A kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések szerepe a gyulladásos bőrbetegségek patomechanizmusában Doktori (PhD) értekezés

A kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések szerepe a gyulladásos bőrbetegségek patomechanizmusában

Doktori (PhD) értekezés

Bánvölgyi Ágnes

PTE ÁOK 2006

A kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések szerepe a gyulladásos bőrbetegségek patomechanizmusában

Doktori (PhD) értekezés

Bánvölgyi Ágnes

Témavezető: Dr. Pintér Erika, egyetemi docens Programvezető: Dr. Szolcsányi János, akadémikus

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet 2006

2

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke ..............................................................................5 Összefoglalás ........................................................................................6 Summary .............................................................................................9 Bevezetés........................................................................................... 12 Neurogén gyulladás........................................................................... 13 A mustárolaj .................................................................................... 13 A kapszaicin és a TRPV1 receptor ........................................................ 14 TRPV1 receptor agonisták .................................................................. 17 Szenzoros proinflammációs neuropeptidek ........................................... 18 A tachykininek............................................................................... 18 A kalcitonin gén-rokon peptid .......................................................... 19 Az elvégzett kísérletek tudományos háttere .......................................... 19 Célkitűzések ....................................................................................... 23 Anyag és módszer ............................................................................... 24 Felhasznált állatok ............................................................................ 24 Az ödéma mérése ............................................................................. 24 Neutrofil granulocita akkumuláció mérése ............................................ 25 Statisztika ....................................................................................... 25 A. Mustárolajjal kiváltott gyulladás egérfülben ...................................... 25 Alkalmazott anyagok ...................................................................... 25 Szisztémás kapszaicin-előkezelés ..................................................... 26 Szövettani vizsgálatok .................................................................... 27 B. Oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz egérfülön ............... 27 Alkalmazott anyagok ...................................................................... 27 Szisztémás resiniferatoxin-előkezelés ............................................... 28 Szövettani vizsgálatok .................................................................... 28 Áramlási citometriai vizsgálatok – Mikrogyöngy technika ..................... 29 Eredmények........................................................................................ 30 A. Mustárolajjal kiváltott gyulladás egérfülben ...................................... 30 A./1 Mustárolajjal kiváltott gyulladás BALB/c egerekben ...................... 30

3

A./2 Mustárolajjal kiváltott fülgyulladás TRPV1 receptor génhiányos egerekben .................................................................................... 33 A./3 Mustárolajjal kiváltott fülgyulladás NK1 receptor génhiányos egerekben .................................................................................... 36 A./4 Szövettani eredmények ........................................................... 37 B. Oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz egérfülön ............... 39 B./1 A TRPV1 receptor szerepe az oxazolonnal kiváltott ACD reakcióban 39 B./2 A Th1/Th2 citokin profil változása oxazolonnal kiváltott ACD reakcióban.................................................................................... 44 B./3 A P-anyag és az αCGRP szerepe az oxazolonnal kiváltott ACD reakcióban.................................................................................... 45 Megbeszélés, következtetések ............................................................... 48 A. Mustárolajjal kiváltott gyulladás egérfülben ...................................... 48 B. Oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz egérfülön ............... 50 Tudományos munkám értékelése a legfrissebb irodalmi adatok tükrében ..... 53 Az értekezés új eredményei .................................................................. 56 Irodalomjegyzék.................................................................................. 57 Publikációs lista ................................................................................... 67 Az értekezés alapját képező elsőszerzős cikkek ..................................... 67 További közlemények ........................................................................ 67 Idézhető absztraktok az értekezés témájában ....................................... 68 Poszterek, előadások az értekezés témájában ....................................... 68 Egyéb poszterek ............................................................................... 69 Köszönetnyilvánítás ............................................................................. 72 Függelék ............................................................................................ 73 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények.......................................... 73

4

Rövidítések jegyzéke ACD

allergiás kontakt dermatitisz

AEA

anandamid (arachidonil-etanolamid)

B2

bradikinin-2 receptor

CB1

kannabinoid-1 receptor

CGRP

kalcitonin gén-rokon peptid

DTH IFNγ

delayed-type hypersensitivity (késői típusú hiperszenzitív reakció) interferon-gamma

IL

interleukin

NK1

neurokinin-1 receptor

OD

optikai denzitás

RTX

resiniferatoxin

SP

P-anyag (subtance P)

SR140333

NK1 receptor antagonista vegyület

Th1

T-helper 1 limfocita

Th2

T-helper 2 limfocita

TNFα

tumor nekrózis faktor-alfa

TRPV1

tranziens receptor potenciál vanilloid-1 (a kapszaicin receptora) vazoaktív intesztinális peptid

VIP

5

Összefoglalás Ismert, hogy számos gyulladásos és immun megbetegedés hátterében jelentős szerepet játszanak a neurogén komponensek. A bőrben található szenzoros rostokból gyulladáskeltő (tachykininek és kalcitonin gén-rokon peptid: CGRP) illetve gyulladást gátló (szomatosztatin, galanin stb.) neuropeptidek szabadulnak fel, melyek modulátor hatással bírnak a bőrgyulladások patomechanizmusában. A kapszaicin (a paprika csípős anyaga) szelektíven izgatja, és nagy dózisban deszenzitizálja a fájdalomérző (nociceptív)

szenzoros

rostok

e

szubpopulációját

-

melyek

a

fent

említett

neuropeptideket tartalmazzák -, és amelyeket ez alapján „kapszaicin-érzékeny afferenseknek” nevezünk. A kapszaicin a tranziens receptor potenciál vanilloid 1 (TRPV1) receptorokon keresztül fejti ki hatását a szenzoros rostokon, míg a felszabaduló tachykininek a neurokinin receptorokon (NK1, NK2, NK3) keresztül fokozzák az erek permeabilitását. A mustárolajat (allyl-isothiocyanate) régóta használják rágcsálók bőrére kenve a

gyulladások

során kialakuló

neurogén vazodilatáció és ödéma vizsgálatára.

Kísérleteink célja az volt, hogy megvizsgáljuk a mustárolajjal kiváltott ödémát és neutrofil granulocita akkumulációt egérfül bőrében különös tekintettel a neurokinin-1 (NK1) és tranziens receptor potenciál vanilloid 1 (TRPV1) receptorok szerepére, vad típusú (BALB/c, C57BL/6) és NK1 valamint TRPV1 receptor génhiányos egerek használatával. A mustárolaj egyszeri vagy kétszer történő alkalmazása is képes volt ödémát okozni a fülszövetben, mely hat óra múlva már nem volt megfigyelhető. A hat órás kísérlet során óránként alkalmazott 1%-os mustárolaj 25-30%-os, permanens fülduzzadást váltott ki. A szenzoros idegek kapszaicinnel való deszenzibilizálása valamint az NK1 receptor blokkoló SR140333 is csak az első három órában gátolták az ödémát. Egyik kezelés sem befolyásolta azonban a szövetbe kiáramlott neutrofil granulociták számát. A 2,5%-os kapszaicin jelentős ödémát váltott ki a C57BL/6 vad típusú állatokban, a TRPV1 receptor génhiányos csoportban azonban csak minimális

6

válasz volt megfigyelhető. A mustárolajjal kiváltott fülduzzadást az SR140333 mind a vad típusú, mind pedig a TRPV1 receptor génhiányos csoportban gátolni tudta. A mustárolaj többszöri alkalmazása 35%-os ödémát váltott ki a TRPV1 receptor knockout egerekben, míg a TRPV1 receptor hiánya nem befolyásolta a leukociták akkumulációját. Ezzel szemben az Sv129+C57BL/6 vad típusú állatokban 20%-os fülduzzadást figyeltünk meg, melyet az NK1 receptor hiánya jelentős mértékben csökkentett. A szövetbe kiáramlott neutrofil granulociták számában azonban nem volt különbség a két csoport között. Eredményeink alapján elmondható, hogy a mustárolaj neurogén és nemneurogén úton is képes gyulladást okozni egérfülben. A szenzoros neuronok aktivációját a TRPV1 receptor génhiányos állatokban is megfigyeltük mely igazolja, hogy a mustárolaj TRPV1 receptortól független úton vált ki neurogén gyulladást a bőrben.

A szenzoros neurogén komponens szerepe a késői típusú hiperszenzitív (DTH) reakcióban még kevéssé ismert. Ennek vizsgálatára állítottuk be az oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz (ACD) modellt egérfülben, melyben tisztázni kívántuk a TRPV1 receptor, a P-anyag receptora az NK1 receptor valamint az αCGRP szerepét. A farmakológiai eszközökkel kiegészített kísérletek lehetővé tették a fülduzzadás összehasonlító tanulmányozását, a leukocita akkumuláció, a szövettani változások és a helyi – szöveti – citokin profil (Th1/Th2) alakulását a késői típusú hiperszenzitív reakció elicitációs szakaszában. Az ACD során az oxazolon 65-80%-os fülduzzadást váltott ki 24-48 óra múlva mindhárom egértörzsben. A szenzoros neuropeptideket a kapszaicin ultra-potens analógjával, resiniferatoxinnal (RTX) depletáltuk, ennek hatására a gyulladás mértéke nőtt, valamint a TRPV1 receptor gén-hiányos állatokban is súlyosabb volt. Ezzel szemben az NK1 receptor hiánya, valamint az NK1 receptor antagonista SR140333-mal történő előkezelés csökkentette az ödéma mértékét, hasonlóan az αCGRP génhiányos

7

csoporthoz. Sem a szövettani, sem pedig a mieloperoxidáz enzimaktivitás mérésével kapott eredmények nem igazolták, hogy az alkalmazott előkezelések vagy a genetikai beavatkozások befolyásolták volna az akkumulálódott leukociták számát. Az ACD reakció során valamennyi mintában megnövekedett a tumor nekrózis faktor-alfa (TNFα) citokin koncentrációja 24-48 óra elmúltával, melyet az NK1 receptor és az αCGRP hiánya csökkentett, míg a TRPV1 receptor hiánya fokozott. Az interleukin-4 (IL-4) citokin szintje szintén igen jelentős mértékben emelkedett a 24 órás mintákban, melyet az RTX előkezelés szignifikánsan csökkentett. Összefoglalva elmondható, hogy a szenzoros neuronok modulátor hatása gyulladáskeltő és gyulladáscsökkentő módon is érvényesül az allergiás kontakt dermatitisz során egérben.

8

Summary Neurogenic components have been suggested to play a pivotal role in a range of inflammatory/immune diseases. The skin is densely innervated by sensory nerve fibers which release pro-inflammatory neuropeptides, e.g., tachykinins such as substance P (SP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) or anti-inflammatory peptide mediators, e.g., somatostatin and galanin. These peptides play modulatory role on cutaneous inflammation. Capsaicin, the active ingredient of hot peppers selectively excites and in high dose desensitizes a major subpopulation of nociceptive sensory nerve fibers which contain the above mentioned sensory neuropeptides, and these are classified as „capsaicin-sensitive afferents”. Capsaicin acts on sensory nerves via transient receptor potential vanilloid-1 receptor (TRPV1) and the released tachykinins increase vascular permeability throught neurokinin-1 (NK1) receptors. Mustard oil (allyl-isothiocyanate) has been used in studies of inflammation to mediate neurogenic vasodilatation and oedema in rodent skin. The aim of the present study was to analyze mustard oil-induced oedema and neutrophil accumulation in the mouse ear focusing on the roles of neurokinin 1 (NK1) and vanilloid TRPV1 receptors using wild type (BALB/c, C57BL/6) as well as NK1 and TRPV1 receptor knockout mice. A single or double treatment with 1% mustard oil on the BALB/c mouse ear induced oedema with responses diminished by 6 h. However a 25-30% increase in ear thickness was maintained by the hourly reapplied mustard oil. Desensitization of sensory nerves with capsaicin pretreatment, as well as administration of the NK1 receptor antagonist SR140333 inhibited oedema, but only in the first 3 hours. Neutrophil accumulation in response to mustard oil was diminished neither by SR140333 nor capsaicin pretreatment. Capsaicin solution (2.5%) induced a large oedema in C57BL/6 wild-type mice, but only minimal swelling in TRPV1 receptor knockout group. By comparison, mustard oil-generated ear swelling was inhibited by SR140333 both in wild-type and TRPV1 knockout mice. Repeated administration of mustard oil maintained 35% oedema in TRPV1 knockout animals and the lack of

9

TRPV1 receptors did not alter the leukocyte accumulation. In contrast repeated treatment caused about 20% ear oedema in Sv129+C57BL/6 wild-type mice but the absence

of

NK1

receptors

significantly

decreased

the

response.

Neutrophil

accumulation showed similar values in all groups. This study has revealed that mustard oil acts via both neurogenic and nonneurogenic mechanisms to mediate inflammation in the mouse ear. Importantly, the activation of sensory nerves was also observed in TRPV1 knockout mice indicating that the neurogenic inflammatory component occurs via a TRPV1 receptor-independent process.

The contribution of the sensory neurogenic component in delayed-type hypersensitivity (DTH) responses is poorly understood. We have used a murine ear oxazolone-induced allergic contact dermatitis (ACD) model to examine responses in mice lacking either the TRPV1 receptor, the substance P NK1 receptor, or the αCGRP. The

experiments,

supported

by

pharmacological

studies,

have

enabled

a

comprehensive study of ear swelling, leukocyte accumulation, histopathological changes and the local cytokine profiles (Th1/Th2) during the elicitation phase of the DTH response. Oxazolone induced 65-80% increase of ear thickness after 24-48 h in all the three strains of mice used. Ear swelling was enhanced after depletion of sensory neuropeptides by ultra-potent capsaicin analogue, resiniferatoxin (RTX) pretreatment, and in TRPV1 receptor knockout animals. However, ear swelling was attenuated in NK1 receptor knockout mice, after pretreatment with SR140333, or in mice deleted of αCGRP. Leukocyte accumulation, measured either with histology or myeloperoxidase activity

was

not

significantly

affected

by

the

pharmacological

and

genetic

manipulations. TNF-alpha levels were significantly increased in all the ACD test ears at 24-48 h and decreased in NK1 receptor and αCGRP knockouts but enhanced in TRPV1

10

knockouts. In addition, a prominent increase of IL-4 was detected after 24 h in some strains, which was inhibited by RTX pretreatment. Taken together, the results from this detailed study revealed that sensory neurons may influence murine contact hypersensitivity reactions via pro-, as well as anti-inflammatory mechanisms.

11

Bevezetés Napjainkban a környezetünkben felhalmozódott szennyezőanyagok (pl. a vizek, a levegő és a talaj kémiai szennyezettsége) fokozott terhelést jelentenek a szervezetünkre, így az immunrendszerre is. Az immunrendszer egyensúlyának felborulása pedig számos patológiai folyamatot indít el a szervezetben, mint az autoimmun betegségek, az asztma, az allergiás reakciók. A bőrben (mely a külvilággal közvetlenül érintkező szerv) jelentkező immun- és gyulladásos betegségek: az allergiás kontakt dermatitisz, ekcéma, pszoriázis stb. egyre gyakrabban és súlyosabb formában fordulnak elő a fejlett országokban. A bőrbetegségek több szempontból is figyelmet érdemelnek. Az érintett személyre nézve nemcsak életminőséget befolyásoló tényezők, hanem komoly pszichés jellegű megterhelést is jelentenek. Ezen túlmenően a foglalkozási betegségek nagy részét az ekcéma/dermatitisz csoport teszi ki. E

betegségek

hátterében

meghúzódó

gyulladásos

folyamatokat

három

szakaszra oszthatjuk: az akut szakaszban létrejövő helyi értágulat és érpermeabilitás fokozódás

előkészíti

a

szubakut

fázisban

megfigyelhető

sejtbeáramlást,

a

fehérvérsejtek és fagocitáló sejtek felhalmozódását az érintett területen. A krónikus, proliferatív szakaszban szöveti degeneráció és fibrózis kialakulása figyelhető meg. A gyulladásos folyamat beindításában a legkülönfélébb exogén vagy endogén ingerek vehetnek részt. Az inger következtében felszabaduló mediátorok – hisztamin, bradikinin, szerotonin – hatását számos más folyamat is erősíti, így a sejtek lipid membránjából származó arachidonsavból oxidáció útján, több lépésben keletkező prosztaglandinok (PGE2, PGD2 stb.) és leukotriének (5-HPETE, LTB4, LTC4 stb.). Ezek a rövid életidejű, lokális hormonnak is nevezett anyagok részt vesznek a fájdalom és a láz közvetítésében, fokozzák az erek permeabilitását, így elősegítik az ödéma kialakulását, valamint kemotaktikus hatással is bírnak. Nem elhanyagolható továbbá a komplementrendszer elemeinek szerepe sem a gyulladás fokozásában.

12

Az utóbbi évek kutatásai igazolták, hogy a bőrben található szenzoros neuronokból lokálisan felszabaduló neuropeptidek kiemelkedően fontosak a gyulladás patomechanizmusában (1,2).

Neurogén gyulladás A neuropeptideket a bőrben található kis átmérőjű, mielinhüvely nélküli afferens neuronok ún. C polimodális nociceptorok (a bőrben található C rostok kb. 70%-a) valamint vékony, mielinhüvellyel borított Aδ rostokkal rendelkező neuronok termelik (3). A Capsicum növénycsaládba tartozó paprikafélékben található csípős anyag, a kapszaicin szelektíven izgatja, valamint nagy dózisban deszenzitizálja e fájdalomérző (nociceptív) idegsejtek egy csoportját, melyet ez alapján „kapszaicinérzékeny afferens neuronok”-nak hívunk (2). (A bőrben található idegrostok több mint 50%-a

kapszaicin-érzékeny.)

A

kapszaicin-érzékeny

idegrostok

perifériás

végződéseiből inger hatására felszabaduló gyulladáskeltő neuropeptidek (tachykininek, és kalcitonin gén-rokon peptid - CGRP) vazodilatációt és plazma protein kiáramlást okoznak, ezzel hozzájárulva az ödéma kialakulásához (1). Ezek a lokális változások a legfőbb jellemzői a neurogén gyulladásnak. Az

érzőneuronokban

számos

más

biológiailag

aktív,

gyulladáscsökkentő

neuropeptid is megtalálható, mint az opioid peptidek, a galanin, a szomatosztatin, és a VIP (1).

A mustárolaj A gyulladáskeltő neuropeptideket a kapszaicin mellett a mustárolaj (allylisothiocyanate) is képes felszabadítani. Mindkét vegyület a rágcsálók bőrére kenve neurogén értágulatot (vazodilatációt) és ödémát vált ki (4,5). A mustárolajat először a Brassica nemzetségbe tartozó növények (pl. B. nigra, B. juncea) csípős kivonatában azonosították.

13

A kapszaicin és a TRPV1 receptor A kapszaicin (8-metil-N-vanillil-6-nonenamid) a paprika csípős anyaga melynek erős, szelektív fájdalomkeltő és deszenzitizáló hatását először Hőgyes Endre írta le 1878-ban.

1. ábra. A kapszaicin molekuláris szerkezete A későbbiekben Szolcsányi János és Jancsó-Gábor Aranka feltételezték a „kapszaicin receptor” létezését az alábbi megfigyeléseik alapján (6,7): 1.

Kapszaicinnel kiváltott nociceptív elhárító reflex számos nem-emlős fajon nem figyelhető meg (pl. béka, csirke, galamb).

2.

A

nagy

szelektív:

dózisú a

kapszaicinnel

csípős,

irritáló

kiváltott

érzetkiesés

fájdalomérzet

nagymértékben

kapszaicinnel,

piperinnel,

zingeronnal vagy mustárolajjal sem váltható ki, ugyanakkor a fájdalmas hőküszöb megnövekszik. Másrészről az ízérzékelés, a hidegérzet, a mentollal kiváltott hidegérzet és a tapintásérzékelés nem változik meg. 3.

A szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatok kimutatták, hogy a kapszaicin szerkezetének

kismértékű

változtatása

is

befolyásolja

annak

hatékonyságát. 4.

A kapszaicin érzékeny primer afferens neuronok csoportját a patkányokon alkalmazott nagy dózisú szisztémás kapszaicin-előkezelés hatására e neuronokon

bekövetkezett

ultrastruktúrális

változások

alapján

azonosították.

14

Caterina és munkatársai 1997-ben sikeresen klónozták a kapszaicin receptorát (8), amelyet először vanilloid 1 (VR1), majd később szerkezeti sajátosságai alapján tranziens receptor potenciál vanilloid 1, röviden TRPV1 receptornak neveztek el.

2. ábra. A TRPV1 receptor szerkezete. EC: extracelluláris tér, IC: intracelluláris tér, A: ankirin repeat domén. A savas oldalláncú aminosavak számozva: nyitott kör: glutamát, tele kör: aszpartát. A transzmembrán domének 1-6-ig számozva vannak. A patkány TRPV1 receptor 838 aminosavból álló fehérje, relatív tömege 95 kDa. Hat β lemezes szerkezetű transzmembrán domén építi fel, az 5. és 6. domén között található hidrofób hurok alkotja a csatorna régiót. A molekula C- és Nterminálisa is intracellulárisan helyezkedik el, az N-terminálison három ankirin repeat doménnel. Később a humán TRPV1 receptort is sikerült klónozni, mely 92%-os hasonlóságot mutat a patkányokban talált TRPV1 receptorral (9,10). A TRPV1 receptor volt az első felfedezett termoszenzitív receptor. Ismert, hogy a TRPV receptorcsalád tagjai leggyakrabban tetramér komplexet alkotnak a sejtmembránban. A TRPV1 receptor nagy mennyiségben található a hátsó gyöki, és a trigeminális ganglionokban, specifikusan a kis és közepes átmérőjű szenzoros neuronokon (8,11,12). Ez az előfordulási mintázat megfelel a mielinhüvely nélküli C- és vékony mielinhüvelyes Aδ rostok elhelyezkedésének (13). Bár a TRPV1 receptort más

15

szövetekben is leírták (az agy egyes részein, a bőr és a húgyhólyag epitheliális sejtjein stb.,14-19), de itt a receptor expressziója 30-szor kevesebb, mint a szenzoros ganglionokban (20). A kapszaicin – az alkalmazott dózistól függően – excitátoros, blokkoló vagy toxikus

hatást

okozhat

a

kapszaicin-érzékeny

neuronokban.

A

szenzoros

neuronblokkoló hatás a válaszkészség funkcionális károsodását jelenti nemcsak a kapszaicin receptor fehérjén, hanem akár az egész neuron területén is. Működését tekintve a TRPV1 receptor egy nem szelektív kationcsatorna, kapszaicin hatására a sejtbe áramló Na+ és Ca2+ ionok depolarizációt okoznak, így létrejön a nociceptív szignál,

valamint

a

neuron

perifériás

végződéseiből

szenzoros

neuropeptidek

szabadulnak fel. A csatorna hosszútávú nyitott állapota miatt megnő az intracelluláris Ca2+ szint, ami gátolja a feszültségfüggő Ca2+-csatornákat és mitokondriális duzzadást indukál, ezzel létrejön a szenzoros neuronblokkoló hatás. Ha tovább nő a nyitott állapotú csatornák száma és a nyitott állapot időtartama, létrejöhet a neurotoxikus hatás: a Ca2+ aktiválta proteázok a sejtek lízisét okozzák. (3. ábra)

3. ábra. A TRPV1 receptor működése. EC: extracelluláris tér, IC: intracelluláris tér; AEA: anandamid; NKA: neurokinin A; SST: szomatosztatin

16

TRPV1 receptor agonisták A kapszaicinen kívül más vanilloid származékok is képesek aktiválni a TRPV1 receptort, például a gyömbérből származó zingerone és a bors csípős anyaga, a piperin,

vagy

az

Euphorbia

resinifera-ból

származó

ultra-potens

agonista,

a

resiniferatoxin (RTX). Ezen kívül az 1-3%-os etanol (21), bizonyos redukáló gyökök (22) és néhány, növényekből származó telítetlen 1,4-dialdehid (pl. az isovelleral, 23) is képes direkten aktiválni vagy érzékenyíteni a receptort. De mi lehet a TRPV1 receptor endogén aktivátora? Egyes szerzők az endokannabinoidok csoportjába tartozó anandamidot (arachidonil-etanolamid, AEA) tartották a TRPV1 receptor endogén ligandjának. Zygmunt és munkacsoportja kimutatta, hogy az anandamid a kapszaicin-érzékeny idegrostokon keresztül relaxálja az erek simaizomsejtjeit. Továbbá az anandamid közvetlen alkalmazása a klónozott TRPV1 receptoron capsazepinnel (TRPV1 antagonista) gátolható akciós potenciálokat gerjeszt, mely bizonyítja, hogy képes aktiválni a TRPV1 receptort (24). Az anandamid hatásának megítélése azonban nem ilyen egyértelmű. Köztudott, hogy a szenzoros neuronok több mint 80%-án egyszerre van jelen a CB1 kannabinoid receptor és a TRPV1 receptor is (25). Az endogén kannabinoidok, így az anandamid is, antinociceptív hatással bírnak a különböző akut fájdalom-tesztekben, valamint igen hatásos anti-hiperalgéziás anyagnak bizonyultak a gyulladásos fájdalom modellekben, mint például a komplett Freud-adjuvánssal kiváltott arthritiszben. Az anandamid centrális és periférás hatását egyaránt a CB1 receptor aktivációján keresztül fejti ki: ez gátolja az adenil-cikláz enzimaktivitást valamint a feszültségfüggő Ca2+ csatornákat, így

a

neuron

depolarizációjával

történő

neurotranszmitter

felszabadulást

prejunkcionálisan gátolja (26). A protonok, melyek patofiziológiás körülmények között gyulladás vagy ischémia során szabadulnak fel képesek szenzitizálni, nagy mennyiségben pedig aktiválni a szenzoros neuront a TRPV1 receptoron keresztül. Gyulladásos szövetekben a lokális

17

pH 5 körüli értékre csökken, ekkor a receptor aktiválása hozzájárul a fájdalom kialakulásához. A bradikinin – az egyik legismertebb fájdalomkeltő mediátor a szervezetben – indirekt módon képes aktiválni a kapszaicin receptorát. A B2 bradikinin receptor szintén megtalálható a kapszaicin-érzékeny érzőideg rostokon, ingerlése foszfolipáz C aktivációt okoz, mely inozitol triszfoszfát (IP3) és diacilglicerol (DAG) termelést idéz elő. A DAG hatására protein kináz C kötődik a membránhoz és foszforilálja a TRPV1 receptort, mely így érzékenyebbé válik más (pl. hő vagy kémiai) ingerek iránt (27,28). Az arachidonsavból oxidációval létrejövő prosztaglandinok (PGE2, PGI2 stb.) is endogén ligandként szerepelhetnek krónikus gyulladások során (29). Így például a bradikinin hatására aktiválódó foszfolipáz A2 enzim arachidonsavat szabadít fel, majd ebből

a

12-lipoxigenáz

enzim

által

létrehozott

12-HPETE

(12-

hidroperoxieikozatetraénsav) belülről kötődik a TRPV1 receptorhoz, így aktiválva azt. Jelentős aktiváló hatással bír a magasabb hőmérséklet kb. 45 ºC-ig, a receptor szenzitizálása után azonban már az alacsonyabb hőfok is kiváltja az akciós potenciált. A fentiekből is kitűnik, hogy a TRPV1 receptor a legkülönfélébb környezeti ingereket képes integrálni.

Szenzoros proinflammációs neuropeptidek A tachykininek A kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronokból stimuláció hatására felszabaduló gyulladáskeltő neuropeptidek egyik csoportja a tachykininek: neurokinin A, neurokinin B és a P-anyag. Mindhárom peptid C-terminálisán a Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2 aminosav szekvencia található. G-fehérjéhez kapcsolt receptoraik a NK1, NK2 és NK3 receptor, melyekhez nem egyforma affinitással kötődnek. A tachykinin család legjelentősebb tagja a P-anyag, vagy Substance P (SP) a posztkapilláris venulák falain található neurokinin-1 (NK1) receptoron keresztül fejti ki érpermeabilitást fokozó hatását (30). NK1 receptor található még hízósejteken, polimorfonukleáris leukociták, makrofágok és

18

limfocita sejtek membránjában is (31). Így a P-anyagnak szerepe van a makrofágok és hízósejtek aktivációjában, a limfociták proliferációjában, a T-sejtek kemotaxisában és a B limfociták immunglobulin teremlésének fokozásában. A P-anyag fontos szerepet játszik a neutrofil granulociták akkumulációjában, melyet többek között patkány légutakban is vizsgáltak (32). Az eddig végzett kísérletek azt mutatják, hogy a Panyag in vivo a leukociták akkumulációját közvetett úton, a hízósejtek aktiválásával (33,34) és az azokból történő mediátor felszabadulással segíti elő (35,36).

A kalcitonin gén-rokon peptid A 37 aminosavból álló kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) egy több mint 90%os szerkezeti hasonlóságot mutató fehérjecsalád tagja (α és β formájuk is ismert). Biológiai hatásukat a CGRP1 és CGRP2 receptorokon fejtik ki, a legtöbb vaszkuláris hatás azonban a CGRP1 receptoron keresztül valósul meg. A CGRP hosszan tartó értágító hatását az érfalak símaizomsejtjein található CGRP1 receptorokon keresztül váltja ki, általában nitrogén-monoxidtól független úton. A CGRP az adenil-cikláz enzimaktivitását fokozza, ezzel megnövelve az intracelluláris cAMP szintet, mely a protein kináz A-t aktiválja, így nyitja az ATP-szenzitív K+ csatornákat, amely a simaizomsejtek relaxációjához vezet. CGRP1 receptor található továbbá T és B limfocitákon, valamint granulocitákon is.

Az elvégzett kísérletek tudományos háttere A mustárolajjal végzett kísérleteink alapját az az elképzelés adta, hogy a mustárolaj kis koncentrációban az érző idegrostok szelektív izgatása révén neurogén gyulladást okoz. Bár egyes szerzők adatai szerint a 20%-os mustárolaj oldat is tisztán neurogén gyulladást okozott, melyet patkány denervált talpbőrén nem lehetett kimutatni (37), az irodalomban azonban a legtöbb bizonyítékot a tisztán neurogén hatásra az 5% alatti koncentrációk alkalmazása esetén írták le, patkány láb bőrére ecsetelve. Elsőként Jancsó Miklós és munkatársai mutatták ki az 5%-os mustárolaj hatástalanságát patkány denervált bőrében, a saphenus ideg átvágása után (4). Tíz évvel később Jancsó Gábor és kollégái igazolták, hogy újszülött patkányokon végzett

19

kapszaicin előkezelés gátolta az 5%-os mustárolajjal kiváltott plazma protein extravazációt

a

bőrben

(38).

A

későbbiekben

szelektív

NK1

receptor

gátlók

használatával több cikkben is bizonyították, hogy a mustárolaj okozta neurogén ödéma NK1 receptoron keresztül jön létre (39-42). Ugyanakkor csak néhány adat található a mustárolaj által kiváltott gyulladásról egerekben (43,44), de ezek alapján feltételezhető, hogy a mustárolaj más úton váltja ki a neurogén gyulladást mint a kapszaicin. Inoue és kollégái egérfülön vizsgálták a 0,5-20%-os mustárolajjal kiváltott plazma extravazáció és ödéma mechanizmusát. Jelentős

különbséget

találtak

a

kapszaicinnel

illetve

a

mustárolajjal

kiváltott

stimulációban, mivel - a kapszaicinnel ellentétben - a mustárolaj ismételt alkalmazása sem okozott deszenzibilizációt. A gyulladásos folyamatot nem befolyásolta a hisztamin H1 és szerotonin 5-HT2 receptort blokkoló vegyületekkel illetve a kapszaicin receptor funkcionális gátlójával, a ruthenium vörössel történt előkezelés. Az NK1 receptor antagonista SR140333 gátolta az 5%-os mustárolajjal kiváltott gyulladást ami arra utal, hogy az így fellépő plazma extravazáció az NK1 receptor agonisták, elsősorban a P-anyag felszabadulása révén jön létre (43).

A kapszaicin-érzékeny idegrostokból való neuropeptid felszabadulás történhet TRPV1 receptor aktiváláson keresztül, vagy TRPV1 receptortól független úton is (45). Kapszaicint kenve a bőr felszínére az akut válasz során megfigyelhetőek a neurogén gyulladás jellemzői, vagyis a felszabaduló neuropeptidek hatására a vérkeringés fokozódik, ödéma alakul ki (31). Köztudott, hogy a neurogén komponensek számos gyulladásos kórkép (asztma, allergiás dermatitisz, pszoriázis, ekcéma, gyulladásos bélbetegségek) kialakulásában is szerepet játszanak. A különböző betegségek során endogén mediátorok útján aktiválódott TRPV1 receptor szerepe azonban még kevéssé ismert.

Rágcsálókon

végzett

resiniferatoxin

kis

dózisai

receptorokat,

nagyobb

kísérletekből

aktiválják

mennyiségben

a

tudjuk,

szenzoros alkalmazva

hogy

a

rostokon

kapszaicin található

depletálják

a

vagy TRPV1

szenzoros

20

neuropeptideket, és az idegvégződések deszenzitizációját okozzák. Ez a szenzoros neurogén komponens funkciójának szelektív blokkolásához vezet. A kontakt dermatitisz a környezetben jelen lévő irritánsok és allergének hatására kialakuló allergiás megbetegedés, ami bőrgyulladással és viszketéssel jár. Az a koncepció, hogy a C és Aδ rostokkal rendelkező szenzoros idegek modulálják az allergiás kontakt dermatitisz (ACD) lefolyását már felvetődött a szakirodalomban, azonban a pontos mechanizmus még ismeretlen (1). Az ACD szenzitizációs fázisában a haptén, vagyis egy kisméretű lipofil molekula penetrál a bőrbe, ahol fehérjéhez (legtöbbször albuminhoz) kapcsolódva válik komplett antigénné. Az antigént a bőr makrofág jellegű sejtjei, a Langerhans sejtek kebelezik be, és prezentálják a felszínükön. A Langerhans sejtek a lokális nyirokcsomókba vándorolnak, ahol megkezdődik az antigén-specifikus T sejtek érése (egereknél 7, emberben 14 nap szükséges a folyamathoz). A hapténnel történő újabb kontaktus során a specifikus Th sejtek aktiválódnak, megindul a késői hiperszenzitív reakció indukciós (effektor vagy elicitációs) fázisa, ami igen súlyos gyulladásos tünetekkel, ödémával, kipirulással, viszketéssel, sejtes akkumulációval, bőrléziókkal sőt nekrózissal jár. (4. ábra) A neuropeptidek megemelkedett szintjét mutatták ki az effektor fázisban, emberben 72, egérben 24-48 óra múlva (46).

21

4. ábra. A késői típusú hiperszenzitív reakció folyamatának vázlata a bőrben. Ag: antigén; APC: antigén prezentáló sejt, itt: Langerhans sejt;Th: T helper limfocita; Mo: monocita; Mφ: makrofág; KTC: keratinocita; IFNγ: interferon-gamma. (Gergely et. al. 2000. után)

22

Célkitűzések 1.

Munkánk során célul tűztük ki a mustárolaj kezelés hatására felszabaduló szenzoros neuropeptidek szerepének tisztázását az ödéma kialakulására és a leukociták akkumulációjára egérfülben.

2.

Célunk

volt

megvizsgálni

a

mustárolaj

egyszeri

és

ismételt

alkalmazásának hatását az akut vaszkuláris és krónikus (6 órás) sejtes gyulladásos fázisban is. 3.

Az általunk beállított gyulladásos modellben kívántuk meghatározni a TRPV1 és az NK1 receptorok szerepét. A kérdések megválaszolásához kapszaicinnel történt szisztémás deszenzibilizációt, szelektív NK1 receptor antagonistát valamint NK1 és TRPV1 receptor génhiányos egértörzseket is felhasználtunk.

4.

Az egérfülön oxazolonnal indukált allergiás kontakt dermatitisz modellben terveztük a TRPV1 receptor szerepének tisztázását receptor génhiányos egértörzs valamint szisztémás RTX előkezelés alkalmazásával.

5.

Elemezni kívántuk az ACD jelenségeit a tachykinin NK1 receptor- és αCGRP génhiányos állatokon, valamint szelektív receptor antagonisták használata után.

6.

Célunk

volt

megfigyelni

a

gyulladásos

jelenségeket

a

szövettani

változások és a lokális citokin szintek alakulásának nyomonkövetésével.

23

Anyag és módszer Felhasznált állatok Kísérleteinket magyarországi és brit laboratóriumokban végeztük, az érvényes állatvédelmi törvények betartásával. BALB/c (20-25g) és C57BL/6 (20-25g) egér törzseket használtunk. A transzgenikus TRPV1 receptor génhiányos egereket Dr. John B. Davis bocsátotta rendelkezésünkre (Neurology and GI Centre of Excellence for Drug Discovery, GlaxoSmithKline, Research and Development Ltd., U.K.). A vad típusú és NK1 receptor génhiányos Sv129+C57BL/6 egereket Dr. Norma Gerard (Perlmutter Laboratory Children`s Hospital Boston, USA) adományozta a londoni laboratóriumnak. Az αCGRP génhiányos egér tenyészpárt Dr. Anne Marie Salmon (Neurobiologie Moléculaire, Institut Pasteur, Párizs) küldte a londoni laboratóriumnak. Az állatok standard rágcsáló tápot és vizet kaptak ad libitum ellenőrzött klímájú körülmények között. Mindhárom génhiányos egértörzs normális növekedést és viselkedést mutatott.

Az ödéma mérése A fül vastagságát mikrométerrel mértük 0,1 mm pontossággal a kezelés előtt valamint a kezelést követően a megadott időpontokban. Az adatokat a fülvastagság %-os változásában adtuk meg a kontroll értékekhez viszonyítva.

1. kép. Egérfül vastagságának mérése mikrométerrel

24

Neutrofil granulocita akkumuláció mérése A lefagyasztott egérfül mintákat 0,5% hexadecyl-trimethylammonium-bromide (HTAB) detergenst tartalmazó foszfát pufferben homogenizáltuk (1 ml puffer/fül) standard körülmények között. Az így nyert homogenizátumot 10 percig centrifugáltuk 10,000g-n, 4

º

C-on, majd a felülúszót Eppendorf csőbe gyűjtöttük. A neutrofil

granulociták akkumulációjának mértékét a minták mieloperoxidáz enzim aktivitásából számoltuk,

melyet

standard

egér

leukocita

preparátumhoz

hasonlítottunk.

A

mieloperoxidáz aktivitást H2O2-3,3’5,5’-tetramethyl-benzidine (TMB/H2O2) reagenssel határoztuk meg 96-lyukú lemezen, szobahőmérsékleten. A minták optikai denzitását (OD) mikrolemez leolvasóban, 620 nm-en mértük, öt perces időközönként harminc percen keresztül (47).

Statisztika A kapott adatokat átlagoltuk, az átlagtól való standard eltérést (S.E.M) is feltüntettük. A kezelt és kezeletlen csoportok eredményeit ANOVA és azt követően Dunnett`s poszt-teszttel hasonlítottuk össze az ödéma esetén valamint kétmintás tpróbát használtunk a neutrofil granulocita akkumulációs vizsgálatok során nyert adatoknál. A valószínűségi értéket P < 0,05-nél tekintettük szignifikánsnak.

A. Mustárolajjal kiváltott gyulladás egérfülben Alkalmazott anyagok Az altatást ketaminnal (100 mg/kg i.p.) és xylazinnal (5 mg/kg i.m.) végeztük. Mindkét fül külső és belső oldalára is 10-10 μl 1%-os mustárolajat kentünk, melyet paraffinolajban oldottunk fel.

25

2. kép. Egérfül kenése paraffinolajjal

Ezt az eljárást 6 órán keresztül minden órában megismételtük. Egy másik kísérleti csoportban az állatok csak egyszer illetve kétszer kaptak kezelést, a 6 órás periódus első és második órájában. A kontroll csoport csak paraffin olajat kapott azonos mennyiségben és időben. A megfelelő csoportokban SR140333 (240 nmol/kg s.c.) előkezelést alkalmaztunk 15 perccel a mustárolaj bőrre kenése előtt, hogy gátoljuk az NK1 receptorokat (48). A kísérleti idő letelte után a fülből nyert mintákat szövettani vizsgálatokhoz készítettük elő, vagy -20

º

C -on tároltuk a neutrofil

granulocita akkumuláció vizsgálatához.

Szisztémás kapszaicin-előkezelés A

kapszaicin-érzékeny

idegrostok

szenzoros

neuropeptid

tartalmának

depletálására szisztémás kapszaicin előkezelést, deszenzitizációt alkalmaztunk. A kapszaicint etanolban (10%), Tween 80-ban (10%) és fiziológiás sóoldatban (80%) oldottuk fel. Az altatott állatoknak 30 mg/kg s.c. kapszaicint adtunk a nyakbőr alá három egymást követő napon. Így a kapott teljes dózis 90 mg/kg (49). Az előkezelés sikerességét egy csepp 0,1%-os kapszaicin oldat szembe cseppentésével ellenőriztük (ha nem váltott ki pislogást, az előkezelést sikeresnek tekintettük). Az állatokat 14 nappal a kapszaicin előkezelés után vittük kísérletbe.

26

Szövettani vizsgálatok A

szövetmintákat

4%-os

paraformaldehid

oldatban

fixáltuk.

Paraffinos

beágyazást követően 6 µm-es metszeteket készítettünk a fül alapjánál majd hematoxilin-eozinnal festést végeztünk. A gyulladás sejtes szakaszának vizsgálatához kloroacetát-észterázzal jelöltük a mieloid sejteket.

B. Oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz egérfülön Alkalmazott anyagok Az altatást ketaminnal (100 mg/kg i.p.) és xylazinnal (5 mg/kg i.m.), valamint (az

angliai

laboratóriumban)

2%-os

izofluránnal

végeztük,

amit

altatógéppel

adagoltunk. Az állatokat két egymást követő napon 2%-os oxazolonnal (50-50 μl) érzékenyítettük, melyet a leborotvált hasbőrre kentünk (szenzitizációs fázis).

3. kép. Érzékenyítés oxazolonnal a leborotvált hasbőrön Hat nap elteltével a bal fülre 96%-os etanolt (kontroll), a jobb fülre pedig 2%os oxazolon oldatot kentünk (15-15 μl oldat a fül külső és belső oldalára - elicitációs fázis). A megfelelő csoportokban a kezelés előtt 15 perccel 240 nmol/kg SR140333 NK1 receptor blokkolót adtunk s.c. a nyaki régióba, és ezt megismételtük az elicitációs szakaszban 24 és 48 óra múlva is. A kísérleti periódus végén az állatokat leöltük, a

27

fülszöveteket előkészítettük a szövettani vizsgálatokhoz, vagy –80 ˚C-on tároltuk további elemzésekhez.

Szisztémás resiniferatoxin-előkezelés A

kapszaicin-érzékeny

neuronokat

szisztémás

resiniferatoxin

(RTX)

előkezeléssel deszenzibilizáltuk. (Az RTX már kisebb dózisban is képes ugyanazt a neurotoxikus hatást kiváltani a kapszaicin-érzékeny afferensekben mint a kapszaicin, tapasztalataink szerint azonban az RTX-et az állatok akutan jobban tolerálták.) Az RTX-et kevés 96%-os etanollal vittük oldatba, majd fiziológiás sóoldattal higítottuk a kívánt koncentrációkra (3, 7, 10 μg/ml). Az altatott állatoknak 30, 70 és 100 μg/kg RTX-et adtunk három egymást követő napon, s.c. a nyaki régióba. Az előkezelés sikerességét egy csepp 0,1%-os kapszaicin oldat szembe cseppentésével ellenőriztük (ha nem váltott ki pislogást, az előkezelést sikeresnek tekintettük).

Szövettani vizsgálatok A fülszöveteket 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk. 6 μm-es metszeteket készítettünk a fül alapjánál és hematoxilin-eozinnal festettük. A gyulladás sejtes fázisának vizsgálatához kloroacetát-észteráz festést is végeztünk, mely

a

mieloid

sejtek

markere.

A

gyulladás

mértékének

összehasonlításához

pontoztuk az alábbi hisztopatológiai elváltozásokat: ödéma mértéke, a szőrtüszők nekrózisa után kialakuló mikroabcesszusok száma, a szövetben akkumulálódott mononukleáris és polimorfonukleáris sejtek száma. Az ödémát a metszetek szélessége alapján μm-ben mértük számítógépes program (AnalySIS) segítségével, az etanollal kezelt fülmetszetet tekintettük kontrollnak (0 pont). A mikroabcesszusok abszolút számát számoltuk egy metszetben és pontoztuk 0-5-ig. A szövetbe kiáramlott sejtek számát 200x-os nagyításnál metszetenként három látótérben számoltuk meg, a kapott értéket átlagoltuk és pontoztuk 0-5-ig (50).

28

Áramlási citometriai vizsgálatok – Mikrogyöngy technika Az allergiás kontakt dermatitisz (ACD) során bekövetkező citokin profilt érintő változásokat a BD Biosciences által forgalmazott Th1/Th2 egér CBA (cytometric bead array) kittel határoztuk meg (4. kép). A kit öt jól elkülönülő fluoreszcens intenzitással rendelkező gyöngypopuláció keverékét tartalmazza, melyekre IL-2, IL-4, IL-5, IFNγ és TNFα citokineket befogó antitesteket kapcsoltak, így lehetővé vált öt különböző citokin mérése egyetlen mintából. A mintákat 1 ml 1%-os phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF, Sigma-Aldrich, Budapest) tartalmú RPMI-1640 szövettenyésztő médiumban homogenizáltuk, majd centrifugálás után a felülúszóból 50 μl-t, további 50 μl befogó gyöngykeveréket, és 50 μl phycoerithrinnel (PE) jelölt detektáló antitest keveréket összekevertünk, és két órán keresztül inkubáltunk. A minták fluoreszcens intenzitását áramlási

citométerrel

(FACS

Calibur,

BD

Biosciences)

határoztuk

meg,

az

eredményeket CellQuest szoftverrel analizáltuk. A minták citokin tartalmát standard görbe felállítása után a SAT2 szoftver (Soft Flow, USA) segítségével állapítottuk meg.

4. kép. A mikrogyöngy technikán alapuló mérések vázlata. Ag: antigén, At: antitest

29

Eredmények A. Mustárolajjal kiváltott gyulladás egérfülben A./1 Mustárolajjal kiváltott gyulladás BALB/c egerekben Az 1%-os mustárolaj egyszeri kenése BALB/c egérfülre 15%-os fülvastagodást idézett elő, míg ismételt alkalmazása kifejezettebb, 30%-os választ okozott. Mindkét esetben az ödéma 6 óra múlva már nem volt megfigyelhető (5.a. ábra). Az egyszeri kenést követően a leukociták száma alig növekedett a fülszövetben 6 óra alatt, de az 1%-os mustárolajat kétszer alkalmazva szignifikánsan nőtt a minták mieloperoxidáz enzim aktivitást mutató sejttartalma a paraffin olajjal kezelt kontroll csoporthoz képest, és ezt a szisztémás kapszaicin előkezelés sem befolyásolta (5.b. ábra).

35

**

fülvastagság %-os változása

30

paraffinolaj mustárolaj (mo) 1x mustárolaj 2x

**

25

*

20

*

15 10 5 0 -5 0

1

2

3

4

5

6

Idő (óra) mo

mo

5.a. ábra. A fülvastagság %-os változása BALB/c egéren 1%-os mustárolaj egyszeri illetve ismételt alkalmazását követően. * p<0,05, ** p<0,01

30

*

1,4 1,2

Neutrofil / fül x 10

6

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

paraffinolaj

mustárolaj 1x

mustárolaj 2x

kapsz. desens.+ mustárolaj 2x

5.b. ábra. A fülszövetbe kiáramlott neutrofil granulociták száma BALB/c egéren, különböző kezeléseket követően. * p<0,05 Az óránként alkalmazott mustárolaj 25-30%-os fülduzzadást váltott ki, mely a hat órás kísérlet alatt sem csökkent (6.a. ábra). A szisztémás kapszaicin előkezelés a kísérlet első három órájában szignifikánsan csökkentette az ödémát, de a kísérlet második felében újra fokozódott a gyulladás mértéke. Az NK1 receptor blokkoló SR140333 alkalmazása szintén csak az első három órában csökkentette az ödémát, abban az esetben is, ha a második periódusban újra kezeltük vele az állatokat (6.a. ábra). A mustárolaj óránkénti alkalmazása jelentős neutrofil sejt kiáramlást okozott a fülszövetekben, de ezt a folyamatot sem az SR140333, sem a szisztémás kapszaicin előkezelés nem gátolta (6.b. ábra).

31

paraffinolaj mustárolaj (mo) SR140333+mo kapszaicin desens.+mo

40

fülvastagság %-os változása

35 30

*+

25 20

*

15

+

10 5

** ++

++

1

2

0 -5 0

mo SR140333 mo

mo

3

4

mo SR140333 mo

5

mo

6

Idő (óra)

mo

6.a. ábra. A fülvastagság %-os változása BALB/c egéren. * p<0,05, ** p<0,01

2,0 1,8

Neutrofil / fül x 10

6

1,6

**

** **

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

paraffinolaj mustárolaj 6x mustárolaj 6x kapsz. desens.+ + SR140333 mustárolaj 6x

6.b. ábra. A fülszövetbe kiáramlott neutrofil granulociták száma BALB/c egéren, különböző kezeléseket követően. ** p<0,01

32

A./2 Mustárolajjal kiváltott fülgyulladás TRPV1 receptor génhiányos egerekben A 2,5%-os kapszaicin oldat egyszeri alkalmazása nagymértékű ödémát váltott ki a C57BL/6 egerek vad egyedeiben, de csak minimálisat a TRPV1 receptor génhiányos egerekben (7.a. ábra).

etanol TRPV1 +/+ TRPV1 -/-

fülvastagság %-os változása

60 50 40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

Idő (óra)

kapszaicin 2,5%

7.a. ábra. A fülvastagság %-os változása 2,5%-os kapszaicin kezelést követően C57BL/6 egéren.

A mustárolaj viszont hasonló mértékű fülduzzadást váltott ki a knockout állatokban mint a vad C57BL/6 csoportban. A receptor génhiányos csoportban az ödéma azonban tovább megfigyelhető volt, de ez a válasz NK1 receptor blokkoló SR140333 hatására mindkét csoportban teljesen eltűnt (7.b. ábra).

33

paraffinolaj TRPV1 +/+ mustárolaj (mo) TRPV1 -/- mo TRPV1 +/+ mo+SR140333 TRPV1 -/- mo+SR140333

fülvastagság %-os változása

20

15

10

5

0

0

1

2

3

4

Idő (óra) mo

7.b. ábra. A fülvastagság %-os változása 1%-os mustárolaj kezelést követően C57BL/6 egéren.

A többször alkalmazott mustárolaj 30-40%-os fülduzzadást tartott fent a C57BL/6

egerekben.

Az

SR140333

előkezelés

hasonló

kinetikájú

választ

eredményezett mint a BALB/c egerek esetében, vagyis a kísérlet első három órájában szinte

teljesen

kivédte

a

duzzadást,

míg

a

második

periódusban

nem

volt

megfigyelhető hatása (8.a. ábra). A TRPV1 receptor hiánya nem befolyásolta a leukocita akkumuláció mértékét (8.b. ábra).

34

paraffinolaj TRPV1 -/- mustárolaj (mo) TRPV1 +/+ mo TRPV1 +/+ mo+SR140333 TRPV1 -/- mo+SR140333

fülvastagság %-os változása

50

40

30

+

20

10

**

** ++

** +

** ++

**

** ++

0

-10 0

mo SR140333

1

2

3

4

5

6

mo

mo

mo SR140333

mo

mo

mo

Idő (óra)

8.a. ábra. A fülvastagság %-os változása C57BL/6 egéren különböző kezelések hatására.* p<0,05, ** p<0,01

TRPV1

-/-

0,9

TRPV1 0,8

+/+

Neutrofil / fül x 10

6

0,7 0,6

TRPV1

TRPV1

0,5

+/+

-/-

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

paraffinolaj

mustárolaj

8.b. ábra. A neutrofil granulociták számának változása C57BL/6 egéren különböző kezelések hatására

35

A./3 Mustárolajjal kiváltott fülgyulladás NK1 receptor génhiányos egerekben Az 1%-os mustárolaj ismételt alkalmazása 20-25%-os ödémát okozott az Sv129+C57BL/6 vad típusú egerekben összehasonlítva az oldószerrel kezelt kontroll csoporttal ahol nem tapasztaltunk változást. Az NK1 receptor hiánya szignifikánsan csökkentette

a

mustárolajjal

kiváltott

háromszorosára

fülduzzadást,

ezzel

ödémában

emelkedett

a

igazolva

(9.a.

a

ábra).

szövetminták

P-anyag A

jelentős

kezelést

mieloperoxidáz

szerepét

követően enzim

a

majdnem

tartalma

a

paraffinolajjal kezelt kontroll csoportéhoz képest, de nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést az NK1 receptor génhiányos állatcsoport és a vad típusú egerek között. Ez alátámasztja a korábban kapott adatainkat, amikor az NK1 receptor antagonista SR140333 nem gátolta a mustárolajjal kiváltott leukocita akkumulációt a BALB/c törzsben (9.b. ábra).

40

NK1-/- mustárolaj (mo) NK1+/+ mustárolaj NK1-/- paraffinolaj NK1+/+ paraffinolaj

fülvastagság %-os változása

35 30 25 20 15 10

*

**

**

**

5 0 0

1

2

3

4

mo

mo

mo

mo

mo

Idő (óra)

9.a. ábra. A fülvastagság %-os változása Sv129+ C57BL/6 egéren különböző kezelések hatására.* p<0,05, ** p<0,01

36

NK1 +/+

*

1,4

***

6

1,2 Neutrofil / fül x 10

NK1 -/-

1,0 0,8 0,6

NK1 +/+

NK1 -/-

0,4 0,2 0,0

paraffinolaj

mustárolaj

9.b. ábra. A neutrofil granulociták számának változása Sv129+C57BL/6 egéren különböző kezelések hatására.* p<0,05, *** p<0,001

A./4 Szövettani eredmények A hematoxilin-eozinnal festett szövettani metszeteken jól megfigyelhető, hogy az 1%-os mustárolaj többszöri alkalmazása 20-30%-os fülvastagság növekedést okozott. A paraffinolajjal kezelt kontroll mintákhoz képest a mustárolaj fokozta a leukociták kiáramlását az érpályákból a szövetbe. A TRPV1 és az NK1 receptorok hiánya nem befolyásolta az akkumulálódott mieloid sejtek számát mustárolaj kezelést követően (10. ábra).

37

10. ábra. Mustárolajjal (1%) kiváltott fülgyulladás szövettani képe. (A) Paraffinolajjal kezelt kontroll fül BALB/c egérből. (B) Mustárolajjal kezelt és (C) kapszaicinnel előkezelt BALB/c egérfül. (D) Mustárolajjal kezelt C57BL/6 vad típusú (TRPV1 +/+) és (E) knockout (TRPV1-/-) egérfül (haematoxylin-eosin, 100x). (F) Mustárolajjal kezelt Sv129+C57BL/6 vad típusú (NK1 +/+) és (G) knockout (NK1-/-) egérfül (haematoxylin-eosin, 200x). Kloroacetát-észterázzal jelölt akkumulálódott mieloid sejtek BALB/c egérfülben. (H) Paraffinolajjal kezelt kontroll fül (200x). (I) Mustárolajjal kezelt fül (200x). (J) Mustárolajjal kezelt fül (600x).

38

B. Oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz egérfülön B./1 A TRPV1 receptor szerepe az oxazolonnal kiváltott ACD reakcióban Az oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz (ACD) reakcióban mért fülvastagságok

mind

a

három

vad

típusú

egértörzs

(BALB/c,

C57BL/6,

Sv129+C57BL/6) esetében hasonlóan alakultak (11. ábra). Jelentős fülduzzadás volt megfigyelhető az elicitációt követő 24 órában, amely még a következő 72 órában is fennmaradt.

fülvastagság %-os változása

140

etanol oxazolon

120

*

100

*

80

*

60 40 20 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Idő (óra)

11.a. ábra. A fülvastagság %-os változása BALB/c egéren.* p<0,05

140

etanol oxazolon

***

fülvastagság %-os változása

120

***

100

***

80 60 40 20 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Idő (óra)

11.b. ábra. A fülvastagság %-os változása C57BL/6 egéren.*** p<0,001

39

180

***

fülvastagság %-os változása

160

etanol oxazolon

***

140 120

**

100 80 60 40 20 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Idő (óra)

11.c. ábra. A fülvastagság %-os változása Sv129+C57BL/6 egéren. ** p<0,01, *** p<0,001 A TRPV1 receptor genetikai deléciója minden mérési időpontban 40-80%-kal növelte a fülduzzadás mértékét összehasonlítva a vad típusú csoport eredményeivel. Hasonló eredményre vezetett a kapszaicin-érzékeny idegrostok szenzoros neuropeptid tartalmának kémiai úton történő depléciója szisztémás resiniferatoxin előkezelés által. Ebben az esetben 50-70%-kal fokozódott a fülduzzadás oxazolon kezelés hatására (12.a. ábra).

40

%-os változás az oxazolonos kontrollhoz

110

TRPV1-/RTX előkezelés

+++

100 90 80

*

70

*

60

+++

50

**

40

+

30 20 10 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Idő (óra)

12.a. ábra. A fülvastagság %-os változása az oxazolonos kontrollhoz viszonyítva C57BL/6 egéren.* p<0,05, *** p<0,001 Méréseinket alkalmazását

a

szövettani

követően

48

vizsgálatok

órával

is

levett

alátámasztották. szövetmintákban

Az

oxazolon

szignifikánsan

megnövekedett a mieloperoxidáz enzim aktivitása, mely a polimorfonukleáris és egyéb mieloid sejtek felszaporodására utal (12.b. ábra).

10

BALB/c

n=5-6 etanol

Neutrofil szám / fül x 10

6

9 8 7

oxazolon

C57BL/6 C57BL/6

6

Sv129+ C57BL/6

5 4 3 2 1 0

RTX TRPV1 TRPV1 CGRP CGRP +/+ -/-/+/+ RTX

NK1 NK1 +/+ -/-

12.b. ábra. A neutrofil granulociták számának változása a vizsgált egértörzsekben

41

Ezt az eredményt a szövettani metszetek szintén igazolták. Az oxazolonnal indukált sejtes gyulladást azonban sem az RTX előkezelés, sem a TRPV1-, illetve az NK1 receptor gén hiánya, sem az αCGRP hiánya nem csökkentette szignifikánsan a kontrollhoz viszonyítva (I. táblázat, valamint 13. ábra).

I. táblázat. Oxazolonnal kiváltott ACD szövettani kiértékelése egérfül metszeteken Kezelés

Egértörzs

Ödéma (μm)

etanol

BALB/c C57BL/6 Sv129/ C57BL/6 BALB/c TRPV1+/+ TRPV1+/+ RTX elők. TRPV1-/CGRP+/+ CGRP-/NK1+/+ NK1-/-

241.0±47.9 256.2±21.3 259.3±12.4

0 0 0

0 0 0

431.6±41.5 487.8±19.8 680.6±42.9

3 3 5

671.2±8.7 485.3±16.2 425.5±12.2 637.1±26.0 305.7±45.3

5 3 3 5 1

oxazolon

Ödéma érték

MA szám

MA érték

Összetett pontérték

0 0 0

Sejt akkumuláció érték 0 0 0

14±2.6 34.7±5.6 42.0±3.6

1 3 4

3 4 5

5 10 14

56±2.3 35.8±3.1 38.6±4.3 12.3±3.7 14.5±3.1

5 3 3 1 1

5 4 4 3 3

15 10 10 9 5

0 0 0

A közölt adatok a fülvastagság szoftveres mérésén és – az egyéb szövettani elváltozások esetében - szemikvantitatív méréseken alapulnak a következők szerint: az ödémát a fülmetszet vastagságának lemérésével (µm-ben) állapítottuk meg, átlagolva±SEM, n=5, majd pontoztuk 0-5-ig az etanollal kezelt kontroll metszetekhez viszonyítva (mely 0 ponttal szerepel). A mikroabcesszusok (MA: a szőrtüszők, faggyúmirigyek és környékük gyulladása) számát a teljes fülmetszeten számoltuk, 0-5-ig pontoztuk (n=5). A sejtes beáramlást 200x nagyításnál látómezőnként számoltuk, metszetenként három látómezőben, n=5, majd pontoztuk 0-5-ig. Megadtuk az egyes kísérleti csoportok összetett pontértékét is.

42

13. ábra. Oxazolonnal kiváltott fülgyulladás szövettani képe (a) etanollal kezelt kontroll, és (b) oxazolonnal kezelt BALB/c egérfülben. (c) Oxazolonnal kezelt C57BL/6 vad típusú (TRPV1+/+) és (d) TRPV1 receptor knockout egérfül. (e) Oxazolonnal kezelt Sv129+C57BL/6 vad típusú (NK1+/+) és (f) NK1 receptor knockout egérfül (100x). Az akkumulálódott mieloid sejtek jelölésére kloroacetát-észteráz festést alkalmaztunk.

43

B./2 A Th1/Th2 citokin profil változása oxazolonnal kiváltott ACD reakcióban Az

oxazolon

alkalmazását

követő

24

és

48

órában

levett

mintákból

mikrogyöngy módszerrel meghatároztuk a Th1 sejtes válaszra jellemző

IL-2,

interferon-gamma (IFNγ) és TNFα valamint a Th2 vonal aktiválásakor megjelenő IL-4 és IL-5 citokinek mennyiségét. Az így kapott eredmények meglepő képet mutatnak. Az IL-2 szintje alacsony maradt, míg a TNFα citokin mennyisége szignifikánsan megemelkedett, amely a TRPV1 receptor génhiányos csoportban jól korrelált a gyulladás

során

tapasztalt

növekedéssel.

Az

IL-4

koncentrációja

szintén

megnövekedett különösen a 24 órás BALB/c csoport mintáiban. Érdekes módon az RTX előkezelés hatására a citokinek koncentrációja minden csoportban alacsonyabb volt (14. ábra).

TRPV1+/+ és TRPV1-/- egértörzs 24 órás minta

TRPV1+/+ és TRPV1-/- egértörzs 48 órás minta 500

TRPV+/+ TRPV+/+ + RTX TRPV1-/-

400

300

*

200

*

*

100

Koncentráció (pg/fül)

Koncentráció (pg/fül)

500

300

200

100

IL-5

IL-4

IFNγ

0

TNFα

IL-2

TNFα

500

BALB/c BALB/c+RTX 400

*

300

*

200

300

200

0

IL-2

IL-4

IL-5

IFNγ

BALB/c BALB/c+RTX

400

*

100

*

100

Koncentráció (pg(fül)

500

Koncentráció (pg/fül)

IFNγ

IL-5

IL-4

BALB/c egértörzs 48 órás minta

BALB/c egértörzs 24 órás minta

0

*

*

0

IL-2

TRPV1+/+ TRPV1+/+ + RTX TRPV1 -/-

400

TNFα

IL-2

IL-4

* IL-5

* IFNγ

TNFα

14. ábra. A citokin profil változása C57BL/6 és BALB/c egértörzsekben. * p<0,05

44

B./3 A P-anyag és az αCGRP szerepe az oxazolonnal kiváltott ACD reakcióban A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a TRPV1 receptor hiányának gyulladáskeltő hatása magyarázható-e a jelentősebb vazoaktív neuropeptidek (P-anyag, CGRP) hatásainak

kiesésével.

A

P-anyag

receptorát,

az

NK1

receptort

SR140333

antagonistával gátoltuk. Az így mért fülduzzadás eredmények megközelítőleg 40%-os csökkenést

mutattak,

igazolva

a

P-anyag

jelentős

szerepét

a

folyamat

szabályozásában (15.a. ábra). Az NK1 receptor gén hiánya szintén csökkentette az ödémaképződést a vad típusú kontroll csoporthoz képest, azonban kevésbé gátolta a reakciót mint azt az SR140333 antagonistával kezelt BALB/c csoportban tapasztaltuk. Az

αCGRP

gén

hiánya

is

mérsékelte

az

oxazolon

kezelést

követő

ödémát

összehasonlítva a vad típusú C57BL/6 csoport eredményeivel, de a 24 óra múlva kialakult 40%-os gátlás csak körülbelül 25%-osra mérséklődött 48 és 72 óra elteltével (15.b. ábra).

%-os változás az oxazolonos kontrollhoz

Idő (óra) 0

10

20

30

40

50

60

70

80

0

-10

-20

-30

**

*

-40

-50

-60

** *

SR140333 NK1 -/-

15.a. ábra. A fülvastagság %-os változása az oxazolonos kontrollhoz viszonyítva Sv129+C57BL/6 egéren.* p<0,05, ** p<0,01

45

%-os változás az oxazolonos kontrollhoz

Idő (óra) 0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10

-20

***

-30

*

-40

-50

αCGRP -/-

***

-60

15.b. ábra. A fülvastagság %-os változása az oxazolonos kontrollhoz viszonyítva C57BL/6 egéren.* p<0,05, *** p<0,001

A kontrollhoz viszonyítva sem az NK1 receptor sem az αCGRP hiánya nem okozott csökkenést a 48 órás minták mieloperoxidáz enzim aktivitásában (12.b. ábra). A citokin vizsgálatok eredményei szerint 48 óra elteltével az NK1 receptor és az αCGRP hiánya is csökkentette a TNFα koncentrációját (16. ábra).

46

NK1+/+ és NK1-/- egértörzs 48 órás minta

NK1+/+ és NK1-/- egértörzs 24 órás minta

Koncentráció (pg/fül)

Koncentráció (pg/fül)

NK1 +/+ NK1 -/-

400

300

200

400

*

300

200

100

100

0

NK1 +/+ NK1 -/-

500

500

*

0

IL-2

IL-4

IL-5

IFNγ

IL-2

TNFα

Koncentráció (pg/fül)

Koncentráció (pg/fül)

300

200

IFNγ

500

CGRP +/+ CGRP -/-

400

IL-5

TNFα

CGRP+/+ és CGRP-/- egértörzs 48 órás minta

CGRP+/+ és CGRP-/- egértörzs 24 órás minta 500

IL-4

CGRP +/+ CGRP -/-

400

300

200

* 100

100

0

0

IL-2

IL-4

IL-5

IFNγ

TNFα

IL-2

IL-4

IL-5

IFNγ

TNFα

16. ábra. A citokin profil változása Sv129+C57BL/6 és C57BL/6 egértörzsekben. * p<0,05

47

Megbeszélés, következtetések A. Mustárolajjal kiváltott gyulladás egérfülben Kísérleteink igazolták, hogy a mustárolaj neurogén és nem neurogén módon képes gyulladást indukálni egérfülön. A mustárolaj egyszeri vagy ismételt alkalmazása is kiváltotta az ödémát, mely a korai szakaszban (0-3 óra) neurogén folyamatok során jött létre. Meglepő módon a szenzoros idegvégződések aktivációja a TRPV1 receptor génhiányos egerekben is létrejött, ebből következik, hogy az aktiváció TRPV1 receptoroktól független mechanizmusokon keresztül is megtörténik. Kísérleteinkből kiderült továbbá, hogy a mustárolaj ismételt alkalmazását követő 3-6 óra múlva a gyulladásos folyamatokat már főleg a neurogén komponensektől független mediátorok uralják, melyek nemcsak fenntartják az ödémát hanem fokozzák a neutrofil sejtek akkumulációját is, mellyel megindul a gyulladás sejtes fázisa. Eredményeink szerint az 1%-os mustárolaj egyszeri alkalmazása átmeneti vaszkuláris gyulladást hoz létre (15%-os fülduzzadás) BALB/c egéren, mely 6 órán belül fokozatosan és teljesen eltűnik. Ez az egyszeri stimulus nem okoz mérhető leukocita akkumulációt a fülszövetben mely azt jelenti, hogy az átmeneti érpályát érintő

változásokat

nem

követi

sejtes

válasz.

Ha

azonban

egy

óra

múlva

megismételtük a mustárolajos kenést szignifikáns neutrofil beáramlást tapasztaltunk, mely a szisztémás kapszaicin-előkezelés hatására sem csökkent. Ez azt bizonyítja, hogy az 1%-os mustárolaj ismételt dózisban képes olyan kemotaktikus utakat aktiválni, melyek függetlenek a neurogén komponensektől. A hat órán keresztül óránként

megismételt

mustárolajos

kenés

25-30%-os

folyamatos

fülvastagság

növekedést eredményezett. Bár korábbi munkákban feltételezték, hogy a mustárolaj (5-20%-os

koncentrációban)

kizárólag

neurogén

módon

hoz

létre

gyulladást

egerekben (43) és patkányokban (37), jelen adataink következetesen alátámasztják, hogy a 6 órás kísérleti periódus első 3 órájában neurogén, míg a második felében már nem kizárólag neurogén mechanizmusok indukálják és tartják fent a gyulladást. Ezt az

48

eredményt megerősítik a kapszaicin-előkezeléssel és az NK1 receptor antagonistával végzett kísérleteink is. A kapszaicin-előkezelés során a kapszacin-érzékeny szenzoros idegvégződések neuropeptid tartalma depletálódik, és ez képes kivédeni a korai szakaszban a fülduzzadást. A 3-6 órás periódusban a kapszaicin előkezelésnek már nincs gátló hatása a gyulladásos folyamatokra, hasonlóan az NK1 receptor antagonista SR140333 előkezeléshez. A mustárolaj ismételt alkalmazásával háromszoros mieloperoxidáz enzim aktivitást tapasztaltunk a fülszövetből vett mintákban. Ez jelentős mértékű neutrofil granulocita

akkumulációra

utal,

melyet

a

szövettani

metszetek

vizsgálata

is

alátámasztott. Mivel a fokozott sejtkiáramlást sem a szisztémás kapszaicin-előkezelés, sem az NK1 receptor antagonista SR140333 előkezelés nem befolyásolta, így a szenzoros neuropeptidek szerepét kizárhatjuk ebben a folyamatban. Jelen munkánk célja egy olyan kísérleti modell kifejlesztése volt, mely alkalmas a neurogén gyulladás sejtes fázisának vizsgálatára. Korábbi kísérleteinkhez hasonlóan (48,51) most sem találtunk bizonyítékot arra, hogy a szenzoros idegvégződések stimulációjával indukált endogén neuropeptidek felszabadulása neutrofil granulocita beáramlást idézne elő a bőrben. A kapszaicinnel kiváltott fülduzzadás nem jelenik meg TRPV1 receptor génhiányos egerekben, de a mustárolaj kezelést követően kialakuló fülödémát nem befolyásolja a TRPV1 receptor hiánya. TRPV1 receptor génhiányos egereken végzett kísérleteink alapján feltételezzük, hogy a mustárolaj hat a kapszaicin-érzékeny idegrostokon, de a TRPV1 receptortól független úton aktiválja az idegvégződést. Az a tény, hogy az NK1 receptor antagonista SR140333 gátolja a korai ödémát mind a C57BL/6 vad típusú, mind a TRPV1 receptor génhiányos egerekben igazolja, hogy a mustárolaj okozta gyulladás neurogén szakasza NK1 receptorokon keresztül mediált. A TRPV1-, és NK1 receptorok szerepe a kontakt dermatitisz során kialakuló neutrofil akkumuláció során nem bizonyított.

49

B. Oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitisz egérfülön Eredményeink alátámasztották azt a feltevést, hogy a TRPV1 receptor jelentős módosító szereppel bír a kontakt dermatitisz során. A TRPV1 receptorok genetikai hiánya, vagy a szenzoros neuropeptidek depléciója szisztémás RTX előkezeléssel fokozta az oxazolonnal kiváltott gyulladást, mely egybevág azzal az elképzeléssel, hogy az érzőideg rostok aktivációja a TRPV1 receptoron keresztül patofiziológiás körülmények között gyulladáscsökkentő hatású. Ezt szintén igazolja az allergiás kontakt dermatitiszben a TRPV1 knockout egerekben mért magas TNFα szint is. Összehasonlítva a sejtakkumulációval, akár a szövettani adatok, akár a mieloid sejtek mieloperoxidáz enzim aktivitása alapján megállapítható, hogy a folyamat során bekövetkező sejtkiáramlásra nincs hatása a TRPV1 receptor kiesésének. Néhány korábbi

publikációban

bizonyítást

nyert,

hogy

a

szisztémás

kapszaicin-

előkezelés/deszenzitizálás fokozza az ödémát ACD reakció során (49,52-54), és az általunk kapott eredmények is ezt igazolják. A gyulladás súlyosbodása ACD során azt feltételezi, hogy a TRPV1 receptort is expresszáló kapszaicin-érzékeny neuronokból felszabaduló mediátorok eredő hatása az, hogy gátolják a dermatitisz kifejlődését. Az irodalom meglehetősen következetes a P-anyag szerepének megítélésében (55-57). Kísérleteink során az NK1 receptorok genetikai hiánya és az antagonista SR140333 használata is megerősítette, hogy a P-anyag gyulladáskeltő hatású. A

CGRP

vizsgálata

során

egyesek

gyulladáskeltő

(55,58),

míg

mások

gyulladáscsökkentő (59) hatását írták le az allergiás kontakt dermatitiszben. Az in vitro kísérletek többségében a CGRP és az immunsejtek kapcsolatát vizsgálták és arra a következtetésre jutottak, hogy a CGRP elősegíti a gyulladás sejtes fázisát (31,60). Néhány adat arra enged következtetni, hogy a szenzoros rostokból felszabaduló endogén CGRP in vivo gyulladáscsökkentő hatású. Az αCGRP génhiányos egerekkel végzett

kísérleteink

megerősítik

a

CGRP

proinflammációs

hatását

az

ACD

folyamatában. Ha tehát a P-anyag és a CGRP hatása is fokozza a gyulladást, hogyan

50

magyarázható az ACD látható súlyosbodása RTX előkezelést követően, vagy a TRPV1 receptor génhiányos állatokban? Laboratóriumunk korábbi vizsgálataiban bizonyítást nyert, hogy a folyamat során felszabaduló neuropeptideknek (pl. szomatosztatin) nemcsak lokális, hanem szisztémás gyulladáscsökkentő hatásuk is van (26,42), és számos más neuropeptidről is kiderült, hogy rendelkezik gyulladást gátló hatással, például a galanin (61), az opioid peptidek (62), a VIP (63-65) és a PACAP-38 (66) amely a felszabadult mennyiségtől függően vált ki lokális vagy szisztémás gyulladáscsökkentő hatást. A haptének által kiváltott késői típusú hiperszenzitív reakció T-sejt specifikus immunválaszt indít el a szervezetben. A kemotaktikus hatású T-helper limfociták aktiválják a mieloid sejtek akkumulációját (50), amit a mieloperoxidáz enzim aktivitás alapján kimutattunk a fülszövetben allergiás kontakt dermatitiszben. Korábban Goebeler és munkatársai publikálták (58), hogy a P-anyag és a CGRP topikális alkalmazása a bőrben fokozza a leukociták beszűrődését a kezelt területre, jelen munkánkban azonban nem sikerült egyértelmű bizonyítékot találni arra, hogy a felszabaduló endogén neuropeptidek befolyásolnák a leukocita akkumulációt az ACD során. Eredményeink

szerint

a

TNFα

a

kulcs-citokin

e

folyamatban,

melynek

mennyisége lokálisan megemelkedik allergiás kontakt dermatitiszben. Bár az IL-4 is növekedett volt, elsősorban a 24 órás mintákban, szerepe azonban a kontakt hiperszenzitív

reakciókban

ellentmondásos.

Egyes

szerzők

immunszuppresszív

hatásairól számolnak be (67,68), míg mások szerint induktor szerepet tölt be (69-71). Azt azonban mindenképpen kijelenthetjük, hogy a oxazolon indukálta ACD az egérfülben a várakozásokkal szemben nem tipikus Th1 típusú válasz, a Th2-es citokinek, elsősorban az IL-4 szerepe szintén kiemelt jelentőségű. Az a tény, hogy a TRPV1 receptort expresszáló neuronok RTX-szel történt deszenzibilizációja mind az IL4 mind a TNFα szintet csökkentette arra utal, hogy a neurogén komponensek hatással vannak a citokin termelésre. Magának a TRPV1 receptorfehérjének genetikai hiánya

51

növelte a TNFα szintet és az inflammációs tüneteket is. Az NK1 receptor knockout és az αCGRP hiányos egereknél, főleg a 48 órás mintavétel esetén szignifikánsan kisebb TNFα szintet mértünk a vad típusú kontrollokhoz képest, ami jól korrelál az enyhébb gyulladásos képpel. Legjelentősebb következtetésként elmondhatjuk, hogy a TRPV1 receptor akár genetikai akár kémiai depléciója súlyosbítja az oxazolon által indukált ACD tüneteit. Az idegvégződésekből felszabaduló P-anyag és CGRP proinflammációs hatásokat okoznak, tehát szükségszerű feltételeznünk, hogy a TRPV1 receptor izgatása során nemcsak ezek

a

proinflammációs

mediátorok,

hanem

gyulladásgátló

peptidek

(pl.

szomatosztatin) is felszabadulnak, melyek mint endogén gátló rendszer, enyhítik az allergiás

dermatitiszben

megvizsgáljuk,

hogy

a

létrejövő neurális

gyulladásos

szomatosztatin

tüneteket. szerepet

A

játszik-e

közeljövőben a

folyamat

modulációjában. Fontos célkitűzésünk, hogy újabb láncszemeket ismerjünk meg a szenzoros

neuropeptidek

és

gyulladásos

sejtek

közötti

kapcsolatban,

és

így

hozzájáruljunk az idegrendszer és az immunrendszer közötti kommunikáció minél pontosabb megismeréséhez.

52

Tudományos munkám értékelése a legfrissebb irodalmi adatok tükrében 1. A mustárolajjal kiváltott akut gyulladásos modellben kapott eredményeinket 2004-ben publikáltuk a Neuroscience című folyóiratban, amelyben elsőként bizonyítottuk funkcionális vizsgálatok alapján, hogy a mustárolaj nem a TRPV1 receptorokat aktiválja. Nem sokkal később Sven-Eric Jordt és munkatársai igazolták, hogy a mustárolaj (és más isothiocianát molekulák) az ANKTM1 (ankirin-like

transmembrane

protein-1)

receptoron

keresztül

izgatja

a

kapszaicinre is érzékeny idegrostokat (72). Az ANKTM1 receptor a tranziens receptor potenciál, vagyis a TRP receptorcsalád tagja, így e receptor/kation csatorna új elnevezése TRPA1. Szerkezete hasonlít a TRP ioncsatornákhoz, de N-terminális régiója különösen sok, 17 ankirin repeat domént tartalmaz. TRPA1 receptor található a belső fülben, ahol a szőrsejteken mechanoreceptorként funkcionál (73), valamint a hátsó gyöki és trigeminális ganglion sejteken. Itt olyan kis átmérőjű neuronokon jelenik meg, melyek TRPV1 receptort igen, de TRPM8 receptort nem expresszálnak (74-76). A TRPA1 receptort a természetben található csípős anyagok közül (a mustárolajon kívül) a fahéjban található cinnamaldehid, a metil szalicilát (a kúszó fajdbogyóból – Gaultheria procumbens), az eugenol (a szegfűszegből kivont vegyület), és az allicin, a fokhagyma csípős anyaga is aktiválja. Ezek a vegyületek a bőrön alkalmazva fájdalmas égő és szúró érzést váltanak ki, így elmondható, hogy a TRPA1 receptor is szerepet játszik bizonyos fájdalmas ingerek érzékelésében. Caterina és munkatársai 1997-ben elsőként írták le a TRPV1 receptor termoszenzitív tulajdonságát (8), mely intenzív kutatásokat indított el a hőérzékelés

molekuláris

szintű

feltárására.

A

későbbiekben

a

TRP

receptorcsalád újabb tagjáról, a TRPM8 receptorról bizonyosodott be, hogy a 23 °C alatti, nem fájdalmas hideg ingerre valamint a bőrön alkalmazott

53

mentolra és az icilinre érzékeny (77,78). A TRPA1 receptor hőérzékelésben betöltött

szerepe

ellentmondásos.

Story

és

munkatársai

különböző

sejttenyészeteken végzett kísérleteikkel bizonyították, hogy a TRPA1 receptor a fájdalmas, 17 °C alatti hideg ingerek továbbításában játszik szerepet (76,79). Bautista

és

munkatársai

azonban

TRPA1

receptor

génhiányos

egerek

használatával kimutatták, hogy a knockout állatok fájdalmas hideg érzékelése valamint a vesztibuláris és auditoros érzékelése sem tért el a vad típusú állatokétól. Ugyanakkor a TRPA1 génhiányos egerekben a mustárolaj okozta ödéma illetve a bradykininnel kiváltott termális hiperalgézia nagy mértékben csökkent (80). Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a TRPA1 a fájdalom kialakulásában egy olyan ioncsatorna, melyet számos különböző inger képes aktiválni (81).

2. Az utóbbi öt évben a TRPV1 receptorok szerepét számos fájdalom- és gyulladásos modellben vizsgálták. Bár több közleményben leírták a TRPV1 receptorok pronociceptív és proinflammátoros szerepét az akut fájdalom és gyulladás mediációjában (82,83) de a krónikus gyulladásos és fájdalom tesztekben a receptor funkciója ellentmondásos (82,84) A TRPV1 knockout egereken végzett kísérletekből kiderült, hogy a receptor genetikai hiánya csökkenti az experimentális artritisz tüneteit (29,85,86). 2005-ben elsőként írtuk le a TRPV1 receptor protektív hatását az oxazolonnal kiváltott allergiás kontakt dermatitiszben (87). Ezt követően más modellekben is bizonyítást nyert, hogy a TRPV1 receptor gén hiánya nem csökkenti, hanem súlyosbítja a tüneteket.

Massa

és

munkatársai

2006-ban

írták

le

a

dinitrobenzén-

szulfonsavval kiváltott colitis-ben (88), valamint ezt az eredményt igazolták lipopoliszachariddal indukált légúti gyulladás és hiperreaktivitás során is intézetünk munkatársai (Elekes és munkatársai, közlésre elkülött kézirat).

54

A TRPV1 molekulán ható antagonisták nagyon ígéretesnek tűntek a fájdalom-kórképek és gyulladásos betegségek kezelésének eszközeként. Az általunk is megerősített legújabb adatok azonban arra utalnak, hogy a TRPV1 receptort

nem

tekinthetjük

kizárólag

proinflammátoros

és

pronociceptív

molekulának, mivel egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy ezen receptorok aktiválását követően gyulladásgátló és antinociceptív hatások is érvényesülnek.

55

Az értekezés új eredményei 1. Kísérleteink igazolták, hogy a mustárolaj neurogén és nem neurogén módon is képes gyulladást indukálni egérfülön. 2. Eredményeink

szerint

az

1%-os

mustárolaj

egyszeri

alkalmazása

átmeneti vaszkuláris gyulladást okoz, melyet nem követ sejtkiáramlás. A mustárolaj ismételt dózisban már képes olyan kemotaktikus utakat aktiválni, melyek függetlenek a neurogén komponensektől. 3. Funkcionális kísérletekkel elsőként bizonyítottuk, hogy a mustárolaj a TRPV1

receptortól

független

úton

aktiválja

a

kapszaicin-érzékeny

idegrostokat. A mustárolaj okozta gyulladás neurogén szakasza NK1 receptoron keresztül mediált. 4. Elsőként írtuk le, hogy a TRPV1 receptor akár genetikai akár kémiai depléciója súlyosbítja az oxazolonnal kiváltott ACD tüneteit, valamint a TRPV1 receptor aktivációja során felszabaduló neuropeptidek jelentős módosító szereppel bírnak a kontakt dermatitisz során. 5. Kísérleteink megerősítették, hogy a P-anyag és a CGRP gyulladáskeltő hatású az allergiás kontakt dermatitisz folyamatában. 6. Megfigyeltük,

hogy

az

egérfülben

oxazolonnal

indukált

ACD

a

várakozásokkal szemben nem tipikus Th1 típusú válasz, a Th2-es citokinek, elsősorban az IL-4 szerepe szintén kiemelt jelentőségű.

56

Irodalomjegyzék

1. Brain, S. D. 1997. Sensory neuropeptides: their role in inflammation and wound healing. Immunopharmacology 37:133-152. 2. Szolcsanyi, J. 1996. Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions: facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. Prog.Brain Res. 113:343-359. 3. Scholzen, T., C. A. Armstrong, N. W. Bunnett, T. A. Luger, J. E. Olerud, and J. C. Ansel. 1998. Neuropeptides in the skin: interactions between the neuroendocrine and the skin immune systems. Exp.Dermatol. 7:81-96. 4. Jancso, N., A. Jancso-Gabor, and J. Szolcsanyi. 1967. Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br.J.Pharmacol. 31:138-151. 5. Louis, S. M., A. Jamieson, N. J. Russell, and G. J. Dockray. 1989. The role of substance P and calcitonin gene-related peptide in neurogenic plasma extravasation and vasodilatation in the rat. Neuroscience 32:581-586. 6. Szolcsanyi, J. and A. Jancso-Gabor. 1975. Sensory effects of capsaicin congeners I. Relationship between chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung. 25:1877-1881. 7. Szolcsanyi, J. and A. Jancso-Gabor. 1976. Sensory effects of capsaicin congeners. Part II: Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin-type compounds. Arzneimittelforschung. 26:33-37. 8. Caterina, M. J., M. A. Schumacher, M. Tominaga, T. A. Rosen, J. D. Levine, and D. Julius. 1997. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389:816-824. 9. Hayes, P., H. J. Meadows, M. J. Gunthorpe, M. H. Harries, D. M. Duckworth, W. Cairns, D. C. Harrison, C. E. Clarke, K. Ellington, R. K. Prinjha, A. J. Barton, A. D. Medhurst, G. D. Smith, S. Topp, P. Murdock, G. J. Sanger, J. Terrett, O. Jenkins, C. D. Benham, A. D. Randall, I. S. Gloger, and J. B. Davis. 2000.

57

Cloning and functional expression of a human orthologue of rat vanilloid receptor-1. Pain 88:205-215. 10. McIntyre, P., L. M. McLatchie, A. Chambers, E. Phillips, M. Clarke, J. Savidge, C. Toms, M. Peacock, K. Shah, J. Winter, N. Weerasakera, M. Webb, H. P. Rang, S. Bevan, and I. F. James. 2001. Pharmacological differences between the human and rat vanilloid receptor 1 (VR1). Br.J.Pharmacol. 132:1084-1094. 11. Guo, A., L. Vulchanova, J. Wang, X. Li, and R. Elde. 1999. Immunocytochemical localization of the vanilloid receptor 1 (VR1): relationship to neuropeptides, the P2X3 purinoceptor and IB4 binding sites. Eur.J.Neurosci. 11:946-958. 12. Tominaga, M., M. J. Caterina, A. B. Malmberg, T. A. Rosen, H. Gilbert, K. Skinner, B. E. Raumann, A. I. Basbaum, and D. Julius. 1998. The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron 21:531543. 13. Holzer, P. 1991. Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory neurons. Pharmacol.Rev. 43:143-201. 14. Birder, L. A., A. J. Kanai, W. C. de Groat, S. Kiss, M. L. Nealen, N. E. Burke, K. E. Dineley, S. Watkins, I. J. Reynolds, and M. J. Caterina. 2001. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98:13396-13401. 15. Mezey, E., Z. E. Toth, D. N. Cortright, M. K. Arzubi, J. E. Krause, R. Elde, A. Guo, P. M. Blumberg, and A. Szallasi. 2000. Distribution of mRNA for vanilloid receptor subtype 1 (VR1), and VR1-like immunoreactivity, in the central nervous system of the rat and human. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97:3655-3660. 16. Sasamura, T., M. Sasaki, C. Tohda, and Y. Kuraishi. 1998. Existence of capsaicin-sensitive glutamatergic terminals in rat hypothalamus. Neuroreport 9:2045-2048. 17. Schumacher, M. A., I. Moff, S. P. Sudanagunta, and J. D. Levine. 2000. Molecular cloning of an N-terminal splice variant of the capsaicin receptor. Loss of N-terminal domain suggests functional divergence among capsaicin receptor subtypes. J.Biol.Chem. 275:2756-2762.

58

18. Biro, T., M. Maurer, S. Modarres, N. E. Lewin, C. Brodie, G. Acs, P. Acs, R. Paus, and P. M. Blumberg. 1998. Characterization of functional vanilloid receptors expressed by mast cells. Blood 91:1332-1340. 19. Biro, T., C. Brodie, S. Modarres, N. E. Lewin, P. Acs, and P. M. Blumberg. 1998. Specific vanilloid responses in C6 rat glioma cells. Brain Res.Mol.Brain Res. 56:89-98. 20. Sanchez, J. F., J. E. Krause, and D. N. Cortright. 2001. The distribution and regulation of vanilloid receptor VR1 and VR1 5' splice variant RNA expression in rat. Neuroscience 107:373-381. 21. Trevisani, M., D. Smart, M. J. Gunthorpe, M. Tognetto, M. Barbieri, B. Campi, S. Amadesi, J. Gray, J. C. Jerman, S. J. Brough, D. Owen, G. D. Smith, A. D. Randall, S. Harrison, A. Bianchi, J. B. Davis, and P. Geppetti. 2002. Ethanol elicits and potentiates nociceptor responses via the vanilloid receptor-1. Nat.Neurosci. 5:546-551. 22. Vyklicky, L., A. Lyfenko, K. Susankova, J. Teisinger, and V. Vlachova. 2002. Reducing agent dithiothreitol facilitates activity of the capsaicin receptor VR-1. Neuroscience 111:435-441. 23. Sterner, O. and A. Szallasi. 1999. Novel natural vanilloid receptor agonists: new therapeutic targets for drug development. Trends Pharmacol.Sci. 20:459465. 24. Zygmunt, P. M., J. Petersson, D. A. Andersson, H. Chuang, M. Sorgard, M. Di, V, D. Julius, and E. D. Hogestatt. 1999. Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature 400:452-457. 25. Ahluwalia, J., L. Urban, M. Capogna, S. Bevan, and I. Nagy. 2000. Cannabinoid 1 receptors are expressed in nociceptive primary sensory neurons. Neuroscience 100:685-688. 26. Helyes, Z., E. Pinter, J. Nemeth, and J. Szolcsanyi. 2003. Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic inflammation. Curr.Med.Chem.- Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents 2:191-218. 27. Cesare, P., A. Moriondo, V. Vellani, and P. A. McNaughton. 1999. Ion channels gated by heat. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96:7658-7663.

59

28. Premkumar, L. S. and G. P. Ahern. 2000. Induction of vanilloid receptor channel activity by protein kinase C. Nature 408:985-990. 29. Szabo, A., Z. Helyes, K. Sandor, A. Bite, E. Pinter, J. Nemeth, A. Banvolgyi, K. Bolcskei, K. Elekes, and J. Szolcsanyi. 2005. Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: In vivo study using gene-deficient mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 314:111-119. 30. McDonald, D. M., J. J. Bowden, P. Baluk, and N. W. Bunnett. 1996. Neurogenic inflammation. A model for studying efferent actions of sensory nerves. Adv.Exp.Med.Biol. 410:453-462. 31. Grant.A. 2002. Leukocytes and neurogenic inflammation. Inflammopharmacology 9:403-420. 32. Baluk, P., G. Thurston, T. J. Murphy, N. W. Bunnett, and D. M. McDonald. 1999. Neurogenic plasma leakage in mouse airways. Br.J.Pharmacol. 126:522528. 33. Matsuda, H., K. Kawakita, Y. Kiso, T. Nakano, and Y. Kitamura. 1989. Substance P induces granulocyte infiltration through degranulation of mast cells. J.Immunol. 142:927-931. 34. Suzuki, H., S. Miura, Y. Y. Liu, M. Tsuchiya, and H. Ishii. 1995. Substance P induces degranulation of mast cells and leukocyte adhesion to venular endothelium. Peptides 16:1447-1452. 35. Walsh, D. T., V. B. Weg, T. J. Williams, and S. Nourshargh. 1995. Substance Pinduced inflammatory responses in guinea-pig skin: the effect of specific NK1 receptor antagonists and the role of endogenous mediators. Br.J.Pharmacol. 114:1343-1350. 36. Yano, H., B. K. Wershil, N. Arizono, and S. J. Galli. 1989. Substance P-induced augmentation of cutaneous vascular permeability and granulocyte infiltration in mice is mast cell dependent. J.Clin.Invest 84:1276-1286. 37. Bester, H., A. J. Allchorne, and C. J. Woolf. 1998. Recovery of C-fiber-induced extravasation following peripheral nerve injury in the rat. Exp.Neurol. 154:628636.

60

38. Jancso, G., E. Kiraly, and A. Jancso-Gabor. 1977. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature 270:741-743. 39. Amann, R., T. Egger, and R. Schuligoi. 2000. The tachykinin NK(1) receptor antagonist SR140333 prevents the increase of nerve growth factor in rat paw skin induced by substance P or neurogenic inflammation. Neuroscience 100:611-615. 40. Lembeck, F., J. Donnerer, M. Tsuchiya, and A. Nagahisa. 1992. The nonpeptide tachykinin antagonist, CP-96,345, is a potent inhibitor of neurogenic inflammation. Br.J.Pharmacol. 105:527-530. 41. Pinter, E., B. Brown, J. R. Hoult, and S. D. Brain. 1999. Lack of evidence for tachykinin NK1 receptor-mediated neutrophil accumulation in the rat cutaneous microvasculature by thermal injury. Eur.J.Pharmacol. 369:91-98. 42. Szolcsanyi, J., E. Pinter, Z. Helyes, G. Oroszi, and J. Nemeth. 1998. Systemic anti-inflammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. Br.J.Pharmacol. 125:916-922. 43. Inoue, H., T. Asaka, N. Nagata, and Y. Koshihara. 1997. Mechanism of mustard oil-induced skin inflammation in mice. Eur.J.Pharmacol. 333:231-240. 44. Laird, J. M., T. Olivar, C. Roza, C. De Felipe, S. P. Hunt, and F. Cervero. 2000. Deficits in visceral pain and hyperalgesia of mice with a disruption of the tachykinin NK1 receptor gene. Neuroscience 98:345-352. 45. Banvolgyi, A., G. Pozsgai, S. D. Brain, Z. S. Helyes, J. Szolcsanyi, M. Ghosh, B. Melegh, and E. Pinter. 2004. Mustard oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-independent neurogenic inflammation and a nonneurogenic cellular inflammatory component in mice. Neuroscience 125:449459. 46. Krasteva, M., J. Kehren, M. T. Ducluzeau, M. Sayag, M. Cacciapuoti, H. Akiba, J. Descotes, and J. F. Nicolas. 1999. Contact dermatitis I. Pathophysiology of contact sensitivity. Eur.J.Dermatol. 9:65-77. 47. Bradley, P. P., D. A. Priebat, R. D. Christensen, and G. Rothstein. 1982. Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker. J.Invest Dermatol. 78:206-209.

61

48. Cao, T., E. Pinter, S. Al Rashed, N. Gerard, J. R. Hoult, and S. D. Brain. 2000. Neurokinin-1 receptor agonists are involved in mediating neutrophil accumulation in the inflamed, but not normal, cutaneous microvasculature: an in vivo study using neurokinin-1 receptor knockout mice. J.Immunol. 164:5424-5429. 49. Girolomoni, G. and R. E. Tigelaar. 1990. Capsaicin-sensitive primary sensory neurons are potent modulators of murine delayed-type hypersensitivity reactions. J.Immunol. 145:1105-1112. 50. Saulnier, M., S. Huang, M. Aguet, and B. Ryffel. 1995. Role of interferongamma in contact hypersensitivity assessed in interferon-gamma receptordeficient mice. Toxicology 102:301-312. 51. Pinter, E., M. Than, D. Q. Chu, C. Fogg, and S. D. Brain. 2002. Interaction between interleukin 1beta and endogenous neurokinin 1 receptor agonists in mediating plasma extravasation and neutrophil accumulation in the cutaneous microvasculature of the rat. Neurosci.Lett. 318:13-16. 52. Buckley, T. L. and F. P. Nijkamp. 1994. Mucosal exudation associated with a pulmonary delayed-type hypersensitivity reaction in the mouse. Role for the tachykinins. J.Immunol. 153:4169-4178. 53. Nilsson, G. and S. Ahlstedt. 1989. Increased delayed-type hypersensitivity reaction in rats neuromanipulated with capsaicin. Int.Arch.Allergy Appl.Immunol. 90:256-260. 54. Veronesi, B., W. C. Williams, R. J. Smialowicz, D. M. Sailstad, D. Doerfler, and M. J. Selgrade. 1998. Neuropeptide denervation alters both the elicitation and induction phases of contact hypersensitivity in mice. Toxicol.Appl.Pharmacol. 153:243-249. 55. Ek, L. and E. Theodorsson. 1990. Tachykinins and calcitonin gene-related peptide in oxazolone-induced allergic contact dermatitis in mice. J.Invest Dermatol. 94:761-763. 56. Niizeki, H., I. Kurimoto, and J. W. Streilein. 1999. A substance p agonist acts as an adjuvant to promote hapten-specific skin immunity. J.Invest Dermatol. 112:437-442.

62

57. Wallengren, J. 1991. Substance P antagonist inhibits immediate and delayed type cutaneous hypersensitivity reactions. Br.J.Dermatol. 124:324-328. 58. Goebeler, M., U. Henseleit, J. Roth, and C. Sorg. 1994. Substance P and calcitonin gene-related peptide modulate leukocyte infiltration to mouse skin during allergic contact dermatitis. Arch.Dermatol.Res. 286:341-346. 59. Asahina, A., J. Hosoi, S. Beissert, A. Stratigos, and R. D. Granstein. 1995. Inhibition of the induction of delayed-type and contact hypersensitivity by calcitonin gene-related peptide. J.Immunol. 154:3056-3061. 60. Torii, H., J. Hosoi, A. Asahina, and R. D. Granstein. 1997. Calcitonin generelated peptide and Langerhans cell function. J.Investig.Dermatol.Symp.Proc. 2:82-86. 61. Xu, X. J., J. X. Hao, Z. Wiesenfeld-Hallin, R. Hakanson, K. Folkers, and T. Hokfelt. 1991. Spantide II, a novel tachykinin antagonist, and galanin inhibit plasma extravasation induced by antidromic C-fiber stimulation in rat hindpaw. Neuroscience 42:731-737. 62. Carlton, S. M. and R. E. Coggeshall. 1997. Immunohistochemical localization of enkephalin in peripheral sensory axons in the rat. Neurosci.Lett. 221:121-124. 63. Delgado, M., C. Abad, C. Martinez, J. Leceta, and R. P. Gomariz. 2001. Vasoactive intestinal peptide prevents experimental arthritis by downregulating both autoimmune and inflammatory components of the disease. Nat.Med. 7:563-568. 64. Foey, A. D., S. Field, S. Ahmed, A. Jain, M. Feldmann, F. M. Brennan, and R. Williams. 2003. Impact of VIP and cAMP on the regulation of TNF-alpha and IL10 production: implications for rheumatoid arthritis. Arthritis Res.Ther. 5:R317R328. 65. Williams, R. O. 2002. Therapeutic effect of vasoactive intestinal peptide in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 46:271-273. 66. Nemeth, J., D. Reglodi, G. Pozsgai, A. Szabo, K. Elekes, E. Pinter, J. Szolcsanyi, and Z. Helyes. 2006. Effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. Neuroscience.

63

67. Asada, H., J. Linton, and S. I. Katz. 1997. Cytokine gene expression during the elicitation phase of contact sensitivity: regulation by endogenous IL-4. J.Invest Dermatol. 108:406-411. 68. Gautam, S. C., N. F. Chikkala, and T. A. Hamilton. 1992. Anti-inflammatory action of IL-4. Negative regulation of contact sensitivity to trinitrochlorobenzene. J.Immunol. 148:1411-1415. 69. Dieli, F., G. Sireci, E. Scire, A. Salerno, and A. Bellavia. 1999. Impaired contact hypersensitivity to trinitrochlorobenzene in interleukin-4-deficient mice. Immunology 98:71-79. 70. Salerno, A., F. Dieli, G. Sireci, A. Bellavia, and G. L. Asherson. 1995. Interleukin-4 is a critical cytokine in contact sensitivity. Immunology 84:404409. 71. Weigmann, B., J. Schwing, H. Huber, R. Ross, H. Mossmann, J. Knop, and A. B. Reske-Kunz. 1997. Diminished contact hypersensitivity response in IL-4 deficient mice at a late phase of the elicitation reaction. Scand.J.Immunol. 45:308-314. 72. Jordt, S. E., D. M. Bautista, H. H. Chuang, D. D. McKemy, P. M. Zygmunt, E. D. Hogestatt, I. D. Meng, and D. Julius. 2004. Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 427:260265. 73. Corey, D. P., J. Garcia-Anoveros, J. R. Holt, K. Y. Kwan, S. Y. Lin, M. A. Vollrath, A. Amalfitano, E. L. Cheung, B. H. Derfler, A. Duggan, G. S. Geleoc, P. A. Gray, M. P. Hoffman, H. L. Rehm, D. Tamasauskas, and D. S. Zhang. 2004. TRPA1 is a candidate for the mechanosensitive transduction channel of vertebrate hair cells. Nature 432:723-730. 74. Bautista, D. M., P. Movahed, A. Hinman, H. E. Axelsson, O. Sterner, E. D. Hogestatt, D. Julius, S. E. Jordt, and P. M. Zygmunt. 2005. Pungent products from garlic activate the sensory ion channel TRPA1. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102:12248-12252. 75. Kobayashi, K., T. Fukuoka, K. Obata, H. Yamanaka, Y. Dai, A. Tokunaga, and K. Noguchi. 2005. Distinct expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary afferent neurons with adelta/c-fibers and colocalization with trk receptors. J.Comp Neurol. 493:596-606.

64

76. Story, G. M., A. M. Peier, A. J. Reeve, S. R. Eid, J. Mosbacher, T. R. Hricik, T. J. Earley, A. C. Hergarden, D. A. Andersson, S. W. Hwang, P. McIntyre, T. Jegla, S. Bevan, and A. Patapoutian. 2003. ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 112:819-829. 77. McKemy, D. D., W. M. Neuhausser, and D. Julius. 2002. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 416:52-58. 78. Peier, A. M., A. Moqrich, A. C. Hergarden, A. J. Reeve, D. A. Andersson, G. M. Story, T. J. Earley, I. Dragoni, P. McIntyre, S. Bevan, and A. Patapoutian. 2002. A TRP channel that senses cold stimuli and menthol. Cell 108:705-715. 79. Bandell, M., G. M. Story, S. W. Hwang, V. Viswanath, S. R. Eid, M. J. Petrus, T. J. Earley, and A. Patapoutian. 2004. Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 41:849-857. 80. Bautista, D. M., S. E. Jordt, T. Nikai, P. R. Tsuruda, A. J. Read, J. Poblete, E. N. Yamoah, A. I. Basbaum, and D. Julius. 2006. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell 124:1269-1282. 81. Kwan, K. Y., A. J. Allchorne, M. A. Vollrath, A. P. Christensen, D. S. Zhang, C. J. Woolf, and D. P. Corey. 2006. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron 50:277-289. 82. Bolcskei, K., Z. Helyes, A. Szabo, K. Sandor, K. Elekes, J. Nemeth, R. Almasi, E. Pinter, G. Petho, and J. Szolcsanyi. 2005. Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-deficient mice. Pain 117:368-376. 83. Geppetti, P., S. Materazzi, and P. Nicoletti. 2006. The transient receptor potential vanilloid 1: role in airway inflammation and disease. Eur.J.Pharmacol. 533:207-214. 84. Szallasi, A., F. Cruz, and P. Geppetti. 2006. TRPV1: a therapeutic target for novel analgesic drugs? Trends Mol.Med. 85. Barton, N. J., D. S. McQueen, D. Thomson, S. D. Gauldie, A. W. Wilson, D. M. Salter, and I. P. Chessell. 2006. Attenuation of experimental arthritis in TRPV1R knockout mice. Exp.Mol.Pathol. 81:166-170.

65

86. Keeble, J., F. Russell, B. Curtis, A. Starr, E. Pinter, and S. D. Brain. 2005. Involvement of transient receptor potential vanilloid 1 in the vascular and hyperalgesic components of joint inflammation. Arthritis Rheum. 52:32483256. 87. Banvolgyi, A., L. Palinkas, T. Berki, N. Clark, A. D. Grant, Z. Helyes, G. Pozsgai, J. Szolcsanyi, S. D. Brain, and E. Pinter. 2005. Evidence for a novel protective role of the vanilloid TRPV1 receptor in a cutaneous contact allergic dermatitis model. Journal of Neuroimmunology 169:86-96. 88. Massa, F., A. Sibaev, G. Marsicano, H. Blaudzun, M. Storr, and B. Lutz. 2006. Vanilloid receptor (TRPV1)-deficient mice show increased susceptibility to dinitrobenzene sulfonic acid induced colitis. J.Mol.Med. 84:142-146.

66

Publikációs lista Az értekezés alapját képező elsőszerzős cikkek 1. Ágnes Bánvölgyi, Gábor Pozsgai, Susan D. Brain, Zsuzsanna Helyes, János Szolcsányi, Minakshi Ghosh, Béla Melegh and Erika Pintér: Mustard oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-independent neurogenic inflammation and a non-neurogenic cellular inflammatory component in mice, Neuroscience 2004, (Vol.125): 449-459. IF: 3,5 2. Ágnes Bánvölgyi, László Pálinkás, Tímea Berki, Natalie Clark, Andrew D.Grant, Zsuzsanna Helyes, Gábor Pozsgai, János Szolcsányi, Susan D. Brain, Erika Pintér: Evidence for a novel protective role of the vanilloid TRPV1 receptor

in

a

cutaneous

contact

allergic

dermatitis

model,

Journal

of

Neuroimmunology 2005 (69): 86-96. IF: 2,82

További közlemények 3. Zsuzsanna Helyes, Árpád Szabó, József Németh, Balázs Jakab, Erika Pintér, Ágnes Bánvölgyi, László Kereskai, György Kéri, and János Szolcsányi: Antiinflammatory and Analgesic

Effects of Somatostatin Released From

Capsaicin-Sensitive Sensory Nerve Terminals in Freund’s Adjuvant-Induced Chronic Arthritis Model of the Rat, Arthritis Rheum. 2004 May;50(5):16771685. IF: 7,39 4. Árpád Szabó, Zsuzsanna Helyes, Katalin Sándor, Andrea Bite, Erika Pintér, József Németh, Ágnes Bánvölgyi, Kata Bölcskei, Krisztián Elekes, János Szolcsányi: Role of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 Receptors in Adjuvant-Induced Chronic Arthritis: in Vivo Study Using Gene-Deficient Mice, The

Journal

Of

Pharmacology

And

Experimental

Therapeutics

2005,

314(1):111-119. IF: 4,31

67

Idézhető absztraktok az értekezés témájában 1. Ágnes Bánvölgyi, József Pál, György Szekeres, János Szolcsányi, Susan D. Brain, Erika Pintér: The role of capsaicin-sensitive sensory nerve endings in oxazolone

induced

early

inflammatory

reactions

and

delayed-type

hypersensitivity in mouse ear, Neuropeptides 2002, 36 (6): 471. IF: 1,69 2. Zsuzsanna Helyes, Kata Bölcskei, Erika Pintér, Gábor Pethő, József Németh, Ágnes

Bánvölgyi,

János

Szolcsányi:

Analgesic

effect

of

TT-232,

a

heptapeptide somatostatin analogue, in acute and chronic pain models in the rat, Br. J. Pharmacol. Proc. Suppl., 2003 (138): 218 IF: 3,502

Poszterek, előadások az értekezés témájában 1. Bánvölgyi, Á., Pál, J., Szekeres, Gy., Szolcsányi, J., Brain S.D., Pintér, E.: The role of capsaicin-sensitive sensory nerve endings in oxazolone induced early inflammatory reactions and delayed-type hypersensitivity in mouse ear, 12th Annual Meeting of ENC, Olsztyn, Lengyelország, 2002 2. Bánvölgyi Á., Pozsgai G., Dénes V., Szolcsányi J., Brain S.D. és Pintér E.: A mustárolaj okozta gyulladás jellemzése BALB/c, NK1- és VR1 receptor hiányos transzgenikus egereken. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság V. Konferenciája, Debrecen, 2002. 3. Bánvölgyi Á., Pozsgai G., Szabó Á., Helyes Zs., Szolcsányi J., Davis J.B., Brain S.D., és Pintér E.: A mustárolajjal kiváltott fülgyulladás jellemzése BALB/c, NK1 és VR1 receptor génhiányos egerekben. Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXVII. Vándorgyűlése, Pécs, 2003. 4. Bánvölgyi, Á., Pozsgai, G., Szolcsányi, J., Davis, J. B., Brain, S. D. and Pintér, E.: Characterization of mustard oil-induced ear oedema in BALB/c, NK1 and VR1 receptor knockout mice. Summer Neuropeptide 2003 Conference (XIII. ENC), Montauk, NY, USA 5. Á. Bánvölgyi, G. Pozsgai, Zs. Helyes, J. Szolcsányi, Brain S. D., E. Pintér: Role of neurokinin 1 (NK1) and vanilloid 1 (VR1) receptors in oxazolone-induced delayed-type hypersensitivity reaction (DTH) in mice. 4th International Conference of PhD Students, Miskolc, 2003. (előadás)

68

6. Bánvölgyi Ágnes, Pozsgai Gábor, Pálinkás László, Szabó Árpád, Helyes Zsuzsanna,

Berki

Tímea,

Szolcsányi

János,

Pintér

Erika:

A

szenzoros

neuropeptidek hatásának vizsgálata az oxazolonnal kiváltott késői típusú hiperszenzitív

reakcióban

egéren.

Magyar

Klinikai

Farmakológusok

V.

Kongresszusa és MFT Immunfarmakológiai Szekció Ülése 2003. 7. Pintér Erika, Bánvölgyi Ágnes, Dénes Viktória, Szolcsányi János, Susan D. Brain:

Az

oxazolonnal

kiváltott

késői

hiperszenzitív

reakció

jellemzése

neurokinin-1 (NK1)- és vanilloid-1 (VR1) receptor hiányos egerekben. Magyar Idegtudományi Társaság VIII. Konferenciája, Balatonfüred, 2003. 8. Pintér E., Bánvölgyi Á., Szabó Á., Helyes Zs., Szolcsányi J., Davis J.B., Brain S.D.: A neurokinin-1 (NK1) és a vanilloid-1 (VR1) receptorok szerepe az oxazolon okozta késői hiperszenzitív reakcióban egérben. Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXVII. Vándorgyűlése, Pécs, 2003. 9. Pintér, E., Bánvölgyi, Á., Szolcsányi, J., Davis, J.B. and Brain S.D.: Role of Neurokinin 1 (NK1) and vanilloid 1 (VR1) receptors in oxazolone-induced delayed-type hypersensitivity reaction (DTH) in mice. Summer Neuropeptide 2003 Conference (XIII. ENC), Montauk, NY, USA

Egyéb poszterek 1. Ágnes Bánvölgyi, Zsuzsanna Helyes, Kata Bölcskei, Erika Pintér, Gábor Pethő, József Németh and János Szolcsányi: Ananlgesic and anti-hyperalgesic effects of the hepatapeptide somatostatin analogue, TT-232, in acute and chronic nociceptive rat models. Magyar Idegtudományi Társaság VIII. Konferenciája, Balatonfüred, 2003. 2. Helyes Zs., Bölcskei, K., Pintér, E., Pethő, G., Németh, J., Bánvölgyi, Á., Szabó,

Á.,

Szolcsányi,

J.:

Heptapeptid

szomatosztatin

analóg,

TT-232,

analgetikus hatása akut és krónikus fájdalom modellekben patkányban. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság V. Konferenciája, Debrecen, 2002. 3. Árpád Szabó, Zsuzsanna Helyes, József Németh, Balázs Jakab, Erika Pintér, Ágnes

Bánvölgyi,

György

Kéri

and

János

Szolcsányi:

Effect

of

the

69

heptapeptide somatostatin analogue, TT-232, on thermally-evoked acute plasma extravasation and Freund’s adjuvant-evoked chronic arthritis in the rat. Magyar Idegtudományi Társaság VIII. Konferenciája, Balatonfüred, 2003. 4. Zsuzsanna Helyes, Árpád Szabó, József Németh, Balázs Jakab, Erika Pintér, Ágnes Bánvölgyi and János Szolcsányi: Anti-inflammatory and analgesic effect of somatostation released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in Freund’s adjuvant-induced chronic arthritis model of the rat. Magyar Idegtudományi Társaság VIII. Konferenciája, Balatonfüred, 2003. 5. Helyes Zsuzsanna, Szabó Árpád, Németh József, Jakab Balázs, Bite Andrea, Sándor Katalin, Pintér Erika, Bánvölgyi Ágnes, Szolcsányi János: Kapszaicinérzékeny

szenzoros

gyulladásgátló

és

idegvégződésekből

fájdalomcsillapító

hatása

felszabaduló krónikus

szomatosztatin

izületi

gyulladásos

patkánymodellben. Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXVII. Vándorgyűlése, Pécs, 2003. 6. Szabó Árpád, Helyes Zsuzsanna, Sándor Katalin, Bite Andrea, Börzsei Rita, Bánvölgyi Ágnes, Pintér Erika, Németh József, Jakab Balázs, Szolcsányi János: A kapszaicin receptor (VR1/TRPV1) szerepe a Freund-adjuvánssal kiváltott krónikus ízületi gyulladásban. Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXVII. Vándorgyűlése, Pécs, 2003. 7. Helyes, Zs., Bölcskei, K., Pintér, E., Pethő, G., Németh, J., Bánvölgyi, Á., Szolcsányi, J.: Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in acute and chronic pain models in the rat. Winter Meeting of the British Pharmacological Society, Brighton, U.K., 2003. 8. Helyes Zs., Szabó Á., Bite A., Sándor K., Németh J., Jakab B., Pintér E., Bánvölgyi Á., Davis J. B., and Szolcsányi J.: Role of capsaicin-sensitive sensory nerves and vanilloid receptor (VR1/TRPV1) in the development of Freund’s adjuvant-induced chronic arthritis. Summer Neuropeptide 2003 Conference (XIII. ENC), Montauk, NY, USA 9. Szabó Árpád, Czirják László, Helyes Zsuzsanna, Pintér Erika, László Terézia, Sándor Katalin, Bite Andrea, Börzsei Rita, Bánvölgyi Ágnes, Szolcsányi János: A kapszaicin receptor (VR1/TRPV1) szerepe krónikus ízületi gyulladásos és

70

szkleroderma

egérmodellekben.

Magyar

Klinikai

Farmakológusok

V.

Kongresszusa és MFT Immunfarmakológiai Szekció Ülése 2003.

71

Köszönetnyilvánítás Köszönettel

tartozom

Dr.

Szolcsányi

János

akadémikusnak,

a

Neurofarmakológia Program vezetőjének, aki lehetővé tette számomra, hogy az intézetében végezhessem Ph.D. tanulmányaimat, és munkásságával példát mutatott az évek során. Hálásan köszönöm témavezetőmnek, Dr. Pintér Erikának és Dr. Helyes Zsuzsannának munkám során nyújtott szakmai irányításukat, és támogatásukat. Köszönöm hasznos tanácsaikat, és emberséges hozzáállásukat. Külön

köszönet

illeti

Meenakshi

Ghosht

az

Orvosi

Genetikai

és

Gyermekfejlődéstani Intézetből, aki a TRPV1 receptor knockout állatok genetikai meghatározásában, a PCR technika megismertetésében segített. Köszönöm Dr. Pálinkás Lászlónak az Immunológiai és Biotechnológiai Intézet munkatársának az áramlási citometriás mérésekben nyújtott nélkülözhetetlen segítségét. Ezúton szeretném köszönetemet kifejezni munkatársaimnak, Dr. Pozsgai Gábornak a mieloperoxidáz enzim aktivitás mérésében nyújtott segítségéért, valamint Dr. Hírné Perkecz Anikónak a professzionális szövettani metszetek elkészítéséért. Köszönettel tartozom Olaszné Zádor Csillának, aki az elmúlt évek során kifogástalan asszisztensi munkájával járult hozzá a kísérletek zökkenőmentes elvégzéséhez. Végül, de nem utolsó sorban hálával tartozom férjemnek és családomnak türelmükért, megértésükért, és odaadó szeretetükért.

72

Függelék Az értekezés alapjául szolgáló közlemények

73