DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS
A systemás lupus erythematosus aktivitásának megítélésére szolgáló laboratóriumi paraméterek
Dr. Nagy György
Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Falus András Prof. Dr. Fekete Béla Dr. Varga Lilián Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Sipka Sándor Dr. Kiss Emese
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti és Klinikai Immunológia Budapest, 2002.
1
TARTALOMJEGYZÉK
I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE:.................................................................................4 II. MAGYAR NYELVU ÖSSZEFOGLALÓ:.............................................................5 III. ANGOL NYELVU ÖSSZEFOGLALÓ:...............................................................6 IV. IRODALMI HÁTTÉR:.........................................................................................7 Az SLE epidemiológiája, a laboratóriumi vizsgálatok szerepe az aktivitás meghatározásában:...........................................................................................7 Az anti-DNS antitestek jellemzése, szerepük az SLE patogenezisében, az aktivitás megítélésében:....................................................................................8 Az anti-DNS antitestek általános jellemzése:...........................................8 Az anti-DNS antitestek eredete:..............................................................9 Az anti-DNS antitestek patognosztikus szerepe.....................................10 Az anti-DNS antitestszint meghatározás; az anti-DNS antitest, mint SLE aktivációs marker:.................................................................................11 A komplementrendszer szerepe az SLE patogenezisében és aktivitásának megítélésében:.................................................................................................14 A komlementrendszer muködése:..........................................................14 A
komlementrendszer
vizsgálatának
szerepe
az
SLE
aktivitásának
megítélésében:.......................................................................................16 A komplementrendszer aktivitását jellemzo paraméterek, mint SLE aktivációs markerek:.............................................................................16 A neopterin szerepe az SLE aktivitásának megítélésében:...........................19 A neopterin általános jellemzése:..........................................................19 A neopterin, mint SLE aktivációs marker:.............................................20 A
szolubilis
interleukin-2
receptor
szerepe
az
SLE
aktivitásának
megítélésében:................................................................................................21 A szolubilis interleukin-2 receptor általános jellemzése:........................21 A szolubilis interleukin-2 receptor, mint aktivációs marker:...................21 A citokinháztartás szabályozásának zavara SLE-ben:.................................22 2
Interleukin-2:........................................................................................22 Interleukin-4:........................................................................................24 Interleukin-6.........................................................................................24
Interleukin-10:......................................................................................24 Interleukin 12.......................................................................................24 Alfa interferon:.....................................................................................25 Gamma- interferon...............................................................................25 Tumor nekrosis faktor a :.....................................................................26 Egyéb paraméterek:..............................................................................26 V. CÉLKITUZÉSEK:....................................................................................................28 VI. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK:..........................................................................30 Betegcsoportok:..............................................................................................30 A betegségaktivitás meghatározása:..............................................................30 Vér- és vizeletvétel, a minták tárolása:..........................................................30 Rutin laboratóriumi módszerek:...................................................................31 Komplementaktivációs komlexek koncentrációjának meghatározása:........31 Anti-C1q antitest koncentráció meghatározása:..........................................33 Anti-koleszterin antitest koncentráció mérése:.............................................33 Szérum
neopterin
és
szolubilis
interleukin-2
receptor
szint
mérése:............................................................................................................33 Áramlási citometria:......................................................................................34 RT-PCR:........................................................................................................34 Statisztikai módszerek:..................................................................................35 VII. EREDMÉNYEK:...............................................................................................38 A komplementaktivációs termékek vizsgálata SLE-ben (1. közlemény):.....38 Anti-koleszterin antitest vizsgálata SLE-ben (2. közlemény):......................46 Intracelluláris citokintermelés (INF-? és IL-4) vizsgálata SLE-ben (3. közlemény):...............................................................................................47 Az IFN-?, IL-4 és IL-10 mRNS vizsgálata SLE-ben (4. közlemény):...........49
3
Több laboratóriumi paraméter együttes értékelése SLE-ben (5. közlemény):...............................................................................................55 VIII. MEGBESZÉLÉS:............................................................................................63 IX. LEGFONTOSABB SAJÁT EREDMÉNYEK:.................................................68 X. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS:.............................................................................69 XI. IRODALOMJEGYZÉK:....................................................................................70 XII. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE:.........................................................80
4
I: Rövidítések jegyzéke ABTS:
etilbenztiazolin-6-szulfonsav
BILAG:
„British Isles Lupus Assessment Group”
BSA:
borjú (bovin) szérum albumin
CH50
összhaemolítikus aktivitás
C1rs-C1inh:
C1rs-C1 inhibitor komplex
C3b(Bb)P:
alternatív konvertáz
DNS:
dezoxiribonukleinsav
GTP:
guanozin-trifoszfát
EDTA:
etiléndiamin-tetraecetsav
ELISA:
"Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay"
IC:
immunkomplex
IL:
interleukin
FITC:
fluoreszcein-izotiocianát
IFN:
interferon
mRNS:
messenger ribonukleinsav
OD:
optikai denzitás
OPD:
O-feniléndiamin
PBMC:
perifériás vér mononukleáris sejt
PBS:
foszfáttal pufferolt sóoldat
PE:
fikoeritrin
PMA:
phorbol-miristát-acetát
RIA:
radio-immuno-assay
RNS:
ribonukleinsav
ROC:
„Receiver Operator Characteristics”
RT- PCR:
reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció
SC5b-9:
szoubilis terminális komplex
sIL-2R:
szolubilis interleukin-2 receptor
SLE:
systemás lupus erythematosus
SLEDAI:
„Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index”
TNF:
tumor necrosis faktor
5
II: Magyar nyelvu összefoglaló A systemás lupus erythematosus (SLE) szisztémás autoimmun betegség, melynek aktivitása folyamatosan változik. Néhány laboratóriumi paraméter rendelkezésre áll az SLE aktivitásának megítélésére, de ezek szenzitivitása és specificitása a kívánatosnál alacsonyabb. Munkánk során az SLE klinikai aktivitásának megítélésére használható - a rendelkezésre álló módszereknél jobban használható - laboratóriumi markereket kerestünk. A komplementaktiváció során képzodo protein-protein komplexek eredményeink szerint hasznos SLE aktivációs markerek. A vizsgált paraméterek közül az alternatív konvertáz enzim[(C3B(Bb)P] szérumszintje korrelált legjobban a betegség aktivitásával (Rs=0.41, P<0.001) és mutatta a legnagyobb különbséget a klinikailag aktív és inaktív betegek között (P<0.001). A szolubilis terminális komplex (SC5b-9) kevésbé hasznos aktivációs markernek bizonyult mint az alternatív konvertáz, ugyanakkor a C3, C4, CH50 meghatározásoknál hasznosabb volt az SLE aktivitásának megítélésében. Az anti-koleszterin antitest szintje magasabb volt lupusos betegek szérumában, mint egészséges kontrollokéban (P<0.001), de nem volt szignifikáns különbség az aktív és inaktív betegek között. Lupusos betegekbol nyert limfociták citokin-termelését is vizsgáltuk. Az interleukin-4 (IL-4) és interferon-gamma (IFN-?) termelésében nem találtunk szignifikáns különbséget SLE-s betegek és egészséges kontrollok, illetve aktív és inaktív SLE-s betegek között. Egy beteg mintáiban - igen magas klinikai aktivitás mellett - jelentos IL-4 túlsúlyt és alacsony IFN-? szintet találtunk, az aktivitás csökkenésével az IL4 szint csökkent, míg az IFN-? szint növekedett. Az IFN-? és IL-10 mRNS szint ugyanakkor SLE-s betegek mononukleáris sejtjeiben szignifikánsan magasabb, míg az IL-4 szignifikánsan alacsonyabb volt. Több laboratóriumi paraméter együttes értékelésével hasznos információ nyerheto a klinikai aktivitás megítélésére. Logisztikus regresszió módszerével eloállítottunk egy egyszeru, klinikai laboratóriumban is alkalmazható formulát. A formula használatával aktivitási valószínuség számolható, mely szignifikánsan jobb a klinikai aktivitás becslésére, mint az egyedi tesztek.
III: Angol nyelvu összefoglaló 6
Systemic lupus erythematosus is a systemic autoimmune disease, with disease activity varying over time. There are some laboratory parameters, which help to assess disease activity, however, we still lack equivocal disease activation markers. Our aim was to find new SLE activation markers, which display better characteristics than the existing methods. We found that protein-protein complexes produced upon complement activation are useful SLE activation markers. Alternative convertase enzyme level [C3B(Bb)P] had the highest correlation with disease activity (Rs=0.41; P<0.001), as well as it showed the highest difference between clinically active and inactive patients (P<0.001), among the parameters measured. The soluble terminal complex SC5b-9 was less sensitive and less specific activation marker than C3B(Bb)P, however, it was still more useful than traditional complement determinations such as C3, C4, or CH50 measurement. Anticholesterol antibody level was found to be elevated in lupus patients, comparing with healthy individuals (P<0.001), but there was no significant difference between clinically active and inactive patients and there was no significant correlation with clinical activity. Intracellular cytokine balance was also measured in lupus patients’ lymphocytes. We did not find significant difference in interleukin-4 (IL-4) and interferon-gamma (IFN-?? levels between either SLE patients and healthy individuals or active and inactive SLE patients. One patient with highly active diasease showed a marked IL-4 predominance over IFN-?, however with decreasing disease activity, IL-4 level decreased and IFN-? increased. In contrast with the protein levels, IFN-? and IL-10 mRNA were significantly increased, IL-4 mRNA was significantly decreased in SLE patients’ peripheral blood lymphocytes. According to our results. it is possible to reach more information about clinical activity with the combination of more laboratory test results. We constructed a simple formula with logistic regression method with can be used in clinical laboratory. Using this formula Prabability of Clinical Activity (PCA) can be calculated, which gives significantly better estimation of clinical activity than single tests.
IV: Irodalmi háttér Az SLE epidemiológiája, a laboratóriumi vizsgálatok szerepe az aktivitás 7
meghatározásában A systemás lupus erythematosus (SLE) az egyik legtöbbet vizsgált autoimmun betegség, az immunkomplex betegségek prototípusa. Nokben kilencszer gyakoribb, mint férfiakban, prevalenciája nok körében 1:800-1000 közé teheto, gyakoribb, mint számos jól ismert betegség. A betegség általános immunregulációs zavarral jár, SLE-s betegeken számos immunológiai paraméter változásáról számoltak be (1, 2). Az SLE szinte minden szervet megbetegíthet, számos esetben progresszív betegséghez, maradandó szervkárosodáshoz vezet. Aktivitásának mértéke idorol-idore változik. A tünet és panaszmentes periódusok alatt nem indokolt a kezelés, vagy csak fenntartó kezelésre van szükség. A klinikailag aktív periódusokban azonban intenzív kezelés szükséges, mely önmagában is komoly mellékhatásokkal járhat, ezért is igen fontos, hogy a kezelés a megfelelo idoben és módon történjék. A betegek klinikai állapota az esetek egy részében huen tükrözi a betegség aktivitásának mértékét és jelzi a kezelés szükségességét. A klinikai állapot megítélésén kívül laboratóriumi vizsgálatoknak is szerepe van az SLE diagnózisának felállításában, az aktivitás mértékének megítélésében, a terápiára adott válaszreakció értékelésében. További szerepe lehetne a laboratóriumi vizsgálatoknak az exacerbációk elorejelzése. Nem rendelkezünk olyan laboratóriumi paraméterrel, mely megfelelo szenzitivitással és specificitással jelzi az SLE aktivitásának mértékét (3-6).
Számos paraméterrol leírták, hogy korrelációt mutat az SLE aktivitásával. Ezek egy része rutin vizsgálóeljárássá vált, míg számos módszer még nem vonult be a mindennapi klinikai gyakorlatba. A következokben az általánosan elfogadott, vagy a mindennapi klinikai gyakorlatba még be nem vonult, de ígéretesnek tuno aktivációs markerekkel kapcsolatos tapasztalatokat ismertetem. Sok esetben csupán az ismert, hogy bizonyos paraméterek lupusos betegekben különböznek egészséges kontrolloktól, de a betegség aktivitásával való összefüggést nem vizsgálták. Ezen utóbbi potenciális aktivációs markerek egy része szintén helyet kap munkámban.
8
Az anti-DNS antitestek jellemzése, szerepük az SLE patogenezisében, az aktivitás megítélésében Az anti-DNS antitestek általános jellemzése Az egyik legfontosabb és legtöbbet vizsgált SLE aktivációs marker az anti-DNS antitest (7-8). A DNS molekula két polinukleotid láncból felépülo kettos láncú makromolekula, mely természetes állapotában térszerkezetét tekintve jobb menetes helikális struktúrát alkot. Melegítés hatására a kettos lácú szerkezetet szilárdító hidrogén hidak közötti kötés felszakad és a kettos lánc egyes szálú DNS molekulákra esik szét. Az anti-DNS antitestet 1957-ben írták le elso alkalommal. Az anti-DNS antitestek szintje az SLE-s betegek jelentos részében emelkedett az egészséges kontrollpopulációhoz képest és számos adat szerint a betegség aktivitásával általában változik. Az anti-DNS antitestek szintje már évekkel az SLE diagnózisának felállítása elott is emelkedett az esetek mintegy 50 százalékában (9). Az emelkedett anti-DNS antitestest szint az SLE jelenleg elfogadott American Rheumatism Association (ARA) klasszifikációs (diagnosztikus) kritériumainak egyike, azonban a diagnózis megfelelo számú egyéb kritérium jelenléte esetén felállítható normális anti-DNS szint esetén is (10). Az anti-DNS antitestek szintje több, az SLE aktivitásának megítélésére szolgáló index része, így a manapság leginkább elfogadott Systemic Lupus Eythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) része is (11). Az immunológiai homunculus részeként egészségesekben is eloforduló IgM izotípusú, polispecifikus, kis affinitású anti-DNS antitestek temelodését igazolták, mely antitestek a saját struktúrák védelmében játszhatnak szerepet. A kettos láncú DNS molekulaforma elleni IgG izotípusú antitest azonban elsosorban SLE-s betegek szérumában fordul elo (12-13). Mind az egyes, mind a kettos szálú DNS molekulaforma elleni antitesteket kimutatták humán plazmában. A kettos szálú DNS preparátumok különbözo mértékben tartalmazhatnak egyes szálú DNS molekulákat is és fordítva, továbbá közös epitópok miatt az egyes és a kettos szálú DNS elleni antitestek keresztreagálhatnak egymással. Így a csak egyes-, vagy csak kettos -szálú DNS elleni antitestek azonosítása problematikus. Mind egyes, mind kettos szálú DNS elleni antitest gyakori SLE-s betegek szérumában (14).
9
Az anti-DNS antitestek eredete Az anti-DNS antitest termelés az SLE-ben megfigyelt poliklonális B sejt aktiváció részjelensége. Így például B sejt mitogénekkel (pl. lipopolysachariddal) anti-DNS termelés indukálható (15). Ugyanakkor a poliklonális B sejt aktiváció kizárólagos szerepe ellen szól, hogy lupusos betegekben elsosorban nagy affinitású IgG izotípusú anti-DNS antitestek termelodnek, mely T sejtek részvételére utal. Szintén a T sejtek anti-DNS termelésben való részvétele mellett szól, hogy állatmodellekben a T sejtfunkciók gátlása csökkenti az anti-DNS szintet, enyhíti a lupusos glomerulonephritist (16-18). Számos érv szól tehát a T sejtek részvétele mellett az anti-DNS antitest termelésben, ugyanakkor szerepük pontosan nem tisztázott a DNS specifikus B sejtek stimulálásában. Nem tunik valószínunek, hogy a B sejtek közvetlenül a DNS molekulát mutatnák be HLA-val asszociálva T sejteknek, bár ezt is alátámasztja néhány megfigyelés. A DNS molekulával in vivo kötodo fehérjék, így hiszton-, vagy víruseredetu DNS-köto fehérjék szerepe is felvetodik a folyamatban. Datta és munkatársai hiszton-specifikus T sejtek jelenlétét igazolták SLE-ben. A szerzok szerint elképzelheto, hogy a DNS-specifikus B sejtben a DNS-sel egyidoben megtörténik a hiszton-, vagy más DNS-köto peptid feldolgozása és prezentációja, mely anti-DNS termelést stimulálhat. Hipotézisünk mellett szól, hogy klónozott, hiszton-specifikus T sejtek egérbe juttatva anti-DNS termelést váltanak ki (19-21) A legtöbb eukariota fajból származó DNS önmagában nem okoz antitestválaszt, proteinDNS komplex azonban antitesttermelést indukál. Egészséges állatokban ilyen módon egyes szálú DNS elleni antitesttermelés indukálható. Kémiailag módosított DNS, glikozilált DNS, vagy egyéb szintetizált polinukleotid adjuváns nélkül is antitesttermelést indukál, mely antitestek igen specifikusak az immunizáló molekulára, nem keresztreagálnak sem egyes, sem kettos szálú DNS-sel (22-23). Trypanosoma cruziból származó 52 aminosav tartalmú peptid és emlos DNS komplex hatásosan vált ki egyes szálú DNS elleni antitest termelést. Többszöri immunizáció kettos szálú DNS elleni antitestek megjelenésével járt (24). Vizsgálatok történtek arra vonatkozóan, hogy az eukariota DNS önnmagában miért nem immunogén, illetve megváltozhat-e ez a tulajdonság SLE-s betegekben. SLE-s betegek szérumában p53 tumor necrosis faktor karboxiterminális doménja elleni antitest a kontroll egészséges populációnál nagyobb mennyiségben található meg. A p53 karboxiterminális domén a sejtbol kikerült, sérült DNS molekulához kötodik, így gátolva a DNS elleni immunválaszt. Az antiDNS antitest DNS-hez való kötodése gátolható p53 tumor necrosis faktorral. Így az emelkedett 10
anti p53-nak szerepe lehet a sérült DNS molekulák elleni hatékony immunválasz kialakulásában SLE-s betegeken (25). A DNS-sel, vagy protein DNS komplexszel történo immunizáció nem csupán antitesttermelést okoz, de az endotoxinhoz hasonlóan aktiválja az immunrendszert is. Az antitesttermelés és az immunrendszert aktiváló hatás lényegesen kifejezettebb és gyakrabban fordul elo bakteriális DNS molekulával történo immunizáció esetén. Egyes megfigyelések szerint, meglepo módon, állatkísérletekben emlos sejtekbol származó DNS-sel gátolható a bakteriális DNS-re adott immunválasz (26). SLE-s betegek szérumából nyert anti-DNS DNS-köto képessége foszforilkolinnal gátoható. A foszforilkolin elsosorban mikrobiális eredetu DNS molekulán fordul elo. Az IgG1 antitestválasz, mely valószínuleg T sejt-függo mechanizmussal jön létre, hatékonyabban gátolható foszforilkolinnal, mint az IgG2 típusú, T sejttol független antitestválasz (27). Vizsgálatok történtek az anti-DNS termelo limfociták pontosabb azonosítására is. A CD5 sejtfelszíni markert tartalmazó (CD5 pozitív) B limfociták kis részét képezik a teljes B sejt repertoárnak (5-10 %). Általánosan elfogadott, hogy a polispecifikus, kis affinitású, IgM izotípusú antitesteket, melyek elsosorban a saját struktúrák védelmében játszanak szerepet, foleg a CD5 pozitív B sejtek termelik. Anti-DNS antitestek esetében mind IgG, mind IgM izotípus a CD5 pozitív és CD5 negatív B limfocitákban egyaránt termelodik, ugyanakkor a nagy affinitású antiDNS antitestek fo forrása a CD5 negatív B limfocita populáció. A CD5 pozitív és a CD5 negatív B limfociták anti-DNS termelésében további különbség, hogy míg a CD5 negatív B limfociták anti-DNS termelése a poliklonális B sejt aktiváció mértékétol függ, a CD5 pozitív B sejteké ettol független (28-29).
Az anti-DNS antitestek patognosztikus szerepe Számos megfigyelés utal az anti-DNS antitestek patogenetikai szerepére. Egérben monoklonális anti-DNS lupus szeru betegséget indukál, mely autoantitest termeléssel, lupusos glomerulonephritissel jár (30-32). A kettos szálú DNS elleni antitestek mennyisége és a lupusos glomerulonephritis intenzitása közötti összefüggés alapján szintén feltételezheto, hogy az antitesteknek a betegség aktivitásának jelzésén túl patogén szerepe is van. A feltételezett patomechanizmusok egyike a komplement komponenseket is tartalmazó immunkomplexek képzodése és lerakódása a glomerulusban,
mely
mellett
szól
a
lupus
nephritisben
gyakran
megfigyelheto
komplementaktiváció. Az anti-DNS antitestek keresztreakcióját heparán szulfáttal, alfa aktininnel
11
és lamininnal is igazolták, mely - mivel mindkét makromolekula megtalálható a vesében - szintén az anti-DNS antitestek nephrotoxikus hatásának potenciális patomechanismusa lehet (33-35). Az anti-DNS antitestek patognosztikus szerepe valószínunek tunik, ugyanakkor más mechanizmus egyideju jelenléte is feltételezheto, hiszen csupán az anti-DNS antitestek kötodése nem magyarázza a lupus nephritises betegekbol származó vesebiopsziás mintákon fénymikroszkóppal megfigyelheto depozitumok jelenlétét. IgG és IgM izotípusú anti-DNS antitestek is mérheto mennyiségben vannak egészséges kontrollok szérumában, ugyanakkor az anti-DNS antitesteknek SLE-ben számos adat szerint patogén szerepe van. Felvetodik a kérdés, hogy a patogenetikai jelleg magyarázható-e csupán az antitestek mennyiségének különbségével. Korábbi munkák eredménye szerint SLE-s betegekbol származó anti-DNS antitest különbözo eukariota és prokariota fajokból származó DNS-sel egyaránt reagál, míg egészséges kontrollokból származó anti-DNS igen specifikus Micrococcus lysodeicticusból és Staphylococcus epidermidisbol származó egyes szálú DNS-re. Igazolták továbbá, hogy az SLE-s betegekbol származó anti-DNS a legtöbb forrásból származó DNS molekulán eloforduló közös epitop ellen irányul, míg az egészségesek szérumában található antiDNS a fent említett baktériumfajokból származó DNS molekula epitopja ellen irányul. Valószínunek tunik tehát, hogy egészségesek és SLE-s betegek anti-DNS antitest specificitása közötti különbség is szerepet játszik az SLE-s anti-DNS patogén jellegében (36). Az anti-DNS antitestszint meghatározás; az anti-DNS antitest, mint SLE aktivációs marker Az anti-DNS antitestek részben szabadon keringenek, részben immunkomplexeket képeznek, melyek különbözö szervekben rakódhatnak le. Az anti-DNS antitestek különböznek komplementaktiváló képességben, aviditásban, antigén specificitásban, egyéb antigénekkel való keresztreaktivitásban. Több módszer áll rendelkezésre az anti-DNS antitestek szintjének meghatározására, melyek közül leginkább elterjedt az ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) módszer, a Farr módszer és a Crithidia luciliae módszer (7). Egyes tanulmányok szerint, a különbözo módszerek eltéro aviditású antitesteket detektálnak. A Farr módszer elsosorban a nagy aviditású anti-DNS antitestek szintjét méri, mely veseérintettség esetén emelkedett, míg az ELISA módszer a kis aviditású antitesteket is detektálja, melyek például cerebrális érintettségre jellemzoek (37-38). A legtöbb vizsgáló szerint az anti-DNS antitest szintjének változása fontosabb annak abszolút értékénél. Néhány megfigyelés szerint az exacerbáció elott néhány héttel emelkedni kezd az anti-DNS antitestek szintje. Közvetlenül az exacerbáció elott az anti DNS antitestszint 12
lassabban növekszik, vagy csökken, mely megfigyelés az anti-DNS tartalmú immunkomplexek keletkezésére utal, melyek fontos szerepet játszanak az SLE patogenezisében (7). Az anti-DNS antitest keresztmettszeti és longitudinális vizsgálatokban is jó aktivációs markernek tunt sok vizsgáló szerint. Néhány longitudinális vizsgálat az exacerbáció elotti antiDNS emelkedésrol is beszámolt és felvetette az anti-DNS antitestek exacerbációt elorejelzo szerepét. Néhány jelentosebb vizsgálat az alábbi eredményeket találta: Swaak és munkatársai (8; 39-40) 143 SLE-s beteg követéses vizsgálatát végezték hat éven át. Munkájuk során anti-DNS antitestek és a komplementfaktorok exacerbációt elorejelzo tulajdonságát vizsgálták. A betegeket kezeloorvosuk négy-hat hetente vizsgálta. A vizsgált ido alatt 33 beteg 37 exacerbációját figyelték meg, melyek közül 21 esetben volt veseérintettség, 12 esetben veseérintettség nem volt (csak az elso shubot értékelték). Megfigyeléseik szerint a veseérintettséggel járó 21 esetben az anti-DNS antitestek emelkedo szintje (tíz hét alatti megduplázódás) 100 százalékosan szenzitív és 100 százalékosan specifikus elorejelzoje volt veseérintettséggel
járó
exacerbáció
bekövetkeztének.
Az
exacerbációk
alatt,
mind
veseérintettséggel járó, mind veseérintettséggel nem járó forma esetén klinikailag inaktív betegekhez képest szignifikánsan magasabb anti-DNS szintet mértek. A szerzok felvetik az exacerbációt megelozo immunszupresszív terápia lehetoségét emelkedo anti-DNS szint esetén. Ter Borg és munkatársai (7) 72 beteg követéses vizsgálatát végezték átlagosan 18.5 hónapon át. A vizsgálat ideje alatt 33 exacerbációt figyeltek meg, melyek közül 13 veseérintettséggel járt, 20 nem járt veseérintettséggel. Az anti-DNS antitest szintet Farr módszerrel, Crithidia luciliae módszerrel és ELISA módszerrel is mérték. A megfigyelt 33 exacerbációhoz 27 esetben társult anti-DNS szint emelkedés legalább egy módszerrel mérve (27 esetben Farr módszerrel, 19 esetben Crithidia luciliae módszerrel és 23 esetben ELISA módszerrel). A 27 anti-DNS szint emelkedéssel kísért exacerbációból 24 esetben az alkalmazott módszerek közül legalább egy szignifikánsan emelkedett az exacerbáció elott. 23 alkalommal a Farr módszer, 12 alkalommal a Crithidia luciliae módszer, míg 17 alkalommal az ELISA módszer jelezte elore az exacerbációt. Néhány esetben az anti-DNS antitest szint szingifikáns emelkedése nem járt együtt exacerbációval (Farr módszer 5 alkalom, Crithidia luciliae módszer 7 alkalom, ELISA módszer 3 alkalom). A veseérintettséggel járó exacerbációk 92, míg a veseérintettséggel nem járó exacerbációk 55 százalékában találták magasabbnak az anti-DNS szintet a betegek korábbi anti-DNS szintjéhez képest. A Farr módszert szenzitívebbenk találták, mint a Crithidia luciliae, vagy ELISA módszereket. A szerzok felvetik az immunszupresszív terápia lehetoségét magas anti-DNS szint esetén, klinikai aktivitás hiányában is, exacerbációt megelozo terápiaként.
13
Eredményeik szerint az anti-DNS szint mérése informatívabb, mint a C3, vagy C4 komplementszintek mérése. Abrass és munkatársai (41) 48 beteg követéses vizsgálatát végezték 6-18 hónapon át. Vizsgálataik szerint az anti-DNS antitest szintjének emelkedése nem jelzi megbízhatóan elore az SLE exacerbáció bekövetkeztét. Petri és munkatársai (42) 185 SLE-s beteget követtek 14 hónapig. A megfigyelési ido során 146 exacerbáció értékelése alapján nem találták hasznosnak az anti-DNS antitest mérését. Esdaile és munkatársai (4) 202 beteg követését végezték átlagosan 86.5 hónapon át. 83 exacerbációt figyeltek meg 53 betegnél. Megfigyeléseik szerint az anti-DNS antitest szintje az esetek dönto részében nem emelkedik meg exacerbáció elott. Ugyanakkor mind veseérintettséggel járó mind veseérintettséggel nem járó exacerbáció alatt szignifikánsan magasabb anti-DNS szintet mértek a klinikailag inaktív betegekhez képest. A legtöbb vizsgáló szerint az emelkedett anti-DNS szint meglehetosen specifikus SLE-re. Egyes vizsgálók szerint az exacerbációkat gyakran az anti-DNS szinjének emelkedése elozi meg, illetve kíséri, míg mások szerint az anti-DNS emelkedés gyakran elmarad az exacerbáció alatt. Bizonyos betegeknél permanensen magas anti-DNS szint mérheto klinikai aktivitás jelei nélkül, mely talán az anti-DNS meghatározás legfontosabb hibájának tekintheto. A vizsgálók által leírt jelentos különbségek fo okai a különbözo betegpopuláció, a különbözo módszerrel történo anti-DNS meghatározás, a klinikai aktivitás eltéro kritériumai, az adatok különbözo statisztikai módszerekkel történo értékelése és a longitudinális vizsgálatokban különbözo gyakorisággal történo betegvizsgálatokban keresendo, melyek miatt a különbözo vizsgálatok eredményei csak fenntartásokkal hasonlíthatóak össze egymással. Szintén különböznek a vizsgálatok abban a tekintetben, hogy az anti-DNS antitest aktivitást elorejelzo képességét, vagy a klinikai aktivitás jelenlétét detektáló képességét vizsgálták. Az anti-DNS antitest meghatározás a széles körben elterjedt és a rutin vizsgálóeljárások közül az egyik leghasznosabb módszer, melynek szerepe feltehetoen a jövoben változni fog az SLE aktivitásának laboratóriumi értékelésében.
A komplementrendszer szerepe az SLE patogenezisében és aktivitásának megítélésében A komplementrendszer muködése A komplementrendszer limitált proteolízissel aktiválódó molekulák kaszkádja, mely számos fontos effektor funkcióval rendelkezik, úgy mint a kórokozó molekulák lízise,
14
anafilaktikus, kemotaktikus hatás, opszonizáció, valamint az immunkomplexek eltávolítása a keringésbol (1; 2; 43; 44). A komplementrendszer klasszikus úton, alternatív úton és lektin-indukált úton aktiválódhat (1. ábra). A klasszikus utat elsososorban az IgG, vagy IgM tartalmú immunkomplexek aktiválhatják. Az aktivációhoz a C1q globuláris fejéhez legalább két, komplexben lévo ellenanyagmolekula Fc részének kell kötodnie. Az antigénnel immunkomplexet alkotó IgM molekulán legalább három kötohely válik hozzáférhetové, így egyetlen IgM molekula elég lehet a C1q aktiválásához. A planáris szerkezetu, antigénhez nem kötodo IgM nem reagál C1q molekulával. A monomer IgG csak egyetlen C1q kötohellyel rendelkezik, így a C1q aktiválásához legalább két IgG molekula egyideju kötodése szükséges a C1q globuláris fejéhez úgy, hogy közöttük 35-45 nm távolság legyen. Az IgM tartalmú immunkomplexek tehát hatékonyabban aktiválják a komplementrendszert. Az alternatív utat elsosorban Gram negatív, Gram pozitív baktériumok, vírusok, vírussal fertozött sejtek, paraziták, gombák és immunkomplexek aktiválhatják. Az alternatív út aktiválódását a kis mértékben állandóan hidrolizáló C3 (C3H 2O) molekulák teszik lehetové. Az „idegen” felszínhez, vagy immunkomplexhez kötodo C3H 2O aktív marad, mely lehetové teszi az alternatív konvertáz [C3b(Bb)P] keletkezését, az alternatív út aktiválódását. A C3b(Bb)P enzim a natív, nem hidrolizált C3 molekulát hasítja, így ezen a ponton pozitív visszacsatolás történik, hiszen az enzim szubsztrátja annak alegysége is egyben. A lektin indukált utat a mannózköto lektinnel (MBL) opszonizált mikroorganizmusok képesek aktiválni. A
komplementrendszer
aktivációja
protein-protein
komplexek
és
komplementdegradációs termékek keletkezéséhez vezet, melyek szérumszintje jelzi a komplementaktiváció mértékét (43). A C1 komponens aktivációját követoen a C1-inhibitor C1r és C1s molekulákkal kötodik, így C1rs-C1inhibitor (C1rs-C1 inh.) komplex keletkezik. A C1rsC1-inhibitor szérumszintje a klasszikus út aktivitásának mértékét jelzi (45) Az alternatív út aktivációja során keletkezo C3b(Bb)P szérumszintje az alternatív út, míg a szolubilis terminális komplex (SC5b-9) szintje a végso közös út aktivitásának mértékét
15
16
tükrözi. Számos komplementdegradációs termék mennyisége mérheto szérumban. Így a C3a, C5a, C4d, Ba, Bb faktorok mennyisége is a komplementrendszer aktivitásának mértékétol függ.
A komplementrendszer vizsgálatának szerepe az SLE aktivitásának megítélésében Számos adat utal arra, hogy az SLE aktív szakában nagy mennyiségben termelodo különbözo antitestek immunkomplexeket alkotnak antigénjeikkel és komplementfaktorokkal, majd ezek az immunkomplexek a komplementrendszert aktiválják (1; 2; 43). A komplementrendszer aktiválódásával no a komplementfaktorok felhasználása, csökken koncentrációjuk. Párhuzamosan a betegség aktivitásával kialakuló akutfázis reakció részeként számos komplementfaktor termelodése fokozódik, mely a fokozott felhasználás mellett a komplementfaktorok szintjét és az összhaemolitikus aktivitás mértékét befolyásolja. A fokozott felhasználással
együtt
jelentkezo
fokozott
termelés
magyarázatul
szolgál
e
komplementmeghatározások korlátozott klinikai értékére. A C3, C4 és összhaemolitikus aktivitás meghatározás a legtöbb korábbi tanulmány szerint nem jelzi kelloen megbízhatóan elore a betegség aktiválódását, illetve az aktivitás jelenlétét sem ( 3-6). Az összhaemolitikus aktivitás, a C3, C4 komplementfaktorok szintjének csökkenése is a SLEDAI index része (11).
A komplementrendszer aktivációját jellemzo paraméterek, mint SLE aktivációs markerek Néhány fontosabb korábbi vizsgálat eredményeit az alábbiakban foglalom össze: Valentijn és munkatársai (46) 33 SLE-s beteg longitudinális vizsgálatát végezték 38 hónapig. Megfigyeléseik szerint az összhaemolitikus aktivitás 32 százalékos szenzitivitással és 80 százalékos specificitással, a C3 komplement 20 százalékos szenzitivitással és 94 százalékos specificitással, míg a C4 komplement 49 százalékos specificitással és 47 százalékos szenzitivitással jelzi az SLE aktivitását. Megfigyeléseik szerint a C3 és C4 komplementszint és az összhaemolitikus aktivitás szintje szignifikánsan alacsonyabb veseérintettség esetén, mint veseérintettséggel nem járó exacerbációban. Központi idegrendszeri manifesztáció esetén a C3 komplementszint és az összhaemolitikus aktivitás magasabb volt, mint egyéb szervi manifesztációkkal járó exacerbációban. Swaak és munkatársai (8; 39-40) megfigyelései szerint, 16 héttel a vesét érinto exacerbáció elott a C4 komplementfaktor szintje az esetek 80 százalékában, míg a C3 az esetek 50 százalékában jelezte az exacerbáció bekövetkeztét. A vését nem érinto exacerbációk esetében az exacerbáció elott 24 héttel végzett vizsgálat szerint a C3 komplementfaktor 30 17
százalékos, míg a C4 komplementfaktor 40 százalékos szenzitivitással jelezte elore az exacerbációt. Ter Borg és munkatársai (7) vizsgálatai szerint a C3 komplement 51, a C4 komplement 21 százalékos szenzitivitással jelzi a betegség aktivitását. Abrass és munkatársai (41) vizsgálatai szerint a C3 komplement szintje nem jelzi elore megbízhatóan az SLE aktiválódását. Sturfelt és munkatársai (47) 33 beteg követéses vizsgálatát végezték, átlagosan 20 hónapon át. Vizsgálataik szerint a C3 és C4 komplement nem jelezte elore megbízhatóan a vizsgálati ido alatt megfigyelt 24 exacerbációt, melyek közül 8 veseérintettséggel járt, 16 nem járt veseérintettséggel. Petri és munkatársai (42) megfigyelései szerint a C3 és C4 komplement 50 százalékos szenzitivitással jelezte az exacerbációt. A C3, C4 komplementfaktorok és az összhaemolitikus aktivitás tehát az esetek egy részében hasznosnak bizonyult az SLE aktivitásának megítélésében, számos vizsgáló szerint azonban ezek a vizsgálatok nem rendelkenek kello szenzitivitással és specificitással, melynek egyik oka, hogy a komplementrendszer aktivitását az SLE-s exacerbáción kívül számos más folyamat is okozhatja. Nehezíti a vizsgálatok értékelését a komplementfaktorok fent említett fokozott termelodése exacerbáció alatt, mely ellensúlyozza a fokozott felhasználást (43). Az öröklodo komplementdeficienciák szintén nehezítik a komplementfaktorok értékelését (48-49). Ennek kiküszöbölésére különbözo, a komplementaktiváció során keletkezo proteinprotein komplexek, vagy komplement degradációs termékek szintjét lehet mérni, melyek elsosorban a komplementrendszer aktivitásának mértékétol függenek. Sturfelt és munkatársai (50) nyolc SLE-s beteg átlagosan három évig tartó követéses vizsgálatát végezték. Eredményeik szerint a klasszikus út aktivációját mutató C1rs-C1inhibitor komplex nem különbözött szignifikánsan klinikailag aktív és inaktív állapotban. A C1rs-C1-inh. komplex szignifikánsan korrelált az immunkomplexek szintjével. A számos egyéb vizsgált komplementkomponens közül a C1s, C4-köto protein, C5 és properdin szintjét exacerbáció alatt kissé alacsonyabbnak találták. Manzi és munkatársai (51) 31 SLE-s beteg követéses vizsgálatát végezték átlagosan 12 hónapon keresztül. Munkájuk során összehasonlították komplementaktivációs termékek és C3, C4 komplementmérés értékét az SLE aktivitásának megítélésében és az aktivitás elorejelzésében. Az aktivitás jelenlétének megítélésében megfigyeléseik szerint a C4d szenzitivitása 71százalék, míg specificitása 58 százalék volt. A C3b szenzitivitása 78 százalék, specificitása 52 százalék volt. A szolubilis terminális komplex (SC5b-9) szenzitivitása 62 százalék, specificitása 54 százalék volt. A C3 és C4 komplementfaktor szenzitivitása és specificitása a komplementaktivációs termékeknél kissé alacsonyabb volt. Az exacerbáció
18
elorejelzésében a komplementaktivációs termékek és a C3, C4 komplement egyaránt 50-65 százalék körüli szenzitivitással és 50-60 százalék körüli specificitással rendelkezett. Buyon és munkatársai (52) 86 SLE-s beteg követéses vizsgálatát végezték 15 hónapon át. A vizsgálat során nyert 380 plazmából SC5b-9, Ba, Bb, C4d komplementaktivációs termékeket mértek. Eredményeik szerint a vizsgált komplementaktivációs termékek közül az alternatív útvonal aktivitását jellemzo Ba faktor jelezte elore legjobb szenzitivitással és specificitással az exacerbáció bekövetkeztét, míg a klasszikus út aktivitásának mértékét mutató C4d mérése bizonyult legkevésbé informatívnak. A C3, C4 komplementfaktorok és az összhaemolitikus aktivitás szenzitivitása és specificitása kisebb volt, mint a komplementaktivációs termékek esetében. Megfigyeléseik szerint az exacerbációk csupán 45 százalékát kíséri a C3, 64 százalékát a C4 komplementfaktor szintjének csökkenése, míg az összhaemolitikus aktivitás az exacerbációk 71 százalékában csökkent. A terhesség alatti exacerbációkat elsosorban az alternatív útvonal aktiválódása kíséri (53). Auda és munkatársai (54) 30 SLE-s beteg plazmájából mértek C1rs-C1inhibitor, C3bP és SC5b-9 szintet. Mindhárom komplementaktivációra specifikus protein-protein komplex szintjét magasabbnak találták SLE-s betegekben, mint az egészséges kontrollokban. A betegség aktivitásának mértéke és a komplementaktivációs termékek szintje közötti összefüggést nem vizsgálták. Kerr és munkatársai (55) 51 SLE-s beteget vizsgáltak. Eredményeik szerint az alternatív út aktivációja az SLE aktivitásának hasznos markere. A legtöbb vizsgáló szerint a komplementparaméterek hasznosak az SLE aktivitásának megítélésében. A komplementfaktorok és az összhaemolitikus aktivitás mérésénél hasznosabb az aktivációra specifikus protein-protein komplexek és a komplementdegradációs termékek szintjének mérése, különösen melyek az alternatív út, vagy a végso közös út aktiválódását jelzik.
A neopterin szerepe SLE aktivitásának megítélésében A neopterin általános jellemzése Az SLE-ben a humorális immunrendszer mellett, a celluláris immunrendszer aktivációját is leírták (1; 2). A neopterin a celluláris immunrendszer aktivitásának egyik korai, specifikus és szenzitív markere. 1963-ban izolálták elso alkalommal méhlárvából és dolgozó méhek szárnyából. Négy évvel késobb, sikerrel izolálták emberi vizeletbol (500 liter emberi vizeletbol 25 mg neopterint sikerült kinyerni) (56).
19
A neopterin guanozin trifoszfátból (GTP) származó pirazino pirimidin derivátum. A biopterin szintézis során keletkezik, fiziológiás szerepe pontosan nem ismert (2. ábra). A biopterin a fenilalanin hidroxiláz enzim kofaktora. A fenilalanin hidroxiláz enzim genetikai defektusa az egyik leggyakrabban eloforduló enzimopátiához a fenilketonuriához vezet (1:10 000), mely súlyos mentális retardációval jár. A biopterin defektusa a fenilketonuria ritka formáját okozza (1:1 000 000), mely a fenilalanin hidroxiláz enzim genetikai defektusához hasonló klinikai tünetekkel jár. 1979-ig csupán ebben a ritka és súlyos betegségben írták le a vizelet és a szérum neopterin szint emelkedését. 1979-ben magas neopterin szintet mértek tumoros betegekben, illetve különbözo vírusfertozésekben szenvedo betegek szérum és vizelet mintáiban(57).
guanozin- trifoszfát 1 7,8 dihidroneopterin- trifoszfát 2 (5,6,7,8-tetrahidro)biopterin (D-eritro)neopterin
O2
+ 3
fenilalanin
tirozin
2. ábra. A pteridinek bioszintézise. A folyamatot katalizáló enzimek: 1: GTP ciklohidroláz, 2: dihidroneopterin-trifoszfát konvertáló, 3: fenilalanin hidroxiláz. A fenilalanin hidroxiláz enzim molekuláris oxigén segítségével muködik, koenzime az (5,6,7,8-tetrahidro)biopterin. A (Deritro)neopterin keletkezése dihidroneopterin-trifoszfátból valószínuleg nem enzimatikus úton történik (56, 58-59). Ezt a felismerést számos in vitro kísérlet és klinikai vizsgálat követte. A neopterin fo forrását az aktivált makrofágok és monociták képezik, melyek neopterin termelése gammainterferonnal (IFN-?) jelentosen fokozható. Az IFN-? in vivo elsosorban aktivált T sejtekbol származik. A neopterin mérés a gamma interferon szint mérésével szemben számos elonnyel bír: a gamma inteferon gyorsabban metabolizálódik, szolubilis, vagy sejthez kötött receptorokhoz kötodik. Az IFN-? mellett alfa interferon (IFN-a) is stimulálja monociták neopterin termelését kisebb mértékben (59). Egyéb monocita aktiváló szerek, úgy mint zimozán, phorbol miristát acetát (PMA), kolónia stimuláló faktorok, béta-interferon nem fokozta a monociták neopterin
20
termelését. Tumoros sejtvonalak és endotél sejtek in vitro neopterin termelését is igazolták (5961). Hasznosnak találták a neopterin meghatározást az allograft rejekció korai markereként, vese, máj, csontvelo, szívtranszplantáción átesett betegeken. Szintén emelkedett neopterin szintet mértek számos vírusfertozés (herpes, hepatitis, rubeola, HIV, Epstein-Barr vírus) esetén. Bizonyos bakteriális fertozések, elsosorban melyeket intracelluláris baktériumok okoznak, így például Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, valamint Plasmodium falciparum fertozés esetén szintén emelkedett neopterin szintet igazoltak. Az immunológiai betegségek közül is számos esetben, így rheumatoid arthritis, Chron betegség, colitis ulcerosa, autoimmun thyreoditis, autoimmun diabetes mellitus is gyakran jár emelkedett neopterin szinttel (59).
A neopterin mint SLE aktivációs marker Leuhiron és munkatársai, illetve Hagihara és munkatársai vizsgálatai szerint SLE-s betegekben az egészséges kontrollpopulációhoz képest emelkedett a vizelet és szérum neopterin szint, mely a klinikai aktivitással is korrelált (62-63). Lim és munkatársai 68 SLE-s beteg keresztmettszeti, majd átlagosan fél éven át végzett követéses vizsgálata alapján, a vizelet neopterin szint mérés az SLE hasznos aktivációs markerének bizonyult. Szignifikáns korrelációt kaptak a vizelet neopterin és a klinikai aktivitás mértékét jelzo BILAG (British Isles Lupus Assessment Group) index között. A C3, C4, C3d komplementfaktorok, solubilis interleukin-2 receptor (sIL-2R) és az anti-DNS antitest a szerzok szerint kevésbé hasznos SLE aktivációs markerek. Samsonov és munkatársai 52 SLE-s beteg vizsgálata alapján szérum neopterin szintet szintén hasznos aktivációs markernek találták (6466).
A
szolubilis
interleukin-2
receptor
szerepe
SLE
aktivitásának
megítélésében A szolubilis interleukin-2 receptor általános jellemzése Az interleukin-2 (IL-2) a T sejtek autokrin és parakrin növekedési faktora. Fontos biológiai hatása, hogy eloidézi nagy affinitású IL-2 receptor megjelenését. Az IL-2-t aktivált T sejtek, T sejt hibridómák, T sejt klónok, T sejtvonalak és NK sejtek termelik. Az aktivált T limfociták felszínén az IL-2-t alacsony affinitással köto IL-2R? (p55) és IL-2R? jelenlétét igazolták, mely proteinek nonkovalens módon összekapcsolódva a fiziológiás IL-2 jelátvitelért felelos, nagy 21
affinitású receptorkomplexet alkotnak. Míg az IL-2R? nyugvó és aktivált limfocitákon egyaránt megtalálható, az IL-2R? (p55) csak aktivált limfocitákon található meg, a limfocita aktiváció korai és megbízható markere (44, 67). 1985-óta ismert, hogy in vitro T sejt aktiváció folyamán az IL-2R? de novo sejtfelszíni expressziója mellett, egy 45-kD molekulatömegu IL-2-köto protein (sIL-2R) szekréciója is megtörténik, mely az IL-2R? (p55) proteolítikus hasításával keletkezik. Az sIL-2R fiziológiás funkciója pontosan nem ismert, az interleukin 2 molekulát alacsony affinitással köti. In vitro az IL-2 válasz sIL-2R-rel gátolható. A szolubilis IL-2 receptor (sIL-2R) szint elsosorban a celluláris immunrenszer aktivációját mutatja (68). Az sIL-2R-t in vivo is sikerült kimutatni, egészséges kontrollok plazmájában alacsony mennyiségben. Magasabb sIL-2R szint igazolódott daganatos megbetegedésekben, rheumatoid arthritisben, polymyositisben és sclerodermában (69-73).
A szolubilis interleukin-2 receptor, mint SLE aktivációs marker
Wolf és munkatársai szignifikánsan magasabb sIL-2R szintet mértek SLE-s betegek szérumában, mint egészséges kontrollokéban. Eredményeik szerint az sIL2-R szint korrelál a betegség aktivitásának mértékével (74). Manoussakis és munkatársai 43 SLE-s beteg sIL-2R szintjét mérték meg. SLE-s betegekben szignifikánsan magasabb sIL-2R szintet találtak, mint egészséges kontrollokéban, illetve az sIL-2R szint korrelált az SLE aktivitásának mértékével. Hasonló eredményre jutott Semenzato és munkatársai 12 SLE-s beteg vizsgálata alapján (75-76). Danieli és munkatársai hatvanegy SLE-s beteg vizsgálata alapján szintén hasznos aktivációs markernek találták az sIL-2R-t (77). Wong és munkatársai 88 SLE-s beteg vizsgálata alapján szignifikáns különbséget találtak egészséges kontrollok és inaktív SLE-s betegek, illetve aktív és inaktív SLE-s betegek sIL-2R szintjei között. Eredményeik szerint ugyanakkor az sIL-2R szérumszint és az SLE aktivitásának mértéke között nem volt szignifikáns korreláció. Fertozések esetén mind aktív, mind inaktív SLE-ben lényegesen magasabbnak találták az sIL-2R szintet. Különösen krónikus fertozések, így például tuberculosis, vagy candida fertozés járt együtt igen magas sIL-2R szinttel. Ezért javasolják az sIL-2R mérés bevezetését az SLE-ben fellépo fertozések diagnózisában (78). Roberti és munkatársai 31 SLE-s beteg követéses vizsgálatát végezték 18 hónapon át. Munkájuk eredménye szerint a vizelet sIL-2R szint szingifikánsan emelkedett SLE-s exacerbációk alatt, függetlenül a veseérintettség jelenlététol, vagy annak hiányától (79). 22
Lim és munkatársai 68 SLE-s beteg szérum sIL-2R vizsgálatát végezték el. Eredményeik szerint a szérum sIL-2R koncentráció szignifikánsan magasabb volt SLE-s betegekben, mint egészséges kontrollokban, ugyanakkor az aktív és az inaktív betegek között csupán határérték szignifikanciát találtak (64).
A citokinháztartás szabályozásának zavara SLE-ben A citokinek kis molekulatömegu glikoproteinek, fontos szerepet játszanak az immunválasz szabályozásában. Mint jónéhány immunológiai paraméter, a citokinháztartás is sok korábbi vizsgálat szerint jelentosen megváltozhat lupusban (80).
Interleukin-2 (IL-2) Az IL-2 a B és T sejtek növekedésében, differenciálódásában szerepet játszó citokin (rövid jellemzését lásd a solubilis interleukin-2 receptor (sIL-2R) általános jellemzésérol szóló részben). Alcocer-Varela és munkatársai, illetve Linker-Israeli és munkatársai eredményei szerint (81, 82) az SLE-s betegekbol származó perifériás mononukleáris sejtek (PBMC) IL-2 termelése in vitro mitogén stimuláció hatására kevésbé fokozódik, mint egészséges kontrollokból származó mononukleáris sejteké. A csökkent aktiválhatóság nem korrelál a betegség klinikai aktivitásával, negatív korrelációt mutat a spontán IgG termelés növekedésének mértékével. Viallard es munkatársai nem találtak szignifikáns különbséget SLE-s betegek és egészséges kontrollok mononukleáris sejtjeinek spontán és mitogén indukált IL-2 termelése között (83). A mitogén indukcióra bekövetkezo IL-2 termelés ugyanakkor szignifikáns korrelációt mutatott az SLE aktivitásával. Az IL-2 csökkent indukálhatóságának egyik lehetséges oka CD4 pozitív T sejtek intrinsic defektusa, mely sejtek az IL-2 fo forrását képezik. SLE-s betegekbol származó mononukleáris sejtek in vitro IL-2 termelése fokozható phorbol miristát acetáttal (PMA)-val, vagy lektinnel. A csökkent IL-2 termelés reverzibilis jellege intrinsic defectus ellen szól. SLE-s betegek széruma, hasonlóan lupusos betegekbol származó CD8 T sejtek szekrétumához gátolja az IL-2 termelést. A CD8 T sejtek eltávolításával fokozható volt a lektin indukált IL-2 termelés SLE-s betegek esetén, normál kontrollok esetén viszont nem. Szintén igazolták, hogy az MHC IIt expresszáló CD8 pozitív sejtek száma emelkedett az SLE-s shubok alatt (84-88).
23
Lupusos betegekbol származó stimulálatlan PBMC IL-2 mRNS mennyisége és az IL-2 szérumszintje emelkedett az egészséges kontroll csoporthoz képest. Lehetséges, hogy az állandó IL-2 stimuláció kompenzációs szupressziót vált ki. A számos akalommal leírt sIL-2R szint emelkedés SLE-ben szintén az IL-2 fokozott termelése mellett szól (80). Interleukin-4 (IL-4) Az interleukin-4 (IL-4) fo forrását az aktivált TH2 sejtek képezik, de ?/? T limfociták, NK sejtek, bazofil granulociták, CD8+ T sejtek, hízósejtek IL-4 termelésérol is beszámoltak. Az IL-4 számos ismert hatása közül néhány: elosegíti a nyugvó B sejteken MHCII molekulák expresszióját, a B sejtek immunglobulin termelését, proliferációját, TH2 típusú sejtek kialakulását (44). Az SLE-s betegek mononukleáris sejtjeinek IL-4 termelése fokozott, más vizsgálók szerint viszont nem különbözik szignifikánsan egészséges kontrollokétól (83, 89-90). Funauchi és munkatársai eredményei szerint lupusos betegekben az egészséges kontroll populációhoz képest magasabb az IL-4 termelo T limfociták aránya stimuláció elott és stimuláció után egyaránt. Az IL-4 termelo T limfociták száma korrelációt mutat a betegség aktivitásával (91). Rekombináns IL-4 az SLE-s betegekbol származó B sejt kultúrák IgG termelésést fokozza. Frissen izolált, stimulálatlan mononukleáris sejtek IL-4 mRNS mennyisége ugyanakkor nem különbözött a normál kontrollokétól (92-93). Horwitz és munkatársai eredményei szerint (94) lupusos betegek mononukleáris sejtjeinek IL-4 mRNS mennyisége alacsonyabb a normál kontrollokénál és nem korrelál a betegség aktivitásának mértékével. Interleukin-6 (IL-6) Az interleukin-6 (IL-6) az akutfázis válaszban játszik szerepet, a B sejtek differenciálódását és ellenanyag termelodését is serkenti. Elsosorban a makrofágok, T limfociták, endotélsejtek termelik (44). SLE-s betegek szérumában egészséges kontrollokéhoz képest emelkedett IL-6 szintrol számoltak be. Lupusos betegek mononukleáris sejtjeinek IL-6 mRNS tartalma fokozott. SLE-s betegekbol származó mononukleáris sejtek spontán in vitro IgG termelése fokozott, mely IL-6 kezeléssel tovább fokozható, anti IL-6 antitestekkel pedig gátolható. Lupusos betegekben emelkedett az IL-6 termelo monociták aránya (93,95-96).
24
Interleukin-10 (IL-10) Az IL-10-et elsosorban CD5+ B sejtek, aktivált TH2 sejtek, monociták és keratinociták termelik (44). Az SLE-s betegek szérum IL-10 szintje egészséges kontrollokénál magasabb és szignifikánsan korrelál a klinikai aktivitás mértékével (97). SLE-s betegek mononukleáris sejtjeinek IL-10 termelése szignifikánsan magasabb az egészséges kontrollokénál. Aktív lupusos betegekben nagyobb az IL-10 termelo monociták aránya (83, 91, 96). Inaktív SLE-s betegekbol származó perifériás mononukleáris sejtek anti-DNS termelése hatékonyan fokozható IL-10 kezeléssel. Klinikailag aktív betegek anti-DNS termelése ugyanakkor gátolható volt IL-10 kezeléssel (98). Interleukin-12 (IL-12) Az IL-12 heterodimer, mindkét komponense B limfocitákban és makrofágokban termelodik. Aktiválja a citotoxikus effektorsejteket és a makrofágokat, serkenti a TH1 limfociták proliferációját, IFN-? termelését (44). Tokano és munkatársai eredményei szerint az SLE-s betegek szérum IL-12 szintje magasabb az egészséges kontrollokénál (99). Nem találtak összefüggést az IL-12 szint és a klinikai aktivitás között a legtöbb szervi manifesztáció estén. Lupusos pleuritisben ugyanakkor igen magas szérum IL-12 szintet igazoltak. Az IL-12 mind aktív, mind inaktív betegek perifériás mononukleáris sejtjeinek anti-DNS termelését gátolta (98). Alfa interferon (INF -a) Az alfa interferon (IFN-? ) (44) szérumszintje lupusos betegek szérumában magasabb, mint egészséges kontrollokéban (100). Blanco és munkatársai eredményei szerint SLE-s betegek széruma monociták dendridikus sejtté történo differenciálódását fokozta, mely hatás elsosorban a magasabb IFN-? szint következménye (gátolható anti IFN-? antitestekkel) (101). Az így képzodo dendritikus sejtek autoantigéneket prezentálhatnak. A CD11c + dendridikus sejtek aránya ugyanakkor mintegy negyven százalékkal alacsonyabb SLE-s betegekben, mint kontrollokban. Az IFN-? szérumszintje és a lupusos betegek szérumának dendridikus sejt differenciálódást fokozó hatása korrelál a betegség klinikai aktivitásával. Gamma interferon (IFN-?)
25
A gamma interferon (IFN-?) a TH1 típusú immunválasz egyik kulcsfontosságú szabályozója. Aktiválja a mononukleáris sejteket, stimulálja az NK sejtek citotoxikus aktivitását, számos sejten növeli az MHC I expresszió mértékét. A B sejteket az antitest dependens sejtmediált citolízisben szerepet játszó antitest-izotípusok termelésére serkeni. Az
IFN-?-t
elsosorban a TH1 sejtek, a ?/? T-limfociták és a CD8+ T sejtek termelik (44). Az IFN-? SLE-s betegek mononukleáris sejtjeinek spontán IgG termelését fokozza. Klinikailag aktív és inaktív SLE-s betegek stimulálatlan mononukleáris sejtjeinek IFN-? mRNS mennyisége fokozott. SLE-s betegek szérumában és a vesét érinto exacerbáció esetén vesebiopsziás mintákban anti IFN-?-antitesteket mutattak ki (102-104). Lupusos betegekben kisebb az IFN-?-t szekretáló monociták aránya, mint egészséges kontroll populációban (91). Más vizsgálók szerint ugyanakkor nincs szignifikáns különbség az SLE-s betegek és egészséges kontrollok mononukleáris sejtjeinek IFN-?- termelése között (83, 90.) Hagiwara és munkatársai (96) eredményei szerint lupusos betegek mononukleáris sejtjeinek spontán IFN-? termelése
alacsonyabb a kontrollokénál. Szignifikáns korrelációt
találtak a klinikai aktivitás és az IL-10/IFN-? termelo sejtek hányadosa között. Lektinnel történo in vitro stimulációt követoen az SLE-s betegek mononukleáris sejtjeinek IFN-?-termelése alacsonyabb a kontrollokénál, mely korrigálható kalcium-ionoforral és PMA-val (105-106) Tumor necrosis factor a (TNF-? ) A tumor necrosis factor ? (TNF-? ), melyet kezdetben tumorsejteket ölo és kahexiát okozó hatása miatt kahektinnek neveztek, az akutfázis válaszban kulcsszerepet játszó citokin. A TNF-? elsosorban makrofágokban termelodik. Jelentosen fokozza az IL-1 és az IL-6 termelodését (44). SLE-s betegek mononukleáris sejtjeinek TNF-? mRNS szintje kissé magasabb, mint az egészséges kontrolloké, ugyanakkor a lektin indukálta TNF-? termelés csökkent. SLE-s betegekbol származó mononukleáris sejtek spontán IgG termelése csökkentheto TNF-? -t neutralizáló antitestekkel (93, 107). Egyéb paraméterek
26
Számos további paraméterrol leírták, hogy korrelál az SLE aktivitásával, vagy különbözik lupusos betegekben egészséges kontrolloktól, így feltételezheto, hogy aktivációs markerként is muködik. A továbbiakban ezek közül néhányat ismertetek. A sejtmag alkotórészek elleni antitestek termelése az SLE egyik legfontosabb jellemzoje. Ugyanakkor számos lipid, protein, glikoprotein, szénhidrát elleni antitest szintje is magasabb SLEben, feltehetoen a poliklonális B sejt aktiváció eredményeképpen. A vizsgált antitestek különbözo mértékben korrelálnak az SLE klinikai aktivitásával. A lipidháztartás zavara, hiperlipidémia, fokozott érelmeszesedés SLE-ben gyakran megfigyelheto. Az utóbbi években vált ismertté, hogy bizonyos lipidek, így pl. az oxidált LDL, lizofoszfatidilkolin, apolipoprotein-A1 elleni antitestszint is emelkedett SLE-ben (108-112). A betegség aktivitása és az említett antitestek szintje közötti összefüggést nem vizsgálták. A habituális abortuszok, gyakori artériás és vénás thrombózisok formájában fellépo antifoszfolipid szindróma lehet a lupus részjelensége, vagy jelentkezhet önálló betegségként (12). Mindkét formára jellemzo antifoszfolipid antitestek jelenléte. Az antifoszfolipid szindróma aktivitásának követésére az anti-cardiolipin antitestek mellett jelentoséget tulajdonítanak az antibéta-2 glikoprotein-1 és anti-annexin-V antitesteknek, melyek antifoszfolipid szindrómában fontos aktivitási markerek több vizsgáló szerint (113-115). Li és munkatársai eredményei szerint anti-endotheliális antitestek az SLE-s betegek 86 százalákában detektálhatóak (116). Bizonyos szervi manifesztációk és különbözo antiendotheliális antitestek elofordulása között összefüggést találtak. A 66 kDa-os antigénre specifikus antitest foleg nephritisben és vasculitisben, 55 kDa-os antigénre specifikus antitest thrombocytopénia esetén, míg 18 kDa-os antigénre specifikus antitest elsosorban pleuritises betegekben fordult elo. Lupusos betegekben az anti-C1q antitestek szintje magasabb, különösen nephritis fennállása esetén. Prada és munkatársai szerint a lupusos anti-C1q antitestek IgG2 alosztályba tartoznak (117). A CD27 elsosorban T sejteken expresszálódó protein, kisebb mértékben monociták és B sejtek is expresszálják. T sejt receptor stimuláció hatására CD27 sejtfelszíni expressziója és szolubilis CD27 termelése fokozódik. Lupusos betegekben a szolubilis CD27 szérumszintje egészséges kontrollokénál magasabb és korrelál a betegség aktivitásával (118). A CD14 molekula monocitákon, makrofágokon expresszálódik. Nockher
és
munkatársai eredményei szerint szolubilis formája lupusos betegekben magasabb és korrelál a betegség klinikai aktivitásával (119).
27
A haemosztázis molekuláris markerei szintén hasznosak lehetnek az SLE aktivitásának megítélésében. Inoh és munkatársai eredményei szerint thrombin-antithrombin-III komplex és D-dimer szérumszintje jól korrelál az SLE aktivitásával (120). Kotajima és munkatársai szoros korrelációt találtak a szérum thrombomodulin szint és a lupus klinikai aktivitásának mértéke között (121). Nishiya és munkatársai a szérum ferritin szintet hasznosnak találták a lupus klinikai aktivitásának megítélésében (122).
28
V: Célkituzések
1. Számos irodalmi adat utal a komplementrendszer aktiválódására SLE-ben, különösen klinikai aktivitás esetén. Így feltételezheto, hogy a komplementrendszer aktivitásának ismerete segítséget nyújthat az SLE klinikai aktivitásának megítélésében. A rutinszeruen mért paraméterek ugyanakkor nem tájékoztatnak kello pontossággal a komplementrendszer aktivitásának mértékérol. Ismertek olyan, a komplementaktivációra igen specifikus proteinprotein komplexek és komplementdegradációs termékek, melyek pontosan tájékoztatnak a komplementrendszer aktiváltságáról. A korábban elvégzett néhány vizsgálat szerint ezen proteinprotein komplexek egy része hasznos SLE-aktivációs marker. Különösen az alternatív út aktivitását jelzo markerek bizonyultak informatívnak az SLE aktivitásának megítélésében. Ezért végeztük el a rutinszeruen mért komplementparaméterek és aktivációra specifikus proteinprotein komplexek vizsgálatát, azok SLE aktivitását jelzo képességének összehasonlítását.
2. Az érelmeszesedés és az autoimmunitás kapcsolata az utóbbi évek izgalmas kutatási területe. Néhány korábbi vizsgálat szerint SLE-ben lipidek, lipoproteinek elleni antitestek nagyobb mennyiségben fordulnak elo, mint egészséges kontrollokban. Szintén az utóbbi idoben vált ismertté, hogy az anti-koleszterin antitestszint kapcsolatban van az érelmeszesedéssel. Számos adat utal SLE-ben fokozott mértéku érelmeszesedésre. Vizsgáltuk ezért az anti-koleszterin antitestszintet SLE-s betegekben; vizsgáltuk továbbá az anti-koleszterin antitestszint és egyéb laboratóriumi aktivációs markerek korrelációját.
3. Korábbi irodalmi adatok a citokinháztartás számos rendellenességét írták le SLE-ben. A rendelkezésre álló adatok ugyanakkor sokszor igen ellentmondóak. Munkánk során ezért vizsáltuk, hogy az SLE jellemezheto-e citokinháztartás változással.
4. Az SLE aktivitásának megítélésére több-kevesebb pontossággal számos paraméter használható, melyek az immunrendszer különbözo részeinek aktivitását mutatják. Nem 28
rendelkezük olyan paraméterrel, mely önmagában eléggé specifikus és szenzitív az SLE klinikai aktivitásának megítélésében. Korábban igen kevés olyan vizsgálat történt, mely több laboratóriumi paraméter diagnosztikus értéke kombinálásának lehetséges szerepét vizsgálta az SLE aktivitásának megítélésében. Olyan klinikai laboratóriumban is egyszeruen alkalmazható matematikai modellt kerestünk, mely több laboratóriumi paraméter diagnosztikus értékének kombinálásával, az egyes paraméterek diagnosztikus értékét felülmúlja az SLE aktivitásának megítélésében.
30
VI: Betegek és módszerek Betegcsoportok A vizsgálatokat az 1982-es American Rheumatism Association kritériumok alapján diagnosztizált SLE-s betegeken végeztük (10). Minden beteg kaukázusi rasszból származott. Az általunk vizsgált betegek az SLE-n kívül más fertozo, vagy gyulladásos betegségben nem szenvedtek. Az egyes tanulmányokban vizsgált betegcsoportok között technikai okok miatt csak kis átfedés volt.
A betegségaktivitás meghatározása A klinikai aktivitás módosított SLEDAI (mSLEDAI) score meghatározás alapján történt. Az mSLEDAI score-t úgy kaptuk, hogy a SLEDAI score-ból (11) kivontuk az anti-DNS és komplement paraméterek pozitivitásáért adható pontokat. A klinikai aktivitás kritériuma: 1: legalább 2 pont az mSLEDAI skálán, 2: azonnali kezelés szükségessége. Más vizsgálókhoz hasonlóan, mindkét kritérium egyideju jelenléte esetén tekintettük a beteget klinikailag aktívnak (123).
Vér és vizeletvétel, a minták tárolása A betegektol minden vizit alkalmával vér és vizeletmintákat vettünk. Az anti-DNS, C3, C4, összhaemolitikus aktivitás (CH50), anti-C1q-IgG, anti-C1q-IgA, neopterin, szolubilis IL-2 receptor (sIL-2R), anti-koleszterin IgG meghatározás natív vérmintából történt. Vérvétel után a mintákat centrifugáltuk és aliquotokban mínusz 20 fokra fagyasztottuk. A szolubilis terminális komplex (SC5b-9), C1rs-C1inhibitor és az alternatív konvertáz [(C3b(Bb)P)] meghatározása EDTA plazmából történt. A komplementaktivációs termékek mérésére levett EDTA plazmákat centrifugálás után aliquotokban mínusz 70ºC-ra fagyasztottuk. A citokin mRNS szint meghatározás céljából végzett reverz transzkriptáz PCR („reverse transcriptase- polymerase chain reaction”, RT-PCR) Na-heparinos plazmából történt. Az ELISA mérésekre használt fagyasztott vérminták a legtöbb esetben egyszer voltak felolvasztva. Néhány alkalommal, összhaemolitukus aktivitás, vagy anti-DNS koncentráció mérés esetén kétszer, háromszor feolvasztott mintákat is használtunk. A komplementaktivációs termékek meghatározása minden esetben csak egy alkalommal felolvasztott mintákból történt. Az áramlási
31
citometriás és a szemikvantitatív reverz PCR (RT-PCR) vizsgálatok céljaira Na-heparinos csövekbe vettünk vérmintákat.
Rutin laboratóriumi módszerek Rutinszeruen végeztünk minden betegnél vérkép, vörövérsejtsüllyedés, szérum kreatinin és vizelet üledék vizsgálatot. Szintén minden betegtol történt anti-DNS szint meghatározás ELISA módszerrel és összhaemolitikus aktivitás (CH50) meghatározás. 100 egészséges kontroll vizsgálata alapján az anti-DNS vágópont („cut-off”) értéke (átlag + 2X standard deviáció) 7.18 U/ml volt. Az összhaemolitikus aktivitás normál értéke 48-105 U/ml volt 100 egészséges konroll vizsgálata alapján. A C3 és C4 komplemetkomponensek koncentrációjának meghatározása radiális immundiffúzió módszerével történt. A normál tartomány 0.7-1.8 g/l volt C3 és 0.08-0.3 g/l C4 esetében 130 egészséges kontroll mintáinak mérése alapján.
Komplementaktivációs komplexek koncentrációjának meghatározása A szolubilis terminális komplex (SC5b-9), koncentrációjának meghatározása korábban leírt ELISA módszerrel történt (124). Az ELISA módszereket egyidejuleg 96 minta mérésére alkalmas polisztirol lemezeken végeztük. A lemezekre anti-human C5b-9-et tartalmazó karbonát puffert (pH 9.6) mértünk, majd a mintákat 4ºC-ra helyeztük. Az anti-C5b-9 a C5b-9 neoepitopjával reagáló antitest. 16 óráig tartó inkubáció után a nem specifikus kötohelyeket blokkoltuk 1 százalékos bovin szérum albumint (BSA) tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) és mostuk 0.1 százalékos Tween-PBS-ben. A következokben a frissen felolvasztott EDTA plazma mintákat és ismert koncentrációjú standard hígítási sort mértük a lemezekre duplikátumokban, 1:3 hígításban, majd 60 peres inkubáció következett szobahomérsékleten. Ismételt mosás után (0.1 százalékos Tween-PBS) nyúl anti-human C5 IgG-t mértünk a lemezekre, majd ismét 60 percig tartó inkubáció következett. Ezt követoen peroxidázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG-t mértünk a lemezekre. Ismét mosás következett 30 perces inkubáció után, majd o-feniléndiamint (OPD) és hidrogén peroxidot (H2O2) mértünk a lemezekre. Az OPD oxidációja miatt színreakció alakult ki, melyet 2 Normálos kénsavval állítottuk le. Az optikai denzitást (OD) 492 nm-en mértük, mely értékbol 620 nm-en mért OD értéket levontuk, a lemez
32
által okozott zaj kiküszöbölésére. Negyven egészséges kontroll alapján az SC5b-9 vágópont értéke (átlag + 2x SD) 661 ng/ml volt. A C1rs-C1inhibitor koncentráció meghatározása korábban leírt ELISA módszerrel történt (125). A lemezekre hígított anti-human C1 inhibitort mértünk, majd 4ºC -ra helyeztük. Tizenhat óráig tartó inkubáció után a nem specifikus kötohelyeket blokkoltuk 1 százalékos BSA-t tartalmazó PBS-ben és mostuk 0.1 százalékos Tween-PBS-ben. A következokben a frissen felolvasztott, hígított EDTA plazma mintákat és ismert koncentrációjú standard mintákból hígítási sort mértük a lemezekre duplikátumokban, 1:200 hígításban, majd 60 peres inkubáció következett szobahomérsékleten. Ezt követoen mosás után (0.1 százalékos Tween-PBS) kecske anti-human C1s mértünk a lemezekre, majd 60 percig tartó inkubáció következett. Ismételt mosás után peroxidázzal konjugált nyúl anti-kecske IgG-t mértünk a lemezekre. Harminc perces inkubáció majd ismét mosás következett. Végül etilbenztiazolin-6-szulfonsavat (ABTS) és H2O2t mértünk a lemezekre. A színreakciót oxálecetsavval állítottuk le. Az optikai denzitást 405 nm-en mértük, mely értékbol, a lemez által okozott zaj kiküszöbölésére, a 492 nm-en mért OD értéket levontuk. Negyven egészséges kontroll alapján az C1rs-C1 inhibitor vágópont értéke (átlag + 2xSD) 252 U/ml volt. Az alternatív konvertáz [C3b(Bb)P] koncentráció meghatározás korábban leírt ELISA módszer alapján történt (125 ). A lemezekre hígított, kecske anti-humán properdint mértünk, így inkubáltuk 16 órán át 4ºC-on. Mosás és blokkolás után frissen felolvasztott hígított mintákat (1:25) és ismert koncentrációjú standard hígítási sort mértünk a lemezekre. Ismét mosás következett, majd anti-humán C3c-biotint mértünk a lemezekre, majd 60 perc inkubáció után ismét mosás történt. Ezt követoen streptavidin peroxidázt mértünk a lemezekre. Ismét mosás következett 30 perces inkubáció után, majd OPD-t és hidrogén peroxidot (H2O2) mértünk a lemezekre. A kialakuló színreakciót kénsavval állítottuk le. Az optikai denzitást (OD) 492 nm-en mértük, mely értékbol 620 nm-en mért OD értéket levontuk. Negyven egészséges kontroll alapján a C3b(Bb)P vágópont értéke (átlag + 2xSD) 10.8 U/ml volt.
Anti-C1q antitest koncentráció meghatározása Anti-C1q antitestek mérése ELISA módszerrel történt. A lemezekre elsoként tisztított humán C1q-t mértünk, majd 16 órán át inkubáltuk 4 oC-on. Ezt követoen 1 Mólos NaCl-ot és 1%-os BSA-t tartalmazo PBS-ben hígított mintákat és standard hígítási sort mértünk a lemezekre. Hatvan perces inkubációt követoen peroxidázzal konjugált nyúl anti-humán IgG-t,
33
vagy IgA-t mértünk a lemezekre. Ismét mosás következett, majd OPD-t és hidrogén peroxiddot mértünk a lemezekre. A kialakuló színreakciót kénsavval állítottuk le. Az optikai denzitást (OD) 492 nm-en mértük, mely értékbol 620 nm-en mért OD értéket levontuk. Negyven egészséges kontroll alapján az anti C1q IgG vágópont értéke (átlag + 3X OD) 0.575, míg az anti-C1Q IgA vágópont értéke (átlag + 3X OD) 0.612 volt.
Anti-koleszterin antitest koncentráció mérése Az anti-koleszterin antitest mérése korábban leírt ELISA módszerrel történt (126). A lemezekre elsoként etanolban oldott koleszterint mértünk, majd 16 órás inkubáció történt 4 oC-on. Ezt követoen PBS-sel mostunk, majd kazeint mértünk lemezekre, a nem specifikus kötohelyek blokkolása céljából. A következokben hígított mintákat majd peroxidázzal konjugált nyúl anti-humán immunglobulint mértünk a lemezekre. Hatvan perc inkubáció után OPD-t és H2O2-t mértünk a lemezekre. A színreakciót kénsavval állítottuk le. Az optikai denzitást (OD) 492 nmen mértük, mely értékbol 620 nm-en mért OD értéket levontuk. 218 egészséges kontroll alapján az anti-koleszterin antitest szint 5-224 U/ml között volt.
Szérum neopterin és sIL-2R szint mérése A neopterin és sIL-2R szintek mérése gyári ELISA kit felhasználásával történt (neopterin: BRAMS Diagnostica GmbH Berlin, Germeny, sIL2-R: Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA, USA), a gyártók használati útmutatója szerint. 38 egészséges kontroll vizsgálata alapján az átlag + 2X standard deviáció értékek neopterin estében 9.2 nmol/l, sIL-2R esetében 2315 pg/ml volt, hasonlóan a gyártó cégek által megadott értékekhez.
Áramlási citometria Áramlási citometria módszerével teljes vér stimulálását követoen T limfocitákból intracelluláris IFN-? és interleukin-4 szintet mértünk. A frissen levett Na-heparinos mintákat 20 ng/ml PMA-val, 2 ?g/ml ionomycinnel és intracelluláris transzport gátló brefeldin-A-val (20 ?g/ml) kezeltük, korábban leírt módszer alapján (127). Brefeldin-A kezelés a stimulálatlan kontroll minták esetében is történt. A mintákat 5 órán át inkubáltuk CO2 - termosztátban, 37ºC-on. A stimulálást követoen anti-CD3 PerCP-vel kezeltük a mintákat, majd 30 perces inkubáció következett, mely után lizáló oldattal lizáltuk a
34
vörösvérsejteket. A következokben centrifugáltuk a mintákat, majd permeabilizáló oldattal permeabilizáltuk a fehérvérsejtek plazmamembránját. Ezt követoen monoklonális antitestekkel, vagy a megfelelo izotípus kontrollokkal kezeltük a mintákat (anti IFN-??FITC/anti-Il-4-PE, vagy ?2a FITC/??1-PE), majd CellFIX fixáló oldatban resuspendáltuk oket. Az így stimulált és elokészített mintákat áramlási citométerrel (Becton-Dickinson FACS CALIBUR, CELLQuest program 3.1) 24 órán belül analizáltuk, a mérésig 4 oC-on tároltuk. A T limfocitákat CD3 pozitivitás alapján különítettük el. A minták T limfocita populációiban az intracelluláris IFN-? és interleukin-4 pozitív sejtek arányát 5000-10000 CD3 pozitív sejt analízise alapján állapítottuk meg. Az atípusos intracelluláris festodés kiküszöbölésére minden mérés alkalmával a megfelelo izotípus kontroll értékkel korrigáltunk.
RT-PCR A
betegektol
levett
vért
Na-heparinos
csövekbe
gyujtöttük.
Ficol-Uromino
centrifugálással perifériás mononukleáris sejteket (PBMC) nyertünk. Öt beteg esetében a mononukleáris sejt szeparálást követoen szeparáltuk a monocita, T limfocita, B limfocita és NK sejtpopulációt. A monocitákat 37ºC-on 30 percig tartó inkubációval kitapasztottuk muanyag felülethez, majd a kitapadt sejteket 0.05%-os EDTA-PBS-sel eluáltuk. A T sejteket monocita depletált sejtpopulációból E-rozetta módszerrel nyertük (128). A vörösvérsejteket desztillált vízzel lizáltuk. A nem T (E-rozetta negatív) sejteket B és NK sejtekre nylon adherencia módszerével választottuk szét. A sejteket kétszer mostuk fiziológiás Hanks oldattal (PBMC), vagy RPMI-1640-nel (a sejt frakciókat) majd ezt követoen TRI reagenssel lizáltunk. Az össz-RNS kinyerését követoen eltávolítottuk a DNS kontaminációt RNáz mentes DNáz segítségével. A cDNS szintézis korábban leírt módon történt (129). A módszer rövid leírása: 5 ?g sejt RNS-t, 0.5 ?g oligo(dT), 10 mM ditriotreitol (DTT), 0.5 mM dezoxiribonukleotid (dNTP), 200 U leukaemia vírus reverz transzkriptáz, és 40 U humán placentáris RN-áz inhibitor elegyének inkubációját végeztük 42ºC-on. Ezt követoen denaturáltuk a cDNS-t, majd a denaturált cDNS-t a DNS amplifikációig -80ºC-on tároltuk. Kompetitív PCR: A cDNS kvantifikálása korábban leírt módon történt (129). Röviden: IFN-?, IL-10, IL-4 és ? aktin specifikus cDNS amplifikáció multispecifikus kompetitor szekvenciákat tartalmazó szintetikus pQA1, pQB3 plazmidok segítségével történt. A sense és az antisense primerek szekveciája, a cDNS- és kompetitor-specifikus amplikonok az 1.
35
táblázatban vannak felsorolva. ? aktin cDNS-t koamplifikáltuk linearizált pQB3 kompetitor DNS-sel (0.01, 0.1, 1, 10 pmol). A PCR elegy tartalmazott 300 nM-t a sense és 300 nM-t az antisense primerekbol, 1.3 egység Taq polimeráz enzimet, 50 ?M dezoxiribonukleotid keveréket. IFN-??, IL-10 és IL-4 kompetitív PCR a ? aktin PCR-hez hasonló módon történt. PQA1 (IL-4; IFN-??? és pQB3 (IL-10) kompetitor DNS hígításaival (0.001, 0.01, 0.1, 1 pmol illetve 0.01, 0.1, 1, 10 pmol) történt a kompetíció. Az amplifikált cDNS specifikus és kompetítor DNS specifikus
36
37
produktumok mennyiségét kolorimetriás módszerrel tettük mérhetové, a következo módon: biotinilált citokin, vagy ? aktin cDNS és kompetitor specifikus primerek segítségével, digoxigeninnel jelzett uracil felhasználásával egy jelzett láncot szintetizáltunk. Az így kapott, biotinnal jelzett mintát streptavidinnel fedett lemezekre vittük. Kvantifikáció peroxidázzal jelzett anti-digoxigenin antitestek segítségével történt.
Statisztikai módszerek A különbözo beteg és kontroll populációk kontinuus változóit Mann-Whitney, KruskallWallis nonparaméteres teszttel, vagy T teszttel hasonlítottuk össze. A beteg és kontroll csoportok kontinuus változói közötti korrelációt Spearman teszt segítségével becsültük meg. A klinikai aktivitás és az egyes aktivációs markerek korrelációjának vizsgálata esetében a klinikai aktivitás jellemzésére mSLEDAI score-t használtuk, hiszen a SLEDAI score tartalmazza az anti-DNS és komplement paramétereket, melyek önmaguk is aktivációs markerek. Így lehetové vált az antiDNS, komplement szintek és egyéb vizsgált aktivációs markerek klinikai aktivitással való korrelációjának összehasonlítása. Fischer egzakt teszt segítségével betegcsoportok bináris formátumú változóit hasonlítottuk össze. A ? 2 teszt segítségével kontinuus változók diszkriminatív tulajdonságát vizsgáltuk. Minden esetben 0.05 alatti p értéket tekintettünk szignifikánsnak. A szenzitivitást, specificitást, pozitív prediktív értéket és a negatív prediktív értékeket standard képlet szerint számítottuk: -szenzitivitás = valódi pozitív/valódi pozitív + álnegatív -specificitás = valódi negatív/valódi negatív + álpozitív -pozitív prediktív érték = valódi pozitív/valódi pozitív + álpozitív -negatív prediktív érték = valódi negatív/valódi negatív + álnegatív
Vizsgálataink során a különbözo potenciális SLE aktivációs markereket mint kontinuus változókat vizsgáltuk, így egy határvonalat kellett kijelölni minden esetben, amelytol a teszt értékét pozitívnak tekintettük. A határvonal megállapítása mindig önkényes. A határvonal értékének növelése a szenzitivitás csökkenését és a specificitás növekedését, ugyanakkor a határvonal értékének csökkentése a szenzitivitás növekedését és a specificitás csökkenését vonja maga után. A különbözo határvonal értékeknél kapott szenzitivitás és specificitás értékeket koordináta rendszerben ábrázolva megkapjuk egy változó un. Receiver Operator Characteristic
38
(ROC) görbéjét, melynek alapján kiválasztható a legkedvezobb szenzitivitással és specificitással rendelkezo határvonal érték. Munkánk során ahol megfelelo számú minta állt rendelkezésre, illetve szignifikáns különbség volt a vizsgált paraméter klinikailag aktív és inaktív betegekben mért értékei között, a legjobb határvonal értékeket ROC görbe segítségével azonosítottuk, korábban leírt módszer felhasználásával (130). Logisztikus regresszió módszerével vizsgáltuk, hogy több paraméter együttes felhasználása segítségével javítható-e a betegség aktivitásának megbecslése laboratóriumi módszerekkel. A logisztikus regressziót SAS 6.12 statisztikai program felhasználásával végeztük.
39
40
VIII: Megbeszélés Munkám fo célja az SLE klinikai aktivitásának megítélésére használható, a korábban leírt paramétereknél hasznosabb aktivációs markerek keresése, illetve az SLE-ben lezajló patofiziológiai történések jobb megértésének elosegítése volt. Lupusos exacerbációk alatt a komplementrendszer aktiválódik. Évtizedek óta ismert, hogy a C3, C4, CH50 komplementparaméterek szintje a lupus aktív stádiumában alacsonyabb, ezeket a paramétereket számos lupusos beteget gondozó centrumban alkalmazzák rutin meghatározásként, az aktivitás megbecslésére. Ezen paraméterek ugyanakkor nem rendelkeznek kello szenzitivitással és specificitással az SLE aktivitásának megítélésére (3-6). Ennek foként a lupusos exacerbációkban a komplementrendszer aktiválódásával járó fokozott felhasználás mellett jelentkezo fokozott termelodés szolgál magyarázatául. Az elmúlt másfél évtizedben számos próbálkozás történt komplementaktivációs termékek mérésére, melyek szintje elsosorban a
komplementfaktorok
felhasználásától
függ.
A
legtöbb
vizsgáló
szerint
egyes
komplementaktivációs termékek hasznosabbak az SLE aktivitásának megítélésében, mint a C3, C4, vagy CH50 komplementfaktorok mérése (50,52,53,55). A komplentaktiváció klasszikus útjának aktivitását jelzo komplementaktivácós termékek, úgy mint C4a, C4d, vagy C1rs-C1inh. szérumszintjének mérése csekély haszonnal bírnak az SLE klinikai aktivitásának megítélésében, az irodalmi adatok szerint (50,52). Korábbi vizsgálatokhoz hasonlóan a C1rs-C1inh. szint a mi eredményeink szerint sem hasznos az SLE aktivitásának megítélésére, hiszen nem mutat szignifikáns különbséget klinikailag aktív és inaktív betegek között illetve nem korrelál a klinikai aktivitás mértékét jelzo mSLEDAI-val. Az irodalmi adatok tükrében leghasznosabbnak az alternatív út aktiválódását mutató paraméterek tunnek (52-53,55). A B faktor aktiváció során keletkezo Ba és Bb komplementhasítási termékek hasznosabb aktivációs markerek mint C3, C4, CH50 mérés (52,55). Az alternatív konvertáz enzim [C3b(Bb)P] az alternatív út aktivitását igen jó szenzitivitással és specificitással jelzo marker. Auda és munkatársai mértek elso alkalommal C3b(Bb)P szintet SLE-s betegek plazmájából, azt az egészségesekénél magasabbnak találták, de összefüggését az SLE aktivitásával nem vizsgálták (54). Chiu és munkatársai nem találtak szignifikáns különbséget klinikailag aktív és inaktív betegek plazma C3b(Bb)P szintje között (131), további vizsgálat a C3b(Bb)P SLE aktivitást jelzo szerepének tisztázására nem történt. A korábbi vizsgálók által hasznos SLE aktivációs markernek talált szolubilis terminális komplex (51,52), a mi eredményeink szerint is jól jelzi az SLE aktivitásának mértékét.
41
Munkánk során vizsgáltuk a komplementrendszer alternatív út aktivitását jelzo alternatív konvertáz enzim szerepét az SLE aktivitásának megítélésében. Eredményeink szerint az alternatív konvertáz 93%-os szenzitivitással és 71%-os specificitással jelzi az SLE aktivitásának jelenlétét. Hasznosabb aktivációs marker mint az anti-DNS, vagy a komplementrendszer klasszikus útjának, vagy végso közös útjának aktivitását mutató markerek. Chiu és munkatársai a mieinktol eltéro eredményei valószínuleg az eltéro betegpopulációkban keresendo (131). Az
alternatív
konvertáz
[C3b(Bb)P]
a
komplementaktiváció
során
pozitív
visszacsatolással fokozza saját termelodését (44). Így kis változás a komplementrendszer aktiválódásában jelentos C3b(Bb)P szint emelkedéssel járhat, mely magyarázatul szolgálhat arra, hogy a C3b(Bb)P hasznosabb aktivációs marker, mint a többi vizsgált paraméter. Az SLE fontos jellemzoi olyan antitestek, amelyek egészséges kontrollokban nem, vagy csak kisebb mennyiségben találhatóak meg, ezért korábban feltételezték, hogy a betegség foleg a humorális immunválasz zavarával jár. A lipidek elleni immunválasz vizsgálatára lupusban csupán néhány próbálkozás történt (108-112). Munkánk során elso alkalommal mértünk lupusos betegek szérum mintáiban anti-koleszterin antitest szintet, mely szignifikánsan magasabbnak bizonyult lupusos betegekben az egészséges kontrollokhoz képest, ugyanakkor a betegség aktivitásával nem korrelált. A jelenség további vizsgálata szükséges. SLE-ben a citokinháztartás zavaráról számos érdekes adatot ismertünk meg, melyek egymással nehezen összeegyeztethetoek. Magyarázhatja ezt a betegség hullámzó lefolyása, vagy a vizsgálatok magas ára miatt, az egyes tanulmányok alkalmával megvizsgált betegek alacsony száma. Szintén részben magyarázhatja az is a különbözo vizsgálók által leírt különbségeket, hogy a citokintermelést különbözo módszerekkel vizsgálták. A leggyakoribb módszerek: 1. citokin mRNS szint mérése kvantitatív RT-PCR-rel 2. intracelluláris citokinmérés áramlási citometriával, western blottal 3.szérumcitokin-szint vagy sejtkultura citokintermelés mérése ELISA módszerrel vagy RIA módszerrel 4. a szérumban, vagy sejtkultúrában a citokinháztartás változására utaló paraméterek (pl. neopterin, sIL-2R) szintjének mérése ELISA, vagy RIA módszerrel. Különbözo módszerekkel nem csupán a spontán, de a mitogén stimuláció hatására bekövetkezo citokintermelést is vizsgálták. Az elsosorban a humorális immunválaszt serkento TH2 és a celluláris immunválaszt serkento TH1 típusú citokinek vizsgálata egyértelmuen nem igazolt sem TH2, sem TH1 túlsúlyt. A
42
leginkább egyértelmunek tuno citokin változás az interleukin-10 szint emelkedése, mely a legtöbb vizsgáló szerint magasabb lupusos betegekben mint egészséges kontrollokban és mennyisége korrelál a betegség aktivitásával (83,91,96). Az in vivo viszonyok pontos megismerése közelebb vihet a lupusban lezajló patologiás folyamatok megértésében. Izolált mononukleáris sejtek citokintermelésének vizsgálata során figyelembe kell vennünk azt a körülményt, hogy – a mononukleáris sejtek izolálása közben eredeti környezetükbol kiszakított sejtek citokintermelése megváltozhat. Alvadásgátolt teljes vérbol áramlási citometriával meghatározható az intracelluláris citokinek mennyisége, így a mononukleáris sejtek izolálására nincs szükség. Munkánk során ezt a viszonylag új módszert alkalmaztuk, így elso alkalommal mértünk teljes vérbol áramlási citometriával intracelluláris cikokinszintet lupusos betegek mintáiból. Eredményeink szerint nincs szignifikáns különbség lupusos betegek és egészséges kontrollok limfocitáinak interleukin-4 és gamma interferon termelése között, sem stimuláció jelenlétében, sem stimuláció nélkül. Szemikvantitatív
RT-PCR
módszer
felhasználásával
limfocita
citokin
mRNS
meghatározást végeztünk. Az mRNS mérés elozetesen izolált mononukleáris sejtekbol történt. A protein meghatározással ellentétben az IFN-? mRNS és az IL-10 mRNS szint lupusos betegekben szignifikánsan magasabb, míg az IL-4 mRNS mennyisége szignifikánsan alacsonyabb volt. A különbségek feltehetoen az eltéro módszerek, mérési körülmények használatából adódnak. További vizsgálatok szükségesek a kérdés tisztázására. Az utóbbi évek kutatásai rávilágítottak a celluláris immunválasz zavarára is SLE-ben (90). A celluláris immunitás aktiválódásának egyik igen megbízható markere a neopterin. Több korábbi vizsgálat a neopterint hasznos SLE aktivációs markernek találta (62-65). Korábban egyes vizsgálók a szérum neopterin mérések helyett a reggeli elso vizelet neopterin szint mérését javasolták, mivel a neopterin szinte kizárólag vesén keresztül választódik ki, így beszukült vesefunkció esetén a szérumban fokozott termelés nélkül is emelkedett koncentráció mérheto. A vizeletkoncentráltság egységesítése éredében vizelet neopterin vizelet kreatininre normalizált értékét adták meg. Munkánk során mégis a szérum neopterin mérést választottuk, melynek magyarázata, hogy minden betegünk normális vesefunkcióval rendelkezett, így tehát a rossz vesefunkcióból adódó hibalehetoséget ki lehetett zárni. Ugyanakkor beszukült vesefunkció esetén a szérum neopterin és szérum kreatinin hányados használata kiiktatja a vesefunkció romlása miatti hibákat. A statisztikai módszerek általában szükségesek a biológiai rendszereken végzett mérések összehasonlítására. A rendelkezésre álló statisztikai módszerek arzenáljából
43
célszerunek látszik szelektálni, hiszen míg érdemi következtetés gyakran nem vonható le statisztikai elemzés nélkül, a vizsgálat tárgyát képezo változókon kívül számtalan körülményt is mérlegelni lehet, így a potenciálisan alkalmazható statisztikai módszerek száma igen magas. Mivel azonban minden potenciális körülmény tökéletes vizsgálata nem lehetséges, célszeru a leginkább informatív módszerek alkalmazása mellett maradni, a tökéletes statisztikai elemzésre való törekvés igénye nélkül. Munkánk során próbáltuk kiválasztani és alkalmazni a szükséges és elégséges statisztikai módszereket. A lupusos exacerbációk alatt a celluláris és a humorális immunrendszer aktiválódása is megtörténik (1-2). Korábbi vizsgálatok eredményeképpen hasonlóan a mi eredményeinkhez humorális és a celluláris immunrendszer aktivitását jelzo paraméterek alacsony korrelációt mutatnak egymással (64,65). A humorális immunrendszer aktivációját jelzo paraméterek ugyanakkor (anti-DNS, C3, C4, CH50 komplement) igen jól korrelálnak egymással. Igy tehát bizonyos betegeknél, vagy a shub bizonyos periódusában foleg a celluláris, vagy foleg a humorális immunitás aktivitása fokozodik. Logikusnak tunik több laboratóriumi paramérer egyideju értékelése, melyre korábban csupán néhány próbálkozás történt (132-136). Ezen adatok alapján a következo kerdésekre kerestünk választ: ?
Érdemes-e az egymással igen magas korrelációt mutató anti-DNS, C3, C4, CH50 komplementparaméterek egyideju mérését elvégezni?
?
Az
egymással
nem
korreláló
paraméterek
együttes
értékelésébol nyerheto-e
többletinformáció? A kérdések megválaszolására a rendelkezésre álló módszerek közül logisztikus regresszió módszerét választottuk. Eredményeink szerint az egymással igen jó korrelációt mutató paraméterek együttes értékelése lényeges többletinformációval nem jár, tehát érdemes kiválasztani a leginkább informatív módszert. Az egymással szignifikánsan nem korreláló paraméterek együttes értékelése ugyanakkor jelentos többletinformációval jár. Munkánk eredményeképpen logisztikus regresszió módszerével eloállítható egy klinikai laboratóriumban alkalmazható formula. Ennek felhasználásával könnyen kezelheto, a lupus aktivitásával az egyes paramétereknél szignifikánsan jobban korreláló érték un. aktivitási valószínuség (AV) nyerheto. Az AV értéket a neopterin és az anti-DNS szérumszintjébol számolható. Az aktivitási valószínuséget hasznosabbnak találtuk az SLE aktivitásának megítélésében, mint a neopterin, anti-DNS, sIL-2R, C3, C4, CH50 meghatározást. Az AV legkedvezobb szenzitivitása és specificitása egyaránt 90 % körül van, mely lényegesen
44
magasabb, mint a komplementaktivációs termékek közül a leghasznosabbnak talált C3B(Bb)P szenzitivitása és specificitása. (A minták tárolási körülményei igen különbözoek voltak. Ezért technikai okok miatt az egyes munkákban a különbözo betegcsoportok között igen kicsi az átfedés. Az egyes aktivációs markerek tulajdonságait így csupán a különbözo munkák során elvégzett statisztikai számítások összevetésével végeztük el.) A korábbi vizsgálók által leírt szenzitivitás és specificitás értékek szintén a mi eredményeinknél alacsonyabbak. A többi vizsgált paraméter bevonása szignifikánsan nem javítja az AV-t. További vizsgálatok szükségesek, lehetoleg több SLE-s beteg gondozó centrum bevonásával az AV további vizsgálatára. Hasonló módszer alkalmazható lehet az SLE-s exacerbációk és fertozés elkülönítésére is.
IX: Legfontosabb saját eredmények
- Az alternatív konvertáz enzim szérumszintje jól korrelál az SLE aktivitásának mértékével, hasznosabb mint a számos laboratóriumban rutinszeruen mért paraméterek.
- Az anti-koleszterin antitest szinje emelkedett SLE-s betegek szérumában, de nem korrelál a klinikai aktivitás mértékével.
- T sejtek interleukin-4 és interferon gamma mennyisége nem különbözik SLE-s betegekben és egészséges kontrollokban, illetve független az SLE aktivitásának mértékétol. Az interferon gamma és az IL-10 mRNS szint ugyanakkor szignifikánsan emelkedett, míg az IL-4 mRNS szint szignifikánsan csökkent SLE-s betegekben, de független a betegség aktivitásától.
45
-
Klinikai
laboratóriumban
is
alkalmazható,
egyszeru
matematikai
formula
felhasználásával a neopterin és az anti-DNS szérumszintjébol aktivitási valószínuség számolható, mely az egyes laboratóriumi paramétereknél lényegesen pontosabban tükrözi az SLE aktivitásának mértékét.
46
X: Köszönetnyilvánítás Elsosorban köszönettel tartozom témavezetomnek, Gergely Péter Professzor Úrnak, aki munkámat mindvégig segítette, támogatta, az önálló gondolkodásra, munkára nevelt. Köszönöm Füst György Professzor Úrnak igen értékes és gondos segítségét, sok hasznos ötletét, bíztatását. Köszönöm Karádi István Professzor Úr segítségét, lelkesítését és a kutatómuka támogatását a klinikai munka mellett is. Köszönöm továbbá Michael Kirschfink Professzor Úr és Falus András Professzor Úr tanácsait, támogatását. Köszönettel tartozom továbbá mindazoknak, akik munkámat segítették.
47
XI: Irodalomjegyzék 1
Gergely P. Klinikai Immunológia. Medintel, Budapest, 1997
2
Petrányi Gy és mtsai (szerk.) Klinikai Immunológia, Medicina, Budapest, 2000
3
IUIS/WHO Working Group: Use and abuse of eight widely-used diagnostic procedures in
clinical immunology: a WHO memorandum. Bull WHO 1981; 59: 717-28 4
Esdaile JM, Abrahamowicz M, Joseph L et al. Laboratory tests as predictors of disease
exacerbations in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1996; 39: 370-378 5
Esdaile JM, Joseph L Abrahamowicz M et al. Routine immunologic tests in systemic
lupus erythematosus: is there a need for more studies? J Rheumatol 1996; 23: 1891-1896 6
Hay E, Gordon C, Emery P: Assessment of lupus: where are we now? Ann Rheum Dis
1993; 52: 169-172 7
TER Borg EJ, Horst G, Hummel EJ et al. Measurement of increases in anti-double-
stranded DNA antibody levels as a predictor of disease exacerbation in systemic lupus erythematosus. A long-term, prospective study. Arthritis Rheum 1990; 33: 634-643 8
Swaak AJG, Groenwold J, Bronsweld W: Predictive value of complement profiles and
anti-dsDNA in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 1986; 45: 359-366 9
Arbuckle MR, James JA, Kohlhase KF, Rubertone MV, Dennis GJ, Harlej JB:
Development of anti-dsDNA antibodies prior to clinical diagnosis of systemic lupus erythematosus. Scand J Immunol 2001; 54: 211-219 10
Tan EM, Cohen AS, Fries JF et al.: The 1982 revised criteria for the classification of
systemic lupus erythematosus (SLE). Arthritis Rheum 1982; 25: 1271-1277 11
Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB et al. Derivation of the SLEDAI: A disease
activity index for lupus patients. Arthritis Rheum 1992; 35: 630-640 12
Klinman DM, Banks S, Hartman A et al: Natural murine autoantibodies and conventional
autoantibodies exhibit similar degrees of antigenic cross-reactivity. J Clin Invest 1988; 82: 652657 13
Zouali M, Stollar BD, Scwarz RS. Origin and diversification of anti-DNA antibodies.
Immunol Rev. 1988; 105: 137-159 14
David SP: Anti-DNA antibodies in systemic lupus erythematosus. Rheum Dis Clin N
Amer 1992; 18: 437-454
48
15
Izui S, Zaldivar NM, Scher L et al. Mechanism for induction of anti-DNA antibodies by
bacterial lipopolysaccharides in mice: Anti-DNA induction by LPS without significant release of DNA in circulating blood. J Immunol 1977; 119: 2151-2156 16
Wofsy D, Seaman WF: Successful treatment of autoimmunity in NZB/NZW F1 mice
with monoclonal antibody to L3T4. J Exp Med 1985; 161: 378-391 17
Khalil M, Inaba K, Steinman R et al. T cell studies in a peptide-induced model of
systemic lupus erythematosus. J Immunol 2001; 166: 1667-1674 18
Rekvig OP, Andreassen K, Moens U. Antibodies to DNA - towards an uderstanding of
their origin and patophysiological impact in systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol 1998; 27: 1-6 19
Datta SK, Kaliyaperumal A, Desai-Mehta A: T cells of lupus and molecular targets for
immunotherapy. J Clin Immunol 1997; 17: 11-20 20
Mohan C, Adams S, Stanik V et al. Nucleosome: A major immunogen for pathogenic
autoantibody-inducing T cells of lupus. J Exp Med 1993; 177: 1367-1381 21
Desai-Mentha A, Mao C, Rajagopalan S et al. Structure and specificity of T cell
receptors expressed by potentially pathogenic anti-DNA antibody inducing T cells in human lupus. J Clin Invest 1995; 95: 531-541 22
Stollar BD. The specificity and applications of antibodies to helical nucleid acids. CRC
Crit Rev Biochem 1975; 3: 45-69 23
Stollar BD. Antibodies to DNA. CRC Crit Rev Biochem 1986; 20: 1-36
24
Desai DD, Krishnan MR, Swindle JT et al. Antigen specific induction of antibodies
against native mammalian DNA in nonautoimmune mice. J Immunol 1993; 151: 1614-1626 25
Herkel Z, Mimran A, Erez N et al. Autoimmunity to the p53 protein is a feature of
systemic lupus erythematosus (SLE) related to anti-DNA antibodies. J Autoimmun 2001; 17: 6369 26
Pisetsky DS: Immune responses to DNA in normal and aberrant immunity. Immunol Res
2001; 22: 119-126 27
Sharma A, Isenberg DA, Diamond B. Crossrectivity of human anti-dsDNA antibodies to
phosphorylcholine: clues to origin. J Autoimmun 2001; 16: 479-484 28
Suzuki N, Sakane T, Engelman EG. Anti-DNA antibody production by CD5+ and CD5-
B cells of patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 1990; 85: 238-247 29
Casali P, Burastero SE, Balow JE et al. High affinity antibodies to ssDNA are produced
by CD5- B cells in systemic lupus erythematosus patients. J Immunol 1989; 143: 3476-3283
49
30
Tsao BP, Ebling FM, Roman C et al: Structural charactreristics of the variable regions of
immunoglobulin genes encoding a pathogenic autoantibody in murine lupus. J Clin Invest 1990; 85: 530-540 31
Mendlovich S, Brocke S, Frike H et al. The genetic regulation of the induction of
experimental SLE. Immunology 1990; 69: 228-236 32
Mendlovich S, Fricke H, Shoenfeld Y et al. The role of anti-idiotypic antibodies in the
induction of experimental systemic lupus erythematosus in mice. Eur J Immunol 1989; 19: 729734 33
Faaber P, Rijke TPM, van de Putte LBA et al. Cross reactivity of human and murine
anti-DNA antibodies with heparan sulfate. J Clin Invest 1986; 77: 1824-1830 34
Sabbaga J, Line SRP, Potocnjak P et al: A murine nephritogenic monoclonal anti-DNA
autoantibody bonds directly to mouse laminin, the major non-collagenous protein component of the glomerular basement membrane. Eur J Immunol 1989; 19: 137-143 35
Mostoslavsky G, Fischel R, Yachimovich N et al. Lupus anti-DNA antibodies cross react
with a glomerular structural protein: a case for tissue injury by molecular mimicry. Eur J Immunol 2001; 31: 1221-1227 36
Karounos DG, Grudier JP, Pisetsky DS. Spontaneous expression of antibodies to DNA of
various species origin in sera of normals and patients with SLE. J Immunol 1988; 140: 451-455 37
Smeenk R, van der Lelij G, Aarden L: Avidity of antibodies to dsDNA: comparison of
IFT on Crithidia luciliae, Farr assay and PEG assay. J Immunol 1982; 128: 73-78 38
Pisetsky DS: Anti-DNA antibodies in systemic lupus erythematosus. Rheum Dis Clin N
Amer 1992; 18: 437-454 39
Swaak AJG, Aarden LA, Statuis van Eps LW et al. Anti dsDNA and complement
profiles as prognostic guides in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1979; 22: 226235 40
Swaak AJG, Groenvold J, Aarden LA et al. Prognostic value of anti-dsDNA in SLE.
Ann Rheum Dis 1982; 41: 388-395 41
Abrass CK, Nies KM, Louie JS et al. Correlation and predictive accuracy of circulating
immune complexes with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1980; 23: 273-282 42
Petri M, Genovese M, Engle E et al. Definition, incidence and clinical descriptin of flare
in systemic lupus erythematosus. A prospective cohort study. Arthritis Rheum 1991; 34: 937-944
50
43
Kirschfink M: Testing the complement system. The clinical laboratory. Springer Verlag
Berlin Heidelberg 1998; 522-547
44
Gergely J, Erdei A. Immunbiológia, Medicina, Budapest, 1998
45
Laurell AB, Martensson U, Sjöholm HE: Quantitation of C1r-C1s-C1 inactivator
complexes by electroimmunoassay. Acta Pathol Microbiol Scand 1979; 87: 79-81 46
Valentijn RM, van Overhagen H, Hazeovet HM et al. The value of complement and
immune complex determinations in monitoring disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1985; 28: 904-913 47
Sturfelt G, Jonsson N, Sjöholm AG: Sequential studies of complement activation in
systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol 1985; 14: 184-196 48
Nusinow SR, Zuraw BL, Curd JG. Herediary and acquired deficiencies of complement.
Med Clin North Am 1985; 69: 487-504 49
Fielder AHL, Walport MJ, Batchelor JR et al. Family study of the major
histocompatibility complex in patients with systemic lupus erythematosus: importance of null alleles of C4A and C4B in determining disease susceptibility. Br Med J 1983; 286: 425-428 50
Sturfelt G, Sjöholm AG, Svensson B: Complement components, C1 activation and disease
activity in SLE. Int Archs Allergy appl. Immunol 1983; 70: 12-18 51
Manzi S, Rairie JE, Carpenter AB et al. Sensitivity and specificity of plasma and urine
complement split products as indicators of lupus disease activity. Arthritis Rheum 1996; 39: 1178-1788 52
Buyon JP, Tamerius J, Belmont HM et al. Assessment of disease activity and impending
flare in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1992; 35: 1028-1037 53
Buyon JP, Tamerius J, Ordorica S et al. Activation of the alternative complement
pathway accompanies disease flares in systemic lupus erythematosus during pregnancy. Arthritis Rheum 1992; 35: 55-61 54
Auda G, Holme ER, Davidson JE et al. Measurement of complement activation products
in patients with chronic rheumatic diseases. Rheumatol Int 1990; 10: 185-189 55
Kerr LD, Adelsberg BR, Schulman P et al. Factor B activation products in patients with
systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1989; 32: 1406-1413 56
Wacher H. Neopterin: biochemistry, methods, clinical application. Gerike GmbH Berlin,
Germany 1991
51
57
Wachter H, Hausen A and Grassmayr K. Increased urinary excretion of neopterin in
patients with malignant tumors and with virus diseases. Hoppe Seyler’s Z Physiol Chem 1979; 360: 1957-1960 58
Hausen A, Fuchs D, Grüenwald K et al. Urinary neopterin as a marker for
haematological neoplasias. Clin Chim Acta 1981; 117: 297-305 59
Fuchs D, Hausen A, Reibnegger G et al. Neopterin as a marker for activated cell
mediated immunity. Immunol Today 1988; 9: 150-155 60
Andert S, Griesmacher A, Zuckerman A et al. Neopterin release from human endothelial
cells is triggered by interferon-gamma. Clin Exp Immunol 1992; 88: 555-558 61
Rokos K, Kunze ROF, Koch MA et al. Unconjugated pterins and related biogenic
amines. de Gruyter 1987; 177-184 62
Leohirun L, Thuvasethakul P, Sumethkul V et al. Urinary neopterin in patients with
systemic lupus erythematosus. Clin Chem 1991; 37: 47-50 63
Hagihara M, Nagatsu T, Ohhashi M et al. Concentrations of neopterin and biopterin in
serum from patients with rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus and in synovial fluid from patients with rheumatoid or osteoarthritis. Clin Chem 1990; 36: 705-706 64
Lim KL, Jones AC, Brown NS et al. Urine neopterin as a parameter of disease activity in
patients with systemic lupus erythematosus: comparisons with serum SIL-2R and antibodies to dsDNA, erythrocyte sedimentation rate, and plasma C3, C4, and C3 degradation products. Ann Rheum Dis 1993; 52: 429-435 65
Lim KL, Muir K, Powell RJ. Urine neopterin: a new parameter for serial monitoring of
disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 1994; 53: 743748. 66
Samsonov MY, Tilz GP, Egorova O et al. Serum soluble markers of immune activation
and disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus 1995; 4: 29-32 67
Smith KA. Interleukin-2: inception, impact and implication. Science 1989; 240: 1169-1176
68
Rubin LA, Kurman CC, Fritz ME et al. Soluble interleukin 2 receptors are released from
activated human lymphoid cells in vitro. J Immunol 1985; 135: 3172-3177 69
Nelson DL, Wagner DK, Marcon L et al. An analysis of soluble IL-2 receptors in human
neoplastic disorders. Biotechnology in Clinical Medicine. Edited by A Albertini, C Lentant, R Poeletti, New York, Raven Press 1987 70
Rubin LA. The soluble interleukin-2 receptor in rheumatic disesase. Arthritis Rheum
1990; 33: 1145-1148
52
71
Keystone EC, Snow KM, Bombardier C et al. Elevated soluble interleukin 2 receptor
levels in the sera and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 844-849 72
Campen DH, Horwitz DA, Quismorio FP Jr et al. Serum levels of interleukin-2 receptor
and activity of rheumatic diseases characterized by immune system activation. Arthritis Rheum 1988; 31: 1358-1364 73
Wood NC, Symons JA, Duff GW: Serum interleukin 2 receptor in rheumatoid arthritis: a
prognostic indicator of disease activity? J Autoimmun 1988; 1: 353-360 74
Wolf RE, Brelsford WG: Soluble interleukin-2 receptors in sytemic lupus erythematosus.
Arthritis Rheum 1988; 31: 729-735 75
Manoussakis MN, Papadopoulos GK, Drosos AA et al. Soluble interleukin 2 receptor
molecules in the serum of patients with autoimmune diseases. Clin Immunol Immunopathol 1989; 50: 321-332 76
Semenzato G, Bambara LM, Biasi D et al. Increased serum levels of soluble interleukin-2
receptor in patients with systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. J Clin Immunol 1988; 8: 447-452 77
Danieli MG, Paoletti P, Recchioni A et al. Serum levels of soluble interleukin-2 receptor
in patients with systemic lupus erythematosus and systemic idiopathic vasculitis. Scand J Rheumatol 1993; 22: 215-219 78
Wong KL, Wong PRO: Serum soluble interleukin 2 receptor in systemic lupus
erythematosus: effects of disease activity and infection. Ann Rheum Dis 1991; 50: 706-709 79
Roberti I, Dikman S, Spiera H et al. Comparative value of urinalysis, urine cytology and
urine sIL2-R in the assessment of renal disease in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Nephrol 1996; 46: 176-182 80
Linker-Israeli, M. Cytokine abnormalities in human lupus. Clin Immunol Immunopathol
1992 ; 63: 10-12 81
Alcocer-Varela J, Alarcon-Segovia D. Decreased production of and response to
interleukin-2 by cultured lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus J Clin Invest 1982; 69: 1388-1392 82
Linker-Israeli M, Bakke AC, Kitridou RC et al. Defective production of interleukin 1 and
interleukin 2 in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). J Immunol 1983; 130: 26512655
53
83
Viallard JF, Pellegrin JL, Ranchin V et al. Th1 (IL-2, interferon-gamma (IFN-?)) and Th2
(IL-10, IL-4) cytokine production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 1999; 115: 189-195 84
Huang YP, Perrin LH, Miescher PA et al. Correlation of T and B cell activities in vitro
and serum IL-2 levels in systemic lupus erythematosus. J Immunol 1988; 141: 827-833 85
Murakawa Y, Takada S, Ueda Y et al. Characterization of T lymphocyte subpopulations
responsible for deficient interleukin 2 activity in patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol 1985; 134: 187-195 86
Linker-Israeli M, Bakke AC, Quismorio FP et al. Correlation of interleukin-2 production
in patients with systemic lupus erythematosus by removal of spontaneously activated supressor cells. J Clin Invest. 1985; 75: 762-768 87
Linker-Israeli M, Graj-JD, Quismorio FP et al. Characterization of lymphocytes that
suppress IL-2 production in systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 1988; 73: 236-241 88
Linker-Israeli M, Quismorio FP, Horwitz DA. Further characterization of interleukin-2
production by lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 1988; 18: 1216-1222 89
Tanaka Y, Saito K, Shirakawa F et al. Production of B cell-stimulating factors by B cells
in patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol 1988; 141: 3043-3049 90
Akahoshi, M. Nakashima, H. Tanaka et al. Th1/Th2 balance of peripheral T helper cells
in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1999; 42: 1644-1648 91
Funauchi M, Ikoma S, Enomoto H et al. Decreased Th1 like and increased Th2 like cells
in systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol 1998; 27: 219-224 92
Tan PL, Blumenstein M, Yeoman S et al. B cell lymphokines in human systemic lupus
erythematosus. Ann Rheum Dis 1989; 48: 491-495 93
Linker-Israeli M, Deans RJ, Wallace DJ et al. Elevated levels of endogenous IL-6 in
systemic lupus erythematosus. A putative role in patogenesis. J Immunol 1991; 147: 117-123 94
Horwitz, DA, Wang H and Gray JD. Cytokine gene profile in circulating blood
mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus: increased interleukin-2 but not interleukin-4 mRNA. Lupus 1994; 3, 423-428 95
Swaak AJ, van Rooyen A, Aarden LA. Interleukin-6 (IL-6) and acute phase proteins in
the disease course of patients with systemic lupus erythematosus. Rheumatol Int 1989; 8: 263268
54
96
Hagiwara E, Gourley MF, Lee S et al. Disease severity in patients with systemic lupus
erythematosus correlates with increased ratio of interleukin-10:interferon-? secreting cells in the peripheral blood. Arthritis Rheum 1996; 39: 379-385 97
Park YB, Lee SK, Kim DS et al. Elevated interleukin-10 levels correlated with disease
activity in systemic lupus erythematosus. Clin Exp Rheumatol 1998; 16: 283-288 98
Tyrrell-Price J, Lydyard PM, Isenberg DA: the effect of interleukin 10 and 12 on the in
vitro production of anti-double stranded DNA antibodies from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 2001; 124: 118-125 99
Tokano, Y. Morimoto, S. Kaneko H et al. Levels of IL-12 in the sera of patients with
systemic lupus erythematosus (SLE)- relation to Th1 and Th2 derived cytokines. Clin ExpImmunol 1999; 116: 169-173 100
Preble OT, Black RJ, Friedman RM et al. Systemic lupus erythematosus: presence in
human serum of az unusual acid-labile leukocyte interferon. Science 1982; 216: 429-431 101
Blanco P, Palucka AK, Gill M et al. Induction of dendritic cell differentiation by IFN-
alpha in systemic lupus erythematosus. Science 2001; 294: 1540-1543 102
Funauchi M, Sugishima-H, Minoda M et al. Effect of interferon-gamma on B
lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 1991; 18: 368-372 103
Linker-Israeli M, Wallace DJ, Jordan SC et al. Arthritis Rheum. 1990 may.(abstract)
104
Kim T, Kanayama Y, Negoro N et al. Serum levels of interferons in patients with
systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 1987; 70: 562-569 105
Tsokos GC, Boumpas DT, Smith PL et al. Deficient gamma interferon production in
patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1986; 29: 1210-1215 106
Stolzenburg T, Binz H, Fontana A et al. Impaired mitogen-induced interferon-gamma
production in rheumatoid arthritis and related diseases. Scand J Immunol 1988; 27: 73-81 107
Malave I, Searles RP, Montano J et al. Production of tumor necrosis factor/cachectin by
peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic lupus erythematosus. Int Arch Allergy Appl Immunol 1989; 89: 355-361 108
Dinu AR, Merrill JT, Shen C et al. Frequency of antibodies to the cholesterol transport
protein apolipoprotein A1 in patients with SLE. Lupus 1998; 7: 355-360 109
Wu R, Svenungsson E, Gunnarsson I et al. Antibodies against lysophosphatidilcholine and
oxidized LDL in patients with SLE. Lupus 1999; 8: 142-150 110
Manzi S. Inflammation-mediated rheumatic diseases and atherosclerosis. Ann Rheum Dis
2000; 59: 321-325
55
111
Illowite NT. Hyperlipidemia and the rheumatic diseases. Curr Opin Rheumatol 1996; 8:
455-458 112
Bruce IN, Urowitz MB, Gladman DD et al. Natural history of hypercholesterolemia in
systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 1999; 26: 2137-2143 113
Tsutsumi A, Matsuura E, Ichikawa K et al. Antibodies to ß2 glycoprotein I and clinical
manifestations in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1996; 39: 14661474 114
Perumal HMD, Thiagarajan P, Ahn C et al. Autoantibodies to ß 2 glycoprotein I in
systemic lupus erythematosus and primery antiphospholipid antibody syndrome: clinical correlations in comparison with other antiphospholipid antibody tests. J Rheumatol 1998; 25: 667-674 115
Matsuda J, Saitoh N, Gohchi K et al. Anti-annexin V antibody in systemic lupus
erythematosus patients with lupus anticoagulant and/or anticardiolipin antibody. Am J Haematol 1994; 47: 46-58 116
Li SJ, Liu MF, Lei HY: Characterization of anti-endothelial cell antibodies in the patients
with systemic lupus erythematosus. A potential marker for disease activity. Clin Immunol Immunopathol 1996; 79: 211-216 117
Prada AE, Strife CF: IgG subclass restriction of autoantibody to solid-phase C1q in
membranoproliferative and lupus glomerulonephritis. Clin Immunol Immunopathol 63; 1992: 8488 118
Pallares JF, Martinez ME, Gaya A. Elevated soluble CD27 levels in serum of patients
with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol Immunopathol 1996; 239-243: 1996 119
Nockher WA, Wigand R, Schoeppe W et al. Elevated levels of soluble CD14 in serum of
patinets with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 1994; 96: 15-19 120
Inoh M, Tokuda M, Kiuchi H et al. Evaluating systemic lupus erythematosus disease
activity using molecular markers of haemostasis. Arthritis Rheum 1996; 39: 287-291 121
Kotajima L, Aotsuka S, Sato T. Clinical significance of serum thrombomodulin levels in
patients with systemic rheumatic diseases. Clin Exp. Rheumatol 1997; 15: 59-65 122
Nishiya K, Hashimoto K. Elevation os serum ferritin levels as a marker for active
systemic lupus erythematosus. Clin Exp Rheumatol 1997; 15: 39-44 123
Porcel JM, Ordi J, Castro-Salomo A et al: The value of complement activation products
in the assessment of systemic lupus erythematosus flares. Clin Immunol Immunopathol 1995; 74: 283-288
56
124
Kotnik V, Luznik-Bufon T, Schneider PM et al. Molecular, genetic and functional
analysis of homozygous C8? chain deficiency in two siblings. Immunopharmacology 1997; 38: 215-221 125
Cat R, Rosario NA, de Messias IT et al. Evaluation of complement activation in
premature newborn infants with hyaline membrane disease. Eur J Pediatr 1993; 152: 205-208 126
Horváth A, Füst G, Horváth I et al. Anti-cholesterol antibodies (ACHA) in patients with
different atherosclerotic vascular diseases and healthy individuals. Characterization of human ACHA. Atherosclerosis 2001; 156: 185-192 127
Maino VC, Picker LJ. Identification of functional subsets by flow cytometry: intracellular
detection of cytokine expression. Cytometry 1998; 34: 207-215 128
Pócsik É, Gonzalez-Cabello R, Gergely P. Precultured and fresh human T cells suppress
the mitogen response of autologous lymphocytes. Immunol Lett 1983; 6: 97-100 129
Zuo W, Durand Gasselin I et al. Quantification of cytokine gene expression by
competittive PCR using a colorometric assay. Eur J Cytokine Netw 1995; 6: 257-264 130
Metz CE: Basic principles of ROC analysis. Semin Nucl Med 1978; 8: 2832-2898
131
Chiu YY, Nisihara RM, Wurzner et al. SC5b9 is the most sensitive marker in assessing
disease activity in Brasilian SLE patients. J Investing Allergol Clin Immunol 1998; 8: 239-244 132
Cronin ME, Leair DW, Jaronski S et al. Simultaneous use of multiple serologic tests in
assessing clinical activity in systemic lupus erythematosus. Clin Immunol Immunopathol 1989; 51: 99-109 133
Helve T, Kurki P, Teppo AM et al. DNA antibodies and complement in SLE patients. A
follow-up study. Rheumatol Int 1983; 3: 129-32 134
Klemp P, Meyers OL, Harley EH. A new specific assay for the detection of DNA
immune complexes: its relevance in SLE. Ann Rheum Dis 1983; 42: 317-322 135
Morrow WJ, Isenberg DA, Todd-Pokropek A et al. Useful laboratory measurements in
the management of systemic lupus erythematosus. Q J Med 1982; 51: 125-138 136
Villarreal GM, Drenkard C, Villa AR et al.: Prevalence of 13 autoantibodies and of the
16/6 and related pathogenic idiotypes in 465 patients with systemic lupus erythematosus and their relationship with disease activity. Lupus 1997; 6: 425-435
57
XII: Saját közlemények jegyzéke Az értekezés témájában megjelent saját közlemények
Nagy G. Brózik M. Varga L. Füst G. Kirschfink M. Kiss E. Gergely P. Usefulness of detection of complement activation products in evaluating SLE activity. Lupus 2000; 9(1): 19-25
Nagy G. Pállinger É. Antal-Szalmás P. Aleksza M. Marschalko M. Brózik M. Falus A. Gergely P. Measurement of intracellular interferon-gamma and interleukin-4 in whole blood T lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Immunology Letters 2000 Nov; 74(3): 207-210
Nagy G. Brózik M. Tornóci L. Gergely P. Diagnostic value of combined evaluation of neopterin and anti-DNA antibody levels for assessment of disease activity in systemic lupus erythematosus. Clinical & Experimental Rheumatology 2000 Nov-Dec; 18(6): 699-705
Csiszár A. Nagy G. Gergely P. Pozsonyi T. Pócsik É. Increased interferon-gamma (IFN-gamma), IL-10 and decreased IL-4 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology 2000 Dec; 122(3): 464-470
Nagy G. Horváth A. Füst G. Romics L. Gergely P. Karádi I:. Anticholesterol antibody levels in patients with systemic lupus erythematosus. Annals of the Rheumatic Diseases 2001 Jul; 60(7): 722-3
További saját közlemények:
58
Rohács T, Nagy G. and Spät A: Cytoplasmatic Ca2+ signalling and reduction of mitochondrial pyridine nucleotides in adrenal glomerulosa cells in resronse to K+, angiotensin II and vasopressin. Biochem J 1997; 322: 785-792 Kerényi Á. Nagy G. Veres A. Varga L. Füst A. Nagymihány A. Czumbel N. Süveges I. Füst G.: C1r-C1s-C1inhibitor (C1rs-C1inh) complex measurements in tears of patients before and
after
penetrating
keratoplasty.
Curr
Eye
Res
2002
Feb;
24(2):
99-104
Idézheto absztraktok: Nagy G. Brózik M. Varga L. Füst G. Kirschfink M. Kiss E and Gergely P: Usefulness of complement activation products in evaluating SLE activity. Mol Immunol 1999; 36: 307
Nagy G. Brózik M. Tornóci L. and Gergely P: Logistic regressional approach to combine the diagnostic value of neopterin and anti-DNA to discriminate between active and inactive SLE patients. Lupus 2001; S: 75
59
