A sejtelmélet kialakulása párhuzamos a mikroszkóp fejlődéstörténetével
Élő állati sejtek megfigyelése Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) -elsőként figyelte meg és írta le pontosan a mikroorganizmusokat --egy lencséből, un. bolhalencséből álló mikroszkópot használt
Robert Hooke 1635-1703
Robert Hook 1635-1703 -fizika, kémia, meteorológia, geológia, csillagászat, biológia -az Angol Királyi társaság titkára -A sejt/cella/cellula szó megalkotója -Penészeket, protozoákat vizsgált -A fatest szerkezetét vizsgálta -Felismerte a szállítónyalábok szerepét
A sejt fogalma 1838-39 • Matthias Schleiden
Theodor Schwann
Omnis cellula e cellula – minden sejt sejtből lesz (1855) Rudolph Virchow (1820-1902)
• „All living things are made of cells. • The cell is the basic unit of all living things. • Cells only come from pre-existing cells. „
• Cellulár-patológia
Robert Hook mikroszkópja Az összetett mikroszkóp jellemzői szemlencse - okulár tárgylencse - objektív kondenzor lencse-kontrasztosságot biztosítja A nagyítás kiszámítása: okulár x objektív Nagy volt a torzítás, ezért a baktériumokat nem láthatta
Sejttan avagy citológia
elölt vagy élő?
A felbontóképesség
A citológia „klasszikus” vizsgálómódszerei mikroszkópia + mikrotechnika Normál fénymikroszkópia Fáziskontraszt mikroszkópia Polarizációs = II = DIC (differencia interferencia kontraszt m.) Fluoreszcens = II = Konfokális Lézer Scanning Mikroszkópia (CLSM) Elektronmikroszkópia transzmissziós (TEM) pásztázó vagy scanning (SCAM) analitikai (AEM)
Zsigmondy Richárd
Ultramikroszkóp 1903 Tyndall-jelenség: kolloidrészecskéket szuszpendálnak egy sötét hátterű, tartályban, majd a tartályt egy erős fénykúppal világítják meg oldalról úgy, hogy a fénykúp csúcsa a látómezőben legyen. A részecskék diffrakciósgyűrűrendszereket okoznak, amelyek a sötét háttér előtt fehér pettyekként tűnnek fel.
Világos látóterű mikroszkópia
Sötét látóterű mikroszkópia
Nem látjuk a mintát
A minta „felvillan”
Festet t sejt
Festetl en sejt
A. A sejt festett része csökkenti a fényhullám amplitúdóját, a normál fénymikroszkópban így alakul ki a kép. B. A fény az eltérő sűrűségű anyagokon áthaladva eltérő időkben (fázisokban) lép ki. A fény fázisok közti különbségeket teszi látható intenzitáskülönbséggé a fáziskontraszt mikroszkóp .
FÁZISKONTRASZT MIKROSZKÓP
Epiteliális sejt
neutrofil granulocita
FÉNYMIKROSZKÓP
(Metilénkék)
(May-Grünwald-Giemsa)
Spazmonéma helix Kontrakció: 40% ms alatt Sebesség: 8 cm/s Negative töltések
Semlegesítés Ca2+-vel
Polarizáció: a fény terjedése a térnek csak egy meghatározott síkjában lehetséges ilyen megvilágításban az anizotróp (kettős törő) struktúrák különlegesen viselkednek (szabályos biológiai szerkezetek: izom, kollagén rostok, csont, porc alkotóelemei)
Fluoreszcens Mikroszkópia A fluoreszcens mikroszkópia legfontosabb alkalmazási területe a különböző makromolekulák térbeli és időbeli elhelyezkedésének vizsgálata sejt/szövet szinten. Használják még többek között fehérje interakciók vizsgálatára, de a sejten belüli pH és ionkoncentrációk meghatározására is.
Fluorokróm – Természetes vagy szintetikus, fluoreszcenciára képes molekula. A fluorokrómok delokalizált elektronrendszere felelős a specifikus abszorbcióért és emisszióért.
A fluoreszcens mikroszkóp felépítése
Mikroszkópia: múlt és jelen vékonybél keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés
vékonybél keresztmetszet, immunofluoreszcens festés
Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia
A konfokális mikroszkóp segítségével a hagyományos fluoreszcens mikroszkópnál mélyebben lehet behatolni a sejtekbe/szövetekbe. A mintát lézer gerjeszti pontonkként, x-y irányban pásztázva. Az emittált fotonokat egy fotoelektron sokszorozó detektálja A mintából vékony optikai metszetek sorozatát készítjük, ugyanis a detektor előtti csapnyílások kiszűrik a más fókuszsíkokból jövő zavaró fluoreszcenciát. Az optikai metszetekből a vizsgált minta háromdimenziós szerkezete számítógéppel meghatározható.
a konfokális mikroszkóp fényútja fókuszban levő emittált sugár lézer
fotoelektron fotoelektron sokszorozó sokszorozó detektor detektor detektor csapnyílás
fókuszon kívüli emittált sugarak dikroikus tükör objektív minta
fókuszsíkok
gerjesztő sugár
Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp
A fénymikroszkóp különböző fajtái Emberi epiteliális sejtek FM: Festetlen: a fény áthalad a mintán - kis kontraszt
FM: Festett, de fixált ( nem élő) preparátum
Fluoreszcens mikroszkóp: a fluoreszcens festék elnyeli az UV és kibocsátja a látható fényt
Fáziskontraszt mikroszkóp: élő, festetlen preparátum törésmutató különbségen alapul Interferencia differenciál mikroszkóp Konfokális mikroszkóp: fluoreszcens festék + lézerfény
A felbontóképesség növelése A képalkotáshoz nem látható fényt, hanem elektronsugárzást használunk.
Transzmissziós elektronmikroszkóp TEM
Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM)
Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM) Elektron sugár
Első kondenzor lencse Kondenzor apertúra Második kondenzor lencse Objektív apertúra Pásztázó tekercs Erősítő/Detektor OBJEKTÍV
MINTA
Visszavert elektronok
Másodlagos elektronok
SCEM
Nem elég a feloldóképesség! --- megfelelő preparációs eljárásokkal kell megőrizni, kontrasztot fokozni vagy szelektíven jelölni. Az anyag feldolgozásának lépései
Fixálás (kémiai (aldehidek, pl.formalin) vagy fizikai (fagyasztás) Mosás (fixálószer eltávolítás) Víztelenítés (a beágyazó anyag ált. hidrofób) Beágyazás (tartást ad, paraffin/FM-re, műgyanta/EM-re) Metszés (mikrotomokkal)
Fénymikroszkópra
Paraffinos sorozatmetszés kerekes mikrotom
kriosztát
Festés
Tartósítás - Fedés
Citológiai festések Savas + bázikus (hematoxilin-eozin) Bázikus (toluidinkék, „Nissl”) Redukció (ezüstimpregnáció) Metakromázia
Hematoxilin-eozin kettős festés
Az általános magés citoplazma festés
Toluidinkék
Nissl festés krezilibolyával
Ezüstimpregnáció
Metakromázia
Amikor valami nem festődik ilyen egyszerűen………… Pl. Nyák Lipidcsepp Myelin
………………és jött a biokémia! In vitro vagy in situ? Citokémia
Nyálka – szénhidrát - PAS
Lipid
Elektronmikroszkópra Ultramikrotóm
Itt a „tárgylemez” a mikrostély vagy grid! Meglehetősen kicsi……. a preparátum pedig vékony…
Hogy is van ez? FM: 5-10 µm metszet EM vizsgálat előtt tájékozódásra : 0,5-1 µm – ún félvékony metszet EM-re 50-90 nm ultravékony metszet
Az EM anyag különlegessége: kettős fixálás Aldehid + ozmium(utóbbi a membránok egyes alkotóihoz köt – alapkontrasztot ad) Kontrasztosítás vizsgálat előtt: további nehézfémsókkal (ólomsók, uranilsók)
FM (balra) és TEM kép (jobbra)
részletgazdagságána k összehasonlítása
Hepatocyták
SEM (balra) és TEM kép (jobbra) összehasonlítása
Hepatocyták
FUSA/NEUROSCIENCE/CALCIU M/CalciumLab.html
Nehézfém árnyékolás Miozin
Kromatin
A számítógépes képfeldolgozás példája: álszínezés
Riboszómák
Fagyasztva törés (balra) és fagyasztva maratás (jobbra) összehasonlítása
cellbio.utmb.edu/cellbio/nucpore4.jpg
cellbio.utmb.edu/cellbio/nucpore5.jpg
A Golgi EM kimutatása • Fagyasztva törés – TEM
A Golgi EM kimutatása • TEM metszet
Fáziskontraszt mikroszkóp
A mitokondriumok fénymikroszkóppal is kimutathatók Paraffinos metszet félvékony metszet
Mitokondrium, fagyasztva maratás
Harántkrisztás mitokondriumok,
TEM
Kehelysejtek:
FM metszet (bal), TEM metszet (jobb), SEM (bal)
M
N N= nucleus, M = mucinogén szemcék GYTK
Specifikus jelölések: az immunreakció - immuncitokémia
Az antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló kimutatási módszerek alaptípusai Direkt módszer
Indirekt módszer Jelzés Secunder ellenanyag Primer ellenanyag
Antigén Az antigén leggyakrabban fehérje. A jelzés lehet: enzim – ami majd látható csapadékot termel (ált. barna vagy kék) fémszemcse – pl. arany fluoreszcens anyag – ún. kromofor pl. Alexa, Cy, FITC néven
---Enzimes
Arany-----
Fluoreszcens
…….és ha szeretnénk ÉLŐ sejteket vizsgálni, mit tehetünk? Válasszunk bizonyos mikroszkópokat/üzemmódokat -
Fáziskontraszt Polarizációs DIC
Válasszunk in vivo festések Normál fénymikroszkópra: Neutrálvörös – lizoszóma Janus zöld – mitokondrium Metilénkék – mag Tus – citoplazma fagocitózissal DE Leggyakrabban fluoreszcens festékkel – fluoreszcens mikroszkópra (permeabilizálással, mikroinjektálva, vezikulába zárva, ami fuzionál a sejtmembránnal, vagy észteresítéssel amfipatikussá alakítva)
Manipulációs tér Nagyobb munkatávolság A sztereomikroszkóp Az inverz mikroszkóp
Nukleinsav-festések DAPI (2,4 diamidino-2-fenilindol) magfestés (Hoechst – kék, könnyeben diffundál) (propidium-jodid –piros lenne)
Akridin-orange Egy festék, két emissziós tartomány RNS-tartalmú citoplazma piros DNS tartalmú mag zöldessárga
Sejtszervecskékre jellemző fehérjékhez kötnek: Lysotracker - lizoszóma
Mytotech - mitokondrium
• Membránpotenciál változás töltésmegoszláson alapuló próbákkal. • Ionkoncentráció alakulása a sejtben: indikátor festékek Pl. FURA-2 Zöld: ic. Ca++ cc nő
Egysejt jelölés – nyomjelző molekulák bejuttatása / tracerek Pl. Lucifer yellow, biotin – immunreakcióval előhívni
….és jött a molekuláris biológia……… In situ hibridizáció: nukleinsavhoz jelölt nukleinsav darabot (próbát) kötünk, hibridizáltatunk Mire jó? -gének keresése -mRNS mennyiség mérése – génexpresszió mértékének ismerete
Miért in situ? -Mert a szövetben, a sejtben zajlik, mikroszkóppal láthatóvá tehető/vizualizálható.
GFP (zölden fluoreszkáló fehérje/green fluorescent protein génjét inzertáljuk a sejtbe, a keresett fehérjénk génje mellé
-Fúziós fehérjéket fejeztetünk ki – látjuk a célfehérje megjelenését, mennyiségét -Jó modellszervezetek: Saccharomices cerevisiae Caeonorrhabditis elegans Drosophila melanogaster Mus musculus
FISH fluorescent in situ hibridization
Meghatározott DNS szekvenciát keresünk fluoreszcens kromoforral jelölt próbával
Aequoria victoria
K+-csatorna + GFP
• És az utolsó megfontolások: • -gyakran egy jelöléssel indítunk be egyegy folyamatot a sejtben (pl. szignál transzdukciót… • - a sejtek in vivo általában szöveti kötelékben fordulnak elő – viselkedésük és morfológiájuk izolálva eltérő
A XXI. században: Morfológia, biokémia, molekuláris biológia, fejlődésbiológia, fiziológia mikrobiológia
a sejttan/citológia ma már SEJTBIOLÓGIA (funkcionális mikromorfológia)
