A humán ABCG2 fehérje dimerizációjának tanulmányozása pontmutánsok segítségével Doktori értekezés
Dr. Polgár Orsolya Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Váradi András tudományos főmunkatárs, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Csanády László egyetemi tanársegéd, Ph.D. Dr. Marcsek Zoltán osztályvezető, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Falus András egyetemi tanár, akadémikus Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Sarkadi Balázs osztályvezető főorvos, akadémikus Dr. Buday László egyetemi docens, D.Sc.
Budapest 2006.
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke………………………………………………………….………...3 Bevezetés………………………………………………………………………………..5 A multidrog rezisztencia jelensége………………….……………………..……5 Az ABC transzporter fehérjecsalád……………………………………..…........5 Az ABCG2-t kódoló gén és a fehérje…………………………………………...7 Az ABCG2 és az őssejtek……………………………………………………….8 Az ABCG2 szubsztrátjai és inhibitorai………………………...……………….9 A transzporter szerepe a klinikumban................................................................13 Az ABCG2 fehérje szerkezete…………………………………..…….…….....15 Az ABCG2 polimorfizmusai..............................................................................18 Célkitűzések....................................................................................................................20 Módszerek......................................................................................................................22 Eredmények és megbeszélésük......................................................................................30 1. A GXXXG motívum szerepe az ABCG2 fehérjében.................................................30 A GXXXG motívum .........................................................................................30 A GXXXG motívum az ABCG alcsaládban......................................................31 A GXXXG mutánsok expressziója HEK 293 sejtekben....................................32 A mutánsok funkciójának és felszíni expressziójának vizsgálata......................34 A G406L/G410L mutáns ATP-áz aktivitása......................................................36 Kémiai keresztkötési vizsgálatok.......................................................................37 Mitoxantron kezelés hatása a GXXXG mutánsokra...........................................39 A 402-es treonin vizsgálata a dimerizáció tekintetében.....................................40 Következtetések………………………………………………………………..41 A TM5 szerepe az ABCG fél-transzporterek és orthológjaik............................43 dimerizációjában A G553L mutáns expressziója HEK 293 sejtekben...........................................44 A G553L mutáns sejten belüli lokalizációjának vizsgálata................................47 A mutáns vizsgálata keresztkötő reagensekkel..................................................48 A G553L mutáns expressziója rovarsejtekben...................................................49
1
A G553E mutáns................................................................................................54 Következtetések………………………………………………………………..55 3. A számítógépes ABCG2 modell tesztelése pontmutánsok segítségével....................56 A modell jelentősége és létrehozása...................................................................56 A modell tesztelése pontmutánsok segítségével.................................................58 Következtetések………………………………………………………….. ……60 Összefoglalás..................................................................................................................61 Summary.........................................................................................................................62 Irodalomjegyzék.............................................................................................................63 Saját publikációk jegyzéke.............................................................................................76 Köszönetnyilvánítás........................................................................................................78
2
Rövidítések jegyzéke ABC
ATP-kötő domén (ATP Binding Cassette)
ABCG2
ABCG2 multidrog transzporter, az ABCG alcsalád második tagja
ABCP
placenta-specifikus ABC fehérje (placenta-specific ABC protein)
ALL
akut limfoblasztos leukémia
AML
akut mielogén leukémia
BCRP
emlőrák drogrezisztencia fehérje (breast cancer resistance protein)
BSA
marha szérum albumin (bovine serum albumin)
CAPS
3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid
cDNS
komplementer DNS
CFTR
cisztikus fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)
DPBS
Dulbecco féle foszfáttal pufferolt sóoldat (Dulbecco's phospahte buffered saline)
DSG
disuccinimidyl glutarate
DSP
dithiobis(succinimidyl propionate)
DSS
disuccinimidyl suberate
DTT
ditiotreitol
ER
endoplazmás retikulum
FBS
szarvasmarha szérum (fetal bovine serum)
FTC
fumitremorgin C
GFP
zöld fluoreszcens fehérje (green flourescence protein)
HEK 293
humán embrionális vesesejt (human embryonic kidney)
Hst
Hoechst 33342
ICD
intracelluláris domén
MBS
m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester
MDR1
multidrog rezisztencia fehérje vagy P-glikoprotein (multidrug resistance protein, P-glycoprotein)
3
MRP1
multidrog rezisztenciához társuló fehérje 1 (multidrug resistanceassociated protein 1)
MX
mitoxantron
MXR
mitoxantron rezisztencia fehérje (mitoxantrone resistance protein)
PCR
polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction)
P-gp
P-glikoprotein
PMSF
fenilmetilszulfonil-fluorid
PVDF
polivinilidén-difluorid
SDS
sodium dodecyl sulfate
SNP
egyszerű nukleotid polimorfizmus (single nucleotide polymorphism)
SP
side population
TAP
antigén processzáló transzporter (transporter associated with antigen processing)
TBS
Tris-szel pufferolt sóoldat (Tris-buffered saline)
TM
transzmembrán szegmens
TMD
transzmembrán domén
vt
vad-típus
4
Bevezetés A multidrog rezisztencia jelensége A
fejlett
országokban,
köztük
hazánkban
is,
a
kardiovaszkuláris
megbetegedések után a rákos betegségek állnak a mortalitási statisztikák élén. Az egyre újabb kemoterápiás szerek bevezetése és a kiterjedt kutatások ellenére mind a mai napig a rákkal diagnosztizált betegek közel felénél a megbetegedés öt éven belül halálhoz vezet. Ezen előnytelen statisztikák hátterében az elégtelen prevenció és a kései diagnózis mellett a kemoterápiás szerek iránt kialakuló rezisztencia tekinthető az egyik legfontosabb tényezőnek. A rákos sejtek számos módon képesek ellenállni a kemoterapeutikumok toxikus hatásainak, melyek közül az ABC transzporter fehérjék által közvetített úgynevezett multidrog rezisztencia jelensége az egyik legintenzívebben tanulmányozott. Az ABC transzporter fehérjecsalád Az ABC (ATP-binding cassette) transzporterek alkotják az egyik legnagyobb ma ismert fehérjecsaládot, melynek tagjai gyakorlatilag minden fajban megtalálhatók. A humán genomban 48 ABC transzportert kódoló gént azonosítottak (Dean, 2001), melyeket felépítésük és szekvenciájuk hasonlósága alapján hét alcsoportba lehet besorolni (ABCA-ABCG). Közös jellemzőjük a megközelítőleg 200 aminosavból álló nukleotid-kötő domén (NBD), amely tartalmazza a más ATP-kötő fehérjékben is megtalálható Walker A és Walker B konszenzus szekvenciákat, valamint a csak ABC transzporterekre jellemező úgynevezett C signature motívumot. Ezen fehérjék másik fontos strukturális eleme a szubsztrátkötő helyeket is tartalmazó transzmembrán domén (TMD), amely egy tipikus ABC transzporter esetében 12, egyenként 20-25 aminosavból álló transzmembrán szegmensből (TM) épül fel. A TMD és az NBD összekapcsolását, és nagy valószínűséggel a kettő közötti kommunikációt a TMD részét képező úgynevezett intracelluláris domén (ICD) biztosítja (Reyes, 2005). Működésük jellege alapján a fehérjecsalád tagjai között találhatók transzport fehérjék, ioncsatornák
és
plazmamembránban,
receptorok,
sejten
endoplazmás
belüli
lokalizációjuk
retikulumban,
mitokondriumban elhelyezkedőket különböztethetünk meg.
5
alapján
pedig
peroxiszómában
vagy
A humán ABC transzportereket kódoló gének közül jelenleg 17-ről ismert, hogy valamilyen megbetegedés pathomechanizmusában közvetlen szerepet játszik (Dean, 2005), ilyenek pl. a Tangier betegség (ABCA1), a Stargardt betegség (ABCA4), a Dubin-Johnson szindróma (ABCC1/MRP1), a pseudoxanthoma elasticum (ABCC6) vagy a sitosterolaemia (ABCG5/ABCG8). Az ABC transzporterekkel kapcsolatba hozható betegségek közül talán a legismertebb és legkiterjedtebben tanulmányozott a mukoviszcidózis, vagy más néven cisztás fibrózis, amely az egyik leggyakrabban előforduló örökletes megbetegedés (Riordan, 1989). A mukoviszcidózis kialakulásáért az ABCC7/CFTR gén mutációi tehetők felelőssé, melyek közül leggyakrabban az 508as aminosav delécióját okozó fordul elő. A genetikai megbetegedések mellett a korábban említett kemoterápiás szerekkel szemben kialakuló multidrog rezisztencia jelenségében játszanak jelentős szerepet az ABC transzporterek (Gottesman, 2002). Ezért a jelenségért elsősorban a fehérjecsalád három tagja tehető felelőssé, mégpedig a P-glikoprotein (ABCB1/MDR1), az MRP1 (ABCC1) és az ABCG2. Mindhárom fehérje a sejtek plazmamembránjában elhelyezkedő transzporter, melyekre igen széles és részben egymást átfedő szubsztrátspecificitás jellemző. A három fehérje közül elsőként, idén éppen 30 éve a Pglikoprotein (P-gp) került leírásra (Juliano, 1976). A több évtizeden át folytatott számos klinikai tanulmány ellenére a mai napig nem teljesen tisztázott a P-gp klinikai jelentősége és az általa okozott rezisztencia kialakulásának megelőzési módszerei, annak ellenére, hogy szubsztrátjai között olyan a mindennapi gyakorlatban használt kemoterápiás gyógyszerek vannak, mint a topotekán, a vinblasztin, a vinkrisztin, a doxorubicin és a taxol. Az említett három multidrog transzporter közül a legkevesebb klinikai adat egyelőre az ABCG2-vel kapcsolatban áll rendelkezésünkre, tekintettel arra, hogy a három közül ezt a fehérjét azonosították legfrissebben, a 1990-es évek végén. Érdekességként megemlítendő, hogy három munkacsoport (köztük az is, melyben az ezen dolgozat alapjául szolgáló kísérletek készültek) közel egy időben írta le, és három különböző névvel látta el a fehérjét, úgymint BCRP (emlőrák drogrezisztencia fehérje, breast cancer resistance protein, Doyle, 1998), MXR (mitoxantron rezisztencia fehérje, mitoxantrone resistance protein, Miyake, 1999) és ABCP (placenta-specifikus ABC fehérje, placenta-specific ABC protein, Allikmets, 1998). A humán gén nevezéktan bizottság (Human Gen Nomenclature Committee)
6
hivatalos elnevezésül az ABCG2-t jelölte meg, melyből kiderül, hogy az ABCG alcsalád második tagjáról van szó. Ennek ellenére az irodalomban gyakran BCRP néven található meg a fehérje. Az ABCG2-t kódoló gén és a fehérje Az ABCG2 fehérjét kódoló gén a 4-es kromoszóma hosszú karján helyezkedik el (4q22), több mint 60 kilobázis hosszú, 16 exonból valamint 15 intronból áll, és egy 72 kDa tömegű, 655 aminosavból álló fehérjét kódol (Knutsen, 2000). Az ABCG2 gén promóterében nincs TATA box, ugyanakkor számos Sp1, AP1 és AP2 kötőhelyet tartalmaz (Bailey-Dell, 2001). Kifejeződésének pontos szabályozási mechanizmusa még nem ismert, ezidáig a nemi hormonokat (Ee, 2004; Imai, 2005; Tanaka, 2005; Yasuda, 2005; Wang 2005) és a hipoxiát (Krishnamurthy, 2004) írták le, mint az expressziót befolyásoló tényezőket. Citogenetikai vizsgálatokkal a magas ABCG2 fehérjeszinttel jellemzett, különféle kemoterápiás szerekkel szelektált karcinóma sejtvonalakban a 4-es kromoszómát érintő génátrendeződések, a gén amplifikációja, a 4-es és 7-es kromoszóma közötti kiegyensúlyozott transzlokáció, valamint az úgynevezett double minute kromoszómák voltak azonosíthatók (Knutsen, 2000; Rao, 2005). Az ABCG2 fehérje eredetileg multidrog rezisztens karcinóma sejtvonalakban került leírásra, melyet követően számos tanulmány tárgya volt szöveti megoszlásának, és a normál szövetekben betöltött funkciójának jellemzése. A lokalizációra vonatkozó vizsgálatok
során
időnként
egymásnak
ellentmondó
eredmények
születtek.
Mindenesetre több vizsgáló egyértelműen leírta a fehérje jelenlétét a placentában, a vékony- és vastagbélben, a májban, a központi idegrendszerben (a vér-agy gátban), a herében,
az
ováriumban
és
az
érfalban
mind
Northern
blottal,
mind
immunhisztokémiai eljárásokkal (Doyle, 2001; Maliepaard, 2001; Fetsch, 2005). Az elvégzett kísérletek alapján a polarizált sejtekben az ABCG2 az apikális membránban helyezkedik el (Maliepaard, 2001). Az ABCG2 fehérje expressziójának ezen normál szövetekben tapasztalt megoszlása nagyban valószínűsíti a transzporter szerepét az endogén és exogén káros anyagokkal szembeni védekezésben, bár ezidáig a transzporter fiziológiás szubsztrátjai nem kerültek azonosításra. A placentában látott különösen magas szint a magzat toxikus hatásokkal szembeni védelmében játszott
7
szerepre utal. Ugyanakkor érdekes megemlíteni a laktáció során kimutatott magas ABCG2 szintet az emlő mirigyállományában, ami a más szövetekben feltételezettekkel ellentétben éppen az anyatejes csecsemő fokozott expozícióját vonhatja maga után az ABCG2 által transzportált toxikus anyagok tekintetében (Jonker, 2005; van Herwaarden, 2006). Az ismertetett szöveti megoszlás felhívja a figyelmet a fehérje potenciális jelentőségére a szubsztrátjaiként ismert, orálisan adott gyógyszerek felszívódásában
és
az
általa
transzportált
gyógyszerek
szervezeten
belüli
disztribúciójában is (Cascorbi, 2006). Ebben az értelemben az ABCG2 egy kétélű fegyvernek tekinthető, hiszen jelenléte korlátozhatja a felszívódást, ugyanakkor a központi idegrendszert és a magzatot védheti a káros mellékhatásoktól. Az Abcg2 knock-out egerek életképesek, fertilisek, és az első leírások szerint teljesen egészségesek voltak. Később azonban a knock-out egerek egy csoportjánál magas klorofill tartalmú diéta mellett, fény hatására jelentkező nekrotikus léziókat figyeltek meg, elsősorban a fülön (Jonker, 2002). A jelenség hátterében minden bizonnyal a klorofillnak és bomlástermékeinek ABCG2 hiányában kialakult fokozott felszívódása áll. Ez a megfigyelés tovább valószínűsíti a fehérje káros hatásokkal szembeni védekezésben betöltött szerepét. Az ABCG2 és az őssejtek Néhány évvel ezelőtt írták le először az ABCG2 fehérje jelenlétét a haemopoetikus őssejtek felszínen, ezen belül is az őssejtek side population-nek (SP) elnevezett frakciójában. Ez a csontvelő sejtjeinek kb. 0.05%-át kitevő, őssejtekben igen gazdag populáció Hoechst 33342-vel (Hst) nem festődő szubpopulációként különül el az áramlási citométerben (Goodell, 1996; Goodell, 1997). A fenotípusért minden valószínűséggel az ABCG2 transzporter jelenléte tehető felelőssé. A Hoechst 33342 fluoreszcens festék szintén szubsztrátja a P-glikoproteinnek, de a P-gp deficiens egerekben normál SP sejtek figyelhetők meg, kizárva ezzel ennek a transzporternek a szerepét az SP frakció létrehozásában (Zhou, 2001; Uchida, 2002). Az ABCG2 őssejtekben való jelenléte ismételten a toxikus hatások elleni védekezésben játszott szerepre irányítja a figyelmet. Egyes feltételezések szerint azonban az alacsony differenciáltsági állapot fenntartása érdekében van jelen a fehérje, és pumpál ki az őssejtekből egy, a differenciálódáshoz szükséges anyagot (Zhou, 2001). Az őssejtek
8
iránt az utóbbi időben tanúsított nagy érdeklődés reflektorfénybe helyezte az ABCG2 fehérjét, számos csoport vizsgálja a transzporter őssejtekben betöltött szerepét, és a témával kapcsolatban szinte naponta jelenik meg újabb közlemény. Érdemes azonban megemlíteni, hogy, ellentétben a szakirodalomban látható tendenciával, az ABCG2 expresszió dokumentálása egy rákos sejtvonalban nem feltétlenül egyenlő az őssejtek jelenlétével, sok esetben pl. korábbi drog expozíció eredményének tudható be. Az őssejtek ABCG2 által mediált Hoechst transzporton alapuló azonosítása áramlási citométerben valóban fontos és viszonylagosan egyszerű technika, arra azonban lényeges felhívni a figyelmet, hogy az ABCG2 jelenléte se nem szükséges, se nem elégséges az őssejtek kialakulásához. Ez utóbbi megfigyelést támasztja alá, hogy a knock-out egerekben jelentős fejlődési rendellenesség nem észlelhető, és az állatok normál haemopoetikus őssejt állománnyal rendelkeznek. Az ABCG2 szubsztrátjai és inhibitorai Hasonlóan
a
multidrog
rezisztenciában
szerepet
játszó
többi
ABC
transzporterhez, az ABCG2 fehérje is széles szubsztrátspecificitással rendelkezik, és számos inhibitora ismert. Mind a szubsztrátok, mind az inhibitorok tekintetében jelentős átfedés található a P-glikoproteinnel és az MRP1-el. Az ABCG2 által transzportált
molekulákról
általánosságban
elmondható,
hogy
nagyméretűek,
hidrofóbok, lehetnek pozitív és negatív töltésűek. Vannak közöttük kemoterápiás szerek, fluoreszcens festékek, antivirális szerek, antibiotikumok, HMG-CoA reduktáz inhibitorok, egyes élelmiszerekben is megtalálható ismert karcinogének és egyéb a természetben előforduló anyagok, de olyan a mindennapi klinikai gyakorlatban régóta használt gyógyszerek is, mint a cimetidin, a folsav, vagy a szulfaszalazin (Robey, 2006). Az endogén szteroidok között is nagy valószínűséggel vannak az ABCG2 által transzportált vegyületek, de az erre vonatkozó közlemények egyelőre ellentmondásosak (Janvilisri, 2003; Imai, 2003; Pavek, 2005; Suzuki, 2003). Mivel az ABCG2-t multidrog
rezisztens
karcinóma
sejtvonalakban
azonosították,
először
a
kemoterapeutikumok között előforduló szubsztrátjai váltak ismertté, ezek közül is elsőként a mitoxantron (Miyake, 1999). Ezt követően az ABCG2-t expresszáló sejtekben keresztrezisztenciát írtak le antraciklinekkel, etopoziddal, topotekánnal, irinotekánnal és az utóbbi SN-38 nevű metabolitjával szemben (Nakagawa, 1992;
9
Kellner, 1997; Yang, 1995; Chen, 1999; Rabindran, 1998; Allen, 1999). A fehérje képes transzportálni továbbá a flavopiridolt (Robey, 2001), egyes topoizomeráz gátlókat (Komatani, 2001) és a metotrexátot (Volk, 2002), valamint az ígéretes, új rákellenes gyógyszercsoportba tartozó, specifikus tirozin kináz inhibitorok közül az imatinibet és a gefitinibet. Ez utóbbi két vegyület egyúttal a protein kompetitív inhibitora is (Elkind, 2005; Burger, 2004; Yanase, 2004). Az említett szerek közül néhánnyal, így pl. az antraciklinekkel kapcsolatban, hasonlóan a fluoreszcens festék rhodamin 123-hoz, a későbbiekben ellentmondásos eredmények születtek, ugyanis a vad-típussal transzfektált emlős sejtek nem voltak képesek ezeket a molekulákat kipumpálni. Ma már ismert, hogy ennek az ellentmondásnak a hátterében a 482-es aminosav különböző variánsai állnak (Honjo, 2001). A vad-típusú ABCG2 esetében ebben a pozícióban arginin található, szemben az egyes drog-szelektált sejtvonalakban előforduló glicinnel vagy treoninnal. Mint kiderült, az imént említett „ellentmondásos vegyületeket“ csak a mutáns verziók transzportálják. Későbbi tanulmányokból világossá vált, hogy ezek a mutációk csak gyógyszeres szelekció hatására jönnek létre, ezen a helyen egyszerű nukleotid polimorfizmus (single nucleotide polymorphism, SNP) nem fordul elő. Ami érdekes, hiszen a mutáns változatokra a vad-típusénál is szélesebb szubsztrátspecificitás jellemző, ami szelekciós előnyt jelenthetne. A jelenség hátterében feltételezhető, hogy az arginin jelenléte elengedhetetlen egy ezidáig azonosítatlan, ám a szervezet szempontjából fontos szubsztrát transzportjához, hasonlóan a metotrexátéhoz, melyet csak a vad-típus képes a sejtekből kipumpálni. Szintén ennek az aminosavnak a jelentőségére hívja fel a figyelmet, hogy egerekből származó drog-szelektált karcinóma sejtvonalakban is előfordulnak hasonló mutációk a 482-es argininnek megfelelő pozícióban
(Allen, 2002). Több kutatócsoport
tanulmányozta mélyrehatóan ennek az aminosavnak a szerepét, és azt figyelték meg, hogy helyettesítése gyakorlatilag bármely nem pozitív töltésű aminosavval, a glicint és treonint hordozó sejtvonalakéhoz hasonló szélesebb szubsztrátspecificitást eredményez (Özvegy-Laczka, 2005/A; Miwa, 2003). A számítógépes predikciós programok szerint ez az arginin a harmadik transzmembrán szegmens citoplazmikus felszínéhez közel helyezkedik el, és az említettek alapján az érintett szubsztrátok megkötésében vagy transzlokációjában lehet szerepe.
10
A szubsztrátok közül érdemes kiemelni még a feoforbid a-t (Jonker, 2002), tekintettel arra, hogy ezt a fluoreszcens porfirin vegyületet nem transzportálja sem a Pglikoprotein, sem az MRP1, ezáltal az ABCG2-t tőlük könnyen elkülöníthetővé teszi áramlási citometriás vizsgálatokban (Robey, 2004). Az 1. táblázatban a ma ismert szubsztrátok és inhibitorok átfogó listája található. Az inhibitorok közül először a fumitremorgin C-t (FTC) azonosították, mint ABCG2-re specifikus gátlószert. Az első jelentések erről a szerről még akkor születtek, 1. táblázat A humán ABCG2 szubsztrátjai és inhibitorai. A *-al jelölt vegyületek transzportját érintik a 482-es mutációk (Robey, 2006).
Szubsztrátok
Inhibitorok
kemoterápiás szerek: mitoxantron BBR3390 58 antraciklinek* Daunorubicin* Doxorubicin* Epirubicin* bizantrén* flavopiridol etopozid* tenipozid kamptotekinek 9-aminokamptotekin topotekán irinotekán SN-38 SN-38 glükoronid diflomotekán* (gyenge) homokamptotekin* (gyenge) DX-8951f (gyenge) BNP1350 (gyenge) indolokarbazolok: J-107088 NB-506 UCN-01 folsav antagonisták: metotrexát*,metotrexát di*- és triglutamát* GW1843* tomudex* tirozin kináz gátlók: imatinib gefitinib CI1033 egyéb vegyületek: antivirális szerek: zidovudin (AZT)
diketopiperazinok: fumitremorgin C Ko143 triprosztatin A indolil diketopiperazinok szteroidok és szteroidszerű vegyületek: kortikoszteron digoxin beklometazon 6-alfa-metilprednizolon dexametazon triamkinolon mometazon ciklezonid antivirális szerek: ritonavir saquinavir nelfinavir immunszupresszánsok: tacrolimus sirolimus Ciklosporin A piridines and dihidropiridinek: niguldipin nicardipin nitrendipin dipiridamol nimodipin DHP-014 tirozin kináz gátlók: gefitinib imatinib EKI-785 CI1033 P-glikoprotein inhibitorok: elacridar (GF120918)
11
lamivudin HMG-CoA reduktáz gátlók: rosuvasztatin pitavasytatin cerivasztatin karcinogén anyagok: aflatoxin B1 2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]quinolin 3-amino-1,4-dimetil-5H-pirido[4,3-b]indol 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo(4,5-b) piridin porfirinok: feoforbid a pirofeoforbid a metil-észter klorin e6 protoporpfirin IX fuoreszcens anyagok: rhodamin 123* Lysotracker zöld* BODIPY-prazosin Hoechst 33342 flavonoidok: genistein quercetin glükuronid, glutation és szulfát konjugátumok: benzo[a]pirén-3-szulfát (BP3S) benzo[a]pirén-3-glükuronid (BP3S) ösztron-3-szulfát 4-metilumbelliferon szulfát 4-metilumbelliferon glükuronád 6-hidroxi-5,7-dimetil-2-metilamino-4-(3piridilmetil)benzotiazolglükuronid (E3040) dehidroepiandroszteron szulfát (DHEAS) 17-β-esztradiol szulfát acetaminophen szulfát benzimidazolok: albendazol szulfoxid oxfendazol pantoprazol antibiotikumok: ciprofloxacin ofloxacin norfloxacin erythromycin dirithromycin rifampicin nitrofurantoin dihidrotesztoszteron szulfaszalazin fenetil izotiocianát dipiridamol ochratoxin A GV196771 folsav cimetidin ME3229
12
tariquidar (XR9576) biricodar* (VX-710) flavonoidok: chrysin biochanin A benzoflavon 6-prenylchrysin tectochrysin naringenin quercetin acacetin kaempferol szilimarin heszperetin daidzein rezveratrol genistein naringenin-7-glükozid benzimidazolok: pantoprazol omeprazol oxfendazol ösztrogének, ösztrogén agonisták és antagonisták: 17-béta-esztradiol ösztron dietilstilbösztrol tamoxifen toremifene TAG-11 TAG-139 taxánok: ortataxel* tRA96023* tRA98006* flavopiridol UCN-01 novobiocin*
amikor maga a fehérje még nem volt ismert, de az FTC gátolta a P-gp-t és MRP1-et nem expresszáló sejtvonalak multidrog rezisztenciáját. A későbbiekben kiderült, hogy a jelenség hátterében az ABCG2 fehérje gátlása állt (Rabindran, 1998). Kísérletekben gyakran használt specifikus ABCG2 inhibitor még az FTC-analóg Ko143 (Allen, 2002). Hasonlóan a szubsztrátokhoz az inhibitorok esetében is sok olyan van, amelyik egyúttal a P-glikoproteint, az MRP1-et, vagy mindkettőt gátolja. Legtöbbjük éppen ezen tulajdonságuk miatt került kipróbálásra mint ABCG2 inhibitor. Ilyenek pl. az elakridar, a tarikvidar, vagy a ciklosporin (de Bruin, 1999; Robey, 2004; Lee, 1997). Az inhibitorok jelentős csoportját képezik a flavonoidok, köztük a szilimarin, a heszperetin, a rezveratrol, stb. (Cooray, 2004). A flavonoidok közül némelyik a fehérje szubsztrátjaként is viselkedik, ami kompetitív inhibitor szerepet valószínűsít (Morris, 2006). Tekintettel arra, hogy az említett flavonoidok sok élelmiszerben előfordulnak, a vékonybélben való jelenlétük révén módosíthatják a szubsztrátok között szereplő orális gyógyszerek felszívódását. Az utóbbi időben több kutatócsoport fordított hangsúlyt új ABCG2 inhibitorok azonosítására. A potens, specifikus és alacsony toxicitású inhibitoroknak jelentősége lehet az ABCG2-t eleve hordozó, illetve a szubsztrátokkal való előzetes kezelés hatására a fehérjét expresszáló drog-rezisztens tumorok terápiájában. Emellett a fehérje gátlása elősegítheti a szubsztrátként szereplő gyógyszerek enterális felszívódását. Valószínűleg a P-glikoprotein inhibitorokkal látott kudarcokra való tekintettel, mely részben a szerek toxicitására, részben pedig a rosszul tervezett tanulmányokra vezethető vissza, ezidáig az ABCG2 inhibitorok még nem kerültek klinikai kipróbálásra. Az inhibitor kipróbálás késlekedésében az is jelentős szerepet játszik, hogy a mai napig ellentmondásosak az ABCG2 klinikumban betöltött szerepét célzó vizsgálatok eredményei. A transzporter szerepe a klinikumban A szakirodalomban számos tanulmány található, amely az ABCG2 klinikai jelentőségével foglalkozik a rákos sejtek multidrog rezisztenciájának tekintetében. A legtöbb adat a transzporter leukémiában betöltött potenciális szerepére vonatkozóan található, ám ezek a vizsgálatok elég ellentmondásosak. Egyes vizsgálók pl. magas
13
expressziót találtak (Ross, 2000; Suvannasankha, 2004; Galimberti, 2004) akut mielogén leukémiában (AML), míg mások nem tudták kimutatni az ABCG2-t az AMLel diagnosztizált betegekből származó mintákban (van Der Kolk, 2002; van Der Pol, 2003; Abbott,2002). Ennek megfelelően a fehérje jelenlétének a prognózisra vonatkozó predikciós értéke is egyelőre ellentmondásos ebben a betegségben. Az AML-ben látottakhoz hasonlóan akut limfoblasztos leukémiában (ALL) is egyelőre tisztázatlan az ABCG2 által betöltött szerep (Stam, 2004; Sauerbrey, 2002). Többen vizsgálták az ABCG2 transzporter jelentőségét szolid tumorok esetében is, ahol szintén egymásnak ellentmondó eredmények születtek. Az egyik ilyen tanulmány
pl.
34
immunhisztokémiai
parafinba vizsgálatával
ágyazott,
különböző
mindössze
egy,
a
szöveti
eredetű
vékonybélből
minta
származó
adenokarcinóma esetében igazolta a fehérje jelenlétét (Scheffer, 2000). Ugyanakkor egy másik vizsgáló csoport szintén parafinba ágyazott tumorokban gyakori ABCG2 expressziót írt le (Diestra, 2002). Ezeknek az ellentmondásoknak a hátterében nagy valószínűséggel a nem standardizált detekciós módszerek, illetve az alkalmazott eljárások (PCR, áramlási citometria, immunohisztokémia, stb.) közötti szenzitivitási különbségek állnak. Az említett ellentmondások ellenére valószínű, hogy az ABCG2 fehérje fontos szerepet játszik a klinikai multidrog rezisztenciában, amit elsősorban az támaszt alá, hogy humán karcinóma sejtvonalak esetén bizonyítottan képes a jelenség létrehozására. Ugyanakkor korábban láttuk, hogy az ABCG2 szubsztrátjai közé a kemoterápiás szerek mellett számos más gyógyszercsoportba tartozó vegyület is tartozik (1. táblázat), melyek farmakokinetikájában lehet klinikai jelentősége a transzporternek. Ezek közül a kompetitív inhibitorként viselkedő szubsztrátok emelendők ki, amelyeknek a gyógyszerkölcsönhatások tekintetében juthat lényeges szerep. A fejezet végén lesz szó a
transzporter
polimorfizmusairól,
melyek
a
szubsztrát
vegyületek
farmakokinetikájában látott egyéni különbségekre szolgálhatnak magyarázatul. A genetikai polimorfizmusokon alapuló, egyénre szabott gyógyszeres terápia kifejlesztése egy új, és várhatóan igen gyorsan fejlődő területe az orvostudománynak.
14
Az ABCG2 fehérje szerkezete Az ABCG2 fehérje, hasonlóan az ABCG alcsalád többi tagjához úgynevezett fél-transzporter. Jelenlegi tudásunk szerint ahhoz, hogy egy ABC transzporter működőképes legyen legalább két transzmembrán (TMD) és két nukleotid-kötő doménre (NBD) van szükség (Berkower, 1999), melynek tipikus példája a több mint 1200 aminosavból álló P-glikoprotein. Ezzel szemben a 655 aminosavból felépülő ABCG2 fehérje mindössze egy-egy ilyen domént tartalmaz, melyeknek sorrendje fordított a P-gp-nél is látott hagyományosnak tekintetthez képest, azaz az NBD helyezkedik el N-terminálisan, és C-terminális a TMD. Ennek a fordított doménszerkezetnek a jelentősége ezidáig nem ismert. Az ABC fél-transzportereknek homo-, vagy heterodimerizálódniuk kell ahhoz, hogy transzport funkciót tudjanak ellátni. A dimerizáció szükségességét támasztják alá azok a legújabb kutatások, melyek szerint a katalitikusan aktív ATP-kötő hely létrehozásában mindkét NBD részt vesz. (Reyes, 2005). Az ABC transzporterek heterodimerizációjára egy jellegzetes példa az ABCG2-vel egy alcsaládba tartozó ABCG5 és ABCG8 fehérjék által alkotott dimer, melynek a növényi szterolok transzportjában van szerepe. Ez a két fehérje obligát módon képez heterodimert, és a dimer létrejötte szükséges a plazmamembránban történő expresszióhoz, maga a heterodimerizáció nagy valószínűséggel az endoplazmás retikulumban történik (Graf, 2003). Az ABCG alcsalád két másik szintén féltranszporter tagja, az ABCG1 és az ABCG4 fehérjék egyes kísérleti eredmények szerint
mind
homo-,
mind
heterodimerizációra
képesek
(Cserepes,
2004).
Érdekességként megemlítendő, hogy a bakteriális ABC transzporterek között találhatók olyanok is, amelyekben a TMD és NBD külön polipeptidláncként található meg, ez azonban a humán ABC fehérjék esetében nem fordul elő (van Veen, 1997). Az ABC transzporter molekulák sematikus felépítését az 1. ábra szemlélteti. Az ABCG2 fél-transzporter minden valószínűség szerint homodimerizáció útján alkotja a funkcionális molekulát. Ezt a feltételezést támasztja alá az a megfigyelés, miszerint Sf9 rovarsejtekbe transzfektálva, ahol heterodimerizációhoz szükséges partner jelenléte valószínűtlen, a fehérje funkcióképes (Özvegy, 2001). Egy korábbi tanulmány szerint a két ABCG2 monomerből létrehozott fúziós fehérje is normál transzport aktivitással rendelkezik,
ami szintén a homodimerizációt
valószínűsíti (Bhatia, 2005). Ugyancsak a homodimerizáció mellett szólnak a
15
koimmunoprecipitiácós kísérletek, melyekben két különböző módon jelölt monomert használtak (Henriksen, 2005/B; Kage, 2002).
1. ábra Az ABC transzporterek sematikus felépítése a lehetséges doménsorrendek bemutatásával. A: Az NBD és a TMD külön kódolódik, a transzporter négy alegységből áll össze, élesztőgombákban és baktériumokban fordul elő. B: A két TMD és a két NBD alkot egy-egy alegységet, szintén baktériumokban található meg. C: A transzporter egy polipetidláncból áll, mely két TMD-t és két NBD-t tartalmaz. D: Az előzőtől a domének sorrendjében különbözik, szintén teljes transzporter, tipikus példája a P-gp. E: Fél-transzporter N-terminálisan elhelyezkedő TMD-vel, pl. TAP1/TAP2. F: Szintén féltranszporter, ahol a TMD C-terminálisan található, ilyen az ABCG2. G: Egy polipeptidlánc, ahol Nterminálisan további TM szegmensek találhatók (TMD0), az MRP1 és rokon fehérjéi esetén látható ilyen felépítés.
Általánosságban rendelkezésünkre
az
elmondható, ABCG2
hogy
fehérje
16
elég
kevés
szerkezetéről,
ismeret illetve
áll a
jelenleg
dimerizáció
mechanizmusáról. A legpontosabb információkat a protein kristályosítása útján lehetne nyerni, ez azonban, mint általában a membránfehérjék esetén, igen nehéz feladat. Ezidáig teljes humán ABC transzportert még nem sikerült kristályosítani, csak izolált NBD térszerkezetek állnak rendelkezésünkre, és a bakteriális homológok közül is csak néhány kristályszerkezete ismert. Az utóbbiak közül az MsbA nevű lipid transzporter említendő meg, amely az ABCG2-hez hasonlóan homodimerizálódó fél-transzporter, és ezáltal egyedülálló bepillantást enged egy dimer struktúrájába. Ezt a fehérjét három különböző baktériumból, meglehetősen jó felbontással kristályosították (Chang, 2001; Chang, 2003; Reyes, 2005). Az ABCG2 molekula transzmembrán doménjét a 361-655 aminosavak képzik, melyek, bár az egyes számítógépes programok ebben eltérést mutatnak, a konszenzus predikció szerint hat transzmembrán szegmenst alkotnak. A fehérje sematikus felépítése a dolgozatban említésre kerülő aminosavak jelölésével a 2. ábrán látható. A molekula rövid C-terminális szakasza intracellulárisan helyezkedik el, és az ötödik és a hatodik transzmembrán hélix között található egy hosszabb extracelluláris hurok. Ebben az extracelluláris szakaszban található a 603-as cisztein, amelyről kimutatták, hogy egy szimmetrikus diszulfid hidat képez a homodimert formáló két monomer között (Henriksen, 2005/A). Úgy tűnik, hogy ez a diszulfid híd nem esszenciális a fehérje működése szempontjából, miután alaninra, illetve glicinre történő cserélése esetén a vad-típusnak megfelelő fenotípusú, funkcionális fehérje volt látható. Ugyanebben az extracellulárisnak tartott hurokban két másik cisztein is található, ezek szerepe azonban már nem ilyen egyértelmű, több kutatócsoport feltételezése szerint a monomeren belüli intramolekuláris diszulfid híd képzésében vesznek részt. Két egymástól független publikációban mindhárom cisztein egyidejű mutációjakor a fehérjét működésképtelennek és intracelluláris elhelyezkedésűnek írták le, szemben egy harmadik laboratóriummal, ahol ugyanez a hármas mutáns a sejtfelszínen helyezkedett el és funkcionális volt (Wakabayashi, 2006; Henriksen, 2005/A; Bhatia, 2005). Ezekre az ellentmondásokra a magyarázat valószínűleg a tanulmányokban használt különböző expressziós rendszerekben keresendő. Az ABCG2 fehérje minden bizonnyal N-glikozilálódik, melynek helye az irodalomban található kísérleti eredmények alapján az 596-os aszparagin (Diop, 2005). Két másik konszenzus N-glikozilációra alkalmas szekvencia is található a proteinben,
17
2. ábra Az ABCG2 fehérje sematikus felépítése a dolgozatban kiemelt aminosavak jelölésével. (A könnyebb tájékozódás érdekében minden tizedik aminosav telített körrel van jelezve.)
ezek azonban úgy tűnik, hogy nem modifikálódnak. A glikozilációban résztvevő 596os aminosav a fentebb említett, a predikciók szerint extracelluláris hurokban helyezkedik el, amely további bizonyítékként szolgál arra, hogy ez a TM5 és TM6 közötti régió valóban a sejten kívüli térben található. Az ABCG2 polimorfizmusai Mint korábban már említésre került, az ABCG2 fehérje a normál szövetekben leírt
lokalizációja
alapján
fontos
szerepet
játszhat
egyes
gyógyszerek
farmakokinetikájában. Ebben a tekintetben lehet igen nagy jelentősége a gén egyszerű nukleotid polimorfizmusainak, ezek közül is azoknak, amelyeknek funkcionális következménye van. Számos tanulmány foglalkozott az ABCG2 polimorfizmusainak feltérképezésével a különböző populációkban és azoknak a fehérje expessziójára és
18
működésére kifejtett hatásával.
Az ismert SNP-ek között legalább négy olyan
található, amely megváltoztatja a protein aminosav szekvenciáját, ezek a V12M, a Q141K, az I206L és az N590Y (2. ábra). Közülük a Q141K emelendő ki, tekintettel arra, hogy hatására csökkent sejtfelszíni expressziót és ATP-áz aktivitást, valamint egyes kemoterápiás szerekre vonatkozóan a fehérje alacsonyabb transzport kapacitását írták le (Morisaki, 2005; Imai, 2002; Mizuarai, 2004). Ez a polimorfizmus egy glutamin lizinre történő cseréjével jár, és különösen a japán lakosságban fordul elő nagy frekvenciával. Topotekánnal és diflomotekánnal történő kezelés esetén a Q141K polimorfizmust hordozó betegeknél magasabb plazmakoncentrációt dokumentáltak mint a vad-típust hordozó egyéneknél (Sparreboom, 2004; Sparreboom, 2005). Kutatások folynak annak a megállapítására is, hogy egyes eddig megmagyarázatlan fototoxicitási reakciók hátterében állhatnak-e az ABCG2 csökkent transzport aktivitással rendelkező polimorfizmusai, hasonlóan pl. a más fajokban megfigyelt fényérzékenységi reakciókhoz.
19
Célkitűzések A humán ABCG2 fehérje minden valószínűséggel szerepet játszik a ráksejtek kemoterápiás szerek iránti multidrog rezisztenciájában. Emellett a fehérjét kódoló gén polimorfizmusai magyarázatot adhatnak egyes, a fehérje szubsztrátjaiként szereplő gyógyszerek felszívódásában és eloszlásánál látott egyéni különbségekre. Az elmúlt néhány évben az őssejtkutatás területén is kiterjedt vizsgálatok foglalkoznak az ABCG2-vel, tekintettel arra, hogy korai őssejt markernek bizonyult. Mindhárom kutatási irány továbbvitele érdekében lényeges megismerni a fehérje pontos felépítését, mely célzott terápiás beavatkozások alapját képezheti. Az ABCG2 fehérje úgynevezett fél-transzporter, melynek működéséhez dimerizációra van szükség. Az ABCG2 esetében ez nagy valószínűséggel homodimerizációt, esetleg homooligomerizációt jelent. A már ismert szerkezetű féltranszporterhez hasonlóan a dimerizácós folyamatban a transzmembrán régiónak feltehetőleg lényeges szerepe van. Egyes membránfehérjék esetében az alfa hélixekben elhelyezkedő, úgynevezett GXXXG motívumnak tulajdonítanak jelentőséget a dimer stabilizálásában. A legkiterjedtebben tanulmányozott ilyen protein a vörösvérsejtek membránjában található glikoforin. Az ABCG2 fehérje első transzmembrán szegmensében is megtalálható a GXXXG motívum, ennek a dimerizációban betöltött esetleges szerepét próbáltuk feltárni pontmutánsok vizsgálata segítségével. A homodimerizációban játszott szerepe tekintetében az ötödik transzmembrán hélixben elhelyezkedő 553-as glicint is vizsgáltuk. Az irodalmi adatok szerint az ennek megfelelő glicin és azt körülvevő aminosavak feltételezhetően szerepet játszanak az ABCG2-vel
rokon,
szintén
ABC
fél-transzporter
Drosophila
white
fehérje
heterodimerizációjában. Ennek az aminosavnak az ABCG2-ben betöltött szerepét szintén pontmutánsok létrehozásával tanulmányoztuk. A jelen munkával párhuzamosan, az általunk megfigyeltek figyelembe vételével készült egy számítógépes ABCG2 modell egy velünk kollaboráló krisztallográfiás laboratóriumban. A modell transzmembrán domén része, a kísérletes eredmények mellett elsősorban a már ismert kristályszerkezetű MsbA bakteriális fél-transzporterhez való homológián alapult. A modell helytállóságának pontmutánsok segítségével történő igazolására irányuló néhány kísérlet is leírásra kerül az Eredmények és megbeszélésük
20
fejezet harmadik részében. A modellt részletesen ismertető közlemény publikációja folyamatban van.
21
Módszerek Sejttenyésztés A humán embrionális vesesejteket (HEK 293, ATCC) 37 0C-on, 10%-os FBS-el (Invitrogen), 100 U/ml penicilin/sztreptomicinnel (Invitrogen) és 2 mM/l glutaminnal (Invitrogen) kiegészített Eagle-féle minimális esszenciális médiumban (ATCC) tenyésztettük, 5% CO2 jelenlétében. A transzfektált sejtvonalakat a fentiek mellett 2 mg/ml G418-ban (Invitrogen) tartottuk fent. A kontrollként használt SF295/MX500 sejtvonal lépcsőzetes szelekcióval készült (Rao, 2005), és 500 µM mitoxantronban (Sigma) tartottuk fent. Az MCF-7/FLV1000 kontroll sejtek pedig 1000 nM-os flavopiridolban (National Cancer Institute Drug Screen) és RPMI (ATCC) médiumban nőttek
(Robey,
2001).
A
80-90%-ban
konfluens
transzfektált
sejteket
a
membránpreparálás előtti éjszakán 2-10 µM mitoxantronnal kezeltük a jelzett kísérletekhez. Az Sf9 (Spodoptera frugiperda) sejteket (Invitrogen) 27 0C-on, 10% FBS-sel, 100 U/ml penicillinnel és 100 mg/ml sztreptomicinnel kiegészített TNM-FH (Sigma) médiumban tenyésztettük. Mutagenezis A HEK 293 sejtek transzfekciójához az ABCG2 pontmutánsokat hordozó plazmidokat megrendelés alapján a Lofstrand Lab Limited nevű cég készítette a pcDNA3.1/Myc-HisA(-) (Invitrogen) vektorban, a NotI és BamHI klónozási helyek felhasználásával irányított PCR mutagenezis technikával, a Stratagene-féle protokoll alkalmazásával. A felhasznált vektorok közvetlenül az ATG start kodon előtt egy konszenzus Kozak szekvenciát is tartalmaznak. A GXXXG mutánsok a rhodamin 123al történő egyszerűbb vizsgálat érdekében az R482G mutációt is hordozzák. A transzfekció elvégzése előtt a plazmid DNS szekvenciáját ellenőriztük, és minden mutáns esetében egy reprezentatív transzfektált klónból preparált DNS bázissorrendjét is meghatároztuk festék terminációs szekvenáló eljárás segítségével. Az utóbbi esetben a szekvenálási reakciót megelőző, az ABCG2 gén amplifikációját célzó első PCR reakció a pcDNA3.1 vektorra specifikus primerekkel történt, a HEK 293 sejtek saját ABCG2 génjének amplifikálódása elkerülése érdekében.
22
A rovarsejtek transzfekciójához a pAcUW21 vektort (Pharmingen) annak érdekében, hogy több klónozóhelyet tartalmazzon, egy korábbi munka során egy linker beépítésével módosítottuk, és pAcUW21-L-nek neveztük el (Szakács, 2001). Ezen vektor SacI helyére ligáltuk az ABCG2/R482G és ABCG2/G553L cDNS-eket, amelyeket a megfelelő pcDNA3.1/ABCG2 vektorokból SacI emésztéssel vágtunk ki. A vad-típusú ABCG2-t és a K86M mutáns változatot irányított PCR mutagenezis (overlap extension) módszerrel hoztuk létre (Horton, 1993). A PCR során az ABCG2/R482G cDNS-t használtuk templátként, és a két belső primér pár tartalmazta a mutáns aminosavnak megfelelő kodont. A mutagenezis a következő reakcióelegyben zajlott: 1x ThermoPol puffer (NEB), 250 mM dNTP (Amersham), 200 ng templát DNS, 1 mM külső primér, 1 mM belső primér, U. P. vízzel 50 ml-ig kiegészítve, 1 egység Vent DNS polimeráz. A mutációt hordozó DNS szakaszt két darabban amplifikáltuk, és a keletkezett két PCR terméket 2% agarózt tartalmazó TAE (40 mM Tris, 20 mM acetát, 1 mM EDTA, pH 7,2, Crosslink Lab) gélben megfuttattuk, majd QIAquick gél extrakciós kit segítségével (Qiagen) tisztítottuk. A gélből izolált PCR termékeket használtuk fel a PCR mutagenezis második lépésében, ahol a teljes mutációt tartalmazó kazetta amplifikációja történt. A második PCR reakció összetétele 1x ThermoPol puffer, 250 mM dNTP, 500 ng tisztított termék, 1 mM A külső primér, 1 mM B külső primér U. P. vízzel 50 ml-ig kiegészítve, valamint 1 egység Vent DNS polimeráz volt. A második PCR reakció termékét 1 mM ammónium-acetát jelenlétében, egyszeres
térfogatú
fenol:kloroform:izoamil-alkohol
(35:34:1)
hozzáadásával
tisztítottuk, majd a vizes fázisban lévő DNS-t kétszeres térfogatú abszolút alkohol hozzáadásával kicsaptuk. Az ily módon tisztított, vad-típust kódoló DNS-t PstI és MscI, míg a K86M mutációt tartalmazó DNS-t NotI és SpeI restrikciós enzimekkel emésztettük, 2% agaróz TAE gélben megfuttattuk, és Sephaglas BrandPrep kit segítségével (Amersham) izoláltuk. A tisztított fragmenteket ezután a pAcUW21L/ABCG2/R482G vektor PstI-MscI, illetve NotI-SpeI hasítóhelyei közé eső DNSszakasz helyére ligáltuk. A mutagenezisen átesett DNS-szakaszok bázissorrendjét minden esetben ellenőriztük festék terminációs szekvenáló eljárás segítségével (ABI, SzBK Szeged).
23
Transzfekció emlős sejtekben A stabil transzfekcióra HEK 293 sejtekben került sor, a TransFast elnevezésű transzfekciós reagens (Promega) felhasználásával. A transzfekciót megelőző napon 10 cm átmérőjű kör alakú sejttenyésztő edényenként 7.5 x 105 sejtet telepítettünk, amely másnapra 60-70%-os konfluenciának felelt meg. A transzfekció 1:2 arányban kevert plazmid DNS-el és transzfekciós reagenssel, edényenként 10 µg DNS felhasználásával, 37 0C-on, 5% CO2 jelenlétében, szérummentes médiumban, egy órán át történt. A sejteket ezt követően 48 órán át növesztettük szérummal kiegészített médiumban, majd fokozatosan megkezdtük a G418 hozzáadását, 2 mg/ml végső koncentrációig. Az elhalt sejteket naponta eltávolítottuk friss médium hozzáadásával. Átlagosan két hét elteltével láthatóvá váltak a rezisztens kolóniák, melyeket tripszinezett, steril klónozó korongok (PGC Scientific) segítségével izoláltunk. További átlagosan két hét eltelte után az ABCG2 fehérje sejtfelszíni expresszióját az 5D3 antitest (eBioscience) segítségével, áramlási citométerben vizsgáltuk (részletesen lásd alább). Amennyiben ezzel a módszerrel pozitív klónok kerültek meghatározásra, azok közül mutációnként legalább hatot tovább tenyésztettünk. Amennyiben az 5D3 antitesttel nem voltak pozitív klónok azonosíthatók, akkor immunobloton ellenőriztük a mutáns fehérje jelenlétét (részletesen lásd alább). Kísérleti kontroll céljából vad-típussal és ABCG2-t nem tartalmazó pcDNA3.1 vektorral transzfektált stabil sejtvonalakat is létrehoztunk. A GFP tag-gel jelölt mutánsok létrehozása Az N-terminálison GFP tag-gel jelölt vad-típusú ABCG2-t és a G553L mutánst a pAcUW21-L/wtABCG2 illetve a pAcUW21-L/ABCG2-G553L vektorok XhoIBamHI fragmensének, a pEGFP vektor (Clontech) megfelelő helyére történő klónozásával hoztuk létre. Ezt követően a FuGene reagens (Roche) felhasználásával HEK 293 sejteket transzfektáltunk a pEGFP/vtABCG2 illetve a pEGFP/G553L vektorokkal, a gyártó utasításait követve. 72 órával a transzfekció után a sejtek natív GFP fluoreszcenciáját egy Olympus IX70 lézer szkennelő mikroszkóppal analizáltuk, illetve a sejteket az immunofluoreszcenciánál leírtak szerint a BXP-21 monoklonális ABCG2 ellenes antitesttel jelöltük. A stabil klónokat 0,5 mg/ml G418-ban történő szelekcióval hoztuk létre. A rekombináns bakulovírusok létrehozása
24
Az ABCG2 változatok cDNS-ét hordozó, rekombináns bakulovírusokat a BaculoGold transzfekciós kit (Pharmingen) felhasználásával, a gyártó utasításait követve készítettük el. Röviden: 1,5 x 105 Sf9 sejthez a médium teljes eltávolítását követően 250 ng E. coli BHM törzsből (NEB) izolált transzfer vektort és 60 ng linearizált bakulovírus DNS-t, majd 250 µl A (Grace-féle médium, 10% FBS-sel) és 250 µl B (25 mM Hepes, pH 7,1; 125 mM CaCl2; 140 mM NaCl) puffert adtunk. Ezután 4 órán át, 27 0C-on inkubáltuk a kotranszfektált sejteket, majd 4 óra elteltével eltávolítottuk a transzfekciós elegyet, és médiumra cseréltük. Négy nap elteltével összegyűjtöttük a sejteken lévő médiumot, ami tartalmazta a rekombináns vírusokat (vírusfelülúszó).
A
vírusfelülúszóból
az
egyedi,
rekombináns
vírusokat
végponthígítással állítottuk elő. Ezek közül immunoblot segítségével kiválasztottuk a legmagasabb ABCG2 fehérje expressziót nyújtó klónokat. A kiválasztott klónt több lépésben amplifikáltuk, míg magas titerű (108 pfu/ml) vírusfelülúszóhoz jutottunk. Membránpreparátumok készítése Az eljárást végig 4 0C-on végeztük. A sejteket jéghideg DPBS-ben (Invitrogen) történt két egymást követő mosás után hipotóniás lízis pufferbe (5 mM EGTA, 5 mM EDTA, 10 mM Tris pH 7.4, 10 mM HEPES, 5 µg/ml aprotinin, 5 µg/ml leupeptin, 2 mM PMSF and +/- 2 mM dithiothreitol /DTT) helyeztük, és nagy nyomású nitrogén jelenlétében 20 percen át lizáltuk. A sejtmagokat és a fel nem tárt sejteket 1200/perc fordulatszámon történő 10 perces centrifugálással távolítottuk el. Ezt követően a mitokondriumokat szedimentáltuk ultracentrifugában, 7000/perc fordulatszámon, újabb 10 percen át. Végül a membránokat a felülúszó egy órán át tartó, 40000/perc fordulatszámon végzett ultracentrifugálásával nyertük ki. A membránokat tartalmazó csapadékot lízis pufferben oldottuk fel, és a lizátumokat –20 0C-on tároltuk. A membránpreparátumok fehérje koncentrációját a Bradford módszer alkalmazásával, a Bio-Rad fehérje meghatározó reagens (Bio-Rad) segítségével, spektrofotométerben állapítottuk meg. A kalibrációs görbe BSA (Pierce) felhasználásával készített standard hígítási sorral történt. Elektoforézis és immunoblot A membránpreparátumokat mintafelvivő pufferben (50 mM Tris-PO4 pH 6,8,
25
20% glicerin, 1-20 µg bromofenolkék, 2% SDS, 2% β-merkaptoetanol) történt oldás után 7,5%-os Tris-HCl gélen (Bio-Rad), 100 V-on egy órán át elektroforizáltuk, MiniProteán elktroforézis készülékben (Bio-Rad). A nem redukáló körülmények között végzett
elektroforézis esetében
a mintafelvivő puffer
nem
tartalmazott
β-
merkaptoetanolt, és a membránpreparálásnál használt lízis puffer DTT felhasználása nélkül készült. Az elektroforézist követően a fehérjéket 0,2 µm pórusméretű PVDF (Millipore) membránra blotoltuk át, Mini-Trans-Blot (Bio-Rad) készülék segítségével CAPS-et (Sigma) és 10 % metanolt tartalmazó transzfer pufferben 100 V-on, 60 percen át, a készülék állandó hűtése mellett. A transzfer sikerességét és mintafelvitel egyenletességét 0,1%-os Ponceau S oldatban (Sigma) történt 10 perces festéssel ellenőriztük, melyet többszöri desztillált vizes öblítés és 5%-os tejet tartalmazó TBS pufferben történő blokkolás követett, egy órán át. Ezután a membránt egy éjszakán át inkubáltuk 5%-os tejet és a BXP-21 monoklonális antitestet (Kamiya Biomedicals) 1:250 hígításban tartalmazó TBS oldatban, 4
0
C-on. Majd 1%-os Tween 20-t
tartalmazó TBS pufferben történt mosásokat követően a membránokat egy órán át tormaperoxidázzal konjugált egér ellenes másodlagos antitestet (Amersham) és 5% tejet tartalmazó TBS-ben inkubáltuk, melyet ismételt mosások követtek TBS-tweenben. Végül ECL-ben (Amersham) történt 3 perces áztatást követően a jelerősséget autoradiográfiával határoztuk meg. Northern blot analízis A transzfektált sejtekből az RNS-t az RNA STAT-60 reagens (Tel-Test Inc.) felhasználásával, a gyártó utasításait követve nyertük ki. A cDNS jelölése a Riboprobe in vitro transzkripciós reagens (Promega) segítségével történt. Az RNS mennyiségének és minőségének meghatározása érdekében 5 µg-ot elektoforézisnek vetettünk alá 1% agarózt és 6% formaldehided tartalmazó gélen. A gélt etidium bromiddal megfestettük, majd az RNS-t nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A jelöléshez az ABCG2 gén első 662 bázispárjából készült riboprobe került felhasználásra a pCRII-TOPO nevű vektorban (Invitrogen). A hibridizáció 58 0C-on, egy éjszakán át, 50%-os formamid oldatban történt, amely 0,75 M NaCl-t, 0,075 M nátrium citrátot, 0,1% SDS-t és 5X Denhardt féle oldatot tartalmazott. SDS-t, NaCl-t és nátrium citrátot tartalmazó oldatban két egymást követő mosás után a jelerősséget autoradiográfiával határoztuk
26
meg, a film -70 0C-on történt expozíciójával. Áramlási citometria Az ABCG2 ellenes monoklonális 5D3 antitesttel történő jelöléshez a sejteket előzetes tripszinizációt követően, 2% BSA-t és a fikoeritrinnel konjugált 5D3 antitestet, vagy
fikoeritrinnel
konjugált
IgG-t
tartalmazó
DPBS
oldatban
inkubáltuk
szobahőmérsékleten 30 percen át, melyet két mosás követett DPBS-ben. A mintákat az analízis elvégzéséig sötétbe helyeztük. A drog transzport vizsgálatára irányuló kísérletek esetében a tripszinizált sejteket 10% FBS-t tartalmazó médiumban reszuszpendáltuk, és szintén 30 percig inkubáltuk 37 0C-on, 5%-os CO2 jelenlétében. A médiumhoz 20 µM mitoxantront, vagy 0,5 µg/ml rhodamin 123-at (Sigma), vagy 10 µM pheophorbid a-t (Frontier Scientific), vagy 250 nM BODIPY-prazosint (Molecular Probes) adtunk, az FTC (Natural Product Extraction Laboratory, NIH) nevű specifikus ABCG2 blokkoló 10 µM-os koncentrációjának jelenlétében, illetve annak hiányában. A sejteket ezután jéghideg médiumban egyszer átmostuk, és további egy órán keresztül inkubáltuk szubsztrátot nem tartalmazó médiumban, 37 0C-on, FTC jelenlétében vagy annak hiányában. A sejteket ezután kétszer DPBS-ben mostuk, és az analízis elvégzéséig sötétben tartottuk. A mintákat 488 nm-es argon és 635 nm-es vörös dióda lézerrel felszerelt FACSort áramlási citométerben elemeztük. Mintánként legalább 10000 esemény került regisztrálásra. Az elpusztult sejteket propidium jodidos festéssel azonosítottuk. Kémia keresztkötés A kémiai keresztkötési reakciók in vivo történtek. A sejteket 3-30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten 2 mM-os koncentrációjú DSS-t, vagy DSP-t, illetve 1 mM-os koncentrációjú MBS-t, vagy DSG-t tartalmazó médiumban. A keresztkötő reagenseket a Pierce-től vásároltuk. A reakciót 20 mM-os végső koncentrációjú TrisHCl (pH 8) hozzáadásával állítottuk le, melyet azonnal a fent leírtak szerinti membránpreparálás és immunoblotolás követett. PNG-áz enzimes kezelés Ehhez a kezeléshez a Glyko N-Glycanase (ProZyme) nevű kitet használtuk a
27
gyártó
utasításainak
megfelelően.
Mintánként
100 µg membránpreparátumot
inkubáltunk egy éjszakán át, 37 0C-on, melyet a fentiekben részletezett immunoblotolás követett. Az ATP-áz aktivitás mérése A membránok ATP-áz aktivitását az ATP-hidrolízis során felszabaduló inorganikus foszfát kolorimetriás detektálásával határoztuk meg. Az ABCG2-re specifikus aktivitásnak az össz ATP hidrolízis vanadátra érzékeny frakcióját tekintettük (Sarkadi, 1992). A membránokat a Gribar et al által leírtak alapján készítettük (Gribar, 2000), és –70 °C-on, TSNa pufferben (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 250 mM sucrose, 1 mM AEBSF és 1% aprotinin) tároltuk. A méréseket 20 percen át végeztük, ATP-áz pufferben (10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM KCl, 2 mM dithiothreitol, 2 mM EGTA, 5 mM Na-azide, 1,5 mg/ml ouabain), 37 °C-on. A reakciót 5 mM ATP-vel indítottuk, és 2,5%-os végső koncentrációjú SDS-el állítottuk meg. A Hoechst 33342 festék transzportjának vizsgálata rovarsejtekben 4 x 106 Sf9 rovarsejtet koinfektáltunk a vad-típust, a K86M-et, a G553L-t illetve β -galaktozidázt hordozó változó mennyiségű bakulovírussal a 16. ábrán jelzett arányokban. A fertőzést követően 40 órával a sejteket egyszer mostuk, majd szuszpendáltuk szobahőmérsékletű HPMI oldatban (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 400 µM MgCl2, 40 µM CaCl2, 10 mM Hepes, 10 mM NaHCO3, 10 mM glükóz és 5 mM Na2HPO4). A sejtekből mintát vettünk, amit ezután tripán-kékkel (Sigma) festettünk meg, és megszámoltuk az élő és az elpusztult sejteket. Ezután 5 x 105 rovarsejtet szuszpendáltunk 2ml HPMI oldatban, és a Hoechst 33342 festék akkumulációját állandó keverés mellett, 370C-on olvastuk le, fluoreszcens spektrofotométerben (Perkin Elmer), 350 nm (excitáció)/460 nm (emisszió) mellett. A festék csak akkor válik fluoreszcenssé, amikor DNS-hez kötődik (Haugland, 1996), így a mérés során folyamatosan detektálhattuk annak sejtbe történő beáramlását. A sejteket 4 percen át előinkubáltuk 37 0C –on, majd 1µM Hst-t adtunk hozzájuk, és további 10 percen át jegyeztük a fluoreszcencia változását. Ezt követően ABCG2 inhibitort (1 µM Ko143) adtunk a sejtekhez. A sejten belüli fluoreszcenciát meghatároztuk a transzport inhibitor
28
jelenléte által okozott teljes gátlása (F100) esetén, és az inhibitor jelenléte nélkül (F0). A transzport aktivitást a következő egyenlet alapján számítottuk: F100 - F0 / F100 x 100. Immunofluoreszcens jelölés A jelölést megelőzően két nappal 12 mm-es üveg fedőlemezenként 1.5 x 105 sejtet telepítettünk. A jelölés napján, egy gyors DPBS-es mosást követően, a sejteket öt percig fixáltuk 4%-os paraformaldehiddel, szobahőmérsékleten, melyet ötszöri DPBSel történő mosás után további fixálás és permeabilizálás követett -20 C-ra előhűtött metanolban szintén öt percig, szobahőmérsékleten. Újabb öt mosás után DPBS-ben, a sejteket egy órán át blokkoltuk DPBS alapú pufferben, mely 2 mg/ml BSA-t (ICN), 0.1%-os Triton X-100-ot (Sigma) és 5%-os kecske szérumot (Vector Laboratories) tartalmazott. Ezután egy órás inkubáció következett a BXP-21 monoklonális antitest 1:100-as, illetve a nyúl poliklonális kalnexin ellenes antitest (Abcam) 1:1000-es hígításást tartalmazó pufferben, szobahőmérsékleten, melyet újabb öt mosás követett DPBS-el. Végezetül a mintákat 1:250 hígítású fluoreszceinnel konjugált egér ellenes másodlagos antitestben (Vector Laboratories) inkubáltuk, egy órán át. A tárgylemezre erősített fedőlemezeket lézerrel szkennelő konfokális mikroszkóppal analizáltuk. A GFP tag-et hordozó mintákat fixálás és mosás után natívan elemeztük.
29
Eredmények és megbeszélésük 1. A GXXXG motívum szerepe az ABCG2 fehérjében A GXXXG motívumról Mint az a Bevezetésben már említésre került az ABCG2 fehérje egy úgynevezett fél-transzporter. Általánosan elfogadott az a nézet, mely szerint az ABCG2 protein esetében homodimerizáció útján jön létre a funkcionális molekula. Ezt a feltételezést kísérletes adatok is alátámasztják, úgymint a transzporter funkcionális volta heterológ expressziós rendszerekben, pl. Sf9 rovarsejtekbe transzfektálva, továbbá a két ABCG2 monomerből létrehozott fúziós fehérje normális működése, valamint
a
két
különböző
tag-gel
jelölt
ABCG2
molekula
sikeres
koimmunoprecipitációja (Özvegy, 2001; Bhatia, 2005; Henriksen, 2005/B; Kage, 2002). Jelenleg azonban nem áll rendelkezésünkre információ arra vonatkozóan, hogy mely aminosavaknak van jelentősége a homodimer létrehozásában. Éppen ezért vizsgáltuk meg az ABCG2 első transzmembrán szegmensében található GXXXG motívum esetleges szerepét a homodimerizációban. A GXXXG motívum, azaz két glicin egymástól három tetszőleges aminosavval elválasztva, a transzmembrán hélixekben előforduló egyik leggyakoribb szekvencia motívum (Russ, 2000; Senes, 2000). Számos membránfehérje dimerizációjában írták le a szerepét, ilyenek pl. a humán karbonsav anhidráz (Whittington, 2001), az Ff bakteriofág fő köpenyfehérje (Melnyk, 2002), az élesztőgomba ATP szintetáz (Arselin, 2003), illetve az epidermális növekedési faktor receptor (ERB) család egyes tagjai (Mendrola, 2002). A GXXXG motívum segítségével dimerizálódó fehérjék közül a legintenzívebben tanulmányozott a vörösvértestek membránjában található glikoforin (Gerber, 2001). Ez a protein egy transzmembrán szegmenst tartalmaz, és homodimert alkot. A glikoforin esetében a GXXXG motívummal együtt, az azt körülvevő szekvenciában, összesen hét aminosavról nyert megállapítást (Brosig, 1998), hogy fontos szerepet játszik a dimer összetartásában (LIXXGVXXGVXXT). Érdekes módon az ABCG2 fehérjében is található egy treonin a GXXXG motívumtól három aminosavval elválasztva, amelynek a dimerizációban betöltött potenciális szerepe tisztázására is végeztünk kísérleteket.
30
A GXXXG motívum szerepe a membránfehérjék dimerizációjában, a feltételezések szerint, azon alapul, hogy az alfa hélix felcsavarodása során a glicinek azonos felszínre kerülnek, és oldallánc nélküli kis aminosavak lévén lehetőséget nyújtanak két transzmembrán szegmens szoros egymás mellé kerüléséhez, amely van der Waals kötések létrejöttét eredményezheti. Hasonló szerepet más kisméretű aminosavaknak, így alaninnak és szerinnek, valamint az általuk alkotott AXXXA és SXXXS motívumoknak is tulajdonítanak. Az első megközelítés, amellyel a GXXXG motívum dimerizációban betöltött szerepét
valószínűsítették,
a
membránfehérjékben
előforduló
transzmembrán
szegmensek szekvenciájának átfogó elemzése volt. Ezen analízis során kiderült, hogy az alfa hélixekben a véletlenszerűen várhatónál több mint 30%-al gyakrabban fordul elő a GXXXG szekvencia (Senes, 2000). Egy másik vizsgálati stratégia alapját pedig egy 19 alaninból, illetve leucinból álló TM szegmens képezte, amelybe az alfa hélixekben leggyakrabban előforduló kilenc aminosavat random módon beépítették az 1-es, 2-es, 5-ös, 6-os, 9-es, 10-es és a 13-as pozíciókba (Russ, 2000). Az így létrehozott transzmembrán szegmenseket ezután az úgynevezett TOXCAT vektorba klónozták, amely fúziós fehérjét képez a TM és egy dimerizációtól függő bakteriális transzkripciós faktor között. Amennyiben a vizsgált transzmembrán szakasz képes a dimerizációra, akkor a transzkripciós faktor elindítja a klóramfenikol acetiltranszferáz enzim átíródását,
és a kérdéses TM-et
hordozó baktériumok rezisztenssé válnak
klóramfenikollal szemben. Az ebben a kísérletes modellben dimerizációt mutató TM szakaszok 96%-ánál az 5-ös és a 9-es pozíciókban GXXXG motívumot alkotó glicineket figyeltek meg. Ugyanezekben a pozíciókban a második leggyakrabban előforduló aminosav a szerin volt, amelyről feltételezett, hogy a glicinhez hasonló szerepet játszhat a dimerizációban. A GXXXG motívum az ABCG alcsaládban A 3. ábrán bemutatott szekvencia analízis szemlélteti, hogy a GXXXG motívum igen jól konzervált az ABCG alcsalád tagjainak első transzmembrán szegmensében. Mint látható a motívum az ABCG2-n kívül megtalálható az ABCG1 és ABCG4 fehérjékben. Megemlítendő továbbá, hogy ugyanebben a pozícióban az ABCG2 orthológ Drosophila white fehérjében és az egér Abcg3 fehérjében az AXXXG
31
motívum helyezkedik el, amely az előző bekezdésben említett analízisek során szintén az alfa hélixekben egyik leggyakrabban előforduló szekvencia volt (Liu, 2002).
ABCG5 ABCG8 ABCG2 Abcg3 ABCG1 ABCG4 white
KLGVLLRRVT QFTTLIRRQI QLRWVSKRSF QLKWIICQSF QFCILFKRTF QFCILFKRTF QFRAVLWRSW
RNLVRNKLAV SNDFRDLPTL KNLLGNPQAS KNFKGFPWVT LSIMRDSVLT LSILRDTVLT LSVLKEPLLV
ITRLLQNLIM LIHGAEACLM IAQIIVTVVL VIQAIITVIL HLRITSHIGI HLRFMSHVVI KVRLIQTTMV
406 410 GLFLLFFVLR SMTIGF..LY GLVIGAIYFG ATAVGTAFRV GLLIGLLYLG GVLIGLLYLH AILIGLIFLG TM1
VRSNVLKGAI FGHGSIQLSF LKNDSTG..I LKNDCIE..V IGNETKK..V IGDDASK..V QQLTQVG..V
3. ábra A humán ABCG alcsalád, az egér Abcg3 és a Drosophila white fehérje első transzmembrán szegmensének szekvenciája. A számok a GXXXG motívum pozícióját jelzik az ABCG2 fehérjében
A GXXXG mutánsok expressziója HEK 293 sejtekben Annak érdekében, hogy a GXXXG motívum által az ABCG2 fehérjében betöltött szerepet tanulmányozzuk, a Módszerek fejezetben részletezett eljárással a következő mutánsokat hordozó vektorokat készíttettük: G406L, G410L, G406A, G410A, G406L/G410L és G406A/G410A. A mutáns plazmidokkal HEK 293 sejteket transzfektáltunk, és G418-al történő szelekcióval mutációkként legalább hat stabil klónt hoztunk létre. A GXXXG motívumot érintő aminosavcserék mellett a klónok az R482G mutációt is hordozzák. Erről a mutációról ismert, hogy szélesebb szubsztrátspecificitást eredményez, és ezáltal lehetővé tette a mutánsok transzport funkciójának a vizsgálatát áramlási citométerben olyan könnyen hozzáférhető fluoreszcens anyagokkal mint pl. a rhodamin 123. Mint az korábban említésre került, ez a mutáció gyakran található meg drog-szelektált karcinóma sejtvonalakban. Annak bizonyítása érdekében, hogy a GXXXG mutánsoknál megfigyelteket nem az R482G mutáció jelenléte okozta, a G406L/G410L mutánst a vad-típusban (R482) is létrehoztunk, mely az R482G-t is hordozó G406L/G410L mutánssal teljesen megegyező fenotípust mutatott.
Kontrollként a laboratóriumunkban korábban
létrehozott vad-típussal, R482G variánssal és az ABCG2-t nem tartalmazó pcDNA3.1 vektorral transzfektált sejteket használtuk (Robey, 2003). A mutánsokat hordozó pozitív klónokat áramlási citométerben, az 5D3 monoklonális ABCG2 ellenes antitest segítségével azonosítottuk, majd a mutáns
32
fehérjék expressziós szintjét a szintén monoklonális BXP-21 antitest alkalmazásával vizsgáltuk immunobloton. A 4. ábra A részén a leucin mutánsok, a B részén pedig az alanin mutánsok reprezentatív klónjai láthatók immunobloton. Tekintettel arra, hogy elsősorban a leucinra történő mutációk esetén, ezek közül is különösen a G406L/G410L
mutánsnál
a
kontrollénál
(R482G)
lényegesen
alacsonyabb
fehérjeszintet tapasztaltunk,
4. ábra A: A leucin mutánsok fehérje expressziós szintje immunobloton a BXP-21 monoklonális antitesttel. A számok a vizsgált klónokat jelölik, GXXXG mutánsonként két-két klón látható, valamint egy kontroll R482G klón. Mintánként 25 µg fehérje került elektroforézisre. B: Az alanin mutánsok két-két reprezentatív klónja immunobloton. (15 µg fehérje). C: Az alanin és leucin mutánsok egy-egy klónjának RNS szintje Northern bloton. Kontrollként a vad-típus (482R) és az üres vektorral transzfektált sejtvonalból (pcDNA) készült RNS minta látható.
33
ellenőriztük a mutáns klónok RNS szintjét is Northern blottal. A 4/C ábrán látható, hogy a mutánsok túlnyomó részében legalább a vad-típuséval megközelítően azonos mennyiségű RNS volt detektálható, és érdekes módon éppen a legalacsonyabb fehérjeszintet mutató kettős leucin mutáns esetében bizonyult az RNS mennyisége a legnagyobbnak. A mutánsok funkciójának és felszíni expressziójának vizsgálata Az előzőekben leírt alacsony fehérje expressziós szintek, különösen a látott magas RNS szinteket is figyelembe véve, a mutáns fehérjék processzálásában vagy dimerizációjában bekövetkezett változásokat valószínűsítettek. A mutánsok további jellemzése érdekében áramlási citométerben végeztünk a felszíni expresszióra és a transzport funkcióra vonatkozó vizsgálatokat. A mutánsok sejtfelszínen való jelenlétének igazolására az 5D3 elnevezésű monoklonális ABCG2 ellenes antitestet alkalmaztuk. Ez az antitest a fehérje egy extracelluláris epitópját ismeri fel, és mivel a mérések során a sejteket nem permeabilizáltuk a pozitív jelölés a transzporter plazmamembránban történő jelenlétére utal. A 5. ábra első oszlopában látható, hogy ezzel a módszerrel, a kontrollként alkalmazott R482G-hez hasonlóan, a mutáns fehérjék esetében pozitív felszíni jelölést tapasztaltunk. A mutánsok funkcionalitásának vizsgálatához négy, az ABCG2 fehérje szubsztrátjaként ismert fluoreszcens vegyületet alkalmaztunk, úgymint a BODIPY-prazosint, a rhodamin 123-at, a mitoxantront és a feoforbid a-t. A rhodamin 123-al kapcsolatban megemlítendő, hogy ezt a vad-típusú ABCG2, azaz a 482-es pozícióban arginint hordozó fehérje nem képes transzportálni. Ez az egyébként P-glikoprotein szubsztrát, fluoreszcens vegyület csak az R482G és az R482T variánsok esetében viselkedik szubsztrátként, amint erről a bevezetésben részletesebben volt szó (Honjo, 2001). Tekintettel arra, hogy az itt jellemzett mutánsok mind hordozzák az R482G mutációt is, esetükben várható lett volna a rhodamin 123 transzportja. A várttal ellentétben azonban, mint az a 5. ábra harmadik oszlopában látható, mindhárom leucin mutáns esetében a rhodamin 123 transzportjának teljes hiánya volt megfigyelhető. Ugyancsak a transzport funkció teljes kiesése volt tapasztalható a G406L/G410L mutáns esetében BODIPY-prazosinnal és feoforbid a-val vizsgálva. Az utóbbi két vegyület tekintetében a csak az egyik glicin helyett leucint hordozó mutánsok (G406L, G410L) is jelentősen csökkent transzport aktivitást
34
mutattak. Mitoxantronra vonatkozóan mindhárom leucin mutáns szignifikáns transzport kapacitás csökkenést mutatott, ami a kettős leucin mutáns esetében a transzport majdnem teljes hiányát jelentette. A leucin mutánsoknál tapasztaltakkal ellentétben, mint azt a 5. ábra második sora szemlélteti, a G406A/G410A mutáns, a normál felszíni jelölés mellett, a kontrolléval megegyező transzport aktivitást mutatott mind a négy vizsgált szubsztrát tekintetében. Az ábrán nem látható, de ezzel megegyező eredményeket értünk el az egyszeres alanin mutánsokkal is (G406A, G410A). Ez az eredmény nem meglepő,
5. ábra Az első oszlop a kontroll R482G és a jelzett mutáns sejtvonalak esetén az ABCG2 fehérje sejtfelszínen történt detektálását dokumentálja az 5D3 monoklonális antitesttel áramlási citométerben. (Negatív kontroll: —, ABCG2: ----) Az ábra további részében az oszlopok tetején jelzett fluoreszcens szubsztrátok transzportja látható ugyanezen mutánsokra vonatkozóan szintén áramlási citométerben mérve. A transzportot az FTC jelenlétében (----) és hiányában (—) mért akkumuláció különbsége jelzi. A két görbe egybeesése estén az illető vegyület nem transzportálódik.
35
hiszen a korábbiakban említetteknek megfelelően az alanin a glicinhez hasonló szerepet tölthet be a dimerizációban. A G406L/G410L mutáns ATP-áz aktivitása A GXXXG mutánsok további funkcionális jellemzése érdekében a Módszerek fejezetben
leírtak
szerint
megmértük
az
ATP-áz
aktivitásukat.
Az
ABC
transzporterekről ismert, hogy drogok által stimulálható, vanadát-szenzitív ATP-áz aktivitást fejtenek ki (Ambudkar, 1992). A P-glikoprotein esetében pl. a szubsztrátok jelenlétében 3-6-szoros növekedés észlelhető a bazális ATP hidrolízis mértékéhez képest. A transzportra vonatkozó tanulmányokban leginkább érintett G406L/G410L mutáns ATP-áz funkcióját vizsgáltuk meg növekvő koncentrációjú prazosin jelenlétében, és hasonlítottuk össze az R482G variánssal és az üres pcDNA3.1 vektorral transzfektált sejtekkel. A 6. ábrán látható, hogy a G406L/G410L mutáns bazális ATP-áz aktivitása lényegesen kisebb az R482G-énél, gyakorlatilag az üres vektor
6. ábra A prazosin emelkedő koncentrációjának hatása a G406L/G410L mutánsból, a kontroll R482G transzfektánsból és az üres vektorral transzfektált sejtekből (pcDNA) készült membránok ATP-áz aktivitásának vanadát-érzékeny frakciójára. Az első mérési pont (0 µM prazosin) a bazális aktivitást jelzi. A görbék legalább két különböző membránpreparátum felhasználásával készült három mérés átlagát jelzik.
36
kontrolléval azonos, és, ellentétben az R482G-nél látottakkal, prazosinnal egyáltalán nem stimulálható. Ez az eredmény azért is érdekes, mert az ebből a szempontból modellnek tekinthető P-gp estében csak az ATP-kötő domént is érintő mutációknál írták le a bazális aktivitás csökkenését. Szemben a transzmembrán doménben előforduló mutációkkal, amelyeknél csak a szubsztrát által stimulált ATP hidrolízis mértéke változott meg a bazális aktivitás érintettsége nélkül. Kémiai keresztkötési vizsgálatok Mivel a korábbiakban a transzport funkciót és az ATP-áz aktivitást érintő jelentős változásokat tapasztaltunk a GXXXG motívum egy vagy mindkét glicinjének leucinra történő cserélésekor, kémiai keresztkötési reakciókkal próbáltuk megállapítani, hogy vajon a funkciót érintő változások hátterében a homodimerizáció elégtelensége áll-e. A kémia keresztkötési reakciókat mint a dimerizáció indirekt vizsgálómódszerét szokták alkalmazni. Az itt bemutatott kísérletek elvégzésekor még nem volt ismeretes, hogy a 603-as pozícióban elhelyezkedő cisztein formál diszulfid hidat a két ABCG2 monomer között, és, hogy ennek a diszulfid hídnak a hiányában is funkcióképes a transzporter (Henriksen, 2005/A). Azonban korábban már ismert volt, hogy az ABCG2 fehérje nem redukáló körülmények között elektoforetizálva a redukáló gélen látott 72 kDa tömegű monomerrel ellentétben kb. 150 kDa tömegű, ami diszulfid híd jelenlétére utalt (Kage, 2002). Kísérleteinkben először a DSS nevű, 11.4 Å keresztkötő távolságú reagenst alkalmaztuk. A 7/A ábrán látható, hogy a kontroll, a G406L és a G406L/G410L mutánsok esetében egyaránt sikeres keresztkötés volt tapasztalható DSS-el, amit a monomer legalább kétszeresének megfelelő molekulasúlyú jel megjelenése igazol az immunobloton. Ezekhez a kísérletekhez a kontrollt és a mutánsokat hordozó sejtvonalakat a membránpreparálás megkezdése előtt 30 percig inkubáltuk a keresztkötő reagensben. A mutánsok további jellemzése érdekében a DSP nevű, a DSS-éhez hasonló keresztkötő távolságú reagens hatását is megvizsgáltuk. Ez a vegyület annyiban különbözik a DSS-től, hogy az általa létrehozott kötések DTT, illetve β-merkaptoetanol jelenlétében felbomolnak. A 7/B ábrán az R482G kontroll esetén megfigyelhető, hogy a DTT és a β-merkaptoetanol eliminálásával végzett membránpreparálás és elektroforézis során a DSP-vel keresztkötött mintákban oligomereknek megfelelő
37
molekulasúlyú fehérjét detektáltunk. Az irodalomban leírtaknak megfelelően, ezzel azonos eredményt kaptunk nem redukáló körülmények között a keresztkötő reagens hiányában is. Ebben az esetben is a DTT, a β-merkaptoetanol, vagy mindkettő együttes jelenlétében a fehérje a monomernek megfelelő méretűre redukálódott le. Ehhez hasonló eredményt értünk el DSP, illetve nem redukáló körülmények alkalmazásával a GXXXG mutánsok esetében is. A G406A, a G410A, a G406L és a G410L mutánsokkal végzett kísérletek
7. ábra A: A kontroll R482G, a G406L és a G406L/G410L mutánsok esetén keresztkötés figyelhető meg DSSel, melyet a monomernek megfelelő 72 kDa-nál nagyobb molekulasúlyú jelek megjelenése jelez. B: A kontroll esetén szintén megfigyelhető a keresztkötés DSP-vel és nem redukáló körülmények között. DTT vagy β-merkaptoetanol (2-ME) hozzáadása a keresztkötés megszűnését eredményezi. C: Keresztkötés DSP-vel, nem redukáló körülmények és a redukáló ágensek hatása a G406A és a G410L mutánsok esetén. D: Ugyanez a G406L és a G410A mutánsoknál. Mindkét keresztkötő reagenst élő sejteken használtuk, a reakció megállítását membránpreparálás és immunoblotolás követte a BXP-21 antitesttel. (Az MX500 egy pozitív kontrollként használt mitoxantronban szelektált sejtvonalból készült membránt jelez.)
38
eredményét a 7/C és a 7/D ábra szemlélteti. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a korábban látott funkcionális eltérések ellenére a leucin mutánsok esetében a két ABCG2 monomer igen közel helyezkedik el egymáshoz a sejtfelszínen. Megemlítendő, hogy a fent leírt kísérletek során a keresztkötő reagensek és a nem redukáló körülmények alkalmazásakor egyaránt az immunobloton látott jel felerősödését tapasztaltuk. A jelenség magyarázata egyelőre nem ismert, mindenesetre más kutatók közleményeiben is leírásra került hasonló megfigyelés (Kage, 2002). Mitoxantron kezelés hatása a GXXXG mutánsokra Az irodalomban találhatók arra vonatkozó tanulmányok, hogy egyes Pglikoprotein mutánsok esetében a szubsztrát jelenléte elősegíti a fehérje végleges szerkezetének a kialakulását (Loo, 1997). Tekintettel arra, hogy az általunk létrehozott ABCG2/GXXXG leucin mutánsok esetében a vad-típusénál lényegesen alacsonyabb fehérje expressziós szintet tapasztaltunk (4/A ábra), felmerült, hogy esetükben is egy szubsztrát
jelenléte
elősegítené
az
úgynevezett
fehérje
folding-ot.
Ennek
tanulmányozása érdekében a G406L és a G406L/G410L mutánsokat egy éjszakán át nagy dózisú mitoxantronnal inkubáltuk, majd az így kezelt sejtekből nyert membránokat immunobloton vizsgáltuk. Ebben a kísérletben is az R482G mutánst hordozó transzfektált sejtvonalat használtuk kontrollként. A 8/A ábrán látható, hogy a vizsgált négy mutáns klón közül háromnál a mitoxantron kezelés hatására szignifikáns növekedés volt észlelhető az immubloton detektálható fehérje mennyiségében, míg a 482G variáns esetében a mitoxantron kezelés nem eredményezett lényeges fehérjeszint változást.
A
mutáns
fehérjék
mennyiségében
mitoxantron
kezelés
hatására
bekövetkezett növekedés a immunofluoreszcens mikroszkópia során is detektálható volt (8/B ábra). Az ábrán nem látható, de a mitoxantron kezelés hatására a transzport funkcióban nem következett be javulás egyik mutánsnál sem az áramlási citométerben végzett mérések során. Ezek az eredmények értelmezhetők úgy, hogy a szubsztrát jelenlétében a mutáns fehérjék nagyobb stabilitással rendelkeznek. A laktacisztin nevű proteoszóma inhibitor alkalmazásakor a mitoxantron kezelésnél látottaknál kisebb mértékű fehérjeszint növekedést láttunk az immunobloton, viszont a mitoxantron kezelés hatására nem volt tapasztalható növekedés az ubikvitinnel jelölt fehérjék összmennyiségében. Ezek a megfigyelések egyrészt valószínűsítik, hogy az ABCG2
39
fehérje az ubukvitin-proteoszóma rendszeren keresztül bomlik le, másrészt viszont kizárják, hogy a mitoxantron kezelés hatására a mutáns fehérjék mennyiségében látott növekedés a proteoszóma gátlása révén jött volna létre. A mutáns fehérjék szubsztrát jelenlétében megnövekedett stabilitásának az igazolása érdekében félélet idő meghatározási vizsgálatokat tervezünk.
8. ábra A: A kontroll (R482G-2), a G406L és a G406L/G410L mutánsokat egy éjszakán át 2-10 µM mitoxantronnal kezeltük, melyet membránpreparálás
és immunoblotolás követett a BXP-21
monoklonális antitesttel. A számok a felhasznált klónokat jelzik. B: Konfokális mikroszkópia egy éjszakán át tartó mitoxantron kezelést és a BXP-21 antitesttel történt immunofluoreszcens jelölést követően a kontroll és a mutánsok egy-egy klónjánál.
A 402-es treonin vizsgálata a dimerizáció tekintetében A fejezet bevezetésében említésre került, hogy a GXXXG motívum felhasználásával dimerizálódó fehérjék modelljének tekinthető glikoforin esetében a GXXXG motívum környezetében elhelyezkedő más aminosavak szerepe is igazolódott a homodimer stabilitásának a fenntartásában (Brosig, 1998). Ebben a fehérjében, csakúgy, mint az ABCG2 fél-transzporter első TM szegmensének 402-es pozíciójában,
40
található egy treonin a GXXXG motívumtól három aminosav távolságban. A glikoforin molekulában ez a treonin az egyike a dimerizációban szerepet játszó aminosavaknak. Ezen treonin ABCG2-ben betöltött szerepének tanulmányozása érdekében hoztuk létre a T402R és a T402R/G406L/G410L mutációt hordozó stabil HEK 293 klónokat. Az ezekkel a mutánsokkal végzett kezdeti kísérletek tanúsága szerint a T402R mutáció önmagában nem befolyásolja sem a fehérje sejtfelszíni expresszióját, sem a működését az áramlási citométerben történt mérések során. Ugyanakkor a T402R/G406L/G410L mutáció hatására az 5D3 antitesttel a fehérje nem detektálható a sejtfelszínen, az általunk vizsgált szubsztrátok tekintetében a transzport funkció teljes kiesését mutatja, és az immunofluoreszcens festés az endoplazmás retikulumban (ER) történt retenciót valószínűsít. Az ezzel a két mutánssal végzett kísérletek ismétlése az eredmények megerősítése érdekében folyamatban van. Az eddig tapasztaltak azt igazolják, hogy amennyiben a TM1-ben elhelyezkedő GXXXG motívum szerepet játszik az ABCG2 fehérje dimerizácójában, akkor a glikoforinnál látottakhoz hasonlóan itt is egy kiterjedtebb szekvencia vesz részt a homodimer stabilizálásában. A bemutatott eredmények értelmezhetők úgy, hogy csak a GXXXG motívum hiányában a két monomer még szoros közelségben marad, de már nem képes a transzport funkció ellátására, míg a treonin által biztosított további stabilizáció kiesése már a dimerizáció teljes megszűnését jelenti, és a fehérje az ER-ban reked. A korábban már említett, ABCG2-vel azonos alcsaládba tartozó, ABCG5/ABCG8 heterodimer esetében ismert, hogy a dimerizáció feltétele a fehérje sejtfelszíni expressziójának (Graf, 2003). Az ABCG2 esetében ezidáig még nem igazolt, hogy az ABCG5/ABCG8-nál látottakhoz hasonlóan a dimerizácó elengedhetetlen lenne a plazmamembránba történő úgynevezett trafficking-hez. Mindesetre a fentiekben leírt kísérletek ezt a hipotézist látszanak alátámasztani. Következtetések A GXXXG motívum szerepéről az ABCG2 fehérje homodimerizációjában az általunk
létrehozott
mutánsokkal
végzett
kísérletek
alapján
összefoglalva
elmondhatjuk, hogy ezeknek a glicineknek szerepe van a funkcionális transzporter molekula kialakításában. A fentiekben részletezett vizsgálatok a motívum lényeges szerepére utalnak a fehérje processzálásában, de a látottak alapján semmiképpen nem
41
állítható, hogy az önmagában lenne felelős a dimerizációért. Ez utóbbi egyébként nem is várható, tekintettel arra, hogy a jelenleg már ismert kristályszerkezetű ABC transzportereknél leírtak alapján egyértelmű, hogy számos kapcsolódási pont található a dimert formáló molekulák között. Az is elképzelhető továbbá, hogy a GXXXG motívum az egyes ABCG2 monomereken belül járul hozzá két transzmembrán szegmens szoros kapcsolatához, esetleg a szubsztrátkötő régió részeként, ami egy alternatív magyarázatként szolgálhat a leucin mutánsaink esetében látott drámai funkcionális hatásra. Ugyan a GXXXG motívum az ABCG2 esetében csak az első transzmembrán szegmensben található meg, de a negyedik transzmembrán hélix tartalmazza az AXXXA szekvenciát, ami esetleges partner lehet egy ilyen intramolekuláris kapcsolat kialakításában.
42
2. Az 553-as glicin által betöltött szerep vizsgálata az ABCG2 fehérjében A TM5 szerepe az ABCG fél-transzporterek és orthológjaik dimerizációjában A dimerizáció tekintetében egyik legkiterjedtebben tanulmányozott fehérje a humán ABCG2 orthológjának tekinthető Drosophila white fehérje. Ez a protein is egy fél-transzporter, amely azonban az ABCG2-vel ellentétben nem homo-, hanem heterodimerizálódik. Két lehetséges dimerizációs partnere ismert, a brown és a scarlet fehérjék. Ezeknél a proteineknél a dimerizáció létrejötte elég egyértelműen vizsgálható, ugyanis a white és a scarlet fehérjékből álló heterodimer a barna szemszín létrehozásáért felelős triptofán transzportert alkotja. A white és a brown fehérjék dimerizációjának a következtében pedig a piros szemszínt eredményező pigment prekurzorát szállító guanin transzporter jön létre. A Drosophila white fehérjével kapcsolatban leírták, hogy az ötödik transzmembrán szegmensben elhelyezkedő 588590-es
aminosavak
mutációja
nagy
valószínűséggel
a
heterodimerizáció
megszűnésével jár (Mackenzie, 1999). Az G589E mutáns esetében elsősorban a whitebrown dimer érintettsége volt megfigyelhető, de a barna szemszínért felelős pigment szintjének kisebb mértékű csökkenését is leírták. A Drosophila white fehérjénél említett aminosavak az 552-554-es aminosavaknak felelnek meg az ABCG2 ötödik transzmembrán szegmensében, és ez a régió igen jól konzervált az ABCG alcsaládban (9. ábra). 553
ABCG2 ABCG5 ABCG8 ABCG1 ABCG4 Abcg3 brown white
MALAIAAGQS LTLVLLGIVQ MALAAAALLP LGLLIGAAST LGLLIGAASN LPLSIGAGEN
VVSVATLLMT NPNIVNSVVA TFHMASFFSN SLQVATFVGP SLQVATFVGP AVAVPTLLVT MASECAA FGYLISCASS STSMALSVGP TM5
ICFV.FMMIF LLSIAGVLVG ALYNSFYLAG VTAI.PVLLF VTAI.PVLLF IYFV.FMLFF PFDL.IFLIF PVII.PFLLF
SGLLVNLTTI SGFLRNIQEM .GFMINLSSL SGFFVSFDTI SGFFVSFKTI SGLSLYPGSF GGTYMNVDTV GGFFLNSGSV
ASWLSWLQYF PIPFKIISYF WTVPAWISKV PTYLQWMSYI PTYLQWSSYL LPKLSWIQYF PGLK PVYLKWLSYL
9. ábra A humán ABCG alcsalád, az egér Abcg3, valamint a Drosophila brown és white fehérjék ötödik transzmembrán szegmensének szekvenciája. A jól konzervált glicin az 553-as aminosavnak felel meg az ABCG2-ben.
43
Ennek a régiónak dimerizációban játszott szerepét valószínűsítik az ABCG8 G574E mutánssal kapcsolatban leírtak is, miszerint ezt a mutánst a vad-típusú ABCG5el koexpresszálva CHO-K1 sejtekben nem észlelhető dimerizáció (Graf 2004). Ugyanakkor a G574R mutáció az ABCG8 esetében nem akadályozta meg a heterodimer képződését (Graf, 2004). Az ABCG2 fehérjének ezzel a régiójával kapcsolatban az irodalomban egy L554P mutáns került leírásra, amely a vad-típussal együtt expresszálva PA317 sejtekben csökkentette a drog rezisztenciát a csak vad-típust hordozó sejtekhez képest, ami inkább megtartott dimerizáció melletti funkcionális érintettségre utal (Kage, 2002). Megjegyzendő azonban, hogy a L554P mutánsnak a részletes karakterizálása nem történt meg, csupán a citotoxicitási vizsgálatokban látottak alapján feltételezhető, hogy a mutáció nem a dimerizációt érinti. A G553L mutáns expressziója HEK 293 sejtekben Tekintettel a Drosophila white fehérjében látottakra és az ABCG2 553-as glicinjének jól konzervált voltára, létrehoztunk egy G553L mutánst a vad-típusú ABCG2-t tartalmazó pcDNA3.1 vektorban. Hasonlóan a GXXXG mutánsoknál leírtakhoz ennél a mutánsnál is stabil klónok létrehozására törekedtünk, azonban a G418-as szelekció befejeztével az 5D3 monoklonális antitesttel nem sikerült pozitív klónokat azonosítani áramlási citométerben (10/A ábra) összesen 24 minta analízise során. Annak eldöntése érdekében, hogy csak a sejtfelszíni expresszió hiányáról van-e szó ennél a mutánsnál, vagy a transzfekció volt sikertelen, néhány klónból membránpreparátumot készítettünk, azt elektroforetizáltuk és a BXP-21 monoklonális antitesttel immunobloton vizsgáltuk a mutáns fehérje jelenlétét. A 10/B és a 10/C ábrákon látható, hogy a vizsgált hat klón közül háromnál egyáltalán nem volt a fehérje detektálható, a másik háromnál pedig szignifikánsan csökkent mennyiségű ABCG2 volt kimutatható. Ennél a kísérletnél a mitoxantronban szelektált SF295/MX500 sejtvonalból készült membránokat használtuk pozitív kontrollként (Rao, 2005). Az ábrán érdemes megfigyelni még, hogy a pozitív klónok esetében a szokásos 72 kDa molekulasúlynak megfelelő jel mellett egy alacsonyabb molekulasúlyú jel is látható. A fehérjeszintben látott ilyen drámai csökkenésére való tekintettel megvizsgáltuk az előző ábrán bemutatott klónok RNS tartalmát is. Mint azt a 10/D ábrán bemutatott Northern blot szemlélteti, a klónok nagy részénél a vad-típuséhoz képest inkább magasabb RNS
44
szint volt észlelhető. Az 1-es és a 6-os számú klónnál látható, a vártnál magasabb molekulasúlyú RNS feltehetőleg alternatív inzerciós hely eredménye. Tekintettel arra, hogy egyedül a 2-es számú klón (G553L-2) esetében találtunk számottevő mennyiségű fehérjét, a további kísérletekben ezt a klónt használtuk.
10. ábra A: A vad-típus és a G553L mutáns 6 klónjának vizsgálata áramlási citométerben az 5D3 antitesttel. Csak a vad-típus esetében detektálható felszíni expresszió, melyet a negatív kontroll (—) és az ABCG2 (----) fluoreszcenciájának elkülönülése jelez. B: Az ábra előző részében bemutatott mutáns klónokból készült membránpreparátumok vizsgálata immunobloton a BXP-21 antitesttel, a film 10 perces expozíciójával C: A B részen látott immunoblot egy éjszakás expozíciót követően. (Az MX500 egy pozitív kontrollként használt mitoxantronban szelektált sejtvonalból készült membránt jelez.) D: A vad-típussal, üres vektorral (pcDNA) és a mutáns klónokkal transzfektált sejtvonalakból készült RNS Northern bloton.
45
Az irodalomból ismert, hogy az ABCG2 fehérje az 596-os aszparaginon Nglikozilálódik. Annak bizonyítása érdekében, hogy a G553L mutáns esetén az immunobloton látott 72 kDa-nál alacsonyabb molekulasúlyú jel a nem glikozilálódott proteinnek felelhet meg, a Módszerek részben leírtaknak megfelelően a mutáns klónból készült membránokat PNG-áz enzimmel kezeltük. A 11. ábrán látható, hogy a vadtípussal transzfektált HEK 293 sejtekkel és a flavopiridolban szelektált MCF7/FLV1000 sejtvonallal (Robey, 2001) ellentétben az G553L mutáns esetében a glikánokat eltávolító enzim hatására nem következik be további csökkenés a fehérje molekulasúlyában, ami arra utal, hogy ez a jel valóban a nem glikozilált formának felel meg. A későbbiekben látni fogjuk, hogy a G553L mutáns az ER-ban helyezkedik el, azonban nem valószínű, hogy az aberráns lokalizációnak az oka pusztán a glikoziláció hiánya lenne. Ezt támasztja alá az a bevezetésben már említett vizsgálat, amely az ABCG2 596-os aszpraginjának glikozilációját igazolta, és amelyben az is bizonyítást nyert, hogy ez a poszttranszlációs modifikáció nem szükséges a plazmamembránban történő lokalizációhoz (Diop, 2005). Érdekességként megemlítendő, hogy az ABCG5/ABCG8 heterodimer esetében ugyanakkor azt tapasztalták, hogy bár mindkét fehérje glikozilálódik, ez az ABCG8 esetében elengedhetetlen a dimer membránban történő kifejeződéshez, míg az ABCG5 esetében, hasonlóan az ABCG2-nél látottakhoz, a glikoziláció nem szükséges sem a funkcióhoz, sem a sejtfelszíni lokalizációhoz (Graf, 2004).
11. ábra A G553L mutáns 2-es számú klónjából, a vad-típusból és egy flavopiridolban szelektált emlő karcinóma sejtvonalból (MCF-7/FLV1000) készült membránokat az N-Glikozidáz F enzimmel kezeltük, melyet immunoblotolás követett a BXP-21 antitesttel. A glikozilált ABCG2-t 72 kDa tömegű jel jellemzi a redukáló körülmények között történt elektoforézis során.
46
A G553L mutáns sejten belüli lokalizációjának vizsgálata Tekintettel arra, hogy az 5D3 antitesttel végzett áramlási citometriás vizsgálatok alapján valószínűsíthető volt, hogy a G553L mutáns intracellulárisan helyezkedik el, a pontos
lokalizáció
vizsgálata
érdekében
a
transzfektált
sejtvonalakon
immunofluoreszcens festést végeztünk. Erre azért is szükség volt, mert az irodalomból ismert, hogy az 5D3 antitest a fehérje konformációjára érzékeny (Özvegy-Laczka, 2005/B), tehát ezzel az antitesttel való jelölés hiánya nem feltétlenül jelenti a felszíni expresszió hiányát.
12. ábra A G553L mutánssal és a vad-típussal transzfektált HEK 293 sejtek konfokális mikroszkópiája a poliklonális kalnexin ellenes (zöld) és a monoklonális ABCG2 ellenes BXP-21 (piros) antitesttel történt immunnofluoreszcens jelölést követően. A mutáns esetében mindkét antitesttel intracelluláris festés látható, mely nagymértékű átfedést mutat (sárga). Ezzel szemben a vad-típusnál a BXP-21 antitest a plazma membránnak megfelelő jelölést mutat, és nem látható átfedés az anti-kalnexinnel.
A 12. ábra felső sorában látható, hogy az G553L mutáns valóban intracelluláris festődésű a BXP-21 monoklonális antitesttel, és kolokalizációt mutat az ER markerként használt kalnexinnel. Ezzel szemben, mint az ábra alsó sorában látható, a vad-típusú
47
fehérje a sejtfelszínen helyezkedik el, és esetében a BXP-21 és a kalnexin ellenes antitest esetén nem tapasztalható átfedés. Ez az eredmény azonban nem jelenti egyértelműen azt, hogy a G553L mutáns esetében a dimerizáció hiánya áll az ER retenció hátterében, bár egyike a lehetséges magyarázatoknak. Korábban említésre került, hogy az ABCG5/ABCG8 esetében szükséges a dimerizáció ahhoz, hogy a transzporter elhagyja az ER-t (Graf, 2003). Az ABCG2 esetében erre vonatkozó kísérletek azonban nem történtek még, de amennyiben ugyanez igazolódna, az sem bizonyítaná, hogy az G553L mutáns esetén a dimerizáció a károsodott. Az ER-ban történt retenció oka lehet még, hogy a mutáció abnormális harmadlagos szerkezetet eredményez. Mindenesetre a mutáns fehérjét az ER minőségellenőrző rendszere nagy valószínűséggel felismeri és eltávolítja, megmagyarázva ezzel a látott igen alacsony expressziós szintet. A mutáns vizsgálata keresztkötő reagensekkel Az 553-as glicint érintő mutáns ER lokalizációjának hátterében a dimerizáció esetleges érintettségét keresztkötő reagensek alkalmazásával vizsgáltuk. Mint az már a GXXXG mutánsoknál leírásra került, ez a módszer a dimerizáció indirekt vizsgálatának tekinthető. A várakozással ellentétben azonban azt tapasztaltuk, hogy a keresztkötés sikeres volt az G553L mutáns esetében DSS-sel, DSG-vel és MBS-sel is. Hasonlóan az előző fejezetben leírtakhoz, a keresztkötő reagenseket itt is in vivo alkalmaztuk,
és
fontos
megemlíteni,
hogy
mindhárom
vegyület
átjut
a
plazmamembránon. A 13. ábra a DSG-vel és az MBS-sel tapasztaltakat mutatja be a mutáns és a vad-típus esetében. Látható, hogy mindkét keresztkötő reagens alkalmazása esetén dimernek, illetve oligomernek megfelelő molekulasúlyú jel volt detektálható az immunobloton. A DSG keresztkötő távolsága 7.7 Å, az MBS-é pedig 9.9 Å, azaz elmondható, hogy ER béli lokalizációjuk ellenére a mutáns ABCG2 monomerek igen szoros közelségben vannak egymáshoz. A G553L-2 klón transzport funkcióját is megvizsgáltuk áramlási citométerben mitoxantronnal és feoforbid a-val, és mindkét szubsztrát tekintetében a transzport teljes hiányát tapasztaltuk. Ezt az eredményt azonban kritikusan kell szemlélni, hiszen az immunobloton látott minimális fehérjeszint mellett aligha várható ezzel a módszerrel a funkció detektálása. A későbbiekben azonban látni fogjuk, hogy a rovarsejtekben
48
13. ábra A vad-típus és a G553L mutáns 2-es klónjának vizsgálata keresztkötő reagensekkel. A transzfektált sejtek inkubálása DSG-vel és MBS-el dimernek illetve oligomereknek megfelelő molekulasúlyú jelek megjelenésével járt a membránpreparálást követő immunoblotolás során (BXP-21 antitesttel). A keresztkötő reagensek hiányában a 72 kDa molekulasúlyú monomer látható mindkét esetben.
történt expresszió során is inaktívnak bizonyult ez a mutáns mind az ATP-áz aktivitás, mind a Hoechst festék transzportja tekintetében. A keresztkötő reagensekkel elért eredményekről a funkcionális vizsgálatok ismeretében az feltételezhető, hogy inkább térbeli közelséget, és nem dimerizációt jeleznek, amennyiben a dimerizáció folyamatán a funkcionális, transzportra képes molekula létrejöttét értjük. Ismét megjegyzendő, hogy nagy valószínűséggel a dimert több TM, számos ponton érintkezve alkotja, és a TM5 általunk vizsgált régiója csak esetleg egyike ezeknek. Az ezt érintő mutáció hatására, bár a monomerek szoros közelsége nem szűnik meg, a molekula elveszti a funkcionalitását. A G553L mutáns expressziója rovarsejtekben Tekintettel az emlős sejtekben látott igen alacsony fehérjeszintre, az G553L mutánst Sf9 rovarsejtekben is expresszáltuk, remélve, hogy a funkcióra nézve megbízhatóbb adatokat szerezhetünk. A korábbi tapasztalatok szerint ez a heterológ rendszer alkalmas a humán ABC transzporterek vizsgálatára, magas expressziós szintet biztosít, és egyes feltételezések szerint toleránsabb az aberráns fehérjékkel szemben (Altmann, 1999). Érdekes módon az G553L mutáns esetében a rovarsejtekben nemcsak
49
a HEK 293 sejtekben látottakhoz képest megnövekedett fehérjeszintet, hanem a mutáns sejtfelszíni expresszióját is tapasztaltuk. A 14/A ábra szemlélteti a vad-típus és a G553L mutáns sejtfelszínen történt detekcióját az 5D3 antitesttel áramlási citométerben az emlős sejteknél leírt módszer alkalmazásával. A negatív kontrollhoz képest a fluoreszecenciában a mutáns esetében kisebb eltolódás látható, mint a vad-típusnál, ami az immunobloton a fehérjeszint hozzávetőlegesen 75%-os csökkenésének felelt meg. Mindenesetre ez a fehérje mennyiség szignifikánsan magasabb volt az emlős sejtekben korábban kimutatotthoz képest (10/A és 10/B ábra). A G553L mutáns detektálása a
14. ábra A: Az Sf9 rovarsejtekben mind a vad-típus, mind a G553L mutáns detektálható a sejtfelszínen az 5D3 antitesttel végzett áramlási citometria során. Az izotípus kontroll vékony vonallal és az 5D3 antitest vastag vonallal látható az ábrán. B: A fertőzött rovarsejtekből készített membránok vanadát-érzékeny ATP hidrolízise a foszfát felszabadulás kalorimetrikus mérésével. Az G553L mutáns bazális ATP-áz aktivitása szignifikánsan kisebb a vad-típusénál és az inhibitor (Ko143) hozzáadása nem csökkenti tovább számottevően, míg a vad-típus esetén magas alap aktivitás látható, melyet gátol az inhibitor. Az G553L mutánsnál látottak az inaktív Walker A mutáns K86M-el gyakorlatilag azonosak.
50
sejtfelszínen az 5D3 konformáció-szenzitív antitesttel egyúttal amellett szól, hogy a harmadlagos szerkezetében nincs jelentős eltérés a vad-típuséhoz képest. A rovarsejtekben megfigyelt normális sejtfelszíni expresszió ellenére az ATP-áz aktivitás mérésénél azt tapasztaltuk, hogy a G553L mutáns gyakorlatilag nem képes ATP-t hidrolizálni. A 14/B ábrán látható, hogy a vad-típus esetén a vártnak megfelelően jelentős mértékű, és az ABCG2-specifikus inhibitor Ko143-al gátolható ATP hidrolízist mértünk. A G553L mutánsnál azonban Ko143 jelenlétében és hiányában szinte azonos vanadát-érzékeny ATP-áz frakciót detektáltunk, mely a K86M mutációt hordozó kontrolléval volt egyenértékű. A 86-os lizin a Walker A motívumban helyezkedik el, és a szakirodalomból ismert, hogy a K86M mutáns inaktív (Özvegy, 2002; Henriksen, 2005/B). A mutáns és a vad-típus koexpressziója Az eddig ismertetett vizsgálatokkal a G553L mutáns abberáns lokalizációját láttuk az emlős sejtekben, és a funkció érintettségére vonatkozó eredményeket is bemutattunk. Annak érdekében, hogy mindezek hátterében a mutáció dimerizációban játszott esetleges szerepét tovább elemezzük a mutánst és a vad-típusú fehérjét koexpresszáltuk. Elsőként HEK 293 sejtekben végeztünk tranziens kotranszfekciót a G553L mutáns GFP-vel jelölt variánsával és a nem jelölt vad-típussal. A 15. ábra első sorában látható, hogy a G553L/GFP a konfokális mikroszkópia során, a korábban a nem jelölt mutáns fehérjénél bemutatottaknak megfelelően (12. ábra), intracellulárisan helyezkedik el mind a BXP-21 antitesttel történő jelölés, mind a natív GFP fluoreszcencia elemzése alapján. A 15. ábra második sora pedig azt szemlélteti, hogy a kotranszfekció esetén sem módosul a mutáns lokalizációja, míg a BXP-21 antitesttel festődő vad-típus a sejtfelszínen helyezkedik el, addig a G553L/GFP fluoreszcenciája továbbra is intracellulárisan detektálható, a kettő közötti átfedés hiányával a plazmamembránban. Ebből az a következtetés vonható le, hogy a mutáns és a vad-típus között nem jött létre interakció, azaz nem alkotnak dimert. Annak igazolása érdekében, hogy nem a GFP-vel történt jelölés okozza az intracelluláris retenciót a vad-típus jelölt változatát is létrehoztuk. Az ábra harmadik sorában látható, hogy a GFP-vel történt jelölés ellenére a vad-típus a sejtfelszínen detektálható.
51
15. ábra A GFP-vel jelölt G553L mutáns és a nem jelölt vad-típus koexpressziója HEK 293 sejtekben. A BXP-21 antitesttel történt immunofluoreszcens festést (piros) követően a mintákat konfokális mikroszkópban elemeztük. Az ábra második sorában látható, hogy a GFP-el jelölt mutáns intracellulárisan helyezkedik el (zöld), míg a nem jelölt vad-típus a plazmamembránban lokalizálódik, ahol nem látható GFP fluoreszcencia. Az első sorban a GFP-vel jelölt mutáns, a harmadik sorban pedig a kontrollként GFP-vel jelölt vad-típus látható önálló expresszió esetén, az utóbbinál tökéletes átfedés (sárga) figyelhető meg a GFP és a BXP-21 között. Az utolsó sorban a szintén kontrollként alkalmazott nem jelölt vad-típus látható.
Koexpressziós vizsgálatokat a rovarsejtes heterológ rendszerben is végeztünk, és mivel korábban láttuk, hogy itt a G553L mutáns is a plazmamembránban volt detektálható, az együttes expresszió funkcióra kifejtett hatását vizsgáltuk a Hoechst 33342 transzportjának mérésén keresztül. Sf9 rovarsejteket fertőztünk egyidejűleg állandó számú vad-típusú ABCG2-t hordozó vírussal és a G553L, illetve a K86M mutánsok növekvő mennyiségével a 16. ábrán jelzett arányoknak megfelelően. A vad-
52
típus és a G553L mutáns 50:400-hoz arányú kotranszfekciójánál, ami megközelítőleg azonos fehérje expressziós szintnek felel meg, az aktivitás 35%-os csökkenését figyeltük meg. Az inaktív G553L mutáns és a vad-típus dimerizációjának esetén úgynevezett domináns negatív hatás lenne várható, 75%-os csökkenéssel a Hoechst transzport kapacitásban, a dimerizácó hiánya esetén pedig minimális csökkenést kellene tapasztalni az aktivitásban. Az általunk végzett koexpressziós kísérlet eredménye tehát arra utal, hogy az emlős sejtekben látottakkal ellentétben a rovarsejtekben van valamennyi interakció a mutáns és a vad-típus között.
16. ábra Az oszlopok alatt jelzett arányban fertőztünk Sf9 rovarsejteket a vad-típussal (vt) és vagy a G553L mutánssal, vagy β-gaktozidázzal, vagy a K86M mutánssal, majd fluoreszcens spektrofotométerben mértük a Hoechst festék akkumulációját. (A feltüntetett relatív értékek kalkulációját a Módszerek fejezetben ismertettük, minden oszlop három mérés átlagának felel meg, kivéve az 50:200 arányt K86M mutáns esetén, ahol csak egy mérés történt.) Az ábra alsó részén a mérésekhez használt sejtekből készített membránok láthatók immunobloton a BXP-21 antitesttel.
53
A kontrollként használt bizonyítottan inaktív K86M mutánsról ismert, hogy a dimerizáció szempontjából nem érintett, ami összhangban van a bemutatott kísérletben látott, a vad-típusra kifejtett szignifikáns aktivitás csökkentéssel, bár itt sem látható tökéletes domináns negatív effektus (Henriksen, 2005/B). A G553E mutáns A töltéssel rendelkező glutaminsavra történő mutáció hatását is megvizsgáltuk az ABCG2 fehérje 553-as pozíciójában. Az ezzel identikus G589E mutáció a Drosophila white fehérjében röntgen sugárzás hatására jött létre, és a feltételezések szerint a heterodimerizáció megszűnését eredményezi (Mackenzie, 1999). A 17/A
17. ábra A: A G553E mutáns klónoknál nem detektálható felszíni expresszió az 5D3 antitesttel végzett áramlási citometria során, melyet a negatív kontroll (—) és az ABCG2 (----) fluoreszcenciájának egybeesése jelez. B: Mind a vad-típus, mind a G553E mutáns esetén sikeres keresztkötés látható DSG-vel, melyet a monomernél magasabb molekulasúlyú jelek megjelenése szemléltet. A kísérlethez a transzfektált HEK 293 sejteket inkubáltuk a keresztkötő reagenssel, melyet membránpreparálás és immunoblotolás követett a BXP-21 antitesttel.
54
ábrán látható, hogy, akárcsak a G553L mutáns, a G553E mutáns fehérje sem detektálható az 5D3 antitesttel a HEK 293 sejtek felszínén stabil transzfekciót követően. Az ábra B részén megfigyelhető, hogy egyebekben is a leucin mutánséhoz hasonló fenotípus jellemzi az G553E mutánst, mégpedig az expressziós szint nagyfokú csökkenése, a 72 kDa-nál alacsonyabb molekulasúlyú második jel megjelenése az immunobloton, valamint sikeres keresztkötés az alkalmazott rövid keresztkötő távolságú reagenssel. Következtetések Az általunk elvégzett kísérletek eredménye alapján, összefoglalva elmondható, hogy az 553-as glicin szerepe feltételezhető a funkcionális ABCG2 homodimer kialakításában. Ezt elsősorban az emlős sejtek vad-típussal és G553L mutánssal történt kotranszfekciója támasztja alá, ahol a két fehérje interakciója nem volt kimutatható az immunofluoreszcens festés során. Ugyanakkor a rovarsejtekben látottak, a mutáció drámai funkcionális hatása mellett, nem zárják ki a homodimer létrejöttét. Ebben a heterológ rendszerben ugyanis a mutáns képes volt, ha csak kis mértékben is, csökkenteni a vad-típus transzport funkcióját. Ezen ellentmondások feloldására további kísérleteket tervezünk, többek között a más aminosavakra történő mutáció következményeinek
vizsgálatát
ugyanebben
a
pozícióban,
illetve
koimmunoprecipitációt az eddig vizsgált mutánsok és a vad-típus jelölt változataival.
55
3. A számítógépes ABCG2 modell tesztelése pontmutánsok segítségével A modell jelentősége és létrehozása Mint az a bevezetőben részletesen ismertetésre került, az ABCG2 transzporter nagy valószínűséggel szerepet játszik a tumorok sikeres kezelésének egyik fontos akadályát képező multidrog rezisztencia jelenségben, ugyanakkor megtalálható az őssejtek úgynevezett SP populációjának felszínén, és számos szubsztrátjaként ismert gyógyszer farmakokinetikájában is jelentős szerepe lehet. Mindhárom vonatkozás szempontjából elősegítené a kutatásokat, ha a fehérje pontos szerkezete ismert lenne. A GXXXG és az G553 mutánsokkal végzett kísérleteinkkel kapcsolatban is láttuk, hogy azok sokszor ellentmondásos eredményekkel végződnek, amelyek a szerkezet ismeretében könnyebben értelmezhetővé válnának. Tekintettel arra, hogy az ABCG2 molekula kristályszerkezete egyelőre nem áll rendelkezésünkre, úgy gondoltuk, hogy létrehozunk egy számítógépes modellt, amely remélhetőleg segíti a transzporterrel kapcsolatos ismeretek bővítését a kristályosítás sikerességéig. A modell egy kollaboráció részeként a National Cancer Institute (USA) Sejtbiológia Laboratóriumának krisztallográfiás részlegében került létrehozásra, és az azt részletesen bemutató publikáció jelenleg revízió alatt van. (Li, Y.F., Polgar, O., Okada, M., Esser, L., Bates, S.E., and Xia, D. Towards Understanding the mechanism of Action of the Multidrug Resistance-linked Half ABC transporter ABCG2: a Molecular Modeling Study. Journal of Molecular Graphics and Modeling) Röviden összefoglalva elmondható, hogy az ABCG2 molekula ATP-kötő és transzmembrán doménjei külön kerültek modellezésre, tekintettel arra, hogy csak az NBD esetén volt a modell létrehozásához elegendő szekvencia homológia a már ismert kristályszerkezetű ABC transzporterekkel. Az NBD modellezéséhez az Escherichia coli MalK fehérje ATP-kötő doménjének szerkezetét használtuk, amely dimerként, 2 ATP molekulával együtt került kristályosításra, tehát feltételezhetően a fiziológiásnak megfelelő a szerkezete (Chen, 2003). Az NBD modellen további finomításokat végeztünk az aminosav oldalláncok ütközéseinek elkerülése és a kémiai kötések optimalizálása érdekében. A TMD esetén a modell az irodalomban található kísérletes eredmények felhasználásával a Vibrio cholerae MsbA szerkezetére alapozva készült (Chang, 2003), a membránfehérjék szerkezetére vonatkozó sztereokémiai szabályok
56
figyelembe
vételével.
A
transzmembrán
domén
modellezésénél
az
ismert
kristályszerkezetű fehérjék szekvenciájától való nagy eltérés mellett az ABCG2-nél látott, a legtöbb ABC transzportrehez képest fordított doménsorrend is nehézséget jelentett. A TMD modellezése során is sor került az NBD-nél említett finomításokra. Megemlítendő, hogy tekintettel az NBD és a TMD között található szekvencia egyedi voltára az ABCG2 fehérjében, ez a nagyjából 80 aminosavból álló régió nem került modellezésre. Hasonló okokból kifolyólag a modell nem tartalmazza a TM5 és TM6 közötti extracellulárisnak tartott hurkot sem. Fontos elmondani még, hogy a TMD modellezésénél végig szem előtt tartottuk azt a feltételezésünket, miszerint a TM1-ben található GXXXG motívum és a TM5-ben elhelyezkedő 553-as glicin része a két ABCG2 monomer által alkotott dimerizációs felszínnek. Arra is törekedtünk továbbá, hogy a 482-es arginin a szubsztrátok megkötésében vagy transzlokációjában feltételezett szerepének megfelelően helyezkedjen el.
18. ábra Az ABCG2 homodimer számítógépes modellje szalagdiagram formájában két ATP molekulával.
57
A 18. ábra szalagdiagram formájában mutatja be az ABCG2 dimer számítógépes modelljét, amely szimmetrikus, az ATP-kötő domének tekintetében az úgynevezett zárt konformációnak felel meg, és a 44-es tirozinnal kezdődik. A molekula megközelítően 100 Å magas, és a legnagyobb szélessége 55 Å. Formája nagyban hasonlít az MsbA kristálynál látottakhoz, azaz a 12 transzmembrán hélix az extracelluláris tér felé zárt, kúp alakú üreget fog közre. A kúp alapja egy ellipszis, melynek átmérői nagyjából 20, illetve 10 Å hosszúságúak. Az üreg falát elsősorban a TM3-at és a TM5-öt alkotó aminosavak képezik, de szerepet kap benne a TM1, a TM4 és a TM6 is. A homodimer kialakításában pedig az egyik monomerből elsősorban a TM2 és a TM3, a másik monomerből pedig a TM5 vesz részt, de egyes aminosavak a TM1-ből és a TM6-ból is találhatók a dimerizációs felszínben. Hasonlóan az MsbA kristálynál látottakhoz, az NBD és a TMD összeköttetését az úgynevezett intracelluláris domén (ICD) biztosítja, ami a TM2 és aTM3 között elhelyezkedő huroknak felel meg. A legújabb feltételezések szerint az ICD közvetíti az ATP hidrolízis következtében létrejövő konformációváltozást a szubsztrátkötő helyek felé (Reyes, 2005). Az ABCG2 fehérjének ez a szakasza lényegesen rövidebb mint az MsbA megfelelő régiója, ám ahhoz hasonlóan valószínűleg helikális szerkezetű. A modellben megfigyelhető még, hogy a két NBD szendvicsszerűen fogja közre az ATP molekulákat. Ez ugyancsak megfelel a legújabb kutatási eredményeknek, miszerint a Walker A motívum az egyik NBD-ből és az úgynevezett signature motívum a másik NBD-ből alkotja a katalitikusan aktív ATP-kötő helyet (Reyes, 2005). A modell tesztelése pontmutánsok segítségével A TMD modell építésének kezdeti stádiumában azt találtuk, hogy az egyik monomer második transzmembrán szegmensében elhelyezkedő 431-es fenilalanin a dimert alkotó másik monomer TM5-jében található 566-os valinnal érintkezik. Ennek kísérletes igazolása érdekében létrehoztuk a F431S és a V556S mutánsokkal transzfektált stabil HEK 293 sejtvonalakat. Amint azt a 19. ábra bal oldali oszlopa szemlélteti, mindkét mutáns normális sejtfelszíni expressziót mutatott az 5D3 antitesttel történt jelölés során áramlási citométerben. Az ábra jobb oldali oszlopában pedig az látható, hogy az F431S és a V556S mutánsok egyaránt képesek voltak a porfirin származék feoforbid a transzportjára, amely egy ABCG2-re specifikus szubsztrát. A
58
sejtfelszíni lokalizáció és a megtartott transzport funkció amellett szól, hogy mindkét vizsgált mutáns esetében létrejött az ABCG2 homodimer, tehát a vizsgált aminosavak dimerizációban játszott szerepe nem esszenciális. Ugyanakkor azt tapasztaltuk, hogy a TM2-nek ez a kezdeti modellje, melyben a 431-es fenilalanin a dimerizációs felszín része volt, nem felelt meg a transzmembrán hélixekre jellemző hidrofóbicitási elvárásoknak. A TM2 módosított modellje esetén, ahol ez a fenilalanin a lipid kettősréteg felé néz, megfelelő hidrofóbicitási indexet állapítottunk meg, egyetértésben a mutagenezis eredményével, mely szerint ez az aminosav nem vesz részt a dimer formálásában.
19. ábra A bal oldali oszlopban a vad-típus és a mutánsok két-két klónja esetén az ABCG2 felszíni expressziója látható áramlási citométerben, 5D3 antitesttel történt jelölést követően. (Negatív kontroll: —, ABCG2: ----) A jobb oldali oszlop a feoforbid a transzportját szemlélteti ugyanezen mutánsokra vonatkozóan, szintén áramlási citométerben mérve. A transzportot az FTC jelenlétében (----) és hiányában (—) mért akkumuláció különbsége jelzi.
59
A véglegesnek tartott modellben az előző fejezetben részletesen vizsgált 553-as glicin a harmadik TM-ben elhelyezkedő 494-es tirozinnal érintkezve képezi a dimerizációs felszín részét. Ez alapján azt feltételeztük, hogy amennyiben ezt a két aminosavat egymással megcseréljük, a vad-típusnak megfelelő fehérjét kapunk. A várakozással ellentétben azonban a HEK 293 sejtekben történt tranziens transzfekció során a Y494G/G553Y nem volt detektálható a sejtfelszínen az 5D3 antitesttel. Következtetések A modell tesztelésére további kísérletek vannak folyamatban. Mindenesetre az ABCG2 molekula kristályszerkezetének hiányában úgy gondoljuk, hogy az itt bemutatott modell jó alapot képez a molekula szerkezetének megismerésére irányuló kísérletek tervezéséhez.
60
Összefoglalás Az ABCG2 fehérje a rákos sejtek multidrog rezisztenciájában szerepet játszó fél-transzporter, amelyről feltételezett, hogy homodimerizálódik. Az ABCG2 protein első transzmembrán szegmensében egy jól konzervált GXXXG motívum található. Ez a motívum számos membránfehérje, köztük a glikoforin dimerizációjában játszik szerepet. Amennyiben az ABCG2 ezen glicinjeit leucinra cseréljük (G406L/G410L), a fehérje inaktívvá válik, de megtartja sejtfelszíni lokalizációját és a mutáns kémiai keresztkötése is sikeres. Mindkét glicin alaninra történő mutációja a valószínűleg szintén dimerizációs AXXXA motívumot hozza létre, ez a mutáns a vad-típussal azonos viselkedésű volt. A glikoforin esetében a GXXXG motívumot is magában foglaló kiterjedtebb szekvencia felelős a dimerizációért (LIXXGVXXGVXXT). Érdekes, hogy az ABCG2-ben is található egy treonin a GXXXG motívumtól három aminosavval elválasztva. Amennyiben ezt a treonint a glicinekkel együtt mutáljuk a keletkező T402R/G406L/G410L mutáns teljesen inaktív és az immunofluoreszcens festés alapján elsősorban az ER-ban helyezkedik el. A 402-es treonin önálló mutációja esetén a fehérje funkcionális volt és a sejtfelszínen helyezkedett el. Egy másik régió, amely potenciálisan részt vesz az ABCG2 fehérje dimerizációjában, egy három aminosavból álló szekvencia a TM5-ben (az 552-554-es aminosavak). A humán ABCG2 orthológjának tekintett Drosophila white fehérje esetében feltételezett, hogy ezen aminosavak megfelelőinek a mutációja a dimerizáció károsodásával jár. Az 553-as glicin leucinra történő mutációja esetén (G553L) csökkent fehérje expressziós szintet, ER lokalizációt, és az N-glikoziláció hiányát tapasztaltuk, sikeres kémiai keresztkötés mellett HEK 293 sejtekben. Érdekes módon ugyanez a mutáns Sf9 rovarsejtekbe transzfektálva a sejtmembránban helyezkedett el, azonban itt sem rendelkezett ATP-áz aktivitással. A G553L mutáns és a vad-típus együttes expressziója során HEK 293 sejtekben a mutáns továbbra is aberráns lokalizációjú volt, ami a mutáns és a vad-típus dimerizációjának hiányát valószínűsíti. Ugyanennek az aminosavnak a glutaminsavra történő mutációja szintén jelentősen csökkent fehérjeszinthez, a glikoziláció hiányához és ER retencióhoz vezet. Ezek az eredmények valószínűsítik, hogy a fentiekben említett TM1-ben, illetve TM5-ben elhelyezkedő aminosavak fontosak az ABCG2 molekula sejten belüli
61
transzportjában, és, bár értelmezhetők úgy is, nem egyértelműen bizonyítják a dimerizációban játszott szerepet. Az
ismert
kristályszerkezetű
bakteriális
ABC
transzporterekhez
való
hasonlóságon alapuló számítógépes ABCG2 modell létrehozása és kísérletes tesztelése is leírásra kerül. A modell sok hasznos információt nyújt a dimerről, és további, az ABCG2 molekula megértését célzó kísérletek tervezéséhez szolgálhat alapul.
62
Summary ABCG2 is an ATP-binding casette half-transporter associated with multidrug resistance in cancer that is presumed to homodimerize for function. A well-conserved GXXXG motif is found in TM1 of ABCG2, a motif that is involved in the dimerization of several membrane proteins, most extensively studied in glycophorin A. We found that mutating these glycine residues to leucine (G406L/G410L) renders the protein inactive, while surface expression and susceptibility to chemical cross-linking is retained. Substituting these glycines with alanine, thus creating the AXXXA putative dimerization motif, has no effect on the protein. In glycophorin A dimerization is mediated by an extended seven-residue sequence containing the GXXXG motif (LIXXGVXXGVXXT). Remarkably, ABCG2 also has a threonine separated by 3 amino acids from the GXXXG motif. Mutating this threonine to arginine together with the glycine to leucine mutations in the GXXXG motif (T402R/G406L/G410L) results in a protein with no transport capacity that is primarily localized to the ER in immunofluorescence studies. When only threonine 402 is mutated the protein traffics to the cell surface and is functional. Another conserved region potentially involved in ABCG2 dimerization is a 3amino acid sequence in TM5 (residues 552-554). Mutations of the corresponding residues in the Drosophila white protein (an orthologue of ABCG2) presumably disrupt heterodimerization. We found that substituting glycine 553 with leucine (G553L) results in significant decrease in protein expression with mostly ER localization, and deficient N-linked glycosylation, but intact cross-linking. Interestingly, the same mutant, when expressed in Sf9 insect cells, traffics to the cell membrane but is inactive, as revealed by its inability to hydrolyze ATP. Coexpressing the G553L mutant together with the wild-type protein in HEK 293 cells does not change the mutant’s altered localization, suggesting that no mutant/wild-type dimers are formed. Mutation of the same residue to glutamic acid (G553E) also leads to significantly decreased protein expression level, altered glycosylation and ER retention. These data suggest that the above-mentioned residues in TM1 and TM5 of ABCG2 are important in protein trafficking and are consistent with, but do not yet prove, involvement in dimerization. We also report the creation and limited experimental testing of a computer
63
model of ABCG2 based on homology to bacterial ABC transporters with available crystal structures. The dimeric model is very informative and can serve as a template for
future
experiments
aimed
at
understanding
64
the
ABCG2
molecule.
Irodalomjegyzék Abbott, BL, Colapietro, AM, Barnes, Y, Marini, F, Andreeff, M, and Sorrentino, BP. (2002) Low levels of ABCG2 expression in adult AML blast samples. Blood 100:4594601 Allen, JD, Brinkhuis, RF, Wijnholds, J, and Schinkel, AH. (1999) The mouse Bcrp1/Mxr/Abcp gene: amplification and overexpression in cell lines selected for resistance to topotecan, mitoxantrone, or doxorubicin. Cancer Res 59:4237-41 Allen, JD, Jackson, SC, and Schinkel, AH. (2002) A mutation hot spot in the Bcrp1 (Abcg2) multidrug transporter in mouse cell lines selected for Doxorubicin resistance. Cancer Res 62:2294-9 Allen, JD, van Loevezijn, A, Lakhai, JM, van der Valk, M, van Tellingen, O, Reid, G, Schellens, JHM, Koomen, G-J, and Schinkel, AH. (2002) Potent and Specific Inhibition of the Breast Cancer Resistance Protein Multidrug Transporter in Vitro and in Mouse Intestine by a Novel Analogue of Fumitremorgin C. Mol Cancer Ther 1:417425 Allikmets, R, Schriml, LM, Hutchinson, A, Romano-Spica, V, and Dean, M. (1998) A human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is involved in multidrug resistance. Cancer Res 58:5337-9 Altmann F, Staudacher E, Wilson IB, Marz L. (1999) Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycoconj J 16(2):109-23 Ambudkar SV, Lelong IH, Zhang J, Cardarelli CO, Gottesman MM, Pastan I. (1992) Partial purification and reconstitution of the human multidrug-resistance pump: characterization of the drug-stimulatable ATP hydrolysis.Proc Natl Acad Sci U S A 89(18):8472-6 Arselin G, Giraud MF, Dautant A, Vaillier J, Brethes D, Coulary-Salin B, Schaeffer J, Velours J. (2003) The GxxxG motif of the transmembrane domain of subunit e is involved in the dimerization/oligomerization of the yeast ATP synthase complex in the
65
mitochondrial membrane. Eur J Biochem 270(8):1875-84 Bailey-Dell, KJ, Hassel, B, Doyle, LA, and Ross, DD. (2001) Promoter characterization and genomic organization of the human breast cancer resistance protein (ATP-binding cassette transporter G2) gene. Biochim Biophys Acta 1520:23441 Berkower, C and Michaelis, S. (1999) Mutational analysis of the yeast a-factor transporter STE6, a member of the ATP binding cassette (ABC) protein superfamily. EMBO J 10:3777-85 Bhatia, A, Schafer, HJ, and Hrycyna, CA. (2005) Oligomerization of the human ABC transporter ABCG2: evaluation of the native protein and chimeric dimers. Biochemistry 44:10893-904 Brosig B, Langosch D. (1998) The dimerization motif of the glycophorin A transmembrane segment in membranes: importance of glycine residues. Protein Sci 7(4):1052-6 Burger, H, van Tol, H, Boersma, AW, Brok, M, Wiemer, EA, Stoter, G, and Nooter, K. (2004) Imatinib mesylate (STI571) is a substrate for the breast cancer resistance protein (BCRP)/ABCG2 drug pump. Blood 104:2940-2 Cascorbi, I. Role of pharmacogenetics of ATP-binding cassette transporters in the pharmacokinetics of drugs. (2006) Pharmacol Ther (Epub ahead of print) Chang, G. (2003) Structure of MsbA from Vibrio cholera: a multidrug resistance ABC transporter homolog in a closed conformation. J Mol Biol 330:419-30 Chang, G and Roth, CB. (2001) Structure of MsbA from E. coli: a homolog of the multidrug resistance ATP binding cassette (ABC) transporters. Science 293:1793-800 Chen J, Lu G, Lin J, Davidson AL, Quiocho FA. (2003) A tweezers-like motion of the ATP-binding cassette dimer in an ABC transport cycle. Mol Cell (3):651-61 Chen, Y-N, Mickley, LA, Schwartz, AM, Acton, EM, Hwang, J and Fojo, AT (1990)
66
Characterization of Adriamycin-resistant human breast cancer cells which display overexpression of a novel resistance-related membrane protein. J Biol Chem 265:10073-10080. Cooray, HC, Janvilisri, T, van Veen, HW, Hladky, SB, and Barrand, MA. (2004) Interaction of the breast cancer resistance protein with plant polyphenols. Biochem Biophys Res Commun 317:269-75 Cserepes J, Szentpetery Z, Seres L, Ozvegy-Laczka C, Langmann T, Schmitz G, Glavinas H, Klein I, Homolya L, Varadi A, Sarkadi B, Elkind NB. (2004) Functional expression and characterization of the human ABCG1 and ABCG4 proteins: indications for heterodimerization. Biochem Biophys Res Commun 20(3):860-7 Dean, M, Annilo, T. (2005) Evolution of the ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily in vertebrates. Annu Rev Genomics Hum Genet 6:123-42. Dean, M, Rzhetsky, A, and Allikmets, R. (2001) The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. Genome Res 11:1156-66 de Bruin, M, Miyake, K, Litman, T, Robey, R, and Bates, SE. (1999) Reversal of resistance by GF120918 in cell lines expressing the ABC half-transporter, MXR. Cancer Lett 146:117-26 Diestra, JE, Scheffer, GL, Catala, I, Maliepaard, M, Schellens, JH, Scheper, RJ, Germa-Lluch, JR, and Izquierdo, MA. (2002) Frequent expression of the multi-drug resistance-associated protein BCRP/MXR/ABCP/ABCG2 in human tumours detected by the BXP-21 monoclonal antibody in paraffin-embedded material. J Pathol 198:213219 Diop, NK and Hrycyna, CA. (2005) N-Linked glycosylation of the human ABC transporter ABCG2 on asparagine 596 is not essential for expression, transport activity, or trafficking to the plasma membrane. Biochemistry 44:5420-9 Doyle, LA, Yang, W, Abruzzo, LV, Krogmann, T, Gao, Y, Rishi, AK, and Ross, DD. (1998) A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95:15665-70
67
Ee, PL, Kamalakaran, S, Tonetti, D, He, X, Ross, DD, and Beck, WT. (2004) Identification of a novel estrogen response element in the breast cancer resistance protein (ABCG2) gene. Cancer Res 64:1247-51 Elkind, NB, Szentpetery, Z, Apati, A, Ozvegy-Laczka, C, Varady, G, Ujhelly, O, Szabo, K, Homolya, L, Varadi, A, Buday, L, Keri, G, Nemet, K, and Sarkadi, B. (2005) Multidrug transporter ABCG2 prevents tumor cell death induced by the epidermal growth factor receptor inhibitor Iressa (ZD1839, Gefitinib). Cancer Res 65:1770-7 Fetsch, PA, Abati, A, Litman, T, Morisaki, K, Honjo, Y, Mittal, K, and Bates, SE. (2005) Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett 235(1):84-92 Galimberti, S, Guerrini, F, Palumbo, GA, Consoli, U, Fazzi, R, Morabito, F, Santini, V, and Petrini, M. (2004) Evaluation of BCRP and MDR-1 co-expression by quantitative molecular assessment in AML patients. Leuk Res 28:367-72 Gerber D, Shai Y. (2001) In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem 276(33):31229-32 Goodell, MA, Rosenzweig, M, Kim, H, Marks, DF, DeMaria, M, Paradis, G, Grupp, SA, Sieff, CA, Mulligan, RC, and Johnson, RP. (1997) Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med 3:1337-45 Goodell, MA, Brose, K, Paradis, G, Conner, AS, Mulligan, RC. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. (1996) J Exp Med 183(4):1797-806 Gottesman, MM, Fojo, T, Bates, SE. (2002) Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. Nat Rev Cancer 2(1):48-58 Graf GA, Cohen JC, Hobbs HH (2004) Missense mutations in ABCG5 and ABCG8 disrupt heterodimerization and trafficking. J Biol Chem 279(23):24881-8 Graf, GA, Yu, L, Li, WP, Gerard, R, Tuma, PL, Cohen, JC, and Hobbs, HH. (2003)
68
ABCG5 and ABCG8 are obligate heterodimers for protein trafficking and biliary cholesterol excretion. J Biol Chem 278:48275-82 Gribar JJ, Ramachandra M, Hrycyna CA, Dey S, Ambudkar SV. (2000) Functional characterization of glycosylation-deficient human P-glycoprotein using a vaccinia virus expression system. J Membr Biol 173(3):203-14 Haugland, R. P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Products , 6th Ed. Molecular Probes, Oregon. Editor: Michelle T. Z. Spence. Chapter 8, Section 8.1, page 151, 2nd paragraph Henriksen, U, Fog, JU, Litman, T, and Gether, U. (2005/A) Identification of intra- and intermolecular disulfide bridges in the multidrug resistance transporter ABCG2. J Biol Chem 280:36926-34 Henriksen, U, Gether, U, and Litman, T. (2005/B) Effect of Walker A mutation (K86M) on oligomerization and surface targeting of the multidrug resistance transporter ABCG2. J Cell Sci 118:1417-26 Honjo, Y, Hrycyna, CA, Yan, QW, Medina-Perez, WY, Robey, RW, van de Laar, A, Litman, T, Dean, M, and Bates, SE. (2001) Acquired mutations in the MXR/BCRP/ABCP
gene
alter
substrate
specificity
in
MXR/BCRP/ABCP-
overexpressing cells. Cancer Res 61:6635-9 Horton, R. M. (1993) Methods in Molecular Biology, vol. 15 (PCR Protocols: Current Methods and Applications) (White, B. A., ed.), pp. 251-268, Humana Press, Totowa, NJ. Imai, Y, Asada, S, Tsukahara, S, Ishikawa, E, Tsuruo, T, and Sugimoto, Y. (2003) Breast cancer resistance protein exports sulfated estrogens but not free estrogens. Mol Pharmacol 64:610-8 Imai, Y, Ishikawa, E, Asada, S, and Sugimoto, Y. (2005) Estrogen-mediated post transcriptional down-regulation of breast cancer resistance protein/ABCG2. Cancer Res 65:596-604
69
Imai, Y, Nakane, M, Kage, K, Tsukahara, S, Ishikawa, E, Tsuruo, T, Miki, Y, and Sugimoto, Y. (2002) C421A polymorphism in the human breast cancer resistance protein gene is associated with low expression of Q141K protein and low-level drug resistance. Mol Cancer Ther 1:611-6 Janvilisri, T, Venter, H, Shahi, S, Reuter, G, Balakrishnan, L, and van Veen, HW. (2003) Sterol transport by the human breast cancer resistance protein (ABCG2) expressed in Lactococcus lactis. J Biol Chem 278:20645-51 Jonker, JW, Buitelaar, M, Wagenaar, E, Van Der Valk, MA, Scheffer, GL, Scheper, RJ, Plosch, T, Kuipers, F, Elferink, RP, Rosing, H, Beijnen, JH, and Schinkel, AH. (2002) The breast cancer resistance protein protects against a major chlorophyllderived dietary phototoxin and protoporphyria. Proc Natl Acad Sci U S A 99:15649-54 Jonker, JW, Merino, G, Musters, S, van Herwaarden, AE, Bolscher, E, Wagenaar, E, Mesman, E, Dale, TC, and Schinkel, AH. (2005) The breast cancer resistance protein BCRP (ABCG2) concentrates drugs and carcinogenic xenotoxins into milk. Nat Med 11:127-9 Juliano, RL, Ling, V. (1976) A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta 455(1):152-62. Kage, K, Tsukahara, S, Sugiyama, T, Asada, S, Ishikawa, E, Tsuruo, T, and Sugimoto, Y. (2002) Dominant-negative inhibition of breast cancer resistance protein as drug efflux pump through the inhibition of S-S dependent homodimerization. Int J Cancer 97:626-30 Kellner, U, Hutchinson, L, Seidel, A, Lage, H, Danks, MK, Dietel, M, and Kaufmann, SH. (1997) Decreased drug accumulation in a mitoxantrone-resistant gastric carcinoma cell line in the absence of P-glycoprotein. Int J Cancer 71:817-24 Knutsen, T, Rao, VK, Ried, T, Mickley, L, Schneider, E, Miyake, K, Ghadimi, BM, Padilla-Nash, H, Pack, S, Greenberger, L, Cowan, K, Dean, M, Fojo, T, and Bates, S. (2000) Amplification of 4q21-q22 and the MXR gene in independently derived mitoxantrone-resistant cell lines. Genes Chromosomes Cancer 27:110-6
70
Komatani, H, Kotani, H, Hara, Y, Nakagawa, R, Matsumoto, M, Arakawa, H, and Nishimura, S. (2001) Identification of breast cancer resistant protein/mitoxantrone resistance/placenta-specific, ATP-binding cassette transporter as a transporter of NB506 and J-107088, topoisomerase I inhibitors with an indolocarbazole structure. Cancer Res 61:2827-32 Krishnamurthy, P, Ross, DD, Nakanishi, T, Bailey-Dell, K, Zhou, S, Mercer, KE, Sarkadi, B, Sorrentino, BP, and Schuetz, JD. 2004. The stem cell marker Bcrp/ABCG2 enhances hypoxic cell survival through interactions with heme. J Biol Chem 279:24218-25 Lee, JS, Scala, S, Matsumoto, Y, Dickstein, B, Robey, R, Zhan, Z, Altenberg, G, and Bates, SE. (1997) Reduced drug accumulation and multidrug resistance in human breast cancer cells without associated P-glycoprotein or MRP overexpression. J Cell Biochem 65:513-26 Liu Y, Engelman DM, Gerstein M. (2002) Genomic analysis of membrane protein families: abundance and conserved motifs. Genome Biol 3(10):research0054 Loo TW, Clarke DM. (1997) Correction of defective protein kinesis of human Pglycoprotein mutants by substrates and modulators. J Biol Chem 272(2):709-12 Mackenzie, SM, Brooker, MR, Gill, TR, Cox, GB, Howells, AJ, and Ewart, GD. (1999) Mutations in the white gene of Drosophila melanogaster affecting ABC transporters that determine eye colouration. Biochim Biophys Acta 1419:173-85 Maliepaard, M, Scheffer, GL, Faneyte, IF, van Gastelen, MA, Pijnenborg, AC, Schinkel, AH, van De Vijver, MJ, Scheper, RJ, and Schellens, JH. (2001) Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res 61:3458-64 Melnyk RA, Partridge AW, Deber CM. (2002) Transmembrane domain mediated selfassembly
of
major
coat
protein
J Mol Biol (1):63-72
71
subunits
from
Ff
bacteriophage.
Mendrola JM, Berger MB, King MC, Lemmon MA. (2002) The single transmembrane domains
of
ErbB
receptors
self-associate
in
cell
membranes.
J Biol Chem 277(7):4704-12 Miyake, K, Mickley, L, Litman, T, Zhan, Z, Robey, R, Cristensen, B, Brangi, M, Greenberger, L, Dean, M, Fojo, T, and Bates, SE. (1999) Molecular cloning of cDNAs which are highly overexpressed in mitoxantrone-resistant cells: demonstration of homology to ABC transport genes. Cancer Res 59:8-13 Miwa, M, Tsukahara, S, Ishikawa, E, Asada, S, Imai, Y, and Sugimoto, Y. (2003) Single amino acid substitutions in the transmembrane domains of breast cancer resistance protein (BCRP) alter cross resistance patterns in transfectants. Int J Cancer 107:757-63 Mizuarai, S, Aozasa, N, and Kotani, H. (2004) Single nucleotide polymorphisms result in impaired membrane localization and reduced atpase activity in multidrug transporter ABCG2. Int J Cancer 109:238-46 Morisaki, K, Robey, RW, Ozvegy-Laczka, C, Honjo, Y, Polgar, O, Steadman, K, Sarkadi, B and Bates, SE. (2005) Single nucleotide polymorphisms modify the transporter activity of ABCG2. Cancer Chemother Pharmacol 56:161-72. Morris, ME and Zhang, S. (2006) Flavonoid-drug interactions: Effects of flavonoids on ABC transporters. Life Sci 78(18):2116-30 Nakagawa, M, Schneider, E, Dixon, KH, Horton, J, Kelley, K, Morrow, C and Cowan, KH. (1992) Reduced intracellular drug accumulation in the absence of P-glycoprotein (mdr1) overexpression in mitoxantrone-resistant human MCF-7 human breast cancer cells. Cancer Res 52:6175-6181. Ozvegy C, Litman T, Szakacs G, Nagy Z, Bates S, Varadi A, Sarkadi B (2001) Functional characterization of the human multidrug transporter, ABCG2, expressed in insect cells. Biochem Biophys Res Commun 285(1):111-7 Ozvegy C, Varadi A, Sarkadi B. (2002) Characterization of drug transport, ATP hydrolysis, and nucleotide trapping by the human ABCG2 multidrug transporter.
72
Modulation of substrate specificity by a point mutation J Biol Chem 277(50):47980-90 Ozvegy-Laczka, C, Koblos, G, Sarkadi, B, and Varadi, A. (2005/A) Single amino acid (482) variants of the ABCG2 multidrug transporter: major differences in transport capacity and substrate recognition. Biochim Biophys Acta 1668:53-63 Ozvegy-Laczka C, Varady G, Koblos G, Ujhelly O, Cervenak J, Schuetz JD, Sorrentino BP, Koomen GJ, Varadi A, Nemet K, Sarkadi B. (2005/B) Functiondependent conformational changes of the ABCG2 multidrug transporter modify its interaction with a monoclonal antibody on the cell surface.J Biol Chem. 280(6):421927 Pavek, P, Merino, G, Wagenaar, E, Bolscher, E, Novotna, M, Jonker, JW, and Schinkel, AH. (2005) Human breast cancer resistance protein: interactions with steroid drugs, hormones, the dietary carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo(4,5b)pyridine, and transport of cimetidine. J Pharmacol Exp Ther 312:144-52 Rabindran, SK, He, H, Singh, M, Brown, E, Collins, KI, Annable, T, and Greenberger, LM. (1998) Reversal of a novel multidrug resistance mechanism in human colon carcinoma cells by fumitremorgin C. Cancer Res 58:5850-8 Rao, VK, Wangsa, D, Robey, RW, Huff, L, Honjo, Y, Hung, J, Knutsen, T, Ried, T, and Bates, SE. (2005) Characterization of ABCG2 gene amplification manifesting as extrachromosomal DNA in mitoxantrone-selected SF295 human glioblastoma cells. Cancer Genet Cytogenet 160:126-33 Reyes, CL and Chang, G. (2005) Structure of the ABC transporter MsbA in complex with ADP.vanadate and lipopolysaccharide. Science 308:1028-31 Riordan, JR, Rommens, JM, Kerem, B, Alon, N, Rozmahel, R, Grzelczak, Z, Zielenski, J, Lok, S, Plavsic, N, Chou, JL, et al. (1989) Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 245(4925):1437 Robey, RW, Honjo, Y, Morisaki, K, Nadjem, TA, Runge, S, Risbood, M, Poruchynsky, MS and Bates, SE . (2003) Mutations at amino acid 482 in the ABCG2 gene affect
73
substrate and antagonist specificity. Br J Cancer 89:1971-8. Robey, RW, Medina-Perez, WY, Nishiyama, K, Lahusen, T, Miyake, K, Litman, T, Senderowicz, AM, Ross, DD, and Bates, SE. (2001) Overexpression of the ATPbinding cassette half-transporter, ABCG2 (MXR/BCRP/ABCP1), in flavopiridolresistant human breast cancer cells. Clin Cancer Res 7:145-52 Robey, RW, Polgar, O, Deeken, J, To, KW, and Bates, SE. (2006) Drug transporters, Chapter 12: Breast cancer Resistance Protein. A könyv megjelenése tervezett a Wiley and Son kiadó által 2006-ban. Robey, RW, Steadman, K, Polgar, O, Morisaki, K, Blayney, M, Mistry, P, and Bates, SE. (2004) Pheophorbide a is a specific probe for ABCG2 function and inhibition. Cancer Res 64:1242-6 Ross, DD, Karp, JE, Chen, TT, and Doyle, LA. (2000) Expression of breast cancer resistance protein in blast cells from patients with acute leukemia. Blood 96:365-368 Russ, WP and Engelman, DM. (2000) The GxxxG motif: a framework for transmembrane helix-helix association. J Mol Biol 296:911-9 Sarkadi B, Price EM, Boucher RC, Germann UA, Scarborough GA. (1992) Expression of the human multidrug resistance cDNA in insect cells generates a high activity drugstimulated membrane ATPase. J Biol Chem 267(7):4854-8 Sauerbrey, A, Sell, W, Steinbach, D, Voigt, A, and Zintl, F. (2002) Expression of the BCRP gene (ABCG2/MXR/ABCP) in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 118:147-50 Scheffer, GL, Maliepaard, M, Pijnenborg, AC, van Gastelen, MA, de Jong, MC, Schroeijers, AB, van der Kolk, DM, Allen, JD, Ross, DD, van der Valk, P, Dalton, WS, Schellens, JH, and Scheper, RJ. (2000) Breast cancer resistance protein is localized at the plasma membrane in mitoxantrone- and topotecan-resistant cell lines. Cancer Res 60:2589-93
74
Senes A, Gerstein M, Engelman DM. (2000) Statistical analysis of amino acid patterns in transmembrane helices: the GxxxG motif occurs frequently and in association with beta-branched residues at neighboring positions J Mol Biol 296(3):921-36 Sparreboom, A, Gelderblom, H, Marsh, S, Ahluwalia, R, Obach, R, Principe, P, Twelves, C, Verweij, J, and McLeod, HL. (2004) Diflomotecan pharmacokinetics in relation to ABCG2 421C>A genotype. Clin Pharmacol Ther 76:38-44 Sparreboom, A, Loos, WJ, Burger, H, Sissung, TM, Verweij, J, Figg, WD, Nooter, K, and Gelderblom, H. (2005) Effect of ABCG2 Genotype on the Oral Bioavailability of Topotecan. Cancer Biol Ther 4:650-8 Stam, RW, van den Heuvel-Eibrink, MM, den Boer, ML, Ebus, ME, Janka-Schaub, GE, Allen, JD, and Pieters, R. (2004) Multidrug resistance genes in infant acute lymphoblastic leukemia: Ara-C is not a substrate for the breast cancer resistance protein. Leukemia 18:78-83 Suvannasankha, A, Minderman, H, O'Loughlin, KL, Nakanishi, T, Greco, WR, Ross, DD, and Baer, MR. (2004) Breast cancer resistance protein (BCRP/MXR/ABCG2) in acute myeloid leukemia: discordance between expression and function. Leukemia 18:1252-7 Suzuki, M, Suzuki, H, Sugimoto, Y, and Sugiyama, Y. (2003) ABCG2 transports sulfated conjugates of steroids and xenobiotics. J Biol Chem 278:22644-9 Szakacs G, Ozvegy C, Bakos E, Sarkadi B, Varadi A. (2001) Role of glycine-534 and glycine-1179 of human multidrug resistance protein (MDR1) in drug-mediated control of ATP hydrolysis. Biochem J 356(Pt 1):71-5 Tanaka, Y, Slitt, AL, Leazer, TM, Maher, JM, and Klaassen, CD. (2005) Tissue distribution and hormonal regulation of the breast cancer resistance protein (Bcrp/Abcg2) in rats and mice. Biochem Biophys Res Commun 326:181-7 Uchida, N, Leung, FY, Eaves, CJ. (2002) Liver and marrow of adult mdr-1a/1b(-/-) mice show normal generation, function, and multi-tissue trafficking of primitive
75
hematopoietic cells. Exp Hematol (8):862-9 Yanase, K, Tsukahara, S, Asada, S, Ishikawa, E, Imai, Y, and Sugimoto, Y. (2004) Gefitinib reverses breast cancer resistance protein-mediated drug resistance. Mol Cancer Ther 3:1119-25 Yang, CJ, Horton, JK, Cowan, KH, and Schneider, E. (1995) Cross-resistance to camptothecin analogues in a mitoxantrone-resistant human breast carcinoma cell line is not due to DNA topoisomerase I alterations. Cancer Res 55:4004-9 Yasuda, S, Itagaki, S, Hirano, T, and Iseki, K. (2005) Expression level of ABCG2 in the placenta decreases from the mid stage to the end of gestation. Biosci Biotechnol Biochem 69:1871-6 van Der Kolk, DM, Vellenga, E, Scheffer, GL, Muller, M, Bates, SE, Scheper, RJ, and De Vries, EG. (2002) Expression and activity of breast cancer resistance protein (BCRP) in de novo and relapsed acute myeloid leukemia. Blood 99:3763-3770 van der Pol, MA, Broxterman, HJ, Pater, JM, Feller, N, van der Maas, M, Weijers, GW, Scheffer, GL, Allen, JD, Scheper, RJ, van Loevezijn, A, Ossenkoppele, GJ, and Schuurhuis, GJ. (2003) Function of the ABC transporters, P-glycoprotein, multidrug resistance protein and breast cancer resistance protein, in minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica 88:134-47 van Herwaarden, AE, Wagenaar, E, Karnekamp, B, Merino, G, Jonker, JW, and Schinkel, AH. (2006) Breast cancer resistance protein (Bcrp1/Abcg2) reduces systemic exposure of the dietary carcinogens aflatoxin B1, IQ and Trp-P-1 but also mediates their secretion into breast milk. Carcinogenesis 27:123-30 van Veen HW, Konings WN. (1997) Multidrug transporters from bacteria to man: similarities in structure and function. Semin Cancer Biol (3):183-91. Volk, EL, Farley, KM, Wu, Y, Li, F, Robey, RW, and Schneider, E. (2002) Overexpression of wild-type breast cancer resistance protein mediates methotrexate resistance. Cancer Res 62:5035-5040
76
Wakabayashi K, Nakagawa H, Adachi T, Kii I, Kobatake E, Kudo A, Ishikawa T. (2006) Identification of cysteine residues critically involved in homodimer formation and protein expression of human ATP-binding cassette transporter ABCG2: a new approach using the flp recombinase system. J Exp Ther Oncol 5(3):205-22 Wang, H, Zhou, L, Gupta, A, Vethanayagam, RR, Zhang, Y, Unadkat, JD, and Mao, Q. (2006) Regulation of BCRP/ABCG2 Expression By Progesterone and 17{beta}Estradiol in Human Placental BeWo Cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 290(5):E798-807 Whittington DA, Waheed A, Ulmasov B, Shah GN, Grubb JH, Sly WS, Christianson DW. (2001) Crystal structure of the dimeric extracellular domain of human carbonic anhydrase XII, a bitopic membrane protein overexpressed in certain cancer tumor cells.Proc Natl Acad Sci U S A 98(17):9545-50 Zhou, S, Schuetz, JD, Bunting, KD, Colapietro, AM, Sampath, J, Morris, JJ, Lagutina, I, Grosveld, GC, Osawa, M, Nakauchi, H, and Sorrentino, BP. (2001) The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med 7:1028-34
77
Saját publikációk jegyzéke A dolgozat alapjául szolgáló közlemények: Polgar, O, Robey, RW, Morisaki, K, Dean, M, Michejda, C, Sauna, ZE, Ambudkar SV, Tarasova, N, Bates, SE. (2004) Mutational analysis of ABCG2: role of the GXXXG motif. Biochemistry 43(29):9448-56. Polgar, O, Ozvegy-Laczka, C, Robey, RW, Morisaki, K, Okada, M, Tamaki, A, Koblos, G,
Elkind, NB, Ward, Y, Dean, M, Sarkadi, B, and Bates, SE. (2006)
Mutational Studies of G553 in TM5 of ABCG2: a Residue Potentially Involved in Dimerization. Biochemistry 45(16):5251-60. Egyéb saját közlemények: Robey, RW, Fetsch, PA, Polgar, O, Dean, M, and Bates, SE. (2006) The livestock photosensitizer, phytoporphyrin (phylloerythrin), is a substrate of the ATP-binding cassette transporter ABCG2. Res Vet Sci, 2006 Jun 27; [Epub ahead of print] Morisaki, K, Robey, RW, Ozvegy-Laczka, C, Honjo, Y, Polgar, O, Steadman, K, Sarkadi, B, Bates, SE. (2005) Single nucleotide polymorphisms modify the transporter activity of ABCG2. Cancer Chemother Pharmacol 56(2):161-72. Robey, RW, Steadman, K, Polgar, O, Bates, SE. (2005) ABCG2-mediated transport of photosensitizers: potential impact on photodynamic therapy. Cancer Biol Ther 4(2):187-94. Polgar, O, Bates, SE. (2005) ABC transporters in the balance: is there a role in multidrug resistance? Biochem. Soc Trans 33(Pt 1):241-5. Robey, RW, Steadman, K, Polgar, O, Morisaki, K, Blayney, M, Mistry, P, Bates, SE. (2004) Pheophorbide a is a specific probe for ABCG2 function and inhibition. Cancer Res 64(4):1242-6.
78
Leonard, GD, Polgar, O, Bates, SE. (2002) ABC transporters and inhibitors: new targets, new agents. Curr Opin Investig Drugs 3(11):1652-9.
79
Köszönetnyilvánítás Elsősorban Dr. Susan Batesnek szeretnék köszönetet mondani, amiért az általa vezetett laboratóriumban a jelen dolgozat alapjául szolgáló kísérletek elvégzéséhez biztosította számomra a lehetőséget. Hálás vagyok Susan-nek a kutatási témáért, valamint a folyamatos szakmai és emberi támogatásáért. Köszönettel tartozom továbbá a Dr. Susan Bates és a Dr. Tito Fojo által irányított kutatócsoportok összes tagjának, akik készségesen segítettek a viszgálatok elvégzésében és a felmerülő problémák megoldásában. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Váradi Andrásnak az általa nyújtott segítséget. Külön köszönettel tartozom Dr. Özvegy-Laczka Csillának, amiért a rovarsejtes expressziós rendszer használatára megtanított és az azzal kapcsolatos kísérletek elvégzésében segítségemre volt. Hálás vagyok Dr. Sarkadi Balázsnak amiért az általa vezetett laboratóriumban mindezt lehetővé tette.
80
