A vírusellenálló transzgénikus növények. Az RNS silencing antivirális rendszer működése. (A silencing-független vírusellenállóság genetikai alapjai)
Leadva:1-51-ig. (52-56 már nem)
Silhavy Dániel
MBK Növényi RNS Biológia csoport Gödöllő
A növényi vírusok és a terjedő, veszélyes növénykórokozók (emerging infectious diseases) A növényi vírusok obligát paraziták, amelyek a gazda génexpressziós rendszerét használják a replikációjukhoz Vírus okozta mezőgazdasági kár viszonylag kicsi, de egyes területeken, egyes fajokon nagyon súlyos lehet Pl. Manióka, szub-Szahara térség A haszonnövények esetén az „Emerging infectious diseases” 46%vírus, 30%gomba, 16% baktérium
Konklúzió: a haszonnövényeket védeni kell a vírusoktól
Vírus fertőzési ciklus Magátvitel az új generációba
Virus vektorok rovar, nematoda, gomba, mechanikus
Vírus vektorok
fertőzés (replikáció a „primary infected” sejtben)
Lokális és szisztemikus terjedés
Fertőzött levél Szisztemikus terjedés replikáció a „primary Sejtről-sejtre infected” sejtben
mozgás
Új gazdanövény
Szisztemikus levél
Hogyan védhetjük meg a haszonnövényeket a vírusoktól?
- Vírus vektorok kiirtása (inszekticidek stb.) -Vírusellenálló növények termesztése. Olcsó, környezetbarát alternatíva. A vírusellenálló növény legalább egy lépését gátolja a vírus fertőzési ciklusnak, -vírus vektor fertőzést -replikáció a „primary infected” sejtekben -sejtről-sejtre mozgást -szisztemikus mozgást A fertőzés megakadályozásához a növénynek a vírust terjesztő vektorral szemben rezisztensnek kell lenni (levélszőrök, viaszos kutikula, vastag sejtfal stb.). A nemesítők ezt is vírusrezisztenciának tartják. Virológusok: Vírusrezisztens a növény, -ha a vírus nem képes replikálódni az elsődleges fertőzött sejtekben, -vagy ha nem tud sejtről-sejtre, illetve szisztemikusan mozogni.
Vírusrezisztencia típusok Genetikai módosításon alapuló rezisztencia
Természetes rezisztencia A rezisztencia gének hagyományos úton bevihetőek
A rezisztencia gének transzformációval építhetőek csak be
Kell: genetikai változatosság, szelekciós rendszer
Természetes vírus rezisztencia rendszerek Vírus specifikus
(genetikai variabilitás,hagyományos nemesítés)
Poligénes Ált. quantitatív rez. ritkán használt, de pl. MSV mastrevírus jó
Monogénes Recesszív!! 1/3 R-gén !!!
Általános antivirális rendszer (RNS silencing, RNAi) (genetikai variáció nincs hagyományos nemesítéshez rossz biotechnológiai nemesítés)
Domináns 2/3
Inhibitor!
Növényi transzformáció: Idegen gének növényi sejtekben történő kifejeztetése Expresszió
Tranziens (időszakos) génexpresszió Az idegen DNS kópiaszáma magas de a DNS nem integrálódik,nem öröklődik
Stabil (termesztésre csak ez) Az idegen DNS a növény genomjába integrálódik, öröklődik
-DNS direkt bejuttatása növényi sejtekbe -Agrobaktérium mediált génbejuttatás
Transzgénikus növények !!!!
-Víruskapcsolt génkifejezés Gyors, magas szintű expresszió könnyen állítható
Térbeli, időbeli vizsgálatokra is jó Egyed szintű vizsgálatokat tesz lehetővé Jobban hasonlít endogén génexpresszióhoz
A PDR koncepció Cél: Idegen gén beépítésével vírusellenállóvá tenni a növényt. Elvben nagyon sokféle gén alkalmas lehet rá, pl dsRNS vírusok ellen dsRNS kötő fehérjék termeltetése. Gyakorlatban egy domináns típus: Pathogen derived resistance (PDR) Korai megfigyelés: keresztvédettség, cross-protection. Egy gyenge tüneteket okozó vírus fertőzés véd az azonos vagy nagyon hasonló, de erős tüneteket okozó vírusok ellen (immunizál). Ok: nem volt ismert, de használták a vírusok elleni védekezésben. Sanford és Johnston 1985- : PDR általános mesterséges védekezés lehet bármely patogén ellen (vírus, gomba, baktérium). Elv: fertőzéshez patogén fehérjék (és RNS-ek) megfelelő mennyisége és minősége kell. Minden patogén termel olyan fehérjéket, amelyek a patogénnek kellenek, a gazdának nem. Ha ezeket vad vagy inkább mutáns formában a gazdában túltermeltetjük, felborul a patogenezishez szükséges fehérje egyensúly, a gazda védett lesz. Teszt: E. coli ban termeltettek a Qβ fágból eltérő fehérjéket, a transzgénikus E. coli-k védettek lettek Qβ-ra!!!
A fehérje-alapú PDR, mint mesterséges növényi vírusrezisztencia rendszer A PDR első növényi tesztje- 1986. Powell …Beachy Transzgénikus dohány , ami a TMV köpenyfehérje (CP) génjét expresszálja Tobacco mosaic virus (TMV, + ssRNS vírus)
Transzgénikus vonalak fertőzése TMV-vel, illetve kontroll vírussal
Eredmény: -TMV CP expresszáló vonalak védettek a TMV-vel szemben, de fogékonyak a kontroll vírusokkal szemben (kivéve ha azok a TMV közeli rokonai) -Minél magasabb a CP transzgén eredetű fehérje szint, annál erősebb védettség Fehérje-alapú PDR (Protein-based PDR vagy CP-mediated resistance) A PDR koncepció növényekben vírusok ellen hatékony, ígéretes, mert bármely vírus ellen könnyen védettség érhető el !!!!
Az RNS-alapú PDR, mint mesterséges növényi vírusrezisztencia rendszer 1992. Lindbo, Dougherty Cél: TEV (Tobacco etch virus, potyvírus) rezisztens dohány növények előállítása Beépíteni CP, CPmut.(áns) és kontrollként nem-transzlálható cpRNS Sok száz vonal, kiválasztva magas és alacsony CP, illetve CPmut. expresszáló egyedek és egy darab cpRNS expresszáló negatív kontroll. Eredmény: TEV fertőzés A TEV CP termelők mind fertőződnek, némelyik idővel kigyógyult, Mások teljesen fogékonyak. Hasonló eredmény CPmut.-okkal is.
A cpRNS vonal teljesen rezisztensnek bizonyult!!!!!! -A cpRNS vonalban a cpRNS transzkripció erős, a sejtmagban a cpRNS szint magas, a citoplazmában a cpRNS szint drámaian alacsony. -A cpRNS expresszáló vonal rezisztenciája specifikus, csak TEV ellen hat. -Itt fehérje nincs, PDR mégis van: RNS-alapú PDR (RNA-based PDR, ma már tudjuk RNS silencing alapú rezisztencia) A növényekben PDR-alapú transzgénikus vírusrezisztencia kétféle módon is elérhető, virális fehérje, illetve RNS termeltetésével !!!! Az RNS-alapú hatékonyabb!!!!
Vírusellenálló transzgénikus növények 1, Gyorsan, számos gazdanövénybe beépítették egy, illetve több vírus CP-jét vagy cpRNS-ét. Sok változatos vírusellenálló vonal, mindenféle növényi vírus ellen (+ssRNS, -ssRNS, dsRNS, ssDNS, dsDNS). Nagyon sikeres programok, szinte mindenhol hatékony rezisztencia. Piacra jutás nagyon nehéz, kevés vírusellenálló fajta - a transzgénikus vonal hozama, minősége nem romolhat - versenyképes fajtákba kell bevinni - a víruskártételnek komolynak kell lenni - a transzgénikus növény bevezetéséhez a szükséges tesztek rettenetesen drágák - vásárlók elfogadják -Ma alig néhány vírusellenálló fajta a piacon -USA: vírusellenálló papaya, illetve tökfélék, tök, (zucchini, sárgadinnye), -Kína: vírusellenálló paradicsom, paprika, illetve papaya
Vírusellenálló Papaya 1, Vírusellenálló Papaya-USA USA- Fő papaya termelő vidék Hawaii. PRSV- Papaya ringspot virus (potyvirus). Úgy tűnt teljesen elpusztítja a papaya termesztést. CP-transzgénikus növények 1998. Elfogadottság:2000 42% transzgénikus, 2006 90%
Papaya infected with the papaya ringspot virus
Virus resistance gene introduced
Vírusellenálló Papaya 2, 2 fajta -SunUP- homozigóta a CP-re -Rainbow- heterozigótaCP-re- SunUp X nem transzgénikus Kapoho RNS-alapú PDR, mert CP fehérje nem mutatható ki, beépített cpRNS RNS silencing célpont (kevés mRNS , sok siRNS).
Rainbow körülvéve nem-transzgénikussal
Rainbow
Vírusellenálló Papaya 2, Mennyire ellenálló más törzsekre? A Rainbow-ba és a SunUp-ba a Hawaii PRSV egy darabját építették. Fertőzés: Hawaii PRSV, illetve Taiwan-i PRSV-vel. Hawaii PRSV Taiwan PRSV
Rainbow
SunUp
Taiwan PRSV A homozigóta vonal ellenálló Taiwan-i törzsre, a heterozigóta fogékony. A fogékonyság tehát függ a vírus különbözőségétől, illetve a transzgénikus vonal hatékonyságától. Rezisztensek PRSV-re ha legalább 90 % szekvencia hasonlóság a CP régióban RNS szinten.
Vírusellenálló Tök 1, 1994- nyári tök ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) és WMV (Watermelon mosaic virus) , illetve CMV (Cucumber mosaic virus) CP beépítés egyenként. Keresztezéssel 2 vagy mindhárom összeépíthető. Hagyományos nemesítéssel beépítés több tökfélébe pl. öt zucchini fajtába. Azokban is működik, tehát a rezisztencia faktor nem fajta, faj specifikus. A rez. molekuláris alapja nem ismert (fehérje vagy RNS-alapú PDR). Elfogadottság: 2006 20%, de New Jersey-ben 70% The Freedom II squash has a modified coat protein that confer resistance to zucchini yellows mosaic virus and watermelon mosaic virus II. Scientists are now trying to develop crops with as many as five virus resistance genes
Vírusellenálló Tök 2,
Non-TR. TR.
TR.
Non-TR. ZYMV és WMV fertőzés A fertőzés a hozamot és a minőséget is rontja
Vírusellenálló burgonya, 1998- két transzgénikus vírusellenálló burgonya vonal -Potato leafroll virus PLRV rezisztens –itt a CP beépítés nem működött, de a replikáz beépítés igen. (ezt a vonalat keresztezték a a burgonyabogár rezisztens Bt transzgénikussal is) -PVY Potato virus Y rezisztens- CP beépítés 2001-ben kivonták, sok kritika, viszonylag kis piaci érték.
Vírusellenálló tesztvonalak 983 field teszt transzgénikus vírusrezisztens vonalakkal,
Vírusellenálló transzgénikus vonalak
Miért sikeresek a vírusrez. transzgénikus vonalak a többi patogén rez. képest? Könnyű, biztosan működő PDR rendszer. Miért kevés a piacon? – drága (lásd korábban)
Vírusellenálló transzgénikus vonalak veszélyei 1, A vonal rossz, nem védi a növényt -félrevezeti a farmert, pl. nem öli a vektort. Ezek nagyon megbízható vonalak, a rezisztencia erős!!! 2, A rezisztencia nem tartós. Rezisztencia törést eddig csak üvegházban tapasztaltak!!! 3, A transzgénikus CP rekombinálódhat más vírussal. Ez elvben igaz, eddig ilyet nem láttak. De természetben az együttfertőzés gyakori, ott sokszor valószínűbb a rekombináció!!! 4, A transzg. CP más vírus RNS-eit is becsomagolhatja, veszélyes új vírus jöhet. Elvben ez is lehet, de lásd 3. pontot. Az RNS-alapú PDR-nél elvben sem lehet!!! 5, A transzgén pollennel kijut, vírusellenállóvá teszi a vad rokon növényt. Igaz, ha van rokon ,amelynek a fékentartásában a vírus komoly szerepet játszik, nem szabad használni!!! 6, Kimerítheti a gazda védelmi rendszerét, más patogénekkel szemben fogékonyabb lesz.. Ezt sem tapasztalták eddig.!!! Fajtadiverzitás!!!!????
Vírusrezisztencia típusok Genetikai módosításon alapuló rezisztencia
Természetes rezisztencia
Természetes vírus rezisztencia rendszerek Vírus specifikus
(genetikai variabilitás, hagyományos nemesítés)
Poligénes
Általános antivirális rendszer (RNS silencing, RNA interferencia-RNAi)
Monogénes
Ált. quantitatív rez. Recesszív!! Domináns ritkán használt, de 2/3 pl. MSV mastrevírus jó 1/3 R-gén !!!
Inhibitor!
Természetes genetikai variabilitás van, hagyományos nemesítésben használható! Hagyományos nemesítésben általánosan használt
Genetikai variabilitás nincs, hagy. nemesítéshez rossz. De, transzgénikus nemesítésre kiváló!!!
A transzgénikus vírusellenállóság alapja, az RNS silencing rendszer
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "az RNS interferencia rendszer felismeréséért" "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
„Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.” Nature. 1998 Feb 19; 806-11.
RNAi = RNS interferencia = RNS silencing
Géninaktiválás antisense RNS technológiával Baktétiumokban van antisense gátlás, hátha eukariótákban is hatékony lehet Target mRNS degradáció
Target mRNS 5’
3’
Antisense RNS 5’5’ 3’3’ 5’ 3’
3’ 5’
5’3’ 3’
5’
Működhet-e az antisense gátlás növényekben? Hexokináz1
Endogén gén transzgén
Vad növény
antiAtHexokináz1
vad típus
anti-AtHexokináz1 anti-AtHexokináz1
Hexokináz mRNS
6% cukor Az antisense RNS-ek növényekben gyakran a cél mRNS degradációját, ezáltal géninaktivációt, silencing-et okoznak!
Mi történik a sense mRNS túltermelésénél? Chalcone synthase (CHS) gén
pigment képzésért felelős
Erős promoter Chalcone synthase gén Chalcone synthase transzgénikus petúnia
Nem transzformált
transzformánsok
Napoli et al. 1990
Chs mRNS Co-szupresszió (ritka)
Ritkán, de a sense mRNS túltermelési eltünteti a célgén mRNS-ét, Az antisense gátlás modellel nem összeegyeztethető!!!
Mi okozhatja a co-szupressziót? Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. „Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.” Nature. 1998 Feb 19; 806-11.
RNAi - RNS silencing szúrni sense, antisense, illetve sense+antisense (dsRNS) RNS-sel Unc22 sense Unc22 antisense
Unc22 dsRNS
UNC-22 kell normál mozgáshoz
A dsRNS hatékony és specifikus géninaktivációt eredményez, sokkal jobb, mint a sense vagy antisense túltermelés !
Sejt-autonóm RNA silencing
dsRNS
Amplifikáció, cap + visszacsatolás
induktor
Második szál szintézis
RDR
RDR
(exonukleáz)
cap
D I CER
AAA
AAA
siRNS
cap AAA
RISC
Specifitási faktor
21-26 nt
Végrehajtó komplex (AGO) A homológ mRNS hasítása (vagy transzlációs gátlása)
Az RNAi (silencing) rendszer A silencing rendszer egy ősi eukarióta génszabályozási mechanizmus, amely kétszálú (double-stranded, ds)RNS-ek hatására indukálódik és a dsRNS-sel homológ nukleinsavak inaktiválása, elsősorban a homológ mRNS-ek specifikus lebontása révén a hasonló gének specifikus és nagyon hatékony inaktivációját, silencing-jét eredményezi. A rendszer specifitását rövid 21-26 nt RNS-ek adják!!!!
Az RNAi (silencing) rendszer jelentősége Az RNAi rendszer felismerése alapvetően változtatta meg az eukarióta génszabályozásról, az RNS-ek szerepéről alkotott képet Páratlanul hatékony eszköz a gén-funkció kapcsolat megállapítására Óriási gyakorlati jelentőség Az RNS-alapú transzgénikus vírusrezisztencia (RNS-alapú PDR) pl. ezen alapszik.
A növényi RNS silencing alapmechanizmusa (az amplifkációs ciklus nélkül) Sejt-autonóm RNA silencing
D I CER
dsRNS
Rövid távú szisztemikus RNS silencing
siRNS
AAA
RISC cap AAA
RISC
Plasmodezma
(AGO)
A homológ mRNS hasítása (vagy transzlációs gátlása)
Phloem
Rövid távú szisztemikus RNA silencing
Felső levelek
A vírusok –elvben- a növényi RNS silencing ideális célpontjai Transzláció
Virus + RNS
+
Viral RdRP
+_
- RNA Replikáció
Viral RdRP
viral dsRNS D I CER siRNS Plasmodezma
_ +
viral dsRNS
_
++ +
Viral RdRP
RISC Vírus RNS degradáció
RISC Szisztemikus RNS silencing
Az RNS silencing valóban antivirális rendszer növényekben?
Control wt
CMV fertőzés wt
RNS silencing mutáns
A növényi RNS silencing egy hatékony antivirális rendszer! Vaucheret et. al., Cell 2000
Mennyire hatékony antivirális rendszer az RNS silencing? A legtöbb vírus egyáltalán nem fertőzi a legtöbb növényt - non-host Szerepet játszhat-e ebben az RNS silencing? PVX-Arabidopsis non-host kapcsolat Teszt: PVX képes-e fertőzni a silencing (DICER) mutáns Arabidosist?
Jaubert M et al. Plant Physiol. 2011;
Az RNS silencing egy rendkívül hatékony antivirális rendszer, amely (teljes) non-host védettséget biztosíthat!
Transzláció
Vírus + RNS
+
Vírus RdRP
+_
- RNA Replikáció
Vírus RdRP
vírus dsRNS D I CER siRNS Plasmodezma
_ +
vírus dsRNS
_
++ +
RISC Vírus RNS degradáció
RISC Szisztemikus RNS silencing
Vírus RdRP növényi RNS silencing - vírus silencing szupresszió: A vírus előnyben, mert a silencing akkor aktiválódik, amikor a vírus már fertőz!!!
Transzgénikus vírus rezisztens növények Virális szekvenciák transzgénről expresszáltatva
(intron szeparált fordított ismétlődés) CP
intron
PC
Fertőzés
AAA
vírusszekvencia siRNS dsRNS DICER AA
90-100 %-os védettség!!!
Vírus + RNS RISC RISC
RISC Vírus RNS degradáció
Amikor a vírus fertőz, már van vírus ellen aktív siRNS-RISC komplex!!!
Transzgénikus multivírus rezisztencia Tosposviruses gazd- fontos negatív szálú vírusok.
A transzgén egy-egy darabot ford. ismétlődésként hordoz 4 eltérő Tospovírusból. Tr16
Cont.
Tr16 Cont.
Számos vírus ellen egyidejű védettség érhető el !!! Bucher et. al., J. Gen Virol 2006
Miért okoztak a CP és ncCP transzgén beültetések RNS silencing-et? dsRNS
Amplifikáció, cap + visszacsatolás
induktor
Második szál szintézis
RDR
AAA
RDR
cap
D I CER
AAA
siRNS
cap AAA
Specifitási faktor
RISC (AGO)
Végrehajtó komplex
A homológ mRNS hasítása A transzgén expresszió erős és kevésbé kontrollált, mint az endogén, ezért sok aberráns cap vagy AAA nélküli mRNS, ezek beindítják az RDR-silencing ciklust. Az aberráns RNS-ek által indukált silencing ált. gyengébb, mint a inverted-repeat, azaz a direkt dsRNS termelésen alapuló. Minél több vírus szekvenciájú siRNS-RISC fertőzéskor, annál hatékonyabb védettség.
-RNS silencing természetes antivirális rendszer -A transzgénikus vírusellenálló növények az RNS silencing rendszert használják ki, virális szekvencia beépítés, amiről siRNS-ek képződnek, ezek beépülnek RISC-be, fertőzéskor azonnal támadják a vírust. Erős, specifikus és tartós rezisztenciát okoznak. -inverted repeat beépítés-direkt dsRNS szintézis, vagy virális szekvencia erős expressziója, RDR-silencing ciklus aktiválása. Inv. Rep. Több siRNS, jobb védettség. -transzgénikus vírusellenálóság specifikus, csak azok ellen a vírusok ellen hatásos, amelyeket a virális beépített szekvenciáról képződött siRNS-ek Felismernek. Tartós, mert a vírusnak nagy szekvencia részt kéne lecserélni, hogy elkerülje.
Gazda-parazita ko-evolúció (fegyverkezési verseny) Gazda
vírus evolúció, hatékonyan fertőző vírusok
Silencing antivirális rendszer ?
Az RNS silencing szupressziója, a vírusok lépése az evolúciós fegyverkezési versenyben
Ha az RNS silencing ilyen hatékony antivirális mechanizmus, hogyan fertőznek a növényi vírusok? 2 lehetőség: azokban a vírus-gazda kapcsolatokban, ahol a vírus fertőz, a patogén elkerüli vagy legyőzi (szupresszálja) az RNS silencing-et?
N. benthamiana- Cymbidium ringspot virus (Cym) model rendszer N. Benthamiana -hatékony RNS silencing rendszer működik
p19
Cym ORF 1 ORF 2 Cym
ORF 3 ORF 4
- kontroll G-RNS
Sziszt. levél minta
21 nt siRNS
Cym a szisztem. levélben
A vírus nem tudja elkerülni a silencing-et, valószínű szupresszálja!
Hogyan győzhetik le a vírusok az RNS silencing-et? N. benthamiana- Cymbidium ringspot virus (Cym) model rendszer
p19
Cym ORF 1 ORF 2
ORF 3 ORF 4
p19
19stop ORF 1 ORF 2
ORF 3 ORF 4 5
6
Recovery 1
Cym a szisztem. Levélben
19stop a szisztem. Levélben
A p19 kell a hatékony szisztemikus fertőzéshez!
2
Hogyan szupresszálja a silencing-et a p19, 1? in vitro siRNS kötés vizsgálata
19 GST-p19 fúziós
synthetic 21mer ds siRNS
G GST ds siRNSkompetítor
19G 19G
100X 1000X
ss siRNS P19
G
ds siRNS P19
G
P19
Jelölt p19-kötött ds siRNS Jelölt szabad ss vagy ds siRNS
Long ss RNS
Long ds RNS
A p19 in vitro méretszelektíven köti a ds siRNS-eket, a silencing kulcsmolekuláit! Az első méretszelektív dsRNS-kötő fehérje!
Mi a p19 méretspecifikus ds siRNS-kötésének az alapja?
p19 dimerként köti a ds siRNS-t
C
N
C Vargason, et al.,2003
N
N
Reading head α2 α1
C Dimerization, dsRNA binding β1
β2
α3
α4
β3
β4
α5
P19
A p19 dimer köti a dsRNS-t, az N-terminális vég köti a ds siRNS végét, de csak a megfelelő méret esetén, azaz a p19 sokkal jobban köti siRNS-méretű dsRNS-eket , mint a nagyobbakat vagy kisebbeket.
Hogyan szupresszál a P19? Vírus fertőzés iránya RISC
RISC
RISC
RISC
P19 Viral RNA
CymRSV
Vírus RNS
RISC
Cym19stop
RISC
RISC
P19 dimer
Vírus siRNS-ek
RISC
RISC
RISC RISC
Viral RNAs
p19 dimers
Virus siRNAs
Havelda et al. 2005
Vírus kódolta RNS szupresszorok Viral family Virus Positive-strand RNA viruses in plants Carmovirus Turnip Crinkle virus Cucumovirus Cucumber mosaic virus; tomato aspermy virus Closterovirus Beet yellows virus Citrus tristeza virus
Comovirus Hordeivirus Pecluvirus Polerovirus
Cowpea mosaic virus Barley yellow mosaic virus
Peanut clump virus Beet western yellows virus; cucurbit aphid-borne yellows virus Potexvirus Potato virus X Potyvirus Potato virus Y; tobacco etch virus; turnip yellow virus Sobemovirus Rice yellow mottle virus Tombusvirus Tomato bushy stunt virus; cymbidium ringspot virus; carnation Italian ringspot virus Tobamovirus Tobacco mosaic virus; tomato mosaic virus Tymovirus Turnip yellow mosaic virus Negative-strand RNA viruses in plants Tospovirus Tomato spotted with virus Tenuivirus Rice hoja blanca virus DNA viruses in plants Geminivirus African cassava mosaic virus Tomato yellow leaf curl virus Mungbean yellow mosaic virus Positive-strand RNA viruses in animals Nodavirus Flock house virus; nodamura virus
Suppressors
Other functions
P38 2b
Coat protein Host-specific movement
P21 P20 P23 CP S protein b
Replication enhancer Replication enhancer Nucleic-acid binding Coat protein Small coat protein Replication enhancer; movement; seed transmission; phatogenicity determinant Movement Phatogenicity determinant
P15 P0 P25 HcPro P1 P19
Movement Movement; polyprotein processing; aphid transmission; phatogenicity determinant Movement; phatogenicity determinant Movement; phatogenicity determinant
P30 p122
Replication
P69
Movement; phatogenicity determinant
NSs NS3
Phatogenicity determinant Unknown
AC2, AC4 C2 C2
Transcriptional activator protein (TrAP), Phatogenicity determinant
B2
Plaque formation
Voinnet, 2005
A legtöbb növ. vírus expresszál RNS silencing szuppresszort!
vírus dsRNS P14?
D I CER siRNS Plasmodezma P19 P0
RISC Vírus RNS degradáció
RISC Szisztemikus RNA silencing
A különböző RNS silencing szuppresszorok eltérően hatnak!
Gazda
Gazda-vírus ko-evolúció (fegyverkezési verseny) Szupreszor nélküli vírus evolúció
Silencing antivirális rendszer Virális silencing szupreszorok evolúciója vagy meglévő fehérje szerez + funkciót pl. TEV HvPro vagy új, szupresszor fehérje evolválódik pl. p19 Komplexebbb, hatékonyabb silencing rendszer (pl. több DICER, AGO, RdRP vagy spec. Védekezési mechanizmusok Pl. N. tabaccum p19-et felismeri hiperszenzitív válasz, Sejthalál, védettség A gazda silencing rendszere hatékony egyes vírusok ellen, mások ellen nem. A vírus szupresszora is hatékony lehet egyes gazdák ellen, másoké ellen nem A gazda-vírus kapcsolat eredménye függ genetikai és környezeti tényezőktől is.
Ha a silencing szupresszorok gátolják az RNS silencing-et, vajon hogyan véd mégis?
A hőmérséklet hatása a gazda-vírus interakcióra Magas hőmérséklet Harrison(1955): Vírus replikáció
Alacsony vírus szint
gyenge tünetek
Heat masking
Vírus szint Hőmérséklet-függő vírus degradáció
Lehet, hogy az RNS silencing a feltételezett hőmérséklet-függő RNS degradációs rendszer ?
Befolyásolja-e a hőmérséklet a vírus-indukálta szisztemikus RNS silencing-et? 21°C
27°C
19stop Cym 19stop
Cym
15°C
Vírus akkumuláció a szisztemikus levelekben
A vírus-indukálta szisztemikus RNS silencing hőmérsékletfüggő
Alacsony hőmérséklet, gyenge silencing
Magas hőmérséklet, hatékony silencing
Fertőző vírusok tünetei erősödnek
szupresszor nélküli vírus is fertőz
tünetgyengülés, még erős szupresszort termelővírus ellen is véd Hőterápia Heat masking
Az RNS silencing hiába a növények talán leghatékonyabb antivirális rendszere, nemesítésre nem jó, nincs fajon belül variáció. De a silencing rendszer megértése hozzásegíthet, hogy hatékonyabb vírusellenálló növényeket hozzunk létre!!!!
Milyen hatással van a hőmérséklet a transzgénikus vírusrezisztenciára? Növényi RNS silencing hőmérsékletfüggő, hidegben gyenge. A transzgénikus vírusrezisztencia alapvetően silencing-en alapszik CymRSV aberráns RNS-t expresszáló rezisztens dohány (A1) CymRSV 15°°C 24°°C 24°°C 15 A1 wt A1 wt A1
wt
Alacsony hőmérsékleten az aberráns RNS silencing-en alapuló vírusellenállóság elveszhet! De az inverted repeat-konstrukciók által kiváltott vírusellenállóság hatékonyabb, hidegben is működik!!! Artificial miRNS-alapú vírusrezisztencia szintén stabil hidegben.
Vírusrezisztencia típusok Genetikai módosításon alapuló rezisztencia
Természetes rezisztencia A rezisztencia gének hagyományos úton bevihetőek
A rezisztencia gének csak transzformációval építhetőek be
Természetes vírus rezisztencia rendszerek Vírus specifikus
(genetikai variabilitás,hagyományos nemesítés)
Poligénes Ált. quantitatív rez. ritkán használt, de pl. MSV mastrevírus jó
Monogénes Recesszív!! 1/3 R-gén !!!
Általános antivirális rendszer (RNS silencing, RNAi) (genetikai variáció nincs hagyományos nemesítéshez rossz biotechnológiai nemesítés)
Domináns 2/3
Inhibitor!
R-gén(ek) közvetítette egygénes, domináns vírusrezisztencia R (resistance) gének domináns gazda faktorok, amelyek megvédik a növényeket az adott R génnek megfelelő Avr (Avirulence) gént hordozó patogénektől (gene-for-gene model). Az R-gén közvetítette védekezés hatékony mindenféle patogén rovar, nematodes, gomba, baktérium és vírus ellen. Fertőzés VirusA2 Avr* R1
VirusA1 Avr1 R1 Rezisztencia Számos R-gént klónoztak----hasonlóság
!
NB=Nucleotide binding LRR=Leucine rich repeat
! Virális Avr faktorok : bármely vírus fehérje, ritkán RNS darab, Egy vírus esetén a különböző gazdákban más és más fehérjék lehetnek az AVR faktorok.
Hogyan védik az R-gének a növényt?
Két fő aspektus: Hogyan ismeri fel az R gén a megfelelő Avr faktort? Az R-Avr kapcsolat miként vezet rezisztenciához?
Hogyan ismeri fel az R gén a megfelelő Avr faktort? Két model: receptor-ligand versus guarding model Receptor-ligand Avr
R Def.
-néhány száz R több ezer Avr-t tud azonosítani -Kísérletes biz. az R-Avr direkt interakcióra nagyon ritka -azonos co-factorok kellenek a különböző R-Avr rendszerekhez
Guarding model Avr
* R Co-factor
R=TMV N rez. faktor, Avr faktor p50 replikáz domain N-p50 R-Avr a legjobban tanulmányozott növényi R-Avr system
Def.
Yeast two-hybrid P50 direkt interaktál az NBS-LRR
Ueda et. al., Plant Mol. Biol. 1997
Hogyan védik az R-gének a növényt?
Más tanulmányok: P50 közvetetten interaktál az N fehérje TIR doménjével. Yeast two-hybrid screen. a TIR domén kapcsolódik az NRIP1 kloroplaszt génnel Részt vesz-e az NRIP1 az N közvetítette rezisztenciában? N gén knock-out NRIP1 knock-out (N+NRIP1) vad dohány TMV fertőzés (TMV-GFP)
NRIP1-N guard model Caplan et. al., Cell 2008
Az R-Avr kapcsolat miként vezet rezisztenciához? R-Avr interakció számos védelmi rendszert is aktivál és gyakran vezet lokális sejthalálhoz, ami korlátozza a patogén terjedését HR (hypersensitive response),
Mennyire specifikusak a különböző R-Avr kiváltotta védelmi válaszok? CMV+
PVX-Avr -
PVX-avr CMV-
PVX Rx gén PVX Rx gén protoplast PVX Rx gén Rx-PVX Avr kiváltotta védelmi válasz képes más (CMV) vírus replikációját is gátolni Köhm et. al., Plant Cell 1993
