A SEJTSZÓRÓDÁSBAN RÉSZTVEVO JELÁTVITELI UTAK VIZSGÁLATA: A PROTEIN KINÁZ C SZEREPE
Gujdár Annamária
Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Témavezeto: Dr. Faragó Anna egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobio kémiai Intézet (2004)
Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
BEVEZETÉS
Az invazív sejtproliferáció, azaz a sejtszóródással kísért proliferáció, számos
fiziológiás
folyamat
nélkülözhetetlen
eleme,
patológiás
körülmények között viszont a daganatok metasztázis képzésének egyik komponense. A legismertebb, fiziológiás szóródást indukáló faktor a hepatocita növekedési faktor (HGF), munkacsoportunk ennek a jelpálya rendszerét vizsgálja. A HGF akkor fejti ki biológiai hatásait, ha receptorához, a met protoonkogén által kódolt, tirozin-kináz aktivitással rendelkezo c-Met-hez kötodik. A c-Met heterodimer szerkezetu molekula, ? és ? alegységekbol áll, melyeket egy diszulfid híd köt össze. Az ? alegység a sejt külso felszínén helyezkedik el, tömege 50 kDa, erosen glikozilált. A ? lánc, amely 145 kDa-os, egy exracelluláris, egy transzmembrán és intracelluláris doménekbol áll. A receptor intracelluláris, C terminális, részén megtalálható a kináz domén, illetve az autofoszforilációra alkalmas tirozin oldalláncok, köztük a multiszubsztrát dokkoló hely, ahonnan a receptoraktiváció hatására különbözo jelpályák indulhatnak el. A ligand kötodése után két receptormolekula dimerizálódik, majd tirozin-kináz doménjeik
segítségével
egymást
több
tirozin
oldalláncon
keresztfoszforilálják az ATP ? helyzetu foszfátjának terhére. Ezt a jelenséget nevezik autofoszforilációnak, amely a tirozin-kináz receptorokra általánosan jellemzo. A Met receptoron elhelyezkedo, úgynevezett multiszubsztrát dokkoló helyekhez az oket specifikusan felismero fehérjék SH2 illetve PTB doménjeikkel tudnak kötodni.
1
A c-Met receptorra jellemzo, hogy a Gab1 dokkoló fehérje specifikus aminósav szekvenciájával közvetlenül is kötodik a fehérjéhez, HGF hatására
több
tirozin
oldalláncon
foszforilálódik,
és
a
receptor
muködésében kiemelkedoen fontos szerepet játszik. A Met receptor által stimulált invazív proliferációban esszenciális szerepe van a foszfatidilinozitol 3-kináznak (PI3K), az Erk1/Erk2 MAP kináz kaszkád aktiválódásának és az Src kináznak. (1.ábra)
migráció
Src kináz
tirozin kináz domén
Rac túlélési jel PI(3)K
multidokkoló hely
P
P
P
P
Akt/PKB proliferáció
Ras
Erk1/Erk2 migráció
P
Stat
Gab1
jelerosítés P P
Shc
P
PLC?
„branched” morfogenezis
P
1.ábra A Met receptorról induló különbözo jelátviteli utak
2
A Met receptor által indított jelpályában az I A osztályba tartozó PI 3kináznak van szerepe. Minthogy ez mind a receptor multidokkoló helyérol, mind a Gab 1-rol aktiválódik, a HGF a PI3-kináz eros aktiválódását indukálja. A PI 3-kináz aktiválódása szükséges a túlélési jelhez és a proliferációhoz. Egyik fontos szerepe a protein kináz B aktiválódásának az eloidézése. A HGF által indukált migrációhoz vezeto útvonalon esszenciálisnak tartják a PI 3-kináz szerepét a Rac GTP-köto fehérje aktiválódásában, és az aktin citoszkeleton átrendezodésében. Ugyancsak mind a Met receptorról, mind a Gab 1-rol elindulhat az Erk1/Erk2 MAP kinázok aktiválásához vezeto jelpálya.
AZ ÉRTEKEZÉSBEN ÖSSZEFOGLALT MUNKA KÖZVETLEN ELOZMÉNYEI
A munkacsoport, melyhez elobb tudományos diákköri hallgatóként, majd PhD hallgatóként csatlakoztam, évek óta foglalkozik az invazív proliferációt irányító jelpályák szabályozási folyamataival. Ezekhez a vizsgálatokhoz modell sejtként a HepG2 humán hepatoma sejtek szolgálnak. A HepG2 sejtek viszonylag differenciált sejtek, igen sok képességükben hasonlítanak a nem daganatos májsejtekhez. Az invazív proliferáció vizsgálatához azért különösen jó modellek, mert HGF/scatter faktorral enyhe szóródásra serkenthetoek, a HGF-hez teljesen hasonló jelpálya modulokat használó EGF egyáltalán nem képes szóródást indukálni ezekben a sejtekben, ezzel szemben a protein kináz C-t permanensen aktiváló forbol észter a HepG2 sejtek igen eros szóródását hozza létre. A munkacsoport vizsgálati stratégiája kezdettol fogva az EGF
3
és HGF jelpályák közti különbségek, illetve a HGF és a forbol észter által stimulált mechanizmusok közti hasonlóságok és különbségek kimutatásán alapul.
Ezen
vizsgálatok
legfontosabb
eredményei,
amelyek
az
értekezésben összefoglalt munka kiindulási pontját jelentik, a következok: 1. Kiderült, hogy az ERK1/2 MAP kinázok aktiválódása nélkülözhetetlen feltétele a HepG2 sejtek szóródásának, akár HGF, akár forbol észter által indukált szóródásról van szó. (Korábban csak a PI 3-kináz szóródásban betöltött szerepét hangsúlyozták, az Erk1/2 aktiválódását csak proliferációs jelnek tartották.) 2. A munkacsoport kimutatta, hogy a HGF-fel indukált jelpályában a PI3kináz aktivitása hozzájárul az Erk1/Erk2 aktiválódás intenzitásának fokozódásához, míg az EGF jelpályájában a PI3-kináznak nincs ilyen hatása. 3. Összehasonlítva a HGF, EGF, illetve a forbol észter által stimulált Erk1/Erk2 aktiválódás kinetikáját, nyilvánvalóvá vált, hogy a szóródást kiváltó stimulusok hosszantartó (6-8 óra, vagy több) Erk1/Erk2 aktiválódást hoznak létre, míg a szóródást kiváltani nem tudó EGF által létrehozott Erk1/Erk2 aktiválódás sokkal rövidebb ideig tart (3 óra alatt lecseng). 4. Az Erk1/Erk2 MAP kináz kaszkád nagyon intenzív aktiválódása viszont, a p21 fehérje expressziójának fokozódása révén, összefüggésbe hozható a sejtszóródást kíséro átmeneti növekedés gátlással. Ezek a megfigyelések vezettek ahhoz a következtetéshez, hogy a vizsgált rendszerben, a biológiai válasz jellegét, vagyis hogy migrációval vagy proliferációval válaszol a sejt egy adott jelre, azt a mindkét válaszban szerepet játszó jelpályák aktiválódásának intenzitása és idotartama határozza meg.
4
5. A fenti következtetést egészítette ki egy másik megfigyelés (az ehhez vezeto kísérletekben már én is részt vettem), miszerint a HGF jelpályában (de az EGF jelpályában nem), a protein kináz C csökkenti az Erk1/Erk2 intenzív aktiválódásának idotartamát. A vázolt eredmények alapján rajzolódott ki az a feltételezés, hogy a HGF által indukált invazív proliferáció során a migráció és proliferáció koordinálását egy olyan szabályozó rendszer végezheti, amely a mindkét fajta válaszhoz vezeto jelpályák aktiválódásának intenzitását és idotartamát képes negatívan modulálni. A HGF jelpályában a negatív moduláló szerepre az Erk1/Erk2 aktiválódásra gyakorolt hatása révén felmerült a protein kináz C mint lehetséges jelölt, ugyanakkor, ezzel ellentétben, a forbol észter által kiváltott szóródásban a protein kináz C pozitív szerepe volt valószínusítheto. (2.ábra)
AZ ÉRTEKEZÉSBEN ÖSSZEFOGLALT MUNKA CÉLKITUZÉSEI
1. Bizonyítani kívántam, hogy a protein kináz C ellentétes szerepeket
játszik nem csupán a HGF és forbol észter Erk1/Erk2 aktiválódására, hanem általában a migrációra gyakorolt hatásában is. 2. Célom volt feltérképezni, hogy a HepG2 sejtek migrációja az aktin citoszkeleton milyen jellegu átrendezodését igényli, illetve a forbol észterrel indukált jelpályák miben hasonlítanak, és miben különböznek a Met receptor által indított jelpályáktól.
5
3. Igyekeztem felderíteni azt a biokémiai mechanizmust, amelynek segítségével a protein kináz C betöltheti a negatív modulátor szerepét a HGF jelpályában.
HGF
c-Met Gab1
Foszfatidilinozitol 3-kináz
Erk1/2 MAP kinázok
túlélési jel
növekedési jel migráció 2. ábra
A HGF jelpálya munkacsoportunk korábbi munkája során kialakult modellje
EREDMÉNYEK
1. Kimutattuk, hogy a PKC ellentétes szerepet játszik a HepG2 sejtek forbol észterrel, illetve HGF/scatter faktorral kiváltott szóródásának szabályozásában. Míg az elsoért a PKC intenzív aktiválódása a felelos, a
6
HGF által indukált szóródás intenzitását a PKC aktivitása negatívan modulálja. 2. Megfigyeltük, hogy a forbol észterrel kiváltott eros migrációt nagyszámú, hosszú aktin filamentum képzodése kíséri. A forbol észterrel aktivált PKC hatására indukálódó aktin polimerizáció nem gátlódik a PI 3kináz enzim gátlásakor, jelezve, hogy ebben a mechanizmusban nem a PI 3-kinázé az iniciátor szerep. A forbol észterrel indukált migrációt nem gátolja az Src tirozin-kináz gátlása sem. 3. Kimutattuk, hogy a p21-aktivált protein kináz (PAK) aktiválódik forbol észterrel kezelt sejtekben és ezt a jelenséget sem védi ki sem a PI 3-kináz, sem az Src kináz gátlása. A PAK1 izoforma mennyisége átmenetileg csökken a migráció során. 4. Kimutattuk, hogy a HepG2 sejtek migrációját az ? 2 és ? 1 integrinek expressziójának fokozódása kíséri. Megállapítottuk, hogy a forbol észterrel aktivált PKC integrin expresszió fokozódást indukál, míg a HGF jelpályában a PKC csökkenti az integrin expresszió intenzitását. A növekedési faktorral kiváltott integrin expresszióhoz szükséges a PI 3kináz aktivitása is. 5. Kimutattuk, hogy a HGF hatására aktiválódó PI 3-kináz aktiválódásának idotartama a PKC gátlásakor növekszik. A PKC-nak nincs ilyen hatása az EGF jelpályában, ahol a PI 3-kináz aktiválódását a dokkoló foszfotirozinok elvesztése terminálja. Valószínu, hogy a PKC HGF jelpályára gyakorolt negatív hatásának a molekuláris alapja, a migráció stimulálásában esszenciális szerepet játszó PI 3-kináz aktiválódása idotartamának csökkentése. Ezzel szemben, az is valószínusítheto, hogy a forbol észterrel nagyon intenzíven aktivált PKC olyan, alternatív jelpályán keresztül képes stimulálni a migrációt, amelyhez nem szükséges a PI 3kináz aktiválása. 7
HGF
Forbol észter PLC
Met
Nem PI 3K
I Gab1 YP I
PKC
I
YP YP
Erk1/2
PI 3K
Túlélési jel +
Növekedési jel
-
PKC
Erk1/2
Aktin citoszkeleton
Migráció 3. ábra A PKC migrációra gyakorolt ellentétes hatásainak modellje (Az YP jelölés a foszfotirozinokat szimbolizálja.)
8
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK
Az értekezésben bemutatott eredmények közvetlen elozménye:
Szabolcs Sipeki, Erzsébet Bander, Gyöngyi Farkas, Annamária Gujdár, D. Kirk Ways, Anna Faragó Protein kinase C decreases the hepatocyte growth factor-induced activation of Erk1/Erk2 MAP kinases. Cellular Signalling 12 (2000) 549-55. IF: 3,3
Az értekezésben összefoglalt munka az alábbi közleményeken alapul:
Annamária Gujdár, Szabolcs Sipeki, Erzsébet Bander, László Buday, Anna Faragó Phorbol ester-induced migration of HepG2 cells is accompained by intensive stress fibre formation, enhanced integrin expression and transient down-regulation of p21-activated kinase 1 Cellular Signalling 15 (2003) 307-318. IF: 4,4 Annamária Gujdár, Szabolcs Sipeki, Erzsébet Bander, László Buday, Anna Faragó Protein kinase C modulates negatively the hepatocyte growth factorinduced migration, integrin expression and phosphatidylinositol 3-kinase activation Cellular Signalling 16 (2004) 505-513. IF:4,4
9
