A sejtműködés szabályozási lehetőségei valójában a fehérjefunkció szabályozását jelentik
• • • •
Transzkripció mRNS mennyiség Poszttranszkripció mRNS élettartam Transzláció szintetizálódó fehérje mennyisége Poszttranszláció fehérjemennyiség, hely és aktivitás (mikro)kompartmentalizáció (irányítás) poszttranszlációs módosulás nonkovalens (allosztérikus) kovalens (foszforiláció) fehérjelebontás - aggregáció Sőti Csaba, 2004
Hatástartam hosszú hosszú hosszú rövid-hosszú rövid-hosszú rövid közép irreverzíbilis 1
A poszttranszlációs módosulások típusai Enzimatikus • Fehérje tekeredés, PPIáz • Fehérje splicing • Transzamidáció • Prosztetikus csoport • Acetiláció • Limitált proteolízis • Foszforiláció • Karboxiláció • Metiláció • Glikoziláció • Lipidmodifikáció • Diszulfid-hidak • Hidroxiláció Sőti Csaba, 2004
aminosav (Cys) (Gln-Lys) (Lys, Cys, His, Tyr) (Lys) bárhol (Ser, Thr, Tyr) (Glu) (Lys, Glu, His) (Ser, Thr, Asn, Hyl) (Cys, Ser, Gly) (Cys) (Pro, Lys) 2
A poszttranszlációs módosulások típusai Nem-enzimatikus • Oxidáció • Glikáció • Lassú szerkezetváltás
Sőti Csaba, 2004
aminosav (Cys, Met, Lys, Arg) (Lys, Arg) -
3
A poszttranszlációs módosulások hatásai Enzimatikus • Mennyiség: élettartam • Szerkezet: 1D, 2D, 3D, 4D • Stabilizáció • Aktivitás • (Immun)felismerés: • Lokalizáció: (mikro)kompartmentalizáció • Kölcsönhatás más, kis- vagy nagymolekulákkal Nem-enzimatikus • denaturáció • funkcióvesztés • aggregáció Sőti Csaba, 2004
4
Limitált proteolízis •
(f)Met eltávolítása (N-terminális N-acetilációja: Cα-NH-CO-CH3) élettartam, mirisztoiláció
•
Szignálszekvenciák eltávolítása (ER, mitokondrium) prefehérjék
•
Profehérjék-proenzimek, egyéb fehérjék aktivációja emésztőenzimek, extracelluláris vázfehérjék, polipeptid hormonok
•
Több peptidből álló polifehérjék szétvagdalása (peptidhormonok, vírusfehérjék, ubikvitin)
HIV-proteáz inhibitorok az AIDS kezelésében
Sőti Csaba, 2004
5
Foszforiláció-defoszforiláció ATP
ADP Szűk szubsztrátspecificitás, felismerési motívumok, aktivitás általában indukált
kináz
fehérje
fehérje
foszfatáz Pi Sőti Csaba, 2004
H2O
P
töltésváltozás: szerkezet, aktivitás, fehérje-egyéb molekula kölcsönhatás Széles szubsztrátspecificitás, irányító alegységek, aktivitás általában konstitutív 6
Foszforiláció-defoszforiláció
Kináz kaszkád: Amplifikáció és divergencia
kináz 1 kináz 2 kináz 5 Sőti Csaba, 2004
kináz 3
kináz 6
kináz 4 kináz 7 7
Karboxiláció, metiláció K-vitamin-dependens. Alvadási faktorok Ca-foszfolipid-kötését teszi lehetővé.
Donor: S-adenozil-Met Izomfehérjék, kalmodulin Ca-kötését befolyásolja. Sőti Csaba, 2004
8
Lipidmodifikáció Nem-membránfehérjék kihorgonyzása a membránhoz Belső membránfelszín: -- zsíraciláció (palmitoil-
mirisztoil-)
-- izopreniláció (farnezil-, geranilgeranil-)
Külső membránfelszín: GPI-horgony (ER) bent Sőti Csaba, 2004 kint
9
Zsíraciláció Donor: zsíracil-KoA
példa fehérje:
Palmitoiláció (C16):
rodopszin, ras
-- láncközi Cys vagy Ser (tio-)észter -- plazmamembránba irányít Mirisztoiláció (C14):
v-src
-- N-terminális Gly amid -- plazmamembránba, sejtmagba, mitokondriumba, citoszolba irányít Sőti Csaba, 2004
10
Preniláció ras
farnezil-PP
PP
Cys-SH Val Leu Ser COO-
C A A X
ras Cys-S Val Leu Ser COO-
SAH
SAM
ras
ras
Cys-S CO
Cys-S COO-
CH3
Sőti Csaba, 2004
C C X X
C C X X
C X C
C C
proteáz
Geranilgeraniláció (rab) 11
Glikozil-foszfatidilinozitol horgony Donor: preformált GPI-egység Tulajdonságok:
C
Sőti Csaba, 2004
•
gyors laterális mozgás (nincs citoszkeletális kapcsolat)
•
aspecifikus szolubilizáció (PLC)
•
fehérje irányítás
12
A fehérjék célbajuttatása Vezikuláris transzport ER-ből, sejtfelszínről
Membrántranszport citoszolból
- mitokondrium
- kloroplaszt
Golgi - szekréció - lizoszóma - membrán Sőti Csaba, 2004
- sejtmag
13 - peroxiszóma
A fehérje membrántranszport általános jellemzői ER, mitokondrium, kloroplaszt, (peroxiszóma, nukleusz): •
A fehérje kitekert állapota stabilizálódik
•
Irányító szekvencia
•
Receptor - dokkoló fehérje
•
A fehérje kitekert állapotban jut át egy csatornán
•
Makroerg kötések (és elektrokémiai potenciál) terhére
•
A szignálpeptidet egy peptidáz eltávolíthatja
•
A fehérjét dajkafehérjék tekerik be, szerelik össze Sőti Csaba, 2004
14
A mitokondriális fehérje transzport általános jellemzői
•
Kitekerő/stabilizátor:
Hsp70, MSF
•
Preszekvencia
N-terminális bázikus + hidroxi-
•
Receptor - dokkoló fehérje:
Tom (transporter of outer membrane)
•
Csatorna:
Tom/Tim (tr. of inner membrane)
•
Makroerg kötések:
mHsp70 (Grp75) ATPáz, H+-grad.
•
Szignálpeptidáz:
Van
•
Dajkafehérjék:
Grp75, mHsp60
Sőti Csaba, 2004
15
Mitokondriális fehérje transzport
Sőti Csaba, 2004
16
A nukleáris fehérje transzport általános jellemzői •
Kitekerés (NLS kibontás):
natív fehérjék (dajkafehérjék)
•
Nukl. lokalizációs szignál nukl. export szignál
belső bázikus mono- v bipartit többféle, Leu-gazdag
•
Receptor - dokkoló fehérje:
Importin α, β ; exportin 1
•
Csatorna:
Nukleáris pórus komplex
•
Makroerg kötések:
ATP/GTP (Ran) szükséges
•
Szignálpeptidáz:
Nincs
•
Dajkafehérjék:
nem ismeretes
Sőti Csaba, 2004
17
A nukleáris pórus komplex szerkezete 10 nm
Mw = 125 MDa!
Sőti Csaba, 2004
18
Nukleáris fehérje transzport Szubnukleáris kompartmentek:
Ran
Sőti Csaba, 2004
•
Magvacska: bázikus-Gln-bázikus
•
Magmembrán: Cys-alifás aminosavak
Bejutás (NLS expozíció): •
konstitutív (magi fehérjék)
•
indukált (transzkripciós faktorok) -- foszforiláció (jun) -- ligandkötés (szteroid receptor) -- inhibitor disszociáció (NFκB) 19
Az ER fehérje transzport általános jellemzői
•
Kitekerő/stabilizátor:
Riboszóma-SRP
•
Szignálszekvencia
N-terminális hidrofób + bázikus
•
Receptor - dokkoló fehérje:
SRP-SRP receptor
•
Csatorna:
Traszlokon (TRAM)
•
Makroerg kötések:
ER Hsp70 (Bip, Grp78) ATPáz
•
Szignálpeptidáz:
Van
•
Dajkafehérjék:
Grp78, ER Hsp90 (Grp94, Gp96)
SRP: (signal recognition particle): ribonukleoprotein Sőti Csaba, 2004
20
ER szignálszekvencia
-- 13-36 aminosav hosszú -- bázikus (kék) ill. hidrofób (sárga) oldalláncok -- szignálpeptidáz A/G mellett hasít Csaba, 2004 --Sőtibelső szignálpeptid = stop-transzfer szekvencia: TM hélix
21
A fehérjék bejutása az ER-be
SRPR GTPáz: TRAM-riboszóma/fehérje asszociáció Sőti Csaba, 2004
Grp78 behúz, majd beteker (ATP)
22
Poszttranszlációs módosulások az ER-ben • • • • • • •
Szignálszekvencia lehasítása γ-karboxiláció Peptidkötés izomerizáció: PPIáz Glikoziláció Lipidmodifikáció: GPI Diszulfid-hidak, PDI Hidroxiláció
Sőti Csaba, 2004
(A/G-X) (Glu) (X-Pro) (Ser, Thr, Hyl, Asn) (Cys) (Cys) (Pro, Lys)
23
Glikoziláció az ER-ben/Golgi-ban Cél: fehérje betekeredés, irányítás, stabilitás, funkció, antigenitás Meghatároz: fehérje 3D szerkezet, endoszóma enzimkészlet Aktivált prekurzorok: UDP-monoszacharidok (CMP-NANA)
•
N-glikoziláció (Asn)
•
O-glikoziláció (Ser, Thr, Hyl) Sőti Csaba, 2004
24
O- és N-glikoziláció
Sőti Csaba, 2004
25
Glikoziláció az ER-ben/Golgi-ban
•
N-glikoziláció (Asn) ER: core glikoziláció (14 tagú oligoszacharid: GluNAc, Man, Glu) Golgi: pentaszacharid marad, Fuc, GluNAc, Gal, NANA általában hosszabb szénhidrátláncok
•
O-glikoziláció (Ser, Thr, Hyl) monoszacharidok egyesével rakódnak fel (cisz - transz-Golgi) Gal, GalNAc, NANA általában rövidebb szénhidrátláncok vércsoportok Sőti Csaba, 2004
26
Glikoziláció az ER-ben: core-glikoziláció
Sőti Csaba, 2004
27
Glikoziláció az ER-ben: core-glikoziláció tunicamycin
Asn-X-Ser Sőti Csaba, 2004
bacitracin 28
Fehérjetekeredés az ER-ben: minőségi kontroll Dajkafehérjék: kalnexin, kalretikulin kalnexin
kalnexin ER lumen
Glu
exportkész
glukozidáz tekeredési ciklusok Citoszol
glukoziltranszferáz
α1-antitripszin "hiány": valójában K/E pontmutáció KK: májzsugorodás (cirrhosis), tüdőtágulás (emphysema) Sőti Csaba, 2004 PT: tekeredési zavar
29
Fehérjeirányítás az ER-Golgi rendszerből (vezikuláris transzport) ER - cisz-Golgi: C-term. KDEL: retrográd transzport cisz-transz Golgi: membránhélix: retrográd transzport transz Golgi: • plazmamembrán, konstitutív (alapértelmezés) (membrán- v. szekréciós fehérjék) • plazmamembrán, indukált szekréció (szekretogranin-Ca2+ koaggregáció) • primer
lizoszóma: mannóz-6-P
• plazmamembrán,
ER
Sőti Csaba, 2004
receptormediált endocitózis: (receptor citoszolikus szignál, pl. LL, YXXΦ) 30
Fehérjeirányítás a lizoszómába: mannóz-6-P Man6P
Man foszfotranszferáz cisz-Golgi
receptor transz-Golgi, pH 6.5
Hidroláz
endoszóma pH 5 M6P-foszfatáz Man
receptor lizoszóma
II. mukolipidózis (I-sejt betegség): foszfotranszferáz hiány, AR KK: mentális retardáció, vázproblémák, ízületi merevség, halál Sőti Csaba, 2004 PT: nagy lizoszómák, enzimek az extracelluláris térbe
31
Receptor-mediált endocitózis Receptor: transzmembrán glikoprotein Membrán: burkos gödör (klatrin) Burkos vezikulum (klatrin ketrec) Eltávolítás: Hsp70 (ATP) Endoszóma: szortírozás (pH 5) reciklizáció vs. lizoszóma Lizoszóma: degradáció
Sőti Csaba, 2004
32
Receptor-mediált endocitózis
Receptor Fehérje
Példa transzferrin LDL EGF
Familiáris II. Hiperlipoproteinémia (LDL-receptor "hiány") KK: hiperkolesterinémia, ateroszklerózsi, trombózis, szívinfarktus, halál a 20-as évek elején PT: pl. LDL rec. mutáns nem internalizálódik Sőti Csaba, 2004
33
A vezikuláris transzport molekuláris mechanizmusa 1., vezikula kialakulás 2., leszakadás 3., burok depolimerizáció, transzport 4., vezikula fúzió
Sőti Csaba, 2004
34
A vezikula kialakulása
Sőti Csaba, 2004
35
A vezikuláris transzport molekuláris mechanizmusa 1., vezikula kialakulás: burokfehérjék Vezikula Burok/adapter fehérje G-fehérje Transzport iránya Klatrin klatrin/ AP1 ARF Golgi-endoszóma Plazmam.-endoszóma Golgi-lizoszóma, retrográd Golgi, Golgi-ER ER-Golgi
Vezikula tartalom: fehérjék burok-adapterkötő szekvenciák pl. KDEL receptor: KKXX, COP αβ kötés Sőti Csaba, 2004
2., vezikula leszakadás: dinamin GTPáz
36
A vezikuláris burok kialakulása
Mg2+, adapterek
Hsp70 ATPáz
klatrin triszkelion trimer Sőti Csaba, 2004
polimer 37
A vezikuláris burok SEM képe
Sőti Csaba, 2004
38
A vezikuláris transzport molekuláris mechanizmusa 4., vezikula fúzió prefúzió
GTP
NSF ATPáz
GTP
NSF, GDP
GTP
NSF: N-etil-maleimid szenzitív faktor SNAP: szolubilis NSFasszociált proteinek T-SNARE: target SNAP receptor
V-SNARE: vezikula SNAP receptor GTP Rab: kis G-fehérje
disszociáció Sőti Csaba, 2004
fúzió
39
Hogyan fertőz az influenza?
Sőti Csaba, 2004
40
A fehérjék végzete: nonszelektív degradáció A fehérjék élettartama: 30 s - 120 nap •
Rövid életű fehérjék: kulcsenzimek, ciklinek hibás, károsodott fehérjék
•
Hosszú életű fehérjék: pl. struktúrfehérjék
•
Membránfehérjék
•
Extracelluláris fehérjék
•
Éhezés, inaktivitás (Szelektív degradáció: kalpainok, kaszpázok) Sőti Csaba, 2004
Lebontó apparátus: Citoszolikus ATPfüggő rendszer
Lizoszóma
41
A citoplazmatikus fehérjebontás mechanizmusa 1., A halálra ítélt fehérjék megjelölődnek: (poli)ubikvitiniláció E1: ubikvitin aktivátor, E2, E3: fehérjespecifikus ligáz
2., A megjelölt fehérjéket a 26S proteaszóma lebontja, ATP hidrolízise szükséges, az ubikvitin felszabadul Sőti Csaba, 2004
42
A 26S proteaszóma szerkezete
ATP-függő, ubikvitin felismerő sapka
20S multikatalitikus proteáz
Sőti Csaba, 2004
43
Mi határozza meg a fehérjék életkorát? A./ Regulációs lebontás: 1., N-terminális szabály: N-terminális aminosavak ubikvitinilációs hajlama Stabilizáció (t1/2 > 30 óra)
Destabilizáció (t1/2 < 3 perc)
Met, Gly, Ala, Ser, Thr, Cys
Arg, Lys, Phe, Leu, Trp
2., PEST (pestis) hipotézis: belső, PEST-gazdag szekvenciák 3., egyéb szekvenciák B./ Hibás fehérjék lebontása: dajkafehérjék Sőti Csaba, 2004
44
Halhatatlan fehérjék - halandó emberek Konformációs betegségek Fehérje instabilitás - α−β konverzió Funkcióvesztés: hiánytünet a funkciót igénylő sejtekben Aggregáció: tünet a posztmitotikus sejtekben (neurodegeneráció) Fehérjetípus Betegség
Tünetek
Prion
Creutzfeld-Jacob kergemerha, stb.
dementia
Poli-Gln
Huntington-kór
dementia és mozgászavar
β-amiloid
Alzheimer-kór
dementia
α1-AT
májcirrhosis és emphysema
Antitrombin
trombózis
Sőti Csaba, 2004
45
Miért romlik fehérjéink egészségi állapota? Miért több a sorvasztó betegség? Mert: - nincs genetikai szelekció ("az emberiség degenerálódik") - hoszabb ideig élünk - dajkafehérjéink túlterheltek - és edzetlenek Megoldás: - dajkafehérjéink edzése: Sőti Csaba, 2004
STRESSZ!!! 46
Hogyan stresszelhetjük szervezetünket megfelelően? A hosszú élet titka folyamatos túlzott
STRESSZ
időleges enyhe
KOR
Sőti Csaba, 2004
47
Vizsgatételek A tRNS szerepe, szerkezete, aminoacil tRNS szintetázok, kodon-antikodon kapcsolat. A riboszóma ciklus, riboszómák szerkezete, a tRNS kötődése a riboszómákhoz a transzláció során. A transzláció iníciációs szakasza prokariótákban és eukariótákban. Az eIF2 faktor foszforilációjának szerepe a transzláció szabályozásában. A transzláció elogációs szakasza prokariotákban és eukariotákban, terminálás. A fehérje szintézis gátlószerei. A fehérjék glikozidációjának mechanizmusa. Poszttranszlációs módosulások. A fehérjék transzportja a sejten belül.
Sőti Csaba, 2004
48
