A molekuláris biológia eszközei I. Nukleinsavak az élő szervezetekben Reverz transzkripció
replikáció
DNS
transzkripció
DNS
transzláció
RNS
Fehérje
DNS • feladata: információ tárolása és a transzkripció szabályozása • helye eukariótáknál: sejtmag + mitokondriumok(15-100 kbázis) RNS • fajtái: mRNS (hnRNS), tRNS, rRNS, ribozimok • feladata: fajtánként más Fehérjék: (enzimek, szerkezeti fehérjék, receptorok, stb.) Nukleinsavakkal kapcsolatos fontosabb enzimek: • polimerázok, nukleázok, ligáz • foszfatázok, kinázok, (proteinázok)
II. Replikáció
• DNS polimeráz (DNS függő DNS polimeráz, irány: 5’→ 3’, RNS primer az elején, repair) • dNTP-k (dATP, dCTP,dGTP,dTTP) • Puffer (pl. Tris vagy foszfát; megfelelő pH, pl. 7.2, megfelelő sókoncentráció: Na+, Mg2+) • Ligáz (Okazaki fragmentumok)
III. Transzkripció
• RNS polimeráz (DNS függő RNS polimeráz, irány: 5’→ 3’) • Transzkripciós faktorok (fehérjék) • NTP-k (ATP, CTP, GTP, TTP) • Puffer (pl. Tris vagy foszfát; megfelelő pH, pl. 7.2, megfelelő sókoncentráció: Na+, Mg2+)
III. Transzkripció 2. (génműködés/szabályozás, a laktózoperon működése) Represszor fehérje
*
*
*
Laktóz
RNS polimeráz
Fogalmak: + Glükóz •operon(több génből álló működési egység) •iniciátor/promóter régió •pozitív és negatív szabályozás: •transzkripciós faktor (itt a CAP fehérje) (cAMP kell a fehérje kötődéshez, + Glükóz ami nincs, ha van glükóz) + Laktóz •represszor fehérje/gén az operátor régióhoz kötődik • {fokozó (enhancer) régió } - Glükóz Lac operon működése: + Glükóz : a represszorfehérje képződik, + Laktóz
hozzákötődik a laktózbontó enzim génjének operátor régiójához gátolva ennek átíródását + Laktóz : laktóz jelenlétében a represszor fehérjét a laktóz kititrálja, így elvileg íródhatna a laktózbontó enzim génje, de az átíráshoz a CAP fehérje és cAMP is szükséges, ami csak glükóz hiányában teljesül
* Represszor fehérjét kódoló gén
IV. Reverz transzkripció (retrovírusok)
Reverz transzkriptáz
RNS
Rnáz H
DNS-RNS heteroduplex
DNS polimeráz
DNS
Integrálódás a gazdasejt genomjába
DNS-DNS duplex
• Reverz transzkriptáz (RNS függő DNS polimeráz, irány: 5’→ 3’) • Rnáz H aktivitás (heteroduplex hasítás) • dNTP-k (dATP, dCTP,dGTP,dTTP) • Puffer (pl. Tris vagy foszfát; megfelelő pH, pl. 7.2, megfelelő sókoncentráció: Na+, Mg2+)
V. mRNS érés, Transzláció mRNS szerkezete
• prokarióták / eukarióták (élesztő), exonok / intronok • mRNS érés (splicing, alternatív splicing, hibás szabályozás → betegségek) • poli A farok, 5’-CAP (fordított irányú metilált G) • in vitro transzlációs rendszerek, (fehérjeszintézis gátlásának vizsgálata, GFP, Green Fluorescent Protein)
VI. Enzimek, mint molekuláris biológiai eszközök Nukleázok Közös bennük, hogy a nukleinsavak foszfodiészter kötéseit képesek hasítani.
Típusok • Exonukleázok(polimerázoknak is van ilyen aktivitásuk) • Endonukleázok • DNázok, RNázok Exonukleázok • A nukleinsavat a végéről kezdik el hasítani. • Különböző helyeken hasíthatnak, így a termék is különböző lehet (Pl. S1 nukleáz egyszálú DNS-t v. RNS-t hasít, 5’-foszfát termékek képződnek; Snake Venom Phosphodiesterase, SVPD hasonló) • Nukleinsavak lebontásos vizsgálata (+foszfatázok használata)
VI. Enzimek Restrikciós endonukleázok 1. Endonukleázok 1960-as évek H. Smith, W. Arber, D. Nathans
Funkció • Gazdaspecificitás (a prokariótáknál vették észre, hogy meg tudja különböztetni a szervezet a saját és idegen DNS-t) -> • Baktérium védekező mechanizmusa: saját DNS metilálása, idegen DNS hasítása • Kettős szálú DNS mindkét szálának hasítása • Általában 4-8 bázis hosszú felismerő/hasító hely (ált. palindrom szekvencia) • Hasítás után tompa/egyenes vagy ragadós vég (blunt end, sticky end) • 5’-foszfát és 3’-OH marad a hasítás után mindkét szálon (van kivétel! NciI) • Elnevezés (baktérium után amiből izolálták + római számok időrendben Hinf I, EcoRI)
Típusok (Az enzimek nevében a római szám nem az enzim I. II. vagy III. típusára utal, hanem csak arra, hogy időrendben mikor fedezték fel. Ez két teljesen független dolog semmi közük egymáshoz.)
• I. és III. Felismerés specifikus, de a hasítás nem. Ahányszor látja az enzim a felismert szekvenciát hasít egyet, de véletlenszerűen akárhol (tandem enzim: metiláz és nukleáz egyben) • II. Specifikus felismerőhely és ott vagy attól nem messze, de pontosan meghatározott helyen hasít. (Nem tandem enzim, ezért szétválasztható a metiláz és nukleáz.)
VI. Enzimek Restrikciós endonukleázok 2. Példák SmaI
...GGG CCC... ...CCC GGG...
...GGG ...CCC
XmaI
...G GGCCC... ...CCCGG G...
...G ...CCCGG
GGCCC... G...
...GG ...CC
CC... GG...
...G ...CTTAA
AATTC... G...
BSpRI, HaeIII
EcoRI
...GG CC... ...CC GG... ...G AATTC... ...CTTAA G...
CCC... GGG...
VI. Enzimek Restrikciós endonukleázok 3. Példák HpHI
...GGTGANNNNNNN N... ...CCACTNNNNNNN N...
HinfI
...G ANTC... ...CTNA G...
HindIII
...GTPy PuAC... ...CAPu PyTG...
...GGTGANNNNNNN N... ...CCACTNNNNNNN N...
...G ...CTNA
...GTPy ...CAPu
ANTC... G...
PuAC... PyTG...
N: akármilyen bázis lehet; Pu: csak purin bázis lehet (A, G); Py: csak pirimidin bázis lehet (C, T)
VI. Enzimek Egyéb fontos enzimek • Ligáz (DNS összeragasztása, 5’-foszfát és 3’-OH szükséges hozzá) • Kinázok, foszfatázok (foszfát bevitele/levágása) • Proteinázok, (+Rnázok, Dnázok) → DNS/RNS/fehérje tisztítási műveleteknél használhatók
VII. Klónozás • célok, lehetőségek, eszközök
• baktériumok, mint munkafelület
VII. Klónozás DNS hordozók = Klónozó vektorok Klónozó vektorokkal szemben támasztott követelmények: • önállóan replikálódjon • be lehessen vinni élő sejtbe (transzformálható legyen) • legyenek markerek benne (szelekciós lehetőség)
1. Plazmid vektorok Plazmid • önálló osztódásra képes • kis méretű • extrakromoszómális • kettős szálú DNS gyűrű • feladatuk általában egy-két, a baci számára fontos gén hordozása (pl. antibiotikum rezisztenciagének) • bizonyos baktériumok pl. klóramfenikollal kezelve úgy osztódnak, hogy CSAK a plazmid osztódik, de a genomi DNS nem! • Ca2+ tartalmú oldattal kezelve a baci sejtek transzformálhatók plazmidokkal (~ 0.1%)
baktérium
Genomi DNS gyűrű
VII. Klónozás Plazmidvektor felépítése Rezisztenciagén 1.
Markergén 2.
Replikációs origó Restrikciós hasítóhelyek
VII. Klónozás
1. DNS emésztése 2. plazmidok hasítása 3. ligálás (rekombináns plazmid DNS)
4. transzformálás
VII. Klónozás
5. Szelekció 1
6. Szelekció 2 (Pl. β-galaktozidáz gén sérül, ha sikeres volt a klónozás, a DNS bekerült a plazmidba -> fehér színű telep.)
VII. Klónozás
Lehetőségek: • klóntárak készítése • adott gének kikeresése, majd klónozása, sokszorozása • a klónozott gén vizsgálata • fehérjék termeltetése (in vitro transzlációs rendszerben vagy baciban→”kiválasztás”)
VII. Klónozás 2. Vírus vektorok (fágok, λ-fág) Előnyök: • nagyobb méretű DNS Klónozható (75-106%) (8-20 kbázis) • jobb transzformáció (~10%) Hátrány: • pl. minimális méretű klónozandó DNS szükséges
VII. Klónozás 3. Kozmidok • Olyan vektor, ami plazmidként és fág DNS-ként is tud viselkedni, mert van benne replikációs origó a plazmidként történő szaporodáshoz, de van benne olyan szekvencia (‘cos’ hely), ami a fágfehérjébe történő bepakolódáshoz kell. • Így baciban könnyen szaporítható és vírusként lehet vele transzformálni. • Beépíthető akár 40 kbázis idegen DNS is.
4. Élesztő (YAC=Yeast Artificial Chromosomes) • Élesztősejtekben szaporodni képes vektor, amibe akár 100 kbázis nagyságú idegen DNS is bevágható. • Rendelkezik replikációs kezdőponttal (ARS: Autonomously Replicating Sequence) • Van benne centromer régió (CEN) és telomer végek, amik szintén a replikációhoz szükségesek • Élesztő DNS rész, ami helyettesíthető (max. 100 kbázis) • LEU2 régió (szelekciós marker → leucinmentes táptalajon csak a transzformált sejtek nőnek ki). • Léteznek élesztő-baktérium vektorok is.
VIII. cDNS könyvtárak
…AAAAAAA
affinitás krom.
…AAAAAAA
szil. hordozóhoz kötött poliT v. mágneses szeparálás
…AAAAAAA …AAAAAAA
…AAAAAAA T
…AAAAAAA T TTT
…AAAAAAA
TTT
TT
rRNS, tRNS, m RNS
Reverz transzkriptáz
TT TT
TT
Rnáz H / lúgos hidrolízis
…AAAAAAA
TTTT
TTTT
RNS-ek a sejtből
TT
TT
csak m RNS-ek
DNS polimeráz Klónozás, Vizsgálat
m RNS
DNS-RNS heteroduplex
DNS
DNS-DNS duplex
