Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola
Ph.D. értekezés
A VÉRTELENÍTÉS HASZNÁLATÁVAL ÖSSZEFÜGGŐ SZÖVETI SÉRÜLÉS VÁZIZMON Készítette: Dr. Turchányi Béla „Szív- és érrendszeri betegségek élettana és klinikuma” doktori program
Programvezető: Dr. Juhász-Nagy Sándor egyetemi tanár Témavezető: Dr. Hamar János egyetemi magántanár 2005 Szigorlati Bizottság Dr. Mózes Tibor e. tanár Dr. Koller Ákos e. tanár Dr. Farkas Tamás c.e.m. tanár OBSI
Opponensek: Dr. Telek Géza PhD Dr. Lantos János e. docens PTE
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK..........................................................................................2 PUBLIKÁCIÓK ......................................................................................................3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..................................................................................6 ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................7 SUMMARY………………………………………………………………………..9 BEVEZETÉS……………………………………………………………………..11 CÉLKITŰZÉSEK……………………………………………………………..….18 ANYAG ÉS MÓDSZER .......................................................................................19 EREDMÉNYEK....................................................................................................27 MEGBESZÉLÉS ...................................................................................................47 FŐBB MEGÁLLAPÍTÁSOK................................................................................53 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS……………………………………………………55 IRODALOM……………………………………………………………………...56
2
Publikációk A disszertációval összefüggő közlemények:
Turchányi B, Hamar J, Tömböl T, Siklós L.: Capsaicin delays regeneration of the neuromuscular junction of rat extensor digitorum longus muscle after ischemia. Muscle Nerve 2006 jan 3. (Epub ahead of print) Turchányi B, Réffy A, Tóth B, Hamar J.: Szelektív deafferentáció, indukált gyulladás, és a vértelenítés együttes hatása az extensor digitorum longus izom szerkezetére és kontrakciós erejére patkányon. Magyar Traumatológia Orthopédia Kézsebészet és Plasztikai Sebészet. 2005. 48 (4):352-363 Turchányi B, Tóth B, Rácz I, Vendégh Z, Fűrész J, Hamar J.: Ischemia Reperfusion Injury of the Skeletal Muscle after Selective Deafferentation. Physiol. Res. 2005. 54. 25-31, Turchányi B, Rácz I, Hamar J, Vendégh Z, Tóth B.: Érzőidegek szerepe a reperfúziós sérülést követő szöveti károsodásban. Magyar Traumatológia Orthopédia Kézsebészet és Plasztikai Sebészet. 2001. 44(1):3-8
Turchányi B, Szalontay T, Zacher G.: Kígyómarás okozta sérülések. Orvosi Hetilap 2000 141(20): 1067-1071 Cziffer E, Farkas J, Turchanyi B. Management of potentially infected complex hand injuries. J Hand Surg [Am]. 1991 Sep; 16(5): 832-834
Folyóiratban megjelent absztraktok: Turchányi B, Fűrész J, Hamar J.: Van-e kimutatható káros hatása az egy óránál rövidebb vértelenségnek? Magyar Sebészet. 2005 58(4) 276 (Előadás)
3
Turchányi B, Tóth B, Vendégh Zs, Hamar J.: Capsaicin pre-treatment beneficially influences reperfusion injury of the skeletal muscle. Acta Physiol. Hung. 2002 89(1-3): 70 (Poszter) Előadások: Turchányi B, Hamar J.: Szelektív deafferentáció szerepe a vázizomzat reperfúziós károsodásában Magyar Traumatológus Társaság Kongresszusa 2004 szeptember 25., Balatonfüred Turchányi B, Szalontay T, Zacher G.: Felsővégtagi compartement szindrómák Magyar Traumatológus Társaság Kongresszusa 2000. május, Debrecen Turchányi B.: Érdemes-e, lehet-e baleseti sebészeti kutatást végezni? Magyar Traumatológus Társaság Kongresszusa 1999. szeptember, Pécs
Egyéb közlemények: Balogh J, Sárváry A, Turchányi B, Feczkó J, Molnár I.: Humerus szártörések kezelése flexibilis felfúrás nélküli reteszes szeggel. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet. 2003 46(2): 154-164 Turchányi B: Proximalis radiustörés. In: Cziffer E.(szerk): Operatív töréskezelés Budapest, Springer. 1997 361-367 Turchányi B, Szabó Gy.: A súlyos kézsérülések ellátása. Honvédorvos 1997 49(4): 286295 Turchányi B, Cziffer E.: Háromdimenziós ligamentotaxis alkalmazása distalis radiustörések helyreállításában. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet. 1996 39(5): 383-388
4
Cziffer E, Farkas J, Turchányi B. A kéz csontdefektussal járó nyílt, potenciálisan fertőzött töréseinek kezelése halasztott korai csontpótlással. Magy Traumatol Orthop Helyreállító Seb. 1990 33(4): 297-302 Turchányi B, Cziffer E, Farkas J. Radiusfejecs protézis beültetés a friss sérülések ellátásában. Magy Traumatol Orthop Helyreállító Seb. 1990 33(3): 161-166 Turchányi B.: Kézigránát-hajítás közben keletkezett humerus törések. Honvédorvos 1988 40(2): 93-101 Kottra G, Turchanyi B, Takacs L. Renorenal vasomotor reflex. Acta Physiol Acad Sci Hung. 1981 57(2): 123-130
5
Rövidítések jegyzéke Az SI rendszerben használatos rövidítések nem szerepelnek a listán AP
akciós potenciál
CGRP
calcitonin gene-related peptide
DL
distalis latencia
EDL
extensor digitorum longus
EVI
Egészség Védelmi Intézet
HMÖ
Heves Megyei Önkormányzat
I
ischaemia
IL
interleukin
i.p.
intraperitonealis
KHK
Központi Honvéd Kórház
MH
Magyar Honvédség
n.
nervus
NCV
ideg-vezetési sebesség
NMJ
neuro muscularis junctio
NO
nitrogén-monoxid
PMN
polimorfnukleáris
R
reperfúzió
SEM
Az átlag standard hibája
SOL
soleus
TNF-α
tumor nekrózis faktor alfa
TRD
train duration
VIP
vasoactive intestinal peptide
6
Összefoglalás A keringészavart követően a végtag, és adott esetben az egész szervezet sorsát, az izomzatot ért károsodás mértéke határozza meg. A biztonságosabb műtéti preparálás, a kisebb vérvesztés és a rövidebb műtéti idő érdekében a végtagsebészetben rutinszerűen alkalmazzuk a pneumatikus vértelenítés technikáját. A mai napig elfogadott elvek szerint két óra folyamatos vértelenítés megengedett, és 15-20 perces átmeneti reperfúzió (R) után az még egy órával meghosszabbítható. A műtétek utáni szövődmények hátterében a vértelenítés okozta másodlagos szöveti sérülés is állhat. Kísérleteinkben a még károsodást nem okozó vértelenítési időtartamot kerestük. Vizsgáltuk az afferens idegek szerepét és a NMJ károsodását a reperfúziós sérülésben, valamint a károsodott végtagból érkező gyulladásos választ. Állatkísérleteinkben a patkány extensor digitorum longus izmát ért károsodást a kontrakciós erő nagyságával jellemeztük fél egy és két óra ischaemiát (I) követően 1, 24, 72 és 168 órával. Fél és egy óra vértelenség után az izomerővesztés az első napot követően még fokozódik, előbbi esetben 80%-ra, utóbbiban 50 %-ra csökken. Az izomerő a fél órás I után egy héttel már újra teljes, míg egy óra I után egy héttel a regeneráció még nem mutatkozik. Két óra I után alig mérhető a vizsgált tartományban izomkontrakció. Szelektív deafferentáció (peptiderg rostok kapszaicinnel történő kikapcsolása) után a két óra I okozta izomerő veszteség szignifikánsan kisebb, mint ép szenzoros rostok mellett. A vértelenség és a deafferentáció csak a kezelt oldal izomerejét változtatta meg. Ha indukált gyulladással kombináljuk a reperfúziós sérülést, akkor az ellenoldalon is izomerő csökkenés jelentkezik, és a deafferentáció protektív hatása sem érvényesül. A NMJ ultrastruktúrájának elemzésével megállapítottuk, hogy az ischaemiát követően a preszinaptikus struktúrák elváltozása jelentős, az axon-terminális sérül, helyét Schwann sejtek nyúlványai foglalják el, míg a posztszinaptikus membrán változatlan marad. Az elváltozások az első órák után tovább súlyosbodnak, viszont az első hét végére már regeneráció jelei láthatóak. A szelektív deafferentáció hatására a NMJ regenerációja késlekedik. Átlag egy órás vértelenítéssel járó kis szövetkárosítást okozó felső végtagi műtéteken átesett betegeknél 10 perc R után polimorfnukleáris sejt szekvesztrációt, 24 óra R után a nagy műtétekre jellemző IL-6 koncentráció emelkedést találtunk. A vértelenség után 48 órával EMG vizsgálattal az alkaron szignifikáns idegvezetési
7
sebesség csökkenést mutattunk ki, mely 30 nap után sem normalizálódott minden esetben. Vizsgálataink szerint fél óra vértelenítés egyébként egészséges szervezetben már kimutatható de egy héten belül múló elváltozásokat okoz. Az egy és két órás vértelenség hatása minőségileg más. A két óra vértelenség utáni izomerő csökkenés deafferentációval mérsékelhető. Gyulladásos környezetben a fél óra vértelenség hatása is jelentős, és az ellenoldalon is észlelhető. Már egy órás vértelenséggel járó műtétek után sejtszekvesztráció, súlyos szöveti sérülést jelző citokin koncentráció és tartós axonkárosodás mutatható ki. Ennek alapján ajánlható, hogy a vértelenségi idő egyébként intakt szöveteken az egy órát, gyulladásos környezetben a fél órát ne haladja meg.
8
Summary INJURY OF THE SKELETAL MUSCLE CONNECTED WITH THE USE OF TOURNIQUET Consequences of the disturbed bloodsupply to the limb are determined by the degree of muscles injury, which can lead to complications of the whole body. The advantages of rutinely used pneumatique tourniquet are: more safe preparation, less blood loss and shorter operating time. The commonly accepted limit for continuous tourniquet time is 2 hours, and it is allowed to use it for another plus hour after a 15-20 minute long transient reperfusion (R). The secondary tissue injury, provoked by the tourniquet itself, could be at the cause of postoperative complications. In our experiments we tried to determine duration of tourniquet, which is harmless. We investigated the role of the afferent neurons and the damage of NMJ in reperfusion injury, as well as the systemic inflammatory response generated in the affected limb. In our animal model the injury of the extensor digitorum longus muscle was characterized by the loss of contractile force after ½, 1 and 2 hour (h) of ischemia (I) and 1, 24, 72 and 168 h of reperfusion (R). The loss of muscle contraction force after ½ and 1 h ischemia was more impaired after the first day of reperfusion, the worst values are 80 % and 50 % respectively. After a week of reperfusion the recovery of the muscle contraction force of ½ h ischaemia group was complete, but there was no restoration in the group of 1 h ischemia. There was no measurable muscle contraction force after 2 h ischemia. The loss of contractile force after 2 h ischemia is significantly reduced after selective deafferentation (i.e. blocking the peptidergic fibers by capsaicin pretreatment). We did not find any effect of ischaemia/reperfusion, with or without deafferentation, on the muscle contraction force of the contra-lateral side. Reperfusion injury, combined with artificial inflammation, caused loss of muscle contraction force in the contra-lateral side and the protective effect of deafferentation could not develop. Analyzing the ultrastructure of NMJ after ischemia/reperfusion we found significant damage of presynaptic elements, the axon terminal was fragmented and replaced by Schwann cells, while the postsynaptic membrane remained intact. The above changes got more aggravated after the first hour, but there were signs of regeneration at the end of first week. The regeneration of MNJ was
delayed
after
selective
deafferentation.
We
found
sequestration
of
polymorphonuclear cells after minor surgery of upper limb in humans operated by 1
9
hour long tourniquet at 10 minutes reperfusion. We also found elevated IL-6 concentration after 24 hour, which is characteristic for major operations. The NCV of the forearm decreased significantly 48 hours after the use of tourniquet and even it was not normal after 30 days in most cases. We have shown that 30 minutes long tourniquet provokes measurable, but within a week reversible changes even in healthy organisms. The effects of tourniquet lastin for one and two hours are different in quality. The loss of muscle contraction force after 2 hours tourniquet can be reduced by selective deafferentation. The effect of half hour ischemia in inflamed milieu is significant and can be observed even in the contra lateral side. One hour tourniquet ischemia and reperfusion can elicit cell sequestration elevated cytokine concentrations, characteristic for tissue damage and long lasting axonal damage. We recommend that tourniquet time should not be longer than 1 hour at intact tissues and only 30 minutes in inflamed milieu.
10
Bevezetés A végtagok keringéskárosodását követően a végtag, és adott esetben az egész szervezet sorsát az izomzat károsodása határozza meg. A XX. század utolsó negyedére a kis és nagyvégtag replantáció, a revascularizáció, az érnyeles szövetátültetés rutinszerűvé váltak. A végtagsebészetben a biztonságosabb preparálás, a kisebb vérveszteség, a rövidebb műtéti idő érdekében 50 éve elterjedt a mesterséges keringészavar, a „tourniquet” vértelenítés technikája. Az 1980-as évekig felhalmozott tapasztalatok alapján, a mai napig oktatott alkalmazási előírások szerint a vértelenítés megengedhető maximális ideje 2 óra, melyet 15-20 perc (felengedés) reperfúzió után további 1 órával szabad kiegészíteni (81). Az addigi ismeretek szerint a két óránál rövidebb keringészavarnak nem volt sem átmeneti, sem tartós szisztémás hatása. E felfogás szerint normotermiás körülmények között a végtagok különböző szöveteinek maximális ischaemia tűrő képessége a következő: izomzaté 4 óra, perifériás idegé 8 óra, zsírszöveté 13 óra, bőré 24 óra a csonté 96 óra, mert a bekövetkező károsodások hosszútávon reverzibilisek (10).
Erre alapozva a mozgásszervek sebészetében a
Magyarország és a világ számtalan ortopéd-traumatológiai osztályán naponta többször alkalmazzák a vértelenséget, melyről pontos országos adat nem áll rendelkezésre. A HMÖ Egri Markhot Ferenc Kórház 70 ágyas Traumatológiai és Kézsebészeti Osztályán 2001. január 1. és 2004. december 31. között 2225 műtétnél alkalmaztunk fél óránál rövidebb, míg 1973 műtétnél fél óránál hosszabb vértelenséget. Klinikai tapasztalat,
hogy
a
betegek
egy
részénél
a
korai
posztoperatív
szak
szövődménymentessége, a végtag makrocirkulációjának kifogástalan volta ellenére elhúzódó
végtagödéma,
fájdalmasság,
paresthesia,
izomgyengeség,
nehezen
magyarázható sebgyógyulási zavar, vagy csak hosszú hónapok alatt javuló reflex sympaticus distrophia alakulhat ki. E szövődmények lehetséges okaként a felhelyezett kötések szorossága okozta keringéskárosodás, azaz a reperfúziós szöveti sérülés Volkmann munkássága óta ismert (103). A perifériás ideg, az izomzat és az egész végtag vértelenítés utáni működészavarait a leszorító mandzsetta direkt nyomására is visszavezették. A XX. sz. utolsó évtizedében fordult a gyógyítók és kutatók figyelme a két óránál rövidebb ischaemia káros következményei felé. A különböző szöveti sérülések kombinálódhatnak is. A már eleve keringéskárosodott, toxikus ártalomnak
11
kitett, gyulladásos vagy idegműködésében sérült szövetek ischaemia toleranciája lényegesen eltérhet a fiatal, egészséges szervezet szöveteinek tűrőképességétől. A doktori értekezésben összefoglaltam kutató munkám azon eredményeit, melyeket 2 óránál nem hosszabb keringészavar hatására észleltünk egészséges, gyulladásos, vagy deafferentált végtagokon. Eredményeink a jelenleg érvényes szakmai ajánlásokban szereplőknél rövidebb ideig, maximum fél - egy óráig tartó mesterséges ischaemia használata mellett szólnak. Az irodalmi háttér bemutatásakor elsősorban azokra az elváltozásokra szorítkozom, melyeket két óránál rövidebb ischaemiát követően találtak. A pneumatikus vértelenítés technikája 50 éves múltra tekint vissza (13). Használata ma sem egységes. Egyes ajánlások szerint a megfelelő vértelen műtéti terület biztosításához a mandzsetta szükséges nyomása combon a szisztolés vérnyomás érték háromszorosa, felkaron a kétszerese. Mások szerint az alsó végtagon maximum 400, felsőn maximum 200 Hgmm az elfogadott nyomás, illetve a szisztolés vérnyomás felett maximum 100-120 Hgmm-s „túl”-nyomás alkalmazása biztonságos bármely végtagon. Abban egységes az irodalom, hogy szélesebb mandzsettával kisebb nyomás alkalmazása is elegendő, de a lábszárra illetve az alkarra tett mandzsetta nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket (8, 21, 61, 63). A tourniquet technikával létrehozott keringés zavar a keringés teljes leállását jelenti, ami ha átmeneti időre is de az amputációval egyenértékű, mert minden más esetben - érelzáródás, lekötés, lefogás, érsérülés, szubtotális amputáció kapcsán - valamilyen collaterális keringés megmarad, ami a szövetek túlélése szempontjából jelentős de nem standardizálható körülményt jelent (saját munkacsoportunk nem publikált adata). A károsodás valójában a keringés helyreállása után kezdődik. A szabadgyökök képződése már 10 perc ischaemia után kimutatható, és 2 órás keringésleállást követően maximális szintet ér el (14). A szabadgyökök megjelenésével párhuzamosan a complement rendszer aspecifikus aktiválódása is megtörténik, mely a PMN sejtek letapadását provokálja (84). A legújabb eredmények szerint az oxigén hiányában az endothel felszínén neoepitope jelenik meg, melyhez IgM típusú antitest kötődik már az ischaemia alatt, és ez az antigén antitest complexum a reperfúzió során vezet a complement aktiválódáshoz (18). Mindez –a korai reperfúzió - számos kóros, pozitív visszacsatolású
folyamatot
indít
be,
melyek
membránkárosodásokhoz,
a
polymorfnukleáris (PMN) sejtek és thrombocyták kitapadásához, aktiválódásához, gyulladásos mediátorok és interstitialis ödéma képződéséhez vezetnek, miáltal a 12
szövetkárosodás napokig súlyosbodik. Ezt nevezzük késői reperfúziónak. A regeneráció az első hét végén már egyértelműen észlelhető, de a 4. hét végére sem mindig teljes.(25, 80, 90, 97) A mai napig sem egyértelmű, hogy a keringéskárosodott területen a reperfúzió során észlelhető jelenségek: az endothel károsodás, az intersticiális ödéma, a fehérvérsejtek kitapadása és migrációja, a thrombocyta kitapadás és thrombusképződés közül melyik az elsődleges. A vértelenítésben térdműtött betegeken gyakrabban előforduló trombózisok miatt indított vizsgálatok során nagyobb thromboxanB2 koncentrációkat mértek, és azt találták, hogy már a reperfúzió 5. percétől emelkedés mutatható ki, és ez a venulák trombózisához vezet (106). A thromboxan szint emelkedése már 10 perc vértelenítés után kimatatható (56). Emberi izom capillárisainak endotheljén a sejtek 3-4 százalékában volt kimutatható a capillaris keringés gátját képező ödéma képződés. Ez az arány elég ahhoz, hogy kiterjedt capilláris no-reflow alakuljon ki, hiszen 20-40 endothel sejt határol egy capillarist (30). Egy órás vértelenség után 15 perccel elektronmikroszkóposan kimutatható a capillárisok falának, azaz az endothelnek a megnyílása, mely ödéma képződéshez vezet (74). A szabadgyökök mellett, velük egyidőben keletkeznek a leukotriének, melyek a PMN sejtek aktiválódásáért felelősek. Öt perccel a két óra leszorítás után a keringés károsodott végtag visszereiben és nyirokereiben a fehérvérsejt és thrombocytaszám alig fele a beáramló vér sejtszámainak (49, 55). A mastocyták károsító hatására hívja fel a figyelmet az a tanulmány, ahol 70 perc ischaemia és 24 óra reperfúzió után egészséges egerek izomrostjainak jóval nagyobb hányada károsodott, mint a genetikailag mastocyta hiányos egereké (53). Az in vivo fluorescens mikroszkópos technika bevezetése a mikrocirkuláció tanulmányozásában látványos fejlődést hozott. Láthatóvá lett, hogy elsősorban a postcapillaris venulák falán indul meg az endothelkárosodás, a fehérvérsejtek mozgásának lassulása, kitapadásuk, majd migrációjuk, a capillárisok inhomogenitása, az interstitialis ödéma képződés, de továbbra sem dőlt el, hogy a reperfúziós sérülés során mi az elsődleges kórfolyamat. (27). Hasonló modell arra is lehetőséget adott, hogy a reperfúzió első 48 órájáig megfigyelhető legyen az átjárható kapillárisok aránya. Patkány gracilis izmon 4 óra keringészavar után a reperfúzió első 8 órájáig nőtt
13
az elzáródott kapillárisok aránya és ezzel egyenes arányban az elhalt izomzat nagysága, ami ekkorra érte el a 100 %-t (75). Az izomzat károsodása sokféle paraméterrel jellemezhető. Eredeti funkciója, a kontrakcióképessége nagyon sok összetevő függvénye. A mikrokeringés mellett az izomzat energiaraktárainak feltöltöttsége és az energia felhasználási képessége, az izomrostok épsége, neuromuscularis junctio (NMJ), a motoros idegrost szerkezeti és működési integritása külön-külön, vagy akár egymással kölcsönhatásban befolyásolják a kontrakciók erejét. A reperfúziós sérülés jellemzésére és egyben gyors és lassú izomcsoportok különböző hypoxia tűrőképességének kimutatására a korai reperfúzióban észlelhető tetanusos kontrakciós erő változásokkal először Gardner foglalkozott (29). Fish (25) hasonlította össze 1, 2, 3 és 4 óra leszorítást követően a regeneráció – két hét - utáni kontrakciós erőket. Rácz (80) a gyors (EDL) és lassú (SOL) izomrostok reperfúziós sérülésének sajátosságait vizsgálta. Befolyásolja az izom sérülését és ez által a kontrakciós erő nagyságát a vértelenítésre használt eszköz direkt nyomása, és a nyomás értéke is (68). A prekondicionálás nem bizonyult egyértelműen védőhatásúnak az ischaemia hatására bekövetkező haemodinamikai változásokat és az izomkontrakciós erő csökkenést illetően, de az is nyilvánvalóvá vált, hogy az izomzat és a neuromuscularis junctio különbözően reagál az ischaemiára (2, 24, 34, 43, 97, 104). Gyulladásos
környezetben
bekövetkező
ischaemia-reperfúziós
sérülés
hatását
tudomásom szerint még nem tanulmányozták. A gyulladáskor észlelt jelenségek, a vazodilatáció, az endothel permeábilitás fokozódás, és a PMN sejtek kitapadása és migrációjuk fokozódása a szenzoros idegek retrográd ingerlésével is kiváltható. Ezt a jelenséget nevezzük neurogén gyulladásnak (7). A hő, fájdalom és kémiai ingerek hatására az érzővégkészülékeken nem csak afferens elektromos
impulzusok
keletkeznek,
hanem
azzal
egyidőben
neuropeptidek
választódnak ki, melyek az idegvégződés mikrokörnyezetében effektor működésszerűen a kis erek tonusát, permeábilitását, a fehérvérsejtek működését szabályozzák. A sensoros idegvégződésekben a CGRP, a substance P, a neurokinin A, a somatostatin és a VIP együtt található meg (54, 87). A mytogen hatásukkal sebgyógyulásban is szerepet játszó Neurokinin A és B, valamint a Somatostatin mintegy 50 % os érellenállás csökkentésre képes (99). Az arteriolák vasodilatációjában a CGRP a leghatékonyabb. A substance P a nagyobb arteriolákat tágítja, a CGRP hatását fokozza, a thrombocyták és a leukocyták kitapadását okozza a venulákban (73). A szenzoros idegek neuroendokrin 14
működésekor, vagy retrográd ingerlés következtében a neuropeptidek hatására jönnek létre a neurogén gyulladásra jellemző jelenségek. Ezek a kettős működésű idegrostok a peptiderg rostok (44, 92, 93). A neuropeptideknek az izomzat keringésének szabályozásában, nyugalmi állapotban, munkavégzés közben és a reperfúziós sérülés kapcsán egyaránt fontos szerepük van. (96, 102). Az oxigénhiány a peptiderg idegrostoknak ugyanúgy ingere, mint a hő és fájdalom. A reaktív hyperaemiában a CGRP szerepe nem egyértelmű (28), de az izomműködés hatására kialakuló értágulatért a CGRP a felelős (102). A vasoactive intestinal peptide (VIP) képes akár a 4 órás ischaemia szabadgyökképző és izomerő erő vesztés hatását kivédeni (100). A CGRP a perifériás idegek axon terminálisában van jelen. A neurogén gyulladás minden tünete kivédhető, a neuropeptidek hatásai felfüggeszthetőek a kapszaicin általános, vagy helyi adásával, a szelektív deafferentációval (44, 45, 92, 93). Ennek alapján feltételeztük, hogy a szelektív deafferentáció, a gyulladás neurogen komponenseinek kikapcsolása a reperfúziós sérülésre is hatással lesz. A kapszaicinnek jelen tudásunk szerint a motoneuronok működésére nincs közvetlen hatása (26). A klinikai tanulmányok a vértelenítés idegműködési zavart okozó hatását először a mandzsetta direkt nyomására vezették vissza (82, 83). Önkéntes egészséges embereken felkarra vagy alkarra helyezett mandzsettával fél óránál rövidebb ischaemiát létrehozva akciós potenciál (AP) amplitúdó és a nervus medianus lefutása mentén különböző mértékű de a leszorítás idejével közel azonos idő alatt elmúló idegvezetési sebesség csökkenést mutattak ki. A gyorsan múló károsodást a rövid leszorítási idővel, az ideg lefutása mentén észlelt különböző vezetési csökkenés változásokat a rostszerkezet (a Ranvier féle befűződések távolságának) egyenetlenségével magyarázták (35, 60). Ischaemizált patkány EDL izmán 50 perc után sikerült NMJ átvezetési zavart kimutatni úgy, hogy a n. ischiadicus vezetési sebessége, és az EDL izom direkt izomhasról történő ingerelhetősége még kifogástalan volt (39). Hypothermiával az egy óránál hosszabb ischaemia vezetési sebesség és AP amplitúdó csökkentő hatását sikeresebben lehet kivédeni az ischaemia, mint a reperfúzió alatti hűtéssel (67). Emberen, önkénteseken 20 perces felkarvértelenség után a n. medianuson 25 %-ra csökkent sensoros AP amplitúdót, 110 %-ra nyúlt sensoros AP latenciát, 160 % -ra megnyúlt sensoros AP tartamot írtak le, ami egy órán belül normalizálódott. Ugyanezen kísérletben a n. ulnaris motoros latenciája érdemben nem változott (40). A késői reperfúzióban történő elektrofiziológiai elváltozásokkal kevesebb kutató foglalkozott. A különböző nyomással (200, 300, 400 Hgmm) és különböző ideig (1, 2, 15
3 h) fenntartott alsó végtagi vértelenség elektrofiziológiai hatását patkányon 6 héten át követték (71). Azt találták, hogy a combra helyezett mandzsettától proximalisan ingerelve a lábszárizmokat elektromos működés a nagyobb mandzsettanyomástól hamarabb leáll (55, 35, 15 perc). Az elektrofiziológiai javulás lassabb, mint a klinikai. Míg az állatok négy hét után a végtaghasználatukban gyógyultnak látszottak, hat hét után is kimutathatóak a spontán denervációs potenciálok és az izmok akciós potenciáljainak károsodása. A két órás és egy órás vértelenség hatása közti különbség szignifikánsan nagyobb volt, mint a kisebb és nagyobb nyomások hatásai közti különbség. Az interleukinok gyulladásos folyamatokban betöltött szerepét, egymásra és a gyulladásos reakcióra való hatását mintegy 20 éve vizsgálják. Műtéti vagy más szöveti sérülés kapcsán az IL-1β, a TNF-α és az IL-6 kerültek a vizsgálatok középpontjába. Előbbiek okozzák a catecholamin és a prosztaglandin szint emelkedést, a lázat, a szív frekvencia fokozódását, míg az IL-6- az acut fázis fehérjék szintézisét indítja meg a májban. Az IL-6 az IL-1β és a TNF-α hatására termelődik a fibroblastokból, kerato-, és monocytákból és az endothel sejtekből (4). Az IL-6 két órával a szöveti sérülés után már megjelenik, és mennyisége arányos a végzett műtét, vagy elszenvedett sérülés kapcsán keletkezett szövetkárosodással (3). Ha 24 óra alatt nem csökken a szintje, akkor dinamikája minden más tünet, vagy paraméternél jobban és előre mutatja az esetleg bekövetkező szövődményt. (9, 22). Az IL-8 képződését az IL-1 vagy a TNF-α indítja be. Az IL-8 a PMN sejtek hatékony aktivátora, de emellett számtalan más életés kórélattani hatása ismert. Előbbiek: haematopoesis, angiogenesis, utóbbiak: mitogén hatás, szabadgyök képzés, nitrogén oxid (NO) felszabadítás, sejtfelszíni adhéziós molekulák képzése. Az osteoblastok működését közvetlen módon gátolja. Reumás gyulladásban, osteoarthritisben, psoriasisban, csont-izületi gyulladásokban, tápcsatorna gyulladásos kórképeiben az IL-8 szintje magas. A többek között a PMN sejtekben termelődő IL-10 a sejtes immunválaszt fékezi, és általában felülvezérli, gátolja a citokinek termelését. Az IL-10 nagy mennyiségben van jelen a törési, vagy más szöveti haematomákban míg az érpályában akár normális lehet a szintje (38). Súlyos sérülések után amennyiben a szérumszintje nem emelkedik, szeptikus szövődmény, több szervi elégtelenség várható (50). Az IL-12 elsősorban monocytákban termelődik, a T sejtek és a killer sejtek proliferációját és aktivitását okozza, elősegíti az interferon termelést, és gátolja az IgE
16
szintézist. Kiterjedt égési sérüléseknél a másodlagos fertőzések kivédésében bizonyított szerepe van (76). Két óra kétoldali alsóvégtagi ischaemia sertésen szisztémás tüneteket okoz. Ezek: a szérum IL-6 szintjének emelkedése, phagocyta kitapadás, fokozódó folyadéktartalom a tüdőinterstíciumban és az ebből következő romló gázcsere (36). Átlag 40 perces hasi aorta kirekesztéssel járó aneurysma műtéteken átesett betegeknél a kirekesztés után 12 órával mérték a legmagasabb IL-6 szintet és ehhez már mindig társult kimutatható ventillációs zavar is (3). Emberen térdműtétek közben alkalmazott átlag 2 órás vértelenítés felengedése után az operált végtagból és a szisztémás vénás vérmintából H2O2, xantin és xantin oxidáz, glutathion és szérum-húgysav vizsgálatakor azt kapták, hogy míg a szisztémás keringésben nem észlelhető szintváltozás, a helyi vénás vérben a reperfúzió első 10-15 percében minden vizsgált anyag szintje szignifikánsan magasabb, amely emelkedés a reperfúzió 30-ik percéig mutatható ki (62). Természetesen nemcsak nemzetközi kutatócsoportok értek el eredményeket a végtag ischaemia–reperfúziós sérülésének tanulmányozásában, hanem jelentős eredmények születtek magyar kutatók munkái nyomán is: Józsa két órás vértelenségi idővel járó kéz műtétek közben végzett izombiopsiák során mérséklet interstitialis ödémát és endothel sejt duzzanatot írt le, míg az izomrostokon, a szinapszisokban és a motoros idegroston nem talált érdemi elváltozást (47). Rácz és munkacsoportja a különböző típusú izomrostok ischaemia toleranciáját hasonlította össze (80). Tömböl és munkatársaik vizsgálták először a NMJ szerkezetének változását a reperfúziós sérülésben (97). Németh és munkatársai a prekondicionálás hatását vizsgálták a reperfúziós során állatkísérletben (70), míg Szokoly és munkacsoportja a hűtés hatását kutatta az ischaemia reperfúziós sérülésben (91).
17
Célkitűzések Célunk az volt, hogy meghatározzuk: 1. A vázizomzatot ért károsodás nagyságát az izom kontrakciós erejének mérésével jellemezve milyen hosszú az a vértelenítés, amelyet az egyébként egészséges patkány extensor digitorum longus (EDL) izma már szignifikáns, de gyorsan múló károsodással vészel át? 2. A szelektív deafferentálás (a neuropeptidek hiányának) hatására megváltozik-e a két óránál nem hosszabb ischaemiát követő reperfúziós szöveti sérülés patkány EDL izmán? 3. A kombinált szöveti sérülésben, a gyulladás, az ischaemia és a szelektív deafferentáció hatásai hogyan kombinálódnak? 4. Van-e kimutatható hatása a két óránál rövidebb vértelenítéssel, kis szövetkárosítással járó műtétek közben bekövetkező szöveti sérülésnek a perifériás ideg működésében, illetve a polimorfnukleáris sejtek és a gyulladásos mediátorok aktiválódásában?
18
Anyag és módszerek 1. 1 Ischaemia modell Állatkísérleteinkhez átlag 300 g-s hím Wistar patkányokat használtunk. A kísérletek minden fázisát 35 mg/kg Pentobarbital i.p. anaesthesiában végeztük. Az állatokat speciális, a mérés céljára kifejlesztett temperált padon a hátukra fektettük (Experimetria KFT, Budapest). A fél, egy és két órát tartó vértelenítést a combtőre felhelyezett standard gumigyűrűvel értük el, melyet korábbi kísérleteink során dolgoztunk ki. (Rácz 1997). A vértelenítés nyomása a gumigyűrű elaszticitásából és átmérőjéből volt számítható. Az állatok méretei és a felhelyezés különbözőségéből adóan 300 és 400 Hgmm között változott. A méréseket 1 óra illetve 1, 3 és 7 nap reperfúzió után végeztük. 1. 2. Izomkontrakció mérés A nervus ischiadicust a comb tövében 1 cm-s bőrmetszésből kipreparáltuk és bipoláris elektródára tettük. Így alkalmaztuk az indirekt ingerlést. A lábszár középső harmadában az EDL izmot 2 cm-s metszésből kipreparáltuk és az izomhas közepére bipoláris elektródát helyeztünk a direkt ingerlés céljából. A lábháton a bőrt eltávolítottuk, a retinaculum extensorumtól distálisan kipreparáltuk az EDL inát és azt erőmérőhöz rögzítettük (FSG01-típus, Experimetria Kft, Budapest). Az erőmérőt minden mérés előtt kalibráltuk. Az előkíséreltek során meghatározott 20 g előfeszítést alkalmaztunk, hogy az izom eredeti nyugalmi feszülésének megfelelő helyzetben legyen. Az ingerlés paraméterei a következők voltak: frekvencia: 75 Hz, áramerősség: 9 mA, impulzus szélesség: 1 ms, TRD: 3 s. Ezek a paraméterek a kétszeres rheobasisnak feleltek meg és supramaximális erősségűek voltak. Direkt és indirekt ingerlést egyaránt alkalmaztunk. Izometriás tetanusos kontrakciókat mértünk, mindkét oldalon mindkét ingerlés fajtából ötöt-ötöt. A regisztrátumot számítógépes program segítségével rögzítettük és értékeltük (Experimetria Kft. Isosys software). A károsított oldal erejét mindig a károsodást nem mutató másik oldal erejéhez viszonyítottuk. (1. 1. 1. ábra)
19
kontrakciós erő gramban
1. 1. 1. ábra Patkány EDL izom kontrakciós-erő regisztrátum 1 óra ischaemia és 72 óra reperfúzió után indirekt ingerléskor
100 80 60 40 20 0
kezelt, bal oldal kezeletlen, jobb oldal
1
1200 2399 3598 4797 5996 7195 8394 9593 ingerlés 3 másodpercenként
1. 1. 1. ábra: izometriás tetanuszos kontrakció regisztrátum-képe. A kezeletlen jobb és a kezelt bal oldalról egyidőben készítve (Isosys Software, Experimetria) egy óra I és 72 óra R után indirekt ingerléskor 20 g-os előfeszítést alkalmazva.
2. 1. Szelektív deafferentálás A peptiderg rostok kikapcsolása céljából feltártuk a kezelt, bal alsó végtag n. ischiadicusát a comb tövében és kapszaicin 1% s oldatával átitatott 10 x 10 x 5 mm-s spongostan szivacsot helyeztünk köré fél óra időtartamra (Jancsó 1967). 30 perc után a sebet kiöblítettük és zártuk. A további kísérleteket egy hét elteltével végeztük. 2. 2. Izomkontrakció mérés szelektív deafferentálás után A vértelenítés és a reperfúziós idők azonosak voltak az 1. 1. pontban leírtakkal, az izomkontrakciós erő mérése pedig az 1. 2. pontokban leírtak szerint történt. Az 1. és 2. csoportban 6-6 állaton, 5-5 mérést végeztünk.
3. Indukált gyulladásos és reperfúziós szöveti sérülés együttes hatásának vizsgálata szelektív deafferentáció után 3. 1. Gyulladás indukció és kontrakciós-erő mérés A gyulladást a bal lábszár középső harmadának elülső felszínén a bőr alá (nem izomba) fecskendezett 0,25 ml/kg terpentin (Budalakk) oldattal provokáltuk. A terpentin dózisát és beadásának idejét egyrészt irodalmi adatokból másrészt előkísérletek során határoztuk meg (Urban 1979, Baumgartner 1982). Amennyiben ezt deafferentálással kombináltuk akkor azt a 2. pontban leírtak szerint egy héttel korábban elvégeztük.
20
Deafferentációval és ischaemiával kombinálva a kapszaicin kezelés egy héttel korábban, a leszorítás pedig közvetlen a terpentin befecskendezése után történt. Fél, illetve 2 órás leszorítás után 6, 24. 72, 168 órával mértük az 1. 2. pontban leírtak szerint az izomkontrakció nagyságát. Mivel itt a nem kezelt oldalon is észleltünk kontrakcióserő csökkenést, ezért minden mérési eredményt a semmilyen kezelést nem kapott kontroll állatok adataihoz hasonlítottunk. 3. 2. Fénymikroszkópos szövettani vizsgálatok A 3. 1. pontban leírt mérések után az EDL izmot 4 %-s pufferolt formaldehid oldatban fixáltuk, haematoxillin-eosinnal festettük, és 40 x-s nagyítás mellett értékeltük az elváltozásokat. Az észlelt elváltozásokat súlyosságuk szerint három fokozatra osztottuk. Ezek leírása az eredmények fejezetben található. 4.
A
NMJ
elektronmikroszkópos
szerkezetének
vizsgálata
ischaemia
és
deafferentációt követő ischaemia után A NMJ szerkezetét a 6 kontroll, 6 csak kapszaicinnel kezelt és a különböző ischaemiareperfúziós kategóriákban 3-3 állaton vizsgáltuk. Az állatok alsó végtagjait az aortán keresztül előbb 100 ml fiziológiás sóval, majd 200 ml jéghideg 4 % paraforlmaldehid és 2,5 % -s glutáraldehyd 0,1 M Nátrium-foszfát puffer (pH 7,4) oldatával perfundáltuk. A kivett mintákat további 24 óráig a perfúzióhoz használt oldatban, négy fokon, majd a továbbiakban, a végleges feldolgozásig
0,1
M
Nátrium-foszfát
pufferben
mínusz
18
o
C-n
tároltuk.
Fénymikroszkópos feldolgozással választottuk ki a NMJ-ban gazdag területeket és abból 0,02 mm vastag darabokat szeltünk, amiket további 2 óráig 4°C -n 1% -s OsO4 – ban posztfixáltunk, dehidráltunk, majd
Durcupan-ba ágyaztunk. A keletkezett
blokkokból 0,5 μm vékony szeleteket készítettünk. A NMJ struktúráját 12000 x nagyítás mellett értékeltük. Az értékelés szempontjai a következők voltak: (i) a szinaptikus gödör térfogatát milyen arányban tölti ki a Schwann sejt, (ii) a postszinaptikus és a preszinaptikus membrán felszínek hogyan aránylanak egymáshoz. A számításokat a következők szerint végeztük: (i) a szinaptikus gödör térfogatát az axon-terminalis térfogata (Vax) és a Schwann sejt térfogata adta (VSch). A Schwann sejt relatív térfoglalását [R(V)Sch ] a következő képlet szerint kaptuk: R(V)Sch = VSch / (VSch+ Vax).
(ii) a poszt- és
preszinaptikus felszínek arányát [R(S)pp] a következők szerint határozzuk meg: A 21
szinaptikus gödör alakja a kezelések hatására nem változott, így a posztszinaptikus membrán felszínét (Spost), a vele szembenéző, de tőle eltávolodott axonterminalis Schwann sejt által le nem fedett membránfelszínhez (Svirt) hasonlítottuk (R(S)pp = Spost/Svirt). 1. 1. 2. ábra) Ezeket a háromdimenziós paramétereket az erre kifejlesztett pontszámlálós és rácsvonal technikákkal határoztuk meg (Gundersen 1988).
pre
virt Sch
Sch
m
m AT
V
AT
s v
V
AT
post
a
post
b
1. 1. 2. ábra. Vázlatos rajz az egészséges (a), és az ischaemia reperfúzió hatására megváltozott szinapszisról (b). AT: axon terminális (fehér), Sch: Schwann sejt (szürke), V: vacuolum, SV: szinaptikus vesiculum, m: mitokondrium, post: posztszinaptikus membrán, pre: preszinaptikus membrán, virt: a posztszinaptikus felszínnel szemben fekvő Schwann sejt által le nem fedett membránfelszín
5. Elektrofiziológiai vizsgálatok A vértelenítés okozta ischaemia és nem a vértelenítő mandzsetta nyomásának kimutatható károsító hatását kerestük, ezért a méréseket olyan szakaszon végeztük, amelyek teljes egészükben a leszorító mandzsettától az ujjvégek felé estek. A vizsgálatokba 30-70 perc (átlag 48 perc) közötti felkari vértelenséggel járó elektív műtéteken átesett betegeket vontunk be. A részvétel írásbeli felvilágosítás és beleegyezés után önkéntes volt. A műtéteket a MH KHK Baleseti Sebészeti Osztályán és a HMÖ Egri Markhot Ferenc Kórházának Traumatológiai és Kézsebészeti Osztályán végeztük. A 15 beteg, akiknek átlagéletkora 51 év volt (42-64), kis szövetroncsolással járó műtéteken estek át, melyek aponeurectomia, tendolysis voltak. A vértelenséget általában a szisztolés vérnyomás értékének kétszeresére állítottuk be, átlagértéke 290
22
Hgmm (250-320) volt. A műtéteket axillaris plexus anaesthesiában végeztük. Mértük a nervus ulnaris, és/vagy nervus medianus könyök és csukló közötti vezetési sebességének (NCV) és akciós potenciál (AP) amplitúdójának, és a distális latenciának (DL) változását a vértelenítésben végzett végtagon műtét előtt és utána 2, illetve 30 nappal. A distalis felületi mérő elektróda a hypothenaron illetve a thenaron volt. Az eredményeket számítógépen értékeltük és rögzítettük (Cadwell Sierra EMG/EP, USA, 2001). 6. Klinikai laboratóriumi paraméterek, gyulladásos mediátorok mérése 6. 1. A vizsgálatba bevont betegek Olyan elektív műtéteket választottunk, ahol műtét során izomszövetet nem károsítottunk mechanikusan, a beteg a vizsgálat előtt egy hétig és a vizsgálat alatt gyulladás-gátlót vagy véralvadás-gátlót nem kapott. A beavatkozások: aponeurectomia, tendolysis, partialis synovectomia voltak, melyek az irodalomban elfogadottan a kis szövetkárosító hatású beavatkozások közé tartoznak (Cruickshank 1990). Egyes anaestheticumok, mint a Propofol is rendelkezhetnek antioxidáns hatással (Kahraman 1997, Cheng 2002), ezért csak vezetéses (axillaris) érzéstelenítésben végzett műtéteket vontunk be a vizsgálatba (az anaestheticum dózisa szokványosan 20 ml 1% Lidocain és 20 ml 0,75 %-s Naropin). A műtéteket a HMÖ Egri Markhot Ferenc Kórházának Traumatológiai és Kézsebészeti Osztályán végeztük. Betegeink életkorát, nemét, a műtét okául szolgáló diagnózist és a felkar-vértelenítés idejét az 1. táblázat tartalmazza.
23
beteg kora, neme
diagnózis
vértelenség ideje
58 éves ♂
M. Dupuytren
55
49 éves ♀
M. Dupuytren
60
64 éves ♂
M. Dupuytren
45
47 éves ♂
Contractura digitorum
35
42 éves ♂
Tenosynovitis chr.
35
64 éves ♀
M. Dupuytren
35
59 éves ♂
M. Dupuytren
70
54 éves ♂
Tenosynovitis chr.
70
59 éves ♂
M. Dupuytren
70
1. táblázat. A vérkép, vérgáz, nekroenzim és citokin Koncentráció vizsgálatokba bevont betegeink adatai
A kutatási program megfelelt a vonatkozó Dekrétumoknak, és a Kórházi Etikai Bizottság elvárásainak. A betegek tájokoztatás után írásbeli beleegyezésüket adták a vizsgálatokhoz. 6. 2. A vértelenítés A leszorítást a felkarra helyezett 8 cm széles mandzsettával, a szisztolés vérnyomás kétszeresével idéztük elő. Úgynevezett elevációs vértelenséget használtunk, azaz a mandzsetta felfújása előtt a végtagot 3 percre felemeltük, hogy a vénák spontán kiürüljenek. A vértelenségi időt gondosan mértük. Az átlag vértelenítési idő 53 perc (min: 35, max: 70 perc) volt. A vértelenítő nyomást a szisztolés vérnyomásérték kétszeresére állítottuk be így értéke 250-320 Hgmm között változott. 6. 3. Vérvételek A vértelenítő mandzsetta felfújása előtt közvetlenül és leeresztése után 10 perccel az érintett végtag cubitális, vagy radiális artériájából és cubitális vénájából vettünk vért. 24 és 48 óra után az operált végtag cubitális vénájából ismét vérmintákat vettünk. Vérvételenként 4,5 ml EDTA-s és 7 ml natív vért vettünk le (BD Vacutiner Systems, Plymuth, UK), ezenkívül vérgázanalízishez 2-2 ml (0,5 % -nyi Nátrium-Heparinnal 24
kevert) vérre volt szükség. A vérgázalanalízishez levett vért azonnal légmentesen lezártuk és a méréseket 10 percen belül elvégeztük. A natív vérből a savót lecentrifugáztuk (3000 ford/perc 10 percig) majd 2 x 0,5 ml savót eppendorf csőben mínusz 80oC –ra lefagyasztottunk a flow-citometriás mérésekhez. A többi vizsgálat a vérvételt követő 4 órán belül megtörtént az addig szobahőmérsékleten tárolt vérből. 6. 4. Vizsgált paraméterek vérgázanalízis, vércukor, szérum-Na+, K+, hemoglobin, haematocrit, vörösvértest szám, fehérvérsejt szám, (ezen belül segment-, stab-, granulocyta, monocyta, lymphocyta basophyl-sejt és monocyta szám) thrombocyta szám, C-reaktív protein (CRP), kreatinin-kináz, laktát-dehydrogenáz, szérum glutaminsavoxalecetsav-transzamináz,
szérum
glutaminsav-phosphorsav-transzamináz,
interleukinok (IL-1b, IL-6 IL-8, IL-10, IL-12), TNF-α. 6. 5. Labortechnikai módszerek A vérkép vizsgálatok Sysmex XE 2100 automatán történtek, a minőségi vérképet Romanovszky festés után 100x nagyítás mellett Wescor automatán történő leolvasással határoztuk meg. Kémiai vizsgálatokat Bayer ADVIA 1650 automatán, a vérgáz vizsgálatokat Bayer Rapidlab 865-típusu vérgázanalizátorral végeztük. Az egyes mintákban az IL-1b, IL-6 IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α citokinek koncentrációját multiplex technikával FACS Array (Becton-Dickinson, USA) flowcytométerben (MH EVI) határoztuk meg CBA Human Inflammation Kit (BectonDickinson, USA) felhasználásával. Statisztikai értékelés Az izomkontrakció méréseknél, ahol leszorítást és/vagy deafferentációt alkalmaztunk a statisztikai értékelésnél független változók voltak a kapszaicin előkezelés (0 vagy +) az ischaemia hossza (fél, 1 vagy 2 óra) a reperfúzió időtartama (1 óra és 1, 3, vagy 7 nap), valamint az ingerlés típusa (direkt, vagy indirekt). Függő változó volt a bal (kísérleti) oldali EDL izom kontrakciós ereje a nem kezelt jobb oldali izom erejének százalékában kifejezve. Az indukált gyulladás és ischaemia kombinálásával kapott izomkontrakciós erő eredményeit az átlag
SD (4-4 állat/csoport) alakban jelentettük meg.
A normál 25
eloszlás ellenőrzése után két csoport összehasonlítását Student-féle t-teszttel, míg több csoport összehasonlítását ANOVA és Student-Newman-Keuls módszerrel végeztük. A statisztikai értékelésre a Statistica programot (6.0 verzió Stat-Soft, USA) használtuk variancia analízissel (Anova teszt). Az utólagos hipotézisek vizsgálata (post- hoc tesztként) Tukey HSD teszttel történt. Az indukált gyulladás vizsgálati csoport kivételével az adatokat átlag ± SEM alakban adtuk meg. Amennyiben az adatok nem normál
eloszlásúak
voltak,
akkor
Kruskal
-
Wallis
tesztet
alkalmaztunk
(elektrofiziológiai vizsgálatok). Az elektronmikroszkópos vizsgálatok quantitativ értékelésénél a kontroll csoportban a normál eloszlást a Kolgomorov Smirnov teszttel ellenőriztük. A kezelt és nem kezelt szinapszisokon talált elváltozásokat a Student-féle t-teszttel hasonlítottuk össze. A kapott eredményeket p <0,05 esetén tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
26
Eredmények 1. Izomkontrakció mérés különböző leszorítási idők után A kezelésben nem részesült állatok EDL izmának ereje mindkét oldalon mindkét fajta (direkt és indirekt) ingerléskor 65 g (± 5) volt, a 20 g-os előfeszítési érték felett. Mivel az egyoldali ischaemia az ellenoldalon kontrakciós-erő változást nem okozott a kezelt oldalon mért értékeket az egészséges oldalhoz hasonlítottuk, és százalékban fejeztük ki. 1. 2. 1. Izomerő fél óra ischaemia után Az első 24 órában alig volt mérhető izomerő veszteség az ingerlés módjától függetlenül. 72 óra reperfúzió után találtuk a leggyengébb, szignifikánsan csökkent erőt, az eredetinek 82%-t, míg 168 óra reperfúzió után az izomerő normalizálódott. Az ingerlés módja szerint nem volt különbség a csoportok között (1. 2. 1. ábra). 1. 2. 1. ábra. Izom erő az ellenoldalhoz képest fél óra leszorítás után 100
*
% ± SEM
80 60
indirekt ingerlés
40
direkt ingerlés
20 0 1 óra
1 nap
3 nap
7 nap
reperfúziós idő
1. 2. 1. ábra. Az EDL izom kontrakciós ereje az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) fél óra tourniquet ischaemia valamint 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió után Szürkecsíkos oszlop: indirekt ingerlés Feketepöttyös oszlop: direkt ingerlés * : szignifikáns különbség az ép és a kezelt oldal között (p <0,05)
1. 2. 2. Izomerő egy óra ischaemia után Minden reperfúziós időben mindkét ingerléssel szignifikáns izomerő csökkenés mérhető. Egy óra illetve 3 nap után az indirekt ingerlésre szignifikánsan kisebb erő mérhető.
A csökkenés a 3. napig kimutatható, a legalacsonyabb érték indirekt
ingerléssel 32 %, direkt ingerléssel 51 % százalék. A 7. napon már javuló érték mérhető, de a regeneráció még tovább tart (1. 2. 2. ábra).
27
1. 2. 2. ábra. Izom erő az ellenoldalhoz képest egy óra leszorítás után 100
#*
% ± SEM
80
#*
*
*
60
indirekt ingerlés direkt ingerlés
40 20 0 1 óra
1 nap
3 nap
7 nap
reperfúziós idő
1. 2. 2. sz. ábra. AZ EDL izom kontrakciós ereje az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) egy óra ischaemia után 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió elteltével Szürkecsíkos oszlop: indirekt ingerlés Feketepöttyös oszlop: direkt ingerlés * : szignifikáns különbség az ép és a kontroll érték között (p <0,05) # : szignifikáns különbség a kétféle ingerlés móddal kapott érték között (p <0,05)
1. 2. 3. Izomerő két óra ischaemia után Indirekt ingerléssel egyik időpontban sem volt mérhető kontrakció. Direkt ingerléskor a négy mérési időben 6 %, 11 %, 16%, 11 %, volt a kimutatható kontrakciós erő. Ez statisztikailag szignifikánsan több volt, mint az idegről történt ingerléskor kapott érték (1. 2. 3. ábra). A regeneráció még 4 hét után sem volt teljes (Rácz 1997). 1. 2. 3. ábra. Izom erő az ellenoldalhoz képest két óra leszorítás után 100
% ± SEM
80 60 40
# #
indirekt ingerlés
#
#
direkt ingerlés
20 0 1 óra
1 nap
3 nap
7 nap
reperfúziós idő
1. 2. 3. sz. ábra. Az EDL izom kontrakciós ereje az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) két óra ischaemia után 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúziós időkben Szürkecsíkos oszlop: indirekt ingerlés Feketepöttyös oszlop: direkt ingerlés # : szignifikáns különbség a kétféle ingerlés móddal kapott érték között (p <0,05)
28
2. Izomerő szelektív deafferentáció és különböző leszorítási idők után A n. ischiadicus kapszaicines előkezelése önmagában nem volt hatással az EDL izom kontrakciós erejére. Ezeket a mérési adatokat nem tüntettük fel. A szelektíven deafferentált izom a vértelenítés különböző időtartamára nem egyformán reagált. Az ép, ellenoldalon nem észleltünk kontrakciós erő változást, ezért a kezelt oldal erejét az egészséges oldalhoz viszonyítottuk és az eredményt százalékban adtuk meg. 2. 1. Izomerő deafferentáció és fél óra vértelenség után Az 1 óra, 3 és 7 nap reperfúzió után lényegében ugyanolyan kontrakciós erőt mutatott a szelektíven deafferentált EDL izom, mint az egyébként ép szenzoros rostokkal bíró. Szignifikáns különbség egyedül az egy nap reperfúziónál mutatkozik, ahol az indirekt ingerlésnél a kapszaicin kezelés védőhatásúnak bizonyul. (2. 1. 1. és 2. 1. 2. ábra)
2. 1. 1. ábra EDL iz om kontrakciós e re je de affe re ntáció é s fé l óra vé rte le nsé g után dire kt inge rlé sse l
2. 1. 2. ábra EDL iz om kontrakciós e re je de affe re ntáció é s fé l óra vé rte le nsé g után indire kt inge rlé sse l
* 100
100 80
kapszaicin 0
60
kapszaicin +
40 20
% ± SEM
% ± SEM
80
kapszaicin 0
60
kapszaicin +
40 20
0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap reperfúziós idő
0 1 óra
1 nap
3 nap
7 nap
reperfúziós idő
2. 1. 1. és a 2. 1. 2. sz. ábrák. Az EDL izom kontrakciós ereje direkt ingerléskor az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) előzetes deafferentálás és fél óra tourniquet ischaemiát követően 1 órával, illetve 1, 3 és 7 nappal Fekete csíkos oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Pepita mintás oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) Kitöltött fekete oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Fekete-fehér rácsos oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) * : szignifikáns különbség a kapszaicinnel kezelt és nem kezelt csoport között (p <0,05)
29
2. 2. Izomerő deafferentáció és egy óra vértelenség után A kapszaicinnel kezelt csoportban direkt ingerléskor 3 és 7 nap reperfúzió után, indirekt ingerléskor 1 és 7 nap reperfúzió után mintegy 30 % -al gyengébb volt a kontrakciós erő, mint a nem kezelt csoportban. (2. 2. 1. és 2. 2. 2. ábra)
2. 2. 2. ábra EDL iz om kontrakciós e re je de affe rntáció és e gy óra vé rte le nsé g után indire kt inge rlé sse l
100
100
80
80
60
*
40
*
20
kapszaicin 0 kapszaicin +
% ± SEM
% ± SEM
2.2.1.ábra EDL iz om kontrakciós e re je de affe re ntáció é s e gy óra vé rte le nsé g után dire kt inge rlé sse l
60
*
40
*
kapszaicin 0 kapszaicin +
20
0
0
1 óra
1 nap
3 nap
7 nap
1 óra
reperfúziós idő
1 nap
3 nap
7 nap
reperfúziós idő
2. 2. 1. és 2. 2. 2. sz. ábrák. EDL izom kontrakciós ereje indirekt ingerléskor az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) előzetes deafferentálás és egy óra tourniquet ischaemia, valamint 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió után Fekete csíkos oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Pepita mintás oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) Kitöltött fekete oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Fekete-fehér rácsos oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) * : szignifikáns különbség a kapszaicinnel kezelt és nem kezelt csoport között (p <0,05)
2. 3. Izomerő deafferentáció és két óra vértelenség után A deafferentált izom ereje mindkét ingerlési mód alkalmazásakor szignifikánsan több volt, mint ép szenzoros rostok mellett. Direkt ingerléskor az 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió után az ép oldal erejéhez viszonyítva: 22%, 15%, 28%, 38 %, illetve indirekt ingerekre: 24%, 16%, 14%, 35% (2. 3. 1. és 2. 3. 2. ábra).
30
2.3.1. ábra EDL iz om kontrakciós e re je de affe re ntáció és ké t óra vé rte le nsé g után dire kt inge rlé sse l
2.3.2. ábra EDL iz om kontrakciós e re je de affe re ntáció és ké t óra vé rte le nsé g után indire kt inge rlé sse l
100
100 80 kapszaicin 0
60
*
40
*
*
% ± SEM
% ± SEM
80
kapszaicin +
20
60 40
*
*
*
*
kapszaicin 0 kapszaicin +
20
0
0 1 óra 1 nap 3 nap 7 nap
1 óra 1 nap 3 nap 7 nap
reperfúziós idő
reperfúziós idő
2. 3. 1. és 2. 3. 2. sz. ábrák. Az EDL izom kontrakciós ereje indirekt ingerléskor az ellenoldali, ép izom erejének százalékában (± SEM) előzetes deafferentálás és két óra tourniquet ischaemia után 1 óra, 1, 3 és 7 nap reperfúzió elteltével Fekete csíkos oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Pepita mintás oszlop: direkt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) Kitöltött fekete oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés nélkül (kapszaicin 0) Fekete-fehér rácsos oszlop: indirekt ingerlés kapszaicin kezelés után (kapszaicin +) * : szignifikáns különbség a kapszaicinnel kezelt és nem kezelt csoport között (p <0,05)
3. Indukált gyulladás és deafferentáció hatása a reperfúziós sérülésre A gyulladás indukcióra használt terpentin beadásának helyén bőrelhalást sehol nem észleltünk.
Szabad
szemmel,
a
fénymikroszkópos
elváltozásokkal
arányos
makroszkópos elváltozásokat találtunk: enyhébb esetben vizenyős szöveteket, középsúlyosnál törékenységet, szakadékonyságot, a legsúlyosabb elváltozásoknál a bőr és az izom között tályogüreget. Szabad szemmel az ellenoldali lábszáron elváltozást nem láttunk. 3. 1. A szövettani elváltozások kategóriái 3. 1. 1. Egészséges izomroston szabályos rostszerkezet, jól látható harántcsíkolat. Az rostok szélén az ellapult magok intenzíven festődnek (3. 1. 1. ábra). 3. 1. 2. Enyhe eltérések: változó mértékű pangásos elváltozások mellett rendszertelenül figyelhetők meg duzzadt, halványan festődő, harántcsíkolatot vesztett izomrostok (3. 1. 2. ábra).
31
3. 1. 3. Közepes fokú degenerációs jelek: az izomrostok többsége duzzadt, halványan festődő, harántcsíkolatát elvesztette. A helyenként még jól festődő rostokban is vacuolumok és magcentralizáció jelent meg (3. 1. 3. ábra). 3. 1. 4. Súlyos elváltozások: az izom harántcsíkolata eltűnt, a rostok halványan festődnek duzzadtak. A felszín közelében bevérzés és gyulladásos beszűrődés, eltakarítási reakció látható. Helyenként az izomrostok is eltűntek, magtörmelék és gyulladásos elemek láthatók, a rostok között sejtdús kötőszövet jelent meg (3. 1. 4. ábra).
3. 1. 1. ábra. Egészséges EDL izom képe Magyarázat a szövegben.
3. 1. 3. ábra. Közepes fokú degenerációs jelek EDL izmon. Magyarázat a szövegben.
3. 1. 2. ábra. Enyhe elváltozások az EDL izmon. Magyarázat a szövegben.
3. 1. 4. ábra. Súlyos degeneráció az EDL izmon. Magyarázat a szövegben.
3. 2. Szövettani eltérések a különböző ideig leszorított csoportokban Fél óra leszorítás és egyidejű 0,25 ml/kg terpentin beadás után 6, 24, 72 órával a mindkét végtagon enyhe degeneratív elváltozások találhatók az EDL izomzatában. 168
32
óra elteltével minden állaton a kezeletlen jobb oldalon enyhe, míg a kezelt bal oldalon 2 állaton enyhe, 2 állaton közepes fokú degeneráció jelent meg (2. táblázat). Reperfúziós idő 6 óra
enyhe
Enyhe
enyhe
enyhe
24 óra
enyhe
Enyhe
enyhe
enyhe
72 óra
enyhe
Enyhe
enyhe
enyhe
168 óra
enyhe
Enyhe
közepes
közepes
2. táblázat. Kapszaicin és terpentin + ½ óra iszkémia hatására kialakult szövettani elváltozások súlyosságuk szerint a kezelt bal oldalon, 4 állaton A nem kezelt jobb oldalon minden, állaton minden reperfúziós időben enyhe elváltozások voltak.
Két óra leszorítás és egyidejű 0,25 ml/kg terpentin beadás után 6, 24 órával a mindkét végtagon enyhe degeneratív elváltozások találhatók az EDL izomzatában. 72 óra után minden állaton a kezeletlen jobb oldalon enyhe, míg a kezelt bal oldalon közepes fokú degeneráció látható. 168 óra elteltével a kezeletlen jobb oldalon minden állaton enyhe, míg a kezelt bal oldalon 2 állaton közepes, 2 állaton súlyos fokú a degeneráció (3. táblázat). Reperfúziós idő 6 óra
enyhe
Enyhe
enyhe
enyhe
24 óra
enyhe
Enyhe
enyhe
enyhe
72 óra
közepes
közepes
közepes
közepes
168 óra
közepes
közepes
súlyos
súlyos
3. táblázat Kapszaicin és terpentin + 2 óra iszkémia hatására kialakult szövettani elváltozások súlyosságuk szerint a kezelt bal oldalon, 4 állaton. A nem kezelt jobb oldalon minden állaton, minden reperfúziós időben enyhe elváltozások voltak.
Az izomrostok fénymikroszkóppal kimutatható degenerációs jelei nem mutattak szoros korrelációt az izomerő változással. Míg enyhe fokú elváltozás minden kezelést kapott állaton észlelhető volt mindkét oldalon, a súlyosabb degenerációs jelek mindig az 50 %, vagy annál is nagyobb erővesztést mutató rostokon voltak láthatóak. A kb. 50 %
33
erőveszteségig a rostok szerkezetében - az általunk észlelt kategóriák szerint - hol az enyhe, hol a közepes fokú degeneratív elváltozások voltak jelen. 3. 4. Kontrakciós erő mérések EDL izmon indukált gyulladásos környezetben Kezelések nélkül a direkt és indirekt ingerléssel mindkét oldalon egyaránt 81 ± 5 g kontrakciós erőket kaptunk a nyugalmi 20 g-os előfeszítési értékkel együtt. 3. 4. 1. Izomerő a szelektív deafferentációt követő fél órás leszorítás és ezzel egyidejű terpentinnel provokált gyulladás után 6 óra elteltével a kezelt (bal) oldalon indirekt ingerléssel 60 %-ra csökkent a kontrakciós erő, míg a direkt ingerléssel normális marad. A jobb oldalon a kétféle ingerléskor az izomerő teljes maradt. A szövettani képen mindkét oldalon enyhe degenerációs jeleket látni. 24 óra után a kezelt oldalon az ideg ingerlésével kiváltott kontrakció változatlanul 60 % a kontrol értéknek, a direkt ingerlésre a kontrakció csökken de ez még nem szignifikáns. A jobb oldalon mindkét ingerlési móddal szignifikáns 60 %-ra csökkenő izomerőt találtunk. A jobb és bal oldal között a különbség nem volt szignifikáns. A szövettani eltérések mindkét oldalon enyhe fokúak. 72 óra elteltével 60 % körüli a kontrakciós erő mindkét oldalon mindkét fajta ingerlés hatására. A szövettani kép ekkor is enyhe degenerációt mutat. A gyulladásprovokáció és fél órás iszkémia után 168 órával a kezeletlen jobb oldal izomereje újra normális, míg a kezelt oldalé indirekt ingerléssel 25 %, direkt ingerléssel 50 % (3. 4. 1. ábra). A szövettani kép a kezelt oldalon közepes degenerációt, a kezeletlenen enyhe degenerációt mutat. 3. 4. 2. Izomerő a szelektív deafferentációt követő 2 órás leszorítás és ezzel egyidejű terpentinnel provokált gyulladás után A kezeletlen jobb oldalon az izomerő a 6 és 24 óra után még normális, reperfúzió 72. órájában a legalacsonyabb, 60 % -s és a 168. órában újra 100 %. Ez a kezeletlen jobb oldalon mérhető kontrakció erő változás a reperfúziós idő függvényében és mértékében hasonló volt a fél órás leszorítás után talált elváltozásokhoz. Abban sincs különbség, hogy a nem kezelt végtagon a szövettani vizsgálat az izomrostokon minden alcsoportban enyhe degeneratív jeleket mutatott.
34
A kezelt bal oldalon indirekt ingerrel egyik vizsgált reperfúziós időben sem provokálható kontrakció, míg direkt ingerléskor fokozatosan csökken: 6 óra reperfúzió után 80 %, 24 óra után alig 50 % az izomerő és a 72, és 168 órás méréskor 40-40 % (3. 4. 2. ábra). A bal oldalon 6 és 24óra után még enyhe, 72 óra után közepes 168 óra után közepes/súlyos izomrost degenerációs jelek voltak.
35
EDL izom kontrakciós ereje deafferentáció és 0,25 m l/kg terpentin + 0,5 h isch után
#
gramm
100
*
* *
50
0
#
*
** * *
*
*
kontroll
6 óra
24 óra
72 óra
168 óra
ij
82
77
62
57
76
dj
81
85
67
58
77
ib
83
50
51
42
18
db
81
82
74
51
42
3. 4. 1. ábra
gramm
EDL izom kontrakciós ereje deafferentáció és 0,25 ml/kg terpentin + 2 h isch után
100
#
80
* *
#
60
*
40
#
* *
* *
*
20 0
kontroll
6 óra
24 óra
72 óra
168 óra
ij
82
82
80
60
78
dj
81
78
70
56
81
ib
83
0
2
0
4
db
81
64
37
30
29
3. 4. 2. ábra 3. 4. 1. és 3. 4. 2. ábrák. Az extensor digitorum longus izom izometriás kontrakciós ereje grammban kifejezve oszlopdiagramban (± SD) a kezelést nem kapott kontrollcsoporton illetve a kapszaicines deafferentáció, terpentines gyulladásprovokáció és fél óra combtővértelenítés után 6, 24, 72 és 168 órával. Az adattáblázatban a pontos számszerű értékek láthatók. Jelmagyarázat: ij = jobb oldalon indirekt ingerlés - nervus ischiadicusról - fekete pöttyös oszlop fehér háttérrel dj = jobb oldalon direkt ingerlés – közvetlenül az izomhasról – fehér pöttyös oszlop szürke háttérrel ib = bal oldalon indirekt ingerlés – n. ischiadicusról - balról fentről jobbra le fekete-fehér csíkos oszlop db = bal oldalon direkt ingerlés – az izomhasról – jobbról fentről balra le fekete-fehér csíkos oszlop * jel: szignifikáns eltérés a kontrol értéktől (p <0.05) # jel: szignifikáns eltérés a kétféle ingerlés hatása között (p <0.05)
36
4. A NMJ elektronmikroszkópos képének qualitativ és quantitativ változásai tiszta ischaemia és deafferentációval kombinált ischaemia után 4. 1. 1. A NMJ szerkezete a kezelést nem kapott izomban A szinaptikus gödör térfogatának 75-80 % -át kitöltő axon terminálisban mitokondriumok és csoportokba rendeződött vesiculomok láthatóak. A részletesebb leírás a 4. 1. 1. ábrát magyarázó szövegben található.
4. 1. 1. ábra. Az axon terminális szakaszán jellemzően nagyobb mennyiségű szinaptikus vesicula (sv) és egészséges mitokondriumok (m) láthatóak. A posztszinaptikus membrán kesztyűujjszerű begyűrődéseiben koncentrálódnak az acetilkolin receptorok (a / jf). A terminális axont kívülről Schwann sejtek (b/ Sch) nyúlványai borítják, a szinaptikus gödröt az axon végkészüléke tölti ki, a Schwann sejt térfoglalása elhanyagolható. Vastag fekete vonal = 0,5 µm.
37
4. 1. 2. A NMJ szerkezete a deafferentált izomban A kapszaicines kezelés önmagában nem volt hatással a NMJ szerkezetére. A részletes leírás a 4. 1. 2. ábra magyarázatában található.
4. 1. 2. ábra. Az axon terminális szakasza a szinaptikus gödröt kitölti, benne nagyobb mennyiségű szinaptikus vesicula (sv) és egészséges mitokondriumok (m) láthatóak. A posztszinaptikus membrán kesztyűujjszerű begyűrődései épek (a / jf). A terminális axont Schwann sejtek (b/ Sch) nyúlványai borítják, a Schwann sejt térfoglalása elhanyagolható. Vastag fekete vonal = 0,5 µm.
38
4. 2. Két órás vértelenség hatása a NMJ szerkezetére Az elváltozások a 4. 2. ábrán láthatóak, leírásuk az ábramagyarázatban található.
4.2. ábra. Az axon terminálisban már egy órás reperfúzió után (a) szabálytalan vacuolumok (V) jelentek meg némelyikben sejtorganellum töredékek volt felismerhető (nyíl). A 24.(b/nyíl) és a 72.(c) órában kevesebb és nagyobb vacuolumok voltak láthatók, bennük már csak kevés sejtorganellum maradvány volt azonosítható, az axon membránja feltöredezett, míg a Schwann sejtek (Sch) nyúlványai egyre több helyet foglaltak el. A Schwann sejt a 72 órás reperfúziókor már csaknem teljesen elfoglalta a szinaptikus gödröt. Egy hét után, bár a Schwann sejt térfoglalása még mindig jelentős, és vacuolumok (V) még mindig láthatók, az axon terminálisban újra vesiculumok (vs) és egy-egy mitokondrium (m) azonosítható, a regeneráció megindult (4. 2. d). A posztszinaptikus felszín (jf) szerkezete nem változott. Vastag fekete vonal = 0,5 µm.
39
4. 3. Két órás vértelenség hatása a NMJ szerkezetére szelektív deafferentáció után Az egy hetes reperfúziós időt leszámítva az elváltozások jellegükben és súlyosságukban a tiszta ischaemia okozta elváltozásokhoz voltak hasonlóak melyek a 4. 3. ábrán leáthatóak, leírásukat az ábramagyarázatban adtuk meg.
4. 3. ábra. Már egy óra után (a) látható az axon terminális fragmentációja (nyíl) és a Schwann sejtek (Sch) térfoglalása. A további reperfúzió során a kötőszövet és a Schwann sejtek térfoglalása előrehalad, csaknem a teljes szinaptikus gödröt kitöltik (b és c). A reinnerváció azonban még 7 nap után is alig volt észlelhető, bár egy-egy regenerálódó axon terminális (AT) már azonosítható volt (d.). A posztszinaptikus felszín (jf) szerkezete nem változott. Vastag fekete vonal = 0,5 µm.
40
A posztszinaptikus membrán szerkezetét az ischaemia, illetve a deafferentáció sem külön-külön, sem együtt nem változtatta meg. 4. 4. Mennyiségi változások a NMJ-ban a különböző kezelések hatására A Schwann sejt relatív térfoglalását [R(V)Sch] és a poszt-, és preszinaptikus felszínek arányát [R(S)pp] minden lefényképezett szinapszison a metodikai résznél leírtak szerint megmértük. Az elektronmikroszkópos képeken látható elváltozásokat folyamatukban a 4. 4. 1. ábrán szemléltetjük. Sch
m
AT
kontroll bl
sv
jf
ISC
ISC + CAPS
v v
1h
AT
deb
deb
AT
72 h
v
v
168 h
v sv
AT
AT
4. 4. 1. ábra
4. 4. 1. ábra. Vázlatos rajz az egészséges (kontroll) szinapszisról és az ischaemia (ISC) illetve a szelektív deafferentáció utáni ischaemia (ISC+CAPS) hatására megváltozott szerkezetű szinapszisról a reperfúzió (1, 72 és 168 óra) után. A Schwann sejt szürkére színezett (Sch) relatív felszín és térfoglalása a reperfúzió 3. napjáig a kétféle kezelés után hasonló. Már egy óra reperfúzió után a mitokondriumok (m) és szinaptikus vesiculák (sv) eltűnnek, fragmentálódik (debr) a terminalis axon (AT), vacuolumok jelennek meg (V). A Schwann sejtek nyúlványai fokozatosan csaknem a teljes szinaptikus gödröt kitöltik. Egy héttel a 2 órás ischaemia után már érdemi regeneráció van, míg deafferentációt és 2 órás ischaemiát követően alig-alig felismerhető a regenerálódó terminális axon egy-egy részlete. (bl: basal lamina, jf: posztszinaptikus membrán)
41
A V(Sch) index a kontroll 23 % -s értékéről a csak ischaemiának kitett csoportban a reperfúzió 1, 24, 72 és 168 órájáig 51%, 54%, 72%, 43 % -ra változott (4. 4. 2. ábra szürke oszlopok). A deafferentált csoportban az 1, 24 és 72 óra elteltével hasonló súlyosságú elváltozások voltak, mint az ép szenzóriumú rostokkal bíró állatokban. 168 óra reperfúzió után azonban a deafferentált csoportban még mindig súlyos károsodás volt észlelhető, a szinaptikus gödröt a 68,5 térfogat %-ban a Schwann sejt töltötte ki (4. 4. 2. ábra fekete oszlopok).
100
4. 4. 2. ábra
*
V Sch (% )
80
60
40
20
0 kontroll
1 óra
24 óra
72 óra
168 óra
4. 4. 2. ábra. A Schwann sejtek relatív térfoglalása (VSch% ±SEM) a szinaptikus gödörben a különböző kezelések és reperfúziós idők után. fehér oszlop: egészséges szinapszis (kontroll) szürke oszlopok: 2 óra ischaemia után fekete oszlopok: deafferentáció és 2 óra ischaemia után *: szignifikáns különbség a kétféle kezelés hatása között
A felszínarányokat vizsgálva azt találtuk, hogy a különböző kezelések ellenére a szinaptikus membrán felszínek arányai változatlanok maradtak. (4. táblázat)
42
4. táblázat Poszt- és preszinaptikus membránfelszen arányai (R(S)pp; átlag ± SEM) Reperfúzió időtartama control 6.49 ± 0,54
1 óra
24 óra
72 óra
168 óra
csak ischaemia:
6.87 ± 0,7
6.26 ± 0,41
7.89 ± 0,03
5.53 ± 0,79
ischaemia és kapszaicin:
6.87 ± 0,9
6.98 ± 0,98
6.88 ± 0,53
5.61 ± 0,19
5. Elektrofiziológiai eltérések vértelenségben végzett műtétek után A műtétek után 48 órával az ideg vezetési sebessége (NCV) az eredeti érték 94 %-a, ami szignifikánsan kisebb, mint a kiinduló érték, de abszolút értékben nem kóros. A 30. napra az értékek 97 %-ak. A műtét után 48 órával a distális latencia (DL) átlag 119 %ra növekszik, az AP amplitúdója (Ampl) 91 %-ra csökken, míg 30 nap múlva a DL 111 %, az Ampl 91 %. A két utóbbi paraméter az NCV változásaihoz hasonló tendenciát mutat ugyan, de az eltérésük nem volt szignifikáns.
5. 1. ábra. Normális ENG képe n. mediánusról: NCV: 57,2 m/s, DL: 3,61 ms
43
5. 2. ábra. Csökkent NCV: 20,9 m/s, megynyúlt DL: 6,84 ms 48 órával a műtét után
6.
PMN sejt szám gyulladásos marker és citokin koncentráció változások a
vértelenségben végzett műtétek előtt, alatt és után 6. 1. Vérkép változások A mennyiségi vérkép változásai nem voltak szignifikánsak sem a különböző vérvételi időpontok, sem az artériás, vagy vénás vizsgálatokat illetően (6. 1. ábra). Mennyiségi vérkép a vértelenség előtt és után 200 150 100 50 0 I előtt a
I előtt v
I után I után I után a v 1 nap
I után 2 nap
vérvételi hgb (g/l)
htk
thrombocyta (G/l)
6.1. ábra
6. 1. ábra. Mennyiségi vérkép, ezen belül a hemoglobin (hgb), haematokrit (htk) és a thrombocytaszám (thr) értékek a különböző vérvételi időpontokban. I: ischaemia, azaz a vértelenség, a: artériás vérből, v: vénás vérből.
6. 2. Fehérvérsejtszám változások A fehérvérsejtszám a reperfúzió kezdetén a polimorfnukleáris sejtszámok tekintetében szignifikáns változást mutatott. Az artériás vérben 10 perccel a reperfúzió kezdete után nagyobb volt a szegmentált fehérvérsejtek sejtek száma, mint a vénás oldalon, ami sejtszekvesztrálódásra utal. 44
sejtszám/ µl
Fehérvérsejt-számok a vértelenség előtt és után
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
*
basophyl stab eossinophil monocyta
I előtt a
I előtt v
I után a
I után I után v 1 nap
lymphocyta
I után 2 nap
segment
vérvételi időpontok 6.2. ábra
6. 2. ábra. Minőségi vérkép, ezen belül a stab és segment granulocyta, basophyl- és eosinophyl-sejt, monocyta és lymphocyta számok a különböző vérvételi időpontokban. I: ischaemia, azaz a vértelenség, a: artériás vérből, v: vénás vérből. * : szignifikáns különbség az I utáni artériás és vénás (a és v) értékek között (p <0,05)
6. 3. Vérgáz, ion, nekroenzim és gyulladásos fehérje viszgálatok A se- Na+, se- K+, se- Ca++ szint változásaiban, valamint szokványos kémiai vizsgálatokkal (SGOT, SGPT, CK, LDH) szignifikáns eltérést a vizsgált időpontokban sem az artériás és vénás, sem a kiinduló és későbbi időpontban vett minták között nem találtunk. A kémiai vizsgálatok adatait nem mutatjuk. A vénás vérben mért pO2 érték a már beállt plexus érzéstelenítést, valamint a leszorítást követően is a kontroll értéknél szignifikánsan magasabb volt (6. 3. ábra). pO2 értékek a műtét alatt 120,0 100,0
*
*
80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 kontroll a kontroll v I előtt a I előtt v I után a vérvételi időpontok 6. 3. ábra
I után v
6. 3. ábra. Az artériás és vénás pO2 értékek a beállt plexus érzéstelenítésben az átlag 53 perces vértelenítés előtt és a reperfúzió kezdete után 10 perccel. I: ischaemia, azaz a vértelenség, a: artériás vérből (szürke oszlop), v: vénás vérből sötét oszlop * : szignifikáns különbség a kontroll vénás (v) értékhez képest (p <0,05)
45
A CRP értékek 24- 48 óra után magasabbak voltak, de az eltérés nem volt szignifikáns. CRP változások a műtét alatt és után 8
mg/l
6 4 2 0 I előtt a
I előtt v
I után a I után v I után 1n I után 2 n vérvételi időpontok 6.4. ábra
6. 4. ábra. Az artériás (a) és vénás (v) CRP koncentrációk a vértelenítés (I) előtt, és utána 10 perccel, valamint 1 (1n) és 2 (2n) nappal később
A vizsgálat citokinek közül az IL-1b, IL-8, IL-10, IL-12 és TNF-α koncentrációjának változása nem volt szignifikáns. Az IL-6 szintje a műtét utáni 24. órában volt a legmagasabb, és a 48. órában már csökkenést mutatott (6. 5. ábra). A koncentrációváltozás a kiinduló értékhez képest szignifikáns volt, de a különböző vértelenítési idők illetve a műtétek másnapján mérhető (legmagasabb) IL-6 szintek között statisztikailag bizonyítható korrelációt nem találtunk. IL-6 koncentráció
*
100
pg/ml
80 60 40 20 0 I előtt a
I előtt v
I után a
I után v
I után 1nap
I után 2 nap
vérvételi időpontok 6.5. ábra 6. 5. ábra. Az artériás (a) és vénás (v) IL-6 koncentrációk (± SEM) a vértelenítés (I) előtt, és utána 10 perccel, valamint 1 és 2 nappal később *: szignifikáns emelkedés a vértelenség előtti értékhez képest (p <0,05)
46
Megbeszélés A végtagokon nem csak a sérülések, mérgezések és betegségek okozhatnak keringészavart, hanem a vérzés nélküli atraumatikus műtéti technika szempontjából, vagy az elsősegélynyújtásban nélkülözhetetlen vértelenítési eljárások is. Amióta a pneumatikus vértelenítés elterjedt különböző vizsgálati eredmények jelentek meg arról, hogy melyik a legkevésbé veszélyes vértelenítési módszer, meddig alkalmazható veszély nélkül a keringés kirekesztés. Humán gyakorlatban még napjainkban sem ritka a két órát meghaladó vértelenség alkalmazása akár alsó, akár felső végtagon.
A
tervezett műtéteknél elvi lehetőség van az ischaemia hosszának meghatározására. A korai műtét utáni szak, a sebgyógyulás, az operált végtag funkciójának visszanyerése szempontjából nem mindegy, hogy egy tervezhető beavatkozás során a műtéti traumát fokozó, vagy a műtét idejét és szövődményeit csökkentő eljárást használunk-e. A már eleve keringés-károsodott, vagy gyulladt területek ischaemia toleranciája lényegesen kisebb. A biztonságosabb műtéti technika alkalmazásához feltétlenül szükségesnek láttuk meghatározni az a vértelenítési időt, ami nem válik önmagában további szöveti sérülés forrásává, a műtéti trauma esetleges megsokszorozójává. A gyulladás, illetve a neurogén gyulladás és az ischaemia-reperfúzió együttes hatásait eddig még nem vizsgálták. A szöveti sérülés elemei, az endothel károsodás, permeábilitás fokozódás, ödéma képződés, a granulocyta aktiváció és migráció, a gyulladásos láncreakciók mind három jelenségben részben közösek, részben átfedést mutatnak, ezért az együttes hatásokban a szinergizmus és az antagonizmus keveredhet. A végtagi ischaemia hatása a neuromuscularis egység szerkezetének változásán, illetve működészavarán jól mérhető (25, 29, 80). A korábbi kutatások és a magunk mérései szerint az izomerővesztés az 1 és 2 óra ischaemia után a korai reperfúzióban már észlelhető és csak a 2. héten kezdődött az érdemi regeneráció. Az általunk alkalmazott fél óra ischaemia a patkány EDL izmon csak a késői reperfúzióban a 72. órájában okozta a szignifikáns izomerővesztést és az első hét végére az izomerő normalizálódott. Az egy és két órás vértelenítés után a kontrakciós erő az idegről történő indirekt ingerléssel kisebb volt, mint a direkt, izomról történő ingerlésnél, ami a szinapszisok károsodására utal. Ezt alátámasztják a NMJ ultrastruktúrájának súlyos károsodását mutató viszgálataink is (97). A fél óra ischaemiánál az indirekt, és az izomról történő direkt ingerlés hatása között nem volt különbség, ami alapján feltételezhető, hogy a
47
szinapszisok ischaemia toleranciája 30 perc körül van. Az idegvezetési sebesség csökkenés, mely emberen felkari vértelenségben végzett műtétek kapcsán kimutatható volt, demyelinizációra utal. Állatkísérleteinkben ez a komponens is felelős lehet a reperfúzió során a direkt ingerlés hatásához képest indirekt ingerléskor kapott csökkent izomerőért, de a supramaximalis tetanusos ingerek alkalmazása során ez a mérsékelt idegvezetési zavar nem feltétlenül mutatkozik meg. A gyakorlatban a korai posztoperatív szakban nehéz elválasztani egymástól a műtéti seb, szövetroncsolás okozta fájdalom, a keringészavar közvetlen izomkárosító és a perifériás idegen elektorfiziológiailag kimutatható károsodások hatásait. Eredményeink alapján ebben van egy közvetlen neurogén komponens is. Ennek a kérdéskörnek a tisztázása még további kísérletsorozatokat igényel. Az egy óránál hosszabb ischaemia után észlelhető, regenerációt egy hét alatt sem mutató izomerővesztést a deafferentáció mérsékelte. Ez alapján várható, hogy a neurogén gyulladás pharmacológiai gátlása (41) új fejezetet nyithat a reperfúziós szöveti sérülés kivédésében is. A reperfúziós sérülés nélkül a perifériás ideg helyi kapszaicines kezelése a szinapszisokon ultrastruktúrális elváltozást nem okozott és az izomerőre sem volt hatással. Két órás ischaemiát követően egy héten át izomkontrakció - indirekt ingerlést követően - gyakorlatilag nem váltható ki. A NMJ elektronmikroszkópos elváltozásai, az axonterminális szétesése és a Schwann sejtek térfoglalása arányosnak tűnik az izomerővesztéssel. Ezzel szemben, míg a szelektív deafferentáció és 2 óra ischaemia után nagyobb kontrakciós erőt mutat az EDL izom, a NMJ ultrastruktúráján ugyanolyan súlyosságú, de lassabban regenerálódó elváltozások láthatók, mint a “tiszta” ischaemiát követően. A lehetséges magyarázatok egyike lehet, hogy a CGRP az axonregenerációt, és ezáltal az új szinapszisok képződését gátolja (78). A deafferentációt követően ezért az újonnan képződött szinapszisok nagy száma kompenzálhatja az ischaemia okozta axon terminális károsodásokat (32). Az indukált gyulladás és az iszkémia reperfúziós sérülések kiváltotta elváltozások tanulmányozása során egyaránt az a tapasztalat, hogy a helyi és általános reakciók néhány óra alatt megjelennek, egy nap után még tovább súlyosbodnak, a javulás egy hét után már kimutatható de még hetekig eltart. (11, 105, 92, 97) Terpentin indukálta gyulladás következményeit eddig csak generalizált gyulladásos jeleken mérték és főleg antiphlogisticumok hatásosságának bizonyítására használták. 48
Elsősorban a keringő granulocyta, lymphocyta szám változását és annak dinamikáját vizsgálták, illetve polymorfnukleáris (PMN) sejtek migrációjának gátolhatóságát mérték (6, 105). A terpentines kezeléssel kiegészített leszorítás hatására az EDL izomzat kontrakciós ereje a reperfúziós sérüléseknél tapasztaltaktól eltérően változik. Az egész szervezetre gyakorolt hatásnak tulajdonítható, hogy a nem kezelt jobb oldalon is a 72-ik óráig csökken az izomerő, ami az első hét végére csaknem normalizálódik. A két óránál nem hosszabb bal oldali iszkémia hatására az ellenoldalra kiható károsító hatást nem találtunk. A gyulladásos reakciókban az endothel károsodás következtében sejt és plazma kiáramlás történik a kapillárisokból. A rostok közvetlen károsodására utal a szövettani kép: a sejtmagok átrendeződnek, a rost vizenyős, a sejtorganellumok eltűnnek, a sejtmagok a rostok közepére vándorolnak. Ezeket az időben előrehaladva hol súlyosabb, hol enyhébb formában észlelhető elváltozásokat párhuzamosan követi az izmok kontrakciós erejének változása, azt sugallva, hogy a rostszerkezet épsége arányban áll kontrakciós teljesítőképességével. Ahol súlyos az erőveszteség (az eredeti erő 50 százaléknál kisebbre csökken) ott a legkifejezettebb a rostok degenerációja. Az enyhébb funkcionális veszteséget viszont nem lehet szignifikáns párhuzamba állítani a szövettani képpel, ami arra utal, hogy ott az izomrost szerkezeti elváltozása önmagában nem magyarázza meg az erőcsökkenést. Így, bár vizsgálataink során a szövetek oxigenizációjánoak fokát nem mértük, - és irodalmi adat sem érhető el erre vonatkozóan - csak az lehet magyarázat az erőcsökkenésre, hogy a gyulladás és a reperfúziós sérülés együtt az izomrost oxigénellátását károsítja. Az ellenoldali postcapillaris venulákban leukocyta aggregációt és migrációt mutatott ki két másik modell is: tartós artéria ligatúrával és izomingerlés együttes alkalmazásával (42) illetve 4 órás artéria leszorítással (59). A szisztémás hatás ezekben a kísérletekben az általunk alkalmazottnál lényegesen hosszabb keringészavar után mutatkozott. A gyulladás neurogén komponenseinek vizsgálata során megfigyelték hogy az egyik oldali végtagon kialakult gyulladás, vagy sérülés az ellenoldalon is változásokat provokál a perifériás idegek működésében (64, 87, 89). Izomkontrakciós erőt ilyen körülmények között még nem vizsgáltak. Feltételezhető, hogy nem csak a gyulladásos infiltrációval, a szövettani szerkezet változással, hanem ellenoldali neurogén működészavarokkal is összefügg az, hogy 24 óra elteltével a kezeletlen ellenoldalon is szignifikáns kontrakció erő csökkenés jelenik meg. A C rostok vasoactiv neuropeptidjeinek hatása (CGRP és SP vasodilatator hatásával, Neurokinin-A
sejtakkumuláló
hatásával)
az
allergiás
reakciókban,
asthma 49
bronchialéban, rheumatoid arthritisben, ekcémában, psoriasisban, conjunctivitisben, migrénben, a diabeteses neuropathiában és keringészavarokban már bizonyított (28, 41). A gyulladásos folyamatokban a kapszaicines deafferentáció hatásáról eddig nyert adatok ellentmondásosak: van munkacsoport, mely szerint kapszaicines kezelés hatására csak a fájdalomérző rostok kiesése egyértelmű, míg a gyulladásos permeábilitás fokozódás és ödéma változatlanok maradnak (5, 52), mások szerint a kapszaicin a teljes gyulladásos folyamatot gátolja (16, 45, 46, 93, 94). A szelektív deafferentáció után a keringészavarral együtt kémiailag is indukált gyulladásban a többszörös szövetártalom sajátságosan kombinálódik. Az elváltozások tendenciájukban a tisztán reperfúziós sérüléskor észleltekhez hasonlóak. Míg reperfúziós sérüléskor (kapszaicin előkezeléssel vagy anélkül) a kezeletlen ellenoldal kontrakciós erején korábbi vizsgálatainkban változást nem észleltünk, az indukált gyulladás hatására a nem kezelt, ellenoldalon is szövettani és izomerő változások voltak. A keringészavarral kombinált gyulladásos környezetben direkt ingerléssel mindig nagyobb izomerő volt mérhető, mint indirekt ingerléskor. A hosszabb leszorítás hatására az idegről történő ingerelhetőség a vizsgált tartományban megszűnt. Az idegszövet ischaemia toleranciája ezek szerint a legkisebb. A fénymikroszkópos szövettani szerkezetváltozások a közepes, vagy súlyos elváltozásoknál arányban voltak a mért izomerő csökkenéssel, de az enyhébb károsodási fokozatok sem a károsodás megjelenésekor, sem a restitúciót tekintve nem mutattak korrelációt. A fél óra és a két óra leszorítás hatása az indukált gyulladásos környezetben is lényegesen eltérnek egymástól. A hosszabb leszorítás ilyen körülmények között is súlyosabb kontrakció erő csökkenést, szövettanilag eltakarítási reakciót okoz és a rostszerkezet, valamint az erő visszatérése a vizsgált időszakon belül nem észlelhető. Elfogadott tény, hogy a vértelenítés hosszával a kialakult károsodások arányosak (21). Az általunk átlag 53 perces felkari vértelenségben történt, kis szövetkárosító hatásúnak számító elektív, egyébként szövődmény nélkül gyógyult műtétek közben végzett vizsgálataink is leukocyta szekvesztrációt igazoltak a reperfúzió 10. percében (49, 55). Állatkísérletben Nanobashvili és mtsai a klinikai gyakorlatban elterjedt nekroenzimek közül a CK és LDH változásait a se-taurin szint változásával együtt mérték nyúlon 1 és 2,5 óra ischaemia és 2 óra reperfúzió után. Azt találták, hogy a hosszabb ischaemia után az enzim illetve taurin szintemelkedések kórosak, míg egy óra ischaemia, hasonlóan a jelen vizsgálatainkban tapasztaltakhoz, az enzim koncentrációkat nem változtatta meg (69). 50
A vértelenítéssel járó műtétek során keletkező szabadgyökök megkötésében az anaestheticum is szerepet játszhat. A Propofolról leírták, hogy antioxidáns aktivitása szokásos altatási körülmények között emberen is kimutatható (48, 19), ezért a vizsgálatainkba csak vezetéses érzéstelenítéssel végzett műtéteket vontunk be. A vérgázanalízis értékek szerint a vértelenítés felhelyezése előtt az elérzéstelenített végtagba be és onnan kiáramló vér pO2 értéke alig különbözött. Sikeres teljes sensomotoros block esetén a vezetéses érzéstelenítés hatására az izomzat nyugalmi oxigénigénye jelentősen csökkenhet, mert a nyugalmi és spontán izomkontrakciók kikapcsolódnak. A vegetatív blocknak következménye hyperaemia és shunt-keringés megindulása is lehet, utóbbi viszont az izom oxigénellátásának károsodását jelentheti. Az ellentmondásos lehetőségek miatt azt gondoljuk, hogy a különböző érzéstelenítési módszerek klinikailag igazolható helyi szöveti oxigénhiány tűrő képesség befolyásoló hatása további kiterjedt vizsgálatokat igényel. Az interleukinok koncentrációjának változásait különböző súlyosságú sebészi beavatkozások illetve sérülések kapcsán is tanulmányozták (22). Bár vértelenítésben végzett műtétekre a vizsgálatok nem terjedtek ki, a kutatások során a jelen vizsgálatunkban találtakhoz hasonló tendenciájú citokin-szint változást mértek az egyébként szövődménymentesen gyógyuló műtétek után. Az általunk vértelenítésben végzett kéz műtétek IL-6 koncentráció növelő hatása egyenértékű volt azzal, amit mások a nyílt cholecystectomiák után találtak. Kisebb sebészi beavatkozások közé sorolták a varicectomiát, a pajzsmirigy göbeltávolítást és bőr alatti csomók eltávolítását, melyek szövetkárosító hatása a feltárás és az expozíció nagysága műtéttechnikailag megfelel az általunk végzett műtétek hatásának. A szövetkárosodás önmagában, a kéz műtéteink esetében, a nyílt cholecystectomiák során óhatatlanul bekövetkező károsodáshoz képest minimális, így feltehető, hogy a vértelenség okozta izomkárosodás felelős a citokin-szint emelkedésért. A végtagi leszorításhoz használt nyomás nagysága is jelentősen befolyásolja a kialakult károsodásokat (71). Jelen vizsgálataink során a teljes keringési blokkot még éppen biztosító lehető legalacsonyabb leszorítási nyomás alkalmazására törekedtünk, ami a szisztolés vérnyomás érték kétszerese volt. A vértelenítés károsító hatása kipólyázásos technikánál nagyobb (51), ezért magunk is csak az elevációs módszert használjuk. A Na-heparinról is tudjuk, hogy a reperfúziós sérüléskor szövetvédő hatása van (23), ezért volt fontos, hogy vizsgálatsorba bevont betegeink véralvadásgátló szert ne kapjanak. 51
Az izomszövet károsodása akár intramusculáris injekciót követően is kimutatható, ezért olyan műtéteket választottunk, ahol friss sérülési komponens nincs, illetve a műtéti területbe nem esik izom. Gyulladásos folyamatokban a szövetek viselkedése más lehet, ezért az ilyen betegeket is kizártuk ebből a tanulmányból. Vizsgálatainkkal
az
egy
óránál
rövidebb
ideig
tartó
vértelenítés
okozta
szövetkárosítással kapcsolatos adatokat nyertünk. Eredményeink alapján feltételezhető, hogy a szöveti sérülést jelző IL-6 koncentráció emelkedés inkább a vértelenség mellékhatásának tulajdonítható, mint a műtét közbeni sebészi manipuláció okozta szövetkárosodásnak, de a kettő együtt sem veszélyeztette a gyógyulást. Az egy órás vértelenítési idő - bár az ischaemia nem marad következmény nélkül – vizsgálataink alapján még biztonságos időtartamnak mondható.
52
Fontosabb megállapítások 1. Kísérleti modellen bizonyítottam, hogy már a fél-egy óra keringésleállás szövetkárosító hatása sem múlik el gyorsan és nyomtalanul. Az egy órán túli vértelenség hatása minőségileg más, sokkal súlyosabb következményekkel jár, mint az egy óránál rövidebb. A regeneráció egy hét után kimutatható, de még nem teljes. 2. Kimutattam, hogy a neurogén gyulladás kikapcsolása (a szelektív deafferentáció) bizonyos körülmények között kedvező hatású a reperfúziós szöveti sérülésben. Ez a klinikai gyakorlatban hasznosítható akkor lehet, ha a neuropeptidek hatásai, szintézise és működése farmakológiailag befolyásolhatóak lesznek. 3. A gyulladás és a keringéskárosodás együttes hatásának vizsgálatára új kísérleti modellt hoztam létre. Kimutattam, hogy a gyulladásos környezetben a reperfúziós sérülés súlyosabb, a gyulladás és a reperfúziós sérülés a távoli szöveteken is károsodást okoz és ilyenkor a szelektív deafferentáció kedvező hatása csak részben érvényesül. 4. Elektronmikroszkópos vizsgálatainkkal bizonyítottam, hogy a NMJ szerkezetére a deafferentáció önmagában nincs hatással. A NMJ reperfúziós sérülésekor az elváltozásokat quantitative is jellemeztem, és kimutattam, hogy a neuropeptidek hiánya a morfológiai elváltozásokat súlyosbítja. 5. Vizsgálataim szerint a perifériás ideg érzékenyen reagál a keringészavarra, vagy az azzal kombinált gyulladásos szövetkárosodásokra. A kevesebb, mint 2 óra vértelenséget követően megjelenő és napokig kimutatható elektromos vezetési zavar olyan idegszakaszon volt mérhető, ahol a vértelenítő mandzsetta nyomása nem játszott szerepet, így az oxigén hiány és annak további következményei lehetnek a felelősek a kialakuló állapotért, amire a klinikai gyakorlatban nem is gondolunk, amikor a sérülés, vagy gyulladás után a gyógyulási szakban a lassan múló funkció zavarokat észleljük. 6. A csak kevés szövetroncsolással és egy órás felső végtagi vértelenséggel járó műtétek
során
a
nagy
beavatkozásokra
jellemző
szöveti
sérülést
jelez
a
polimorfnukleáris sejtek kitapadása és az IL-6 koncentráció emelkedése. Az úgynevezett kis műtétek során, ahol maga a műtét minimális szövetroncsolással jár, a vértelenítés lehet a felelős a nagyobb műtéteknél észlelhetőhöz hasonló citokin aktiválódásért. Méréseim szerint a reperfúzió kezdetén, az első 10 percben még nem mutatható ki citokin koncentráció-emelkedés.
53
7. A karidegfonat-érzéstelenítés hatására a vénás vér oxigén telítettsége növekszik. Ennek az oka nem csak az izomzat csökkent nyugalmi oxigénigénye lehet, hanem értágulat kialakulása is. Az érzéstelenítési módszerek a reperfúziós sérülést, a szövetek oxigén igényét, vagy oxigénhiány tűrését kedvezően is befolyásolhatják. 8. Újabb érveket szolgáltattam arra, hogy a tervezett keringészavart, a vértelenség technikáját a műtétek során minél kevesebbet használjuk. Ha mégis elengedhetetlenül szükséges gyulladásos környezetben lehetőleg csak a leglényegesebb fél, egyébként maximum egy óra hosszán át alkalmazzuk.
54
Köszönetnyilvánítás: Nehéz feladat mindenkinek köszönetet mondani, akit illet, mert a kutatás és a disszertáció megírása is csapatmunka. Köszönöm tanítómestereimnek Záborszky Zoltán professzor úrnak, Farkas József tanár úrnak, néhai Cziffer Endrének az MTA doktorának, hogy a baleseti sebészet tanítása és embert próbáló, felőrlő művelése mellett példát mutattak abban, hogy nem elég mások eredményeinek másolása, hanem saját tapasztalataink gondolataink rendezésével is értékes új következtetéseket vonhatunk le. Köszönöm, program és témavezetőimnek, Juhász-Nagy Sándor professzor úrnak, Hamar János tanár úrnak hogy befogadtak csapatukba, bíztattak, segítettek, magamra hagytak, korholtak, mikor-mint kellett, ahhoz, hogy egyszer eredményt tudjak felmutatni. Köszönöm egykori és mai munkatársaimnak, a MH KHK és a HMÖ Markhot Ferenc Kórház Traumatológiai osztályok dolgozóinak és mindenkori betegeimnek, hogy eltűrték azt, ha sokszor és sok héten át nem voltam köztük, mert kísérleteimmel foglalkoztam, könyvtárakat bújtam, tanfolyamokra jártam. Köszönöm feleségemnek és összes gyermekemnek, hogy jól viselték azt a sok időt, amikor az elmúlt években köztük voltam, de nem velük. Inspiráló volt Fűrész József orvosezredes, kandidátus és munkatársai, valamint Siklós László DSc munkatempója, gondolkodás módja és bíztatása egyes problémák megoldásában. Hálásan gondolok Tóth Balázs PhD és Lohner Zsuzsanna főorvos asszony, valamint az OBSI Kísérleti Osztály valamennyi munkatársa segítségére.
55
Irodalom 1.
Ames A. Jr., Wright RL. Kowada, M.: Cerebral ischaemia II. The no reflow phenomenon. Am. J. Pathol. 1968 52: 437-453.
2.
Adanali G, Ozer K, Siemionow M.: Early and late effects of ischemic preconditioning on microcirculation of skeletal muscle flaps. Plast Reconstr Surg. 2002 Apr 1; 109(4): 1344-1351.
3.
Adembri C, Kastamoniti E, Bertolozzi L, Vanni S, Dorigo W, Coppo M, Pratesi C, De Gaudio AR, Gensini GF, Modesti PA. Pulmonary injury follows systemic inflammatory reaction in infrarenal aortic surgery. Crit CAre Med. 2004 Vol. 32 (5): 1170-1177
4.
Baigrie RJ, Lamont PM, Kwiatkowski D, Dallman MJ, Morris PJ.: Systemic cytokine response after major surgery. Br J Surg. 1992 Aug; 79(8): 757-760.
5.
Barthó L., Stein C., Herz A.: Involvement of capsaicin-sensitive neurons in hyperalgesia and enhanced opioid antinociception in inflammation. NaunynSchmiedeberg’s Arch Pharmacol. 1990 342: 666-670.
6.
Baumgartner VR., Obenaus H., Schmook FP., Walzl H.: Systemische Reaktionen in Ratten nach Setzung lokal entzündlicher Prozesse. Arzneimittelforschung, 1982 32(11): 1463-1467
7.
Bayliss WM.: The vaso-motor system. Longmans Green, London 1923.
8.
Berga, MF, Canosa NM, Crespo AF, Dzekonski BJ.: Effect of ischemic tourniquet pressure on the intensity of postoperative pain. Rev Esp Anestesiol Reanim. 2002 Mar; 49(3): 131-135.
9.
Biffl WL, Moore EE, Moore FA, Peterson VM.: Interleukin-6 in the injured patient. Marker of injury or mediator of inflammation? Ann Surg. 1996 Nov; 224(5): 647-664.
10.
Blaisdell, FW.: The pathophysiology of skeletal muscle ischemia and reperfusion syndrome: e review. Cardiovasc Surg. 2002 Dec; 10(6): 620-630
11.
Boura ALA, Svolmanis AP.: Converting enzyme inhibition in the rat by captopril is accompanied by potentiation of carrageenin-induced inflammation. Br. J. Pharmac. 1984 82: 003-008.
12.
Brooks, B.: Pathologic changes in muscle as the result of disturbance of circulation. Arch. Surg. 1922 5: 188-216
13.
Bruner JM.: Safety factors in the use of the pneumatic tourniquet for hemostasis in surgery of the hand. J Bone Joint Surg Am. 1951 Jan; 33(A:1): 221-224.
56
14.
Buttemeyer R, Philipp AW, Mall JW, Ge B, Scheller FW, Lisdat F.: In vivo measurement of oxygen-derived free radicals during reperfusion injury. Microsurgery. 2002 22(3): 108-113.
15.
Bywaters, EGL.: Ischemic muscle necrosis, crushing injury, traumatic edema, the crush syndrome, traumatic anuria, compression syndrome: a type of injury seen in air raid casualties following burial beneath debris. JAMA, 1944 124: 1103-1109
16.
Castro-Lopes JM., Tavares I., Tölle TR., Coimbra A.: Carrageenin-induced inflammation of the hind foot provokes a rise of GABA-immunoreactive cells in the rat spinal cord that is prevented by peripheral neurectomy or neonatal capsaicin treatment. Pain, 1994 56: 193-201.
17.
Chabel C, Russell LC, Lee R.: Tourniquet-induced limb ischemia: a neurophysiologic animal model. Anesthesiology. 1990 Jun; 72(6): 1038-1044.
18.
Chan RK, Ding G, Verna N, Ibrahim S, Oakes S, Austen WG Jr, Hechtman HB, Moore FD Jr.: IgM binding to injured tissue precedes complement activation during skeletal muscle ischemia-reperfusion. J Surg Res. 2004 Nov; 122(1): 29-35
19.
Cheng YJ, Wang YP, Chien CT, Chen CF.: Small-dose propofol sedation attenuates the formation of reactive oxygen species in tourniquet-induced ischemia-reperfusion injury under spinal anesthesia. Anesth Analg. 2002 Jun; 94(6): 1617-1620.
20.
Chiu D, Wang HH, Blumenthal MR.: Creatine phosphokinase release as a measure of tourniquet effect on skeletal muscle. Arch Surg. 1976 Jan; 111(1): 71-74.
21.
Concannon MJ, Kester CG, Welsh CF, Puckett CL.: Patterns of free-radical production after tourniquet ischemia: implications for the hand surgeon. Plast Reconstr Surg. 1992 May; 89(5): 846-852.
22.
Cruickshank AM, Fraser WD, Burns HJ, Van Damme J, Shenkin A.: Response of serum interleukin-6 in patients undergoing elective surgery of varying severity. Clin Sci (Lond). 1990 Aug; 79(2): 161-165.
23.
Dandona P., Qutob T., Hamouda W., Bakri F., Aljada A. and Kumbkarni Y.: Heparin Inhibits Reactive Oxygen Species Generation by Polymorphonuclear and Mononuclear Leukocytes Thr. Res. 1999 96: 437-443
24.
Eastlack RK, Groppo ER, Hargens AR, Pedowitz RA.: Ischemicpreconditioning does not prevent neuromuscular dysfunction after ischemiareperfusion injury. J Orthop Res. 2004 Jul; 22(4): 918-923
57
25.
Fish JS, McKee NH, Pynn BR, Kuzon WM, Olyely MJ.: Isometric Contractile Function Recovery following Tourniquet ischemia J Surg Res. 1989 Okt; 47(4): 365-370
26.
Fitzgerald M: Kapszaicin and Sensory Neurones- A Review. Pain 1983 15: 109-130
27.
Forbes TL, Carson M, Harris KA, DeRose G, Jamieson WG, Potter RF.: Skeletal muscle injury induced by ischemia-reperfusion. Can J Surg. 1995 Feb; 38(1): 56-63.
28.
Franco-Cereceda A, Lundberg JM.: Post-occlusive reactive hyperemia in the heart, skeletal muscle and skin of control and kapszaicin-pre-treated pigs. Acta Physiol Scand 1989 137: 271-277
29.
Gardner VO, Caiozzo VJ, Long ST, Stoffel J, McMaster WC, Prietta CA.: Contractile properties of slow and fast muscle following tourniquet ischaemia. Am J Sports Med 1984 12: 417-423
30.
Gidlof A, Lewis DH, Hammersen F.: The effect of prolonged total ischemia on the ultrastructure of human skeletal muscle capillaries. A morphometric analysis. Int J Microcirc Clin Exp. 1988 Jan;7(1): 67-86
31.
Goodman EC, Iversen LL.: Calcitonin gene-related peptide: novel neuropeptide. Life Sci. 1986 Jun; 38(24): 2169-2178
32.
Gorio A, Carmignoto G, Finesso M, Polato P, Nunzi MG.: Muscle reinnervation II. Sprouting, synapse formation and repression. Neurosci 1983;8:403-416.
33.
Gundersen HJG, Bendsten TF, Korbo L, Marcussen N, Moller A, Nielsen K, Nyengaard JR, Pakkenberg B, Sörensen FB, Vesterby A, West MJ.:Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. Review. APMIS 1988 96(5): 379-394
34.
Gurke L, Marx A, Sutter PM, Frentzel A, Salm T, Harder F, Seelig J, Heberer M.: Ischemic preconditioning improves post-ischemic skeletal muscle function. Am Surg. 1996 May; 62(5): 391-394.
35.
Hansson S.: The association between nerve conduction velocity and the compound action potential amplitude during ischemic blocking. Electromyogr Clin Neurophysiol. 1999 Mar; 39(2): 113-122.
36.
Harkin DW, Barros D'Sa AA, McCallion K, Hoper M, Campbell FC.: Ischemic preconditioning before lower limb ischemia--reperfusion protects against acute lung injury. J Vasc Surg. 2002 Jun; 35(6): 1264-1273
37.
Harris AG, Steinbauer M, Leiderer R, Messmer K.: Role of leukocyte plugging and edema in skeletal muscle ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 1997 Aug; 273(2 Pt 2): 989-996.
58
38.
Hauser CJ, Joshi P, Zhou X, Kregor P, Hardy KJ, Devidas M, Scott P, Hughes JL. Production of interleukin-10 in human fracture soft-tissue hematomas. Shock. 1996 Jul; 6(1): 3-6
39.
Hatzipantelis KP, Natsis K, Albani M Effect of acute limb ischaemia on neuromuscular function in rats. Eur J Surg. 2001 Nov; 167(11): 831-838
40.
Heavner JE, Leinonen L, Haasio J, Kytta J, Rosenberg PH.: Interaction of lidocaine and hypothermia in Bier blocks in volunteers. Anesth Analg. 1989 Jul; 69(1): 53-59
41.
Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J.: Pharmacological Targets for Inhibition of Neurogenic Inflammation. Curr. Med. Chem. Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents, 2003 (2): 191-218
42.
Hickey NC, Hudlicka O, Gosling P, Shearman CP.: Simms MH.: Intermittent claudication incites systemic neutrophil activation and increased vascular permeability. Br J Surg. 1993 80: 181-184
43.
Jacobson MD, Pedowitz RA, Oyama BK, Tryon B, Gershuni DH.: Muscle functional deficits after tourniquet ischemia. Am J Sports Med. 1994 May-Jun; 22(3): 372-377
44.
Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J.: Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with kapszaicin. Br J Pharmac Chemother 1967 31: 138-151
45.
Jancsó G., Király E., Jancsó-Gábor A.: Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature 1977 270: 741-743
46.
Jancsó G., Király E., Jancsó-Gábor A.: Direct Evidence for an Axonal Site of Action of Capsaicin. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1980. 313: 91-94
47.
Józsa L, Renner A, Sántha E.: The effect of tourniquet ischaemia on intact, tenotomized and motor nerve injured human hand muscles. The Hand 1980 12(3): 235-240
48.
Kahraman SKD, Erdem K.: Propofol attenuates formation of lipid peroxides in tourniquet induced ischaemia – reperfusion injury Br. J. Anaesth. 1997 78: 279-281
49.
Klausner JM, Paterson IS, Valeri CR, Shepro D, Hechtman HB.: Limb ischemia-induced increase in permeability is mediated by leukocytes and leukotrienes. Ann Surg. 1988 Dec; 208(6): 755-760
50.
Koller M, David A, Hahn MP, Muhr G.Liberation of interleukin 12 (IL12) after trauma and polytrauma. Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd. 1998
59
115(Suppl I): 453-456 51.
Korth U, Merkel G, Fernandez FF, Jandewerth O, Dogan G, Koch T, van Ackern K, Weichel O, Klein J.: Tourniquet-induced changes of energy metabolism in human skeletal muscle monitored by microdialysis. Anesthesiology 2000 Dec; 93 (6): 1407-1412.
52.
Kwak JY, Jung JY, Hwang SW, Lee WT, Oh U.: Capsaicine-receptor antagonist, capsezapine, reduces inflammation-induced hyperalgesic responses in the rat: evidence for an endogenous capsaicin-like substance. Neuroscience 1998 86 (2): 619-626
53.
Lazarus B, Messina A, Barker JE, Hurley JV, Romeo R, Morrison WA, Knight KR.: The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 2000 Aug; 191(4): 443-448
54.
Lee Y, Takami K, Kawai Y, Girgis S, Hillyard CJ, MacIntyre I, Emson PC, Tohyama M.: Distribution of calcitonin gene-related peptide in the rat peripheral nervous system with reference to its coexistence with substance P. Neuroscience 1985 Aug; 15(4): 1227-1237
55.
Lehr HA, Guhlmann A, Nolte D, Keppler D, Messmer K.: Leukotrienes as mediators in ischemia-reperfusion injury in a microcirculation model in the hamster. J Clin Invest. 1991 Jun; 87(6): 2036-2041
56.
Lelcuk S, Huval WV, Valeri CR, Shepro D, Hechtman HB.: Inhibition of ischemia-induced thromboxane synthesis in man. J Trauma 1984 May; 24(5): 393-396
57.
Lelcuk S, Alexander F, Valeri CR, Shepro D, Hechtman HB.: Thromboxane A2 moderates permeability after limb ischemia. Ann Surg. 1985 Nov; 202(5): 642-646
58.
Levine RL, Williams JA, Stadtman ER, Shacter E.: Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 1994; 233: 346-357
59.
Liu X., Frank WP, Barker JH, Pierangeli SS, Harris EN.: LeukocyteEndothelium Interaction in Arterioles after Ischaemia and Reperfusion. J. Surg. Research 1999 87: 77-84
60.
Lütschg J, Ludin HP.: Longitudinal differences of susceptibility to ischaemia in human sensory nerve fibres. J Neurol. 1982 228(2): 123-132
61.
Machold W, Mullner T, Vorderwinkler KP, Vecsei V.: Technical defects of tourniquet manometers. Unfallchirurg. 2002 Dec; 105(12): 1097-1099
62.
Mathru M, Dries DJ, Barnes L, Tonino P, Sukhani R, Rooney MW. Tourniquet-induced exsanguination in patients requiring lower limb surgery. An ischemia-reperfusion model of oxidant and antioxidant metabolism.
60
Anesthesiology. 1996 Jan; 84(1): 14-22 63.
McEwen JA, Kelly DL, Jardanowski T, Inkpen K.: Tourniquet safety in lower leg applications. Orthop Nurs. 2002 Sep-Oct; 21(5): 55-62
64.
Menendez JA, Cuvas SC.: Changes in contralateral protein metabolism following unilateral sciatic nerve lesion. J. Neurobiol. 1989 21: 303-312
65.
Menger MD, Vollmar B.: In vivo analysis of microvascular reperfusion injury in striated muscle and skin. Microsurgery. 1994 15(6): 383-389
66.
Menger MD, Laschke MW, Amon M, Schramm R, Thorlacius H, Rucker M, Vollmar B.: Experimental models to study microcirculatory dysfunction in muscle ischemia-reperfusion and osteomyocutaneous flap transfer. Langenbecks Arch Surg. 2003 Oct; 388(5): 281-290
67.
Mitsui Y, Schmelzer JD, Zollman PJ, Mitsui M, Kihara M, Low PA.: Hypothermic neuroprotection of peripheral nerve of rats from ischemiareperfusion injury: intraischemic vs. reperfusion hypothermia. Brain Res. 1999 May 8; 827(1-2): 63-69
68.
Mohler LR, Pedowitz RA, Lopez MA, Gershuni DH.: Effects of tourniquet compression on neuromuscular function. Clin Orthop. 1999 Feb; (359): 213220
69.
Nanobashvili J, Neumayer C, Fugl A, Punz A, Blumer R, Prager M, Mittlbock M, Gruber H, Polterauer P, Roth E, Malinski T, Huk I.: Ischemia/reperfusion injury of skeletal muscle: plasma taurine as a measure of tissue damage. Surgery 2003 Jan; 133(1): 91-100
70.
Németh N, Lesznyák T, Brath E, Ács G, Nagy A, Pap-Szekeres J, Furka I, Miko I. Changes in microcirculation after ischemic process in rat skeletal muscle. Microsurgery 2003 23(5): 419-423
71.
Nitz AJ, Dobner JJ, Matulionis DH. Pneumatic tourniquet application and nerve integrity: motor function and electrophysiology. Exp Neurol. 1986 Nov; 94(2): 264-279
72.
Lu YT, Hellewell PG and Evans TW.: Ischemia-reperfusion lung injury: contributions of neutrophyls and hydrostatic pressure. Am. J. Physiol. 1997 273: 46-54
73.
Ohlen A, Lindbom L, Staines W, Hokfelt T, Cuello AC, Fischer JA, Hedqvist P.: Substance P and calcitonin gene-related peptide: immunohistochemical localization and microvascular effects in rabbit skeletal muscle. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1987 Jul; 336(1): 87-93
74.
Okada K.: Reversible changes of skeletal muscular capillaries after application of a tourniquet. Microvasc Res. 1990 Mar; 39(2): 156-168
61
75.
Olivas TP, Saylor TF, Wong HP, Stephenson LL, Zamboni WA.Timing of microcirculatory injury from ischemia reperfusion. Plast Reconstr Surg. 2001 Mar; 107(3): 785-788
76.
O'Suilleabhain C, O'Sullivan ST, Kelly JL, Lederer J, Mannick JA, Rodrick ML.Interleukin-12 treatment restores normal resistance to bacterial challenge after burn injury.Surgery. 1996 Aug; 120(2): 290-296
77.
Oyanagui Y, Sato S, Okajima T.: Suppressions of ischemic paw oedema in mice, rats and guinea pigs by superoxide dismutases from different sources. Free Radic Res Commun. 1988 4(6): 385-396
78.
Piehl F, Hammarberg H, Hökfelt T, Cullheim S.: Regulatory effects of trophic factors on expression and distribution of CGRP and GAP-43 in rat motoneurons. J Neurosci. Res. 1998 51: 1-14
79.
Patman RD, Poulos E. and Shires CT.: The management of civilian arterial injuries. Surgery 1964, 118, 725-737
80.
Rácz IB, Illyés G, Sarkadi L, Hamar J.: The Functional and Morphological Damages of Ischemic Reperfused Skeletal Muscle. Eur Surg Res. 1997 29: 254-263
81.
Renner A.: Traumatológia Budapest, Medicina 2000
82.
Rorabeck CH.: Tourniquet-induced nerve ischemia: an experimental investigation. J Trauma 1980 A Apr; 20(4): 280-286
83.
Rorabeck CH, Kennedy JC. Tourniquet-induced nerve ischemia complicating knee ligament surgery. Am J Sports Med. 1980 B Mar-Apr; 8(2): 98-102
84.
Rubin BB, Smith A, Liauw S, Isenman D, Romaschin AD, Walker PM.: Complement activation and white cell sequestration in postischemic skeletal muscle. Am J Physiol. 1990 Aug; 259(2 Pt 2): 525-531
85.
Saez JC, Cifuentes F, Ward PH, Gunther B, Vivaldi E.: Tourniquet shock in rats: effects of allopurinol on biochemical changes of the gastrocnemicus muscle subjected to ischemia followed by reperfusion. Biochem Med Metab Biol. 1986 Apr; 35(2): 199-209
86.
Sapega AA, Heppenstall RB, Chance B, Park YS, Sokolow D.: Optimizing tourniquet application and release times in extremity surgery. A biochemical and ultrastructural study. J Bone Joint Surg Am. 1985 Feb; 67(2): 303-314
87.
Scott C., Perry M. J. M., Raven P. E., Massey E. J., Lisney S. J. W.: Capsaicin-sensitive afferents are involved in signaling transneuronal effects between cutaneous sensory nerves. Neuroscience 2000 95 (2): 535-541
62
88.
Skofitsch G, Jacobowitz DM.: Calcitonin gene-related peptide coexists with substance P in capsaicin sensitive neurons and sensory ganglia of the rat. Peptides. 1985 Jul-Aug; 6(4): 747-754
89.
Souyri F, Bourre JM.: Altered metabolism of rat contralateral sciatic nerve after microinjection into the endoneurium of the ipsilateral sciatic nerve. Neurosci. Lett. 1989 96: 351-355
90.
Steinau HU.: Major Limb Replantation and Postischaemia Syndrome. Springer, Berlin 1987
91.
Szokoly M, Nemeth N, Brath E, Acs G, Hamar J, Miko I, Furka I.: Experimental "functional amputate model" in ischemia-reperfusion. Magy Seb. 2005 Apr; 58(2): 138-143
92.
Szolcsányi J: Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents and Actions 1988 4-11
93.
Szolcsányi J, Pintér E, Pethő G.: Role of unmyelinated afferents in regulation of microcirculation and its chronic distortion after trauma and damage. In: Reflex Sympathetic Dystrophy: Pathophysiological Mechanisms and Clinical Implications. Janig W, Schmidt RF. (eds), VCH Verlaggeselschaft, Weinheim, 1992 245-261
94.
Szolcsányi J.: Neurogenic inflammation: reevaluation of axon reflex theory. In: Neurogenic inflammation Geppetti P, Holczer P (eds) CRC Press, Roca Raton, 1996 33-42
95.
Tanaka H, Ogura H, Yokota J, Sugimoto H, Yosioka T, Sugimoto T.: Acceleration of Superoxid Production from Leukocytes in Trauma Patients. Ann Surg 1991 214(2): 187-192
96.
Tang ZL, Dai Wen, Li YJ, Deng HW.: Involvement of capsaicin-sensitive sensory nerves in early and delayed cardioprotection induced by brief ischaemia of the small intestine. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1999 359: 243-247
97.
Tömböl T, Pataki G, Németh A, Hamar J.: Ultrastrucutral Changes of the Neuromuscular Junction in Reperfusion Injury. Cell Tissues Organs 2002 170: 139-150
98.
Tremblay GM, Jenelle MF, Bourbonnais Y.: Anti-inflammatory activity of neutrophil elastase inhibitors. Curr Opin Investig Drugs 2003 4: 556-565
99.
Tyden G, Samnegard H, Thulin L, Muhrbeck O, Efendic S.: Circulatory effects of somatostatin in anesthetized man. Acta Chir Scand. 1979 145(7): 443-446
100. Tuncel N, Erden S, Uzuner K, Altiokka G, Tuncel M.: Ischemic-reperfused rat skeletal muscle: the effect of vasoactive intestinal peptide (VIP) on contractile
63
force, oxygenation and antioxidant enzyme systems. Peptides. 1997 18(2): 269-275 101. Urban J., Chan D., Schreiber G.: A rat serum glycoprotein whose synthesis rate increases greatly during inflammation. J. Biol. Chem. 1979 254(21): 10565-10568 102. Yamada M, Ishikawa T, Fujimori A, Goto K.: Local neurogenic regulation of rat hind limb circulation: role of calcitonin gene-related peptide in vasodilatation after skeletal muscle contraction. Br J Pharmacol. 1997 122: 703-709 103. Von Volkmann R.: Die Ischämischen muskelämungen und kontrakturen. Zentrallbl. Chir, 1881 8: 801-803 104. Whetzel TP, Stevenson TR, Sharman RB, Carlsen RC.: The effect of ischemic preconditioning on the recovery of skeletal muscle following tourniquet ischemia. Plast Reconstr Surg. 1997 Dec; 100(7): 1767-1775 105. Williams D.M, Johnson N. W.: Alterations in peripheral blood leukocyte distribution in response to local inflammatory stimuli in the rat. J. Pathol. 1976 118(3): 129-141 106. Zahavi J, Price AJ, Westwick J, Scully MF, Al-Hasani SF, Honey AC, Dubiel M, Kakkar VV.: Enhanced in-vivo platelet release reaction, increased thromboxane synthesis, and decreased prostacyclin release after tourniquet ischaemia. Lancet 1980 Sep; (2): 663-667
64
