezőket is figyelembe vett – kovamoszat populációja, nem csak a vízközeg, hanem a vízbefulladás pontos helyszíne is meghatározható, illetve megadhatjuk, hogy a feltalálási hely és a vízbefulladás helye milyen viszonyban van egymással [8][13][19][32][40][45][48].
13
Amennyiben a vizsgálat pozitív eredménnyel jár, azaz a vízben és meghatározott poszt mortem szövetekben is kovavázakat lehet látni, az elhunyt nagy valószínűséggel vízbefulladt. Minél több diatómát tartalmazott a holttest feltalálásának helyszínét képező víz, illetve minél hosszabb ideig húzódott el a fuldoklás, annál nagyobb a valószínűsége az algák bekerülésének a szervezetbe [7][8]. Az 5.A és B ábrán tüdőszövetben látható diatóma vázakat mutatunk be proteinase K enzimmel történt emésztés után.
A 5. A ábra Cymatopleura sp. váza vízbefulladt személy tüdőmintájában. A képen látható faj – amely feltehetően Cymatopleura
elliptica
–
mérettartománya 50-220 µm. Natív fénymikroszkópos metszet. Készítés helye: PTE ÁOK, Igazságügyi Orvostani Intézet
B B ábra Diatóma vázak (↑) vízbefulladás miatt elhunyt személy tüdőszövet mintájában.
Az
ábrán
látható
Pinnularia sp. mérettartománya: 20120 µm. Natív fénymikroszkópos metszet.
Készítés helye: PTE ÁOK, Igazságügyi Orvostani Intézet
14
A diatómákat és más algafajokat nem csak mikroszkópos, hanem PCR alapú módszerekkel is ki lehet mutatni, ezekről később esik szó. A diagnosztikus lehetőségeket a 6. ábrán mutatjuk be.
diatóma teszt
PCR
pozitív
negatív
negatív
pozitív
más halálok, vagy álnegativitás?
vízbefulladás vagy álpozitivitás?
vízbefulladás
más algafajok keresése a vízmintában
új primer tervezése, majd új PCR
6. ábra Vízben talált holttest esetén alkalmazandó diagnosztikus döntési lehetőségek laboratóriumi vizsgálathoz. Amennyiben a diatóma teszt negatív, érdemes megfontolni a PCR alapú vizsgálat lehetőségét.
A diatóma teszt alkalmazhatóságáról és értékelhetőségéről az igazságügyi orvostani gyakorlatban a kutatóknak eltérő a véleménye. Egyes szakértők már a ’60-es évek végén megkérdőjelezték a teszt hatékonyságát és alkalmazhatóságát a vízbefulladás tényének megerősítésére [43][49][50]. Irodalmi adatok alapján valóban előfordulhatnak olyan kivételes esetek, amikor a diatóma teszt álnegatív vagy álpozitív eredményt adhat [12][38][49][50][51][52][53][54][55].
15
Álnegatív esetek előfordulhatnak, ha (1) a vízbefulladás közege kevés diatómát tartalmazott, (2) a fuldoklás rövid ideig tartott, és a diatómáknak nem volt ideje a keringés segítségével elszállítódni a szervekig, (3) a szövetekben lévő kevés diatóma váz az emésztés következtében elveszett [8][55]. Az irodalomban számos eshetőséget leírtak az álpozitivitás lehetőségére is. Mivel kovamoszatok előfordulnak a levegőben és a talajban is, utólag nehéz kizárni, hogy a diatómák jelenléte a szövetekben nem inhaláció eredménye-e [12][38][56][57]. Langer és munkatársai 1971-ben felvetették, hogy dohányzás közben a dohánylevelek felületén élő kovamoszatok belégzése is lehetséges [58]. Peabody 1977-ben publikált tanulmányában leírja, hogy nem csak a gyufák fejében láthatóak diatóma vázak (amelyek az égés után is épek maradnak), hanem egyes festékek és lakkok is tartalmazzák őket, ez pedig felveti a kontamináció lehetőségét [38]. Otto 1961-ben 28 szilikózisos beteg tüdejét vizsgálta meg, és 23 esetben írta le diatómák jelenlétét a mintákban [18], ezekben a kutatásokban azonban nem vizsgálták a vér vagy a további szervek esetleges pozitivitását. A szilícium tartalmú kozmetikumok és táplálékkiegészítők kovaföldet tartalmaznak porított formában, amely bejutva a szervezetbe szintén torzíthatja vizsgálataink eredményességét [38]. 1.4.3 Cianobaktériumok A cianobaktériumok a diatómáktól eltérően prokarióták. Kékeszöld algákként is hivatkoznak rájuk, ám egyes megfontolások szerint csak az eukarióta algák nevezhetőek algának, ezért a cianobaktérium elnevezést pontosabbnak tartják [29]. A diatómákhoz hasonlóan fotoszintetizáló életmódot folytatnak, és nem csak a vízben, hanem a nedves talajban is előfordulnak. Ismertek unicelluláris és fonalas megjelenésű fajaik is [29]. Az unicelluláris cianobaktérium fajokról elmondható, hogy azok a diatómák mérettartományának
alsó
határán
helyezkednek
el.
A
legkisebb
unicelluláris
cianobaktériumok átmérője 0,2-1 µm közötti (pl. Prochlorococcusok), ezeket méretük miatt pikocianobaktériumoknak nevezzük. A széleskörűen elterjedt Synechococcus nemzetség tagjai a legkisebb pikocianobaktériumok, méretük kisebb, mint egy emberi vörösvértest: coccoid sejtjeik átlagosan 1 µm átmérőjűek [29][59][60]. Nem csak édes- és sósvízi fajaikat ismerjük, a magyarországi álló-és folyóvizekben nagy számban fordulnak elő minden évszakban, illetve a talajból kimosódva megjelenhetnek az esővízben is (pl. árokban nagy esőzések után ideiglenesen felgyűlt víz),
16
ezért megfelelő indikátorszervezetek lehetnek a vízbefulladás laboratóriumi igazolásához [29][34]. Mivel a cianobaktériumok nem rendelkeznek a diatómák SiO2 vázához hasonló, a baktériumoktól való elkülönítésüket segítő, illetve a faji szintű meghatározást lehetővé tévő mikroszkopikus jegyekkel, kimutatásukra más módszerek terjedtek el az algológusok körében.
A
7.
ábrán
néhány
pikocianobaktérium
látható,
amelyeket
autofluoreszcenciájuknak köszönhetően könnyen azonosíthatunk friss vízmintában kékesibolya gerjesztőfénnyel. Ezek a pikocianobaktérium fajok csupán fénymikroszkóppal vizsgálva nem különíthetőek el a vizekben megtalálható más baktériumcsoportoktól. Jelen dolgozat tárgyát ebből a csoportból a Synechococcus nemzetség képezi, amely kis mérete és évszaktól független, széleskörű magyarországi elterjedése miatt a molekuláris szintű vizsgálatok kidolgozásához kiváló szervezetnek bizonyult.
7. ábra Cianobaktériumok (↑) azonosítása balatoni vízmintában fluoreszcens mikroszkóppal. A képen látható fajok átmérője a néhány mikrométeres tartományba esik. Képek készítésének helye: Balatoni Limnológiai Intézet; Olympus BX51, 1000x nagyítás
17
2. CÉLKITŰZÉSEK A vízbefulladás tényének igazolására jelenleg is alkalmazott módszer a diatóma teszt, amelyet már a 19. században is alkalmaztak a törvényszéki orvosi gyakorlatban [31], a PCR (polimeráz láncreakció) 20. század végi felfedezésével azonban új távlatok nyíltak meg az igazságügyi orvostani módszerek kiterjesztésében. Kutatásom céljai a következők voltak: 1. a dél-dunántúli régióban történt vízbefulladások körülményeinek és helyszíneinek felmérése, a rizikófaktorok vizsgálata; 2. a dél-dunántúli régió vizeiben élő legjellemzőbb algacsoportok meghatározása, és az ezeknek az algacsoportoknak megfelelő PCR primerek alkalmazása a vízbefulladás bizonyítására; 3. a korábbi, törvényszéki gyakorlatban alkalmazott mikroszkópos módszer (diatóma teszt) érzékenységének és specifikusságának növelése, és a módszer diatómáktól eltérő algafajokra és cianobaktériumokra való kiterjesztése; valamint 4. egy olyan, a mindennapi igazságügyi orvostani gyakorlatba egyszerűen átültethető, DNS alapú módszer kifejlesztése, amely széleskörűen alkalmazható természetes és mesterséges vizekben történő vízbefulladás esetén a vízbefulladás megerősítésére.
18
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT MÓDSZERTANA
3.1 A vízbefulladások számának felmérése 2008. január 1. és 2012. december 31. között, a dél-dunántúli régió (Baranya-, Tolna- és Somogy-megye) természetes és mesterséges vizeiben elhunyt személyek retrospektív vizsgálata történt. Összesen 114 esetet vizsgáltam meg az alábbi osztályozási szempontok figyelembevételével: nem, életkor, alkohol- és drogfogyasztás, vízbefulladás helyszíne (a vízközeg típusa), illetve más körülmények, amelyek hozzájárulhattak a vízbe kerüléshez (a vízbe kerülés oka). A vizsgálat az összes olyan vízbefúlásos esetet tartalmazta, amikor az elhunyt boncolása intézetünkben, vagy az Igazságügyi Szakértői és Kutató Intézet szekszárdi és kaposvári kirendeltségén keresztül, azaz, Baranya-, Somogy- vagy Tolna-megyében történt. A vízbefulladás, mint halálok, előzményi és nyomozati adatok, a boncolási jegyzőkönyv, és a boncolást kiegészítő mikroszkópos vizsgálatok (szövettan, diatóma teszt) alapján lett megadva. A boncolás során a természetes halálokokat kizárták. A leggyakoribb boncleletek a következők voltak: a savós hártyák pontszerű vérzései; puffadt, száraz tüdők; Paltauf foltok; testszerte híg, folyékony, szederjes vér; jobb szívfél tágulat és belső szervek pangásos bővérűsége [6][7][8]. A szövettani vizsgálatok a makroszkópos megfigyeléseket mindenben megerősítették (pl.: emphysema aquosum).
3.2 Toxikológiai analízis A toxikológiai analízishez szükséges vérmintát a boncolások során a csípő visszerekből nyertük minden esetben. A véralkohol vizsgálatot gőztér mintaadagolóval ellátott gázkromatográffal (Agilent Technologies 7890A), a detektálást lángionizációs detektorral (HS-GC-FID) végeztük el. Kábítószer meghatározásra diódasoros detektorral ellátott nagyteljesítményű folyadékkromatográfot (HPLC-DAD), illetve tömegspektrométerrel (Waters Mass Detector 3100) kapcsolt szuperkritikus fluid kromatográfot (Waters UPC2) alkalmaztunk [61][62]. 19
3.3 Statisztikai analízis A statisztikai analízist a GraphPad Prism programmal végeztük el (Windows) és a leíró módszereken kívül a Pearson-féle Chi-négyzet próbával elemeztük az adatokat. A 0,05 alatti p értéket tekintettük statisztikailag szignifikáns eltérésnek.
20
II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA MÓDSZERTANA
3.4 Mintakezelés A vízmintákból (minimum) 10-50 ml közötti mennyiséget dolgoztam fel esetenként a beérkezett mintamennyiségtől és a vízminta típusától függően. A kísérletek során felhasznált vízminták az ország számos részéről, illetve külföldről is származtak. A feldolgozott vízbefúlásos esetekhez a hatóság által biztosított vízmintákat alkalmaztam. Negatív kontrollként a boncolás helyszínéről (krematórium, boncterem) a saját steril, 50 ml-es centrifugacsöveinkben biztosított vizet alkalmaztam. A kísérletek során a protokollok kidolgozására alkalmazott algatenyészetek a Magyar Tudományos Akadémia Balatoni Limnológiai Kutatóintézete által biztosított algatörzsek voltak: (1) bentikus algák a Balatonból, (2) Synechococcus sp. alga a cianobaktérium alapú PCR vizsgálat kidolgozásához, (3) Choricystis sp. zöld pikoalga a zöldalgákra specifikus primerek alkalmazásakor, (4) Nitzschia sp. a diatóma alapú vizsgálatokhoz (bővebben ld. 3.7.4 PCR kontrollok fejezet). A boncolás során nyert szervminták magyarországi igazságügyi orvostani és szakértői intézetekből származtak, esetenként (minimum) 1-15 g tömegű mintát dolgoztam fel ezekből. A boncolás közbeni mintavétel során az esetleges technikai szennyeződéseket az orvosszakmai ajánlásnak megfelelően (pl. csapvízzel való érintkezés) minden lehetséges módon próbáltuk elkerülni: a kültakaró megnyitása után új, steril eszközzel lettek a szervek eltávolítva, valamint egyszer használatos, steril gyűjtőedényeket alkalmaztunk a minták tárolására. A vízbefulladások során alkalmazandó steril mintavételi eljárás lépéseit Hürlimann publikálta [63].
3.5 A vízbefulladás bizonyítására alkalmazott módszer, a diatóma teszt A diatóma teszt célja kovavázak fénymikroszkóppal történő kimutatása a vízbefulladás helyszínét képező víz- és poszt mortem szövetmintában. A kovavázak jelenléte a mintában utalhat a vízbefulladásos halálokra. A tesztek elvégzésekor a megfelelő pozitív és negatív kontrollok mellett a hatóságok által biztosított, a holttest feltalálásának helyéről származó vízből (min. 10 ml) és a szervmintákból (1-15 g) indultunk ki, majd az emésztési eljárás után az algák 21
vizsgálata a vízmintában és a szövetmintában mikroszkóppal történt. A minta vizsgálatához a megfelelő mikroszkópos technikát a szerint választottam ki, hogy milyen algacsoportokat szeretnék vizsgálni, kimutatni, illetve, hogy az adott minta feltehetően algában gazdag, vagy szegényes környezet-e. 3.5.1 Diatóma teszt I.: Savas emésztés A diatóma tesztnek számos változata terjedt el aszerint, hogy milyen vegyszerekkel emésztik a szövetet. Intézetünkben a mindennapi gyakorlatban a diatóma teszt elvégzése kombinált savas emésztéssel történik (H2SO4, HNO3 és H2O2 felhasználásával) [32]. A vizsgálat során a poszt mortem szövetet (leggyakrabban csontvelő) egy éjszakán át H2SO4-oldatban emésztik. A kénsavas emésztést követően kis részletekben HNO3-at adagolnak az elegyhez halvány sárga szín eléréséig, majd H2O2–oldatot csepegtetnek hozzá, amíg az oldal áttetszővé nem válik. A felülúszó eltávolítása után a kovavázakat fénymikroszkóppal analizálják. 3.5.2 Diatóma teszt II.: Enzimatikus emésztés Az enzimatikus emésztés formalin fixált és natív, fixálatlan mintán is elvégezhető. Ehhez az 1-15 g szövetmintát először steril algamentes vízzel mostuk. Annyi proteinase K enzim lízis puffert adtunk a mintához, hogy az bőven ellepje (kb. 5 ml), valamint 250 μl proteinase K enzimet (Thermo Scientific, >600 U/ml (~20 mg/ml)). Az így kapott oldatot 56°C-on inkubáltuk O/N, óvatosan rázatva a mintát, segítve, hogy az enzim hozzáférjen a szövethez minden irányból. Másnap megismételtük a mosó lépést, majd ismét proteinase K enzimet adtunk az elegyhez (20-200 μl, a minta zavarosságától függően). Szükség szerint ismét O/N rázattuk. Ha a minta áttetszővé vált, lecentrifugáltuk, ezután a pellet mikroszkópban vizsgálható [45][46]. 3.5.3 Diatómák vizsgálata fordított plankton mikroszkóppal A néhány gramm (1-15 g) szövetet 1-2 mm-es darabokra vágtuk és erőteljesen összeráztuk néhány másodpercig steril, 15 ml-es centrifugacsőben. Centrifugálás után (4500 rpm, 15 perc) határozott mozdulattal leöntöttük a felülúszót és desztillált vízben vettük fel a pelletet. A pelletből 3 ml-t kivettünk és 20 μl Lugol-oldatot adtunk hozzá. Ülepítő tartályba mértük az elegyet, levegőmentesen lezártuk, majd O/N ülepítettük (ld.
22
8.A ábra), ezután fordított plankton mikroszkópban vizsgáltuk a jellegzetes vázzal rendelkező diatómákat és a zöldalgákat (ld. 8.B ábra).
B
A
8. ábra A Különböző térfogatú ülepítőtartályok, Lugol-oldatos víz- és poszt mortem szövetmintával. B A vizsgálatok során használt Zeiss fordított plankton mikroszkóp (a Balatoni Limnológiai Intézet tulajdona).
3.6 Pikocianobaktériumok és pikoeukarióta algák azonosítása és elkülönítése vízmintában fluoreszcens mikroszkóppal A friss, homogenizált vízmintákat 0,2 µm pórusméretű, fehér polikarbonát membránszűrőre (Millipore) szűrtük, majd a szűrőt glicerinbe ágyaztuk. A preparátumot Olympus BX51 epifluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk (1000x nagyítás) (ld. 9. ábra). Először a különböző pigment típusú pikoalgákat azonosítottuk kékesibolya (UMWBV2) és zöld (U-MWG2) gerjesztőfény segítségével. A felvételeket a látható fényt érzékelő digitális mikroszkóp kamerával (Olympus DP71) készítettük MacIsaac és Stockner (1993) leírása szerint [64][65][66]. A kékesibolya fénnyel való megvilágítás hatására a pikocianobaktériumok és pikoeukarióta zöldalgák válnak láthatóvá. A zöld fény a
cianobaktériumok
és
az
eukarióták
elkülönítésére
szolgál,
ugyanis
a
pikocianobaktériumok fluoreszcenciája (fikobiliprotein-tartalmuk miatt) zöld fénnyel világítva erősebb lesz, míg az eukariótáké kevésbé erőteljes (a klorofill a és b vörös és kék fénnyel gerjesztődik jól, ám zölddel nem gerjesztődik). 23
9. ábra A vizsgálatok során Olympus BX51 epifluoreszcens mikroszkópot használtunk a Balatoni Limnológiai Intézetben. A mikroszkópos preparátumok és a fotók egy részét a Balatoni Limnológiai Kutatóintézetben készítettük.
3.7 DNS izolálás és PCR 3.7.1 Fitoplankton DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből A több lépésben ülepített, majd kb. 10 ml végtérfogatú vízminta centrifugálása után a pellethez 10% Chelex 100 oldatot adtam [67]. Az 1-15 g tömegű humán poszt mortem szervminták esetében a kb. 2 mm3 darabokra felvágott szöveteket steril, mikroalga-mentes víz hozzáadásával, PotterElvehjem homogenizátor segítségével homogenizáltam. Ezután lecentrifugáltam a szövetszuszpenziót, és a pellethez adtam a 10% Chelex 100 oldatot. Az algák sejtfalát mechanikai módszerrel tártam fel gyors felolvasztás-lefagyasztás lépéseket (-80°C és 56°C) ismételve négy cikluson át. Az utolsó felolvasztáskor a mintát
24
20 percig inkubáltam 56°C-on, majd 8 percre forrásban lévő vízbe helyeztem. Centrifugálás után a felülúszó tartalmazta a DNS-t. 3.7.2 Diatóma DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből A több lépésben ülepített, majd kb. 10 ml végtérfogatú vízmintát 60 percen át vízfürdőben melegítettem. A Potter-Elvehjem homogenizátor segítségével homogenizált, 1-15 g-os szövetdarabokat mikroalga-mentes vízzel egészítettem ki ugyanilyen térfogatra. Az üledékhez 300 μl, ún. diatóma lízis puffert adtam, amelynek az összetétele a következő: 10 mM Tris-HCl, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav dinátrium só (disodiumEDTA), 200 mM NaCl, 0,2 % nátrium-dodecil szulfát (SDS). A mintában lévő algák sejtfalának feltárása mechanikai módon történt: négy cikluson át gyors fagyasztásfelolvasztás (-80°C és 56°C) lépéseket alkalmaztam. Az utolsó felolvasztási lépés után proteinase K enzimet (20 mg/ml) adtam a mintához és néhány órán át 56°C-on, gyengéden rázatva inkubáltam az elegyet. Amikor nagyrészt vagy teljesen áttetszővé vált az üledék (vízminták esetében ez átlagosan 1-3 órán belül, szervminták esetén egész éjszakán át tartó rázatás után következett be), a mintákat centrifugáltam és a DNS-t tartalmazó felülúszót alkalmaztam templátként a PCR során. 3.7.3 PCR A vízből és a szövetekből a különböző izolálási folyamatok végén nyert DNS-t DNS tisztító kit alkalmazásával az esetleges szennyezésektől megtisztítottam (GeneJET Genomic DNA Purification Kit, Thermo Scientific), szükség esetén tisztító és koncentráló kitet alkalmaztam (DNA Clean & Concentrator™-5, Zymo Research), majd az így kapott elegyet használtam templátként a PCR során, 20 μl végtérfogatban. A megfelelő Taq polimeráz enzim megtalálása a kísérletek során sarkalatos pont volt, ugyanis számos enzimmel kísérleteztem, amíg megtaláltam azt, amely a vizsgálatok során a legnagyobb valószínűséggel amplifikálta fel a keresett DNS szakaszt. Végül a Thermo Scientific™ által gyártott DNA DreamTaq™ Polymerase enzim bizonyult a legmegfelelőbbnek. A gyártó ajánlása szerint ez az enzim nagy szenzitivitása miatt erősen szennyezett mintában is fel tudja amplifikálni a kívánt DNS szakaszt. Az enzim számára a gyártó
saját,
optimalizált
DreamTaq™
puffere
biztosítja
az
optimális
reakciókörülményeket. Esetünkben külön előny volt, hogy az enzim robosztus PCR terméket eredményez abban az esetben is, ha a körülmények nem tökéletesen 25
optimalizáltak, hiszen a kísérletek során a specifikusság kiszélesítésének érdekében egyes esetekben reakciónként a szokásos egy helyett két reverse primert is alkalmaztam (ld. 2. táblázat, cianobaktériumokra specifikus CBR primerek). A reakcióelegy összetétele: DNS-t tartalmazó oldat
1 μl
oligonukleotidok (500 nM)
2 μl
dNTP mix (10 mM)
1 μl
Taq polimeráz enzim (5 U/µl)
0,2 μl
10x puffer (+ MgCl2)
2 μl
nukleáz mentes víz
13,8 μl
ÖSSZESEN:
20 μl
Az kísérletek során alkalmazott oligonukleotid szekvenciákat és adataikat a 2. táblázat mutatja [68][69][70][71][72][73]. A CBR kódokkal ellátott primerek cianobaktériumokra, a DIA kódokkal ellátott primerek diatómákra, míg a PLA és RUB jelzésű oligonukleotidok az előbb felsorolt organizmusoktól eltérő plankton szervezetekre specifikusak (pl. zöldalgák).
26
Oligonukleotid
CBR F CBR R1 CBR R2 CBR2 F CBR2 R CBR3 F CBR3 R DIA F DIA R
Szekvencia 5’→3’
Tm
Specifitás Algacsoport
Gén
CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT
66,9°C 59,2°C 59,2°C
Cyanobacteria
16S rRNS
ATGAGCAAGAAGTACGACGC GGTCTCCTGCTCGGACAG
58,3°C 59,1°C
Cyanobacteria / Synechococcus sp.
rbcL
GGTCCACTGTGTGGTCCGAGG GTTCTCGTCGTCCTTGGTGAAGTC
64,7°C 63,4°C
Cyanobacteria / Synechococcus sp.
rbcL
GACTCAACACGGGAAAACTTACC CACCAACTAAGAACGGCCATGC
59,8°C 62,3°C
Heterokontophyta
18S rRNS
DIA2 F DIA2 R
AGATTGCCCAGGCCTCTCG CCATCGTAGTCTTAACCATAAAC
61,7°C 54,9°C
Heterokontophyta / Bacillariophyceae 18S rRNS
PLA F PLA R
ATGTGGCGCCAAGGAATGTTTGT ACCCAATGCCAAATAGCAGC
60,0°C 59,1°C
Eukaryota/Euglena sp.
chloroplast genom
RUB F RUB R
CCACAAACTGAAACTAAAGCA CATGTGCCATACGTGAATACC
54,9°C 57,1°C
Chlorophyta
rbcL
2. táblázat A kísérletek során alkalmazott oligonukleotidok és specifitásuk. F= forward (előre); R= reverse (vissza) oligonukleotid
27
3.7.4 PCR kontrollok Vizsgálatom során kiemelten fontos volt a megfelelő kontrollok kiválasztása. Az eljárás érzékenységéből adódóan a DNS templát mentes kontroll alkalmazása elengedhetetlen a PCR alapú módszerek esetében. A vízbefúlás bizonyításának céljából kísérleteink során az alábbi kontrollok alkalmazását találtam szükségesnek: 1. DNS templát mentes kontroll („no template” kontroll) a PCR-elegy összeállítása során esetlegesen bekövetkező kontamináció kizárására: ebben az esetben az 1 μl DNS templát helyett a minta a DNS templátnak megfelelő térfogatú algamentes desztillált vizet tartalmazott; 2. csapvízminta-kontroll a boncolás helyszínéről, amelyet a boncolás során a tetem lemosására alkalmaztak (boncterem, krematórium); 3. poszt mortem szövet nem vízbefulladás miatt elhunyt tetemekből (8 esetben, amikor a halál oka önakasztás volt); 4. pozitív algatörzs kontrollok: Synechococcus sp., Chorycistis sp., Nitzschia sp. tisztatenyészete, illetve balatoni bentikus algafajok (az algatenyészetek forrása: Magyar Tudományos Akadémia Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, Tihany).
28
4. EREDMÉNYEK
I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEI A WHO évenként vizsgálja a vízbefúlásos halálesetekkel összefüggésbe hozható rizikófaktorokat [1]. Az általuk kiemelt és jelentősnek tartott rizikófaktorok érvényességét vizsgáltam meg Magyarország dél-dunántúli régiójában azon célból, hogy meghatározzam a leginkább veszélyeztetett csoportokat és a leggyakoribb vízbefúlási helyszíneket, illetve a vízbe kerüléshez vezető okokat.
4.1 A vízbefulladások számának felmérése Magyarország dél-dunántúli régiójában Összesen 114 vízbefulladás miatt elhunyt személy retrospektív vizsgálata történt a 2008-2012-ben elhunytak körében. A Pearson-féle Chi-négyzet próba elvégzése nem adott szignifikáns különbséget az egyes években ismertté vált vízbefulladások számát illetően (p=0,1259), tehát az a vizsgált időszak alatt állandónak tekinthető (kivéve 2008-ban, amikor feleannyi vízbefulladás miatt elhunyt személyt boncoltak az általam vizsgált intézetekben, ennek oka nem ismert; ld. 10. ábra).
10. ábra A vízbefulladások számának évenkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).
29
A 114 esetből négy elhunyt személyazonosságát nem tudták megállapítani, azonban a boncolás alapján be lehetett sorolni őket a legtöbb vizsgált csoportba (pl. nem, életkor). Azonban két egyén esetén a halál időpontját nem volt lehetséges évre pontosan megadni, ők „ismeretlenként” vannak feltüntetve a 10. ábrán (részletesen ld. Függelék F/1. táblázata). 4.1.1 Rizikófaktor: Életkor A 2008 és 2012 között vízbefulladás miatt elhunytak életkorának nemenkénti megoszlását vizsgáltam azon célból, hogy megismerjem, mely korcsoport a leginkább veszélyeztetett a vízbefulladás tekintetében ebben a régióban. Az eredményeket a 11. A, B és C ábra, valamint a Függelék F/2. táblázata mutatja be. Úgy találtam, hogy a legmagasabb rizikófaktorú csoport az életkort tekintve az 51 és 60 év közöttiek korcsoportja (31 a vizsgált 114 esetből; 27,19%), sőt, mind a férfiakat, mind a nőket tekintve az 51 és 70 év közöttiek fulladtak vízbe leggyakrabban (ld. 11.C ábra). Ez a korcsoport az összes vízbefulladásos haláleset közel felét (44,73%) tette ki a vizsgált ötéves periódusban. AWHO szerint az 14 év alatti gyermekek között a legmagasabb a vízbefulladási ráta Afrikában, Ázsiában és Amerikában, ám Magyarország vizsgált környékén meglepően alacsony volt az ebbe a korcsoportba tartozó elhunytak száma [1][2][74]. A vizsgálatban szereplő elhunytak közül a legfiatalabb egy 5 éves fiú volt, akit egyik szülője látott elsüllyedni a Balatonban. A legidősebb áldozat egy 88 éves nő volt, akit a saját telkén található kútban találtak meg. A WHO jelentése szerint Kanadában és Új-Zélandon a felnőtt férfiak a vízbefulladás szempontjából a legveszélyeztetettebbek [1][75][76]. Vizsgálatom alapján Magyarországon az 50 év feletti férfiak nagyobb gyakorisággal fulladnak vízbe, mint az 50 év alatti középkorúak és az ennél fiatalabbak. Nem találtam adatot arról, hogy más országokban a dél-dunántúli vízbefulladásos esetekhez hasonlóan magas lett volna az idősebbek körében a vízbefulladások száma.
30
A
B
31
C
11. ábra A vízbefulladásos esetek nemenkénti és korcsoportonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (20082012). A Férfiak; B Nők; C mindkét nem megoszlása.
4.1.2 Rizikófaktor: Véralkoholszint Kevés tanulmány vizsgálja az alkoholfogyasztás és a vízbefulladás kapcsolatát, ám a WHO szerint szoros összefüggés lehet közöttük [77]. Azért, hogy megvizsgáljam az alkoholfogyasztás és a vízbefulladás kapcsolatát, a 2008-2012 közti időszakban bekövetkezett halálesetek áldozatainak véralkoholszintjét és a korcsoportok közti megoszlását hasonlítottam össze. 68 (n=81 fő (83,95%)) férfi és 29 nő (n=33 (87,89%)) véralkoholszintje volt mérhető (összesen 97 a 114 vizsgált esetből), közülük 58 férfi (a mérhető véralkoholszinttel rendelkező férfiak 85,29%-a) és 15 nő (a mérhető véralkoholszinttel rendelkező nők 51,72%-a) fogyasztott alkoholt. Összesen az esetek közel kétharmadában (n=73; 64,04%) volt a véralkoholszint 0,21‰ felett. 17 esetben nem lehetett megmérni a véralkoholszintet az előrehaladott bomlás vagy a vér hiánya miatt. A mérhető véralkoholszintek értékeinek nemek közti megoszlását a 12. ábrán ábrázoltam. Az ábrán jól látszik, hogy azokban az esetekben, ahol a véralkoholszintet 32
mérni lehetett, háromszor annyi elhunyt véralkoholszintje lett pozitív, mint amennyié negatív. A 0,21‰ alatti véralkoholszintet tekintettem negatívnak (n=24; 21,05%), ez alatt az érték alatt az alkoholfogyasztás nem bizonyítható (az alkoholos befolyásoltság megállapítása során figyelembe vett határértékek leírása a Függelék F/3. táblázatában
esetek száma
láthatók).
28
30
10
férfiak nők
14 9 negatív
6
pozitív, BAC < 1,50
pozitív, BAC ≥ 1,50
véralkoholszint
12. ábra A véralkoholszint és a nemek közti összefüggés. A mérhető véralkoholszintek száma n=97 volt. A negatív (n=24, 0-0,20‰ közötti BAC értéket tekintettem negatívnak) és a pozitív (n=73) véralkoholszintű elhunytak száma szignifikáns eltérést mutatott (p<0,05). Az áttekinthetőség miatt az ábrán az 1,50‰ BAC alatti és feletti értékeket különítettem el, amely az enyhe és a közepes fokú alkoholos befolyásoltság határértéke.
A férfiak véralkoholszintje átlagosan magasabb volt, mint az alkoholt fogyasztó nőké. Nyolc férfi elhunyt véralkoholszintje az igen súlyos fokú alkoholos befolyásoltság tartományába esett, azaz közel toxikus mennyiségben volt jelen az alkohol a 33
BAC
Férfiak
nem meghatá rozható1
00,202
0,210,50
0,510,80
0,811,50
1,512,50
2,513,50
3,50<
Össz.
ismeretlen
2 1 1 -
1 2 3 4 2 2 -
1 2 1 2 1 -
1 -
1 -
2 2 1 -
1 -
-
Összesen
4
14
7
1
1
5
1
0
0 1 0 3 4 10 7 5 3 0 33
Életkor 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90
nem meghatá rozható1
00,202
0,210,50
0,510,80
0,811,50
1,512,50
2,513,50
3,50<
Össz.
1 1 5 3 1 2
1 4 1 1 2 1 -
4 3 2 2 3 3 -
2 2 1 1 1 -
1 1 1 1 -
1 1 2 1 3 1 -
3 2 6 2 -
1 4 3 -
13
10
17
7
4
9
13
8
1 12 7 10 8 21 13 6 1 2 81
3. táblázat Vízbefulladás miatt elhunyt személyek véralkoholszint-értékeinek megoszlása korcsoportok szerint (Dél-Dunántúl, 2008-2012). 1
A nem meghatározható véralkoholszint oka: előrehaladott bomlás vagy nem elegendő folyékony vér.
2
0-0,20% közötti BAC érték negatívnak tekinthető.
- 34 -
Mindkettő összesen
Nők
1 13 7 13 12 31 20 11 4 2 114
szervezetükben (3,51‰ feletti véralkoholszint). A halál oka ezekben az esetekben is vízbefulladás volt. Férfiak esetében minden életkorban egyenlő mértékben volt jellemző az alkoholfogyasztás, a nők kevesebb alkohol fogyasztottak, és az is inkább az idősebb korosztályra volt jellemző (ld. 3. táblázat). Az elhunytak pozitív (n=73) és a negatív (n=24) véralkoholszint eredményeinek száma között szignifikáns különbség mutatkozott (ld. 12. ábra). 4.1.3 Rizikófaktor: Kábítószer- és gyógyszerfogyasztás Az
alkoholfogyasztás
mellett
a
kábítószer-
és
gyógyszerfogyasztás
is
befolyásolhatja az áldozatok veszély-felismerési és önmentési képességét, ezért megvizsgáltam, hogy a dél-dunántúli régióban elhunytak esetében van-e kapcsolat a kábítószer- és gyógyszerfogyasztás és a vízbefulladás között, valamint, hogy milyen gyógyszereket fogyasztottak az elhunytak. 74 esetben találtam adatot a kábítószer- és gyógyszerfogyasztásról. 11 esetben (14,86%) azonosítottak valamilyen gyógyszerhatóanyagot a vérben, 5 esetben nőknél, míg 6 esetben férfiaknál. A leggyakrabban benzodiazepin csoportba tartozó szerek jelenlétét írták le a vérben (5 eset), ezt követte a citalopram (2 eset), további egy-egy esetben carbamazepine, noraminophenazon, ibuprofen és venlafaxine került leírásra. Ezeket a gyógyszerhatóanyagokat 54 és 75 év közötti elhunytak véréből mutatták ki. Ezzel szemben amfetaminszármazékot három esetben írtak le (17, 20 és 52 évesek, mindannyian férfiak). Más országok statisztikai adataival összehasonlítva a gyógyszeres illetve kábítószeres befolyásoltság vízbefulladáskor kifejezetten ritka hazánkban [78][79]. 4.1.4 Rizikófaktor: Évszakok A vízbefulladásos halálesetek bekövetkeztének időszakát vizsgálva a várt eredményt kaptam. A Dél-Dunántúlon történ vízbefulladások nagy része a melegebb hónapokban, márciustól augusztus végéig történt (74,56%). A vízbefulladások közele fele (49,12%) nyáron történt (p<0,0001). A téli időszakban bekövetkezett vízbefulladások nagy része öngyilkosság miatt következett be, míg a többi évszakban inkább a véletlenszerű balesetek száma volt a jellemző. A vízbefulladások szezonális mintázata más országokéhoz (pl. USA, Banglades, Irán) hasonlóan alakult (ld. 13. ábra és Függelék F/4. táblázat) [76][77][80].
35
3,51%
10,53% 25,44% 11,40%
49,12%
tavasz
nyár
ősz
tél
ismeretlen
13. ábra A vízbefulladásos esetek évszakonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).
4.1.5 Rizikófaktor: Vízbefulladások helyszínei A vízbefulladások helyszíneit országonként leginkább a földrajzi és éghajlati viszonyok határozzák meg. Vizsgálatom célja volt, hogy felmérjem, mely helyszíneken történik vízbefulladás a környékünkön. A 14. ábrán látható, hogy a legtöbb vízbefulladás természetes vizekben (folyókban, tavakban) történt Magyarország dél-dunántúli régiójában. A holttestek legnagyobb számban a Dunában (n=30; 26,32%), illetve a Balatonban (n=22; 19,30%) kerültek feltalálásra. A beltéri vízbefulladások ritkák voltak, mindössze négy esetben írtak le hasonlót. 13 esetben találták meg az elhunytat az ingatlanja közvetlen környezetében (telekhez tartozó borospince, kút, árok, kerti tó). A kútba ugrás, mint öngyilkosság elkövetésének módja, gyakori Magyarországon az idősebbek körében, ezen a környéken nyolc esetben jegyezték fel a vizsgált ötéves periódusban (bővebben ld. Függelék F/5. táblázat). Négy ismeretlen személyazonosságú holttestet jegyeztek fel ebben az időszakban a három megyében, akiket tudomásom szerint jelen dolgozat megírásakor sem azonosítottak. 36
Mivel a Duna tíz országon folyik keresztül, az is lehetséges, hogy ezek az elhunytak a határon túlról származnak. Ez a tény az áldozatok azonosítását még inkább megnehezíti [39].
7,02% 7,02% 34,21%
7,02% 2,63% 5,26%
36,84%
tó
folyó
patak
árok
otthon
kút
egyéb
14. ábra A dél-dunántúli vízbefulladások helyszínei (2008-2012).
4.1.6 Rizikófaktor: A vízbe kerülés oka Országonként (földrajzi és társadalmi összetétel-különbség miatt) igen eltérő okokra vezethető vissza az elhunytak vízbe kerülése. Célom volt, hogy ezt a lehetséges rizikófaktort megvizsgáljam a dél-dunántúli régióban bekövetkezett vízbefulladások körében. A szemtanúk hasznos adatokat szolgáltathatnak a vízbefúlásos esetek hátteréről a rendőrség számára, ezzel megkönnyítve a nyomozás előrehaladását [3][39], azonban inkább kevés esetben volt jellemző, hogy az eseménynek szemtanúja lett volna valaki. 29 esetben semmilyen adat nem volt ismert a vízbefulladások hátteréről, a boncolás során azonban kizárták az erőszakos elkövetési módot, így a kérdéses halálesetek baleset vagy öngyilkosság miatt következhettek be [39]. A vízbe kerülés oka legnagyobb részben baleset volt (59,65%), ezekben közrejátszhatott a magas véralkoholszint vagy krónikus betegség (cukorbetegség, magas 37
vérnyomás betegség stb.). Minden, vízi sporttevékenység végzése közben elhunyt áldozat férfi volt, és alkoholt fogyasztott. Két esetben (1,75%) írtak le emberölés miatt bekövetkezett vízbefulladást: az egyik áldozat egy fiatal férfi, a másik egy idős nő volt. Mindkét áldozatot bántalmazták, majd vízbe dobták, a haláluk oka végül vízbefulladás volt. 15 esetben (13,16%) jegyeztek fel öngyilkosságra utaló nyomokat a vizsgált 114 esetből. Az öngyilkossági szándék bizonyítása szemtanúk vagy búcsúlevél hiányában nehéz, de egyes nyomok utalhatnak az elkövetési módra: jellegzetes külsérelmi nyomok, elrendezett személyes tárgyak a vízbeesés közelében. Az öngyilkosságok az idősebb korosztályra voltak jellemzőek (61 és 90 év közöttiek) és ezen elhunytak nem fogyasztottak alkoholt, vagy csak kis mennyiségben, tehát nem voltak alkoholos befolyásoltság alatt [81]. A nők a férfiaknál gyakrabban választották a vízbefulladást, mint öngyilkossági elkövetési módot (11 nő és 4 férfi). Az öngyilkosságot elkövető férfiak 50 és 75 év közöttiek voltak, míg a nők 38 és 82 év közöttiek. Az öngyilkosságok elkövetési módja kútba ugrás vagy hídról leugrás volt. A vízbe kerülés okainak megoszlását a 15. ábrán tüntettem fel, a különböző kategóriák bővebben a Függelék F/6. táblázatában láthatók.
13,16%
1,75%
25,44%
59,65%
öngyilkosság
emberölés
baleset
ismeretlen
15. ábra A vízbe kerülés okainak megoszlása a vízbefulladás miatt elhunytak körében (2008-2012).
38
II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA EREDMÉNYEI
4.2 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott mikroszkópos módszer, a diatóma teszt 4.2.1 Vízminták vizsgálata fény- és fluoreszcens mikroszkóppal A vízbefulladás tényének megállapítására jelenleg alkalmazott módszer, a diatóma teszt hatékonyságának és érzékenységének növelését tűztem ki vizsgálataim egyik céljául. A vizsgálatok során kezdetben különböző magyarországi természetes és mesterséges vizekből gyűjtöttem vízmintákat, majd ezek évszakonkénti változását vizsgáltam meg. E vizsgálatok célja elsősorban az volt, hogy megismerjem a vizek algaösszetételét, azért, hogy megtudjam, mely nemzetségek lehetnek legfőbb célpontjai
16. ábra Vízminták gyűjtésének helyszínei a mikroszkópos és DNS alapú vizsgálatokhoz. Világoskékkel a természetes és mesterséges vizek, míg sötétebb színnel a csapvízminták forrását jelöltem. Vaktérkép forrása: http://d-maps.com/
39
a későbbi molekuláris vizsgálatoknak, illetve az algaösszetétel környezettől függő változását szerettem volna feltérképezni. 2011 és 2015 között 69 magyarországi vízmintát gyűjtöttem (ld. 16. ábra), amelyeket natívan fénymikroszkópos, illetve némelyeket Lugol-oldattal hígítva, fordított plankton mikroszkópos vizsgálatnak vetettem alá. A fordított planktonmikroszkóppal meghatározhatjuk, hogy térfogategységnyi vízmintában mennyi alga található, így kis alga tartalmú vizek esetében célszerű ezzel a mikroszkóppal értékelni a diatóma tesztet. A fordított planktonmikroszkóp alkalmazásával tehát növelhetjük annak a lehetőségét, hogy a mintában diatómákat találunk. A saját intézetünkben és a Balatoni Limnológiai Intézetben végzett kutatások alapján a leggyakrabban megfigyelt diatóma nemzetségek az általam gyűjtött magyarországi vizekben a következők voltak: Cyclotella sp., Cymbella sp., Diatoma sp., Navicula sp., Nitzschia sp. A diatómákon kívül a zöldalgák képviseltették magukat nagy számban a fénymikroszkópos vizsgálatok során (Noctoc sp., Pediastrum sp., Scenedesmus sp., Volvox sp.), ezek közül gyakran láttam a Cladophora glomerulata fonalas algára rátelepülő kovamoszatokat és cianobaktériumokat (ld. 17. ábra).
17. ábra Fonalas zöldalgára rátelepült bentikus kovamoszatok natív vízmintában (fénymikroszkópos metszet, 20x nagyítás). A bentikus algafajok jellemzője, hogy nagy mérettartományba esnek. Kép készítésének helye: PTE ÁOK, Igazságügyi Orvostani Intézet
40
Általánosan kijelenthető, hogy a vízmintákban nagy számban voltak leírhatóak baktériumok, amelyek közül leginkább a cianobaktériumokat érdemes kiemelni. A pikocianobaktériumok
fénymikroszkóp
segítségével
nem
elkülöníthetők
más
A
18. A és B ábra A
pikofitoplankton
két
csoportját,
a
pikocianobaktériumokat és
pikoeukariótákat
azonosítottuk
B
autofluoresz-
cenciájuk alapján. A két ábrán ugyanaz a vízminta látható, az ábrán
A
a
pikocianobaktériumok és a pikoeukarióták is látszanak (kékesibolya gerjesztés), míg a
ábrán
B
a
pikocianobaktériumok gerjesztődnek
(zöld
gerjesztés).
Képek
készítésének
helye:
Balatoni
Limnológiai
Intézet;
Olympus BX51, 1000x nagyítás
41
pikoeukarióta kokkuszoktól, ezért azonosításukhoz fluoreszcens mikroszkópra van szükség (ld. 18. A és B ábra). A hazai vizek egyik, évszaktól függetlenül gyakori pikocianobaktérium faja a Synechococcus sp., ezért ezt a csoportot választottam alapul a molekuláris vizsgálati protokoll kidolgozásához. A
pikocianobaktériumok
zöld
fénnyel
megvilágítva
válnak
láthatóvá
autofluoreszcenciájuknak köszönhetően. Az eukarióták nem gerjeszthetők zöld fénnyel, fluoreszcenciájuk csökken. A cianobaktériumok autofluoreszcenciáját csak friss, 24 órán belül vizsgált minta esetében érzékeltük erőteljesnek, 2-3 nap után egyre kevesebb cianobaktérium látható a mintában (amennyiben nincs volt lehetőségünk azonnal megvizsgálni a vízmintát rövid időn belül, a megfelelő, sötétben és hűtve tárolt minta vízmintától függően valamivel hosszabb ideig vizsgálható). Kékesibolya fénnyel gerjesztve a mintát, mindkét csoport láthatóvá válik. A vízminták vizsgálatakor a fajszintű meghatározás nem volt cél, sokkal inkább a hazai vizek algaösszetételének megismerésére fókuszáltam, illetve a protokoll érzékenységének meghatározására. Az osztályozhatóság miatt a vízmintákat az egy látómezőre eső diatóma szám alapján egy skálán értékeltem: negatív (-) jelet kapott az a vízminta, amelyben nem láttam algát, egy pozitív jellel (+) jelöltem azt, amely esetében kevés, vagy nem minden látómezőre jutott alga (<3 db, teljes vagy töredék), a látómezőnként 1-10 közé eső algaszámú vízmintákat két pozitív jellel láttam el (++), és az e fölötti, algában gazdag mintákat három pozitív jellel jelöltem (+++). Tapasztalataim alapján a vízminták több, mint 90%-át értékeltem ++ vagy +++ jellel, mintáink 10%-ában nagyon kevés töredék algát láttunk, vagy egyáltalán nem láttunk benne algát. Az általam vizsgált halastavak igen változatos algaösszetétellel rendelkeztek, és általában az algasűrűség ezekben a víztípusokban volt a legmagasabb. Egy összetett, 9 tóból álló halastórendszert vizsgáltam meg abból a szempontból, hogy az egy területen, egymáshoz igen közel eső tavak algasűrűségét és összetételét hasonlítottam össze. A 10 vizsgált vízmintát 2013. júliusában gyűjtöttük (32°C, Csokonyavisonta), egymással nem összeköttetésben álló halastavakból. Megfigyeléseim alapján a tavak többségét egymáshoz viszonyítva ugyanolyan mennyiségben fordultak elő zöldalgák és diatómák, ám egyes esetekben ettől eltérő módon az egyik vagy a másik csoport dominált (ld. 4. táblázat).
42
Halastó száma
Algák száma
Algák jellemzői
1. tó A oldal 1. tó B oldal 2. tó 3. tó 4. tó 5. tó 6. tó 7. tó
+ + ++ +++ ++ ++ +++ ++
főleg diatómák 1 db alga zöldalgák többségben
8. tó 9. tó
+++ ++
bentikus, nagyméretű diatómák túlsúlyban
zöldalgák többségben
4. táblázat Csokonyavisontai halastavak fénymikroszkópos vizsgálatának eredménye.
4.2.2 Poszt mortem szövetminták mikroszkópos vizsgálata Tapasztalataim alapján a poszt mortem szövetminták vizsgálatának legnagyobb nehézségét a háttér, azaz a humán szövettörmelék jelenléte okozza. Minél nagyobb mértékben sikerül elroncsolni a poszt mortem szövetet, annál nagyobb az esély arra, hogy a kovavázak is eltűnnek vagy eltörnek, ezzel megnehezítve a kovavázak felismerését. Avatatlan szem számára a diatóma vázak a csonttörmeléken kívül (pl. csontvelő vizsgálatakor) növényi szőrökkel is összetéveszthetőek. A vizsgálatokhoz vízbefulladás során elhunyt személyekből származó poszt mortem lép és csontvelő mintát használtam, valamint lehetőség szerint tüdőszövetet (egyes esetekben vér, máj, vese és agy is felhasználásra került). Amennyiben tüdőminta volt biztosított a vizsgálandó szövetminta mellett, ám vízminta nem, a tüdőminta is megfelelő kontrollként szolgált a vizsgálatokhoz, hiszen ennek a szövetmintának a pozitivitása várható el a legnagyobb valószínűséggel. Megfigyeléseim alapján kijelenthető, hogy összehasonlítva a magyarországi igazságügyi orvostani és igazságügyi szakértői intézetek gyakorlatában alkalmazott kombinált savas emésztéssel, a proteinase K enzimmel emésztett poszt mortem szövetmintákban a háttér kevésbé zavaró, kevesebb töredezett, ám több ép vázzal rendelkező diatómát tudtam kimutatni. A két módszer előnyeit és hátrányait az 5. táblázat mutatja. A 19. ábrán egy ilyen, proteinase K enzimmel való emésztés utáni, poszt mortem lépről, illetve az abban megfigyelt diatóma vázról készült felvétel látható. 43
19. ábra Proteinase K enzim alapú feltárás, diatóma váztöredék vízbefulladás miatt elhunyt személy poszt mortem lépszövetében (natív minta, fénymikroszkópos metszet). Kép készítésének helye: PTE ÁOK, Igazságügyi Orvostani Intézet
Klasszikus diatóma teszt Megfizethető
Előnyök
Hátrányok
Nagy háttérzaj Ártalmas anyagok alkalmazása (savak) Gyakorlat szükséges az algák felismeréséhez Az algavázak összetöredezhetnek vagy elveszhetnek (fals negatív eredmény)
Proteinase K alapú diatóma teszt Kisebb háttérzaj Kevesebb anyag szükséges hozzá Egyszerűen szemmel követhető az emésztés hatékonysága Kevesebb algatörmelék
Gyakorlat szükséges az algák felismeréséhez Drágább
5. táblázat A klasszikus, savas emésztéssel végzett diatóma teszt és az enzimatikus emésztéssel végzett diatóma teszt előnyeinek és hátrányainak összehasonlítása.
44
Megjegyzendő, hogy a vízbefulladás helyszínéről származó víz és/vagy a tüdőminta pozitivitása nem jelenti azt, hogy a poszt mortem szövetmintán elvégzett diatóma teszt is pozitív lesz. Amikor pl. a víz kevés diatómát tartalmaz vagy egyáltalán nem is tartalmaz, illetve a fuldoklás rövid ideig tart (gyakorlatilag a halál reflexszerűen következett be), a szövetminta nagy valószínűséggel negatív lesz, míg a vízminta pozitív lehet.
4.3 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott molekuláris biológiai módszer Vizsgálataim során 33 vízbefulladásos esetben izoláltam DNS-t a hatóság által biztosított vízmintákból és poszt mortem szövetekből. Ezekben az esetekben a boncolás során megállapított halálok vízbefulladás volt, és eredményeim a vízbefulladásos bonclelettel és a vízbefulladás igazolásra alkalmazott diatóma teszt pozitivitásával egyezően alátámasztották a vízbefulladás tényét (azaz mind a vízminta, mind valamely poszt
mortem
szövetminta pozitív
eredményt
adott
valamely algaspecifikus
oligonukleotiddal). Nyolc esetben alkalmaztam a vízbefulladástól eltérő ok (önakasztás illetve gyógyszermérgezés) miatt elhunyt holttestekből származó poszt mortem szövetmintákat (lép és májszövet), amely esetekben negatív PCR eredményt kaptam a kísérletek során alkalmazott primerpárokkal. PCR eredménye*
Diatóma teszt eredménye
Víz
Lép
1. eset
pozitív
pozitív
negatív
2. eset
pozitív
pozitív
negatív
3. eset
pozitív
pozitív
negatív
4. eset
n.b.**
pozitív
negatív
6. táblázat Vízbefulladásos esetekből származó poszt mortem szövetek vizsgálatai eredményeinek áttekintése. * Pozitív az eredmény, ha valamely, vagy minden, a 2. táblázatban felsorolt primerrel DNS pozitivitást láttam. Negatív az eredmény, ha minden primerrel negatív eredményt kaptam. ** n.b.= a hatóság nem biztosított mintát
45
Négy esetben pozitív PCR eredményt kaptam, így az általam leírt módszer támogatta a vízbefulladás tényét (ezen esetek áttekintése a 6. táblázatban látható). Ennek a négy esetnek az előző esetekhez képest az az érdekessége, hogy a diatóma teszt mind a víz, mind a szervek mikroszkópos vizsgálatakor negatív eredményt adott, ám a boncoláskor és toxikológiai vizsgálattal a vízbefulladáson kívül minden más kizárásra került. Az említett esetekhez tartozó PCR eredményeink összefoglalása a 7. táblázatban látható. Az 1. esethez tartozó gélfotót a 20. ábra szemlélteti.
életkor víz típusa és mélysége holttest megtalálása gyógyszerszármazékok alkoholfogyasztás
diatóma teszt eredménye
1. eset 54 év talajvíz (200 mm) <1 nap negatív 2,71 g/L (vér) 3,61 g/L (vizelet) negatív
2. eset 2 év tüzivíztározó (500 mm) <1 óra negatív negatív
3. eset 53 év élményfürdő
negatív
negatív
<1 óra negatív 0,21 g/L (vér)
7. táblázat Négy, negatív diatóma teszttel járó vízbefulladásos eset áttekintése.
46
4. eset 35 év árok (100 mm) <1 nap negatív 3,77 g/L (vér) 5,09 g/L (vizelet) negatív
700 bp
L
1
2
3
4
5
6
20. ábra A 7. táblázatban ismertetett 1. esethez tartozó gélfotó (CBR F-R primerek). L - Hyper Ladder II; 1 - templát mentes kontroll; 2 – 1. sz. negatív kontroll: bonctermi vízből származó DNS; 3 – 2. sz. negatív kontroll: nem vízbefulladás miatt elhunyt áldozat lépéből izolált DNS; 4 – a vízbefulladás helyszínét képező vízből ízolált DNS; 5 – a vízbefulladás miatt elhunyt áldozat lépéből izolált DNS; 6 – pozitív kontroll: Synechococcus sp. algatörzsből izolált DNS
47
5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA
I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA Amikor a vízbefulladások vizsgálatának kérdésköre, mint kutatási téma felmerült, első lépésként felmértem a magyarországi, és elsősorban a környékbeli vízbefulladások éves számát és azok körülményeit (ok, helyszín, élvezeti szerek fogyasztása stb.). A felmérés szükségességét több szempontból is elengedhetetlennek tartottam: ennek egyik oka az volt, hogy a vízbefulladás, mint halálok, nem szerepel kiemelt helyen a köztudatban, azaz, az igazságügyi orvostanban kívülállónak tekinthető laikusok nehezen hiszik el, hogy a vízbefulladás valóban olyan problémakör, amellyel érdemes foglalkozni. Szerettem volna ehhez számszerű adatokkal hozzájárulni. Különösen érdekes volt megvizsgálni a régió vízbefulladásainak helyszíneit, hiszen a dél-dunántúli régió (elsősorban Baranya-megye) a többi megyéhez viszonyítva természetes vizekben szegény. A régió vizeinek felmérése más szempontból is fontos volt: a vizek felmérése után
adatainkkal
felkerestem
a
tihanyi
Balatoni
Limnológiai
Kutatóintézet
Hidrobotanikai Osztályát (Magyar Tudományos Akadémia, Ökológiai Kutatóközpont), és az ott dolgozó algológusok segítségével meghatároztuk, hogy melyek a régióbeli vizek leggyakoribb
algacsoportjai,
amelyeket
érdemes
a
DNS
alapú
kutatás
célorganizmusainak választani. Azaz, melyek azok a vízben élő, egysejtű organizmusok, amelyek méretükből és előfordulásukból adódóan megfelelően nagy eséllyel jutnak el a fuldokló áldozat szerveihez és jelenlétük kimutatható. 114, 2008 és 2012 közötti vízbefulladásos haláleset statisztikai elemzését végeztem el. Ezek a dél-dunántúli természetes és mesterséges vizekben bekövetkezett vízbefulladások hasonlítanak a WHO által közölt nemzetközi adatokhoz, ám az adatok elemzésekor számos figyelemreméltó különbséget is találtam. A nemek megoszlása az általam vizsgált esetekben nagyon hasonló a nemzetközi adatokhoz: az elhunytak kétharmada volt férfi [1][2][6][77][78][82]. A dél-dunántúli, vízbefulladás miatt elhunytak korának megoszlása eltért más országok adataitól. A WHO szerint az életkor magas kockázati tényezőt jelent és összefüggésbe hozható a (gyermek)felügyelettel [1]. A legmagasabb vízbefulladási ráta világviszonylatban az 5 év alatti gyermekeket érinti, szorosan követi ezt a csoportot az 514 év közöttiek korcsoportja. A WHO Csendes-óceán nyugati régiójában, ezekben a 48
korcsoportokban a vízbefulladás miatti elhalálozás gyakoribb, mint bármilyen más halálok [1][2][75][74][77]. Magyarországon a vizsgált 5 éves periódusban mindössze egy halálos esetet regisztráltak a vizsgált dél-dunántúli régióban a 10 év alattiak körében. Talán ez visszavezethető a Magyarországon élő kiskorúakra irányuló kiemelt figyelemre, összevetve a kevésbé fejlett vagy fejlődő országokkal. A legmagasabb vízbefulladási ráta az életkorokat tekintve az 51-70 év közöttiekre volt jellemző [6]. Elemzésem
alapján
az
alkoholfogyasztás
nagymértékben
hozzájárul
a
vízbefulladáshoz. Az esetek 31,58%-ában (36 eset a 114-ből) az elhunytak véralkoholszintje 1,51 ezrelék fölött volt. Ilyen magas véralkoholszint (1,50-2,50‰, azaz 150-250 mg%) közepes fokú alkoholos befolyásoltságnak minősül. Ez azt jelenti, hogy az adott személy reflexei lassulnak, a reakcióidő megnő, a motoros aktivitás zavart szenved és mindezek együtt az önmentő képesség csökkenéséhez vezetnek [83]. Számos tanulmányból hiányzik a véralkoholszint és a vízbefulladás közötti összefüggések vizsgálata (pl.: közlemények Iránból) [77][81][84]. Azokban a - leginkább európai tanulmányokban azonban, ahol az elhunytak véralkoholszintjét vizsgálták, egyértelmű összefüggés mutatkozott az alkoholfogyasztás és a vízbefulladás ténye között [78]. A nemzetközi irodalommal összevetve az eredményeket, az általam vizsgált esetekben a mért véralkohol-koncentráció értékek átlagosan magasabbak voltak a vízbefulladt áldozatok körében. 11 esetben (74 esetből), azaz a vizsgált esetek 14,86%-ában írták le valamilyen gyógyszer vagy kábítószer jelenlétét a vérben. Ezzel szemben a nemzetközi adatok azt mutatják, hogy az alkoholfogyasztás mellett a kábítószer fogyasztás szintén kiemelkedő rizikófaktora a vízbefulladásnak [78]. A vízbefulladások számának szezonális megoszlása hasonló más, négy évszakkal rendelkező országokéhoz: a vízbefulladások nagy része a melegebb, nyári hónapokban történt: vizsgálatom során júliustól augusztusig észleltem egy kiugrást az esetek számában (jellemző ok: sport- és más okok miatt bekövetkezett balesetek) [2][3][39][85]. Kissé szokatlan, hogy a téli időszakban az öngyilkosságok száma jelentős volt. Magyarország dél-nyugati régiójában a vizsgált időszakban a legtöbb vízbefulladás természetes vizekben történt: az esetek nagy részének helyszínei folyók és tavak voltak. A vízbefulladások helyszíneit összehasonlítva a nemzetközi adatokkal, jól látszik, hogy országunkban jóval kisebb a beltéri mesterséges vizekben (pl. élményfürdő) és kerti tavakban vízbefulladás miatt elhunytak száma [2][78]. Más országokra jellemző, hogy a kerti tavakban és uszodákban bekövetkező esetek száma magasabb a gyermekek 49
körében, azonban nálunk a gyermekkorúak között egyébként is alacsonyabb volt a vízbefulladásos halálesetek száma [1][85][86][87][84]. Más országok statisztikáival összehasonlítva az adatainkat kitűnik, hogy nálunk kevesen fulladtak vízbe sportolás közben. A Balaton déli részén bekövetkező vízbefulladásos halálesetek az ISZKI kaposvári kirendeltségének hatókörébe tartoznak. A Balaton kedvelt úti célja a vízi sportolási lehetőségek széles körét kihasználók számára, mégis, a kis vízmélység az úszást kedvelők számára nem teszi népszerűvé a tavat. A melegebb időszakban (tavasztól ősz végéig) a tavon kétfokozatú viharjelzés van érvényben, illetve a Nemzeti Közlekedési Hatóság előírja mentőmellény alkalmazását a vízi sporteszközök használatakor. Úgy gondolom, kiemelkedő jelentősége van mindkét ténynek a sportaktivitás közben bekövetkező vízbefulladások kifejezetten alacsony számában [88][89][90]. Magyarországon, főleg a falvakban az öngyilkosság elkövetésének gyakori módja a kútba ugrás (az idősek körében) [81]. Ez az elkövetési mód leginkább az idősebbekre volt jellemző és mindkét nem esetében gyakori volt [91]. Sok más országhoz hasonlóan Magyarországról is elmondható, hogy az életkorral az öngyilkosságok száma is növekszik [78][81][91]. Mindent
összegezve
elemzésem
alapján
kijelenthetjük,
hogy
a
fő
vízbefulladáshoz köthető kockázati tényezők a következők: (1) férfi nem (71,05%), (2) 51 és 70 év közötti életkor (44,73%) és (3) alkoholfogyasztás (64,04%) [1][2][78]. Vizsgálataim során nyilvánvalóvá vált, hogy a véletlenül bekövetkező balesetek (és kisebb mértékben a vízbefulladás általi öngyilkosságok) szoros összefüggést mutatnak az alkoholfogyasztással. Figyelembe kell venni tehát ezeket a kockázati tényezőket a prevenciós megoldások kidolgozásakor. Reményeim szerint ezek az eredmények felhívják a figyelmet az 51-70 éves korcsoportra, hiszen ebben a csoportban volt a legmagasabb a vízbefulladások száma. Fontos, hogy kerüljük az alkoholfogyasztást víz közelében végzett sportolási és szabadidő tevékenység idején, mert amellett, hogy az alkohol növeli az önbizalmat, csökkenti a potenciális áldozatok veszély-felismerési és önmentési képességét [39][84][85][86].
50
II.
A
VÍZBEFULLADÁS
BIZONYÍTÁSÁRA
ALKALMAZOTT
MIKROSZKÓPOS
ÉS
MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA
A vízbefulladás tényének megállapítása jelenleg is nehéz: nincsenek specifikus boncjelei, ugyanis azok a legtöbb fulladásos halálnál megfigyelhetők [8][11][12]. Mi több, egyes boncleletek (pl. habgomba jelenléte) megjelennek a vízbefulladások egy részében, máskor azonban az előrehaladott bomlás miatt hiányozhatnak is [8][92]. Habár a diatóma teszt a leginkább elterjedt módszer a boncolás során prediktált diagnózis támogatására, számos hátránya ismert. A negatív diatóma teszt nem zárja ki a vízbefulladás lehetőségét, és csupán a diatóma teszt negativitására támaszkodni félrevezető lehet. (1) Ha a vízbefulladás helyszínét képező víz kevés diatómát tartalmaz, vagy egyáltalán nem tartalmaz diatómát [93], az esély csökken a mikroszkópos kimutatásra. Ennek egyik oka lehet, hogy a diatómák előfordulását a vizekben számos környezeti
faktor
befolyásolja
(víz
típusa,
hőmérséklete,
fénymennyiség,
tápanyagtartalom, vízszennyezés, algavirágzás, más vízi élőlények stb.), megjelenésük és a vizek fajösszetétele szezonálisan változó [92][93][94][95][96]. (2) Amennyiben a fuldoklás rövid ideig tart, az algáknak nincs elég idejük arra, hogy eljussanak a tüdőtől a szervekig (ez esetben a PCR alapú vizsgálattal sem várható pozitív eredmény). (3) A szövetek savas roncsolása következtében a kovavázak is károsodnak, egy részük teljesen elveszhet [8][92]. (4) A teszt során alkalmazott vegyszerek káros hatással vannak a vizsgálatot végző személy szervezetére. (5) Ezen kívül az algák észrevétele a csonttörmeléket is tartalmazó mikroszkópos csontvelő preparátumban gyakorlott vizsgálót igényel. Habár már a ’60-as években megkérdőjelezték a mikroszkópos módszer alkalmazhatóságát a vízbefulladás bizonyítására, manapság is egyre több kutatás veti fel, hogy a diatóma teszt néhány esetben álnegatív vagy (6) álpozitív lehet [8][12][16][49][50][52][56]. Mindezeket összevetve célszerűnek látszik más algafajok (pikoeukarióták, pikocianobaktériumok) mikroszkópos kimutatását is megcélozni a diatómák mellett (fluoreszcens mikroszkópia), vagy a savas emésztés helyett enzimatikus (proteinase K) emésztést alkalmazni [32]. Előbbi esetben a detektálásnak azért lesz nagyobb az esélye, mert a fénymikroszkóposan vizsgálható algacsoportok számát terjesztjük ki, az enzimatikus emésztés alkalmazásával pedig kisebb az esély arra, hogy az apró, finom kovavázak összetöredeznek vagy teljesen elvesznek (a bentikus kovamoszat fajok nem csak nagyobb méretük miatt jutnak be kisebb valószínűséggel a
51
szervezetbe fuldoklás során, hanem az aljzathoz tapadó életmódjuk miatt is, vagyis akkor nagyobb az esély a bekerülésükre, ha az áldozat felkavarja a víz medrét). Vizsgálataim alapján úgy gondolom, hogy amennyiben a vízbefulladás helyszínéről származó víz igen kevés algát tartalmaz, a poszt mortem szövetminta esetében a preparátum vizsgálatát javasolt fordított plankton mikroszkóppal elvégezni. Ezen mikroszkópos technikát alkalmazva az egy térfogategységre eső, azaz a mintában található minden egyes alga megvizsgálható, ugyanis a Lugol-oldatban található jód az algák pórusaiba beleülve az összes algát mintegy „lehúzza” a vizsgálandó felületre. Jelen dolgozatban a pozitív diatóma tesztek megerősítése mellett négy olyan esetben is sikerrel alkalmaztam a PCR módszert a vízbefulladás diagnózisának támogatására, amikor a diatóma teszt negatív volt. Ezekben az esetekben a vízbefulladás tényét a boncolás és a szövettan is megerősítette, a toxikológiai vizsgálat kizárta a mérgezés lehetőségét, valamint a vízbe kerülés körülményeinek feltárását a szemtanúk leírásai is alátámasztották. Ebben a négy esetben a következő boncleletek leírása történt: száraz, puffadt, felfújt tüdők; Paltauf foltok; testszerte folyékony, sötét szederjes vér, pangásos belső szervek és vérszegény lép. A szövettan során emphysema aquosum került leírásra és minden más halálok kizárásra került. Ahogy a diatóma teszt esetében, úgy az általam alkalmazott módszer esetében is igaz, hogy a DNS alapú tesztek érzékenyek a kontaminációra. Ezért a PCR vizsgálat során számos negatív kontroll alkalmazására van szükség. A poszt mortem szövetminták fitoplanktonnal való szennyeződésnek két forrása lehetséges: a fitoplankton forrása lehet maga a bőrfelszín (a holttest vízben állása miatt), másrészt a boncolás során alkalmazott csapvíz. Ezen okok miatt különösen fontos a körültekintő mintavétel, fontos, hogy a holttest lemosásakor ügyeljünk arra, hogy a szervek ne érintkezzenek a bőrfelszínnel, és a lemosásra lehetőség szerint algamentes vizet alkalmazzunk. A kísérletek során mind a laboratóriumi, mind a bonctermi vízből izoláltam DNSt, ezek a vizsgálatok negatív eredménnyel jártak. A kontamináció lehetősége aprólékos mintaelőkészítés és steril eszközök használatával jelentősen csökkenthető, a negatív kontrollok alkalmazása és a PCR eredmények együttes értelmezése elengedhetetlen [63]. Az általam leírt, PCR alapú módszer jó kiegészítője lehet a jelenleg alkalmazott mikroszkópos módszernek. Számos algafajból történő DNS izolálásához rendelkezésre állnak megbízható protokollok, amelyek - a diatóma teszttel szemben - nem igénylik az egészségre káros vegyszerek alkalmazását. A DNS alapú módszer másik nagy előnye, hogy a PCR technika érzékenységéből és specifikusságából adódóan, már kevés alga 52
jelenléte esetén is nagy eséllyel várható pozitív eredményt a mikroszkópos módszerrel ellentétben. A diatóma teszt és a PCR alapú módszer előnyeit és hátrányait a 8. táblázatban gyűjtöttem össze. A négy, negatív diatóma teszt eredményt adó eset mutatja, hogy amennyiben a vízbefulladás helyszínét képező víz kevés diatómát tartalmaz, vagy egyáltalán nem tartalmaz diatómát [49][50][97], más fitoplankton fajok (cianobaktériumok, zöld pikoalgák) kimutatását érdemes megcélozni. E fajok a diatómákhoz viszonyítva kisebb méretűek, ezért rövidebb ideig tartó fuldoklás esetén is nagy valószínűséggel jutnak el a véráramba és annak segítségével a szervekhez. Habár kevés adat ismert a baktériumok és más algák passzív penetrációjáról, úgy tűnik, hogy a vízben ázó holttest ép kültakarója esetén nem jutnak el a szervekhez [52]. Ennek igazolására Lucci és munkatársai 2008ban jelentettek meg egy tanulmányt a poszt mortem bakteriális invázió hiányáról [16]. Amennyiben tehát a vízbefulladás tényének megerősítésére alkalmazható molekuláris biológiai módszert szeretnénk intézetünk mindennapi gyakorlatába bevezetni, első lépésként javasolt algológusok segítségével a környékbeli vizek algaösszetételének feltérképezése annak érdekében, hogy a megfelelő algacsoportok kimutatását célozzuk meg. A PCR elvégzésekor célszerű minél több csoport kimutatását megtervezni, ugyanis ezzel növelhető a pozitív eredmény esélye. Az általam vizsgált esetekben több primer párral végeztem el a PCR-t, egyes esetekben a diatóma specifikus primerekkel, máskor a zöldalgákra vagy a cianobaktériumokra specifikus primerekkel kaptam negatív eredményt. Már valamely primerrel kapott pozitív eredmény is támogatja a vízbefulladás diagnózisát, hiszen a pozitív eredmény, azaz a poszt mortem szövet DNS pozitivitása azt a tényt valószínűsíti, hogy az áldozat vízbefulladás miatt hunyt el. Fontos, hogy vizsgálatainkhoz olyan oligonukleotidokat válasszunk, amelyek a humán DNS szekvencián nem ismernek fel szakaszokat, csak az általunk keresett algacsoportokra specifikusak. Jelen dolgozatban felsorolt eredményeim bizonyítják, hogy az általam leírt, egyszerűen alkalmazható PCR alapú vizsgálat a mindennapi igazságügyi orvostani gyakorlatba átültethető, mivel annak eredménye további bizonyítékot szolgáltathat a vízbefulladásra a bonclelet mellett olyan esetekben, amikor a diatóma teszt eredménye negatív.
53
Diatóma teszt Megfizethető Kis anyag- és eszközigény
Előnyök
Hátrányok
Nagy háttérzaj Ártalmas anyagok alkalmazása (savak) Gyakorlat szükséges az algák felismeréséhez Az algavázak összetöredezhetnek vagy elveszhetnek (fals negatív eredmény) Kevés alga esetén nagy az esély a negatív eredményre Kontrollok korlátozottan alkalmazhatóak Egyes esetekben fals pozitív eredményt adhat Hosszú időt vesz igénybe (O/N emésztés)
PCR alapú teszt Számos kontroll alkalmazható Bármilyen algacsoport kimutatása lehetséges pozitív eredmény lehetősége növelhető Nem szükséges hozzáértő személyzet Speciális esetekben is alkalmazható (pl. vízbefulladás konkrét helyszínének meghatározása) Egészséget nem károsító anyagok szükségesek hozzá Kis mintaigény Már egy alga DNS-e is felsokszorozható Gyors eredmény (néhány óra) A vízminta és a poszt mortem szövetek egy időben vizsgálhatók Magasabb egyszeri költségek (thermocycler beszerzése) Kontamináció veszélye (kontrollok alkalmazásával kizárható)
8. táblázat A diatóma teszt és a PCR alapú módszer előnyeinek és hátrányainak összehasonlítása.
54
6. ÖSSZEFOGLALÁS
Jelen dolgozatban összefoglaltam a Dél-Dunántúlon 2008 és 2012 között történt vízbefulladások jellemzőit és meghatároztam a főbb rizikócsoportokat. Az eredmények közül kiemelendő, hogy a közép-koraidős korcsoportba eső, alkoholos befolyásoltság alatt álló férfiak a leginkább veszélyeztetett csoport a vízbefulladás lehetőségének szempontjából.
Javaslatot tettem a klasszikus diatóma teszt módosításának lehetőségeire a speciális körülmények (pl. kevés diatómát tartalmazó víz) esetén történő vízbefulladások helyszínéről származó víz vizsgálatakor.
A klasszikus, mikroszkópos diatóma teszt megerősítése mellett bemutattam négy olyan esetet, amikor a vízbefulladás diagnózisának bizonyítására az igazságügyi orvostani gyakorlatban alkalmazott módszer, a diatóma teszt valamilyen okból negatív eredménnyel járt, amely a bonclelettel összehasonlítva ellentmondásos volt. Az általam alkalmazott DNS alapú módszerrel azonban egy vagy több algaspecifikus PCR primerrel kapott pozitív eredménnyel támasztottam alá a vízbefulladás tényét.
Javaslatot tettem egy olyan, a rutinba átültethető, DNS alapú módszer gyakorlati alkalmazására, amely széleskörűen alkalmazható az édes- vagy sósvizekben történő vízbefulladások esetében, a vízbefulladás helyszínét képező víz algaösszetételének feltérképezése után.
55
7. IRODALOMJEGYZÉK
[1]
WHO | Drowning Fact sheet N°347, (2014). http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs347/en/ (accessed January 22, 2014).
[2]
World Health Organization, Global Report on drowning: preventing a leading killer, (2014) 58.
[3]
S.N. Forjuoh, Safety at play: let’s all help to prevent drowning., Int. J. Inj. Contr. Saf. Promot. 18 (2011) 95–6. doi:10.1080/17457300.2011.575282.
[4]
WHO, Water-related Diseases, (2001). http://www.who.int/water_sanitation_health/diseases/drowning/en/#.Ut_OvBWru 4M.mendeley (accessed January 22, 2014).
[5]
Központi Statisztikai Hivatal, (n.d.). http://www.ksh.hu/.
[6]
E. Rácz, F. Könczöl, H. Mészáros, Z. Kozma, M. Mayer, Z. Porpáczy, V.S. Poór, K. Sipos, Drowning-related fatalities during a 5-year period (2008–2012) in South-West Hungary – A retrospective study, J. Forensic Leg. Med. 31 (2015) 7– 11. doi:10.1016/j.jflm.2015.01.001.
[7]
P. Sótonyi, Az igazságügyi orvostan alapjai, Semmelweis Kiadó és Multimédia Stúdió, 2011.
[8]
P. Saukko, B. Knight, Knight’s Forensic Pathology, 3rd ed., CRC Press, 2004.
[9]
L. Tamáska, Igazságügyi orvostan (Kézirat), Budapesti Orvostudományi Egyetem, 1960.
[10] B. Kenyeres, A törvényszéki orvostan tankönyve I-II., Universitas, Budapest, 1925. [11] M.H. Piette, E. De Letter, Drowning: still a difficult autopsy diagnosis., Forensic Sci. Int. 163 (2006) 1–9. doi:10.1016/j.forsciint.2004.10.027. [12] N. Foged, Diatoms and drowning -- once more., Forensic Sci. Int. 21 (1983) 153– 159. [13] A. Gunn, Essential Forensic Biology, Wiley, 2006. [14] J. Azparren, I. de la Rosa, M. Sancho, Biventricular measurement of blood strontium in real cases of drowning., Forensic Sci. Int. 69 (1994) 139–48. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7813997 (accessed January 24, 2011). [15] J.E. Azparren, A. Ortega, H. Bueno, M. Andreu, Blood strontium concentration related to the length of the agonal period in seawater drowning cases, Forensic Sci. Int. 108 (2000) 51–60.
56
[16] A. Lucci, C.P. Campobasso, A. Cirnelli, G. Lorenzini, A promising microbiological test for the diagnosis of drowning., Forensic Sci. Int. 182 (2008) 20–6. doi:10.1016/j.forsciint.2008.09.004. [17] T. Tomonaga, Identification of death by the disorganization method, Jpn. J. Leg. Med. 8 (1954) 143–147. [18] H. OTTO, On the demonstration of diatoms in human lung dust., Frankfurter Zeitschrift Für Pathol. 71 (1961) 176–81. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13731658. [19] M. Kobayashi, Y. Yamada, W.-D. Zhang, Y. Itakura, M. Nagao, T. Takatori, Novel detection of plankton from lung tissue by enzymatic digestion method, Forensic Sci. Int. 60 (1993) 81–90. doi:10.1016/0379-0738(93)90095-R. [20] R. Jeanmonod, C. Staub, B. Mermillod, The reliability of cardiac haemodilution as a diagnostic test of drowning., Forensic Sci. Int. 52 (1992) 171–80. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1601349. [21] H.G. SWANN, N.R. SPAFFORD, Body salt and water changes during fresh and sea water drowning., Tex. Rep. Biol. Med. 9 (1951) 356–82. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14835472. [22] J. Azparren, Diagnosing death by drowning in fresh water using blood strontium as an indicator, Forensic Sci. Int. 137 (2003) 55–59. doi:10.1016/S03790738(03)00284-6. [23] J.E. Azparren, G. Vallejo, E. Reyes, a Herranz, M. Sancho, Study of the diagnostic value of strontium, chloride, haemoglobin and diatoms in immersion cases., Forensic Sci. Int. 91 (1998) 123–32. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9549902. [24] J.E. Azparren, C. Cubero, E. Perucha, P. Martínez, G. Vallejo, Comparison between lung weight and blood strontium in bodies found in seawater., Forensic Sci. Int. 168 (2007) 128–32. doi:10.1016/j.forsciint.2006.07.001. [25] J.E. Azparren, E. Perucha, P. Martínez, R. Muñoz, G. Vallejo, Factors affecting strontium absorption in drownings., Forensic Sci. Int. 168 (2007) 138–42. doi:10.1016/j.forsciint.2006.07.003. [26] M.D. Pérez-Cárceles, S. del Pozo, A. Sibón, J.A. Noguera, E. Osuna, M.A. Vizcaya, A. Luna, Serum biochemical markers in drowning: diagnostic efficacy of Strontium and other trace elements., Forensic Sci. Int. 214 (2012) 159–66. doi:10.1016/j.forsciint.2011.07.047. [27] J. Schopf, B. Packer, Early Archean (3.3-billion to 3.5-billion-year-old) microfossils from Warrawoona Group, Australia, Science (80-. ). 237 (1987) 70– 73. doi:10.1126/science.11539686. [28] S. Bengtson, V. Belivanova, B. Rasmussen, M. Whitehouse, The controversial “Cambrian” fossils of the Vindhyan are real but more than a billion years older., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (2009) 7729–7734. 57
doi:10.1073/pnas.0812460106. [29] J.E. Graham, L.W. Wilcox, L.E. Graham, Algae (2nd Edition), Benjamin Cummings, 2009. [30] F.E. Round, R.M. Crawford, D.G. Mann, Diatoms: Biology and Morphology of the Genera, Cambridge University Press, 2007. [31] V. Revenstorf, Der Nachweis der aspirierten Etränkungsflüssigkeit als Kriterium des Todes durch Etrinken., Vereteljahresschs Geritchl. Med. Off. Sanitaetswes. 27 (1904) 274–279. [32] M. Ming, X. Meng, E. Wang, Evaluation of four digestive methods for extracting diatoms., Forensic Sci. Int. 170 (2007) 29–34. doi:10.1016/j.forsciint.2006.08.022. [33] B. Ludes, M. Coste, N. North, S. Doray, A. Tracqui, P. Kintz, Diatom analysis in victim’s tissues as an indicator of the site of drowning., Int. J. Legal Med. 112 (1999) 163–6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10335878 (accessed February 22, 2011). [34] L. Vörös, ed., Balatoni Természetkalauz, MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, Tihany, 2011. [35] D.G. Mann, P. Vanormelingen, An Inordinate Fondness? The Number, Distributions, and Origins of Diatom Species, J. Eukaryot. Microbiol. 60 (2013) 414–420. doi:10.1111/jeu.12047. [36] A. Auer, M. Möttönen, Diatoms and drowning., Zeitschrift Für Rechtsmedizin. J. Leg. Med. 101 (1988) 87–98. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3188674. [37] N.K. Ibrahim, F.B. Mustafa, Spatial and Temporal Variations of Silica in a Disturbed Tropical River Basin, Sains Malaysiana. 39 (2010) 189–198. [38] A.J. Peabody, Diatoms in forensic science, Forensic Sci. Soc. 17 (1977) 81–87. doi:10.1016/S0015-7368(77)71130-2. [39] E.J. Armstrong, K.L. Erskine, Water-Related Death Investigation: Practical Methods and Forensic Applications, CRC Press, 2010. [40] M.K. Thakar, R. Singh, Diatomological mapping of water bodies for the diagnosis of drowning cases., J. Forensic Leg. Med. 17 (2010) 18–25. doi:10.1016/j.jflm.2009.07.016. [41] K. Verma, Role of Diatoms in the World of Forensic Science, J. Forensic Res. 4 (2013) 2–5. doi:10.4172/2157-7145.1000181. [42] Y. Fukui, M. Hata, S. Takahashi, K. Matsubara, A new method for detecting diatoms in human organs., Forensic Sci. Int. 16 (1980) 67–74. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7399380. [43] E.J. Payne-James, A. Busuttil, W. Smock, eds., Forensic Medicine: Clinical and 58
Pathological Aspects, Greenwich Medical Media, 2002. [44] E. Kakizaki, S. Kozawa, N. Imamura, T. Uchiyama, S. Nishida, M. Sakai, N. Yukawa, Detection of marine and freshwater bacterioplankton in immersed victims: Post-mortem bacterial invasion does not readily occur., Forensic Sci. Int. (2011). doi:10.1016/j.forsciint.2011.03.036. [45] B. Ludes, S. Quantin, M. Coste, P. Mangin, Application of a simple enzymatic digestion method for diatom detection in the diagnosis of drowning in putrified corpses by diatom analysis., Int. J. Legal Med. 107 (1994) 37–41. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7999644. [46] T. Takeichi, O. Kitamura, Detection of diatom in formalin-fixed tissue by proteinase K digestion., Forensic Sci. Int. 190 (2009) 19–23. doi:10.1016/j.forsciint.2009.05.005. [47] P.A. Díaz-Palma, A. Alucema, G. Hayashida, N.I. Maidana, Development and standardization of a microalgae test for determining deaths by drowning., Forensic Sci. Int. 184 (2009) 37–41. doi:10.1016/j.forsciint.2008.11.015. [48] R. Singh, Deepa, R. Kaur, Diatomological mapping of water bodies--a future perspective., J. Forensic Leg. Med. 20 (2013) 622–5. doi:10.1016/j.jflm.2013.03.031. [49] M.S. Pollanen, C. Cheung, D. a Chiasson, The diagnostic value of the diatom test for drowning, I. Utility: a retrospective analysis of 771 cases of drowning in Ontario, Canada., J. Forensic Sci. 42 (1997) 281–5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9068187. [50] M.S. Pollanen, The diagnostic value of the diatom test for drowning, II. Validity: analysis of diatoms in bone marrow and drowning medium., J. Forensic Sci. 42 (1997) 286–90. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9068188. [51] B. Gylseth, G. Mowé, A. Watson, Diatoms in lung tissue, Lancet. 314 (1979) 1375. doi:10.1016/S0140-6736(79)92865-4. [52] F. Bortolotti, G. Del Balzo, R. Calza, F. Valerio, F. Tagliaro, Testing the specificity of the diatom test: search for false-positives., Med. Sci. Law. 51 Suppl 1 (2011) S7–S10. doi:10.1258/msl.2010.010057. [53] B. Schellmann, W. Sperl, Diatomeen-Nachweis im Knochenmark (Femur) Nichtertrunkener, Zeitschrift Für Rechtsmedizin. 83 (1979) 319–324. doi:10.1007/BF01882178. [54] V. Schneider, Bemerkungen zu der Arbeit von B. Schellmann und W. Sperl “Diatomeen-Nachweis im Knochenmark (Femur) Nichtertrunkener,” Zeitschrift Für Rechtsmedizin. 85 (1980). doi:10.1007/BF00201295. [55] J. Payne-James, A. Busuttil, W. Smock, eds., Forensic Medicine: Clinical and Pathological Aspects, 1st editio, Greenwich Medical Media, 2002. [56] P. Lunetta, A. Miettinen, K. Spilling, A. Sajantila, False-positive diatom test: a 59
real challenge? A post-mortem study using standardized protocols., Leg. Med. (Tokyo). 15 (2013) 229–34. doi:10.1016/j.legalmed.2013.03.002. [57] T. Koseki, Fundamental examinations of experimental materials and control animals on the diagnosis of death from drowning by the diatom method, Acta Med Biol. 15 (1968) 207–219. [58] A.M. Langer, A.D. Mackler, I. Rubin, E.C. Hammond, I.J. Selikoff, Inorganic Particles in Cigars and Cigar Smoke, Science (80-. ). 174 (1971) 585–587. doi:10.1126/science.174.4009.585. [59] A. Morel, Y.-H. Ahn, F. Partensky, D. Vaulot, H. Claustre, Prochlorococcus and Synechococcus: A comparative study of their optical properties in relation to their size and pigmentation, J. Mar. Res. 51 (1993) 617–649. doi:10.1357/0022240933223963. [60] M. Kane, T. Fukunaga, H. Maeda, K. Nishi, The detection of picoplankton 16S rDNA in cases of drowning., Int. J. Legal Med. 108 (1996) 323–6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8793643 (accessed February 11, 2014). [61] P. Fernández, L. Morales, C. Vázquez, A.M. Bermejo, M.J. Tabernero, HPLC– DAD determination of opioids, cocaine and their metabolites in plasma, Forensic Sci. Int. 161 (2006) 31–35. doi:10.1016/j.forsciint.2005.10.016. [62] M. Mayer, A. Benko, A. Huszar, K. Sipos, A. Lajtai, A. Lakatos, Z. Porpaczy, Simultaneous Determination of 4-Substituted Cathinones (4-MMC, 4-MEC and 4-FMC) in Human Urine by HPLC-DAD, J. Chromatogr. Sci. 51 (2013) 861– 866. doi:10.1093/chromsci/bms183. [63] J. Hürlimann, P. Feer, F. Elber, K. Niederberger, R. Dirnhofer, D. Wyler, Diatom detection in the diagnosis of death by drowning., Int. J. Legal Med. 114 (2000) 6–14. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11197630. [64] P.F. Kemp, J.J. Cole, B.F. Sherr, E.B. Sherr, eds., Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology, CRC Press, 1993. [65] B.A. Whitton, M. Potts, eds., The Ecology of Cyanobacteria: Their Diversity in Time and Space, Springer Science & Business Media, 2000. [66] L.M.L. Nollet, L.S.P. De Gelder, eds., Handbook of Water Analysis, Third Edition, CRC Press, 2013. [67] P.S. Walsh, D.A. Metzger, R. Higuchi, Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material., Biotechniques. 10 (1991) 506–13. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1867860 (accessed October 19, 2011). [68] U. Nübel, F. Garcia-Pichel, G. Muyzer, PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria, Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 3327–3332. [69] F. Chen, K. Wang, J. Kan, D.S. Bachoon, J. Lu, S. Lau, L. Campbell, Phylogenetic diversity of Synechococcus in the Chesapeake Bay revealed by 60
Rilbulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase (RuBisCO) large subunit gene (rbcL) sequences, Aquat. Microb. Ecol. 36 (2004) 153–164. doi:10.3354/ame036153. [70] S. Abe, M. Suto, H. Nakamura, H. Gunji, K. Hiraiwa, T. Suzuki, T. Itoh, H. Kochi, G. Hoshiai, A novel PCR method for identifying plankton in cases of death by drowning., Med. Sci. Law. 43 (2003) 23–30. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12627677. [71] L.-K. Kang, F.-H. Tsui, J. Chang, Quantification of diatom gene expression in the sea by selecting uniformly transcribed mRNA as the basis for normalization., Appl. Environ. Microbiol. 78 (2012) 6051–8. doi:10.1128/AEM.00935-12. [72] M.W. Fawley, K.P. Fawley, H.A. Owen, Diversity and ecology of small coccoid green algae from Lake Itasca, Minnesota, USA, including Meyerella planktonica , gen. et sp. nov, Phycologia. 44 (2005) 35–48. doi:10.2216/00318884(2005)44[35:DAEOSC]2.0.CO;2. [73] C.V. Moro, O. Crouzet, S. Rasconi, A. Thouvenot, G. Coffe, I. Batisson, J. Bohatier, New design strategy for development of specific primer sets for PCRbased detection of Chlorophyceae and Bacillariophyceae in environmental samples, Appl. Environ. Microbiol. 75 (2009) 5729–5733. doi:10.1128/AEM.00509-09. [74] C. Blum, J. Shield, Toddler drowning in domestic swimming pools, Inj. Prev. 6 (2000) 288–290. doi:10.1136/ip.6.4.288. [75] H. Donson, A. Van Niekerk, Unintentional drowning in urban South Africa: a retrospective investigation, 2001-2005., Int. J. Inj. Contr. Saf. Promot. 20 (2013) 218–26. doi:10.1080/17457300.2012.686041. [76] L. Quan, P. Cummings, Characteristics of drowning by different age groups., Inj. Prev. 9 (2003) 163–8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12810745. [77] A.D. Kiakalayeh, R. Mohammadi, D.S. Ekman, S.Y. Chabok, B. Janson, Unintentional drowning in northern Iran: a population-based study., Accid. Anal. Prev. 40 (2008) 1977–81. doi:10.1016/j.aap.2008.08.008. [78] K. Ahlm, B.-I. Saveman, U. Björnstig, Drowning deaths in Sweden with emphasis on the presence of alcohol and drugs - a retrospective study, 19922009., BMC Public Health. 13 (2013) 216. doi:10.1186/1471-2458-13-216. [79] P. Lunetta, M.P.H.G.S. Smith, F.T.P. Lillsunde, D.I.K. Valonen, F.T.I. Ojanperä, Drowning under the influence of drugs and alcohol, (2013). [80] S. Becker, S. Weng, Seasonal patterns of deaths in Matlab , Bangladesh, Int J Epidemiol. 27 (1998) 814–823. [81] E. Salib, Trends in suicide by drowning in the elderly in England and Wales 1979-2001., Int. J. Geriatr. Psychiatry. 20 (2005) 175–81. doi:10.1002/gps.1211. [82] C. The Royal Life Saving Society, A profile of Ontario drowning and water61
related injuries, 1987-2004., The Drowning Report, Ontario. (2008). http://www.lifesavingsociety.com/. [83] T.R. Driscoll, Review of the role of alcohol in drowning associated with recreational aquatic activity, Inj. Prev. 10 (2004) 107–113. doi:10.1136/ip.2003.004390. [84] M.M. Peden, K. McGee, The epidemiology of drowning worldwide, 10 (2003) 195–199. [85] A. Iqbal, T. Shirin, T. Ahmed, S. Ahmed, N. Islam, A. Sobhan, A.K. Siddique, Childhood mortality due to drowning in rural Matlab of Bangladesh: magnitude of the problem and proposed solutions., J. Health. Popul. Nutr. 25 (2007) 370–6. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2754022&tool=pmce ntrez&rendertype=abstract (accessed October 18, 2014). [86] W.R. Pitt, K.P. Balanda, Childhood drowning and near-drowning in Brisbane: the contribution of domestic pools., Med. J. Aust. 154 (1991) 661–5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2034145 (accessed October 18, 2014). [87] L. Yang, Q.-Q. Nong, C.-L. Li, Q.-M. Feng, S.K. Lo, Risk factors for childhood drowning in rural regions of a developing country: a case-control study., Inj. Prev. 13 (2007) 178–82. doi:10.1136/ip.2006.013409. [88] T.J. Pikora, R. Braham, C. Hill, C. Mills, Wet and wild: results from a pilot study assessing injuries among recreational water users in Western Australia., Int. J. Inj. Contr. Saf. Promot. 18 (2011) 119–26. doi:10.1080/17457300.2010.540333. [89] E. Kakizaki, S. Kozawa, H. Matsuda, E. Muraoka, T. Uchiyama, M. Sakai, N. Yukawa, Freshwater bacterioplankton cultured from liver, kidney and lungs of a decomposed cadaver retrieved from a sandy seashore: possibility of drowning in a river and then floating out to sea., Leg. Med. (Tokyo). 12 (2010) 195–9. doi:10.1016/j.legalmed.2010.03.008. [90] P. Cummings, B.A. Mueller, L. Quan, Association between wearing a personal floatation device and death by drowning among recreational boaters: a matched cohort analysis of United States Coast Guard data., Inj. Prev. 17 (2011) 156–9. doi:10.1136/ip.2010.028688. [91] H. Cattell, Suicide in the elderly, Adv. Psychiatr. Treat. 6 (2000) 102–108. doi:10.1192/apt.6.2.102. [92] F. He, D. Huang, L. Liu, X. Shu, H. Yin, X. Li, A novel PCR-DGGE-based method for identifying plankton 16S rDNA for the diagnosis of drowning., Forensic Sci. Int. 176 (2008) 152–6. doi:10.1016/j.forsciint.2007.08.005. [93] V. V Vavilova, W.M. Lewis, Temporal and altitudinal variations in the attached algae of mountain streams in Colorado, (1999) 99–106. [94] P. Tiselius, B. Kuylenstierna, Growth and decline of a diatom spring bloom phytoplankton species composition, formation of marine snow and the role of heterotrophic dinoflagellates, J. Plankton Res. 18 (1996) 133–155. 62
doi:10.1093/plankt/18.2.133. [95] M. Funayama, S. Mimasaka, M. Nata, M. Hashiyada, Y. Yajima, Diatom numbers around the continental shelf break., Am. J. Forensic Med. Pathol. 22 (2001) 236–8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11563730 (accessed July 3, 2014). [96] F. Watermann, H. Hillebrand, G. Gerdes, W.E. Krumbein, U. Sommer, Competition between benthic cyanobacteria and diatoms as influenced by different grain sizes and temperatures, Mar. Ecol. Prog. Ser. 187 (1999) 77–87. doi:10.3354/meps187077. [97] P.D. Redekar, A.B. Wagh, Relationship of fouling diatom number and chlorophyll-a value from Zuari estuary , Goa ( West coast of India ), Seaweed Res. Utiln. 22 (2000) 173–181.
63
8. PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA
I. A disszertáció alapjául szolgáló közlemények Rácz, E., Könczöl, F., Mészáros, H., Kozma, Z., Mayer, M., Porpáczy, Z., Poór, V.S., Sipos, K. (2015). Drowning-related fatalities during a 5-year period (2008–2012) in South-West Hungary – A retrospective study. J Forensic Legal Med, 31, 7–11. doi:10.1016/j.jflm.2015.01.001 IF: 0,870 Rácz, E., Könczöl, F., Tóth, D., Patonai, Z., Porpáczy, Z., Kozma, Z., Poór, V.S., Sipos, K. (2016). PCR-based identification of drowning: four case reports, Int J Legal Med. doi:10.1007/s00414-016-1359-7 IF: 2,862 Összes impakt faktor: 3,732
II. Egyéb közlemények Poór, V.S., Lukács, D., Nagy, T., Rácz, E., Sipos, K. The rate of RNA degradation in human dental pulp reveals post-mortem interval, Int J Legal Med. 130 (2016) 615–619. doi:10.1007/s00414-015-1295-y. IF: 2,862 Simon, G., Rácz E., Mayer, M., Heckmann, V., Tóth, D., Kozma Zs. (2016) Suicide by Intentional Air embolism, J For Sci. doi:10.1111/1556-4029.13320 IF: 1,322 Közlemények összes impakt faktora: 7,916
64
III. Konferenciaszereplések
Poszterek
2010. május 18-21.
Poór V.S., Pandur E., Nagy J., Rácz E., Miseta A., Sipos K.: A hepcidin és az alfa-1 savas glikoprotein interakciója Megjelenés: 40. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
2012. május 15-18.
Pandur E., Rácz E., Rapp J., Poór V.S., Sipos K.: A vasanyagcserében szerepet játszó gének expressziós vizsgálata SHSY5Y neuroblasztóma sejtvonalban Megjelenés: 42. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
2013. május 21-24.
Rácz E., Poór V. S., Pandur E., Patonai Z., Könczöl F., Porpáczy Z., Sipos K.: Egy különleges vízbefulladásos eset diagnózisának igazolása PCR alapú módszerrel Megjelenés: 43. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
2013. május 21-24.
Poór V.S., Lukács D., Frank D., Rácz E., Sipos K.: RNS degradáció vizsgálata fog pulpában Megjelenés: 43. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
2014. május 20-23.
Pandur E., Marton M., Tamási K., Varga E., Dudás R., Rácz E., Miseta A., Sipos K.: A vasanyagcserét befolyásoló gének mRNS expressziós vizsgálata SH-SY5Y neuroblasztóma és differenciált SH-SY5Y sejteken Megjelenés: 44. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
2014. május 20-23.
Rácz E., Pandur E., Varga E., Poór V.S., Könczöl F., Simon G., Tóth D., Sipos K.: A diatóma teszt csapdái és egy lehetséges megoldás Megjelenés: 44. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
65
2014. május 20-23.
Varga E., Pandur E., Marton M., Tamási K., Júlia K., Rácz E., Márton J., Sipos K.: A THP-1 monocita/makrofág sejtvonal vasanyagcseréjének vizsgálata Megjelenés: 44. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
2015. május 19-22.
Pandur E., Marton M., Tamási K., Varga E., Dudás R., Rácz E., Miseta A., Sipos K.: Bakteriális sejtfalalkotó lipopoliszacharid (LPS) és lipoteichoic sav (LTA) hatása a humán neuroblasztóma SHSY-5Y sejtvonal vasanyagcseréjére Megjelenés: 45. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
2015. május 19-22.
Poór V.S., Rácz E., Sipos K.: Igazságügyi DNS minták stabilitása különböző körülmények között Megjelenés: 45. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg
Előadások
2010
Pécsi
Tudományegyetem,
Általános
Orvostudományi
Kar,
Tudományos Diákköri Konferencia 2010
Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Tudományos Diákköri Konferencia
2010
Sipos K., Poór V. S., Rácz E., Porpáczy Z., Huszár A.: Molekuláris biológiai
módszer
vízbefulladás
bizonyítására
Magyar Igazságügyi Orvosok Társaságának XIV. Konferenciája 2011
Pécsi
Tudományegyetem,
Általános
Orvostudományi
Kar,
Tudományos Diákköri Konferencia 2012
Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Tudományos Diákköri Konferencia
2014
Rácz E., Márton J., Angyal M., Kricskovics A., Bozó Cs., Ujvári Zs.,
Sipos
K.:
A
holttest
fekvésének
hatása
a
mikrobiológiájára Fiatal Igazságügyi Orvosszakértők Fóruma, Hosszúhetény
66
talaj
2014
Kricskovics A. (társszerzőként Rácz E.): A talaj szerves nitrogén tartalmának
változása
a
fekvési
idő
függvényében
Fiatal Igazságügyi Orvosszakértők Fóruma, Hosszúhetény 2015
Kricskovics A., Angyal M., Árvay Gy., Rácz E., Porpáczy Z., Bozó Cs., Újvári Zs., Sipos K.: Pilot kísérlet Sus scrofa domestica tetem forenzikus ökológiai szempontú vizsgálatára Magyar Parazitológusok Társasága Jubileumi Konferencia
2015
Rácz, E., Könczöl, F., Mészáros, H., Kozma, Zs.,Tóth, D., Simon, G., Sipos, K.: Drowning-related fatalities during a 5-year period (2008–2012) in South-West Hungary 7th International Student Medical Congress Košice (ISMCK 2015)
2015
Tóth D. (társszerzőként Rácz E.): A vízbefulladás bizonyítása molekuláris biológiai módszerekkel MIOT Konferencia 2015, Debrecen
2016
Poór V. S., Rácz E., Simon G., Heckmann V., Sipos K., Kozma Zs.: Vízbefulladás? - Új diagnosztikai módszerek bemutatása egy eseten keresztül Magyar Igazságügyi Orvosok Társasága (MIOT) kazuisztikai tudományos nap (Budapest)
67
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Jelen munkámat a PTE ÁOK Igazságügyi Orvostani Intézetben végeztem. 2009ben kezdtem a témával foglalkozni Tudományos diákköri munka keretében, amelyet később PhD hallgatóként folytattam. Ez alatt az idő alatt témavezetőm, dr. Sipos Katalin és állandó munkatársam, Poór Viktor Soma segítették a munkámat, és lehetővé tették számomra
a
megfelelő
kutatási
téma
megtalálását
és
elvégzését,
valamint
iránymutatásukkal és szakmai tanácsaikkal támogatták a munka előrehaladását. Emiatt köszönettel tartozom nekik. Hálával tartozom dr. Könczöl Franciska docens asszonynak, aki ez idő alatt az intézet vezetője volt, és aki lehetővé tette számomra, hogy az intézetben végezhessem kutatómunkámat. Fontos megerősítés volt számomra, hogy mindvégig támogatott abban az elképzelésben, hogy ennek a témának helye van az igazságügyi orvostanban. Köszönetet szeretnék mondani a Balatoni Limnológiai Kutatóintézet minden Munkatársának, akik többek között a kísérletek elindításához szükséges algatörzseket biztosították számomra. Kiemelt hálával tartozom Vörös Lajos Professzor Úrnak, aki két rövid tanulmányutam alatt számos értékes szakmai tanáccsal látott el, sokszor éjszakákba nyúlóan foglalkozott a felmerült problémáimmal és szakmai tanácsaival számos ponton előrelendítette a kutatás előrehaladását. Köszönöm Tugyi Nórának, hogy eligazított az alga-mikroszkopizálás világában, segített meghatározni a fajokat és elkészíteni a mikroszkópos fotókat a dolgozatomhoz. Köszönöm továbbá dr. Kozma Zsolt kinevezett intézetvezető úrnak, dr. Bajnóczky István†, dr. Simon Gábor, dr. Tóth Dénes, dr. Mayer Mátyás, dr. Porpáczy Zoltán, dr. Heckmann Veronika, dr. Jegesy Andrea†, dr. Patonai Zoltán, Nagy Gergely, Dömse Angéla, dr. Pauka Dénes, dr. Pandur Edina, Tamási Kitti, Varga Edit és Wéber Tünde munkatársaimnak a segítségüket és a baráti légkört, amelyet az évek alatt teremtettek. Köszönettel tartozom Pohner Zsuzsannának (ELTE, Mikrobiológiai Tanszék), amiért megosztotta velem tapasztalatait a diatóma DNS izolálás rejtelmeivel kapcsolatban. Nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani Mirkónak és a Családomnak; megértő türelmük, támogatásuk, szeretetük nélkül nem jutottam volna idáig. Köszönöm szépen! 68
FÜGGELÉK
Évek
Esetszám
%
12 25 21 28 26 2 114
10,53 21,93 18,42 24,56 22,81 1,75
2008 2009 2010 2011 2012 Ismeretlen Összesen
100
F/1. táblázat A vízbefulladások számának változása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).
Korcsoport 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 nem meghatározható Összesen
Férfiak
Nők
Mindkettő együtt
Esetszám
%
Esetszám
%
Esetszám
%
1 12 7 10 8 21 13 6 1 2
0,88 10,53 6,14 8,77 7,02 18,42 11,40 5,26 0,88 1,75
0 1 0 3 4 10 7 5 3 0
0 0,88 0 2,63 3,51 8,77 6,14 4,39 2,63 0
1 13 7 13 12 31 20 11 4 2
0,88 11,40 6,14 11,40 10,53 27,19 17,54 9,65 3,51 1,75
81
71,05
33
28,95
114
100
F/2. táblázat A vízbefulladásos esetek nemenkénti és korcsoportonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (20082012).
69
0,20‰ alatt (20 mg%)
az alkoholfogyasztás nem bizonyítható
0,21-0,50‰ (21-50 mg%)
fogyasztott alkoholt, de alkoholosan nem volt befolyásolt
0,51-0,80‰ (61-80 mg%)
igen enyhe
0,81-1,50‰ (81-150 mg%)
enyhe
1,50-2,50‰ (150-250 mg%)
közepes
2,51-3,50‰ (251-350 mg%)
súlyos
3,50‰ felett (351 mg%)
igen súlyos fokú alkoholos befolyásoltság
F/3. táblázat Az alkoholos befolyásoltság vizsgálata során figyelembe vett határértékek Magyarországon (Országos Igazságügyi Orvostani Intézet, 13. módszertani levél).
Évszak tavasz nyár ősz tél ismeretlen Összesen
Esetszám
%
29 56 13 12 4
25,44 49,12 11,40 10,53 3,51
114
100
F/4. táblázat A vízbefulladásos esetek évszakonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).
Vízbefulladás helyszíne tó folyó patak árok otthon* kút egyéb Összesen
Esetszám
%
42 39 6 3 8 8 8
34,21 36,84 5,26 2,63 7,02 7,02 7,02
114
100
F/5. táblázat A dél-dunántúli vízbefulladások helyszínei (2008-2012). * Kivéve kút (ld. külön kategóriaként).
70
Vízbe kerülés oka öngyilkosság emberölés baleset ismeretlen Összesen
Férfiak
Nők
Esetszám
%
4 1 53 23
11 1 15 6
15 2 68 29
13,16 1,75 59,65 25,44
81
33
114
100
F/6. táblázat A vízbe kerülés oka a dél-dunántúli vízbefulladásos halálesetek körében (2008-2012).
71
