Sejtmag, kromatin
A következő 2 előadás diái mind a számonkért anyag részei
Hoechst
BrdU+anti-BrdU
A sejtmag funkciói • tárolja és védi a kromoszómákba szervezödött DNS-t • külön kompartmentet képez • transzkripció helye • replikáció itt zajlik • … • …
A sejtmag funkciói • tárolja és védi a kromoszómákba szervezödött DNS-t • külön kompartmentet képez • transzkripció helye • replikáció itt zajlik • repair és rekombinációs folyamatok • riboszómák gyártása a nukleoluszban
A sejtmag kompartmentalizációjának szerepe
A sejtmag szerkezete • fénymikroszkóp
• transzkripció és transzláció különválása • exon-intron struktúra kialakulása • az exonok, és ezen keresztül a protein domének szabad kombinációja • → az eukarióta világ evolúciójának motorja
– legnagyobb sejtalkotó (5-10 µm) – kromatin állomány – nukleolusz
• EM – – – – –
eukromatin, heterokromatin intranukleáris „szuborganellumok” kettős magmembrán határolja nukleáris mátrix nukleoplazma
Kromatin állomány
Kromatin állomány
• a nukleinsavak és a hozzá kapcsolódó fehérjék a magban: DNS, RNS, hisztonok, hiszton variánsok és nem-hiszton fehérjék (szabályozó fehérjék, átíró-, replikációs- és repair-apparátus fehérjéi) • eukromatin és heterokromatin (fakultatív, konstitutív)
• a nukleinsavak és a hozzá kapcsolódó fehérjék a magban: DNS, RNS, hisztonok, hiszton variánsok és nem-hiszton fehérjék (szabályozó fehérjék, átíró-, replikációs- és repair-apparátus fehérjéi) • eukromatin és heterokromatin (fakultatív, konstitutív)
Diploid emberi sejt: • • • •
6.2 pg DNS 2 x 3000 Mb 46 kromoszóma átlagosan 4-5 cm DNS egy kromoszómában • ~ 2 m DNS egy sejtben – Kompaktálódás foka: kb. 10000x
A génsűrűség a kromoszómák mentén fluktuál • Gén-denz régiók: RIDGEs (regions of increased gene expression), 10 – 30 gén / 20- 200 kb • Hatalmas gén-szegény területek: antiRIDGEs.
Különböző sejtek DNS tartalma:
Visualization of repetitive elements based on sequence information
Tm, reasszociációs kinetika, hibridizáció, ismétlődő szekvenciák
Különleges DNS struktúrák előfordulása
Dotplot Sequence A RNS
Sequence A
Hairpin
R-loop etc.
G4-DNS
Hierarchikus csomagolódási elv
A kromatin elemi szerkezeti egysége a nukleoszóma
exonok átlagos mérete
• átlagosan 200 bp DNS-t tartalmaz • 5 féle hiszton fehérje építi fel (+speciális hisztonok) • nukleoszóma magja (core partikulum): 146 bp DNS és 2-2 db H2A, H2B, H3 és H4 hiszton fehérje • internukleoszómális összekötő DNS (linker régió): H1-nal fedett DNS és fedetlen, változó hosszúságú DNS szakasz
Elektron spektroszkópiás analízis: 10 nm-es rostok még heterokromatinon belül is!
↓ ionerősség, bivalens ionok és H1 hiánya
Protease which degrades histones
nucleus
4 nm DNS duplaspirál
nukleoszomális „gyöngysor”
30 nm rost (?) DNS Sepsis: the dark side of histones Catherine Chaput & Arturo Zychlinsky Nature Medicine 15, 1245 - 1246 (2009)
Hadlaczky Gyula, SzBK
50-100 kb hurok mely a S/MAR szekvenciáknál rögzített a matrixhoz
A szuperhelicitás génszabályozó szerepe:
A hurkokon belül szuperhelicitás, melynek mértéke változik a transzkripció folyamán
Angelman szindróma gyógyítható az egészséges de elhallgattatott allél szuperhelicitásának változtatásával!
As a result of a process dubbed imprinting, the paternal copy of UBE3A is normally silenced in neurons, and the protein is only expressed from the maternally inherited copy.
Szuperhelicitás regulációja: topoizomerázok mérgeik: citotoxikus szerek
Top I: egyszál hasítás majd re-ligáció
Top II: duplaszál hasítás, majd religáció Often classified as an autism spectrum disorder (ASD), Angelman syndrome is marked by developmental delay, lack of speech, seizures and motor difficulties.
Kihorgonyzódás: mag mátrix
A mag mátrix preparálása • Nukleoszkeleton • nuclear lamina - lamin A, B, C • S/MAR: scaffold/matrix associated/attached regions
• detergens kezelés • nukleáz emésztés • hisztonok eltávolítása magas só koncentráció mellett – só extrakció után is funkcionális komplexek – azonban…
Kromoszómák • osztódási ciklus fázisától függően: – interfázisos – metafázisos
Kariogramm
- a metafázisos sejt kromoszóma állománya:
• speciális: – lámpakefe (meiotikus, kétéltű oocyta) – polytene (Drosophyla)
Kromoszóma festés
2 x 22 autoszomális és 2 ivari kromoszóma
Azonos testvér kromatidák
• Q sávok
kondenzinek:
– quinakrin festés
kromoszóma kondenz.
• G sávok – proteolitikus kezelés utáni Giemsa-festés
• R sávok – forró alkalikus kezelés utáni Giemsa-festés
kohezinek: Metafázis kromoszóma
>200 fehérje
Másodlagos befűződés (nukleólusz organizátor)
testvér kromatid kapcs.
Fig. 2 Changes in cohesin association with chromatin during mitosis. During G2 sister chromatids are held together by cohesin. Upon entry into mitosis, most of the arm cohesin is removed, sister chromatids, resolve and condense. After attachment of kinetochores to microtubules emanating from opposite spindle poles, centromeric cohesin is cleaved by separase and sister chromatids are segregated in anaphase. Images show chromosomal DNA marked with H2B-GFP. Scale bar 5µm
Chromosome Research, Volume 19, Number 3, 307-319
Fig. 1 Model for chromosome condensation. a Upon prolonged arrest with spindle poisons mitotic chromosomes become hypercondensed. DAPI staining of chromosome spreads of unarrested (left) and nocodazole arrested (right) cells. b Model for chromosome condensation mediated by topo II, c condensins and d histone modifications. Scale bar 5µm
Chromosome Research, Volume 19, Number 3, 307-319
Interphase
Rend a magban
Heterokromatin Eukromatin
(SZEMINÁRIUM) R-sávok G- ill. Q-sávok
Magvacska (nukleolusz)
Kompartmentalizáció a magban
GC FC DFC rDNA
rRNS
A kromoszómák lehetséges elhelyezkedése az interfázisos magban
INTERFÁZISOS KROMOSZÓMA TERRITÓREUMOK
FISH BrdU-pulse
néhány osztódás
……..
anti-BrdU
„Transzkripciós gyárak”
RNA immunoFISH
haemoglobin β-chain complex 25 Mb távolságban (chr. 7)
erythroid associated factor RNA polymerase II
Dr. Balázs Margit felvétele
2 µm
672 | SEPTEMBER 2005 | VOLUME 6 www.nature.com/reviews/genetics
Replikációs „gyárak” nucleozid-analóg inkorporáció: az S-fázis előrehaladásával változó sztérikus mintázat
korai S
mid S
késői S
NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 6 | SEPTEMBER 2005 | 669
Figure 4 | Organizer factory. Clustered RNA polymerase II motor proteins organize genes and distal regulatory elements by using non-coding intergenic transcription. Rather than polymerases sliding along chromatin, chromatin moves through the factory that is powered by the energy released by the hydrolysis of nucleotide triphosphates during elongating RNA synthesis. Black arrows, gene promoters; blue arrows, direction of chromatin movement; LCR, locus control region; red arrows, intergenic promoters. Chakalova et al., NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 6 | SEPTEMBER 2005 | 669
Dextrane
chromatin overlay
Nukleáris “szuborganellumok” (testek)
Dextrane chromatin
• EM: nucleolus • EM ill. (auto)antitestek: – speckle – coiled body (Cajal) – PML, PML/RAR – Transzkripciós és replikációs gyárak – Polycomb testecskék – Repair fókuszok Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules Verschure et al., EMBO reports VOL 4 | NO 9 | 2003, 861
Mi a bepakolódás funkcionális következménye??
Chromosome conformation and transcriptional activity are affected by the association of chromosomal regions with peripheral or central subcompartments.
Interakcióra lehet lehetőség: nincs van
Meggátolja a hurkokon belüli és hurkok közötti interakciókat!
Association of chromosomal regions with peripheral or central subcompartments. (a) The nuclear lamina and adjacent nuclear space, (b) nuclear pore complexes, (c) a nucleolus, where ribosomal DNA loci from different chromosomes cluster, (d) a transcription factory, where coregulated genes preferentially colocalize, and (e) a polycomb body. The filled gray region represents a CT that is interacting with both a and c.
Gene Recruitment Sequences (GRS) target the gene to the nuclear periphery. Nat Cell Biol. 2010 February; 12(2): 111– 118.
Rajapakse I , Groudine M J Cell Biol 2011;192:711-721
© 2011 Rajapakse and Groudine
„Vázak” kapcsolódása: fantázia rajzon…
…és megfigyelések alapján: modell a SUN proteinek–közvetítette kapcsolatról a citoplazmatikus aktin filamentumokkal
Haque F et al. J. Biol. Chem. 2010;285:3487-3498
©2010 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
• Intranukleáris kompartmentalizáció – – – –
eukromatin és heterokromatin korán és későn replikálódó kromatin magvacska (nukleólusz) és kompartmentjei egyéb nukleáris szuborganellumok: speckle, PML-test, coiled (Cajal) body, ... – interfázisos kromoszoma territóreumok – replikációs ill. transzkripciós “gyárak”
Makromolekulák mozgása a magban
SPT
Elsődlegesen diffúzióval
Different classes of mean square displacement of tracked nuclear vimentin particles. a) Mean squared displacement (MSD) of four representative modes of particle mobility (x-axis: acquisition time in seconds; y-axis: MSD). Roman numbers: I) confined diffusion; II) obstructed diffusion; III) normal diffusion; IV) directed motion (The numeration refers to indicated trajectories in Figure 3a). b) The four different mobility classes are represented by particle trajectories. The trajectories correlate to the numbers indicated by arrows in Figure 3a. Bacher et al. BMC Cell Biology 2004 5:45 doi:10.1186/1471-2121-5-45
mRNS Kromoszóma territóriumok Dr. Anna Szeles, Karolinska Institutet, Stockholm
Dynamics of single mRNP nucleocytoplasmic transport and export through the nuclear pore in living cells. Moret al., Nature Cell Biology VOLUME 12 | NUMBER 6 | JUNE 2010
A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Shyam B. Khatau et al., PNAS November 10, 2009 vol. 106 no. 45 19017–19022
