A plazminogén metilglioxál módosítása csökkenti a fibrinolízis hatékonyságát Léránt István, Kolev Kraszimir, Gombás Judit és Machovich Raymund Semmelweis Egyetem Orvosi Biokémia Intézet, Budapest
Fehérjék poszttranszlációs módosítása a Diabetes Mellitus (DM) késõi szövõdményei kialakulásában fontos szerepet játszhat. DM következtében a keringésében a metilglioxál (MGX) egy reaktív α-keto-aldehid – koncentrációja megemelkedhet1. MGX hatására a fehérjék lizin, arginin, valamint cisztein oldalláncai módosulhatnak2. Vizsgálataink szerint MGX hatására módosult plazminogénbõl képzõdõ plazmin csökkent fibrinolítikus aktivitást mutat3. In vivo, a metilglioxál számtalan molekulával kerülhet kapcsolatba, a DM késõi szövõdményei kialakulásában játszott szerepét az in vivo rendszert megközelítõ rendszerben célszerû vizsgálni.
Munkánk során humán plazmát inkubáltunk metilglioxállal. •
Vizsgáltunk, a plazma metilglioxál kezelése miként befolyásolja aprotrombin idõ, aktivált parciális tromboplasztin idõ értékeket.
•
Tanulmányoztuk, a MGX kezelés hogyan befolyásolja a plazminogén izolálására használt lizin-Sepharose 4B affinitás kromatográfiát.
•
Összehasonlítottuk a MGX módosított, valamint a normál plazmából izolált plazminogén aktivációs kinetikáját.
•
Vizsgáltuk, hogy a csökkent fibrinolítikus aktivitás kialakulása, melyik molekuláris tényezõ – plazminogén, fibrinogén, antitrombin – MGX hatására bekövetkezõ módosulásával magyarázható.
1
P. J. Thornalley, N. I. Hooper, N. I. Jennings, C. M. Florkowski, A. F. Jones, J. Lunec, A. H. Barnett, The human red blood cell
glyoxalase system in diabetes mellitus, Diab. Res. Clin. Pract. 7 (1989) 115-120.
2
A. S. Krolewski, J. H. Warram, L. I. Rand, C. R. Kahn, Epidemiologic approach to the etiology of type I diabetes mellitus and its
complications, N. Engl. J. Med. 317 (1987) 1390-1398.
3
István Léránt, Krasimir Kolev, Judit Gombás and Raymund Machovich: Modulation of plasminogen activation and plasmin
activity by methylglyoxal modification of the zymogen Biochim. Biophys. Acta 1480: 311-320, 2000
0.50
MGX plazma
Extinkció
0.40
Kontroll plazma
0.30 0.20 0.10 0.00 0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20
Frakciószám
1. ábra. Metilglioxál kezelés hatása a plazminogénnek Lizin-Sepharose 4B affinitás kromatográfiával történõ elõállítására. Humán plazmát 20 oC-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10 mM) inkubáltunk. Az elõkezelt plazmát, illetve kontroll plazmát (20 ml) Lizin-Sepharose 4B gyantával (25 ml) kevertettük 1 órán át. Az aspecifikusan kötött fehérjék mosását követõen a plazminogént lineáris grádienssel [ε-aminokapronsav 0-10 mM] eluáltuk.
0.350 0.300
Extinkció
0.250 0.200 0.150 0.100
Kontroll plazma
0.050
MGX plazma
0.000 0
5
10
15
20
Aktivációs idõ [perc]
2. ábra. Humán plazma metilglioxál kezelésének hatása a plazmából izolált plazminogén streptokináz aktivációs kinetikájára Humán plazmát 20 oC-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10 mM) inkubáltunk. A metilglioxál-kezelt, illetve a kontroll plazmából izolált plazminogént (1 µM) streptokinázzal (100 U/ml) inkubáltuk 37 oC-on. A jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl), majd SpPL szintetikus szubsztráttal (100 µM, 200 µl) mértünk a plazmin amidolitikus aktivitását.
Maradék plazmin aktivitás [%]
100 80 60
Kontroll
40
MGX kezelt plazma
20 0
0
20
40
60
Inkubációs idõ [perc]
3. ábra. Plazma metiglioxállal történõ kezelésének hatása a plazmin antitrombin inaktivációs reakciójára Humán plazmát 20 oC-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10 mM) inkubáltunk. A metilglioxál-kezelt, illetve a kontroll plazmából izolált plazminogént streptokinázzal aktiváltuk. A plazmint (1 µM) antitrombinnal (2 µM) inkubáltuk 37 oC-on, a jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl), majd SpPL szintetikus szubsztráttal (100 µM, 200 µl) mértünk a plazmin amidolitikus hatását.
Maradék plazmin aktivitás [%]
100 90 80 70
Plazmin [P]
60
100 uM MGX P
50
P + AT
40
100 uM P + AT
30
10 uM MGX P + AT
20 10 0 0
10
20
30
Inkubációs idõ [perc]
4. ábra. Plazminogén in vitro metilglioxál módosításának hatása a plazmin – antitrombin inaktivációra. Plazminogént [P] (5 µM) 37 oC-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10, 100 µM) inkubáltunk. Dialízist követõen a plazminogént streptokinázzal aktiváltuk. A plazmint (1 µM) antitrombinnal [AT] (2 µM) inkubáltuk 37 oC-on. A jelzett idõpontokban mintát vettünk és SpPL (100 µM) szintetikus szubsztrát segítségével meghatároztuk a maradék plazmin aktivitást.
Maradék plazmin aktivitás [%]
100 90 80 70 60
Plazmin [P]
50
P + kontroll AT
40
P + 100 uM MGX AT
30
P + 10 uM MGX AT
20 10 0 0
5
10
15
20
25
30
Inkubációs idõ [perc]
5. ábra. Antitrombin in vitro metilglioxál módosításának hatása a plazmin inaktivációra. Antitrombint [AT] (5 µM) 37 oC-on 1 órán át kezeltünk metilglioxállal [MGX] (10, 100 µM). A dialízist követõen a kezelt antitrombint [AT] (2 µM) 37 oC-on plazminnal [P] (1 µM) inkubáltuk. A jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl) és SpPL (100 µM) szintetikus szubsztrát segítségével meghatároztuk a maradék plazmin aktivitást.
Maradék trombin aktivitás [%]
100 80 Trombin [T]
60
T+ kontroll AT T+100 mM MGX AT
40
T+ 10 um MGX AT
20 0 0
10
20
30
Inkubációs idõ [perc]
6A. ábra. Antitrombin metilglioxál módosításának hatása a trombin inaktivációjára.
Maradék trombin aktivitás [%]
Trombin aktivitás SpTH szubsztráton: Antitrombint [AT] (2 µM) kezeltünk 1 órán át 20 oC-on metilglioxállal [MGX] (10, 100 µM). A dialízist követõen trombint (1 µM) inkubáltunk 37 oC-on a kontroll, illetve módosított antitrombin oldatokkal. A jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl) és 100 µM SpTH-nal (200 µl) mértünk a minták maradék trombin aktivitását.
100 80 Trombin [T]
60
T+ kontroll antitrombin T+ 100 uM MGX AT T+ 10 uM MGX AT
40 20 0 0
5
10
15
20
Inkubációs idõ [perc]
6B. ábra. Antitrombin metilglioxál módosításának hatása a trombin inaktivációjára. Mérési körülmények, mint 6A., csak SpTH szubsztrát helyett fibrinogént (2 mg/ml) használtunk.
[Metilglioxál] 0 6 µM 60 µM 600 µM 6 mM
Lízis idõk(50%) átlaga ± SD x 100.9 101.5 105.0 106.0 124.5
SD 3.5 4.5 1.0 4.5 3.5
1. táblázat. Metilglioxállal módosított fibrinogénbõl képzett fibrin alvadék lízise Fibrinogént [2 g/l] módosítottunk 37 oC-on 1 órán át metilglioxál oldattal. A dialízist követõen 360 µg fibrinogénbõl 1 U/ml trombinnal a microplate küvettába alvadékot képeztünk. Az alvadék felszínére plazmin oldatott (2 µM) rétegeztünk, a fibrinolízis sebességét az alvadék ún. lízis idejével(50 %) jellemeztük.
[Metilglioxál] 0 6 µM 60 µM 600 µM 6 mM
Lízis idõk(50%) átlaga ± SD x 96.0 104.0 111.0 136.0 oo
SD 2.0 0.5 0.9 7.5
2. táblázat. Metilglioxállal módosított plazmin hatása a fibrin alvadék lízis idejére (50 %) Plazminogént [2 µM] módosítottunk 37 oC-on 1 órán át metilglioxállal. A dialízist követõen a plazminogént streptokinázzal (1000 U/ml) aktiváltuk. A keletkezett plazmin aktivitását a fibrinolízis (360 µg fibrinogénbõl képzõdött alvadék) lízis idejével(50 %) jellemeztük.
Eredmények és megbeszélés
Humán plazma 10 mM MGX-lal 1 órán történõ inkubációja nem befolyásolta a plazma protrombin idõ, aktivált parciális tromboplasztin idõ értékeit. Csökkentette az affinitás kromatográfiás eljárással a plazmából izolálható plazminogén mennyiségét. Az elúció során jelentkezõ minor plazminogén pool arra utal, hogy az izolált plazminogénben a lizin-kötõhely szerepét betöltõ domainek módosulhatnak (1. ábra). Az affinitás kromatográfiás eljárással preparált plazminogén streptokinázzal történõ aktivációjának sebessége, valamint az amidolitikus aktivitást mutató plazmin molekulák hányada csökken az MGX kezelt plazmából származó preparátum esetében (2. ábra). A plazmin - antitrombin inaktiváció sebessége fokozódik MGX kezelésre akkor, ha (i) MGX kezelt plazmából izolált plazminogénbõl aktivált plazmint (3. ábra), (ii) in vitro MGX –lal módosított plazminogénbõl aktivált plazmint (4. ábra) vizsgáltunk. Nincs különbség a plazmin – antitrombin inaktiváció sebességében akkor, ha MGX-módosított antitrombint alkalmaztunk a reakció során (5. ábra). Az antitrombin MGX módosítása nem befolyásolta a trombin – antitrombin inaktiváció folyamatát sem (6. és 7. ábra). Fibrinogén MGX módosítása nem befolyásolta a trombin fibrinogén alvasztási reakciót. A MGXfibrinogén kölcsönhatás nem befolyásolja az MGX-módosított fibrinogénbõl készült fibrinháló plazmin hatására bekövetkezõ oldásának sebességét (1. táblázat).
Ugyanakkor jelentõsen
növekedett a fibrinháló oldási sebessége MGX-kezelt plazminogénbõl aktivált plazmin jelenlétében (2. táblázat).
Eredményeink szerint rendkívül rövid inkubációs idõ – 60 perc – során MGX jelenlétében kialakulnak azok a módosulások, melyek következtében csökkenhet a plazminogén kötõdése a fibrin hálóhoz, aktivációjának sebessége, illetve a fibrinolízis hatékonysága. Vizsgálataink arra utalnak, hogy a fibrinogén, az antitrombin bár módosulhat MGX hatására, ezek nem befolyásolják az alvadási (trombin – fibrinogén) reakciókat, illetve a trombin – antitrombin inaktivációt. Plazminogén módosulása következtében esetleg fiziológiai szerepet kaphat a plazmin – antitrombin reakció is. Kapott eredményeink a DM során kialakuló trombotikus történések okaként a metilglioxálnak a fibrinolítikus rendszer hatékonyságát csökkentõ hatását valószínûsítik.
