__________________________________________________________________________________ Semmelweis Egyetem, Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Program
Doktori (Ph.D.) értekezés
A HSP90
NUKLEOTIDKÖTÉSÉNEK VIZSGÁLATA
Dr. Sőti Csaba
Témavezető: Dr. Csermely Péter egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet
Budapest 2002 __________________________________________________________________________________
ÖSSZEFOGLALÁS A 90 kDa molekulatömegű stresszfehérje (Hsp90) az eukarióta sejt esszenciális dajkafehérjéje. N-terminális ATP-kötő és C-terminális dimerizációs doménjét egy töltött aminosavakban gazdag régió köti össze. Chaperon hatása nélkülözhetetlen a labilis szerkezetű fehérjék felgombolyodásához, stabilizálásához. Az ún. kliensfehérjék a jelátviteli folyamatok kulcsmolekulái (p53, src, Raf, telomeráz), így a Hsp90 funkciójának csökkenése fontos szerepet játszhat az epigenetikus evolúcióban, a civilizációs betegségek elterjedésében, farmakológiás gátlása pedig a daganatellenes terápiában. A Hsp90 funkcióját kismolekulák szabályozzák. A chaperon ciklust a fehérje ATPkötése és ATPáz aktivitása működteti. Az N-terminális ATP-antagonista geldanamycin, illetve az ismeretlen szerkezetű endogén “stabilizátorok” az ATP-ciklust különböző stádiumokban befagyasztják, a kliens aktivációját meggátolják. A Hsp90 kismolekulákkal kialakított kölcsönhatásainak tanulmányozása által képet kaphatunk egy ismeretlen, esszenciális funkció molekuláris alapjairól, valamint olyan gyógyszerekhez juthatunk, melyekkel korunk népbetegségeit, így keringési és degeneratív betegségeket, többek között daganatokat gyógyíthatunk. A Hsp90 endogén stabilizátorait modellező átmenetifém-anionokkal, illetve nukleotidokkal kialakított kölcsönhatását vizsgáló kísérleteink legfontosabb eredményei az alábbiakban foglalhatók össze: 1., Kimutattuk a Hsp90 kölcsönhatását különféle különböző vanadát-oligoanionokkal, illletve permolibdáttal. A permolibdát kötésében részt vevő régiót a Hsp90 középső doménjére lokalizáltuk. 2., Igazoltuk, hogy a Hsp90 rendelkezik egy második, középső-C-terminális doménen elhelyezkedő ATP-kötőhellyel, mely ciszplatinnal specifikusan gátolható. Azonosítottunk egy új N-terminális g-foszfátkötő motívumot, és ennek közelében találtunk rá a C-terminális foszfát-kötő szakaszokra. 3., Eredményeink szerint a Hsp90 töltött régiója egy nukleotid-függő molekuláris kapcsoló, mely csak az N-terminális ATP kötése után teszi lehetővé a C-terminális ATPkötést. A két domén oda-vissza irányuló, szétkapcsolható kölcsönhatásban van. 4., Kísérleteink először mutatták ki a ciszplatin különböző Hsp90-komplexekre kifejtett hatását, így elsőként szolgálnak funkcionális bizonyítékkal az N- és C-terminális ATPkötőhely eltérő biológiai szerepéről. Ciszplatin nem befolyásolta a Hsp90 N-terminális (p23-) komplexének kialakulását, de stabilizálta a C-terminális (Hsp70-) komplexet. A Hsp90-függő kliensfehérjék közül nem hatott az Lck és Raf-1 aktiválódására, ezzel szemben gátolta a luciferáz felgombolyodását. Eredményeink alapján a ciszplatin újabb eszköze lehet a Hsp90 működés modulálásának, és specifikusabb származékaiból “második generációs Hsp90inhibitorok”, ígéretes daganatellenes szerek vagy egyéb gyógyszerek válhatnak, melyek segítséget nyújthatnak a C-terminális nukleotid-kötőhely biológiai szerepének felderítésében.
i
SUMMARY The 90 kDa heat shock protein (Hsp90) is an essential molecular chaperone of eukaryotic cells. It is composed of a non-canonical N-terminal ATP-binding domain and a Cterminal dimerization domain, connected by a highly charged region. Hsp90, as central part of a multiprotein complex, the foldosome chaperones a wide variety of inherently unstable ’clients’, mostly represented by key signalling molecules, such as p53, src, Raf, telomerase, or even mutant proteins. A decrease in Hsp90 function may lead to sudden epigenetic evolutionary changes, epidemic appearance of civilizational diseases. Pharmacological inhibition of Hsp90 is an emerging strategy in antitumor therapy. Hsp90 function is modulated by low molecular weight compounds. The chaperone cycle is driven by its ATP-binding and ATPase activity, while the N-terminal ATP-antagonist geldanamycin and hitherto unidentified endogenous cytosolic stabilizers freeze Hsp90 at different stages of the cycle, abolishing client protein activation. Studying these interactions provides a detailed view on the molecular mechanism of Hsp90 action as well as promotes the development of new drugs effective against age-related degenerative disorders, such as diabetes, cardiovascular diseases and cancer. We set out to study the interaction of Hsp90 with nucleotides and with transition state metal oxyanions, model compounds for the endogenous stabilizers. Our major findings are summarized as follows. 1., We could demonstrate a direct binding of different vanadate oligoanions and permolybdate to Hsp90. The permolybdate-binding region is mapped to the middle domain of Hsp90. 2., We showed that Hsp90 possesses a second, C-terminal ATP-binding site. Cisplatin is a specific inhibitor of the C-terminal nucleotide-binding domain. We identified a novel Nterminal g-phosphate-binding motif in the middle domain in close proximity or overlapping with the C-terminal phosphate-binding sites. 3., The charged region is a nucleotide-dependent molecular switch, which liberates the C-terminal nucleotide-binding domain upon N-terminal ATP-binding. The nucleotide-binding domains have an intricate allosteric communication that can be uncoupled. 4., Using geldanamycin, novobiocin and cisplatin we presented functional evidence on the divergent biological roles of the N- and C-terminal nucleotide-binding sites, respectively. Cisplatin did not affect N-terminal (p23-) complex formation in vitro, while stabilized the Cterminal Hsp90-Hsp70 complex in vivo. Lck and Raf-1 activation in T-cells was not abrogated by cisplatin, however, luciferase refolding was potently inhibited in reticulocyte lysate. Our data suggest that cisplatin may be a novel tool to manipulate Hsp90 function, facilitating the design of “second generation Hsp90-inhibitors”. The specific compounds may be promising drug-candidates, and may contribute to elucidate the importance of the C-terminal nucleotidebinding domain in a number of (patho)physiological processes.
ii
TARTALOMJEGYZÉK 1.
Bevezetés . .....................................................................................................................................
1
2.
Irodalmi áttekintés.......................................................................................................................
3
2.1.
A dajkafehérjék: életbiztosítás sejtszinten.................................................................................
3
2.2.
A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család........................................................................
5
2.3.
A Hsp90 gén és kifejeződése ....................................................................................................
6
2.4.
A Hsp90 általános szerkezeti vonásai .......................................................................................
9
2.4.1. 2.4.2. 2.4.3. 2.5.
A Hsp90 domén-szerkezete............................................................................................. 9 A Hsp90 poszttranszlációs módosulása .......................................................................... 10 A Hsp90 fő immunogén régiói........................................................................................ 11 A Hsp90 doménjeinek elrendeződése ....................................................................................... 12
2.5.1. 2.5.2. 2.5.3. 2.6.
Intramolekuláris kölcsönhatás és chaperon funkció ....................................................... 12 Intermolekuláris kölcsönhatások a Hsp90-dimerben...................................................... 12 Feltételezhető domén-domén kölcsönhatások ................................................................ 13 A Hsp90 doménjeinek finomszerkezete.................................................................................... 14
2.6.1. 2.6.1.1. 2.6.1.2. 2.6.1.3. 2.6.1.4. 2.6.1.5. 2.6.1.6. 2.6.2. 2.6.2.1. 2.6.2.2. 2.6.2.3. 2.6.2.4. 2.6.2.5. 2.6.2.6. 2.6.3. 2.7.
Az N-terminális ATP-kötő domén .................................................................................. A GHKL fehérje család ............................................................................................... Az ATP-kötés szerkezeti alapjai .................................................................................. A Hsp90 ATPáz aktivitása........................................................................................... A C-terminális régió hatása az ATPáz aktivitásra ....................................................... Az ATP-függő molekuláris fogó.................................................................................. A GHKL-domén specifikus gátlószerei....................................................................... A töltött régió.................................................................................................................. A töltött régió autonóm szerkezete .............................................................................. A töltött régió indukált szerkezete működésének fontos tényezője lehet .................... A töltött régió kalcium kötése...................................................................................... A töltött régió foszforilációja....................................................................................... A töltött régió szerepe a Hsp90 chaperon működésében ............................................. A töltött régió szerepe a Hsp90 sejten belüli elhelyezkedésében ................................ A középső és a C-terminális domén................................................................................
14 15 16 17 20 21 22 23 23 25 26 27 28 29 30
A Hsp90 által kialakított kölcsönhatások.................................................................................. 31
2.7.1. 2.7.1.1. 2.7.1.2. 2.7.2. 2.7.2.1. 2.7.2.2. 2.7.2.3. 2.7.3. 2.7.3.1. 2.7.3.2.
A Hsp90 kölcsönhatásai kismolekulákkal ...................................................................... A középső-C-terminális domén kötőhelyei.................................................................. Taxol kötés az N-terminálison ..................................................................................... A Hsp90 kölcsönhatásai makromolekulákkal................................................................. Az N-terminális domén................................................................................................ A töltött régió............................................................................................................... A középső-C-terminális domén.................................................................................... A Hsp90 oligomerizációja, avagy kölcsönhatások önmagával....................................... A Hsp90 oligomerek előfordulása ............................................................................... Az oligomerizáció szerkezeti alapjai ...........................................................................
iii
32 32 34 34 34 34 35 37 37 38
2.7.3.3. 2.7.3.4. 2.7.3.5. 2.7.3.6. 2.7.3.7.
A Hsp90 elektronmikroszkópos képe – ahogy én láttam............................................. A fánkok a natív Hsp90 homo-oligomerjei.................................................................. Az oligomerek vizsgálata egyéb módszerekkel ........................................................... Az oligomer forma és a mikrotrabekuláris hálózat...................................................... Stressz és oligomerizáció.............................................................................................
38 40 42 44 45
2.8.
A Hsp90 biológiai szerepe .............................................................................................. 46
2.8.1. 2.8.1.1. 2.8.1.2. 2.8.1.3. 2.8.2. 2.8.2.1. 2.8.2.2. 2.8.2.3. 2.8.2.4. 2.8.3.
A Hsp90 passzív chaperon működése............................................................................. A passzív chaperon szerep teret nyer a törzsfejlődés során......................................... A Hsp90 chaperon kötőhelyei...................................................................................... A passzív chaperon aktivitás jelentősége..................................................................... A Hsp90 aktív chaperon működése ................................................................................ Kiket?........................................................................................................................... Mit?.............................................................................................................................. Kikkel?......................................................................................................................... Miért?........................................................................................................................... A Hsp90 ezoterikus sajátosságai.....................................................................................
48 48 50 51 52 52 52 55 59 60
3.
Célkitűzések.................................................................................................................................. 62
4.
Vizsgálati módszerek ................................................................................................................... 63
4.1. Általános megfontolások.............................................................................................................. 63 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.2. 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5. 4.2.6. 4.2.7. 4.2.8. 4.2.9. 4.2.10. 4.2.11. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.4. 4.4.1. 4.4.2. 4.4.3. 4.4.4.
Anyagok .......................................................................................................................... 63 A Hsp90 aminosav sorrendje .......................................................................................... 63 ATP-regenerációs rendszer............................................................................................. 63 Biokémiai, in vitro módszerek .................................................................................................. 63 A Hsp90 fehérjék eredete, kifejezése, tisztítása ............................................................. Különböző tagszámú vanadát oligoanionok előállítása.................................................. A Hsp90 permolibdát-módosításának vizsgálata............................................................ A Hsp90 triptikus emésztése........................................................................................... A Hsp90 [a-32P]ATP-kötésének vizsgálata natív gélen.................................................. A Hsp90 fotoaffinitás jelölése [a-32P]ATP-vel .............................................................. g-foszfát-kapcsolt ATP-Sepharose gyanta kötés............................................................. Oxidatív nukleotid-affinitáshasítás ................................................................................. Hsp90-ATP nitrocellulóz filter kötés.............................................................................. A Hsp90-p23 komplex in vitro összeépítése .................................................................. Hődenaturált luciferáz renaturációja retikulocita lizátumban ........................................
63 64 64 65 65 65 66 66 67 67 67
Biofizikai, szerkezetvizsgálati módszerek ................................................................................ 68 Távoli ultraibolya tartományú cirkuláris dikroizmus mérés........................................... 68 Felületi plazmon rezonancia (SPR) mérés...................................................................... 68 51 V-NMR mérés .............................................................................................................. 69 Sejtbiológiai, in vivo módszerek ............................................................................................... 70 Sejtkultúra....................................................................................................................... A Hsp90 ATP-kötésének in situ vizsgálata..................................................................... A Hsp90-Hsp70 in vivo komplexének vizsgálata ........................................................... Raf-1 és Lck aktivációjának és mennyiségének vizsgálata T-sejteken...........................
iv
70 70 70 70
4.5.
Általános analitikai módszerek ................................................................................................. 71
4.5.1. 4.5.2. 4.5.3. 4.6.
Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)......................................................................... 71 Western blot.................................................................................................................... 71 Fehérjekoncentráció meghatározás................................................................................. 72 Bioinformatikai módszerek....................................................................................................... 72
4.6.1. 4.6.2.
Páros és többszörös szekvencia illesztés ........................................................................ 72 A Hsp90 N-terminális g-foszfát kötőhelyének azonosítása ............................................ 72
5. Eredmények................................................................................................................................... 74 5.1.
A Hsp90 kölcsönhatása vanadát oligoanionokkal..................................................................... 74
5.1.1. 5.1.2. 5.2.
Immobilizált Hsp90 vanadát kötése................................................................................ 74 A Hsp90 vanadát kötésének vizsgálata 51V-NMR-rel ................................................... 76 A Hsp90 kölcsönhatása permolibdáttal..................................................................................... 77
5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.3.
A Hsp90 permolibdát-indukált kovalens módosítása ..................................................... 78 A Hsp90 permolibdát kötésének jellemzése ................................................................... 79 A permolibdát-kötőhely térképezése .............................................................................. 80 A Hsp90 kölcsönhatása ATP-vel .............................................................................................. 81
5.3.1. 5.3.2. 5.3.3. 5.3.4. 5.3.5. 5.3.6. 5.3.6.1. 5.3.6.2. 5.3.6.3. 5.3.7. 5.3.8. 5.3.9. 5.3.10. 5.3.11. 5.3.12. 5.4. 5.4.1. 5.4.2. 5.4.3. 5.4.4.
A Hsp90 [a-32P]ATP kötésének vizsgálata natív gélen.................................................. 83 A Hsp90 nukleotid kötésének vizsgálata SPR-rel........................................................... 84 A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek kimutatása nukleotid-affinitáshasítással.................. 85 A nukleotid-affinitáshasítás igazolása egyéb kísérletekkel ............................................ 87 Két eltérő ATP-kötőhely kimutatása nitrocellulóz filter kötéssel .................................. 88 A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek feltérképezése.................................................................. 90 Az N-terminális ATP-kötőhely azonosítása ................................................................ 90 Az N-terminális g-foszfát-kötőhely predikciója........................................................... 91 A foszfát-kötőhelyek behatárolása epitop térképezéssel ............................................. 92 A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek gátolhatósága................................................................... 93 A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek tulajdonságai ................................................................... 95 Az N- és C-terminális ATP-kötőhelyek kölcsönhatásai ................................................. 97 A p23 partnerfehérje hatása a Hsp90 ATP-kötésére....................................................... 99 Taxol megbontja az N-és C-terminális domén kommunikációját...................................100 A Hsp90 nukleotid-kötésének meghatározása in situ .....................................................100 Ciszplatin hatása a Hsp90 biológiai funkciójára.......................................................................101 Ciszplatin hatása a Hsp90 N-terminális komplexének összeépülésére in vitro .................... 102 Ciszplatin hatása a Hsp90 C-terminális komplexének stabilitására in vivo....................102 Ciszplatin hatása a T-sejt-aktivációs jelpálya Hsp90-függő kinázaira in vivo ...............103 Ciszplatin hatása a Hsp90-függő kliensfehérje renaturációjára in vitro.........................104
6. Az eredmények megbeszélése.......................................................................................................105 6.1. 6.1.1. 6.1.2. 6.2.
A Hsp90 kölcsönhatása vanadáttal ...........................................................................................105 A Hsp90-oligovanadát kölcsönhatás lehetséges szerepe ................................................105 A Hsp90-dekavanadát kölcsönhatás lehetséges szerepe.................................................106 A Hsp90 kölcsönhatása permolibdáttal.....................................................................................106
v
6.2.1. 6.2.2. 6.3. 6.3.1. 6.3.2. 6.3.3. 6.3.4.
A permolibdát, mint molibdát analóg vagy SH-reagens.................................................106 A Hsp90 reaktív SH-csoportjai.......................................................................................107 A Hsp90 kölcsönhatása ATP-vel ..............................................................................................108 Az N-terminális nukleotid-kötőhely ...............................................................................108 A C-terminális nukleotid-kötőhely .................................................................................109 Az N- és C-terminális nukleotid-kötőhely kölcsönhatása...............................................111 Párhuzamok a Hsp104-gyel ............................................................................................114
6.4.
A ciszplatin lehetséges szerepe a Hsp90 működésében............................................................115
6.5.
Szerkezet-hatás összefüggések..................................................................................................117
7. Új tudományos eredmények.........................................................................................................120 7.1.
Új kísérleti eredmények ............................................................................................................120
7.2.
Új módszertani eredmények......................................................................................................121
8. A kutatás további irányai .............................................................................................................122 9. Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................................123 10. Irodalomjegyzék............................................................................................................................I 11. Saját közlemények jegyzéke.........................................................................................................XVI Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények............................................................................XVI Az értekezés témaköréhez szorosan nem kapcsolódó közlemények.....................................................XVI
vi
RÖVIDÍTÉSEK, MAGYARÁZATOK Aha-1 as ATP
Activator of Hsp90 ATPase 1 aminosav adenozin-trifoszfát
ATPgS
adenozin-5’-O-(tiotrifoszfát)
BCK BiP Brij 98 CD Cdc CDK CFTR CheA ClpA/X CP Cyp40 DEAE DMSO DnaJ DTT ECL
elágazó szénláncú a-ketosav dehidrogenáz kináz, eukarióta hisztidin kináz Immunoglobulin nehézlánc kötő (binding) protein, Grp78 polioxietilén-éter, detergens cirkuláris dikrozimus, optikai szerkezetvizsgáló módszer cell division cycle, az élesztő sejtciklusában szerepet játszó gén(termék)ek elnevezése ciklin-dependens kináz cisztikus fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor, kloridcsatorna fehérje bakteriális GHKL-típusú hisztidin kináz ATP-függő prokarióta proteáz cisz-diamin-dikloro-platinum(II), ciszplatin, kemoterápiás szer ciklofilin, ciklosporin A-kötő dajkafehérje peptidil-prolil izomeráz aktivitással dietil-amino-etán dimetil-szulfoxid az E. coli 40 kDa-os dajkafehérjéje (Hsp40 homológ) D,L-ditiotreitol kemilumineszcenciás Western-blot detektálási módszer
eEF-2a
eukarióta elongációs faktor 2 a alegysége
eIF-2a EnvZ ER FK506
eukarióta iníciációs faktor 2 a alegysége bakteriális GHKL-típusú hisztidin kináz endoplazmás retikulum immunszuppresszív makrolid, amely a T-sejt aktiváció több lépését is gátolja; 10-100-szor hatásosabb, mint a ciklosporin A FK506-kötő dajkafehérjék peptidil-prolil izomeráz aktivitással középnyomású folyadék-kromatográfia fluoro-szulfonil-benzoil-adenozin, a fehérjéhez kovalensen kötő ATP-analóg tirozin-kináz, az Src család tagja geldanamycin; a Hsp90 specifikus gátlószere, daganatellenes antibiotikum giráz, Hsp90, hisztidin kináz, MutL fehérjéket magában foglaló ATPáz/kináz szupercsalád riboszóma-asszociált chaperon, prefoldin a humán Grp94 neve glukokortikoid-receptor az E. coli Hsp60-homológja, dajkafehérje az E. coli Hsp10-homológja, dajkafehérje glukóz-regulált fehérje, az xy a protein relatív molekulatömegére utal (kDa) DNS giráz (prokarióta topoizomeráz) GHKL-típusú B alegysége hem aktivátor protein 1, az élesztő hemfüggő transzkripciós faktora agyi Hsp90 homológ lektin a Hsp70 ko-chaperonja (Hsp70 interacting protein/p48) magasnyomású folyadékkromatgráfia
FKBP FPLC FSBA Fyn GA GHKL GimC Gp96 GR GroEL GroES Grpxy GyrB Hap1 HBGp82 Hip HPLC
vii
Hop HSF HSJ1b Hscxy Hsp90N Hspxy HtpG
a Hsp70 és Hsp90 kapcsolódását segítő ko-chaperon (Hsp organizing protein/p60/Sti1) hősokk transzkripciós faktor a Hsp40 család emberi idegszövetben megtalálható tagja az adott hősokk fehérje konstitutív formája membránkötött onkogén Hsp90 homológ hősokk fehérje, az xy a fehérje relatív molekulatömegére utal (kDa) az E. coli Hsp90-homológja
IPTG JFC1 KEKE Lck MAP MBP MEK MutL NAD(P)+
izopropil-b-D-tiogalaktopiranozid, nem metabolizálódó laktóz analóg ismeretlen funkciójú, GHKL-típusú fehérje Lys/Glu tartalmú, fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakításában részt vevő szekvencia limfoid sejtek tirozin kináza, a nyiroksejt aktivációs kaszkád korai tagja mikrotubulus-asszociált protein maltózkötő fehérje MAP-kináz-kináz GHKL típusú mismatch repair fehérje nikotinamid-adenin-dinukleotid(-foszfát), redox koenzim
NFkB NLS NMR NSF
transzkripciós faktor, a natív immunitás karmestere nukleáris lokalizációs szignál mágneses magrezonancia spektroszkópia, szerkezetvizsgálati módszer N-etil-maleimid-szenzitív faktor, a vezikuláris fúzióban szerepet játszó fehérje
OKT3 p53 PAR PBS PDI PDK PMSF PPI PP5 PVDF Raf Ras Rd SDS SDS-PAGE SPR Src TCP1/TRiC
a CD3 T-sejt receptor e lánca elleni monoklonális, aktiváló antitest tumor szuppresszor fehérje, transzkripciós faktor proteáz-aktivált receptor, trombin receptor izotóniás foszfátpuffer fehérje diszulfid izomeráz piruvát dehidrogenáz kináz, eukarióta hisztidin kináz fenil-metil-szulfonil-fluorid peptidil-prolil cisz-transz izomeráz (rotamáz) TPR-domént tartalmzó szerin/treonin foszfatáz, a Hsp90 ko-chaperonja polivinilidén-difluorid a MAP-kináz jelpálya szerin/treonin kináza, MAP kináz kináz kináz membrán-asszociált kismólsúlyú GTP-kötő fehérje (GTP-áz) radicicol, nem anzamycin szerkezetű Hsp90-gátlószer nátrium-dodecil-szulfát SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis felületi plazmonrezonancia, asszociációs-disszociációs folyamatok paramétereinek valós idejű meghatározására szolgáló módszer csirke Rous szarkóma vírus onkogénje, tirozin-kinázt kódol t(ailless)-komplex polipeptid 1 (eukarióták citoszolikus Hsp60 homológja)
TNFa TP Trap1 WB
tumor nekrózis faktor a, citokin transz-diamino-dikloro(II)-platinum, klinikailag hatástalan platinavegyület mitokondriális Hsp90 homológ, Hsp75 Western-blot
viii
ÁBRÁK 2.3.ábra
A Hsp90-HSF autoregulációs hurok.........................................................................................
7
2.4. 1. ábra
A Hsp90 domén-szerkezete és triptikus fragmentumainak elhelyezkedése ..............................
9
2.6.1. ábra
A Hsp90 ATP-kötő doménjének kristályszerkezete ................................................................. 14
2.6.2.1. ábra
A töltött régió szerkezete.......................................................................................................... 24
2.6.2.3. ábra
A töltött régió-Hsp90 kölcsönhatás modellje ........................................................................... 27
2.6.2.4. ábra
A töltött régió konformációs állapotainak modellje ................................................................. 28
2.7.1.1. ábra
A Hsp90 ligandkötőhelyei ........................................................................................................ 32
2.7.1.2. ábra
A Hsp90-család lehetséges taxolkötő motívumai ..................................................................... 34
2.7.3.3. ábra
A Hsp90 elektronmikroszkópos képe....................................................................................... 39
2.7.3.4. ábra
A Hsp90 specifikus oligomer struktúrája ................................................................................. 41
2.8. ábra
A Hsp90 aktív és passzív chaperon működésének szakaszai.................................................... 47
2.8.2.3. ábra
A Hsp90 ATP-függő chaperon ciklusa..................................................................................... 56
2.8.2.4. ábra
A Hsp90 szerepe a transzkripciós faktorok működési ciklusában ............................................ 60
5.1.1. ábra
A Hsp90-vanadát kölcsönhatás vizsgálata SPR-rel .................................................................. 75
5.1.2. ábra
A Hsp90-vanadát kölcsönhatás vizsgálata 51V-NMR-rel.......................................................... 76
5.2.1. ábra
A Hsp90 permolibdát-indukált kovalens módosítása ............................................................... 78
5.2.2. ábra
A Hsp90 permolibdát kötésének jellemzése............................................................................. 79
5.2.3. ábra
A Hsp90 permolibdát-kötőhelyének térképezése ..................................................................... 80
5.3.1. ábra
A Hsp90 [a-32P]ATP-kötésének vizsgálata natív gélen............................................................ 83
5.3.2. ábra
A Hsp90 ATP-kötésének vizsgálata SPR-rel............................................................................ 84
5.3.3. ábra
A Hsp90 nukleotid-affinitáshasítása ......................................................................................... 86
5.3.4. ábra
A nukleotid-affinitáshasítás igazolása egyéb kísérletekkel....................................................... 87
5.3.5. ábra
A Hsp90 ATP-komplex nitrocellulóz filter kötése ................................................................... 89
5.3.6.1. ábra
Az N-terminális ATP-kötőhely azonosítása Edman-degradációval.......................................... 90
5.3.6.2. ábra
Az N-terminális g-foszfát-kötőhely predikciója........................................................................ 91
5.3.6.3. ábra
Az ATP-foszfát-kötőhelyek behatárolása epitop térképezéssel................................................ 93
5.3.7. ábra
A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek gátolhatósága............................................................................. 94
5.3.8. ábra
A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek tulajdonságai...................................................................... 96
5.3.9. ábra
A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek kölcsönhatása..................................................................... 98
5.3.10. ábra
A p23 partnerfehérje hatása a Hsp90 ATP-kötésére................................................................. 99
5.3.11. ábra
Taxol hatása a Hsp90 ATP-kötésére ........................................................................................100
5.3.12. ábra
A Hsp90 ATP-kötésének vizsgálata in situ ..............................................................................101
5.4.1. ábra
Ciszplatin hatása a Hsp90-p23 komplex összeszerelésére in vitro ...........................................102
5.4.2. ábra
Hsp90-ligandok hatása a Hsp90-Hsp70 komplexre in vivo ......................................................103
5.4.3. ábra
Hsp90-ligandok hatása a Raf-1 kináz foszforilációjára in vivo ................................................103
5.4.4. ábra
Platinavegyületek hatása a luciferáz renaturációjára in vitro....................................................104
6.3.2. ábra
A Hsp90 fehérjecsalád feltételezett adeninkötő motívuma.......................................................110
6.3.3.1. ábra
A Hsp90-monomer ATP-függő molekuláris kapcsolójának modellje .....................................112
6.3.3.2. ábra
A Hsp90-dimer ATP-függő molekuláris kapcsolójának modellje............................................113
6.5. ábra
A Hsp90 nukleotid-állapotának, oligomerizációjának és chaperon aktivitásának kapcsolata ..119
ix
TÁBLÁZATOK 2.1. táblázat
A dajkafehérje családok.........................................................................................................
4
2.2. táblázat
A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család tagjai...........................................................
5
2.6.1.1. táblázat
A GHKL ATPáz/kináz szupercsalád tagjai ........................................................................... 15
2.6.1.2. táblázat
A GHKL ATP-kötő domén konszenzus motívumai .............................................................. 16
2.6.1.3. táblázat
Különböző fajokból származó Hsp90 fehérjék ATPáz aktivitása.......................................... 19
2.6.1.4. táblázat
C-terminálisan trunkált Hsp90 fehérjék ATPáz aktivitása..................................................... 20
2.6.1.6. táblázat
A Hsp90 N-terminális ATP-antagonistáinak jellemzői.......................................................... 23
2.6.3. táblázat
A Hsp90 deléciós mutánsainak tulajdonságai........................................................................ 30
2.7.2.3. táblázat
A Hsp90 kochaperonjai ......................................................................................................... 36
2.8.1.2. táblázat
A Hsp90 chaperon kötőhelyei ............................................................................................... 50
2.8.2.1. táblázat
A Hsp90-nel kapcsolódó kliens fehérjék ............................................................................... 53
6.3.4. táblázat
A Hsp90 és a Hsp104 nukleotidkötő tulajdonságainak összehasonlítása ..............................115
6.4. táblázat
A Hsp90-kötő vegyületek hatásai és hatásmechanizmusa .....................................................116
x
1. BEVEZETÉS
A többsejtű eukarióta élőlény rendkívül bonyolult organizmus, életben maradását számos (többszörösen átfedő, túlbiztosított) mechanizmus teszi lehetővé – sejtszinten és az élőlény szintjén egyaránt. A sejtszintű folyamatok már a prokariótákban megjelennek, és (alapelveik) szinte változatlanul öröklődnek tovább a legmagasabb rendű élőlényekig. Hogy csak pár ősi példát említsünk, ilyen a glikolízis, a transzláció, és ilyen a stresszválasz, avagy a dajkafehérjék általános sejtvédő feladata, melyek mind az egyed (a sejt) minden áron való túlélését biztosítják. A szöveti szerveződés megjelenése új kívánalmakat ró a sejtre. A “bármi áron túlélni” már nem örökérvényű szabály, belép a “szolgálni, eleget tenni, vagy az egyed érdekében meghalni” altruisztikus parancsolata. A szöveti szerveződés megjelenése elsősorban a sejten kívüli térből érkező üzenetek (növekedés, differenciálódás, sejt-sejt kapcsolat, programozott sejthalál) pontos továbbítását, másrészt a sejt reakcióképességének és épségének (ingerekkel szembeni érzékenység, sejtmozgások, anyagcsere, genom) szabályozását, illetve ellenőrzését kívánja meg; a fentiek elégtelensége vagy inkoherenciája esetén pedig a sejt képessé válik az önnön működését leállító parancs (szeneszcencia, apoptózis) kiadására és végrehajtására. Mindezen forradalmi változások közben megtörténik, hogy addig jelentéktelennek tartott szereplők esszenciális feladatot kapnak. A sejt egyik ilyen szereplője a 90 kDa molekulatömegű stresszfehérje, a Hsp90. Prokarióta homológja igazán lényeges feladatokat még nem lát el, génjének hiánya komoly következménnyel nem jár, az élesztőben viszont már két példányban jelenik meg (a és b izoforma), melyek együttes hiánya halálos. A Hsp90 – egyre inkább bizonyossá válik – az előzőekben felsorolt szinte minden eukarióta vívmánnyal szoros kapcsolatban van. Működésének lényege, hogy a folyamatokat kontrolláló fehérjék (kinázok, magi receptorok, p53 fehérje és mások) specifikus dajkája. Szerkezetét azért érdemes tanulmányozni, mert általa képet kapunk egy érdekes, esszenciális funkció molekuláris alapjairól, valamint olyan gyógyszerekhez juthatunk, melyekkel korunk népbetegségeit, így keringési és degeneratív betegségeket, többek között daganatokat gyógyíthatunk. Laboratóriumunk egy évtizede foglalkozik a 90 kDa-os dajkafehérjék kutatásával. Eredményeinket, feltevéseinket számos díjnyertes rektori pályamunka és szakdolgozat után három, ezidőtájt elkészített és készülő doktori értekezésben foglaljuk össze. Míg Schnaider
1
Tamás értekezése átfogó képet adott a stresszválaszról és a dajkafehérjékről, valamint a Hsp90 makromolekuláris kölcsönhatásairól, Nardai Gábor a dajkafehérjék kórélettanába enged betekintést, addig én a különböző kismolekulák Hsp90 szerkezetére és működésére gyakorolt hatását tűztem toll- és pipettahegyre. Értekezésem terjedelmének csökkentése érdekében az irodalmi áttekintés során többször hivatkozom saját összefoglaló közleményünkre (Csermely és mtsai, 1998), Schnaider Tamás doktori értekezésére (Schnaider, 2000) és témavezetőm könyvére (Csermely, 2001/c). A terjedelmi korlátok mellett a bírálók feladatának egyszerűsítését tartottam szem előtt, amikor néhány eredményünket rendhagyó módon a módszerek részletes ismertetése nélkül az Irodalmi áttekintésbe illesztettem. Ezen eredményeket a tézisekben sem szerepeltettem, mert még nem mentek át a szakfolyóiratok bírálatának szűrőjén, mégis fontosnak tartottam bemutatásukat, mert kitágíthatják a Hsp90 szerkezet-hatás összefüggéseiről kialakított képünket, és teljesebbé tehetik értekezésemet. Mielőtt a Tisztelt Olvasó belekezdene értekezésem olvasásába, előrebocsátom, hogy néha furcsa, „magyartalan” kifejezésekkel, elnevezésekkel találkozik a következő lapokon. Ezek az idegenszerű nevek valójában annak a törekvésnek gyermekei, hogy magyar elnevezéseket találjunk a terjedőben levő, „magyarosabban” hangzó angolszász terminológia ellenében. A magyar a világ háromezer-valahányszáz nyelve közül azon néhány tucat egyike, melyen az összes tudományágat képesek vagyunk művelni. Ez a nyelvújítás rendkívül lekes, aktív tevékenységének köszönhető. Cserébe elnézhető az a néhány nyelvi ficam, amit szintén Kazinczyék mozgalmának tulajdonítanak. Bár felelősségem a tankönyvírókéhoz, tehetségem Kazinczyékéhez mérten csekély, a magam szintjén megpróbálok tenni azért, hogy nyelvünk szépsége és hagyományos értéke ne sorvadjon el, mert a nyelv maga a kultúra. Kérem a Tisztelt Olvasót, a ficamokat nézze el, és tegye helyre tehetsége szerint! Ha pedig jobb elnevezést talál, írja meg nekem, vagy a Biokémiai Társaságok honlapjának nevezéktannal foglalkozó
címére
(http://www.webio.hu/biochat/lada/index.php;
[email protected]). Budapest, 2002. március
Sőti Csaba
[email protected] 2
email:
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1. A dajkafehérjék: életbiztosítás sejtszinten A fehérjék aminosav sorrendje egyedi módon kódolja a fehérje működése szempontjából optimális térszerkezetet, melynek kialakítására a fehérjék túlnyomó többsége megfelelő körülmények között képes. A sejtben korántsem megfelelőek a feltételek: a magas hőmérséklet és a makromolekuláris zsúfoltság segítséget kíván. A segítőket dajkafehérje (molekuláris chaperon) néven illetjük, bár nem valódi dajkák. Valójában a fehérje életének minden szakaszában jelen vannak, mintegy orvosként segítve a fehérje felgombolyodását, transzportját, működését, végül a proteolitikus temetőig kísérve őket (összefoglalásul ld. Hartl, 1996; Bukau és Horwich, 1998; Bukau 1999; Schnaider, 2000; Csermely, 2001/c). Működésüket önkényesen passzív és aktív részre oszthatjuk. A passzív chaperon hatás lényege a hidrofób aminosavakban gazdag polipeptidláncok vagy a meztelen peptid-gerinc kis specificitású és affinitású kötése, mely meggátolja a felgombolyodó vagy denaturálódó fehérjék aggregációját. Passzív chaperon hatása minden dajkafehérjének van. Az aktív chaperon hatás a szubsztrát fehérje ciklikus kötése majd elengedése, részben aktív kitekeréssel zajlik, meggátolja a tekeredési zsákutcákba jutást, és statisztikusan lehetőséget teremt a megfelelő tekeredési útvonal megtalálására. Az aktív chaperon hatás mindig energiaigényes folyamat; vagy ATP hidrolízise (Hsp70, Hsp60, Hsp110), vagy a redoxpotenciál (diszulfidhidak reverzíbilis redukciója, fehérje diszulfid izomeráz) terhére történik. Aktív chaperon hatás segít az újonnan szintetizálódó vagy denaturált fehérjék felgombolyodásában, az oligomerek össszeszerelésében, a sejtalkotókba (mitokondrium, endoplazmás retikulum) történő bejuttatásában, a fehérjeaggregátumok szétszerelésében, és a menthetetlen fehérjék eltakarításában (bemutatás a citoszolikus, ritkábban a lizoszómális fehérjebontó apparátusnak). A dajkafehérjék nagy része stresszfehérje is, azaz valamilyen nem specifikus fehérjeés/vagy lipidkárosító (pl. hősokk) inger fokozza termelődésüket, így a sejt képessé válik működésének helyreállítására, sőt – akár a rákövetkező károsító inger közepette – fenntartására (pl. termotolerancia). Különböző ingerek kereszttoleranciát váltanak ki. A stresszfehérjék szintje így “edzéssel” vagy gyógyszeresen növelhető, mely az egyed jobb életkilátásait eredményezi, és jelentős orvosi vonatkozásokkal kecsegtet (Welch, 1992).
3
A prokarióta sejt fehérjéinek felgombolyodása döntően a transzlációt követően megy végbe, és a dajkafehérjék aktív segítségét igényli. Az eukarióták nagyobb, több doménből álló fehérjéi nem tudnának így betekeredni. A riboszóma és a riboszóma-asszociált chaperonok (melyek
nemcsak
stresszfehérjék)
veszik
át
a
klasszikus
dajkafehérjék
feladatát
(összefoglalásul ld. Netzer és Hartl, 1998). Bár az eukarióta chaperonok korántsem maradnak feladat nélkül, indokolatlannak látszik, hogy mind a Hsp70, mind a Hsp90 külön-külön kitegye a sejt fehérjekészletének 1-5%-át. Elképzelhető, hogy a nagy mennyiségű dajkafehérje egy olyan dinamikus komplexet alkot, mely a sejt alapvázát képezi, és kis affinitású fluktuáló kölcsönhatások révén összetartja, mozgatja és irányítja a spontán diffúzióval nem magyarázható molekuláris mozgásokat (összefoglalásul ld. Pratt, 1997; Pratt és mtsai, 1999; Csermely, 2001/a). Ez az általános szerep magyarázhatja a stresszválasz korral járó kimerülését, az öregedés beindulását és a degeneratív betegségek illetve daganatok megjelenését (Sőti és Csermely, 1998/b; 2002/a; 2002/b; Csermely, 2001/b).
Család
Képviselők
Chaperon működés
Speciális szerep
Irodalom
Kisméretű
Cpn10, GimC, Hsp25, Hsp27, krisztallinok Hsp40, Hdj1, Hdj2 Hsj1a, Hsj1b Cpn60, TCP-1 (TRiC)
aggregáció gátlás
apoptózis, neurodegeneráció Hsp70 segéd ATPáz aktivátor aktin, tubulin apoptózis immortalizáció apoptózis immunitás evolúció jelátvitel daganatképződés immunitás evolúció termotolerancia konformációs betegségek
Arrigo, 1998 Sőti és Csermely, 2002/b Hartl, 1996; Bukau, 1999 Thirumalai és Lorimer, 2001
Hsp40 Hsp60
Hsc70 (Hsp73), Hsp70 (Hsp72), Prp73, mortalin Grp78 (BiP), mtHsp70 ld. 2.2. táblázat
Hsp70
Hsp90
Hsp100
Hsp101/102, Hsp104 Hsp110, Grp170 ClpA/X (E. coli)
2.1. táblázat
aggregáció gátlás felgombolyodás, összeszerelés de novo szintézis, felgombolyodás, transzport, lebontás aggregáció gátlás, szerkezet stabilizálás aggregátumok szétszedése, proteolízis (E. coli)
Bukau, 1999 Schnaider, 2000 Srivastava és mtsai, 1998 Chow, 2000 Csermely és mtsai, 1998 Young és mtsai, 2001 Srivastava és mtsai, 1998 McLaren, 1999 Schirmer és mtsai, 1996 Ogura és Wilkinson, 2001 Sőti és Csermely, 2002/b
A dajkafehérje családok
A dajkafehérjék csoportosítása molekulatömegük alapján történik (2.1. táblázat). Az érdeklődő olvasó további információt talál a tematikus összefoglaló közleményekben. A továbbiakban
a
90
kDa
molekulatömegű
dajkafehérjék
részletesebben.
4
családjával
foglalkozom
2.2. A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család
Elhelyezkedés Képviselő
Faj
Szerep/asszociáció
Deléció
Irodalom
marginális
Bardwell és Craig, 1987
labilis konformációjú fehérjék stabilizálása, hősokk: általános chaperon p53 chaperon galektin-1 ligand
letális
? ?
Mayer és Bukau, 1999 Richter és Buchner, 2001 Schnaider, 2000 Borkovich és mtsai, 1989 Kumagai és mtsai, 2000 Chadli és mtsai, 1997
immunoglobulin-érés, antigén bemutatás
nem letális, naív immunitás kiesik
Csermely és mtsai, 1998 Schnaider, 2000 Randow és Seed, 2001
muslica, emlős
TNFa-receptor Rb-fehérje chaperonja
?
Chen CF és mtsai, 1996; Song és mtsai, 1995; Felts és mtsai, 2000
emlős
Raf aktiváció
?
Grammatikakis és mtsai, 2002
Prokarióta Citoszol HtpG
eubaktérium
? Eukarióta
Citoszol (sejtmag) Hsp90c/Hsp90i Hsc82/Hsp82 Hsp86/Hsp84 Hsp90b/Hsp90a Hsp105 HBGp82 lektin Endoplazmás retikulum endoplazmin Grp94 Gp96 Mitokondrium Hsp75/Trap1 Plazmamembrán Hsp90N
élesztő rágcsáló madár, emlõs emlõs here emberi agy rágcsáló emlős
(ras független)
2.2. táblázat A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család tagjai A Hsp90c és i a fehérje konstitutív és indukálható izoformájának felel meg
A 90 kDa molekulatömegű chaperonok eddig azonosított képviselőit a 2.2. táblázat szemlélteti. A prokarióta gén alapos átalakulása és többszörös duplikációja alakította ki a ma ismert eukarióta Hsp90 fehérjéket (Csermely és mtsai, 1998), ezzel együtt a bakteriális és a humán fehérje aminosavai 40%-ban azonosak, 54%-ban hasonlóak (Bardwell és Craig, 1987)! A prokarióta HtpG fehérje csak rendkívül magas hőmérsékleten rendelkezik (passzív) chaperon aktivitással, deléciója csak ekkor válik hátrányossá az organizmusra nézve (Bardwell és Craig, 1988; Csermely és mtsai, 1998). Az egyre magasabb rendű szervezetek Hsp90 fehérjéinek hőstabilitása egyre kisebb, ezzel egyetemben passzív chaperon aktivitásuk hatékonyabb, és alacsonyabb hőmérsékleten jelentkezik (Jakob és mtsai, 1995/b; Nemoto és mtsai, 2001/b). Az eukarióta citoszol két általános izoformája, a Hsp90a és b 76%-ban azonosak, és több mint 90%-ban hasonlóak (Csermely és mtsai, 1998). A két izoforma között a szerkezeti és működésbeli hasonlóságból kifolyólag gyakran nem tesznek különbséget. Számos kísérleti rendszerben a humán fehérje helyreállítja a Hsp90-hiányos élesztő mutáns 5
életképességét, amely a bakteriális homológról nem mondható el (Picard és mtsai, 1990; Buchner, 1999). Az élőlények bonyolódásával a Hsp90 feladatai egyre sokasodnak. Ez azzal jár, hogy megjelennek a fehérje sejtalkotó-, szövet-, sőt szubsztrátspecifikus variánsai, és leveszik a többletmunkát a Hsp90 válláról. Erre kínál szép példát a Trap1/Hsp75, mely élesztőben még nem, csak muslicában jelenik meg. A muslica Trap1 66%-ban hasonlít a humán Trap1-hez, 50%-ban a humán Hsp90-ekhez. Bár domén-elrendeződése szerkezetileg a HtpG fehérjéhez teszi hasonlóvá, aminosavsorrendje csak 49%-os hasonlóságot mutat (Felts és mtsai, 2000). Kérdéses, hogy a szűk szubsztrátspecificitású, mitokondriális Hsp90-homológ Trap1 hogyan találkozik „in vivo” szubsztrátjaival, a mebránban található TNFa-receptorral, illetve a sejtmagi/citoszolikus retinoblasztóma-fehérjével. A „legfiatalabb”, legkisebb és legszélsőségesebb Hsp90-homológ a Hsp90N, melynek N-terminális ATP-kötő doménje helyén egy rövid hidrofób szekvencia és egy mirisztoilációs szignál található. A Hsp90N fehérje első példája annak, hogyan válhat egy dajkafehérje onkogénné. A fehérje Ras-deficiens sejtekben is képes a Raf-ot kicsalogatni a membránhoz és a MAP-kináz kaszkádot aktiválni, mely a sejtek daganatos elfajulását okozza (Grammatikakis és mtsai, 2002). A továbbiakban a legfőbb képviselőt, az eukarióta Hsp90-et mutatom be, ahol a család egyéb képviselőinek tulajdonságai segítséget nyújthatnak a szerkezet és működés megértéséhez, ott egyértelműen utalok ezekre.
2.3 A Hsp90-gén és kifejeződése A Hsp90 a és b izoformájának génjei – más stresszfehérjéktől eltérően – intronokat tartalmaznak. Mivel hősokk gátolja a splicing-ot, így a Hsp90 mRNS hősokkolt sejteken nem képes transzlálódni, bár egész muslica lárván a Hsp90 mRNS splicing-ja ellenállóbb a hőkezeléssel szemben (Csermely és mtsai, 1998). Mindazonáltal, ez megkérdőjelezné, hogy a Hsp90 fontos hősokk-fehérjeként funkcionáljon. A Hsp90 gének promotere két-két hősokk elemet tartalmaz, a konstitutív b izoforma kevésbé hő-indukálható. Növekedési jel többféle promoteren keresztül mindkét izoforma átíródását fokozza, ezzel szemben az immunsejtek aktivációja és a gyulladásos ingerek elsősorban a b izoforma transzkripcióját serkentik.
6
Természetesen szinte minden káros hatás – még a pszichés stressz is – képes a Hsp90 szintézisét fokozni (összefoglalásul ld. Csermely és mtsai, 1998). Nakai és Ishikawa (2001) kísérletei nyomán a hősokk faktor, a Hsp90 és a sejtciklus kapcsolata új dimenzióval gazdagodott. A HSF-1 és -3 hiányos sejtekben a Hsp90b mennyisége közepesen (kb. 60%-ra), a Hsp90a-é jelentősen (25%-ra) csökkent normál hőmérsékleten, rámutatva a HSF konstitutív transzaktivációs, és a Hsp90 mennyiségére gyakorolt hatására. A Hsp90 relatív hiánya már enyhe hősokk hatására is a Cdc2 (CDK1) kináz destabilizálódáshoz vezet, ami leállítja a sejtciklust. A Hsp90a mennyiségének növelése stresszválasz hiányában is helyreállítja a sejtosztódást. A szerzők arra is rámutattak, hogy a Hsp90 mennyiségének a normál szint fölé növelése sem lehetséges, intenzív apoptotikus hatása miatt. A jelen és más kísérletek (Rutherford és Lindquist, 1998; Imai és Yahara, 2000) fő tanulsága, hogy a sejt (és a szervezet) működéséhez a Hsp90 mennyiségét szűk határok között kell tartani, mert különben a jelátviteli folyamatok káosza uralkodik el. A hősokk faktorok szerepe a Hsp90 szintjének szabályozásában (stresszmentes körülmények között is) kulcsfontosságú. A Hsp90-komplex a hősokk faktort is fogságában tartja, végső soron egy önszabályozó hurokkal saját mennyiségét határozza meg (2.3. ábra).
+
jelátvitel
Hsp90
denaturált fehérje geldanamycin
HSF-1
stresszválasz
-
2.3. ábra A Hsp90-HSF autoregulációs hurok A Hsp90 gátlása stresszválaszt provokál és a jelátviteli folyamatok zavarához vezet. HSF-1, hősokk faktor 1
A Hsp90 a növekedési és differenciálódási jelpályák számos képviselőjével kölcsönhatásba lép (ld. Schnaider, 2000; ill. 2.8.2.1. fejezet). Nem csoda, hogy az
7
egyedfejlődés során mind a Hsp90 mennyisége, mind sejten belüli elhelyezkedése nagy változásokon megy keresztül. A petesejt érése és a korai embriogenezis során a Hsp90 mennyisége jelentősen megnő, a fehérje nagyobb része jut be a sejtmagba (Csermely és mtsai, 1998). A Hsp90 fejlődéssel és sejtciklussal összefüggő ingadozásában is szerepe lehet a hősokk faktoroknak (Nakai és Ishikawa, 2001). Annak ellenére, hogy a Hsp70-ről és más stresszfehérjék öregedésfüggő elváltozásaival számos közlemény foglalkozik, a Hsp90-ről nincs ilyen adat (összefoglalásul ld. Sőti és Csermely, 2000; 2002/a; 2000/b). A Hsp90 minden szervben kifejeződik, az össz fehérjekészlet 1-3%-át alkotja. Élesztőben a fenti mennyiségnek 15-öd része(!) is elegendő a normál hőmérsékleten történő növekedéshez, úgy tűnik tehát, hogy – legalábbis ebben az organizmusban – a természet pocsékol a Hsp90-nel (Xu és Lindquist, 1993). Döntően citoplazmatikus, de 5-6%-a a sejtmagban is megtalálható, ami – tekintetbe véve a Hsp90 nagy mennyiségét, – élettanilag is jelentős lehet (Schnaider, 2000). Hősokk hatására az eddig is tetemes (és felesleges?) fehérje mennyisége 3-10-szeresére nőhet, ami már tényleg luxusnak számít, tekintve, hogy – ismét élesztőben – a Hsp90 nem vesz részt a fehérjék hőaggregáció elleni védelmében (Nathan és mtsai, 1997). Ugyanakkor a szélsőséges hőmérsékleten való növekedéshez elengedhetetlen a masszív Hsp90 mennyiség (Borkovich és mtsai, 1989), de hogy mi lenne ennek a szerepe, az nem tisztázott. Mint említettem, a passzív chaperon hatás a Hsp90 oligomerizációját előidéző hőmérsékleten lép működésbe, feltehetően ekkor már olyan nagymennyiségű fehérje aggregálódik, aminek védelméhez nem elegendő az elsődleges dajkafehérjék (Hsp70, Hsp27) működése. Hősokk hatására a Hsp90 további 6-7% lassan, mindenféle sejtváz- és mozgatórendszeről függetlenül a sejtmagba vándorol (Akner és mtsai, 1992). A hőkezelés végeztével a Hsp90 visszavándorol a citoszolba, egy rákövetkező rövid hősokk hatására már nem figyelhető meg sejtmagi transzlokáció. Újkeletű az a tény, hogy hipoxia (Katschinski és mtsai, 2002) és az apoptotikus program (Gerner és mtsai, 2000) szintén a Hsp90 sejtmagi transzlokációjához vezetnek. A vesekárosító kemoterapeutikum ciszplatin egyszeri injekciója a Hsp90 szelektív indukciójához és sejtmagi transzlokációjához vezet a vesecsatornácskák sejtjeiben. Az expresszálódó fehérjemennyiség és a transzlokáció az injekció utáni ötödik napon tetőzik, egybeesik a legintenzívebb regenerációs periódussal (Satoh és mtsai, 1994).
8
2.4. A Hsp90 általános szerkezeti vonásai 2.4.1. A Hsp90 domén-szerkezete
dimerizáció
ATP-kötés 220
290
Hartl N-terminális
középső
töltött régió P
C-terminális
P C
Buchner
C
C C
CC
400 Nemoto
A
B
C
Tripszin: P
P 80
P
P
40
P
P
32/37
P
50
C
C
C C
CC
C
C
50 C C
CC
C C
CC
C C C
26/27
C
41
32/37 C C
C C 26/27 C C
CC
15
2.4.1. ábra A Hsp90 domén-szerkezete és triptikus fragmentumainak elhelyezkedése A három kutatócsoport által javasolt doménszerkezetek és a domének nevei felül láthatók. A ciszteineket C, a kazein kináz II által foszforilált helyeket P jelöli az elsődleges szekvenciában. A fő triptikus hasítási helyeket nyilak jelölik. A keletkezett fragmentumokat Lees-Miller és Anderson (1989/a), Nemoto és mtsai (1997), Hartson és mtsai (1999), Bogatcheva és mtsai (1999) és saját nem közölt eredményeink alapján állítottam össze. A fragmentumok feletti számokkal a relatív molekulatömegeket jelöltem.
A Hsp90 704-732 aminosavból épül fel (forrás: Swissprot). A továbbiakban – ha külön nem jelzem – a Hsp90 szekvenciáit az egyéb Hsp90 fehérjékhez illesztett humán Hsp90a(1731) szekvenciájára vonatkoztatva adom meg. Alakját tekintve elongált fehérje. Izoelektromos pontja 5,1-5,8, amit a fehérje változó foszforilációs állapota is befolyásol (átlagban 2-3 foszfát/monomer). Alapvetően dimer, azonban oligomerizációra hajlamos (ld. 2.7.3. fejezet). Elektronmikroszkópos tanulmányok alapján a Hsp90 két doménből áll, melyeket egy flexíbilis csukló választ el egymástól lehetővé téve a domének kinyílását vagy becsukódását (Maruya és mtsai, 1999; ld. még 2.7.3.3.A ábra). Predikciós vizsgálatok és limitált proteolís alapján a
9
doménszerkezetről további finom részleteket deríthetünk ki (Lees-Miller és Anderson, 1989/a; Nemoto és mtsai, 1997; Stebbins és mtsai, 1997; Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények; 2.4.1. ábra). A pontos doménfelépítésről megoszlanak a vélemények (ld. ábra). Az N-terminális 25 kDa-os (1-220. as) és a C-terminális 60 kDa-os (300-610. as) domének között egy rendkívül töltött és flexibilis régió (töltött régió) helyezkedik el. Ha a Hsp90-et alacsony koncentrációjú tripszinnel hasítjuk, a töltött régió az N-terminális doménen marad. A nagy C-terminális domén a 614/617. aminosavnál könnyedén kettéhasad, a keletkező középső domén a 400. aminosavnál két szubdoménre válik szét. Az első töltött régión kívül még egy hasonló található a középső doménben (530-580. as). 2.4.2. A Hsp90 poszttranszlációs módosulása A Hsp90 aminosav sorrendje különféle konszenzus motívumokat rejt (Binart és mtsai, 1989; Csermely és mtsai, 1998). Az N-kapcsolt glikozilációt csak az agyban előforduló, ismeretlen funkciójú Hsp90 homológ lektin esetén írták le (Chadli és mtsai, 1997). Kimutatták, de ismeretlen a jelentősége a metilációnak és az ADP-ribozilációnak is (ld. Schnaider, 2000). Tirozin foszforilációt eddig nem találtak, ezzel szemben számos szerin és treonin foszforilált. A Hsp90a N-terminálisát a kettősszálú DNS-függő protein kináz foszforilálja (Lees-Miller és Anderson, 1989/b). Mindkét izoformát foszforilálja a cAMPfüggő protein kináz (Kudlicki és mtsai, 1985), a kazein kináz II (Lees-Miller és Anderson, 1989/a), és a szfingozin-függő kináz (Megidish és mtsai, 1999). A Hsp90 önmagát is képes – csekély hatásfokkal – autofoszforilálni (Csermely és Kahn, 1991). A foszforiláció szerepe a Hsp90 működésében nagyrészt ismeretlen. A defoszforilált Hsp90 kevésbé képes az autofoszforilációra (Csermely és Kahn, 1991) és a v-src kináz kötésére (Mimnaugh és mtsai, 1995). A kazein kináz II általi foszforiláció szükséges az eIF2akináz natív funkcionális szerkezetének kialakításához (Szyszka és mtsai, 1989). Egy nemrég megjelent közleményben pedig bizonyították, hogy a Hsp90 reovírus sejten történő megtapadást közvetítő fehérjéje a Hsp90 szubsztrátja, és a chaperonról történő leválása egyszerre történik meg a Hsp90 foszforilációjával, bár az ok-okozati összefüggést nem bizonyították (Zhao és mtsai, 2001). A chaperon szerep és a foszforiláció közötti összefüggést támogatja az a megfigyelés is, hogy hősokk hatására a foszfátcsoportok forgalma felgyorsul a Hsp90-en (Legagneux és mtsai, 1991), valamint az, hogy a Hsp90-nel asszociáló, TPR-domént tartalmazó fehérjék között helyet kapott a PP5 foszfatáz is (ld. 2.7.2.3. táblázat). A jelátviteli folyamatokkal való kapcsolatot domborítja ki, hogy a plazmamebrán felől induló programozott 10
sejthalál során a Hsp90 foszforilálódik, és a sejtmagba transzlokálódik (Gerner és mtsai, 2000). 2.4.3. A Hsp90 fő immunogén régiói A Hsp90 nemcsak aktívan, hanem antigénként is fontos szerepet játszik az immunrendszer működésben (ld. Csermely és mtsai, 1998). A Hsp90-ben két immunogén régió térképezhető fel (Nemoto és mtsai, 1997), melyek közül az első a töltött régió területére, a második a C-terminális legvégére (702-716. as) esik. Mindkettő az eukarióta Hsp90-ek szerzeménye. A Nemoto-labor eredményei (és predikciós adatok; Binart és mtsai, 1989) alapján azt hihetjük, hogy ezek az epitopok felületiek, annál is inkább, mert a töltött régió szinte nem tartalmaz hidrofób aminosavat. Nem szabad megfeledkezni azonban arról, hogy a szerzők rekombináns (E. coliban termelt) Hsp90-et használtak, melynek triptikus térképe és negyedleges szerkezete kissé eltér a tisztított fehérjéétől. A töltött régió bővelkedik lizinekben, a natív Hsp90-ben mégis csak a határán (283. as) hasítja a tripszin (Lees-Miller és Anderson, 1989/a; Hartson és mtsai, 1999; nem bemutatott adatok). Ez arra utalhat, hogy a töltött régió az intakt Hsp90 más részeivel lép kölcsönhatásba (ld. 2.6.2. fejezet), melyet egy nagy aviditású antitest természetesen képes megbontani. Ezt támogatja saját eredményeinken túl az a megfigyelés is, hogy a töltött régió területén található feltételezett nukleáris lokalizációs szignál csak a középső és a C-terminális domének deléciójával válik elérhetővé (Meng és mtsai, 1996, Jibard és mtsai, 1999). A fenti fő immunogén régiókon túl két fontos anti-Hsp90 antitestet érdemes megemlíteni. Az első az AC88 antitest (Csermely és mtsai, 1998; Hartson és mtsai, 1999), melynek epitopja a 660-680. aminosavak által határolt régióban van, és kizárólag a szabad Hsp90-et ismeri fel. A másik az LKVIRK antitest, mely nevét az általa felismert 408-413. aminosavak által határolt, rendkívül konzervált epitopról kapta. Az (auto)antitest képes kivédeni az invazív kandidázis által előidézett halálozást (Matthews és mtsai, 1991). Mindkét antitestnek nagy hasznát vettük kísérleteink során.
2.5. A Hsp90 doménjeinek elrendeződése A
Hsp90
nagy
fehérje,
doménjeinek
többszörös
intra-
és
intermolekuláris
kölcsönhatásait számos szerkezeti és funkcionális tanulmány alátámasztja. A legalaposabb kutatásokat Takayuki Nemoto csoportja végezte, a HtpG fehérje szerkezetével kapcsolatosan.
11
Mivel modelljüket részben kísérleti eredmények, részben szerkezeti homológia alapján kiterjeszthetőnek vélik az eukarióta Hsp90 fehérjékre, ezért a kölcsönhatásban részt vevő szekvenciákat zárójelben a humán Hsp90 aminosav sorrendjére vonatkoztatva is megadom. Nem szabad elfeledkeznünk arról, hogy a HtpG-ből hiányzik a töltött régió. 2.5.1. Intramolekuláris kölcsönhatás és chaperon funkció A Nemoto-féle A-domén (2.4.1. ábra) második kétharmada, a 116-336. aminosavig (126-399) intramolekuláris kölcsönhatásba lép a B-domén 337-480. aminosavak által határolt B1 szubdoménjével (400-540). A kölcsönhatás, bár gyengébb, de konzervált a humán Hsp90aban is, sőt a prokarióta és eukarióta domének között hibrid komplex is létrehozható (Nemoto és mtsai, 2001/a). A kölcsönhatás hőlabilitása egyik tényezője lehet a HtpG/Hsp90 hő-indukált chaperon aktivitásának (Tanaka és mtsai, 2001). 2.5.2. Intermolekuláris kölcsönhatások a Hsp90 dimerben Szintén Takayuki Nemoto laboratóriuma tárta fel a C-terminális domén dimerizációban játszott szerepét (Nemoto és mtsai, 1995; 2001/a). A HtpG B-domén 481-552. (541-607) aminosavig terjedő B2 szubdoménje antiparalel kölcsönhatást alakít ki a C-terminális utolsó 16 aminosavával (Nemoto és mtsai, 2001/a). Megjegyzendő, hogy a HtpG és a humán Hsp90a C-terminálisainak kölcsönhatása nem teljesen egyezik, HtpG-Hsp90 hibrid komplexek ez esetben nem hozhatók létre (Tanaka és mtsai, 2001). A különbség oka az, hogy az eukarióta Hsp90-ek középső és C-terminális doménjei jelentősen eltérnek a bakteriális homológokétól. A humán Hsp90a C-terminális 49 aminosavának törlése gátolja a dimerizációt (Minami és mtsai, 1994), amihez a baktériumból hiányzó utolsó 35 aminosav feltehetően nem szükséges (Owen és mtsai, 2002). A 30 C-terminális aminosavat nélkülöző csirke Hsp90a mutáns más laborban nem dimerizált (Meng és mtsai, 1996). Jibard és mtsai (1999) tovább pontosították a Hsp90a B2 szubdoménjének azt a régióját, mely kölcsönhat a dimer másik felének Cterminális doménjével. Szerintük az 551-570. és a 664-680., valamint a 682-731. régiók vesznek részt a dimerizációban. Prodromou
és
mtsai
(1997/a)
az
élesztő
Hsp90
N-terminális
doménjének
kristályszerkezetében dimer struktúrát találtak, bár mások ezt oldatban nem tudták kimutatni (Scheibel és mtsai, 1999/a). A dolog hátterében egyrészt az áll, hogy a diffrakciós képen megfigyelt dimer a kristályosítás során keletkező műtermék volt. Másrészt, a későbbiekben
12
szintén Prodromou és mtsai (2000) elegáns kísérletekkel alátámasztott tanulmányban közölték, hogy a dimerizációs tendencia csak ATP jelenlétében valósul meg. Eredetileg ugyanis a 101120. (114-133) aminosavak által határolt fedél régió az ATP-kötő zsebtől meglehetősen távol, a 19-27. (32-40) szegmentum által kihorgonyozva helyezkedik el, ATP hatására azonban feltehetően ráhajlik a zsebre, és elősegíti a Hsp90 N-terminális doménjének dimerizációját. 2.5.3. Feltételezhető domén-domén kölcsönhatások Egyéb domén-domén kölcsönhatásokra csak indirekt bizonyítékok utalnak, minden esetre érdemes itt megemlíteni ezeket. A Hsp90 500-520. aminosavai egy feltételezett kalmodulin-kötő konszenzus szekvenciára emlékeztetnek. A Hsp90 Ca2+-kalmodulin kötésére képes (Minami és mtsai, 1993), melyet az 500-520. szekvenciájú megszintetizált peptid gátol, sőt maga köti a kalmodulint. Ennél is érdekesebb, hogy a peptid a Hsp90-nel is keresztköthető, és elősegíti az oligomerizációját. Feltételezhető, hogy ez a régió a molekula más részéhez köt, amelyet a Ca2+-kalmodulin vagy a hősokk felszabadít (ld. 2.6.2. fejezet). Louvion és mtsai (1996) olyan domináns negatív Hsp90 mutánst találtak, mely az élesztő sejtek növekedését csak magasabb hőmérsékleten gátolja. Az 538-552. (558-572) aminosavak által határolt szegmentum a Hsp90 második töltött régiójában helyezkedik el, amely szerepet játszik a dimerizációban (Nemoto és mtsai, 1995, Jibard és mtsai, 1999). Deléciója destabilizálhatja a dimerizációt, lévén az ebben résztvevő doménben található. További bizonyíték erre az, hogy a domináns negatív hatást ozmotikus stabilizátorok (pl. szorbitol) valamint a mutáns 652. (672) aminosaván túli régió eltávolítása kivédik (a 685. [704] aminosavon túli deléció még nem védi ki). Az sem kizárható, hogy ebben a két régióban találhatóak a Hsp90 C-terminális ATP-kötőhelyének konszenzus motívumai (Csermely és Kahn, 1991; Callebaut és mtsai, 1994). Bár konkrét szekvenciális adatok nem állnak rendelkezésre, egyértelműen bizonyított, hogy az N-terminális domén a fehérje többi részének működését nukleotidfüggően szabályozza (Sullivan és mtsai, 1997; Grenert és mtsai, 1997; 1999). A Hsp90 specifikus chaperonműködése in vitro és in vivo a teljes fehérje jelenlétét igényli (Scheibel és mtsai, 1999/b; Johnson és mtsai, 2000). A töltött régió szintén befolyásolja az N- és C-terminális domének működését (Scheibel és mtsai, 1999/a; Johnson és mtsai, 2000; Bouhouche-Chatelier és mtsai, 2001), melyből fizikai kölcsönhatásra is következtethetünk, amint az N-terminális esetén Prodromou és mtsai (1997/a), a C-terminális esetén mi (Sőti és Csermely, 1998/a) felvetettük.
13
Ezekre a kölcsönhatásokra a C-terminális domén, illetve a teljes fehérje szerkezetének meghatározása deríthet fényt, az eddigi próbálkozások azonban nem eredményeztek nagyfelbontású röntgen diffrakciós képet (Prodromou és mtsai, 1997/a).
2.6. A Hsp90 doménjeinek finomszerkezete 2.6.1. Az N-terminális ATP-kötő domén
A
B
2.6.1. ábra A Hsp90 ATP-kötő doménjének kristályszerkezete A, a humán Hsp90a N-terminális doménjének ADP-komplexe oldalnézetből (PDB: 1BYQ) B, a humán Hsp90a N-terminális doménjének geldanamycin-komplexe felülnézetből (PDB: 1YET) Az ATP g-foszfátja nem ad diffrakciós árnyékot, a b-foszfát a zsebből kifelé mutat. A szerkezeteket a Chime program 2.03 verziójával jelenítettem meg.
Az N-terminális domént mind élesztőből, mind humán rekombináns Hsp90a-ból kristályosították (Prodromou és mtsai, 1997/a; 1997/b; Stebbins és mtsai, 1997; Obermann és mtsai, 1998). A domén konzervált aminosav sorrendje azonos harmadlagos szerkezetben jelenik meg. A domén olyan a/b-szendvics, melynek alja egy nyolcszálú folytonos, nagyrészt antiparalel b-redős lemezből áll, a falait felépítő kilenc hélix és összekötő hurkok pedig egy meglehetősen mély, hidrofób zsebet alakítanak ki (2.6.1. ábra). A zsebet vagy ADP, vagy geldanamycin, egy benzokinon anzamicin antibiotikum tölti ki, amely gátolja a Hsp90 ATPkötését (Grenert és mtsai, 1997), ATPáz aktivitását, és in vivo funkcióját (Obermann és mtsai, 1998; Panaretou és mtsai, 1998).
14
2.6.1.1. A GHKL fehérjecsalád
Fehérje
Típus
Jelentőség
N-terminális domén szerepe
giráz B
prokarióta topoizomeráz II
osztódás
DNS-kötés, hasítás koordináció
topo II
eukarióta topoizomeráz II
sejtosztódás
DNS-kötés, hasítás koordináció
topo VI
archeális topoizomeráz
sejtosztódás
DNS-kötés, hasítás koordináció
MutL
mismatch repair fehérje
DNS hibajavítás
DNS-MutS MutH összehozása
CheA, EnvZ
prokarióta hisztidin kináz
prokarióta jelátvitel
effektor fehérje foszforiláció
PDK, BCK
eukarióta hisztidin kináz
anyagcsere szabályozás
a-ketosav dehidrogenázok foszforilációja
JFC1
adapter fehérje(?)
jelátvitel (?)
lipid (PIP3)-fehérje kihorgonyzás(?)
Hsp90
dajkafehérje
chaperon
kliens aktiváció koordinációja
2.6.1.1. táblázat
A GHKL ATPáz/kináz szupercsalád tagjai
Szinte teljesen fedésbe hozható doménszerkezet figyelhető meg néhány fehérjénél, melyek egymástól látszólag teljesen eltérő elsődleges szerkezettel (<15% aminosav azonosság) és funkcióval rendelkeznek (2.6.1.1. táblázat). Közös vonásuk az, hogy működésük ATPkötését és hidrolízisét igényli. Elsőként a DNS giráz B alegységének N-terminális doménjét egy ATP-analóg jelenlétében, dimerként kristályosították (Wigley és mtsai, 1991). Bergerat és mtsai (1997) ismerték fel, hogy az ATP-kötő motívumok más fehérjékben – köztük a Hsp90ben és a MutL-ben – is megtalálhatók, így a szerkezetet Bergerat-típusú kötőhelynek nevezik. Amerikai szerzők előnyben részesítik a betűszókat, a rokon fehérjék után (giráz, Hsp90, hisztidin kináz, MutL) a GHKL ATPáz/kináz szupercsalád nevet adományozták a családnak (Ban és mtsai, 1999; Dutta és Inouye, 2000). A családtagok száma fokozatosan gyarapodik, legújabb képviselői a mitokondriális a-ketosav dehidrogenázok kinázai (Machius és mtsai, 2001), illetve az egyelőre ismeretlen funkciójú, tandem C2 és SH3 doménekkel rendelkező JFC1 fehérje (Catz és mtsai, 2001). 2.6.1.2. Az ATP-kötés szerkezeti alapjai Bár a Hsp90 és a giráz B N-terminálisa közötti szerkezeti hasonlóságot – egy bravúros CASP2 nyertes predikció segítségével – felismerték (Gerloff és mtsai, 1997), a kristályszerkezet (Prodromou és mtsai, 1997/b) és egyértelmű biokémiai bizonyítékok (Grenert és mtsai, 1997) ismeretéig a Hsp90 ATP-kötéséről, autofoszforilációs és ATPáz aktivitásáról, 15
valamint az ATP Hsp90 szerkezetére és működésére kifejtett hatásairól közölt eredményeinket nemhogy figyelmen kívül hagyták, hanem egyenesen cáfolták (Csermely és Kahn, 1991; Csermely és mtsai, 1993; Kellermayer és Csermely, 1995; Nardai és mtsai, 1996; vs. Jakob és mtsai, 1996). Nem csoda, hiszen a rendhagyó szerkezetű kötőhely a hagyományos Walkertípusú és egyéb nukleotid-kötőhelyektől eltér (Traut, 1994), sőt, még a nukleotidot is kicsavart formában köti (Prodromou és mtsai, 1997/b). A család tagjainak ATP-kötőhelyéről a bgfoszfát kifelé tekint, mintha a modul célja pont a g-foszfát felkínálása lenne egy másik fehérjerésznek, melynek így a térszerkezetét/funkcióját befolyásolhatja (2.6.1. ábra).
Motívum(szakasz)
Konszenzus
Humán Hsp90a
Elhelyezkedés
Szerep
I. (N)
ExxxNxxDA
46
1. hélix
Mg2+-koordináció, ATPáz
DNGxG
92
3. hurok
N6 amin, ATP-specificitás
III. (G2)
GxxGxG
130
4. hurok
a(és g)-foszfát-Mg2+
IV.(G3)
GT
182
6. hurok
N1
*V.
Q/Nx2-5K/R
?
középső domén
g-foszfát, ATPáz
II. (G1)
ElisNssDA DtGiG GqfGvG GT
2.6.1.2. táblázat A GHKL ATP-kötő domén konszenzus motívumai *Az V. motívum nevét mi javasoltuk (Sőti és mtsai, 2002).
A domén szerkezetét vizsgálva magyarázatot kapunk arra, miért kerüli el még a leggyakorlottabb, ATP-kötőhelyekre vadászó bioinformatikus, sőt a kristályszerkezetet meghatározó szakember figyelmét is. Csak és kizárólag az ATP-kötő zsebet alkotó és a nukleotiddal kölcsönhatásba lépő rövid szegmentumok konzerváltak, melyek négy fő motívumot alkotnak (Dutta és Inouye, 2000; 2.6.2. táblázat). A hasonló harmadlagos szerkezetet a másodlagos szerkezeti elemek megőrzöttsége hozza létre, mely nem feltétlenül jelent szekvencia-homológiát. Ezt a tényt elméleti munkája során diákkörösünk, Rácz Attila is kihasználta. A fehérje család ATP iránti affinitása rendhagyóan alacsony, a disszociációs állandó a pár száz mikromólos tartományba esik. A kötés gyengeségére az ATP energetikailag kedvezőtlen konformációján túl az is magyarázatot ad, hogy a családtagok g-foszfát kötő motívuma a következő doménen helyezkedik el, mely nélkül az ATPáz nem működik (Wigley és mtsai, 1991; Ban és Yang, 1998; Dutta és Inouye, 2000). A Hsp90 N-terminális kristályában 16
ennek megfelelően a g-foszfát nem ad diffrakciós árnyékot. A szerkezeti analógiára utal továbbá, hogy az ATP kötéséhez és az (egyébként önmagában igen mérsékelt) ATPáz aktivitáshoz az N-terminálison túli fehérjerészek jelenlétére is szükség van (Obermann és mtsai, 1998; Prodromou és mtsai, 2000; Weikl és mtsai, 2000). Az N-terminális domén nukleotid állapota meghatározza a fehérje (és a C-terminális domén) szerkezetét és funkcióját (Grenert és mtsai, 1997; Chadli és mtsai, 2000). A fehérje nukleotid-kötése és ATPáz aktivitása a sejt számára is létfontosságú (Louvion és mtsai, 1996; Obermann és mtsai, 1998; Panaretou és mtsai, 1998). A GHKL-fehérjék konformációs entrópiáját tovább csökkenti az ATP hatására bekövetkező N-terminális dimerizáció (Wigley és mtsai, 1991; Ban és mtsai, 1999; Maruya és mtsai, 1999; Prodromou és mtsai, 2000), mely szintén növelheti a KD-t, ugyanakkor a dimer két fele a girázban kompozit nukleotid-kötőhelyet alakíthat ki (Wigley és mtsai, 1991). A dimerizációt a 2. és 3. motívumot összekötő fedél bezáródása hozhatja létre, a fedél elhelyezkedése az a fontos tényező, mely az egyéb doméneken túl meghatározza a családtagok specifikus vonásait (Dutta és Inouye, 2000). Az ATP-re specifikus konformáció eléréséhez a középső domén jelenléte is szükséges, mert a Hsp90 kristályában az üres, a geldanamycin- illetve az ADP/ATP-kötött fehérje háromdimenziós szerkezete (a fedél helyzetén kívül) tökéletesen fedésbe hozható. 2.6.1.3. A Hsp90 ATPáz aktivitása Bár a GHKL családban helyet kaptak hisztidin kinázok (CheA, PDK) is, a többi fehérjének mérsékelt, ligand-stimulálta ATPáz aktivitása van. Az ATPáz aktivitást a Cterminális domén a tagok esetén különbözőképpen szabályozhatja (az eltérő C-terminális szerkezetekből és eltérő biológiai szerepből kifolyólag). A topoizomeráz II-ben a C-terminális domént nem tartalmazó mutáns ATPáz aktivitása olyan magas, mint a teljes fehérjéé DNS jelenlétében, azaz a C-terminális egyszerre gátolja a nyugalmi ATPázt és közvetíti a DNS serkentő hatását, feltehetően a domén-domén kommunikáció egymásra épülő lépései révén (Bjergbaek és mtsai, 2000). A MutL ATPáz aktivitása csak az egész fehérjében mérhető (Ban és mtsai, 1999). A Hsp90 ATPáz aktivitását számos labor tanulmányozta (koraiak: ld. Csermely és mtsai, 1998). Saját korai eredményeink (Nardai és mtsai, 1996), bár egybevágtak a csak idén publikált irodalmi adatokkal (Owen és mtsai, 2002), az ATP-kötés körüli bizonytalanság miatt kevésbé ismert folyóiratban láttak napvilágot, és több bizonytalan pontot nem tudtak egyértelműen megválaszolni, így a feledés homályába merültek. A kötőhely kristályosítása óta közlemények csak az élesztő Hsp82 és a HtpG ATPáz aktivitásáról jelentek
17
meg (Obermann és mtsai, 1998; Panaretou és mtsai, 1998; Scheibel és mtsai, 1998; Prodromou és mtsai, 1999; 2000; Young és Hartl, 2000; Weikl és mtsai, 2000; Richter és mtsai, 2001). A foszfomolibdát organikus extrakciója helyett az irodalomban használatos, érzékenyebb metodikát állítottunk be, és vékonyréteg kromatográfia után foszforimidzser detektálással kizárólag élesztő Hsp82 ATP-áz aktivitását sikerült mérnünk, sem a tisztított patkány Hsp90(b), sem a rekombináns humán Hsp90a nem mutatott érzékelhető ATPáz aktivitást, annak ellenére, hogy ATP kötésére mindegyik fehérje, hasonló affinitással képes volt (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). Egy tavalyi chaperon-konferencián kiderült, miért kizárólag az élesztő Hsp82 ATPáz aktivitásáról jelentek meg adatok. Bár a funkcionális kísérleteket általában humán Hsp90-nel csinálták, az ATPáz méréseket – akár egy közleményen belül is – élesztő fehérjével végezték (pl. Obermann és mtsai, 1998), ugyanis az egyéb Hsp90-ek ATPáz aktivitását az élvonalbeli kutatócsoportok sem tudták mérni. Egy ismeretlen csoport azonban azzal az előadással jelentkezett, hogy a humán Hsp90 gyenge, de mérhető ATPáz aktivitását a glukokortikoid receptor stimulálja (Steve McLaughlin, személyes közlés), amelyet az idén közlemény követett (McLaughlin és mtsai, 2002). Hazajövetel után fogtam magam, és az ATPáz aktivitásokat folyadékszcintillációs számlálással kezdtem mérni. Meglepődve tapasztaltam, hogy mindegyik Hsp90 hidrolizálja az ATP-t, de a magasabbrendű fajokból származók az élesztő aktivitásának csak 10%-át mutatják, amely 1-2 óra inkubációs idő alatt is épphogy a háttér határán volt (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). David Toft kutatócsoportja az első, amely alapos vizsgálatban hasonlította össze a különböző fajokból származó Hsp90 homológok ATPáz aktivitását, egy jelenleg (még) nyomtatás előtt álló közleményben (Owen és mtsai, 2002). Saját eredményeinkkel egybehangzóan azt találta, hogy minél magasabbrendű az organizmus, annál gyengébben hidrolizálja az ATP-t (2.6.1.3. táblázat).
Faj
fehérje
Owen és mtsai, 2002; rekombináns fehérjék (30°C)
18
kcat (perc-1)
E. coli HtpG humán Trap1 élesztő Hsc82 csirke Hsp90a humán Hsp90b Nardai és mtsai, 1996; tisztított fehérjék patkány, egér Hsp90 humán 95% Hsp90 humán SDS-gél tisztított Hsp90 Sőti Cs. és Csermely P.; nem közölt adatok patkány tisztított Hsp90(b) humán rekombináns Hsp90a élesztő rekombináns Hsp82 Panaretou és mtsai, 1998; rekombináns fehérje élesztő Hsp82 McLaughlin és mtsai, 2002; rekombináns fehérjék élesztő Hsp82 humán Hsp90b humán+GR-LBD Hsp90b
0,100 0,100 0,080 0,025 0,015 <0,004 0,445 0 0,035 0,046 0,413 0,800 0,500 0,089 1,150
2.6.1.3. táblázat Különböző fajokból származó Hsp90 fehérjék ATPáz aktivitása GR-LBD, glukokortikoid receptor ligandkötő doménje
A nyugalmi ATPáz aktivitás csökkenése összefüggésben állhat a Hsp90 szaporodó szerepeivel, klienseivel és segítő fehérjéivel, melyek chaperon aktivitását egyre szigorúbban kontrollálják. Ezt a hipotézist támasztja alá Chrisostomos Prodromou-nak a fenti konferencián elhangzó előadása is, mely részint egy Aha-1 nevű fehérje (Activator of Hsp90 ATPase 1) klónozásáról szólt. A fehérje nevének megfelelően stimulálja az élesztő Hsp82 ATPáz aktivitását, még érdekesebb volt azonban, hogy a kutatócsoport megfejteni látszott az élesztő Hsp82 ATPáz ciklusát. Részletesen jellemezték a különböző kochaperonok Hsp90-ATPázra kifejtett gátló/aktiváló hatását. Bár a munka épp közlés előtt állt, azóta sem jelent meg tanulmányuk, ugyanúgy jártak, mint a Hsp90 kristályosításával (Prodromou és mtsai, 1997 vs. Stebbins és mtsai, 1997), és az ATP-kötés in vivo szerepével kapcsolatos vizsgálataikkal (Panaretou és mtsai, 1998 vs. Obermann és mtsai, 1998): az eredményeket mások közölték először. Most is így történt, egy másik angol csoport, amely a humán Hsp90b ATPáz aktivitását mérte (ld. fent), az idei év elején ugyanazt a munkát publikálta, csak nem élesztő, hanem humán Hsp90-nel (McLaughlin és mtsai, 2002). A két csoport eredményeit egybevetve kirajzolódik, hogy a humán Hsp90 takarékoskodik az ATP-vel, specifikus kliens viszont 200szorosára fokozhatja a sebességet. Az élesztőét ezzel szemben csak 2-3-szorosára fokozza, azaz belőle ez a hatékony kapcsoló hiányzik. Ennek megfelelően a kochaperonok az élesztő
19
nyugalmi ATPáz aktivitását is szabályozzák, a humánra viszont csak a kliens jelenlétében hatnak. Eredményeik magyarázatot adnak arra a megfigyelésünkre, hogy a Hsp90-asszociált ATPáz aktivitás valamilyen citoszolikus faktor hatására aktiválódik (Nardai és mtsai, 1996).
Utolsó aminosav a humán Hsp90a szekvenciában
ATPáz (a teljes fehérje aktivitásának %-a) Élesztő Hsp82
Csirke Hsp90a
619/614
___________
22
100
584
__________
n.a.
300
571/573
_________
11
900
469
______
1
n.a.
232
___
0
5
2.6.1.4. táblázat C-terminálisan trunkált Hsp90 fehérjék ATPáz aktivitása A vonalak a konstrukciók hosszát mutatják. A csirke 614-es mutáns dimer, a többi monomer szerkezetű. Az ATPáz aktivitásokat Prodoromou és mtsai (2000, élesztő), valamint Owen és mtsai (2002, csirke) közölték. n.a., nincs adat
2.6.1.4. A C-terminális régió hatása az ATPáz aktivitásra Ha főként Prodromou és Toft eredményei alapján megvizsgáljuk, hogy a C-terminális domén hogyan hat az ATPáz aktivitásra, újabb meglepetés ér minket (2.6.1.4. táblázat). Míg az élesztő ATPáz aktivitása a dimerizációs domén elvesztésével drasztikusan csökken, a csirkéé megtízszereződik. Feltehetően a magasabbrendő Hsp90-ek esetén partnerfehérjék függeszthetik fel a C-terminális domén által kifejtett permanens gátlást, amely az ATPáz ciklus finomabb szabályozását és takarékosabb működését eredményezheti. Az élesztő Hsp90 ATPáz aktivitását a C-terminális doménen kötő Sti1 gátolja, az ugyanide kötő Cpr6 viszont nem (Prodromou és mtsai, 1999). A humán homológ Hop kizárólag a humán Hsp90b kliensstimulált ATPáz aktivitását gátolja, a Cyp40 pedig serkenti (McLaughlin és mtsai, 2002). Az izolált N-terminális domén nem rendelkezik számottevő ATPáz aktivitással. Az élesztő Hsp82 ATPáz működéséhez szükséges C-terminális határ valahol a 470-570. aminosav között húzódik. Bár a magasabbrendű fehérjéknél erre közvetlen adat nincs, a csirke Hsp90a p23 kötése az N-terminális doménen kívül a 446-490. aminosavak közti régió jelenlétét igényli (Chadli és mtsai, 2000). Feltételezhető, hogy mind az ATPáz aktivitáshoz, mind a p23
20
kötéséhez a középső domén g-foszfát kötőhelye (valamint a középső domén korrekt felgombolyodása) szükséges. 2.6.1.5. Az ATP-függő molekuláris fogó A
GHKL
család
tagjainak
ATPáz
aktivitását
az
N-terminális
domének
jelenléte/dimerizációja is különbözőképpen befolyásolja. A giráz B-ben a két N-terminális kapcsolódása által kialakított kompozit ATP-kötő zseb szükséges az aktivitáshoz (Wigley és mtsai, 1991; Brino és mtsai, 2000). A MutL dimerizációja elengedhetetlen az ATP hasításához (Ban és mtsai, 1999). A II-es típusú topoizomerázoknál feltehetően nem szükséges az Nterminális domének stabil kapcsolódása az ATP hasításához (Bjergbaek és mtsai, 2000). A Hsp90 helyzete ebben a tekintetben is speciális. Az ATPáz aktivitáshoz szükséges és elégséges, ha a dimer fehérje egyik N-terminális doménje képes az ATP kötésére és hidrolízisére (Richter és mtsai, 2001), bár az ATP-indukált N-terminális dimerizációra képtelen T115I mutáns (Prodromou és mtsai, 2000) nem képes elengedni a kliensfehérjét (Young és Hartl, 2000), azaz az N-terminális asszociáció szükséges a Hsp90 effektív chaperon ciklusához. A Hsp90 dimer ATP-kötő aszimmetriája két dologra emlékeztet. Először, a topoizomerázoknál megfigyelhető, hogy a két ATP nem egyszerre hidrolizál, mindkettőnek megvan a ciklus során a saját szerepe (Baird és mtsai, 1999). Ez a kinetikai aszimmetria megjelenhet két különböző alegység dimerizációja révén is, mint a MutLa heterodimer (Mlh1p és Pms1p) esetében (Tran és Liskay, 2000). Sokkal érdekesebb azonban, hogy a strukturális/funkcionális aszimmetriát nemcsak eltérő alegységek, hanem (mint pl. a topoizomeráz II, és talán a Hsp90 esetén) azonos, de a dimerben eltérő konformációjú alegységek szerkezeti aszimmetriája is létrehozhatja, amelynek gyönyörű példája a kb. 800 aminosavból álló MutS fehérje kristályszerkezete (Lamers és mtsai, 2000). Hogy a Hsp90 rendelkezik-e ilyen tulajdonságokkal, feltehetően csak a teljes molekula kristályszerkezetének szubsztrát jelenlétében történő meghatározása fogja megválaszolni. Általánosságban megfogalmazhatjuk, hogy a GHKL család dimer fehérjéinek Nterminális doménjei az ATP hatására asszociálnak, és megváltoztatják a C-terminális domének konformációját, amely a fehérje-specifikus biológiai funkciót megvalósítja. Az N-terminálisok molekuláris fogóként működhetnek, a C-terminálisokkal együtt kialakított üregben nukleotidvagy fehérjeláncokat ejthetnek csapdába, majd a megfelelő formába alakítják őket. Az ATP hidrolízise helyreállítja a kiindulási állapotot. A Hsp90 3-4 nm átmérőjű centrális üregébe éppen beférhet egy fehérjedomén (Young és mtsai, 2001), ATPáz aktivitása pedig 21
meghatározhatja az aktív, funkcióképes kliensfehérje(komplex) élettartamát (Prodromou és mtsai, 1999). A Bergerat-domén megjelenése a szögesen eltérő funkciót azonos mechanizmussal megvalósító fehérjékben a moduláris evolúció szép példája. 2.6.1.6. A GHKL-domén specificikus gátlószerei A GHKL-fehérjék nukleotid-kötőhelyének specificitása hasonló. A család tagjai ATP-t és dATP-t kötnek, azonban GTP kötés nem detektálható (Grenert és mtsai, 1997; Catz és mtsai, 2001). Emellett szembeötlőek a különböző fehérjék speciális tulajdonságai. A Hsp90 ADP iránt affinitása (KD=10-40 mM) például 5-10-szerese az ATP iránt mérhetőnek (KD=100400 mM), mely a család más tagjaira – a mitokondriális protein kinázok kivételével – nem áll (Prodromou és mtsai, 1997/b; Grenert és mtsai, 1997; Machius és mtsai, 2001; saját nem közölt adatok). Az ADP fogva tartása megakadályozhatja a felesleges ATPáz üresjáratot. Az eltérő szerkezeti sajátságok a gyógyszeripar örömére fehérje-specifikus gátlószerek kifejlesztését teszik lehetővé, a hasonlóságok viszont óva intenek a keresztreakcióktól, melyek súlyos „mellékhatásokat” okozhatnak. Így a girázt mikromólos koncentrációban gátló novobiocin a MutL fehérjét (és várhatóan az eukarióta topoizomerázokat, mismatch repair fehérjéket) századannyira gátolja (Ban és Yang, 1998), a Hsp90 N-terminálisához pedig egyáltalán nem köt. Köt azonban a C-terminális doménjéhez(!), és allosztérikusan gátolja az N-terminális funkcióját (Marcu és mtsai, 2000/a, Sőti és mtsai, 2002). Szerencsére a Hsp90nek vannak specifikus gátlószerei (2.6.1.6 táblázat), melyeknek daganatellenes potenciálja jelenleg fázis II klinikai tanulmányok tárgya. Az eredetileg tirozin kináz gátlóként ismert antitumor antibiotikumokról, a geldanamycinről és a herbimycin A-ról kiderült, nem közvetlenül az src-kinázok aktivitását, hanem dajkájukkal, a Hsp90-nel kialakított aktív konformációjukat létrehozó kölcsönhatást gátolják (Whitesell és mtsai, 1994). A 90 kDa-os stresszfehérjék N-terminális ATP-kötőhelyére az anzamicinektől eltérő szerkezetű radicicol nanomólos affinitással köt (Roe és mtsai, 1999), bár a biológiailag hatásos koncentráció elmarad a geldanamycinétől és az in vitro affinitás alapján várttól (Schulte és mtsai, 1998; Soga és mtsai, 1998). A gátlószerek specificitását megkérdőjelezi az eltérő hatásspektrum (pl. a radicicol erős nyugtató), a hatékony koncentrációk divergenciája (ld. 2.6.1.6. táblázat), valamint a két gátlószer szinergista hatása (Rosenhagen és mtsai, 2001). A citrát liáz a Hsp90 család tagjain kívül az első olyan fehérje, amelyet a radicicol specifikusan gátol (Ki és mtsai, 2000), de hasonló célfehérje elképzelhető a geldanamycin esetén is. A specificitási problémákon túl a Hsp90 kiterjedt „klientúrája” is nem kívánt mellékhatások megjelenésével
22
fenyeget. Két legyet üthetünk egy csapásra, ha a geldanamycin hatását a célfehérjére specifikus gátlószerhez vagy antitesthez való kötéssel csak a kívánt komplexre korlátozzuk (Chiosis és mtsai, 2001).
Paraméter
Koncentráció (nM)
Hivatkozás
geldanamycin
radicicol
1215
19
300
1000-5000
Proliferáció gátlás
20
100
Schulte és mtsai, 1998
Szteroidreceptor gátlása
40
200
Rosenhagen és mtsai, 2001
KD(élesztő Hsp82) Jelátviteli komplexek gátlása
Roe és mtsai, 1999 Soga és mtsai, 1998;
Neuroprotektív hatás
1
10
Sano, 2001
Neurotoxikus hatás
5
nincs
Sano, 2001
Hsp90-specifikus?
?
nem
Egyéb fehérje köti
?
citrát liáz
Ki és mtsai, 2000
10
Ki és mtsai, 2000
KI (mM)
2.6.1.6. táblázat
A Hsp90 N-terminális ATP-antagonistáinak jellemzői
2.6.2. A töltött régió 2.6.2.1. A töltött régió autonóm szerkezete Az N-terminális domént követi a változó hosszúságú, csak az eukarióta Hsp90 fehérjékben előforduló 50-70 aminosavas töltött régió. Nevét elképesztő töltéssűrűségéről kapta, 76% a töltött aminosavak aránya, túlnyomóan savas aminosavakkal (2.6.2.1. ábra). A Hsp90 legfőbb immunogén régiója, és bár aminosav sorrendjének konzerváltsága az egész molekula átlagát nem éri el, aminosav cserék csak a töltések megtartása mellett megengedettek (Nemoto és mtsai, 1997). Feltehetően a fehérje felületén helyezkedik el, de részben a Hsp90 más részeivel, részben más fehérjékkel kialakított kölcsönhatása miatt nem könnyen elérhető. Predikciós vizsgálatok alapján – a módszertől is függően – a helikális elemek dominálnak benne (Binart és mtsai, 1989; Sőti Cs., Csermely P., közlemény előkészületben). A csirke Hsp90a töltött régióját (227-292. as) kifejeztük, majd szerkezetét különböző módszerekkel vizsgáltuk. A távoli ultraibolya cirkuláris dikroizmus (CD) mérések tanúsága szerint élettani körülmények között a töltött régió a statisztikus polipeptidlánc
23
makroszkóposan kaotikus struktúráját veszi fel, amely az aminosav-kötések szintjén igen rendezett struktúrát – rövid életidejű naszcens hélixeket – is hordozhat (Dyson és mtsai, 1988). A triptikus hozzáférhetőség ugyanezt tükrözte: a 18 lizin nagy része elérhető volt, ami a harmadlagos szerkezet szintjén árulkodott arról, hogy a régió nem képez önálló, stabil szerkezetű tekeredési egységet (domént). Az elektrosztatikus repulzió lehetőségét fontolgatva a szerkezeti analízist elvégeztük 0,5 M KCl jelenlétében, a jósolt helikális szerkezet ezzel együtt nem jelent meg. Kísérleteink konkrét tanulsága az, hogy a töltött régió autonóm konformációja nem feltétlenül felel meg a teljes fehérjében felvett heteronóm szerkezetnek, bár nem zárja ki, hogy a Hsp90-ben a töltött régió sztérikus okok miatt nem érhető el.
1
Töltés
0 S -1 227
S 236
246
256
266
276
286
Aminosav
Predikció:
Hélix
EF-kéz homológia
2.6.2.1. ábra
Bizonyos
Hélix
KEKE-régió
nukleáris lokalizációs szignál
A töltött régió szerkezete
kismolekulák
(’ozmolitok’,
pl.
glicerin)
szerkezeti
stabilizátorként
viselkednek, talán leghatékonyabb képviselőjük a trimetilamin-N-oxid, amely egy denaturált mutáns fehérje natív szerkezetét gond nélkül helyreállítja (Baskakov és Bolen, 1998). Az ozmolitok hatásmechanizmusáról alkotott hipotézis szerint az ozmolitok a polipeptidlánc szolvatálását nehezítik, így a fehérje azt igyekszik a belsejébe rejteni (Liu és Bolen, 1995). Peptidek esetén ez b vagy random konformációból a-hélixbe történő átmenetet jelentene. Kísérleteinkben a töltött régió konformációját a trimetilamin-N-oxid nem befolyásolta, ami ellentmondani látszik a polipeptid gerincre gyakorolt hatásának, annál inkább, mert egyéb körülmények között a töltött régió helikális konformációt vett fel (ld. lejjebb). Ugyanakkor a kísérlet arról is tanúskodik, hogy apoláros oldalláncok hiányában hidrofób mag nem alakulhat ki, ami megnehezíti a stabil másodlagos szerkezeti elemek létrejöttét. Elképzelhető, hogy a
24
trimetilamin-N-oxid is az apoláros oldalláncok oldékonyságát befolyásolja, amire az ozmolit jelenlétében savi pH-n végzett CD mérés nyújthat támpontot. 2.6.2.2. A töltött régió indukált szerkezete működésének fontos tényezője lehet A trifluoretanol ismert és kedvelt oldószer a spektroszkópiával foglalkozók körében. Aki szép hélixet akar látni, az trifluoretanol jelenlétében vizsgálja a mintáját. A trifluoretanol ténylegesen elrejti a peptid gerincet, a kérdés csak az, hogy ez a hatás a fehérjében eredetileg meglevő tendencia (hajlam, eredetileg ’propenzitás’) felerősítése, vagy műtermék (Buck, 1998). Az biztos, hogy az alacsony dielektromos állandójú oldószer a fehérjéket kitekeri, denaturálja. Polipeptidünknek hidrofób magja nem lévén, trifluoretanollal nagyon ártani nem tudtunk, és örömmel tapasztaltuk, hogy a töltött régió helicitása a trifluoretanol koncentráció függvényében jelentősen növekedett (Sőti Cs., Csermely P., közlemény előkészületben). Fenti kísérletek azt sugallják, hogy a peptid autonóm konformációját hidrofób (trifluoretanol) oldalláncok közelsége vagy töltésárnyékolás (pH-csökkenés) ionpárosodás folytán modulálni képes a teljes Hsp90-ben, ahol indukált helikális struktúra alakulhat ki. Az utóbbi években több „szerkezet nélkül funkcionáló” fehérjerészekkel foglalkozó közlemény látott napvilágot. Genomunk (fehérjéink) akár 40%-a ilyen lehet, és ennek beláthatatlan előnyei vannak az indukált
szerkezetek
kölcsönhatásokkal
szembeni
specificitása
és
termodinamikai
jellegzetességei miatt (Wright és Dyson, 1999; Wright, 2001). A Hsp90 működésében rengeteg makro- és kismolekula játszik szerepet, amelyek kötőfelszínei kis túlzással nemhogy egy fehérjén, de talán még a kiterített riboszómán sem férnének el. Túl a Hsp90 doménjeinek működését meghatározó molekuláris kapcsoló funkción (Sőti és mtsai, 2002), a töltött régió flexibilis konformációs átmenetei a Hsp90-hez kötő egyéb vegyületek kötésének specificitását és affinitását is meghatározhatja. Ezt a szerepet nemhogy kétségbe vonja, inkább alátámasztja az, hogy az élesztő Hsp90 töltött régiójának deléciója nem azonnal letális (Louvion és mtsai, 1996), nincs hatással az élesztő feromon szignáljára, viszont erősíti a Hap1 (hem aktivátor protein 1, az élesztő hemfüggő transzkripciós faktora) transzaktivációs hatását (Lee és mtsai, 2002). Ez alapján nem zárható ki, hogy a deléciónak hosszú távú hatásai lehetnek pl. az élesztő sejtek élettartamára. A viszonylag primitív egysejtű gombában a jelátviteli folyamatok sokrétűsége, illetve a Hsp90 klienseinek és segítőinek száma csekély (pl. Xu és Lindquist, 1993), ami felveti azt, hogy többsejtűekben fontosabb szerepet kap a töltött régió. Erre bizonyítékot jelenthet a Hsp90 specifikus chaperon működését vizsgáló két modellrendszer: David Toft 25
eredményei szerint a töltött régió hiánya mind a luciferáz, mind a progeszteron receptor felgombolyítását ellehetetlenítette (Johnson és mtsai, 2000; Chadli és mtsai, 2000). Mindkét eredményük a tanulmány margóján odavetve jelent meg, magyarázat nélkül. A kísérletek alapos elvégzése bizonyíthatja a töltött régió „molekuláris kapcsoló” szerepéről kialakított elméletünket, egyúttal magyarázatot adhat a töltött régió biológiai funkciójára. 2.6.2.3. A töltött régió kalcium kötése A Hsp90 kalciumot (Minami és mtsai, 1993) és magnéziumot (Jakob és mtsai, 1995/b) köt. Magnézium jelenlétében a denaturált citrát szintáz (C-terminális chaperon helyre köt, Jakob és mtsai, 1995/b) és a laktalbumin (Schnaider és mtsai, 2000/b) disszociál a Hsp90-ről, a dihidrofolát reduktáz viszont stabil komplexet képez (Yonehara és mtsai, 1996; az Nterminális chaperon helyre köt, ld 2.8.1.2. fejezet). Hosszabb inkubáció divalens kationok jelenlétében a Hsp90 oligomerizációját, aggregációját idézi elő (Jakob és mtsai, 1995/b; Garnier és mtsai, 1998; saját nem közölt adatok). Divalens kationok az N-terminális domén szerkezetét destabilizálják, részben ez állhat az oligomerizáció hátterében (Garnier és mtsai, 1998). A folyamat kalcium jelenlétében kifejezettebb. Érdekes, hogy a magnézium a Hsp90a1221
és a Hsp90a449-731 aggregációját egyformán elősegítette (Garnier és mtsai, 2002), ami
alapján nehéz behatárolni, van-e specifikus divalens kation (magnézium) kötőhely. Predikciós vizsgálatokkal a töltött régióban EF-kéz-szerű motívumokat találtunk (Nardai és mtsai, 1996), bár ez nem a klasszikus nagy affinitású kötést kialakító EF-kéz (Garnier és mtsai, 1998). A vas(II)-indukált redox-hasítás által generált két fragmentum szintén a töltött régió területére esett (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). Ezután megvizsgáltuk, milyen hatást gyakorol 1 mM kalcium az izolált töltött régió szerkezetére. Másodlagos szerkezetét nem befolyásolta, a harmadlagos szerkezetet destabilizálta, mégpedig a töltött régió második felében hatva (Sőti Cs., Csermely P., közlemény előkészületben). Szó esett a Hsp90 kalmodulin kötőhelyéről a domén-domén kölcsönhatásoknál. A szintetikus kalmodulin-kötő peptid nemcsak a Hsp90 oligomerizációját fokozta, hanem a Hsp90 kalcium kötését is gátolta, ami legalábbis egy specifikus kalcium kötőhelyet feltételez (Minami és mtsai, 1993). Ha eredményeinket a fenti adatokkal kombináljuk, a töltött régióHsp90/kalmodulin kölcsönhatást modellezhetjük (2.6.2.3. ábra). A töltött régió (egy része) alapállapotban kölcsönhatásba lép a középső domén C-terminális részével, és lefedi a kalmodulin-kötőhelyet (valamint az ATP-kötőhelyet). Kalcium hatására a kölcsönhatás felszakad, és a Hsp90 C-terminálisán kötőfelület szabadul fel, amely (szubsztrát hiányában) a 26
fehérje oligomerizációját segíti. Egyidejű kalmodulin kötés az oligomerizációt, és a Hsp90 Faktinnal történő kapcsolódását gátolja (Nishida és mtsai, 1986). A kalmodulin feltehetően a Hsp90-en keresztül segíti elő a ciklin D1 és a CDK4 magi átrendeződését (Taulés és mtsai, 1998). A kalcium(-kötött töltött régió) az N-terminális szerkezetét befolyásolhatja (Garnier és mtsai, 1998). A magnézium korántsem biztos, hogy ugyanoda köt, és ekvivalens hatásokat vált ki, az adatok szerint a chaperon aktivitást nem befolyásolja (Yonehara és mtsai, 1996) vagy gátolhatja (Jakob és mtsai, 1995/b).
N
C C töltött regió
Ca2+
N
Ca2+
C
vagy
hő defoszforiláció a-peptid neuropeptid Y
oligomerizáció szubsztrát kötés Ca-kalmodulin kötés sejtmagi transzlokáció
2.6.2.3. ábra A töltött régió-Hsp90 kölcsönhatás modellje Különböző behatásokra a középső-C-terminális doménnel kialakított sókötések felszakadnak, és aktív felszín jelenik meg a Hsp90 felületén.
2.6.2.4. A töltött régió foszforilációja A töltött régió két olyan foszfoszerint (Ser230, Ser262) tartalmaz in vivo, melyeket a kazein kináz II két helyen foszforilál in vitro (Lees-Miller és Anderson,1989/a; ld. 2.6.2.1. ábra). A szerinek az élesztő Hsp82-ben még nem jelennek meg, a muslica és a növényi Hsp90ekben pedig csak az első konzervált (nem közölt adatok). A Hsp90 megvédi a kazein kináz II-t az aggregációtól és az inaktiválódástól (Miyata és Yahara, 1992), a kötésben a töltött régiónak is szerepe van (Miyata és Yahara, 1995). A foszforilációs helyek a jósolt EF-kéz hélixek kezdetére esnek (Nardai és mtsai, 1996; 2.6.2.1. ábra), ami felveti, hogy a foszforiláció befolyásolja a kalcium kötést (és fordítva), valamint a szerkezetet. A fragmentet in vitro foszforiláltuk kazein kináz II-vel, majd a két foszfátcsoportot tartalmazó polipeptidet megtisztítottuk. A foszforiláció – ellentétesen a kalciummal – a fragment második felének szerkezetét stabilizálta, összhangban szerkezeti szimulációs eredményekkel (Smart és 27
McCammon, 1999). Kísérleteink alapján egy modellt álítottunk fel a töltött régió konformációs állapotairól (Sőti Cs., Csermely P., közlemény előkészületben; 2.6.2.4. ábra).
Hsp90-ben
Önálló
“Környezetváltozás” P
? =
P TFE, pH
P
P NPY, Ca vagy
2 Pi
pH
?
2.6.2.4. ábra A töltött régió konformációs állapotainak modellje Vizes oldatban a töltött régióban egy naszcens hélix található. A Hsp90 vagy egyéb makromolekula környező ionos és hidrofób oldalláncai stabilizálhatják a töltött régió szerkezetét. Kalcium, defoszforiláció és neuropeptid Y főként a második hélixet destabilizálja. A sókötések felszakadása hidrofób körülmények között a töltött régió aggregációjához vezet. TFE, trifluoretanol, NPY, neuropeptid Y
A töltött domén részt vehet a kalcineurin kötésében (I. Yahara, személyes közlés). Ez felveti annak lehetőségét, hogy a kazein kináz II által foszforilált szerinek defoszforilációjáért maga a kalcineurin felelős. Az, hogy a fehérje foszforilációs-defoszforilációs kaszkádokban szerepet játszó két fontos fehérjének a Hsp90 egyaránt szubsztrátja és dajkája, még intimebb kapcsolatot feltételez a sejtválasz és a Hsp90 funkcionális állapota között. 2.6.2.5. A töltött régió szerepe a Hsp90 chaperon működésében Érdekes, hogy a Hsp90-ben a hőkezelés és az ATP rendkívül hasonló szerkezetváltozást hoz létre (Csermely és mtsai, 1993; Maruya és mtsai, 1999), a látszólagos szerkezeti egyformaság mégis funkcionális ellentétet eredményez. Pl. hőkezelés gátolja a Hsp90 ATPkötését (nem közölt adatok), a divalens kationok és hő additívan elősegítik a Hsp90 oligomerizációját (Garnier és mtsai, 1998), ATP gátolja mindkettőt (Chadli és mtsai, 1999; Garnier és mtsai, 2002). A különböző Hsp90-ek aspecifikus chaperon aktivitása az
28
oligomerizációjukat provokáló hőmérsékleten indul be (Yonehara és mtsai, 1996; Nemoto és mtsai, 2001/b). Ennek jelentősége lehet stresszes körülmények között, amikor az intracelluláris kalcium koncentráció emelkedik. A divalens kationok hatását abból a szemszögből is nézhetjük, hogy a kationok hogyan befolyásolják az ATP-kötést és a Hsp90 chaperon ciklusát. Elképzelhető, hogy a divalens kationok (és ADP) jelenlétében a szubsztrát kis affinitással köt a Hsp90-hez, majd ATP-kötés hatására erősödik a kölcsönhatás (Schnaider és mtsai, 2000/b; Young és Hartl, 2000), amely pont ellentétes a Hsp40 izoforma Hsj1b (Schnaider és mtsai, 2000/b), vagy a Hsp70 (ld. Hartl, 1996; Young és Hartl, 2000) szubsztrát iránti affinitásával. Így a töltött régió a Hsp90 és a foldoszóma egyéb komponense (pl. Hsp40) közötti szubsztrát transzfer kapcsolója is lehet. Ezt azonban specifikus kliensfehérjével szükséges bizonyítani. 2.6.2.6. A töltött régió szerepe a Hsp90 sejten belüli elhelyezkedésében A Hsp90 töltött régiója tartalmaz egy nukleoplazminban található poliglutamin traktust, amely szerepet játszhat a Hsp90 nukleoplazminszerű aktivitásában és a DNS-kötő fehérjék rendezgetésében (Csermely és mtsai, 1994; 1997). A Hsp90-ben nincs klasszikus nukleáris lokalizációs szignál, bár egy gyenge kétosztatú NLS-t találtunk a töltött régió területén (Nardai és mtsai, 1996). A nukleoplazminszerű poliglutaminsav szekvencia pedig gyorsíthatja a sejtmagba jutást (Vancurova és mtsai, 1997). Immuncitokémiai eredmények szerint a fehérje N-terminális doménje (1-206) és a középső domén egy régiója (384-584) a magban található, a 290-383 és az 585-731 régiók viszont gátolják ennek érvényerre jutását (Jibard és mtsai, 1999). Maga töltött régió is inkább sejtmagi lokalizációt mutatott, de a fehérje elhelyezkedésére összességében nem gyakorolt pozitív hatást (Meng és mtsai, 1996; Jibard és mtsai, 1999), ami azzal is magyarázható, hogy rejtett, vagy maga lefed egy erősebb nukleáris elhelyezkedést segítő szignált. A hőkezelés hatására a Hsp90 sejtmagi transzlokációja figyelhető meg (Akner és mtsai, 1992). Mivel a hőkezelés megnyithatja a töltött régió és a középső domén között kialakított hipotetikus kölcsönhatást, ez újabb támpontot nyújthat modellünk létjogosultságára (2.6.2.3. ábra). Az is elképzelhető, hogy a kazein kináz II általi foszforiláció stabilizálja az ionos kölcsönhatást, és a Hsp90 kikerül a sejtmagból. A kalcineurin ellentétes hatása pedig sejtmagi transzlokációhoz vezet. Így a két enzim aktivitásának aránya és kompartmentalizációja szabályozhatja a Hsp90 intracelluláris elhelyezkedését és egyéb biológiai funkcióit. A modell bizonyítása és a kazein kináz
29
II/kalcineurin hatása a Hsp90 sejtmagi transzlokációjára és működésére további kísérletek tárgyát képezheti. 2.6.3. A középső és a C-terminális domén
Mutáns DNATP DNATP D223-277 D226-287 D338-372 D381-441 D521-540 D558-572 D548-567 D602-621 D601-620 D661-677 DMEEVD 1-704 1-698 1-672
Faj élesztő humán élesztő csirke élesztő csirke csirke élesztő csirke élesztő csirke csirke élesztő élesztő csirke élesztő
Dimerizáció
Letalitás
Egyéb
+ + + + + + + + + +
p23p23-
dimer dimer/aggregátum dimer monomer dimer dimer
monomer
ÖR+ ÖRÖRÖRÖRÖR+
ÖR-
Hivatkozás Panaretou és mtsai, 1998 Obermann és mtsai, 1998 Louvion és mtsai, 1996 Meng és mtsai, 1996 Louvion és mtsai, 1996 Meng és mtsai, 1996 Meng és mtsai, 1996 Louvion és mtsai, 1996 Meng és mtsai, 1996 Louvion és mtsai, 1996 Meng és mtsai, 1996 Meng és mtsai, 1996 Louvion és mtsai, 1996 Louvion és mtsai, 1996 Meng és mtsai, 1996 Louvion és mtsai, 1996
2.6.3. táblázat A Hsp90 deléciós mutánsainak tulajdonságai p23: p23 kölcsönhatás, ÖR: ösztrogén receptor kölcsönhatás
A két domént kiterjedt fizikai és funkcionális kölcsönhatásaik miatt érdemes egyben tárgyalni, annál is inkább, mert a középső doménről (300-614. as) viszonylag keveset tudunk. A két doménnek sem a szerkezete, sem a működése részleteiben nem ismert. A dimerizációban és az ATPáz aktivitásban játszott szerepet már korábban tárgyaltam, nem beszéltem viszont az eukarióta Hsp90-ek által begyűjtött szekvencia feleslegről, melyek jelentős része életfontosságú (2.6.3. táblázat), és nagyon hasonlít a növényi Hsp90 fehérjékre, ami jelentős és univerzális feladatra enged következtetni. A táblázatból az is kiolvasható, hogy az esszenciális funkció és az in vitro dimerizáció között nincs egyértelmű megfeleltetés (Meng és mtsai, 1996; Jibard és mtsai, 1999), persze nem zárható ki olyan fehérjék léte, melyek a Hsp90-et keresztbe tudják kötni. Pl. a Sti1/Hop (Hsp organizing protein) maga is dimer fehérje, és 1:1 arányban köt a Hsp90-dimer C-terminálisához (Prodromou és mtsai, 1999).
30
Felettébb érdekes, hogy a korábban tárgyalt töltött régió mellett a C-terminális MEEVD szekvencia hiánya is összeegyeztethető az élettel. A pentapeptid jelenléte szükséges és elégséges
a
Hop
fehérje
TPR
(tetratrico-peptide
repeat)
doménjével
kialakított
kölcsönhatáshoz, (Chen és mtsai, 1998; Schleufer és mtsai, 2000). A kölcsönhatás specificitását/erősségét a C-terminális domén néhány aminosava befolyásolja (Ramsey és mtsai, 2000). Mivel az élesztő Hop nem esszenciális fehérje (Chang és mtsai, 1997), csak sebességnövelő tényező a luciferáz (Johnson és mtsai, 2000) és a glukokortikoid receptor (Morishima és mtsai, 2000), sőt a v-src kináz (Chang és mtsai, 1997) betekeréséhez, érthető, hogy a kölcsönhatás hiánya nem jár komoly következményekkel. Ugyanakkor a Hop részvétele elengedhetetlen a progeszteron receptor betekeredéséhez, amely a legösszetettebb chaperon-mediálta folyamat (Chen S. és mtsai, 1996; Kosano és mtsai, 1998), de a nemi jellegek működésének zavara az önfenntartással – különösen az egysejtű élesztőével – összeegyeztethető. A Hsp90 működése feltehetően a redox-homeosztázissal is összefüggésbe hozható. Mind ő maga, mind a belőle származó két cisztein tartalmú peptid redukálja a citokróm c-t (Nardai és mtsai, 2000). A peptidek a második savas régió területén/végén találhatóak, a ciszteinek diszulfid-képző potenciálja meglehetősen nagy. Ennek ellenére a Hsp90 fehérje diszulfid izomeráz aktivitással nem rendelkezik. Oxidált glutation gátolja a Hsp90 passzív chaperon aktivitását (Nardai és mtsai, 2000), az SH-csoportok blokkolása a Hsp90-függő DNS-kötést függeszti fel (Schnaider, 2000). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a ciszteinek fontos szerepet játszhatnak a Hsp90 in vivo működésében.
2.7. A Hsp90 által kialakított kölcsönhatások A Hsp90 működésének velejárója a sokféle molekulával kialakított dinamikus kölcsönhatások rendszere. Szubsztrát fehérjéivel, kochaperonjaival, a sejt vázfehérjéivel, és feltételezhetően membránokkal, nukleinsavakkal is kölcsönhatásba lép. A működést a fehérjének kismolekulákkal és saját magával kialakított kölcsönhatásai szabályozzák. A Hsp90-vázfehérje kölcsönhatást ld. Csermely és mtsai (1998) dolgozatában. A membránokkal kialakított
kölcsönhatásokról
nincsenek
adatok.
A
Hsp90
kismolekulákkal,
makromolekulákkal és önmagával létrehozott kölcsönhatásait a következőkben próbálom rendszerbe foglalni.
31
2.7.1. A Hsp90 kölcsönhatásai kismolekulákkal 2.7.1.1. A középső-C-terminális domén kötőhelyei
Ligand
Hivatkozás
Kötőhely a Hsp90-en N
C gP
ADP/ATP (N-term.)
Prodromou és mtsai, 1997
Geldanamycin
Stebbins és mtsai, 1997
Taxol triP
ATP/ADP (C-term.)
Marcu és mtsai, 2000/b
Novobiocin
Marcu és mtsai, 2000/b
Molibdát
Hartson és mtsai, 1999
Ciszplatin
Itoh és mtsai, 1999
Deoxyspergualin 0
200
400
600
732
2.7.1.1. ábra A Hsp90 ligandkötőhelyei Az általunk meghatározott vagy prediktált kötőhelyeket fehér keretekkel jelöltem.
A 2.7.1.1. ábrán összegzem a Hsp90 ismert kismolekulákat kötő szakaszait. A GHKLfehérjék középső doménje köti meg az N-terminális ATP g-foszfátját (Dutta és Inouye, 2000), feltehető, hogy a Hsp90 is analóg módon működik (ld. Eredmények). Molibdát a Hsp90 heterokomplexeinek stabilizátora és a Hsp90 chaperon ciklusának befagyasztója (Nishigori és Toft, 1980; Hutchinson és mtsai, 1992; Hartson és mtsai, 1999). Pontos kötőhelye ismeretlen, de megvédi a 614. aminosav körüli régiót a triptikus hasítástól (Hartson és mtsai, 1999). A ciszplatin kemoterápiás szer (Jamieson és Lippard, 1999; Jorda és Carmo-Fonseca, 2000), de specifikusan köt a Hsp90 C-terminálisához (valamint a töltött régióhoz), és gátolja passzív chaperon aktivitását (Itoh és mtsai, 1999). A giráz gátlószer novobiocin nem köt a Hsp90 N-terminális doménjéhez, mégis gátolja a Hsp90 működését és geldanamycin kötését (Marcu és mtsai, 2001/a). Kötésében a 664-680. aminosavak (is) részt vesznek sőt, ennek a régiónak a deléciója vagy a szintetikus peptid meggátolja a C-terminális domén ATP-Sepharose-kötését is (Marcu és mtsai, 2000/b). Ez felveti, hogy a C-terminálison egy második ATP-kötőhely található, amelyet korábbi 32
kísérleteink lehetséges konklúziójaként megfogalmaztunk (Sőti és Csermely, 1998/a, Csermely és mtsai, 1998). A Hsp90 középső doménje rendkívül gyenge Walker-típusú ATP-kötő motívumokat (Csermely és Kahn, 1991), valamint egy feltételezett Rossmann-kötőhelyet (541633, Callebaut és mtsai, 1994; Garnier és mtsai, 2002) tartalmaz. Ezzel együtt az egyetlen bizonyítható ATP-kötésben részt vevő szegmentum a 664-680. A feltételezett ATP-kötő motívumok közül egyedül a 664-680-as régió nem esszenciális (2.6.3. táblázat), viszont szükséges a progeszteron receptor betekeredéséhez és a foldoszóma összes ko-chaperonjának (Hop, FKBP51/52, Cyp40, sőt p23) megkötéséhez (Chen és mtsai, 1998). A defektus adódhat abból is, hogy ez a mutáns dimerizációra képtelen, ugyanakkor in vivo kölcsönhatásba lép az ösztrogén (Meng és mtsai, 1996) és a glukokortikoid receptorral (Jibard és mtsai, 1999). A 650-697. aminosavak közötti régió szükséges a hélix-hurok-hélix transzkripciós faktor MyoD és E12 ATP-függő aktivációjához (Shue és Kohtz, 1994). A 664680-as régió hiánya teljesen gátolja a Hsp90 ATPáz aktivitását, megjegyzendő, hogy más monomerizációt okozó mutációk akár serkenthetik is az ATPázt (Owen és mtsai, 2002). Ez a régió – inkább allosztérikusan, mint közvetlenül (vö. szteroid receptorok kötése) – fontos szerepet játszik a Hsp90 egyéb (kliens)fehérjékhez és az aktinhoz történő kapcsolódásában, mert az ezt a régiót felismerő AC88 antitest csak a szabad Hsp90-et ismeri fel (Hartson és mtsai, 1999), és gátolja a Hsp90-aktin kölcsönhatást (Kellermayer és Csermely, 1995). Tehát – csakúgy, mint a Hop esetén – az egyetlen sejt számára nélkülözhető funkció a többsejtű, neuroendokrin rendszerrel rendelkező egyedben fontossá válhat. A Hsp70 és a Hsp90 egyaránt képes a 15-deoxysprergualin kötésére. A 15deoxyspergualin citosztatikus, erősen immunszuppresszív peptidomimetikus antibiotikum származék, mindkettőhöz mikromólos affinitással köt (Nadeau és mtsai, 1994). A Hsp70 deoxyspergualin-kötése ATP-vel megbontható, a szer a Hsp70 ATPáz aktivitását 60%-kal fokozza. A deoxyspergualint nem az N-terminális ATP-kötő domén, hanem a C-terminális legvégén található (TPR-domén fehérjék kötéséért felelős) EEVD motívum köti (Nadler és mtsai, 1998), feltételezhetően a Hsp90-hez is a C-terminális EEVD motívumon keresztül köt. Mind a Hsp90 ATP-kötésére és ATPáz aktivitására, mind a chaperon komplex valamely működésére gyakorolt hatás egyelőre tisztázatlan.
33
2.7.1.2. Taxol kötés az N-terminálison A Hsp90 és a Hsp70 a Taxol specifikus kötéséért is verseng (Byrd és mtsai, 1999). A Taxol egyébként a tubulin-oligomer N-terminális GTP-kötő doménjéhez köt, a tubulusokat GTP hiányában is stabilizálja, bár a GTP kötést nem gátolja (Amos és Lowe, 1999). A mikrotubuláris dinamika korlátozása a sejtmozgásokat, főképp a sejtosztódást gátolja, a Taxol széles körben használatos daganatellenes szer (Cragg, 1998). Taxol kezelés hatására a makrofágok geldanamycin-érzékenyen aktiválódnak, ugyanakkor geldanamycin nem gátolja a Taxol-indukálta tubulin kötegelődést (Byrd és mtsai, 1999). Rácz Attila gondos keresés eredményeképpen a Hsp90-ben a tubulin Taxolkötő motívumaival homológ szekvenciákat talált (2.7.1.2. ábra). A feltételezhető kötőhely igazolása folyamatban van.
sertés tubulinb: humán Hsp90a: patkány Hsp90b: élesztő Hsp82: paradicsom Hsc80: rizs Hsp82: humán Grp94: egér Grp94: 2.7.1.2. ábra
20
226
282
160
288
336
FWE AWE 155 AWE 147 IWE 148 VWE 149 VWE 222 IWE 222 IWE
ELN ELN 280 ELN 269 ELN 260 LVN 262 LVN 335 LMN 335 LMN
FRS FRA 328 FRA 317 FRA 308 FKA 310 FKA 383 FKS 383 FKS
A Hsp90-család lehetséges Taxolkötő motívumai
2.7.2. A Hsp90 kölcsönhatásai makromolekulákkal 2.7.2.1. Az N-terminális domén Az N-terminális domén helyet ad egy aspecifikus szubsztrátkötőhelynek (Young és mtsai, 1997; Scheibel és mtsai, 1998), szükséges, de nem elégséges p23 kötéséhez (Chen és mtsai, 1998; Chadli és mtsai, 2000), és jelenléte szükséges és elégséges feltétele az ösztrogén receptor megkötésének in vitro, bár a töltött régió jelenléte a kötést erősíti (BouhoucheChatelier és mtsai, 2001). 2.7.2.2. A töltött régió A töltött régió szerepet játszik a Hsp90 N-és C-terminális doménjeinek összehangolt működését igénylő folyamatokban, de feltételezhető fehérje kötőhelyet is kínál. Erre utalnak
34
azok a kísérleteink, melyekben kimutattuk, hogy a Hsp90 előszeretettel köt hidrofób és pozitívan töltött fehérjékhez (Csermely és mtsai, 1997). Johnson és mtsai (2000) kísérleteiben a 206-449 fragmentum gátolta a citrát szintáz aggregációját, míg a Hsp90 töltött régió nélküli középső doménje (272-617. as) nem mutatott chaperon aktivitást (Young és mtsai, 1997; Minami és mtsai, 2001). Gyanítható, hogy a töltött régió a Hsp90 harmadik chaperon helye, amelyet vizsgáló kísérleteink folyamatban vannak. Ichiro Yahara laboratóriumának eredményei szerint a töltött régió részt vesz a kazein-kináz II-vel (Miyata és Yahara, 1995) és a kalcineurinnal kialakított specifikus fehérje-fehérje kapcsolatban, továbbá a neuropeptid Y kötésében (Ichiro Yahara, személyes közlés). Mindez várható annak ismeretében, hogy a KEKE-motívumok általános kötőfelszínek lehetnek, szerepet játszhatnak a proteaszómaHsp90 kölcsönhatásban és az antigén peptidek bemutatásában (Realini és mtsai, 1994). Binart és mtsai (1989) szerint a töltött régió szerkezete a DNS hélixéhez hasonlít, amely kölcsönhatásba léphet a szteroid receptor DNS-kötő doménjével. A kölcsönhatás a receptor típusától függ. A progeszteron receptor kötésében nem játszik szerepet, míg az ösztrogén/glukokortikoid receptor Hsp90 kölcsönhatást erősíti (Bouhouche-Chatelier és mtsai, 2001). Teszi ezt oly módon, hogy a receptor DNS-kötő régióját lefedi, így a sejtben kifejezett 35 aminosavas szubrégiója glukokortikoid antagonistaként viselkedett (Dao-Phan és mtsai, 1997). 2.7.2.3. A középső-C-terminális domén A
Hsp90
középső-C-terminális
doménjén
feltehetően
több,
fehérje-fehérje
kölcsönhatások kialakítására alkalmas kötőhely található. Nem véletlen, hogy az N- és a középső-C-terminálist élesztőben kifejezve, az előzőhöz egy fehérje sem kötött, az utóbbival a p23 kivételével az összes segítő és a szubsztrát fehérje kölcsönhatásba lépett, bár egyik domén sem volt képes betekerni a klienst (Scheibel és mtsai, 1999/b). A glukokortikoid receptor kötéséhez nélkülözhetetlen a 449-584. aminosavak közötti szubdomén, amely felöleli a második töltött régiót (Jibard és mtsai, 1999). A 614. aminosavtól kezdődő C-terminális doménen pedig egy újabb, ATP- és geldanamycin-érzéketlen chaperon hely található (Young és mtsai, 1997; Scheibel és mtsai, 1998), amely struktúráltabb („olvadt gombóc” v. „laza gombolyag”) állapotú fehérjéket és peptideket köt. A kötőhely átfed a TPR-domén kötőhellyel és a dimerizácós régióval. A C-terminális doménen található a Hsp90 „hidrofób régiója”, mely a fehérje fenil-Sepharose kötését közvetíti (Yamamoto és mtsai, 1991; Grenert és mtsai, 1999). A kötés hidegsokk, hősokk és pH-csökkenés hatására erősödik. Az N-terminális domén
35
nukleotid állapota kapcsoló módjára képes a fenil-Sepharose- és Hop-kötést befolyásolni. Nukleotid hiányában vagy ADP jelenlétében a fehérje azonos konformációban található (Sullivan és mtsai, 1997; saját nem közölt eredmények). Ekkor nagy affinitással köti a gyantát és a Hop fehérjét. ATP hatására a kötőerő csökken, ezt a hatást a p23 jelenléte fokozza (Johnson és mtsai, 1998; Grenert és mtsai, 1999). A konformáció-változásnak nagy szerepe van a Hsp90-függő kliensek érésében. Nem tudni, hogy a C-terminális domén konformációját maga az N-terminális domén, vagy az N-terminális domén által a C-terminális nukleotidkötőhelyre gyakorolt allosztérikus hatás szabályozza. Az sem ismert, hogy a Hop és a fenilSepharose kötőhelye között van-e valami átfedés, az utóbbiról annyit tudunk, hogy nem az Nterminális doménen található (Grenert és mtsai, 1999).
Fehérje C-terminális komplex TPR-fehérjék p60/Hop/Sti1 (Cns1) Cyp40/Cpr6 (Cpr7) FKBP51/52 CHIP protein foszfatáz 5/Ppt1 Nem TPR-fehérjék p50/cdc37 Hsp70/Ssa1 Hsp40/Ydj1 Ismeretlen szerkezetű-fehérjék *14-3-3 N-terminális komplex p23/Sba1 Aha-1/Hch1
Funkcionális domén
Chaperon?
Szerep
TPR TPR, PPI TPR, PPI U-szakasz TPR, Ser-foszfatáz/PPI
nem igen igen ? ?
Hsp70/90 összehozás Hop lecserélés receptor transzport kliens lebontás ? (foszforiláció-ciklus?)
? ATPáz, peptidkötő J (peptidkötő)
nem igen igen
kinázok chaperonja szubsztrát előkészítés szubsztrát elsőként kötése
14-3-3, TPR-szerű
?
PGE2 szintáz ?
igen ?
Raf nukleotid cserélő Hsp90-szubsztrát stabilizálás komplex disszociáció?
2.7.2.3. táblázat A Hsp90 kochaperonjai Dőlt betűvel az élesztő homológokat, zárójelben az élesztő egyéb homológjait adtam meg. *A 14-3-3 dimer Hsp90 komplexét sem nekünk, sem másoknak nem sikerült kimutatni, de szerkezete erősen emlékeztet a TPR-doménre (Taylor és mtsai, 2001) Irodalom: Buchner, 1999; Caplan, 1999; Neckers és mtsai, 1999; Pearl és Prodromou, 2000 (Hch1); Schnaider, 2000; Nathan és mtsai, 1999 (Cns1, Hch1); Tzivion és mtsai, 1998 (14-3-3)
A C-terminális domén számos TPR-tartalmú és TPR-mentes ko-chaperon kötésére képes (2.7.2.3. táblázat). A Hsp90 dimeren két TPR-kötőhely található. A TPR-fehérjék kötése (beleértve a p50-et is) kölcsönösen kizárja egymást (Silverstein és mtsai, 1998). Idáig csak szimmetrikus komplexeket sikerült izolálni, kivéve a Cpr7-Cns1-Hsp90 komplexet (Dolinski és mtsai, 1998; Marsh és mtsai, 1998). A Cpr7 abban is különbözik a Cpr6 homológjától, hogy 36
deléciója hátráltatja az élesztő sejtek növekedését, amit Cpr6 túltermelés sem ellensúlyoz. A biológiai hatást a PPI domént nélkülöző TPR-domén is kiváltja (Dolinski és mtsai, 1998; Marsh és mtsai, 1998). A Hsp90 komplexek két egymást kizáró TPR-fehérjéjének kötését Prodromou és mtsai (1999) élesztőn vizsgálták, és azt tapasztalták, hogy a Sti1 és a Cpr6 azonos affinitású, de hatásuk számos tekintetben ellentétes egymással. A Sti1 dimer, a Cpr6 monomer (ami magyarázza egymás kölcsönös kiszorítását). A Sti1 fehérje kisebb affinitással köt az N-terminálist nem tartalmazó Hsp90 mutánshoz, a Cpr6 kötését ez nem befolyásolja. A Sti1 kötése az N-terminális konformációját megváltoztatja, meggátolja az ATP kötését és hidrolízisét, a Cpr6-é nem. Feltehetően az eltérő tulajdonságok teszik képessé a két fehérjét, hogy a Hsp90 chaperon ciklusának különböző fázisaiban asszisztáljanak. Schnaider Tamás kísérletei nyomán elképzelhető, hogy a Hsp90 vagy direktben, vagy egy fehérje komplex részeként képes nukleinsavak kötésére (ld. Schnaider, 2000). A kötés az LKVIRK antitesttel gátolható volt, ami a középső (g-foszfát-kötő) régió részvételére utalhat. A DNS-kötés jelentősége ismeretlen, a Hsp90 ATP-kötését nem befolyásolja (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). 2.7.3. A Hsp90 oligomerizációja, avagy kölcsönhatások önmagával 2.7.3.1. A Hsp90 oligomerek előfordulása A tisztított Hsp90 elsősorban homodimereket alkot, a b izoforma pedig hajlamos a monomerizációra, amit a C-terminális dimerizációs domén különbözőségével indokolnak (Minami és mtsai, 1991; Nemoto és mtsai, 1995). Mindazonáltal több kutatócsoport megfigyelte, hogy sejtlizátumban a Hsp90 általában nagy molekulatömegű komplexek része (Freitag és mtsai, 1997; Nemoto és Sato, 1998; saját nem közölt megfigyelés). A sejt vagy sejtlizátum hősokkolása fokozza az oligomerizációt (Lanks, 1989; Yonehara és mtsai, 1996). A tisztított Hsp90 natív gél elektroforézise során változó arányú oligomereket figyelhetünk meg (Minami és mtsai, 1991; saját nem közölt megfigyelés). Stabil oligomerek hőkezelés (Lanks, 1989; Minami és mtsai, 1993; Yonehara és mtsai, 1996; Csermely és mtsai, 1998; Chadli és mtsai, 1999), detergensek (Lanks, 1989; Csermely és mtsai, 1998) divalens kationok (Jakob és mtsai, 1995/b; Csermely és mtsai, 1998) és a kalmodulin kötő a-peptid (Minami és mtsai, 1993) hatására alakulnak ki. Minél magasabbrendű szervezetből származik a Hsp90, oligomerizációs hőmérséklete annál alacsonyabb (Jakob és mtsai, 1995/b; Nemoto és mtsai, 2001/b), amely összefügg a passzív chaperon aktivitás megjelenésével (Yonehara és mtsai,
37
1996; Nemoto és mtsai, 2001/b). A hő-indukált oligomerizációt divalens kationok, molibdát és vanadát, illetve denaturált szubsztrátfehérje potencírozzák (Jakob és mtsai, 1995/b; Garnier és mtsai, 1998; Chadli és mtsai, 1999; Nemoto és mtsai, 2001/b), geldanamycin és ATP gátolja (Chadli és mtsai, 1999). Érdemes megjegyezni, hogy a szerzők nem használtak ATPregenerációs rendszert, és a kísérlet időtartama alatt képződött ADP kiszoríthatta az ATP-t az N-terminális
kötőhelyről.
ATP
gátolja
a
divalens
kationnal
kiváltott
oligomerizációt/aggregációt is (Garnier és mtsai, 2002). 2.7.3.2. Az oligomerizáció szerkezeti alapjai Az oligomerizáció összefüggésben állhat a (C-terminális) hidrofób régió fokozott expozíciójával (Yamamoto és mtsai, 1991; Grenert és mtsai, 1999). Ugyanakkor differenciált pásztázó
kalorimetriás
(DSC)
kísérletek
arra
engednek
következteteni,
hogy
az
oligomerizációs hőmérséklet egybeesik az N-terminális domén olvadáspontjával (Garnier és mtsai, 1998). Kis Hsp90 koncentrációnal az N-terminális domének intramolekulárisan (a dimeren belül) kapcsolódnak össze, nagy koncentrációnál illetőleg in vivo pedig vagy intermolekulárisan, vagy szubsztrát fehérjékkel tehetik ugyanezt (Maruya és mtsai, 1999). A specifikus ligandumok (nukleotid, geldanamycin) stabilizálhatják az N-terminális domént, ezért képesek gátolni az oligomerizációt. Elképzelhető, hogy először az N-terminális domén és a középső domén közötti kölcsönhatás szakad fel (Nemoto és mtsai, 2001/a, Tanaka és mtsai, 2001), amely destabilizálja az N-terminális domént. E mellett szól az is, hogy a feltételezhető C-terminális ligandumok (molibdát, vanadát, a-peptid) elősegítik az oligomerizációt. A divalens kationok mind az N- mind a C-terminális domén aggregációját elősegítik. A magnézium-indukálta oligomerizációt az N-terminális geldanamycin/ATP nem védi ki, a Cterminálison kötött ATP viszont gátolja (Garnier és mtsai, 2002). Tehát az oligomerizáció a Hsp90 mindkét doménjének jellemzője, és csakúgy, mint a Hsp90 egyéb tulajdonságaiban, itt is a két domén rendkívül bonyolult kommunikációja határozza meg az eredő választ. Az oligomerizáció a Hsp90 egyéb tulajdonságait, így az ATP-kötést és a chaperon aktivitást szabályozhatja. 2.7.3.3. A Hsp90 elektronmikroszkópos képe – ahogy én láttam 1996-ban a baseli Biozentrumban, Ueli Aebi professzor laboratóriumában jártam. Az együttműködés
célja
az
volt,
hogy
molekuláris
elektronmikroszkópia
segítségével
tanulmányozzuk az ATP Hsp90-re gyakorolt hatását. Ekkor már régóta ismert volt Ichiro 38
Yahara munkacsoportjának a Hsp90 és a Grp94 alacsonyszögű árnyékolással (low-angle rotary shadowing) készített molekuláris elektronmikroszkópos „portréja” (Koyasu és mtsai, 1986). Ennél a technikánál a fehérjét nagy töménységű glicerinoldatba helyezik, majd ráfújják egy csillámlemezre (glycerol spray). A lemezt ezután 6°-os szögben vákuumban forgatva platinával és szénnel árnyékolják, majd a készült profilt (replikát) átúsztatják egy elektronmikroszkópos rácsra. Az elektronmikroszkópos kép a nagy elektronszóró képességnek köszönhetően szép, kontrasztos, részletes, a világos háttéren a fehérje feketén tűnik fel.. Kísérleteink elején örömmel tapasztaltuk, hogy a 95%-os tisztaságú patkány máj Hsp90 (nagyrészt b) árnyékolt replikája a japán csoport által publikált struktúrát mutatja: trinoduláris, elongált alakú dimer (2.7.3.3.A ábra). A technikus javaslatára a mintákat megvizsgáltuk egy másik eljárással, negatív festéssel. Ennél a leképezési módnál a fehérje oldatot egy töltésmentesített (glow-discharged) rácsra visszük fel, egy-két percig inkubáljuk, majd a sót desztillált vízzel lemossuk, mert ez rontja a kép minőségét. Az uranil-formiátba mártott rácsot szobahőn szárítjuk, majd elektronmikroszkóppal vizsgáljuk, ahol a fehérje nem köti meg a nehézfémet, ezért a sötétebb háttéren világos (negatív) képet kapunk. Legnagyobb meglepetésünkre a negatív festéssel kapott kép alapvetően különbözött az árnyékolt replikától: fánk alakú, alapjukkal összetapadó oligomer struktúrákat láttunk (2.7.3.3.B ábra).
A
B
2.7.3.3. ábra A Hsp90 elektronmikroszkópos képe A, glicerin-spray, alacsonyszögű forgatásos árnyékolás. A nyíl oligomert jelöl; B, negatív festés
Az ATP-hatás tanulmányozása helyett hozzáfogtunk a különbség okának szisztematikus felderítéséhez. Az alacsonyszögű árnyékolás előtt a mintát különféle módokon kezeltük (glicerin nélkül, puffert váltva, nem permetezve, hanem centrifugálva), és azt a következtetést vontuk le, hogy részben az alkalmazott alacsony fehérje koncentráció, részben a glicerin
39
(szerkezet stabilizáló) hatása következtében a Hsp90 oligomerek dimerekre disszociálnak (nem bemutatott adatok). Az is megfigyelhető volt, hogy a fánkszerű struktúra elvétve a replikákon is látható (ld. 2.7.3.3.A ábra, nyíl). Míg az árnyékolásnál számtalan lépés segítheti elő a disszociációt, illetve a dimer forma szelektív adszorpcióját és leképezését, a negatív festésnél pont ellentétes a helyzet. Ezt a technikát egyébként is oligomer struktúrák megfigyelésére alkalmazzák, mert az alacsonyabb affinitású intermolekuláris kölcsönhatások jobban megőrződnek. Azonban az alacsony sókoncentráció, a hirtelen pH-változás műtermékek megjelenését, a csillámtól eltérő felszín eltérő adszorpciós képessége egy relatíve kis mennyiségben előforduló másféle speciesz feldúsulását eredményezheti. Ugyan a mintaelőkészítések során csak illékony pufferrel dogoztunk, mégis elképzelhető, hogy a glicerin-spray módszernél nem lemosott illékony puffer sókoncentrációja
hatással
van
a
Hsp90 elektronmikroszkópos
képére.
A
Hsp104
oligomerziációja szintén erősen füg az ionerősségtől (Schirmer és mtsai, 1998; 2001). A pH 4,25-ös uranil-formiát helyett pH 6,9-es foszfowolframáttal festett minták kontrasztja gyengébb volt, de a kép minősége szintén nem változott, azaz nem egy pH-függő oligomerizációval álltunk szemben (nem bemutatott adatok). 2.7.3.4. A fánkok a natív Hsp90 homo-oligomerjei A szelektív adszorpció révén elméletileg egy szennyező fehérje is megjelenhet oligomer Hsp90-ként. Ennek vizsgálatára a mintát az AC88 monoklonális, kereskedelmi forgalomból (StressGen, SPA-830) származó antitesttel inkubáltuk, amely csak a szabad Hsp90-et ismeri fel (Hartson és mtsai, 1999), így kizárható, hogy a felismert fehérje a Hsp90 hetero-oligomerje. Az elektronmikroszkópos képen mind a dimer, mind az oligomer fehérjék anti-Hsp90 immunoreaktívnak bizonyultak (nem bemutatott adatok). További független bizonyítékkal szolgáltak azok a kísérletek, melyben az Ichiro Yahara laboratóriumából származó tisztított patkány Hsp90 és az E. coli-ban kifejezett humán Hsp90a elektronmikroszkópos képe megkülönböztethetetlen volt a mi fehérjénkétől – annak ellenére, hogy a gélképen ezüstfestéssel látott szennyeződés eltérő jellegű volt a három minta esetén (nem bemutatott adatok). A Hsp90 az izolálás kezdeti lépéseiben együtt tisztul több oligomer fehérjével, pl. a proteaszómával és PA28 nevű aktivátorával, illetve a p97 nevű vezikuláris fúzióban szerepet játszó (NSF-szerű) fehérjével (Montel és mtsai, 1999; Schnaider T., Sőti Cs., Csermely P, nem közölt megfigyelések). Ugyan az általunk alkalmazott tisztítási mód elválasztja a proteaszómát a Hsp90-től, 97 kDa körül pedig nincs szennyeződés (Schnaider T., Sőti Cs., Csermely P., nem 40
közölt eredmények), egyéb fehérje 1-2%-os jelenléte nem kizárható. Hogy végképp meggyőződjünk, nem valamilyen szennyező faktort vagy annak a Hsp90-re gyakorolt hatását látjuk, egy adag Hsp90-et HPLC-gélszűréssel a Pharmacia mikropreparatív SMART berendezésén megtisztítottunk. A Hsp90(b) az oszlopról a monomerre jellemzős retenciós idővel eluálódott (amit okozhatott a nagy nyomás és a hígulás), az elektronmikroszkóban a szokott fánkjainkat láttuk viszont, bár a fehérje egy része aggregátumokat képezett (nem bemutatott adat).
A C
B D
E
2.7.3.4. ábra A Hsp90 specifikus oligomer struktúrája HPLC-gélszűréssel tisztított Hsp90 speciális elektronmikroszkópos leképezése. A, negatív festés pozitívan töltött rácson. A nyíl az oldalukkal a rácshoz kötő molekulák mellett egy felülnézetből ábrázolódó molekulát jelöl; B, mosás, festés nélküli in situ árnyékolás a rácson; C, aB-krisztallin, D, GroEL, E, proteaszóma elektronmikroszkópos képe (negatív festés)
Lévén a mintában többé az ezüstfestés sem „látott” semmilyen szennyeződést, egyetlen lehetőség maradt: az oligomer forma szelektív adszorpciója eredményezi a fánkok feldúsulását. Ezt az eshetőséget az akkori körülmények között két módon vizsgálhattuk. Először pozitívan töltött rácsra vittük fel a mintát. A fánkokat szintén viszontláttuk, de érdekes módon most az oldalukkal tapadtak a felülethez, ami arra utal, hogy az oligomerek oldala negatívan töltött (2.7.3.4.A ábra). A másik kísérletben a rácsra felvitt mintát egyéb beavatkozás nélkül in situ árnyékoltuk, így a szelektív adszorpción túl arról is felvilágosítást kaptunk, vajon nem az urán, mint nehézfém denaturálja ilyen érdekesen a Hsp90-et (chaperonoknál sosem lehet tudni!). Az elektronmikroszkópos képen ismét gyönyörű fánkok
41
jelentek meg (2.7.3.4.B ábra), nagyban megerősítve azt az elképzelésünket, hogy a Hsp90 natív negyedleges szerkezete oligomer. Bár a kéthetes kinttartózkodás elejét vette a kvantitatív háromdimenziós képrekonstrukciónak, a Hsp90 elektronmikroszkópos képét hasonló körülmények között más oligomer fehérjékről készített képekkel vetettük össze (2.7.3.4.C, D, E ábra). Világosan látszott, hogy a 90 kDa-os fehérje, a hetero-oligomer proteaszóma és a nem szimmetrikus aB-krisztallin struktúrája nem téveszthető össze. A GroEL szerkezet már kissé jobban emlékeztetett a mi fehérjénkére, de a mi fehérjénk nem mutatott hétszeres szimmetriát, nem feltétlenül két gyűrűből, hanem néha jóval többől állt össze, végül a mi mintánk ritkán adszorbeálódott az oldalánál, inkább felülnézetből láthattuk. 2.7.3.5. Az oligomerek vizsgálata egyéb módszerekkel Kintlétem ideje alatt natív és keresztkötést követő SDS-gélen is tanulmányoztam a Hsp90 negyedleges szerkezetét, hogy független módszerrel győződjem meg eredményeink megbízhatóságáról. A natív gélen az addig itthon tapasztaltakkal egyetértésben mindig jelen voltak oktamerek, és olyan oligomerek, melyek nem hatoltak be az elválasztó gélbe, de nem aggregátumok voltak, mert a tömörítő gélen „átverekedték” magukat. Emellett az oligomerdimer-monomer diszkrét csíkok között a gélen szinte mindig elmosódott, folytonos festődést tapasztaltunk, amely a fehérje elektroforézis közbeni disszociációjára utalt. A keresztkötés a kipróbált tízféle ágens természetétől, hatékonyságától, reaktivitásától (amin, szulfhidril, karboxil) és karjának hosszától függően eltérő és nem abszolút érvényű eredményeket adott, ahol rendszert nem sikerült felfedeznem. Hazajövetelem után glutáraldehiddel ismert negyedleges szerkezetű fehérjéket (GroEL 14mer, albumin (monomer-dimer-trimer), piruvát kináz (tetramer) kötöttem keresztbe, és annál a glutáraldehid koncentrációnal és időnél, ahol megkaptam az ismert formákat, keresztkötöttem a Hsp90-et. Sajnos a különböző fehérjék eltérő körülmények között adták a jellemző negyedleges szerkezetet, így a Hsp90-ről a monomertől az oligomerig minden negyedleges szerkezeti variáns elmondható volna (nem bemutatott adatok). A kudarcot vallott keresztkötés után dr. Szilágyi László laboratóriumában FPLC-gélszűréssel próbálkoztunk. A Hsp90 az irodalmi adatoknak megfelelően elongált dimerként eluálódott (nem bemutatott adatok). Nemoto és Sato (1998) tanulmánya ez idáig az egyetlen, mely szisztematikus kísérletsorozattal igazolta, hogy a Hsp90 in vivo és in vitro oligomert is képez, és az
42
oligomerizációért a C-terminális dimerizációs domén a felelős. A glicerin-grádiens centrifugálással vizsgált a izoforma citoszolban oligomer, dimer és monomer, tisztítva elsősorban dimer és oligomer formában ülepedett, a frakciókat natív gélen megfuttatva a dimer foma dominált. A b izoforma kizárólag oligomer formában ülepedett, natív gélen viszont minden frakcióban kizárólag monomert és dimert lehetett látni. A szerzők kétdimenziós natív gél elektroforézissel bizonyították, hogy az oligomerek és a dimerek az elektroforézis során disszociálnak. Natív géles kísérleteik egybevágnak a mieinkkel, ami azt sugallja, hogy a Hsp90 oligomer formában is előfordul, és hogy az oligomereket a dimerekénél jóval gyengébb kölcsönhatás tartja össze. A mi elektronmikroszkópos kísérleteink annyiban állítanak többet, hogy (1) a nemcsak a citoszolban, esetleg heterokomplexben található Hsp90, hanem a teljesen tiszta, biológiai aktivitását megtartott, tisztított fehérje is előfordul oligomer formában; illetve (2) a Hsp90 domináns negyedleges szerkezete feltehetően az oligomer forma. Ezt az elméletet minden kétséget kizáróan igen nehéz bizonyítani. A Hsp90 ebben a tekintetben sem hazudtolja meg önmagát: alacsony affinitású, feltehetően koncentrációfüggő oligomerizációját olyan metodikával lehet bizonyítani, mely az oldatban létező aktuális viszonyok között teszi lehetővé a negyedleges szerkezet tanulmányozását. Szegény ember vízzel főz alapon megpróbáltam kimutatni, hogy a Hsp90 statikus fényszórása a monomer tesztfehérjékétől eltérően nem lineárisan növekszik a koncentráció emelésével, sikertelenül. Megvizsgáltam, van-e disszociáció a fényszórás és a triptofán fluoreszcencia koncentráció függése között, és hogy 6 M urea jelenlétében kapott fényszórás hányad része a natív fehérje fényszórásának, ismét kecsegtető eredmény nélkül (nem bemutatott adatok). Az elektronmikroszkópos vizsgálatokkal nem egybevágó eredmények magyarázatául kínálkozik, hogy statikus fényszórással nem tudunk abszolút molekulaméretet meghatározni. Elképzelhető az is, hogy a vizsgált koncentráció-tartományban a Hsp90 már oligomer formában található. Végül nem szabad elhanyagolni a citoszol molekuláris zsúfoltságát (Ellis, 2001), mely az összes folyamatot alapjaiban változtatja meg, illetve a Hsp90 in vivo mg/ml-es koncentrációját. Ugyanezeket a körülményeket a fenti módszerekkel tovább vizsgálhatnám, döntő bizonyítékot sem a hipotézis megtartása, sem az elvetése mellett nem jelentene. Milyen kísérlettel/módszerrel
tudnánk
eredményeink
létjogosultságáról
meggyőződni?
Jelen
pillanatban igazán intelligens kísérlet hiányában csak azok a módszerek adhatnak választ, amelyekkel
közvetlenül,
oldatban,
nagy
felbontással
vizsgálhatnánk
a
Hsp90
oligomerizációját. Elméletileg szóba jön az egyensúlyi analitikai ultracentrifugálás és az
43
alacsonyszögű röntgen/neutronszórás. Tudomásom szerint Magyarországon egyik sem elérhető, és mindkét módszer hátránya, hogy vagy a részecskék eloszlását (heterogenitását), vagy az
alakját
eredményezhetnek.
modellek Alternatív
segítségével módszer
közelítik, a
melyek
mágneses
igen
nagy tévedéséket
magrezonancia
spektroszkópia
segítségével meghatározható diffúziós koefficiens, hasonló korlátokkal, nagy fehérjeigénnyel. Amennyiben a teljes Hsp90 molekulát vagy annak középső C-terminális doménjét sikerülne kristályosítanunk, egyéb kérdéseinkre (is) választ kapnánk, de nem kell messzire menni, az élesztő Hsp90 N-terminális doménje (Prodromou és mtsai, 1997/a vs. Scheibel és mtsai, 1999/a) és a p23 fehérje (Weaver és mtsai, 2000) negyedleges szerkezetének kristály- és oldatszerkezete ellentmondásos. A legcélravezetőbb közvetlen képalkotó eljárás, a krioelektronmikroszkópia segítségével véglegesen pontot tehetnénk a Hsp90 negyedleges szerkezetének problémájára. Ennek során a fehérjét tartalmazó folyadékoszlopot hirtelen hűtik le, az üveges vízben a natív szerkezet tanulmányozható. A svájci Biozentrumban már üzemel ilyen készülék, és remélhetőleg még az idén lehetőség kínálkozik a visszatérésre. 2.7.3.6. Az oligomer forma és a mikrotrabekuláris hálózat Miért lehet létjogosultsága a Hsp90 oligomer szerkezetének? Egyrészt a Hsp90 passzív hő-indukált chaperon aktivitása egybeesik a stabil oligomerek megjelenésével, a szubsztrát pedig csak az oligomerekhez köt (Yonehara és mtsai, 1996; Nemoto és mtsai, 2001/b). Ugyanakkor számtalan kísérletben bizonyították, hogy a Hsp90-nek fiziológiás hőmérsékleten is számottevő chaperon aktivitása van. Elképzelhető, hogy az itt jelentkező alacsonyabb hatásfokú chaperon aktivitás a kisebb mértékű/stabilitású oligomerek tulajdonsága, és az alacsony affinitású kölcsönhatások megintcsak átcsúsznak a hagyományos biokémiai metodikák relatíve érzéketlen szűrőjén. Ezt támogatja az is, hogy a Hsp90-et mindig nagy feleslegben és nagy koncentrációban szükséges a szubsztráthoz adni, hogy meggátolja az aggregációt. Hiába válik érzékelhetővé az oligomerizáció stressz (pl. hő) hatására, ez a Hsp90szubsztrát arány javulásában nem tükröződik, ami arra utal, hogy a funkcióért felelős oligomerek már normál körülmények között (37°C-on) is az oldatban voltak, és/vagy arra, hogy a stabil Hsp90-szubsztrát komplexek létrejötte nem az oligomerizációnak, hanem egy azzal párhuzamos konformáció-változásnak köszönhető. A Hsp90 számtalan specifikus és aspecifikus szubsztrátjaival, segítőivel, a citoszkeletális
fehérjékkel
is
viszonylagosan
alacsony
affinitású,
dinamikus
kölcsönhatásrendszert alakít ki. Témavezetőm elképzelése szerint a dajkafehérjék nagy 44
mennyiségük és a nagyszámú kölcsönhatás révén a citoplazmatikus alapállomány rendezettségének fenntartásában és a benne zajló transzportfolyamatok rendezésében játszhatnak központi szerepet (Csermely és mtsai, 1998; Csermely, 2001/a). Kezdeti kísérletekben a Hsp90 „specifikus” gátlószerei, a geldanamycin, a radicicol – de nemkevésbé a novobiocin és a ciszplatin – fokozták az enyhe detergens kezeléssel permeabilizált sejtek fehérjéinek kiáramlását (Pató és mtsai, 2001). Az elméletnek ellentmond Susan Lindquist kutatócsoportjának eredménye, miszerint élesztőben a Hsp90 szintjének 95%-os csökkentése semmilyen nyilvánvaló elváltozással nem jár (Xu és Lindquist, 1993), tehát ahhoz, hogy ezt a sejtszintű szerepet bizonyíthassuk, a fehérjekiáramlást (különböző mennyiségű Hsp90-et tartalmazó) élesztősejteken is meg kell vizsgálni. A citoplazmatikus dajkafehérje komplex specializáltabb, jelátviteli molekulák felgombolyodását, jelfeldolgozását és sejten belüli eloszlását, mozgását felügyelő (foldoszóma illetve transzportoszóma névvel illetett) működését leíró elmélet már korábban megszületett William Pratt agyában, melyet kísérletes bizonyítékokkal támasztott alá (Pratt, 1992; OwensGrillo és mtsai, 1996; Pratt, 1997; Pratt és mtsai, 1999). Az elmélet általánosításához a citoplazmatikus folyamatok túlzott rendezettségén túl két megfigyelés adott szilárd alapot. Az első a mikrotrabekuláris hálózat detektálása a citoplazma „elmozdítható” részének óvatos kimosása után (Schliwa és mtsai, 1981). A másik az a felfedezés, hogy a prokarióta (eubakteriális) és eukarióta sejt között elhelyezkedő archebaktériumok Hsp60-rendszere mikrofilamentáris struktúrát képez (Trent és mtsai, 1997), és a filamentáris chaperon fehérjevédő aktivitása csökkent (Trent és mtsai, 1998). A Hsp90 alacsony affinitású oligomer struktúrájának igazolása fizikai alapot nyújtana a térben és időben rendkívül dinamikus, sokrétű és szerteágazó folyamatok szervezőjével szemben támasztott kívánalmakra. 2.7.3.7. Stressz és oligomerizáció Akár a natív állapot dimer, akár oligomer, az oligomerizáció nagy jelentőséggel bírhat a stressz-indukált sejtválaszban. A stressz (hő, ATP-depléció) stabilizálja a Hsp90 oligomerjeit és szubsztrátjaival alkotott komplexeit, viszont megszünteti a folyamatok dinamikáját, ami magyarázatot kínál arra, hogy a különféle stresszek (pl. hő, ATP-depléció, divalens kationok) miért
vezetnek
a
transzportfolyamatok
széteséséhez,
ugyanakkor
a
citoszkeletális-
mikrofilamentáris rendszer stabilizálódásához. A prokarióta sejt hasonló eredményt ér el, eltérő molekuláris mechanizmussal. A hősokkolt sejtben a Hsp60-homológ GroEL visszatekerő aktivitása átmenetileg szünetel, ám az oligomerizáció nem változik. Az apikális 45
domének konformáció-változása meggátolja a GroEL-gyűrűk közötti, a szubsztrát elengedését lehetővé tevő jelátvitelt, a chaperonin az aggregáció által fenyegetett fehérjéket a stressz végéig tárolja (Llorca és mtsai, 1998). Az eukarióta sejt citoplazmatikus Hsp60 homológja (TCP1/TRiC) csak a szubsztrátok szűk csoportjának dajkálásában vállal szerepet, ezért valószínű, hogy az egyébként is nagy mennyiségben jelenlevő Hsp90 vette át ezt a funkciót. A Hsp90 tároló működésének molekuláris alapjaira egy lehetséges magyarázat látszik kibontakozni kísérleteink és más munkacsoportok eredményei alapján. Maga a hőkezelés gátolja a Hsp90 ATP-kötését (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények), így disszociáló tényező hiányában a Hsp90 aspecifikus szubsztrátjaival (Young és mtsai, 1997; Scheibel és mtsai, 1998) specifikus klienseivel (Young és Hartl, 2000) és az aktinnal (Kellermayer és Csermely, 1995) kialakított komplexe stabilizálódik. Az ATP szerepét támasztja alá, hogy ATP hiányában vagy ADP jelenlétében a Neurospora crassa Hsp90 oligomer formája stabilizálódhat (Ouimet és Kapoor, 1999), ATP és ADP a csirke Hsp90a hő-indukált oligomerizációját gátolja (Chadli és mtsai, 1999). Feltételezzük, hogy a Hsp90-központú chaperon komplex asszociációs-disszociációs folyamatainak dinamikáját a Hsp90 nukleotidciklusának megszakítása befagyasztja. A modellt Az eredmények megbeszélése fejezetben a 6.5. ábrán vázoltam fel. Természetesen a hipotézis bizonyítása mindenek előtt az oligomer krio-elektronmikroszkópos detektálását, és az ATP-től remélt gátló hatás kimutatását igényli, melyet funkcionális kísérletek követhetnek.
2.8. A Hsp90 biológiai szerepe A Hsp90 szerepe az egyéb makromolekulákkal kialakított, elsősorban chaperonszubsztrát kölcsönhatásban jelentkezik. A hagyományos chaperon szerepen túl rendhagyó funkciókról egyre többen számolnak be. Az alábbiakban elsődlegesen a chaperon szerepet foglalom össze, majd utalásokat teszek a rendhagyó funkciókra. A Hsp90 chaperon aktivitását didaktikai és mechanisztikus okokból kifolyólag célszerű két részre osztani. Csakúgy, mint a többi dajkafehérje, in vitro, valamint stresszhatásra passzív chaperon aktivitást mutat, azaz a nem-natív polipetidláncokat megköti, és aggregációjukat meggátolja (Miyata és Yahara, 1992; Wiech és mtsai, 1992; Jakob és mtsai, 1995/a; Nemoto és mtsai, 2001/b). A többi dajkafehérjétől eltérően, aktív chaperon hatása nem abban áll, hogy ATP segítségével helyreállítja a natív térszerkezetet, jóval inkább abban, hogy az egyéb
46
chaperonok által részlegesen felgombolyított kliensfehérjét megköti, majd ATP-ciklusa révén partnereit cserélgeti, és jelenleg ismeretlen mechanizmussal alakítja ki és stabilizálja a kliens szerkezetét. Megítélésem szerint jobb az aktív és passzív jelzőt használni, mert az elterjedt általános és specifikus chaperon aktivitás fogalma nem világítja meg a mechanizmus lényegét. A kétfajta aktivitás sok tekintetben párhuzamba állítható (2.8. ábra).
Szubsztrát keletkezés
Felismerés
Stabilizáció
Transzfer
kochaperonok
ligand partner
Kliens
HSF-1
Hsp40/70
Hsp90
Felgombolyítás
Aktivációképes állapot ATP-függő kialakítása
Legombolyodás
Aktív állapot
?
STRESSZ
denaturált fehérje
Funkcionális fehérje
Hsp40/70 Hsp90 Gombolyodásképes állapotban tartás (ATP-független)
Natív állapot
2.8. ábra A Hsp90 aktív és passzív chaperon működésének szakaszai Fent: az aktív működés keretében a klienst a Hsp90-chaperon-komplex gombolyítja fel és stabilizálja a natívhoz közelálló szerkezetet, majd ligand vagy fehérje partner veszi át és alakítja ki a funkcionális állapotot. Lent: a passzív működés keretében a legombolyodó szubsztrátot A Hsp90 felismeri és felgombolyításra képes állapotát stabilizálja, majd a Hsp70/40 veszi át és alakítja ki a natív szerkezetet. Stresszhatásra a Hsp90-ben konformáció-változás következik be, az aktív, specifikus, dinamikus funkciót passzív, általános, statikus funkció váltja fel. A váltás molekuláris mechanizmusa csakúgy, mint a reverzibilitás kérdése megválaszolatlan.
2.8.1. A Hsp90 passzív chaperon működése 2.8.1.1. A passzív chaperon szerep teret nyer a törzsfejlődés során Jópár éve folyik a vita arról, hogy a Hsp90 in vitro mérhető passzív chaperon aktivitása ténylegesen működik-e in vivo, és van-e az élőlény szempontjából valami jelentősége. A
47
kérdés eldöntésére a legmegfelelőbb modellt a prokarióták kínálják, hiszen itt a Hsp90homológ HtpG még nem terhelt a jelátviteli folyamatok instabil fehérjéivel (ld. 2.2. fejezet). A természet bölcsessége tetten érhető abban, hogy a HtpG nem esszenciális fehérje, egyfajta tartalék. Hiánya csak azon a hőmérsékleten válik hátrányossá, ahol oligomerizációja következtében megjelenik passzív chaperon aktivitása (Bardwell és Craig, 1988; Nemoto és mtsai, 2001/b; a továbbiakban, ha külön nem jelzem, az oligomerek és oligomerizáció alatt a stabil, biokémiai módszerekkel tetten érhető oligomerek megjelenését értem). Természetesen felmerül a kérdés, mi szüksége van a HtpG-nek az ATP-kötőhelyére, specifikus szubsztrátok és segédek hiányában. Sajnos ATP-kötésre/hidrolízisre képtelen mutánst expresszáló törzsekkel vagy geldanamycinnel nem történtek ilyen irányú kísérletek, pedig választ adhatnának arra a kérdésre, honnan ered a Hsp90 eukariótákban életfontosságú jellemzője. Sőt, geldanamycinnnel ez idáig semmilyen kísérlet nem történt baktériumokban, vagy nem közölték! Ha feljebb lépünk az evolúció lépcsőjén, nagy változásokat tapasztalhatunk. Élesztőben alapjaiban változnak meg a de novo szintetizált fehérjék betekeredésének körülményei, melyek a dajkafehérjék terheit csökkenthetik. Ugyanakkor már az eukarióta sejtre jellemző architektúrával találkozunk, és a részlegesen felgombolyodott, hidrofób felszínekkel rendelkező, csapdába esett fehérjéket felismerő és helyrehozó prokarióta GroEL/GroES Hsp60/Hsp10-homológ hiányzik a citoplazmából. Mindkét feladat új kihívásokkal szembesíti a dajkafehérjéket. Látszólag ennek megfelelően alakulnak a dolgok, a Hsp70-et négy, a Hsp90et két gén (Hsc/Hsp82) kódolja, a termékek (Hsp82-vel jelölöm őket) hiányában a sejt életképtelen. A Hsp82 – a Hsp70 egyik homológjával ellentétben – általában nem szükséges a de novo felgombolyodáshoz (Nathan és mtsai, 1997). Feltehetően atavisztikus maradvány az is, hogy normál hőmérsékleten a Hsp82 5%-a is elegendő a sejtek „komfortérzetének” biztosításához (Xu és Lindquist, 1993). Susan Lindquist akadémiai székfoglalója bizonyítani látszott, hogy a Hsp82 nem játszik szerepet a fehérjék hősokk elleni védelmében (Nathan és mtsai, 1997). Ez a következtetés az általuk vizsgált relatíve alacsony hőmérsékleten igaz is. Korábban ők maguk bizonyították, hogy a Hsp82 csak magasabb hőmérsékleten szükségeltetik olyan nagy mennyiségben, amely összhangban állna általános feladatok ellátásával (Borkovich és mtsai, 1989). Érdekes, hogy ezen a hőmérsékleten kezdődik az élesztő Hsp82 oligomerizációja (Jakob és mtsai, 1995/b). Tehát úgy tűnik, élesztőben a Hsp82 általános passzív chaperon aktivitása tartalékot képez, mely csak magasabb hőmérsékleten áll szolgálatba. Ugyanakkor a Hsp82 elősegítheti az enyhébben hősokkolt sejt működésének 48
gyorsabb helyreállítását (Nathan és mtsai, 1997). Az oligomerek kialakulása alatti hőmérsékleten is kifejtheti chaperon hatását, mely ekkor a gombolyodási problémát tapasztaló instabil szerkezetű fehérjékre korlátozódik. A destabilizálódó polipeptidláncok száma azonban a hőmérséklet emelésével növekszik, mely a Hsp82 iránti igény növekedését vonja maga után. Ezt bizonyítja az is, hogy alacsonyabb hőmérsékleten a Hsp82 csak az instabil szerkezetű enzim de novo felgombolyodásában és helyreállításában játszik szerepet (Nathan és mtsai, 1997). Elképzelhető, hogy a már itt is meglevő néhány jelátviteli molekula válaszképes állapotban tartása nagymértékben elősegíti a normál sejtműködés gyorsabb helyreállítását, ami csak a laboratórium üvegbúráján kívül válik fontossá. Persze ez utóbbi feladatok már a passzív és az aktív működések határterületén húzódnak meg. A Hsp90-et nagy mennyiségben termelő sejtvonal hőre ellenálló (Yahara és mtsai, 1986 cím). Sajnos többsejtű élőlényekben még nehezebb különválasztani az aktív, specifikus és a passzív, általános működést. Mégis gyanítható, hogy a Hsp90 passzív chaperon hatása fontosabbá válik. Egyrészt a humán és a marha Hsp90 fehérjék valamivel kisebb koncentrációban gátolják a tesztfehérjék aggregációját, mint akár az élesztő Hsp82 (Jakob és mtsai, 1995/b; Nemoto és mtsai, 2001/b), sőt már szobahőmérsékleten is rendelkeznek chaperon aktivitással (Young és mtsai, 1997; Scheibel és mtsai, 1998; Schnaider és mtsai, 2000/b). Másrészt az E. coli-ban kifejezett humán Hsp90a olyan hőmérsékleten is gátolja a fehérjék általános kicsapódását, amelyen a HtpG (vagy a Hsp82) még nem jut szóhoz (Nemoto és mtsai, 2001/b). A hatékonyabb chaperon aktivitás mögött két fontos változás húzódik meg. Az élesztő Hsp90-ben már megjelenik egy második, C-terminális aspecifikus chaperon kötőhely, amely (részben) átvenni látszik a GroEL szerepét (Scheibel és mtsai, 1998; ld. később). A folyamat ott teljesedik ki, hogy a magasabb rendű organizmusokból származó egyre alacsonyabb hőmérsékleten oligomerizálnak (45°C) és tesznek szert még jelentősebb passzív chaperon funkcióra (Nemoto és mtsai, 2001/b). 2.8.1.2. A Hsp90 chaperon kötőhelyei A Hsp90 két chaperon helye eltérő szubsztrát specificitással, sőt – feltételezésem szerint – két-két alkötőhellyel rendelkezik: fehérjéket és peptideket mindkettő egyaránt köt (2.8.1.2. táblázat). Az N-terminális kötőhely (1-232. as) elsődlegesen hosszabb peptideket és a kémiailag teljesen kitekert, a felgombolyodási útvonal kezdetén járó polipeptidláncokat képes megkötni. A kötés geldanamycin- (és nukleotid-) érzékeny, ugyanakkor a szubsztrátok irreverzíbilisen ottragadhatnak. Az N-terminális domén olvadáspontjánál létrejövő másik 49
kötőhely hődenaturált fehérjékkel lép kölcsönhatásba, az olvadáspont egybeesik a hő-indukált chaperon aktivitás megjelenésével (Garnier és mtsai, 1998; Yonehara és mtsai, 1996). A chaperon hely feltűnése és az oligomerizáció hátterében az N-terminális és a középső domén közötti kölcsönhatás felszakadása állhat: ez a kölcsönhatás emlős Hsp90-eknél jóval gyengébb (Tanaka és mtsai, 2001). Ezt támasztja alá, hogy a középső domén jelenléte részlegesen gátolja az N-terminális domén rodanéz iránti chaperon aktivitását (Young és mtsai, 1997). Ugyanekkor a C-terminális domén felszabadításával (az a-peptid segítségével) a hő-indukált chaperon aktivitás szobahőn is megőrizhető (Yonehara és mtsai, 1996), ami a középső-Cterminális domén és/vagy a töltött régió szerepét hangsúlyozza. A HtpG fehérjére mind a hőindukált chaperon aktivitás (Jakob és mtsai, 1995/b), mind az inzulin peptid kötése jellemző (Scheibel és mtsai, 1998), nincs viszont adat arról, hogy ATP-re, geldanamycinre érzékeny-e.
Szubsztrát
Csapda
Denaturáció
N
C
Hivatkozás
Citrát szintáz
+
Rodanéz Luciferáz
+ +
Dihidrofolát reduktáz Peptidek inzulin VSV8 > 13 as.
-
kémiai hő kémiai kémiai hő kémiai hő
+ -/+1 + +2 + +2 +
+ + + + + +
Scheibel és mtsai, 1998 Tanaka és mtsai, 2001 Young és mtsai, 1997 Young és mtsai, 1997 Minami és mtsai, 2001 Minami és mtsai, 2001
+ -/+1 +
+ + -
Scheibel és mtsai, 1998 Young és mtsai, 1997
2.8.1.2. táblázat A Hsp90 chaperon kötőhelyei N, N-terminális domén, C, C-terminális domén (humán) illetve középső-C-terminális domén (élesztő) Csapda: gombolyodási csapda, spontán felgombolyodási képtelenség. 1-: élesztő, +: csirke és/vagy, humán 2nem engedi el a szubsztrátot. A hő a legombolyodást, a kémiai denaturáció a felgombolyodást modellezi.
A C-terminális domén (628-731. as) szintén tartalmaz egy peptidkötőhelyet, amely az antigén bemutatásban játszhat szerepet. Az ugyanitt található, eukariótákra jellemző chaperon hely struktúrált olvadt gombolyag állapotú, gombolyodási problémákkal küszködő fehérjék kötéséért felelős. Tulajdonságai eszünkbe juttatják a Hsp90 specifikus chaperon funkcióját. Az aktivitás már szobahőn, távol a rendkívül hőstabil domén olvadáspontjától (Garnier és mtsai, 1998) tapasztalható. Nukleotid hatását nem írták le, viszont az ide kötő ciszplatin gátló hatású (Itoh és mtsai, 1999). A chaperon hatást és a Hop kötését a régió néhány savas aminosavának 50
(E650A, D652A) mutációja csökkenti. A 643-as és a 667-es Glu cseréje a chaperon aktivitást fokozza, az eukarióta specifikus C-terminális MEEVD pentapeptid glutaminsavai csak a Hopkötésre hatnak, a chaperon működéshez nem szükségesek (Ramsey és mtsai, 2000). A közlemény rámutatott, hogy a különböző TPR-fehérjék iránti specificitásárt a C-terminális pentapeptid előtt elhelyezkedő különböző régiók felelősek, és ezek a Hop esetén átfednek az általános chaperon hellyel. Johnson és mtsai (2000) adatai arra utalnak, hogy a (csirke) Hsp90a-ban található egy harmadik chaperon hely is, a 206-449. aminosavak között. Míg kísérleteikben a fragmentum gátolta a hőkezelt citrát szintáz aggregációját, addig másoknál (a töltött régiót nélkülöző humán Hsp90a 271-615. as) nem hatott a kémiailag denaturált rodanéz (Young és mtsai, 1997) illetve dihidrofolát reduktáz (Minami és mtsai, 2001) aggregációjára. Tehát specificitása hasonlít a C-terminális kötőhelyéhez. Mind a töltött régió (ld. ott), mind az azután következő régió részt vesz fehérje-fehérje kölcsönhatásokban, pl. az Akt kináz kötőhelye a 327-340. aminosavak között helyezkedik el (Sato és mtsai, 2000), azaz minden lehetőség adott egy harmadik szubsztrátkötőhely azonosításához. 2.8.1.3. A passzív chaperon aktivitás jelentősége Mi lehet a Hsp90 passzív chaperon aktivitásának szerepe, ha önmagában nem képes renaturálni a fehérjéket? Több labor egymástól függetlenül bizonyította, hogy a Hsp90-ről az aktív chaperonok, így a GroEL/GroES (Yonehara és mtsai, 1996) illetve a Hsp40/70 (Freeman és Morimoto, 1996) ATP jelenlétében átveszi a felgombolyodásra képes állapotban megőrzött szubsztrátot, és visszaállítják annak natív állapotát. Tehát az eukarióta sejtben a Hsp90 lehet az egyik tényező, mely hősokk esetén felismeri és elraktározza az aggregációnak kitett fehérjéket, és elvégzi a GroEL feladatának első részét. A helyreállítás feltehetően a Hsp40/70 rendszer dolga. A Hsp90 N- és C-terminális chaperon helye egyaránt képes a nem-natív fehérjét átadni a Hsp70-nek (Minami és mtsai, 2000), mégis a mechanizmus inkább a középső C-terminális doménre jellemző, és újra a specifikus chaperon működéssel állíthatjuk párhuzamba (2.8. ábra). 2.8.2. A Hsp90 aktív chaperon működése A Hsp90 aktív chaperon működésére in vivo egyértelmű bizonyítékot a geldanamycin hatásmechanizmusa jelentett (Whitesell és mtsai, 1994). A szer meggátolja a Hsp90 aktivitásától függő kliensfehérjék felgombolyodását, a biológiai aktivitással nem rendelkező 51
nem-natív fehérjét a proteaszóma lebontja (Schneider és mtsai, 1996; Schulte és mtsai, 1997; összefoglalásul ld. Pratt, 1997; Neckers és mtsai, 1999; Schnaider, 2000). Amenyiben ezt a funkciót jellemezni szeretnénk, a következő kérdésekre kell az alábbiakban választ adnunk: kiket: mely fehérjék a kliensek? mit: mit ismer fel a kliensben, illetve mit csinál a kliensekkel? kikkel: mely fehérjék és hogyan játszanak szerepet a folyamatban? miért: miért szükséges, mi történik a hiányában? 2.8.2.1.Kiket? Az első kérdésre részletes választ a 2.8.2.1. táblázat ad. A táblázat a teljesség igénye nélkül készült, elsősorban az ismert funkcióval rendelkező vagy új klienseket tünteti fel. Az irodalmi hivatkozásokat csak a legújabb szubsztrátok esetében adom meg, egyébként ajánlom a témákban megjelent összefoglalókat (Pratt, 1997; Csermely és mtsai, 1998; Neckers és mtsai, 1999; Schnaider, 2000). A legkorábban azonosított szubsztrátok a virális tyúkszarkóma kináz (v-src) és a szteroid receptor volt, melyeket igazoltak genetikai (Hsp90 mutánsok), farmakológiai
(geldanamycin,
radicicol),
komplex
kimutatás
(immunfluoreszcencia,
immunprecipitáció) és in vitro rekonstitúciós kísérletek (retikulocita lizátum és tisztított fehérjék) révén. 2.8.2.2. Mit? A fenti kérdésre az adhatja meg a választ, ha megvizsgáljuk, miben hasonlítanak a szubsztrátok egymásra. Az aminosav sorrendben, méretben és funkcióban egymástól rendkívül távol álló kliensek legkisebb közös nevezője a problematikus felgombolyodási útvonal és/vagy a feladatuk végrehajtásához szükséges konformációs rugalmasság, valamint reaktív kötőfelszínek megléte. A gyakran több doménből álló fehérjék funkcionális konformációja vagy önmagában labilis (pl. luciferáz), vagy metastabil, nem a termodinamikai minimumon Kliensfehérje
A Hsp90 szerepe/A kliens funkciója
Transzkripciós faktorok Ligandfüggő transzkripciós faktorok Szteroid receptorok (összes) Retinsav receptor Aril-hidrokarbon (dioxin) receptor Hem aktivátor protein 1 (Hap1) Egyéb transzkripciós faktorok Hősokk faktor 1 (HSF-1) Vad típusú p53 (direkt kötés) Mutáns p53 (indirekt kötés)
stabilizáció, transzport, jelmoduláció
Hivatkozás
szteroidok szerteágazó biológiai hatása differenciálódás, fejlődés lipofil toxinokra adott pleiotrop válasz élesztő oxigénfüggő génjeinek transzkripciója
Lee és mtsai, 2002
stresszválasz tumor szupresszor onkogén
Guo és mtsai, 2001 King és mtsai, 2001 King és mtsai, 2001
52
Hipoxia-indukálható faktor (HIF) 1a Polimerázok Hepatitis B polimeráz Telomeráz DNS polimeráz a Kinázok Tirozin-kinázok Src-kinázok (Src, Lck, Fyn, Hck, stb.) Inzulin receptor Fokális adhéziós kináz (FAK) Wee1 Ste11 ErbB2 Szerin/treonin-kinázok Raf, MEK eIF2a-kinázok (Gcn2, hem-függő, dsRNS-függő) eEF-2-kináz kazein-kináz II Cdc2 (CDK1) CDK4/6 CDK9 Polo/Plk Pim-1 PI3-függő kináz 1 (PDK1) Akt/protein kináz B TNFa-RIP/haláldomén kináz Egyéb fehérjék kalcineurin – foszfatáz
hipoxiás adaptáció, tumoros érképződés fehérje-nukleinsav komplex összeépítés HBV replikáció, daganatképződés
Katschinski és mtsai, 2002
telomer elongáció, sejt/tumor halhatatlanság
Holt és mtsai, 1999; Masutomi és mtsai, 2000 Crevel és mtsai, 2001
replikáció (gátlás) aktív konformáció kialakítása, gátlás növekedési jel, daganatképződés inzulin jelátvitel sejtmozgás, adhézió sejtciklus feromon szignál daganatok növekedési jel transzláció transzláció sejtosztódás, anyagcsere sejtciklus sejtciklus TEFB kináz alegysége, HIV transzkripció centroszóma kialakulás, mitózis
Scholz és mtsai, 2001
Donzé és mtsai, 2001
leukémiás sejtproliferáció túlélési jel, daganatképződés túlélési jel, daganatképződés NFkB-aktiváció, apoptózis gátlás
O’Keeffe és mtsai, 2000 Simizu és Osada, 2000; de Cárcer és mtsai, 2001 Mizuno és mtsai, 2001 Fujita és mtsai, 2002 Sato és mtsai, 2000 Lewis és mtsai, 2000
só-stressz, növekedési jel
Imai és Yahara, 2000
túlélési jel
Pandey és mtsai, 2000
Apaf-1 – apoptotikus fehérje NO-szintáz (eNOS, nNOS, iNOS)
Hu és Seeger, 1996
immunválasz, vazorelaxáció, memória
proteaszóma
fehérjelebontás
CFTR – kloridcsatorna
exokrin mirigyek folyadék szekréciója
apoB – apolipoprotein
LDL-anyagcsere
proteáz-aktivált receptor (PAR) pitvari nátriuretikus peptid receptor
trombin jelátvitel
Pai és mtsai, 2001
vazodilatáció, diurézis
Kumar és mtsai, 2001 Busconi és mtsai, 2000
Ga – heterotrimer G-fehérje alegység
jelátvitel
Gbg – heterotrimer G-fehérje alegység
jelátvitel
reovírus sejtadhéziós fehérje
vírusinvázió
Zhao és mtsai, 2001
transzláció
Kang és mtsai, 2000
aminoacil-tRNS szintetázok luciferáz
2.8.2.1. táblázat
modell szubsztrát
A Hsp90-nel kapcsolódó kliensfehérjék
helyezkedik el, ami egyrészt azt jelenti, hogy több hasonló szabadenergiájú konformer fordul elő (heterogén populáció), másrészt ezek a fehérjék intermolekuláris kölcsönhatások kialakítására alkalmas felszínekkel rendelkeznek. A metastabil konformációt valamilyen ágens, pl. membrán (membránfehérjék, src-kinázok, Raf), ligand (ligandfüggő transzkripciós faktorok), kofaktor (hem – NOS, eIF2a-kináz; RNS – polimerázok), fehérje (ciklin – CDK, kalmodulin – kalcineurin, NOS), poszttranszlációs módosulás (foszforiláció – src és más
53
kinázok, p53) stabilizálja. Addig azonban ezt metastabil a konformációt fent kell tartani, és meg kell gátolni egyéb, nem-specifikus kölcsönhatások kialakulását (pl. egyéb ligand, aggregáció, nem megfelelő aktiváció). A Hsp90-nek tehát nem fehérje-specifikusan a natívhoz közelálló, nagyrészt kialakult, de nem makulátlan szerkezeteket kell megkötnie és stabilizálnia. Bár ezt sokan felismerték, és aspecifikus modell szubsztráton (citrát szintázon) ki is mutatták (Jakob és mtsai, 1995/a), egyértelmű, célzatos kísérleti bizonyítékkal senki sem lépett fel. Genetikai bizonyítékként szolgál az, hogy a Hsp90 működésének csökkenése az addig pufferolt, rejtett mutációk manifesztációja révén szokatlan morfológiai variánsok felszaporodásához vezet, azaz a Hsp90 képes a mutáns fehérjék szerkezetét stabilizálni, aktivitását fenntartani (Rutherford és Lindquist, 1998) Azt a nagyon fontos kérdést nem válaszolhatjuk meg, hogy a Hsp90 megszokott kliensei destabilizálódnak tovább a mutációk folytán, vagy új kliensek tűnnek fel. Erre megfelelni mind a Hsp90 hatásmechanizmusa, mind a sejtműködés biztosítása szempontjából mérföldkő lehet. A fehérjék szintjén indirekt bizonyítéknak könyvelhetjük el azt, hogy két szinte azonos fehérje, a c-src és v-src közül in vivo az – a v-src – képez stabilabb komplexet a Hsp90-nel, mely a többszörös mutációk következtében labilisabb szerkezete miatt a dajkafehérje közreműködését jobban igényli aktivitásához (Xu és Lindquist, 1993; Xu és mtsai, 1999). Ezt más src-kinázzal (Scholz és mtsai, 2001) kapott eredmény mellett alátámasztja az is, hogy a Hsp90 kölcsönhatását in vivo és retikulocita lizátumban kizárólag a mutáns p53-mal tudták kimutatni (Blagosklonny és mtsai, 1996). Maciej Zylicz csoportja átalakította a Hsp90-p53 kölcsönhatásról uralkodó képet (King és mtsai, 2001). A Hsp90 in vitro háromszoros affinitást mutat a vad típusú p53-hoz, mint a konformációs mutánshoz, azonban a vad típus destabilizálódása (37°C, 90 perc) a kötést a mutánshoz hasonló szintre csökkenti. Ugyanakkor a foldoszóma többi dajkafehérjéinek jelenlétében a Hsp90 hasonló affinitással köt a vad típusú és a mutáns p53-komplexéhez. A hősokk faktorral in vivo végzett kísérletekben szintén csak a komplex stabilizálása után tudták a Hsp90-nel való kölcsönhatást kimutatni (Guo és mtsai, 2001). Ez számomra azt sugallja, hogy a Hsp90 által felismert konfomer(ek) egy relatíve szűk tartományon belül helyezkednek el, és ebbe a tartományba bizonyos fehérjék talán maguktól is eljuthatnak (vad típusú p53, kazein kináz II) míg másokat (pl. szteroid receptorok, hősokk faktor, mutáns p53) a foldoszóma juttat el oda. Úgy gondolom, hogy a Hsp90 önmagában nem képes aktívan felgombolyítani az erősen torzult fehérjéket, de a metastabil – natív konformerek egyensúlyát
54
az utóbbiak javára képes eltolni, mely bizonyos esetekben „renaturációs aktivitást” kölcsönöz neki, amit kísérletek során is tapasztalhatunk (Miyata és Yahara, 1995; Jakob és mtsai, 1995/a). Természetesen attól, hogy a Hsp90 kliens-felismerő képességének titkát megfejtsük, még messsze járunk. Saját eredményeink a hidrofób és a pozitívan töltött régiók szerepét vetik fel (Csermely és mtsai, 1997). A probléma megoldását nagyban megnezhezíti a Hsp90 általános és specifikus chaperon hatása, több chaperon helye, valamint az a tény, hogy a specifikus kliensek kötőhelye/helyei ismeretlenek, néhány egymásnak ellentmondó, kaotikus molekuláris biológiai megközelítés kivételével. A mutációk, deléciók, trunkációk pedig chaperonoknál és klienseknél a szerkezeti vonatkozások miatt elég „veszedelmesek” lehetnek. A problémát különböző kliens-Hsp90 komplexek kristályosításával, vagy hőmérsékletérzékeny mutánsokat használva egy független kliens Hsp90-függővé tételével tudnánk bizonyítani. 2.8.2.3. Kikkel? A Hsp90 aktív chaperon hatását a citoszolikus dajkafehérje komplex (foldoszóma, ld. Pratt, 1992; 1997) részeként fejti ki. A komplex összetételét számos, a közelmúltban megjelent tanulmány ismerteti (Buchner, 1999; Caplan, 1999; Schnaider, 2000; Richter és Buchner, 2001). Mint az előzőekben utaltam rá, a kliens Hsp90 kötésére alkalmas konformációját a foldoszóma fehérjéi alakítják ki, nem csoda, hogy a legtöbb komponens képes denaturált fehérjék kötésére, passzív chaperon aktivitással rendelkezik (ld. 2.7.2.3. táblázat). Az egyes fehérjék biológiai működésüket – mostanában válik nyilvánvalóvá – jóval szélesebb területen fejtik ki. Példaként érdemes említeni a Cyp40-et, amely prolil-izomerizáció révén az interleukin-2-függő tirozin-kináz aktivitását szabályozza (Brazin és mtsai, 2002), még inkább a p23 fehérjét, amely eredeti szerepével látszólag össze nem egyeztethetően egy citoplazmatikus GSH-függő prosztaglandin E2 szintáz aktivitásával rendelkezik (Tanioka és mtsai, 2000). A Hsp90 foldoszómában kifejtett aktivitása a teljes molekulát igényli, és szinte semmilyen belső deléciót nem tolerál (Johnson és mtsai, 2000; Chadli és mtsai, 2000). A kliens kötésén túl a sokféle segítővel kialakított kölcsönhatás és az ATP-függő bonyolult konformációs átmenetek állhatnak a háttérben. Bár sok kérdés még mindig tisztázatlan, legfőképp a kliensre gyakorolt hatás mechanizmusa, az ATP-ciklus részletes rekonstruálásában a legnagyobb szerepet Chrisostomos Prodromou laboratóriuma játszotta, míg a kliens
55
aktiváció – a glukokortikoid és a progeszteron receptor modelljét használva – nagyrészt William Pratt, David Smith és David Toft érdeme. A ciklus lépéseit – elsősorban az ő munkájuk alapján – az alábbiakban, a 2.8.2.3. ábrán szemléltetem:
Kliens
N
C 60 C
C 60 C
N N N
[6]
[5]
C C
N
[1]
40 70
[0]
C
N
40 60 C 70
2 ATP
51
51
2 ADP 40 70
ADP ADP
[4]
C C
ATP ATP
[2]
2 Pi
6C0
C 51 C C 51
[3]
23
23 51
51
C C
23
ATP
51
51
52
Aha-1, Bag-1, CHIP?
51 52
C C
23
ATP
2.8.2.3. ábra
52
51
[4’]
52
A Hsp90 ATP-függő chaperon ciklusa
[0] A Hsp40 fehérje felismeri, és nagy affinitással köti a klienst (King és mtsai, 2001; Hernández és mtsai, 2002). A Hsp40 elősegíti Hsp70 (dimer!, ld. Hernández és mtsai, 2002) ATP-függő kihorgonyzását, mégpedig részben direkt kölcsönhatás, részben a Hsp70 ATPáz stimulációja révén. Az ATP hidrolízise stabilizálja a Hsp70/kliens-Hsp40 korai komplexet. A Hsp70 nukleotid-állapotát a továbbiakban két fehérje szabályozhatja: a Hip fehérje az ADP-
56
állapotot és a komplexet stabilizálja, a Bag-1 az ADP-t ATP-re cseréli, a komplexet disszociálja. [1] A Hop fehérje a vele előzetesen komplexben levő, nukleotidot nem kötő Hsp90-et kihorgonyozza a Hsp70(ADP)-kliens-komplexhez. A Hsp90 a Hsp70-nel és a klienssel is kapcsolatba kerül. A Hop gátolja a Hsp90 ATP-kötését. Ez a geldanamycin hatására stabilizálódó intermedier komplex. [2] A Hopot egy ciklofillin (FKBP51, Cyp40) lecseréli, és lehetővé teszi a Hsp90 ATPkötését. Az ATP kötése az N-terminális doméneket dimerizálja, a Hsp90 egy molekuláris fogót alakít ki. Az ATP kötése stabilizálhatja a kliens aktivációképes állapotát. Feltehetően ebben a lépésben a Hsp70-Hsp40 disszociál, esetleg lazán kötve marad. A Hop/Hsp70 disszociációja lehet a Bag-1 valódi szerepe (Kanelakis és mtsai, 1999). [3] A p23 a Hsp90(ATP)-szubsztrát komplexhez kapcsolódik, ezzel előáll az érett komplex. A p23 szerepéről pontos kép nincs, hiánya nem vezet komoly zavarhoz, sem az élesztő életképességében, sem a receptorok és kinázok érésében, bár túltermelése növeli a kliensek aktivációját (Fang és mtsai, 1998; Caplan, 1999). A Hsp90 ATPáz aktivitására gyakorolt hatása is ellentmondó (nincs hatás: Young és mtsai, 2000; aktiváció: Chris Prodromou, személyes közlés). A rejtélyt az oszlatja el, hogy az élesztő Hsp82-vel ellentétben, a humán Hsp90-nek csak a kliens által aktivált ATPáz aktivitására hatnak a kochaperonok (McLaughlin és mtsai, 2002). A p23 a Hsp90 ATPáz aktivitását gátolja, a Hsp90(ATP)-kliens komplexét stabilizálja. A molibdát és vanadát stabilizáló hatása is feltehetően az ATPáz gátlásából származik (Nardai és mtsai, 1996). [4] A Hsp90 hidrolizálja az ATP-t, ennek hatására a komplex szétesik, a magára hagyott kliens előbb-utóbb elveszti natív szerkezetét, újra a Hsp70-komplexre kerül vagy a proteaszóma lebontja. Feltételezik, hogy a kliens aktiválható állapota addig tart, amíg a Hsp90 ATP-t köt (Prodromou és mtsai, 1999), ezáltal a foldoszóma a szignáltranszdukció fontos szabályozási tényezőjévé lép elő. Az Aha-1 fehérje lehet a Hsp90 ATPáz aktivátora, amely a kliens aktivációképes állapotban eltöltött idejét csökkenti (alternatíva, hogy az Aha-1 kliens, ezért stimulálja az ATPázt). Újabb adatok szerint a Bag-1 – ismeretlen mechanizmussal – képes a Hsp90-ről is lelökni a szubsztrátot (King és mtsai, 2001), amely áldozatul esik a proteaszómának. Ennek megfelelően az is elképzelhető, hogy a Bag-1 a Hsp90 ATPáz aktivátora. [4’] A kliens konformációja az aktivitásához szükséges tényező (pl. ligand, poszttranszlációs módosulás vagy másik fehérje) hatására stabilizálódik, de továbbra is a
57
foldoszóma laza kötésében marad. Az immunofillin komponens olyan fehérjére cserélődik le, amely elősegíti a kliens transzportját. A glukokortikoid receptor esetén az FKBP51 helyébe a dinein kötésére képes FKBP52 lép (Silverstein és mtsai, 1999), és a receptort a magba juttatja (Davies és mtsai, 2002). Más szerzők – geldanamycin alkalmazásával – szintén bebizonyították, hogy a Hsp90 szükséges a szteroid receptor sejtmagba juttatásához (Czar és mtsai, 1997; Galigniana és mtsai, 1998), sőt gyanítható egy foszforilációs esemény is (Galigniana és mtsai, 1999). [5-6] Az ADP disszociál, a Hop pedig újra kapcsolódik a Hsp90-hez: a ciklus újra kezdődhet. A fehérje kinázok irányító alegysége a p50 (cdc37) fehérje, mely korántsem passzív, önmagában is chaperon aktivitású, és túltermelése a Hsp90 hiányát a v-src kináz érésében ellensúlyozza (Kimura és mtsai, 1997). A Hsp90N-hez nem köt, a Raf aktivációja ez esetben nélküle is végbemegy (Grammatikakis és mtsai, 2002), ami arra enged következtetni, hogy a Hsp90 N-terminálisa szerepet játszhat a kölcsönhatásban, illetve a kináz aktiválódása egyéb stabilizáló tényező (membrán) jelenlétében nem igényli a p50 segítségét. A különböző szubsztrátok foldoszómával szemben támasztott mennyiségi és minőségi igénye eltérő. A felgombolyított állapotban viszonylagosan stabil luciferázt (Minami és mtsai, 2000) és a b-galaktozidázt (Freeman és Morimoto, 1996) a Hsp40-Hsp70 képes renaturálni, a többi fehérje segítő szerepet játszik. A glukokortikoid receptor a Hsp70-et és a Hsp90-et igényli (Morishima és mtsai, 2000; Rajapandi és mtsai, 2000), a progeszteron receptor aktivációjához viszont a Hsp40, Hop és p23 is szükséges (Kosano és mtsai, 1998), amelyek a glukokortikoid receptor fegombolyodását csupán optimalizálják. Új eredmények azt támasztják alá, hogy az egyéb fehérjék specifikus szerepe a kliens szerkezetétől függ. A progeszteron receptort a Hsp40 (Hdj2) képes felismerni, a felismerést a receptor csekély hődenaturációja is meggátolja (Davies és mtsai, 2002)! A mindenkori körülményektől függően a két centrális fehérje, a Hsp70 és Hsp90 hasonló segítő, stabilizáló fehérjékkel rendelkezik, melyek a kliens aktivációját két lépésben szabályozzák. Az első lépésben a Hsp70 ATPfüggően kialakítja a biológiai funkció kifejtésére alkalmas konformációt, ennek instabilitása esetén a második lépésben a Hsp90 belép a ciklusba, és stabilizálja. Összefoglalásul, a foldoszóma – és ezen belül a Hsp90 – a klienst aktivációképes állapotba hozza, egyúttal korai és jel nélküli aktivációját meggátolja. Gondoskodik az aktivált kliens transzportjáról, és szabályozhatja további biológiai aktivitását. A foldoszóma
58
részvételével zajlik a menthetetlen illetve a szabályozott féléletidejű kliensfehérjék lebontása is. Ennek mediátora a Bag-1-en kívül a CHIP fehérje, amely a Hsp90 TPR-kötő doménjéhez köt, disszociálja a p23-at, és elősegíti a kliens poliubikvitinilációját és proteaszóma általi lebontását (Connell és mtsai, 2001). 2.8.2.4. Miért? Erre a kérdésre úgy kapunk választ, ha megvizsgáljuk, mi történik a Hsp90 hiányában vagy gátlása esetén. Élesztőben (Borkovich és mtsai, 1989) és muslicában (Cutforth és Rubin, 1994) a homozigóta deléció letális, tehát vizsgálni csak a Hsp90 szintjének heterozigóta vagy átmeneti,
farmakológiás
csökkentését
tudjuk.
A
Hsp90
szintjének
csökkenésekor
megfigyelhető legmarkánsabb jelenség a sejtciklus leállása (Srethapakdi és mtsai, 2000; Nakai és mtsai, 2001), ami aláhúzza a specifikus Hsp90-gátlószerek terápiás jelentőségét. A geldanamycinnel kiváltott hatások ugyanakkor annyira kiterjedtek és sokrétűek, ahányféle szubsztrátja van a Hsp90-nek. Fentiekkel magyarázható a Hsp90-mutánsokat tartalmazó vagy geldanamycin-kezelt muslicákban megjelenő sokféle morfológiai abnormalitás is (Rutherford és Lindquist, 1998). Ebből következik, hogy a Hsp90 szinte minden folyamatban részt vesz (ami jelenlegi in vivo állatkísérleteink eredményét szinte megjósolhatatlanná teszi). Nehezíti a hatások megítélését az is, hogy a kliensek működési ciklusát számos ponton, ellentétes előjellel szabályozza, melyet a transzkripciós faktorok konkrét példáján szemléltetek (2.8.2.4. ábra). A klasszikus aktivitáson túl, a Hsp90 megvédhet bizonyos kinázokat a véletlen aktivációtól (Donzé és mtsai, 2001). A hormon-kötött, magba jutott, DNS-kötésre képes glukokortikoid receptor (Davies és mtsai, 2002) és a trimerizált hősokk-faktor (Guo és mtsai, 2001) egyaránt komplexben található a Hsp90-nel. A Hsp90 meggátolja a fenti transzkripciós faktorok által kiváltott transzkripciót (Kang és mtsai, 1999; Guo és mtsai, 2001), feltehetően a töltött régió lefedi a DNS-kötő domént. A transzaktivációhoz valószínűleg a komplex tényleges szétesése szükséges. A Hsp90 serkenti a glukokortikoid receptor DNS-ről történő leválását, majd ATP-függő módon elősegíti a hormonkötő konformáció visszanyerését (Liu és DeFranco, 1999).
59
stabilizáció Aktiválható jel
felgombolyítás
Inaktív
Aktivált Hsp90
leválás
transzport DNS-kötés
2.8.2.4. ábra
A Hsp90 szerepe a transzkripciós faktorok működési ciklusában
A szerteágazó klientúra okán sürgető probléma a Hsp90-kliens komplexre specifikus inhibitor előállítása, amelyre több próbálkozás történt, pl. geldanamycin és antitest vagy kinázspecifikus inhibitor (Chiosis és mtsai 2001) vagy szteroid receptor ligand (Kuduk és mtsai, 1999) fúziójával. A nagy mennyiségű Hsp90 szintén nem üdvös, mert kliensét állandó fogságban tarthatja, fenotipikusan a Hsp90 hiányához hasonló képet hoz létre (Imai és Yahara, 2000). 2.8.3. A Hsp90 ezoterikus funkciói Az utóbbi években több olyan közlemény vagy hipotézis látott napvilágot, mely a Hsp90 vagy a dajkafehérjék merőben új szerepeiről számol be. Ezeket terjedelmi korlátok és kiforratlanság miatt csak felsorolásszerűen említem meg. Az első érdekes dolog, hogy a szteroidok bizonyos nongenomikus hatásai chaperonok közvetítésével valósulnak meg, mintha a receptorról felszabaduló néhány molekula váltaná ki a hatást (Tumlin és mtsai, 1997; Russell és mtsai, 2000; Sétáló és mtsai, 2001). Természetesen elképzelhető, hogy a módosult, leváló stresszfehérje valamilyen kaszkádot indít el, de ez még bizonyításra vár. Az is feltehető, hogy maga a Hsp90 is képes hormon kötésére, hiszen a sejtmagi receptorokon kívül találtak már ösztrogén-membránreceptort is (ld. Collins és Webb, 1999), valamint pregnenolon kötőhellyel rendelkezik a mikrotubuláris rendszer is (Murakami és mtsai, 2000). Ez magyarázhatná azt is, hogy dexametazon hatására miért bomlik meg a Hsp90 Raf-fal alkotott komplexe (Cissel és Beaven, 2000).
60
Az endotelsejtekből (érsérülés) származó Hsp90 aktiválja az extracelluláris tér nagytakarítóját, a prekallikrein-kininogén komplexet (Joseph és mtsai, 2002). A Hsp90 proteolízisét rajtunk kívül (Schnaider T., Sőti Cs., Csermely P., nem közölt megfigyelések) Montel és mtsai (2000) is megfigyelték, de utóbb kezdeti eredményeinket nem tudtuk reprodukálni. A Grp94 aminopeptidáz aktivitását leíró Pramod Srivastava munkacsoportja szintén nem észlelte a Hsp90 proteáz aktivitását (Ménoret és mtsai, 2001). A lehetősége ennek mégsem zárható ki. A Hsp70 és a Hsp60 aktiválják a komplement rendszer klasszikus útját (Prohászka és mtsai, 2002). A Hsp90 itt sem mutatott aktivitást, hozzá kell azonban tenni, hogy a StressGen Hsp90a és b denaturált, ATP kötésére képtelen (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt megfigyelés). Az extracelluláris Hsp90 specifikus neuritnövekedést indukál, melynek oka és mechanizmusa ismeretlen (Ishamoto és mtsai, 1998). A sejtekből kiáramló vagy a daganatsejtek felszínén megjelenő stresszfehérjék alarm-jeleknek tekinthetők. Képesek receptor-mediált immunreakciót (Basu és mtsai, 2000), trombocita degranulációt kiváltani (Liao és mtsai, 2001). Ugyanezek a stresszfehérjék képesek antigéneket bemutatni a megfelelő immunsejteknek, amelynek a daganatterápiában láthatjuk hasznát (Srivastava és mtsai, 1998). A Hsp90 részt vesz az LPS/Taxol jelátvitelében (Byrd és mtsai, 1999), mégpedig az LPS a receptorról átkerül a sejtfelszíni Hsp90-re és Hsp70-re (Triantafilou és mtsai, 2001)! A Grp94 sejtfelszíni adenozin-kötő fehérjeként működhet (Hutchinson és Fox, 1989). Ezek a jelenségek a dajkafehérjéket a jelátviteli folyamatok és az immunitás passzív chaperon- és antigénszerepéből a reflektorfény közepébe juttathatják. A fenti áttekintésből egyértelműen láthatjuk, hogy a Hsp90 tradícionális és nonkonvencionális feladatai valamint működési mechanizmusa sok titkot rejtegetnek, de ezek további vizsgálata az alapkutatás és az orvostudomány számára is komoly hasznot hajthat. A Hsp90 szerkezeti biokémiáját célzó kísérleti munkámmal én is a fenti nemes törekvésekhez próbáltam hozzájárulni.
61
3. CÉLKITŰZÉSEK
Doktoranduszi munkám során a Hsp90 szerkezeti jellemzőit az alábbiak szerint kívántam vizsgálni: 1., A Hsp90 más fehérjékkel kialakított komplexeit olyan endogén modulátorok stabilizálják, melyeknek hatását in vitro az átmeneti fém anionok (molibdát, vanadát, wolframát) modellezik (Hutchinson és mtsai, 1992), de az, hogy a komplex melyik részéhez kötnek, ismeretlen volt. Témavezetőm kísérletei rámutattak, hogy molibdát és vanadát a tisztított Hsp90-ben konformáció-változást hoz létre (Csermely és mtsai, 1993). Feladatom volt, hogy bizonyítékot keressek molibdát és vanadát direkt kölcsönhatására a Hsp90-nel, és ha lehetséges, határoljam be a kötő régiót. 2., A Hsp90 ATP-t köt (Csermely és Kahn, 1991; Prodromou és mtsai, 1997), amely konformációját megváltoztatja (Csermely és mtsai, 1993), ATPáz aktivitással rendelkezik (Nardai és mtsai, 1996; Panaretou és mtsai, 1998). Az ATP-kötés és az ATPáz aktivitás esszenciális a sejtműködés szempontjából (Obermann és mtsai, 1998; Panaretou és mtsai, 1998). 1994-ben, munkám kezdetekor nem volt ismert az ATP-kötőhely elhelyezkedése, sőt, a későbbiekben a Hsp90 ATP-kötését és ATPáz aktivitását cáfoló eredmények láttak napvilágot (Jakob és mtsai, 1996). Korai kísérleteim célja az ATP-kötőhely feltérképezése, a konformációs átmenetek finom jellemzése, és az ATP Hsp90 működésére gyakorolt hatásának vizsgálata volt. E kísérleteink lehetséges magyarázataként merült fel, hogy a Hsp90 két nukleotid-kötőhellyel rendelkezik, ezért munkám utolsó három évében a második nukleotidkötőhely
feltérképezésével,
jellemzésével,
valamint
kölcsönhatásának vizsgálatával foglalkoztam.
62
a
két
nukleotidkötő
domén
4. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 4.1. Általános megfontolások 4.1.1. Anyagok Amennyiben külön utalás nem történik, a kísérletek során felhasznált anyagok vagy a Sigma, vagy a Fluka cégtől származnak. 4.1.2. A Hsp90 aminosav sorrendje Amennyiben külön utalás nem történik, a könnyebb áttekinthetőség kedvéért értekezésemben a Hsp90 fehérjék aminosavait a humán Hsp90a aminosav sorrendjére vonatkoztatva adom meg. Ezt a nagyfokú szekvenciális azonosság is indokolja. 4.1.3. ATP-regenerációs rendszer Mivel a Hsp90 (N-terminális kötőhelyének) ADP iránti affinitása mintegy tíz-hússzorosa az ATP iránti affinitásnak, illetve a(z élesztő) Hsp90 számottevő ATPáz aktivitással rendelkezik, előfordulhat, hogy egy-egy kísérlet során a keletkező ADP eléri azt a koncentrációt, amely már képes kiszorítani az ATP-t a kötőhelyről, ennek következtében az ATP helyett az ADP hatását vizsgálnánk. Ezt elkerülendő, számos kísérletben a David Toft munkacsoportja (Sullivan és mtsai, 1997) által bevezetett ATP-regenerációs rendszert alkalmaztuk, azaz a reakcióelegybe 10 mM kreatin-foszfátot és 20 U/ml kreatin-kinázt tettünk.
4.2. Biokémiai, in vitro módszerek 4.2.1. A Hsp90 fehérjék eredete, kifejezése, tisztítása A kísérletekben felhasznált Hsp90 fehérjék egy részét Schnaider Tamással és Nardai Gáborral, Yonezawa és munkatársai (1988) módszere alapján, hím Wistar patkányok májából tisztítottuk. A máj 2x30 másodperces késes, majd potteres homogenizálása után a mintát centrifugáltuk (2,000xg, 20 perc, 4 °C). A felülúszót ammónium-szulfáttal frakcionáltuk (30%os telítettség). Újabb centrifugálás után (2,000xg, 20 perc, 4 °C) a felülúszót Butyl-Sepharose 4B (Pharmacia) oszlopra vittük fel. A minta elúciója 30-0% ammónium-szulfát grádiens segítségével történt. A Hsp90-et a frakciók SDS-gélelektroforézisével detektáltuk. A Hsp90-et
63
tartalmazó frakciókat egy éjszakán keresztül dializáltuk (10 mM Hepes, 0,5 mM DTT, 10-10 µg/ml aprotinin és leupeptin, 1 mM PMSF pH 7,4), majd DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) oszlopon tisztítottuk tovább 0,15-0,35 M NaCl grádienst alkalmazva. Újabb dialízist (10 mM nátrium-foszfát, pH 6,8, 5 mM NaCl, 0,1 mM DTT) követően a Hsp90tartalmú frakciókat hidroxiapatit (Bio-Rad, CHT I) oszlopra vittük fel, majd a fehérjéket 10400 mM nátrium-foszfát grádienssel eluáltuk. A megfelelő frakciókat összeöntöttük, egy éjszakán keresztül dializáltuk (20 mM Hepes, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, pH 7,4), majd Bio-Rad FPLC segítségével, Q-oszlopon tovább tisztítottuk (0-0,5 M NaCl grádiens). Végül a kiválasztott frakciókat egy éjszakán át dializáltuk (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,4), bekoncentráltuk és a fehérjekoncentrációt meghatároztuk. Ezzel az eljárással átlagosan 9598%-ban tiszta Hsp90-preparátumot tudtunk előállítani (SDS-PAGE-t és ezüst-festést követő denzitometriás analízis alapján). Az egyéb forrásból származó Hsp90-et (humán placenta, egér máj) hasonlóképpen tisztítottuk. A humán Hsp90a maltózkötő fehérje konstrukciót (MBP-Hsp90) tartalmazó pMAL-cRI plazmid dr. Yoshihiko Miyata (Kyoto University, japán) ajándéka. A vektort tartalmazó E. coli BL21(DE3) törzset 37°C-on 4 óráig 1 mM IPTG-vel indukáltam, szonikálással feltártam, majd amilóz-kromatográfiát (New England Biolabs) követően az MBP-t trombinnal eltávolítotttam. A Hsp90-et hidroxiapatit- (Bio-Rad), és Q- (Bio-Rad UNO) kromatográfiával tisztítottam tovább. Átlagosan 90-95%-os tisztaságú fehérjét nyertem. 4.2.2. Különböző tagszámú vanadát oligoanionok előállítása Vanadát oligomerek előállítása Csermely és mtsai (1985) módszere alapján történt. Nátrium-monovanadát (Fisher) (pontosabban mono-, di- és tetravanadátot tartalmazó) törzsoldatot 50 mM-os pH 10-es vizes oldat 15 percen keresztül történő forralásával készítettem. Dekavanadát oldatot minden esetben frissen készítettem, az oligovanadát törzsoldat pH-jának 4,0-re, majd 7,4-re állításával. A dekavanadát képződést sárga szín megjelenése mutatta. 4.2.3. A Hsp90 permolibdát-módosításának vizsgálata A Hsp90 permolibdát által történő kovalens módosítását Meshinchi és mtsai (1990) módszere alapján hajtottam végre. 1 mg Hsp90-et inkubáltam 20 mM nátrium-molibdát és 20 mM hidrogén-peroxid jelenlétében 20 ml térfogatban, 50 mM Hepes, 0,5 mM EDTA, pH 7,4
64
pufferben 60 percig 0 illetve 37°C-on. A reakciót 0,1 M DTT-t tartalmazó mintapufferrel állítottam le, majd a mintákat SDS- vagy urea- poliakrilamid gélelektroforézist követően Coomassie Blue festéssel tettem láthatóvá. A mobilitás-változást LKB Ultroscan (PharmaciaLKB) lézerdenzitométer segítségével számszerűsítettem. 4.2.4. A Hsp90 triptikus emésztése A Hsp90 triptikus emésztését a harmadlagos szerkezet (proteáz hozzáférhetőség) tanulmányozása érdekében alkalmaztam a Hsp90-ATP, Hsp90-geldanamycin kölcsönhatások, valamint az általuk létrehozott konformáció-változások jellemzésére. Triptikus hasítással próbáltam fellelni a Hsp90 permolibdát-kötőhelyét és a geldanamycinre érzéketlen Cterminális ATP-kötőhelyét is. A triptikus hasítás során kapott fragmentumok ismert molekulatömegét (Nemoto és mtsai, 1997; Hartson és mtsai, 1999; Bogatcheva és mtsai, 1999; és saját nem közölt adatok) és mobilitását összevetve tudtam olyan kalibrációs egyenest szerkeszteni, melynek segítségével meglehetősen pontosan lokalizálhattam a Hsp90 ATPfoszfátkötő-helyeit. A triptikus emésztést Lees-Miller és Anderson (1989) módszerének módosításával alkalmaztam. 5-7 mg Hsp90-et emésztettem 8 ng TPCK-kezelt tripszinnel (Wortington) 10-60 percig 37°C-on, majd a mintákat SDS-gélelektroforézis és Coomassie vagy ezüstfestés (BioRad) illetve Western blot segítségével elemeztem. 4.2.5. A Hsp90 [a-32P]ATP-kötésének vizsgálata natív gélen A Hsp90 ATP-kötését kontinuus és diszkontinuus natív gélen vizsgáltam. Ötharmincperces jégen történő előinkubálást követően 8 mg Hsp90-et inkubáltam 200 mM (5-10 mCi) [a-32P]ATP (Izotóp Intézet Kft.) jelenlétében 30 percig 37°C-on, 50 mM Hepes, pH 7,4 és 2 mM EDTA vagy 5 mM CaCl2/MgCl2 tartalmú pufferben. A mintákat natív gélelektroforézist követően Coomassie-festéssel és autoradiográfiával elemeztem. 4.2.6. A Hsp90 fotoaffinitás jelölése [a-32P]ATP-vel A Hsp90 és a radioaktív nukleotid ultraibolya fény hatására történő keresztkötése Biswas és Kornberg (1984) módszerének módosításával történt. A megfelelő vegyületekkel történő harmincperces jégen történő előinkubálást követően 3 mg Hsp90-et inkubáltam 200 mM (5-10 mCi) [a-32P]ATP (Izotóp Intézet Kft.) jelenlétében 30 percig 37°C-on, 50 mM 65
Hepes, 50 mM KCl, pH 7,4 és 2 mM EDTA vagy 5-10 mM MgCl2 tartalmú pufferben. Ezt követően a mintákat 0°C-os alumínium blokkban egy UV Stratalinker (Stratagene) készülékbe helyeztem, ahol 10 cm távolságból 30 percig besugároztam. A nem kötött nukleotidot SDSgélen választottam el, majd a fehérjéhez kötött nukleotidot a gél ezüstfestését követő autoradiográfiával tettem láthatóvá. 4.2.7. g-foszfát-kapcsolt ATP-Sepharose gyanta kötés A Hsp90 g-foszfáton keresztül kapcsolt ATP-Sepharose gyantához való kötését Grenert és mtsai (1997) módszerét kissé módosítva vizsgáltam. A reakciók 200 ml 20 mM Hepes, 50 mM KCl, 6 mM MgCl2, 0,01% NP40, pH 7,5 pufferben zajlottak. 5 mg Hsp90-et a jelzett anyagok jelenlétében egy óráig jégen előinkubáltam, majd 25 ml g-foszfát-kapcsolt ATPSepharose gyantát adtam a mintákhoz, és gyakori kevergetéssel 30 percig 37°C-on inkubáltam. A gyanta kiülepítése és a fenti pufferrel történő kétszer 1 ml-es mosása után a kötött Hsp90 mennyiségét SDS-gélelektroforézissel és denzitometriával határoztam meg. 4.2.8. Oxidatív nukleotid-affinitáshasítás A Hsp90 nukleotid-affinitáshasítását Alonso és Rubio (1995) módszere szerint hajtottam végre. 2 mg Hsp90-et 30 percig inkubáltam 20 mM Hepes, 50 mM KCl, pH 7,4 pufferben, többnyire 0,5 mM FeCl3-ból és 30 mM aszkorbátból álló redoxrendszer, valamint általában 1 mM nukleotid jelenlétében. Az ATP-vel végzett kísérletek nagy részében az irodalmi hagyományoknak megfelelően ATP-regenerációs rendszert (10 mM kreatin-foszfát és 20 U/ml kreatin-kináz) alkalmaztam, bár a patkány és humán Hsp90 rendkívül alacsony nyugalmi ATPáz aktivitása ezt nem tette szükségessé (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). Gátlószerek és egyéb anyagok hatásának vizsgálata esetén a Hsp90-et 15-60 percig jégen előinkubáltam.
A
fragmentációt
SDS-gélelektroforézist
követő
ezüst-festéssel
vagy
immunoblottal detektáltam. A hasítási helyek behatárolása izoforma-specifikus, a fehérjelánc eleje vagy vége ellen termeltetett antitestekkel történt: N-terminus: PA3-012 (Hsp90bspecifikus, Affinity Bioreagents), K41218 (Hsp90a/b-reaktív, Inst. Immunology Ltd., Tokió, Japán); C-terminus: K41007 (Hsp90a-specifikus, Inst. Immunology Ltd., Tokió, Japán), K3725B (Hsp90b-specifikus, Inst. Immunology Ltd., Tokió, Japán), LKVIRK (Hsp90a/breaktív, dr. Ruth C. Matthews ajándéka, Manchester Royal Infirmary, Egyesült Királyság).
66
4.2.9. Hsp90-ATP nitrocellulóz filter kötés A Hsp90-hez kötött ATP nitrocellulóz membránon való visszatartását Wong és Lohman (1993) illetve Ban és mtsai (1999) módszerének módosításával vizsgáltam. A nitrocellulóz membránt (TransBlot, Bio-Rad) legalább két óráig 4°C-on ekvilibráltam 40 mM Hepes, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, pH 7,5 pufferben. A Hsp90-et egy óráig jégen előinkubáltam, a fenti pufferben 60 mM radicicol (vagy 36 mM geldanamycin) jelenlétében és nélkülük. A minták megfelelő koncentrációjú Mg-[a-32P]ATP-vel (1-2x107 cpm/minta) történő kiegészítését további 20 perces inkubáció követte 37°C-on. A nitrocellulóz membrán fehérjekötése előkísérleteimben zsebenként 4,5-5,0 mg-nak bizonyult, amelyet nem befolyásolt ATP, radicicol, geldanamycin jelenléte. Az idő leteltével három párhuzamos, egyenként 4,2 mg Hsp90-et (vagy nukleotidot nem kötő tioredoxin kontrollt) tartalmazó mintát (30-30 ml térfogatban) szűrtem át a PR 648 Slot Blot Filtration Manifold (Hoefer, Amersham Pharmacia Biotech) zsebein, majd azonnal 200 ml jéghideg pufferrel mostam. A kísérlet befejeztével a membránt (a radioaktív háttér csökkentése végett) pufferrel mostam, megszárítottam, és a kötött radioaktív ATP-t Bio-Rad foszforimidzserrel jelenítettem meg. Az ATP-kötés pontos sztöchiometriáját a zsebek kivágásával és folyadék szcintillációs számlálással határoztam meg, a kötött radioaktivitást a minták teljes radioaktivitásához viszonyítottam. Kísérleteim során a nitrocellulóz membrán és a tioredoxin ATP-kötése elhanyagolhatónak bizonyult. 4.2.10. A Hsp90-p23 komplex in vitro összeépítése A Hsp90 és p23 fehérje komplexét Sullivan és mtsai (1997) módszerét követve állítottam elő, 10 mM Hepes, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,5 pufferben. 10 mg Hsp90-et és 4 mg p23-at a jelzett Hsp90-gátlószerek jelenlétében vagy nélkülük 30 percig 4°Con előinkubáltam, majd a mintákhoz 5 mM ATP-t vagy 0,5 mM ATPgS-t (valamint ATPregenerációs rendszert) és/vagy 20 mM molibdátot adtam, amit 60 perces inkubáció követett 37°C-on. A p23-at és a hozzá kötött Hsp90-et a JJ3 antitest (dr. David Toft, Mayo Graduate School, Rochester, MN, USA) segítségével immunprecipitáltam, háromszor mostam, majd SDS-gél és Coomassie-festés segítségével tettem láthatóvá. 4.2.11. Hődenaturált luciferáz renaturációja retikulocita lizátumban A luciferáz renaturációt Schumacher és mtsai (1996) módszerét módosítva Rácz Attila diákkörösünk állította be. A nyúl retikulocita lizátumot (Green Hectares) a megfelelő
67
gátlószerekkel 15 percig jégen előkezeltük, 20 mM Hepes.KOH, 50 mM K-acetát, pH 7,5, 100 mg/ml cikloheximid, 5 mg/ml leupeptin, 0,7 mg/ml pepsztatin A jelenlétében. Ezt követően hozzámértünk 60 nM luciferázt (Sigma), és 15 percen keresztül 40°C-on melegítettük. A renaturációt 30°C-on 6 mM Mg-acetát és 5 mM ATP-regenerációs rendszer hozzáadásával indítottuk, majd félóránként a luciferáz aktivitást egy BioOrbit 1258 luminométeren (dr. Tretter László laboratóriumában, Orvosi Biokémiai Intézet) mértük, és a natív, illetve az ATPt tartalmazó denaturált mintákhoz viszonyítottuk.
4.3. Biofizikai, szerkezetvizsgálati módszerek 4.3.1. Távoli ultraibolya tartományú cirkuláris dikroizmus mérés Távoli UV CD méréseket végeztem a Hsp90 másodlagos szerkezetének tanulmányozása céljából. A Hsp90 ATP és/vagy geldanamycin jelenlétében felvett másodlagos szerkezeti elemeinek eloszlását az ELTE Szerves Kémiai Tanszékén, prof. Hollósi Miklóssal együttműködésben egy Jobin-Yvon VI dikrográfon 0,01 cm-es hengeres kvarc küvettában, 25°C-on mértük, 0,5 mg/ml-es fehérje koncentrációnál, 25 mM Hepes, pH 7,4 pufferben. Az egy aminosavra eső átlagos ellipticitást 115-ös átlagos aminosav móltömeg használatával számoltam. 4.3.2. Felületi plazmon rezonancia (SPR) mérés Az SPR-méréseket elterjedten használják makromolekuláris (fehérje-fehérje/nukleinsav) kölcsönhatások kvantitatív valós idejű kiértékelésére. Mivel az Eredmények részben több SPRmérés eredményeit ismertetem, ezért a módszer lényegét célszerűbbnek tartom itt összefoglalni. A mérés során egy vékony aranyburkolatú lemez (szenzor chip) felszínén található mátrixhoz kovalensen valamilyen makromolekulát kötünk. A mátrixon keresztül áramló oldatban jelen levő egyéb (makro)molekula (ligand) a felülethez kiköt, mely a közeg törésmutatóját megváltoztatja. A változást a felületre beeső és onnan visszaverődő monokromatikus polarizált fénysugár szögének (piciny) megváltozásával detektáljuk (1° = 10 000 rezonancia egység, RU, 10 ng/mm2 fehérjemennyiség a lapkán). A ligand injektálásakor mérhető szignál növekedés asszociációs fázisa után a ligand nélküli mosással kapott szignál csökkenés a disszociációról nyújt információt. Megfelelő kontrollok és megfelelő körülmények megválasztásával megkaphatjuk két molekula közötti kölcsönhatás asszociációs 68
(ka) és disszociációs (kd) sebességi állandóját, melyeknek hányadosa valós idejű disszociációs állandót (KD) szolgáltat. A KD ettől függetlenül, emelkedő koncentrációjú ligand alkalmazása során kapott maximális rezonanciaváltozásokból is számolható. Laboratóriumunkban
az
SPR-méréseket
sikerrel
alkalmaztuk
fehérje-fehérje
kölcsönhatások mellett fehérje-kismolekula kölcsönhatások tanulmányozására. Így képesek voltunk jellemezni a Hsp90 oligovanadát- és a Hsp90 nukleotid-kötését. Az első esetben témavezetőm, a második esetben részben témavezetőm, részben én végeztem a méréseket. Az SPR-méréseket BIA-Core apparátuson, 5 ml/perc áramlási sebességgel, 25°C-on végeztük. A karboximetil-dextrán lapkák (Amersham Pharmacia Biotech, CM5, research grade) kötőhelyeit 200 mM 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimiddel és 50 mM Nhidroxi-szukcinimiddel aktiváltuk. A patkány máj Hsp90-et 30-60 mg/ml-es koncentrációban, 10 mM-os nátrium-formiát pufferben (pH 4) immobilizáltuk, majd a lapka fennmaradó reaktív csoportjait 1 M etanolamin.HCl pH 8.5-ös oldatával inaktiváltuk. Kísérleteink során 8-11 ng Hsp90/mm2 lapka felületi koncentrációval dolgoztunk (kb. 2 mM-os koncentráció), mely jó kompromisszum a megfelelő nagyságú jel elérése és a ligand szabad diffúziójának biztosítása, illetve újrakötésének meggátlása között. A kísérleteket alacsonyabb kötött Hsp90 mennyiségnél valamint 10 ml/perc áramlási sebességnél is megismételtük. A tanulmányozni kívánt ligandokat szűrt, gáztalanított futtató pufferben (10 mM Hepes, 150 mM KCl, 0,001% Tween-20, pH 7,4) oldottuk, a szenzorgramokat is ebben a pufferben vettük fel. A ligandok kötését Hsp90-et nem tartalmazó, de hasonlóan kezelt lapkákon is megvizsgáltuk, és ha ligand-mátrix kölcsönhatást találtunk, erre a(z általában elenyésző) háttérre korrigáltunk. A szenzorgramok kiértékelését BIA Evaluation Program 2.1 és 3.0 segítségével, egyszerű exponenciális kinetikai modellt alkalmazva végeztük. 4.3.3. 51V-NMR mérés A vanadát oligoanionok és a Hsp90 kölcsönhatás vizsgálatát dr. Radics Lajossal kollaborációban, az MTA Központi Kémiai Kutatóintézetében végeztem. A mérésekre egy Varian VXR-400 spektrométeren, pulzáló Fourier-transzformált metodika alkalmazásával került sor. A kémiai eltolódást VOCl3 standard-re (0 ppm) vonatkoztatva adtuk meg. A spektrumokat 25°C-on, 10 mm-es küvettákban, 3 ml-ben 50 mM Hepes, 0,1 mM EDTA, pH 7,4, 10% D2O pufferben vettük fel, 12 000 tranzienst (15 msec/tranziens) összegezve.
69
4.4. Sejtbiológiai, in vivo módszerek 4.4.1. Sejtkultúra A kísérleteink során használt Jurkat (J32) T-nyiroksejteket RPMI 1640 médiumban (Gibco) tenyésztettük, Mihály Katalin segítségével. A médium 10% magzati marha szérumot, 2 mM L-glutamint, valamint 100 U/ml penicillint és 100 mg/ml streptomycint tartalmazott. 4.4.2. A Hsp90 ATP-kötésének in situ vizsgálata A T-sejteket három óráig szérummentes médiumban 1,8 mM geldanamycinnel (Gibco), vagy DMSO-val előkezeltem majd PBS-ben mostam. Ezt követően 10 mM Hepes, 1 mM PMSF, 5 mg/ml leupeptin, 0,7 mg/ml pepsztatin A, pH 7,5 "lízis" pufferben gyengéden jégben pottereztem, centrifugáltam. A felülúszót Chelex-100 (Bio-Rad) gyantán bocsátottam át, majd 30 mg fehérjével 1 mM ATP regenerációs rendszer jelenlétében vagy anékül a 4.2.8. fejezetben leírtaknak megfelelően affinitáshasítást végeztem. A keletkezett fragmentumokat Westernblottal tettem láthatóvá. 4.4.3. A Hsp90-Hsp70 in vivo komplexének vizsgálata A T-sejteket három óráig szérummentes médiumban a jelzett anyagokkal vagy DMSOval kezeltem /1,8 mM geldanamycin (Gibco), 100 mM ciszplatin (Sigma), 25 mM Taxol (Sigma), 1 mM novobiocin (Sigma)/, majd PBS-ben mostam. Ezt követően 10 mM Hepes, 1 mM PMSF, 5 mg/ml leupeptin, 0,7 mg/ml pepsztatin A, pH 7,5 "lízis" pufferben gyengéden jégben pottereztem, centrifugáltam. A Hsp70-et az SPA-810 antitesttel (StressGen) immunprecipitáltam, háromszor mostam 50 mM KCl-dal kiegészített lízis pufferrel, végül SDS-gélelektroforézist követően anti-Hsp70 (SPA-810) és anti-Hsp90 (nyúl poliklonális, dr. Ichiro Yahara, Tokyo Metropolitan Inst. of Medical Science, Japán ajándéka) antitestekkel bottoltam. 4.4.4. Raf-1 és Lck aktivációjának és mennyiségének vizsgálata T-sejteken A Jurkat sejtek jelátviteli folyamatainak tanulmányozására a laboratóriumunkban korábban beállított (Schnaider és mtsai, 2000) módszereket alkalmaztuk. A kísérletekben diákkörösünk, Papp Dóra működött közre. A sejteket (2x106/ml) 12-16 óráig a jelzett anyagokkal kezeltük /1,8 mM geldanamycin (Gibco), 100 mM ciszplatin (Sigma), 1 mM
70
novobiocin (Sigma)/. Az utolsó négy órában a szérumot – a növekedési jelpálya kisebb alapaktivitása érdekében – megvontuk, majd a kezelést követően a sejteket 5 mg/ml OKT3 (CD3e-specifikus) antitesttel (Cilag GmbH) 10-30 percig stimuláltuk. A jéghideg PBS-sel mosott sejteket 25 mM Tris, 100 mM NaCl, 1% Brij98, 4 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM nátrium-vanadát, 10 mM nátrium-fluorid, 10 mM b-glicerofoszfát, 1 mM PMSF, 5 mg/ml leupeptin, 0,7 mg/ml pepsztatin A, pH 7,4 pufferben 30 percig 4°C-on lizáltuk, centrifugáltuk, fehérjemeghatározás után 30 mg-ot 7,5%-os SDS-gélre vittünk, végül anti-Raf-1 és anti-Lck antitestekkel (Santa Cruz Biotechnology) blottoltuk.
4.5. Általános analitikai módszerek 4.5.1. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) Kísérleteim során különböző elektroforetikus technikákat és gélméretet alkalmaztam. Leggyakrabban a fehérjéket denaturáló diszkontinuus 5-15%-os SDS-PAGE segítségével, Laemmli (1970) módszerét követve választottam el. A Hsp90 ATP-kötését és negyedleges szerkezetét 5-7%-os diszkontinuus natív gélen tanulmányoztam, azaz a Laemmli-protokoll puffereiből kihagytam az SDS-t és számos esetben a DTT-t. A Hsp90 ATP-kötését és negyedleges szerkezetét 5-7%-os kontinuus natív gélen, fiziológiás pH-n – pH 7,5-ös Hepesimidazol pufferben, McLellan (1982) módszere szerint is vizsgáltam. A Hsp90 permolibdát kötését denaturáló urea gélen bekövetkező mobilitás változással követtem. Ewbank és Creighton (1991) módszere szerint a natív gél szisztémától annyiban különbözik, hogy az elválasztó gélbe 8 M ureát polimerizálunk. A natív- és urea géleket 10 mA/gél konstans áramerősséggel, hidegszobában vagy aktív hűtéssel futtattam. 4.5.2. Western blot Az elektroforetikus elválasztás után immunoblottal detektáltam a Hsp90 oxidatív nukleotid-affinitáshasítása, illetve némely kísérletben a triptikus emésztés során keletkező fragmentumokat, a Jurkat sejtlizátumból kimutatandó fehérjéket, pl. Raf-1, Lck fehérjék, illetve a Hsp70-et és a Hsp90-et a Hsp70 immunprecipitátumában. Az elektroforézis befejeztével a fehérjéket félszáraz blotkészülékkel transzferáltam nitrocellulóz (TransBlot, Bio-Rad) vagy PVDF (ImmunBlot, Bio-Rad) membránra (a gél
71
méretétől és koncentrációjától függően 1-1,5 mA/cm2, 45-90 perc). A blotok kezelésének minden egyes lépése legalább 0,3 ml/cm2 TBS-T (20 mM Tris×HCl, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,6) pufferrel, szobahőmérsékleten történt. Az aspecifikus kötőhelyeket – az elsődleges antitestektől függően – 2% marha szérumalbuminnal vagy zselatinnal 60 percig blokkoltam. Az elsődleges antitesteket 1:1000 - 1:5000 hígításban szintén 60 percig alkalmaztam. A blotokat ezután 3x5-10 percig mostam, majd 1:2000 – 1:10000 arányban hígított peroxidáz-konjugált másodlagos antitesttel (DAKO) 30 percig inkubáltam. Alapos, 5x10 perces mosás után a reaktív fehérjéket kemilumineszcens kittel (Amershem Pharmacia Biotech illetve New England Nuclear) detektáltam, a gyártók utasításai alapján. 4.5.3. Fehérjekoncentráció meghatározás A fehérjekoncentrációt általában Bradford (1976) módszere szerint, Bio-Rad reagenssel, marha szérumalbumin standard-del határoztam meg. Ahol rendkívüli pontosság igényeltetett (pl. CD mérés), a koncentrációt Scopes (1974) módszere szerint mértem.
4.6. Bioinformatikai módszerek 4.6.1. Páros és többszörös szekvencia illesztés A Hsp90 fehérjék egymáshoz és más fehérjékhez történő illesztését, konzerváltságának vizsgálatát BLAST és psi-BLAST, valamint Clustal W programokkal végeztem. 4.6.2. A Hsp90 N-terminális g-foszfát kötőhelyének azonosítása A g-foszfát kötőhely azonosítása Rácz Attila diákkörös hallgatónk nevéhez fűződik. A Hsp90 N-terminális ATP g-foszfátját kötő szekvencia azonosítása során olyan konzervált bázikus aminosavakat kerestünk, melyeket megelőző globális másodlagos szerkezeti elrendeződés (szupermásodlagos szerkezet) megegyezik az ismert kristályszerkezetű, azonos ATP-kötő (GHKL) szupercsaládba tartozó giráz B és MutL fehérjékkel. Ennek megfelelően, először prokarióta (sp|P10413, sp|P46208), élesztő (sp|P02829), növényi (sp|P36181, sp|P33126), protozoon (tr|076257), gyümölcslégy (sp|P02828), szárnyas (sp|P11501) rágcsáló (sp|P34058, sp|P07901) és humán (sp|P07901, sp|P08238) Hsp90, valamint gyümölcslégy (tr|Q9V9D1) és humán (sp|Q12931) Trap1 szekvenciákat pásztáztunk
72
végig többszörös szekvencia illesztéssel, konzervált lizineket keresve a ClustalW 1.74 (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html) program segítségével, alapértelmezett paraméterekkel. Ezzel párhuzamosan, az élesztő, rágcsáló és humán Hsp90, továbbá az E. coli giráz B (sp|P06982) és MutL (sp|P23367) fehérjék szekvenciáit másodlagos szerkezet jóslásnak vetettük alá, Rost és Sander (1993, 1994) zseniális módszerét alkalmazva, a Predict Protein program (http://dodo.cpmc.columbia.edu/predictprotein/) alapértelmezett paramétereivel. A prediktált szerkezeti elemeket a már ismert kristályszerkezetekkel hasonlítottuk össze, a Protein Data Bank-ban elhelyezett koordinátákat felhasználva (MutL: 1BKN, giráz B: 1EI1, humán Hsp90a: 1YET). A módszer kiemelkedő predikciós pontosságát jelzik a rendkívül magas találati arányok: 81,6% a MutL, 71,3% a giráz B illetve 87,3% humán Hsp90a esetében (az átlagos másodlagos szerkezet jósló metódusok találati pontossága 60-70%). A g-foszfát kötőhely azonosítása végett kiválasztottuk azon szegmentumokat, melyek a konzervált Lys előtt 2-7 aminosavval Gln vagy Asn oldalláncot tartalmaznak, és a MutL és giráz B ismert g-foszfát kötőhelyétől kiindulva a kristályszerkezetek valamint az ATP-kötő konszenzus motívumok ismeretében (Dutta és Inouye, 2000), manuálisan illesztettük a Hsp90 szekvenciáját. A potenciális g-foszfát kötőhelyeket a másodlagos szerkezeti elemek illeszkedése szerint pontoztuk.
73
5. EREDMÉNYEK
5.1. A Hsp90 kölcsönhatása vanadát oligoanionokkal Az irodalmi áttekintésben is rámutattam, hogy az átmeneti fém anionok (molibdát, vanadát, wolframát) stabilizálják a Hsp90-nek kliensekkel (szteroid receptor, Nishigori és Toft, 1980; src, Hutchinson és mtsai, 1992) kialakított komplexét, mert meggátolják a p23 leválását (Sullivan és mtsai, 1997). Mindazonáltal az, hogy a stabilizátorok melyik fehérjéhez kötnek, ismeretlen volt egészen addig, amíg biofizikai módszerekkel nem bizonyítottuk, hogy molibdát és vanadát a tisztított Hsp90-ben konformáció-változást okoz (Csermely és mtsai, 1993). Mivel ebbe a munkába diákkörösként kapcsolódtam be, és a kísérleti munka más fázisaiban vettem részt, csak utalok az eredményekre, amelyek a mellékletként befűzött közleményben megtekinthetők. Doktoranduszi munkám egyik feladata az átmeneti fémek kötésének direkt bizonyítása, valamint – amennyiben lehetséges – a kötőhely(ek) feltérképezése volt. Fontosabb eredményeinket 1998-ban közöltük (Sőti és mtsai, 1998). A vanadát anionok koncentráció- és pH-függően oligomerizálnak (Csermely és mtsai, 1985; Sőti és mtsai, 1998). A dekavanadát anion csak savas pH-n keletkezik, a közeg neutralizálása után is stabil, ezért kétféle oldatot vagyunk képesek előállítani (részleteket a ld. Vizsgálati módszerek alatt): (1) monovanadát oldatot, melyben a koncentráció emelkedésével a tetravanadát lesz a domináns forma, dekavanadátot azonban 10 mM-os koncentrációban sem tartalmaz, ezért ezt az oldatot a továbbiakban oligovanadát oldatnak nevezem; (2) dekavanadát oldatot, mely a dekavanadáton kívül egyéb vanadátokat is tartalmaz. Tehát arra kerestünk választ, van-e stabil Hsp90-vanadát kölcsönhatás, és szelektív-e a kötés valamelyik oligomerre. A vanadát kötést két módszerrel vizsgáltuk, felületi plazmon rezonanciával (SPRrel) és mágneses magrezonancia spektroszkópiával (NMR-rel). 5.1.1. Immobilizált Hsp90 vanadát kötése Bár az SPR méréseket kiterjedten használják makromolekuláris kölcsönhatások jellemzésére, megfelelő körülmények között kismolekulák kötését is képes detektálni. Ekkor a törésmutató változását nemcsak maga a kötés, hanem változó mértékben a kötés következtében (pl. konformáció-változás folytán) létrejövő hidráltsági állapot változás, vagy az 74
oldat egyéb komponenseinek megkötése is létrehozhatja. Ezeket kihasználva és figyelembe véve vizsgálta témavezetőm, Csermely Péter a Hsp90 vanadát kötését. Az 5.1.1.A ábra 5 mM oligovanadát illetve 5 mM dekavanadát kötését mutatja az SPR lapkán immobilizált Hsp90hez. Az oligovanadátok kötésének látszólagos disszociációs konstansa a koncentráció függvényében nagyjából lineárisan növekedett (5.1.1.B ábra). Kézenfekvőnek látszik a magyarázat, hogy az 1-10 mM-os tartományban végig 1 mM körüli koncentrációt képviselő monovanadát nagyobb affinitású kötését a fokozatosan emelkedő koncentrációjú tetravanadát – az SPR-jelen nem megnyilvánuló kötése – kiszoríthatja. A dekavanadátra mutatott látszólagos KD a koncentrációtól nem (jelentősen) függött, 3,7 ± 0,9 mM-nak adódott (5.1.1.C ábra). Ez azzal magyarázható, hogy a dekavanadát oldatban a mono- és a dekavanadát koncentrációja az oldat koncentrációjától függetlenül közel egyenlő, azaz feltehetően a KD a
Rezonancia jel
dekavanadát kötésére utal.
Látszólagos KD (mM)
Idő (sec)
Vanadát monomer koncentráció (mM)
5.1.1. ábra A Hsp90-vanadát kölcsönhatás vizsgálata SPR-rel A, 5-5 mM oligovanadát (vonal) és dekavanadát (fekete háromszögek) Hsp90-kötésének SPRspektruma. B, a Hsp90-oligovanadát kölcsönhatás disszociációs állandójának vanadát koncentrációfüggése. C, a Hsp90-dekavanadát kölcsönhatás disszociációs állandójának vanadát koncentrációfüggése. A disszociációs állandókat az SPR-spektrumokból a Vizsgálati módszerek részben leírtaknak megfelelően számoltuk.
75
Ugyan a molibdát a vanadáthoz hasonló konformáció-változást hoz létre a Hsp90-ben (Csermely és mtsai, 1993), SPR-en még 10 mM-os koncentrációban sem adott jelet. Maga az SPR-jel sem feltétlenül a kötés eredményeképpen jön létre (ld. fent). Ezek alapján az SPR maximális rezonancia értékeiből sztöchiometriát számolni – bár az eredeti közleményben kellő diszkusszióval megtettük – merész próbálkozás, mely a valós értékeket nem biztos, hogy tükrözi. 5.1.2. A Hsp90 vanadát kötésének vizsgálata 51V-NMR-rel
Kémiai eltolódás (ppm)
5.1.2. ábra A Hsp90-vanadát kölcsönhatás vizsgálata 51V-NMR-rel A, 0,1-0,1 mM oligo- és dekavanadát NMR-spektruma. B, ugyanez 24 mM Hsp90 jelenlétében
Az SPR mérésekből nem derült ki egyértelműen, hogy a Hsp90 melyik vanadát oligomert részesíti előnyben. A vanadát különböző oligomer formái egymástól könnyen megkülönböztethető NMR spektrummal rendelkeznek (Csermely és mtsai, 1985), így a fehérjékhez való kötésük NMR-rel vizsgálható. Ennek reményében vettük fel az NMR76
spektrumokat dr. Radics Lajos (MTA Központi Kémiai Kutatóintézet) laboratóriumában. Az 5.1.2.A ábrán 0,1-0,1 mM oligo-és dekavanadát keverékének NMR-spektrumát mutatjuk be (utóbbi 1 mM monomer koncentrációnak felel meg). A dekavanadát jellegzetes hármas csúcsa -422, -496 és -513 ppm-nél tűnik fel, -558-nál a monovanadát jelenik meg, az alacsony koncentrációnál nyomokban jelenlevő tetravanadát -572 ppm-nél észlelhető. 24 mM Hsp90 jelenlétében a dekavanadát csúcsok amplitúdójának mintegy 60%-os csökkenését, valamint a csúcsok kiszélesedését figyelhetjük meg (5.1.2.B ábra). A mono- és tetravanadát csúcs amplitúdója három kísérlet közül csak egyben csökkent, kiszélesedés azonban ott sem jelentkezett. Hasonló eredményeket kaptunk oligovanadát és dekavanadát külön-külön, illetve más koncentrációban történő alkalmazásakor. A dekavanadát-jel szelektív változásának hátterében a kötött és szabad forma közötti gyors kicserélődés, illetve a koporsószerű polianion struktúra nagymérvű torzulása állhat (Rehder, 1982). Mindkét jelenség ok-okozati kapcsolatban van a dekavananadát kötésének alacsony affinitásával, amelyet az SPR-mérések során kaptunk. A monovanadát-jel változatlansága ezzel szemben a kompakt monovanadát kismérvű torzulásával, illetve a kötött és szabad forma lassú kicserélődésével magyarázható, amely tények indokolhatják az SPR mérések során kapott alacsonyabb KD-t. A Hsp90 divalens kationok kötésére képes (ld. Irodalmi áttekintés). Ennek ellenére kalcium- és magnézium-ionok nem gyakoroltak hatást az SPR- és NMR mérések eredményére. Bár a Hsp90 redukálja a citokróm c-t (Nardai és mtsai, 2000), vanadát-vanadil átalakulást kísérleteim során nem figyeltem meg. Kísérleteink tehát arról tanúskodnak, hogy a Hsp90 nem egyetlen, hanem többféle vanadát oligomerrel is kölcsönhatásba lép. Témavezetőm elvégezte különböző vanadát- és molibdátfüggő folyamatok Hill-analízisét, az ezekből nyert látszólagos Hill-koefficiensek minden esetben kisebbnek bizonyultak 1-nél, amely szintén alátámaszthatja megfigyeléseinket (ld. Sőti és mtsai, 1998).
5.2. A Hsp90 kölcsönhatása permolibdáttal Miután a vanadát-Hsp90 kölcsönhatást jellemeztük, érdeklődésünk a molibdát felé fordult, melyet a kísérleti munka során jóval gyakrabban használnak a Hsp90 komplexeinek 77
stabilizálására. A molibdát direkt kötését SPR-rel nem tudtuk demonstrálni, ezért megpróbáltam a Hsp90-et a molibdáttal kovalens komplexbe vinni. Azt használtam ki, hogy hidrogén-peroxid jelenlétében diperoxo-molibdát (a továbbiakban permolibdát) alakul ki (Mikalsen és Kaalhus, 1997), amely a szteroid receptor mobilitását megváltoztatja SDS-gélen (Meshinchi és mtsai, 1990). 5.2.1. A Hsp90 permolibdát-indukált kovalens módosítása A Hsp90-et molibdát és hidrogén-peroxid jelenlétében inkubálva még SDS-minigélen is érzékelhető mobilitás csökkenés mutatkozott, amely urea gélen még kifejezettebb volt (5.2.1.A és B ábra). A molibdáthoz hasonlóan más átmeneti fémek is alkotnak peroxo-komplexet (Li és mtsai, 1995), ennek ellenére sem pervanadát, sem perwolframát nem indukált mobilitás változást, és nem védte ki a permolibdát által létrehozott mobilitás változást (5.2.1.B ábra, nem bemutatott adat). Nukleotidok, geldanamycin és divalens kationok szintén hatástalannak bizonyultak, az egyetlen hatásos gátlószer a feleslegben adott DTT volt (5.2.1.A és B ábra, nem bemutatott adat), amiből – összhangban egyéb irodalmi adatokkal – arra következtettünk, hogy a Hsp90 szulfhidril-csoportjai képezik a permolibdát (és talán a molibdát, vanadát) támadáspontját (Meshinchi és mtsai, 1990; Li és mtsai, 1995; Mikalsen és Kaalhus, 1997).
A
B
SDS-PAGE
urea-PAGE
kDa 97 66 45 31 20 mM Na2MoO4 20 mM H2O2 Elõinkubálás
- + - + - - + + - - - -
+ + + + + + + + Mg ATP ADP DTT
- + -+ - -+ + - - - -
+
-
+
+ + + DTT VO4 VO4
5.2.1. ábra A Hsp90 permolibdát-indukált kovalens módosítása A, SDS-gél. B, urea-gél. Az előinkubálásnál a következő koncentrációkat alkalmaztam: Mg, 5; ATP, 2,5; ADP, 2,5; DTT, 100; vanadát (VO4), 1 mM
78
5.2.2. A Hsp90 permolibdát kötésének jellemzése
Hsp90 mobilitás változás (a maximális érték %-a)
Molibdát koncentráció (mM)
Hsp90 mobilitás változás (a maximális érték %-a)
H2O2 koncentráció (mM)
Idő (perc)
5.2.2. ábra A Hsp90 permolibdát kötésének jellemzése Mobilitás változás A, a molibdát koncentráció, B, a hidrogén-peroxid koncentráció, illetve C, az idő függvényében
A permolibdát-Hsp90 reakciót biokémiailag jellemeztük. A jelölés molibdát koncentráció függése kétfázisú kinetikát mutat. 1 mM-os koncentráció alatt a nagy affinitású reaktív csoportok telítődnek, amit enyhébb további mobilitás csökkenés követ (5.2.2.A ábra). Ezzel szemben még 50 mM hidrogén-peroxid sem hoz létre maximális mobilitás változást (5.2.2. B ábra). Nagyobb peroxid-koncentrációknal molibdén(III) képződött, amely a korrekt kiértékelést meggátolta. A fehérje kovalens módosítása gyakorlatilag húsz perc alatt végbemegy (5.2.2.C ábra).
79
5.2.3. A permolibdát-kötőhely térképezése
kD a 97 66 45 31 21 -
Na2MoO4+ H2O2
-
+
Tripszin (perc)
0
0
-
+
10 10
60
+ 60
5.2.3. ábra A Hsp90 permolibdát-kötőhelyének térképezése A permolibdát-kezelést követően a Hsp90-et a megadott ideig tripszinnel emésztettük, majd a fragmentumokat gélelektroforézissel és ezüstfestéssel tettük láthatóvá. A nyilak a módosult fragmentumokat mutatják
Abban a reményben, hogy konkrét molibdát-kötőhely(ek)et találunk, elvégeztük a kontroll és a permolibdát-kezelt Hsp90 triptikus emésztését (5.2.3. ábra). A kezelés hatására a 80 kDa-os (1-610. as), az 50 kDa-os (283-731. as) és a 33-37 kDa-os fragmentumok mutattak mobilitás változást. Utóbbiakról immunoblot analízis segítségével derítettük ki, hogy mindegyik tartalmazza a 408-413. as közötti régiót. Ezek alapján a permolibdát a középső doménen (290–610. as között) található reaktív csoportokat módosítja (v.ö. 2.4.1. ábra). Geldanamycin nem változtatta meg a hasítás kinetikáját, sem a fragmentumok módosítását (nem bemutatott adat). A tripszines hasítás utáni permolibdát kezelés szinte minden fragmentum mobilitását csökkentette, vagy a csökkenést még kifejezettebbé tette (nem bemutatott adat). A módosítás természetét jobban meg szerettük volna ismerni, ezért elvégeztünk néhány kísérletet, melyeknek itt csak az eredményét foglalom össze. Bár SDS-kezelés megnöveli a Hsp90 hozzáférhető SH csoportjainak számát (Nardai és mtsai, 2000), nem hozott létre
80
további mobilitás csökkenést. A Hsp90 két, középső doménből származó, reaktív SH-kat tartalmazó peptidje sem gátolta a jelölést, ámbár koncentrációjuk (1 mM alatt) nem volt elegendő a permolibdát (20 mM) hatásának teljes semlegesítéséhez. Más fehérjék módosítását is megvizsgáltuk. A permolibdát a Hsp70, a p23, és a redukált laktalbumin mobilitását csökkentette, ezzel szemben a szabad SH-kat nem tartalmazó marha szérum albuminra, az oxidált, illetve a karboximetilált laktalbuminra semmilyen hatást nem gyakorolt.
5.3. A Hsp90 kölcsönhatása ATP-vel A Hsp90 ATP-kötése (és ATPáz aktivitása) a fehérje legvitatottabb jellemzője (ld. Irodalmi áttekintés is). Témavezetőm kerek egy évtizede mutatta ki, hogy nagy tisztaságú Hsp90 ATP és GTP kötésére képes (Csermely és Kahn, 1991), amelyet az ATP-indukált konformáció változást jellemző közlemény követett (Csermely és mtsai, 1993). Ez utóbbi munkában diákkörösként két kísérlettel – a fehérje triptikus hozzáférhetőségének és detergens fázisszeparációjának vizsgálatával – én is részt vettem. Az azóta történtek mind a tudomány(terület), mind saját fejlődésem szempontjából érdekesek, ezért röviden beszámolok róluk. Az Orvosi Vegytani Intézetben 1994 októberében a Hsp90 és az ATP kölcsönhatásának jellemzésével, és a kötőhely azonosításával kezdtem foglalkozni. Több okból kifolyólag a sok elvégzett kísérlet nemhogy előrevitt volna, de értékelhető eredménnyel sem szolgált. A legfontosabb ok – most már látom – szakmai képzetlenségem, figyelmetlenségem és a minden eshetőséget tekintetbe vevő gondolkodás hiánya volt. A fenti legfontosabb okon túl ezért az azóta ismert N-terminális ATP-kötőhely szokatlan szerkezete (Prodromou és mtsai, 1997) és alacsony affinitása felelős. Ezzel magyarázható, hogy az ATP-kötés direkt kimutatására irányuló összes próbálkozás kudarcot vallott. A fluoreszcens és radioaktív ATP-analógok azért nem kötöttek a Hsp90-hez, mert a szubsztitúció vagy módosítás sztérikusan gátolta a Hsp90hez való kötést, illetve az általánosan alacsony affinitás miatt vagy lemostam a jelet, vagy a háttér nagyobb volt, mint a jel. Az "engedetlen" kötőhely még a szakma élvonalába tartozó kutatócsoportot is megtévesztette, akik egyébként először írták le a Hsp90 (ATP-független, passzív) chaperon aktivitását (Wiech és mtsai, 1992, Jakob és mtsai, 1995/a). Több alapos kísérlet elvégzése után egyértelműen cáfolták a Hsp90 ATP-kötését és a mi korábbi eredményeinket (Jakob és mtsai, 1996). A különböző helyeken szubsztituált ATP/GTP-
81
gyantákkal
ugyancsak
sztérikus
illetve
affinitásbeli
probléma
adódott.
Szakmai
figyelmetlenségemet legjobban az a példa illusztrálja, hogy miután 1995-ben a Hsp90 gfoszfát-kapcsolt ATP-Sepharose kötésénél az alapos mosás után minimális mennyiségű (10%) fehérjét találtam, elvetettem, mert a Hsp90 a Sepharose-hoz is kötött. Ezek után szomorúan tapasztaltam, hogy két évvel később David Toft laboratóriuma a Hsp90 g-foszfát-kapcsolt ATP-Sepharose kötését a fehérje ATP-kötésének első vitathatatlan biokémiai bizonyítékaként közölte (Grenert és mtsai, 1997), amelyet a tudományos közvélemény is eszerint idéz. Az ATP-kötés megkérdőjelezése egyértelművé tette, hogy csak a kötőhely megtalálása (ha létezik) adhat a kezünkbe olyan bizonyítékot, amellyel a kérdést megválaszolhatjuk. Már voltak erre irányuló, bíztató kísérleteim, amikor megjelent a Hsp90-ADP komplex kristályszerkezete (Prodromou és mtsai, 1997). Egyidejűleg kiderült, hogy a kötőhely geldanamycinnel gátolható (Stebbins és mtsai, 1997). Ekkor gyorsan leközöltük addigi – használható
–
eredményeinket,
és
egyéb
eredményeink
alapján
állva
óvatosan
megfogalmaztuk, hogy a Hsp90-nek egy másik ATP-kötőhelye is van (Sőti és Csermely, 1998). Az eltelt három évben számos in vitro, sőt in vivo kísérlet bizonyította az N-terminális ATP-kötőhely életfontosságát, én viszont már a C-terminális ATP-kötőhelyre koncentráltam. Kísérleteimet poszter formájában 2000 nyarán közzétettem (Sőti és Csermely, 2000) és megint olyan dolgon fáradoztam, mely itthon sokkal nagyobb erőfeszítésbe kerül, mint tőlünk Nyugatra. Miközben hazai N-terminális mikroszekvenálás és tömegspektrometriás analízis reményében együttműködést kerestünk, Len Neckers csoportja leközölte a Hsp90 C-terminális doménjének ATP-kötését (Marcu és mtsai, 2000/b). Ezek után megelégedve az addig kapott egyetlen szekvenciával, a közleményt ebben a formában adtuk le, amely leírja a Hsp90 két ATP-kötőhelye közötti kommunikációt (Sőti és mtsai, 2002). Az alábbiakban a nukleotidokkal kapcsolatos kísérletek eredményeit összegzem. 5.3.1. A Hsp90 [a-32P]ATP kötésének vizsgálata natív gélen
82
A
Coomassie
B
Autoradiogram
Coomassie Autoradiogram kDa
kDa
733 oligomerek
733 -
421 232 -
421 -
120 -
232 dimer
monomer
120 Ion:
60 -
Ca2+
Előinkubálás: -
Ion:
ATP ADP
-
ATP
ADP
Előinkubálás:
Mg2+ -
GA
-
GA
5.3.1. ábra A Hsp90 [a-32P]ATP-kötésének vizsgálata natív gélen A, diszkontinuus gél B, kontinuus gél. Az előinkubálásnál a következő koncentrációkat alkalmaztam: Mg, Ca, 5 mM; ATP, ADP, 10 mM; ,GA (geldanamycin), 36 mM
Megfelelően nagy radioaktivitással, és a gél futása után a fehérje triklórecetsavas kicsapásával a Hsp90 ATP-kötése megfigyelhető diszkontinuus natív gélen (5.3.1.A ábra). A kötés specificitását bizonyítja, hogy hideg ATP-vel és ADP-vel gátolható. A kísérletből látszik, hogy az N-terminális nukleotid-kötőhely ADP iránti 10-20-szoros affinitásának ellenére ADP kevésbé gátolja az [a-32P]ATP kötését, mint ATP (5.3.1.A ábra). Elkerülendő a diszkontinuus gél hirtelen pH-ugrásának és nagy ionerősségének hatását (műtermék), a kötést élettani ionerő és pH mellett, kontinuus gélen is megismételtük, és lényegében azonos eredményeket kaptunk. A kötés Mg2+ jelenlétében is reprodukálhatónak bizonyult, geldanamycin nem gátolta (5.3.1.B ábra), molibdát viszont enyhén gátolta (nem bemutatott adat). Rendkívül érdekes, hogy a kötést a feleslegben levő divalens kation gátolja, illetve az, hogy Mg2+-mal gyengébb a kölcsönhatás, mint Ca2+-mal, ami alátámasztja egyéb megfigyeléseinket (nem bemutataot adatok; Csermely és mtsai, 1993). A kísérlet arra is lehetőséget teremtett, hogy kiértékeljük, az ATP befolyásolja-e a Hsp90 oligomerizációját és előnyben részesíti-e valamelyik oligomer formát. Jelentős hatást nem tudtunk kimutatni (ld. Sőti és Csermely, 1998/a 1. táblázata), bár meg kell jegyeznem (mai tudásom birtokában), hogy a technika több okból sem alkalmas a fentiek vizsgálatára. Egyrészt mind az inkubáció alatt, mind az izotachoforézis során az ATP ADP-vé hidrolizálhat. Az elektroforézis során 83
pedig a fehérje alacsony affinitású oligomerjei és a fehérjéhez kötött nukleotid disszociál. A problémát ATP-regeneráló rendszer jelenlétében, valamilyen fehérje-keresztkötőt és az ATP UV-keresztkötését felhasználva lehetne megvizsgálni. Mindazonáltal a fenti kísérleti felállás újabb támpontot nyújtott a Hsp90 ATP-kötésére, és egy geldanamycinnel nem gátolható kötőhely létére. 5.3.2. A Hsp90 ATP kötésének vizsgálata SPR-rel Miután a Hsp90 vanadát kötését részint SPR segítségével demonstráltuk, megvizsgáltuk, jelentkezik-e ATP hatására rezonancia-változás. A 4 mM Ca2+- és Mg2+-ATP injektálása után kialakuló SPR-jelet szemlélteti az 5.3.2. ábra (Csermely Péter kísérlete). A Mg2+-ATP gyorsabb disszociációja megválaszolta, miért alacsonyabb az affinitása, mint a Ca2+-ATP-é
Rezonancia jel
(Csermely és mtsai, 1993).
Idő (sec)
5.3.2. ábra A Hsp90 ATP-kötésének vizsgálata SPR-rel 4 mM Ca2+- és Mg2+-ATP injektálása után kapott SPR-spektrum
A Hsp90-ATP kölcsönhatások Hill-analízise a kötőhelyek pozitív kooperációjára engedett következtetni (ld. Sőti és Csermely, 1998/a 2. táblázata). Egyéb korábbi kísérleteink nyomán kapott Hill-koefficiensek csak akkor voltak 1-nél nagyobbak (ami pozitív kooperációra utal), ha az ATP-t Mg2+-mal keláltuk. A jelenség egyik magyarázatául szolgálhat, hogy a Ca2+-ATP kizárólag az egyik kötőhelyre köt, a másik kötőhely üresen marad, így heterotipikus (ugyanazon alegység két különböző kötőhelye között) kölcsönhatás
84
nem jöhet létre. Ez az eredmény tehát felveti, hogy a Hsp90 két különböző nukleotidkötőhelye heterotipikus kapcsolatban van. 5.3.3. A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek kimutatása nukleotid-affinitáshasítással A Hsp90 N-terminális doménjét 1997-ben ADP-vel kristályosították (Prodromou és mtsai, 1997). Az is ismert volt, hogy az N-terminális nukleotid kötés befolyásolja a Cterminális konformációját és funkcióját (Grenert és mtsai, 1997), de a mikéntet homály fedte. A C-terminális nukleotid-kötőhely pedig – komoly bizonyíték híján – fantazmagóriának tűnt volna. Ezért elhatároztam, hogy a kérdéseket olyan oldatban történő kísérlettel válaszolom meg, amely helyspecifikus információt nyújt, ráadásul az egész fehérje-ATP kölcsönhatást jellemzi. A fehérjék ligand-kötőhelyeit feltérképezhetjük kémiai proteolízis segítségével, ahol a ligandot valamilyen módon komplexbe hozzuk egy redox-ingázásra képes fémionnal (pl. Fe3+«Fe2+ vagy Cu2+«Cu+). A kelált fém oxidációja hidroxilgyököket generál, amelyek rövid életidejük és hatótávolságuk következtében közvetlenül a kötőhelyen hasítják a polipeptidláncot. A reakciót először a kalmodulin trifluoperazin-kötőhelyének és a streptavidin biotin-kötőhelyének vizsgálatára használták, ahol a vasat illetve a rezet a ligandhoz kovalensen kapcsolt EDTA kelálta (Schepartz és Cuenoud, 1990; Hoyer és mtsai, 1990). Ennél jóval szerencsésebb a helyzet a divalens kation-ligand komplexet kötő fehérjék térképezésénél, hiszen itt a vasiont maga a ligand szállítja oda, minden külső beavatkozás nélkül. Ily módon tanulmányozták a NADP-specifikus izocitrát-dehidrogenáz izocitrát-kötőhelyét (Soundar és Colman, 1993), és a karbamoil-foszfát szintetáz ATPB-kötőhelyét (Alonso és Rubio, 1995). A kísérlet érdekessége és bizonyító ereje ellenére több irodalmi hivatkozást nem találtam. A reakció elve sematikusan az 5.3.3.A ábrán látható. (Az ábrán az is látszik, hogy valójában a vas-foszfátkötő szegmentumok térképezhetők.) Az ábra B részén egy oxidatív affinitáshasítás gélképe látható. A vas nukleotid hiányában is két specifikus (2. sáv), kalcium felesleggel gátolható fragmentumot generál, amely reményt ad arra, hogy feltérképezzük a Hsp90 divalens kation kötőhelyét (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). ADP és ATP hatására több hasítási termék keletkezik, melyek közül a legtömegesebb és mindkét esetben megjelenő egy 70 kDa-os fragmentum (5.3.3.B ábra, 3-4. sáv).
85
5.3.3. ábra A Hsp90 nukleotid-affinitáshasítása A, a reakció elve. A Hsp90 nukleotid-affinitáshasításának megjelenítése B, ezüstfestéssel, illetve Western-blottal, C, anti-C-terminális (K3725B) és D, anti-N-terminális (K41218) antitestekkel. Az ADP-t 0,2, az ATP-t 1 mM, a geldanamycint (GA) 36 mM-os koncentrációban alkalmaztam.
A kötőhely "ujjlenyomatát" anti-C- és anti-N-terminális Hsp90 elleni antitestekkel vettem le. A keletkező fragmentumokat az érintetlen C vagy N terminus és a látszólagos molekulatömeget jelentő szám kombinációjával jelöltem. Az N-terminális nukleotid kötés nyomán keletkező fragmentumok anti-C-terminális antitesttel váltak láthatóvá (5.3.3.C ábra). Míg ADP hatására a már fent megismert C70 fragmentum keletkezett, az ATP g-foszfátja további három fragmentumot eredményezett: a C73 (megegyezik az N73-mal, a K41218-as antitest epitopja miatt) és a C65 az N-terminális doménből (a kristályból már ismertek, ld. 6.2.1. fejezet), a C36 viszont a középső doménből – ez a kötőhely eddig ismeretlen volt. Kísérleti körülményeink között minden fragmentum a teljes fehérje egyszeri hasításával keletkezett, ezért a kinetikai hatás, mint a hasadási különbségek oka kizárhatók. Az affinitáshasítás specificitását számos kísérlettel bizonyítottam. Magnézium felesleg és SDS gátolta, a gyökfogó glicerin nem befolyásolta a hasítást. Geldanamycin hatására az Nterminális nukleotid-függő fragmentáció eltűnt (5.3.3.C ábra, 3-5. sáv), viszont geldanamycin és ATP egyidejű jelenlétében új fragmentumok – C31, N48 és N46 (5.3.3.C és D ábra) – tűntek fel. A kísérlettel oldatban, az egész fehérjén, telítő koncentrációjú geldanamycin jelenlétében sikerült helyspecifikus információt nyernem egy második ATP-kötőhelyről, amely igazolta a C-terminális kötőhely létére irányuló gyanúnkat. A kísérlet szerint a C-terminális 86
ATP-kötőhely csak akkor válik elérhetővé, ha az N-terminális nukleotid-kötőhely telített. Mivel az ATP először az N-terminális kötőhelyre köt be, annak elhasadása meggátolja a Cterminális nukleotid kötést. Nagymennyiségű fehérjét hasítva (illetve másik, érzékenyebb antitestet használva, ld. 5.3.6.3. ábra) még négy fragmentum jelent meg geldanamycin-ATPvel (C39, N42, N39, N38), de ATP-vel önmagában C-terminális hasadást nem láttam (nem bemutatott adat). Kísérleteink során a geldanamycint radicicollal, illetve az ATP-t ATPgS-sel helyettesítve hasonló eredményeket kaptam (nem bemutatott adatok). 5.3.4. A nukleotid-affinitáshasítás igazolása egyéb kísérletekkel Ugyan a fenti kísérletek alátámasztották a két kooperatív kötőhelyről alkotott hipotézisünket, eredményeinket igyekeztem más módszerekkel megerősíteni. A fent említett gfoszfát-kapcsolt ATP-Sepharose kötést beállítva tapasztaltam, hogy nagy koncentrációjú geldanamycin a gyantához való specifikus kötést csak 60%-ban gátolta (5.3.4.A ábra).
5.3.4. ábra A nukleotid-affinitáshasítás igazolása egyéb kísérletekkel A, g-foszfát-kapcsolt ATP-Sepharose kötés 5 mM ATP és 36 mM geldanamycin jelenlétében és anélkül. B, [a-32P]ATP fotoaffinitás jelölés gélképe és autoradiogramja. Alkalmazott koncentrációk: ATP, 10 mM; ADP, 5 mM; GA, 36mM, NB, 10 mM; molibdát (Mo), 20 mM; p23, 0,1 mg/ml. C, távoli ultraibolya tartományú CD-spektrum 1 mM ATP és 36 mM GA jelenlétében és anélkül.
87
Nukleotid fotoaffinitás jelöléssel szintén kimutatható a fehérje-ATP kölcsönhatás (Biswas és Kornberg, 1984). A radioaktív ATP-t tartalmazó fehérjeoldatot ultraibolya fénnyel besugároztam, minek hatására a puringyűrű fotolízise kovalens kötéseket hozott létre a kötőhely szomszédos oldalláncaival. A fehérjéhez kötött nukleotidot SDS-gélt követő autoradiográfiával tettem láthatóvá (5.3.4.B ábra). A keresztkötést hideg ATP és ADP, novobiocin és molibdát gátolta, geldanamycin ellenben szinte hatástalan volt (a geldanamycin fényérzékeny vegyület, de nem bomlott számottevően az ultraibolya besugárzás időtartama alatt). Ebben a kísérletben a Hsp90-partner p23 fehérje kissé gátolta az ATP kötést, viszont geldanamycin, amely elvileg gátolja a p23 Hsp90-hez való kötését (Sullivan és mtsai, 1997), nem módosította a p23 hatását. Az ATP-kötő szegmensek helyét triptikus hasítás után próbáltam meghatározni, de a jelölődés kicsi hatékonysága (a timinek jobban reagálnak, és nukleotidokat jóval könnyebb keresztkötni, mint fehérjéhez kötni) valamint a kötőhelyek alacsony affinitása lehetetlenné tette, hogy egyértelmű eredményeket kapjunk. Mivel a Hsp90 ATP hatására konformáció változást szenved (Csermely és mtsai, 1993), megvizsgáltam, hogy a távoli ultraibolya cirkuláris dikroizmus spektrum alapján megkülönböztethetőek-e a fehérje geldanamycin és geldanamycin-ATP jelenlétében mutatott konformációs állapotai (5.3.4.C ábra). Míg a kontroll és az ATP-s minták reprodukálták korábbi eredményeinket (Csermely és mtsai, 1993), geldanamycin jelenléte a kontrollal azonos spektrumot eredményezett, geldanamycin előinkubálás után adott ATP hatására az előbbiektől eltérő spektrumot kaptunk. A fehérje triptikus hozzáférhetősége geldanamycin hatására szintén változatlan volt (nem bemutatott adat), míg ATP elsősorban a fehérje C-terminális régióját védte meg (ld. Csermely és mtsai, 1993). Ezek alapján és a két nukleotid-kötőhely állapotát számba véve, a Hsp90-nek legalább három különböző konformációját különböztethetjük meg: az üres = geldanamycin = ADP/üres, az ATP/ATP, végül a geldanamycin = ADP/ATP állapotot (ahol a perjel előtt az N-terminális, a perjel után második a C-terminális kötőhely nukleotid-állapotát jelölöm). 5.3.5. Két eltérő ATP-kötőhely kimutatása nitrocellulóz filter kötéssel Miután a fenti kísérletek bizonyították egy geldanamycin-érzéketlen, alacsony affinitású, C-terminális
ATP-kötőhely
létezését,
a
két
kötőhely
kinetikai
paramétereit
és
sztöchiometriáját szerettem volna meghatározni. A klasszikus titrációs kísérleteknek (egyensúlyi dialízis, izotermális titrációs kalorimetria) nagy a hátterük, ezért vagy nagy affinitású kötést, vagy a KD-t meghaladó fehérjekoncentrációt igényelnek. A probléma 88
megoldásához olyan megközelítés szükségeltetett, ahol szelektíven a kötött nukleotid mennyiségét tudjuk mérni, ATP-analógok használatát kerülve (ezekről ugyanis vitázni lehet, hogy az ATP-t helyettesítik, vagy más kötési tulajdonságok határozzák meg a kötésüket, azaz kétségessé válnak a kinetikai paraméterek, szélsőséges esetben az, hogy a második kötőhely ATP-kötőhelyként működik-e). Bár újabb SPR-méréseim eredményéből lehetett következtetni egy geldanamycin/radicicol-érzéketlen kötőhelyre, valamint két különböző kötőhely kooperativitására, a sztöchiometria közvetlenül nem számítható (nem bemutatott adat). Megpróbáltam beállítani egy gyors centrifugás mikrogélszűrést, de a kötött és a szabad nukleotid nem vált el tökéletesen egymástól.
A
B
2 .0 H sp 9 0
1/kötött ATP/Hsp90 (m ol/mol)
kötö tt ATP/Hsp90 (mol/m ol)
R d /H sp 9 0 (C -te rm .) szá m íto tt N -t e rm .
1 .5
1 .0
0 .5
KD (mM)
Bmax (mol/mol)
Hsp90 (gátolatlan)
0.70
1.53
Rd/Hsp90 (C-term.)
6.61
0.87
számított N-term.
0.38
1.03
15
10
5
0
0 .0 0
5
10
-3
[ AT P] ( m M )
-1
1
1/[A TP ] (1/m M )
5.3.5. ábra A Hsp90 ATP-komplex nitrocellulóz filter kötése A, az ATP-kötés telítési görbéje 60 mM radicicol nélkül és jelenlétében. B, az adatok kettős reciprok ábrázolása, és a számított paraméterek.
Az ATP nitrocellulóz membrán kötést már sikeresen alkalmazták egy másik GHKLtípusú fehérje, az „illetlen-pár” (mismatch) hibajavító MutL esetében (Ban és mtsai, 1999). Szerencsés helyzetben voltam, hisz hasonló domén található a Hsp90-ben is, sőt, paramétereit ismerve, belső standard-ként hasznosíthattam. A slot-blot filtrációs kísérlet eredményeit az 5.3.5. ábra összegzi. A geldanamycinnél ötvenszer szorosabban kötő N-terminális antagonosta radicicol (Roe és mtsai, 1999) alkalmazása kizárja, hogy a nagy koncentrációjú ATP kiszorítja helyéről a gátlószert, és ezt értékelnénk C-terminális kötésként. A kontroll és radicicol jelenlétében mért kötés különbségéből számolhattam az N-terminális kötőhely telítési görbéjét és paramétereit, melyek gyönyörűen egybevágnak a korábbi kísérletekkel (Csermely és mtsai, 1993; Scheibel és mtsai, 1997, Prodromou és mtsai, 1997). A radicicol mellett (azaz az N-
89
terminális kötőhely ADP-állapotában) meghatározott KD pedig az affinitáshasítással kapott 1-2 mM-os érték közelébe esik, főleg, ha tekintetbe vesszük, hogy a mosás okozta hígulás folytán felülmérjük a KD-t. Egyelőre az N-terminális ATP-állapotában nem tudjuk a C-terminális kötőhely affinitását mérni, de elképzelhető, hogy eltér a most meghatározott értéktől. Összegezve, a fenti kísérlet bizonyítja, hogy a Hsp90 két ATP molekulát képes kötni, és a második kötőhely affinitása is a sejt ATP koncentrációjának tartományába esik. 5.3.6. A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek feltérképezése 5.3.6.1. Az N-terminális ATP-kötőhely azonosítása
PVDF
Élesztő Hsp82 kristályszerkezet
Szekvenálás
kDa 80
-
C70 GQFGVGFYSA 46.9 -
33.5 - ADP ATP
5.3.6.1. ábra
Az N-terminális ATP-kötőhely azonosítása Edman-degradációval
Az egyéb kísérletek fényében bizonyítottnak tekintettem, hogy az affinitás hasítás alkalmas
a
Hsp90
nukleotid-kötőhelyeinek
tanulmányozására,
ezért
kísérleteimet
kiterjesztettem a térképezés és a biokémiai jellemzés irányába. Kihasználtam, hogy a Cterminális fragmentumok N-terminálisa elárulja a kötő aminosav helyét, és a termékeket blotmembránról megpróbáltuk megszekvenálni (dr. Patthy András laboratóriumában, Gödöllői Biotechnológiai Központ). Sajnos ismételt próbálkozások után is csak a legnagyobb mennyiségben keletkező C70 szekvenciáját sikerült kideríteni (xFxVGFYxA; 5.3.6.1. ábra), amely a GHKL ATP-kötőhely rendkívül konzervált III. motívuma (Dutta és Inouye, 2000). Az élesztő Hsp82 kristályszerkezetében a megelőző
118
G lép kapcsolatba az ADP által koordinált
Mg2+-mal, a többi glicin pedig a foszfátokat köti, az a-t az élesztő Hsp82-ben, az a-t és a g-t a rokon MutL fehérjében (Ban és mtsai, 1999). Annak ellenére, hogy a többi fragmentum
90
szekvenálása sikertelen volt, bizonyítottam, hogy az affinitáshasítás a nukleotid-kötőhelyről egyszerűen, direkt információt képes nyújtani, ezért érdemes lenne más fehérjék esetén is felhasználni. 5.3.6.2. Az N-terminális g-foszfát-kötőhely predikciója
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90 ST Hsp90
--EEE----EEEEE--------HHHHHHHHHHHHHHHHH--------EEEEEE-------------EEEEEE---------------------------HHHHH -VKPAAHPVGTTLE146------KTEFNHIDEIIRRIALA181----DVTINLSHN192---------GKIVRQYRA201----------------------GQKERR -VTGETEKTGTMVR167--------EYEILAKRLRELSFL196----GVSIRLRDK207---------GKEDHFHY217-----------------------GI-KAF ---GEPMGRGTKVI186LHLKEDQTEYLEERRIKEIVKKHSQ211FIGYPITLFVEKE224RDKEVSDDEAEEKED239KEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEK -----------EEEEEEE----HHHHHHHHHHHHHHHHHHH------EEEEEEEE-----------HHHHHH---------------------------HHHHH ---------EEEEE-------HHHHHH-HHHHHHHHHHHH--------EEE-----/
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90
HHHH-------------HHHHHHH--------------------EEEEEEEE-----------EEEEEEE-----------------------------EEEEE LGAI215----------CGTAF-LEQ223-----------------ALAIEWQHGD233-------LTLRGWVAD242-----------------------EIQYCYV VEYL228----------NKNKTPIHP237-----------------NIFYFSTEKD247-------IGVEVALQW257-----------------------ENIYCFT KDGD272KKKKKKIKEKYIDQEELNK291TKPIWTRNPDDITNEEYGEFYKSLTND318WEDHLAVKHFSVEGQLEFRALLFVP343RRAPFDLFENRKKKNNIKLYV HHHH-------------HHHHHHH----------------HHHHHHHHHHHHH----------EEEEEEEEEEEEEEEEE-------HHHHHH-------EEEE
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90
E—EEE-----HHHHHHHHHHHHHHHH-------EEEEEE-------------------------------------------HHHHHHHHHHHHHHHH-----NGRMMR264—-DRLINHAIRQACEDKL280----AFVLYLEI294----DPHQVDVNVHPAKHE309-------------------RLVHDFIYQGVLSVLQ331---NNIPQR275—-GGTHLAGFRAAMTRTL292----IAVVSVKV326----PDPKFSSQTKDKLVS341-------------------SEVKSAVEQQMNELLA357---RRVFIM370DNCDDLIPEYLNFI384--------RGVVDSED392LPLNISREMLQQSKILKVI411RKNIVKKCLELFTELAEDKENYKKFYEQFSKNIKL446GIHE EEEEEE----HHHHHHHHHHHH------------EEE-----------HHHHHHHHHHHHHHHHhhHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH------
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90 ST Hsp90
--EEE----EEEEE--------HHHHHHHHHHHHHHHHH--------EEEEEE-------------EEEEEE---------------------------HHHHH -VKPAAHPVGTTLE146------KTEFNHIDEIIRRIALA181----DVTINLSHN192---------GKIVRQYRA201----------------------GQKERR -VTGETEKTGTMVR167--------EYEILAKRLRELSFL196----GVSIRLRDK207---------GKEDHFHY217-----------------------GI-KAF ---GEPMGRGTKVI186LHLKEDQTEYLEERRIKEIVKKHSQ211FIGYPITLFVEKE224RDKEVSDDEAEEKED239KEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEK -----------EEEEEEE----HHHHHHHHHHHHHHHHHHH------EEEEEEEE-----------HHHHHH---------------------------HHHHH ---------EEEEE-------HHHHHH-HHHHHHHHHHHH--------EEE-----/
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90
HHHH-------------HHHHHHH--------------------EEEEEEEE-----------EEEEEEE-----------------------------EEEEE LGAI215----------CGTAF-LEQ223-----------------ALAIEWQHGD233-------LTLRGWVAD242-----------------------EIQYCYE VEYL228----------NKNKTPIHP237-----------------NIFYFSTEKD247-------IGVEVALQW257-----------------------ENIYCFT KDGD272KKKKKKIKEKYIDQEELNKTK291PIWTRNPDDITNEEYGEFYKSLTND318WEDHLAVKHFSVEGQLEFRALLFVP343RRAPFDLFENRKKKNNIKLYV HHHH-------------HHHHHHH----------------HHHHHHHHHHHHH----------EEEEEEEEEEEEEEEEE-------HHHHHH-------EEEE
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90
E—EEE-----HHHHHHHHHHHHHHHH-------EEEEEE----------------------------------------------------------------NGRMMR264—-DRLINHAIRQACEDKL280----AFVLYLEI294-------------------------------------------DPHQVDVNVHPAKHE309-NNIPQR275—-GGTHLAGFRAAMTRTL292----IAVVSVKV326-------------------------------------------PDPKFSSQTKDKLVS341-RRVFIM370DNCDDLIPEYLNFI384--------RGVVDSED392LPLNISREMLQQSKILKVIRKNIVKKCLELFTELAEDKENYKKFYEQFSKNIKLGIHE450-EEEEEE----HHHHHHHHHHHH------------EEE-----------HHHHHHHHHHHHHHHHhhHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH--------
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90 ST Hsp90
--EEE------EEEEEE--------HHHHHHHHHHHHHHHHH--------EEEEEE----------EEEEEE------HHHHHHHHH----------HHHHHHH -VKPAAH--PVGT-TLE146------KTEFNHIDEIIRRIALA181----DVTINLSHN192------GKIVRQYRA201--QKERRLGAI215-------CGTAF-LE222 -VTGETE--KTGT-MVR167--------EYEILAKRLRELSFL196----GVSIRLRDK207------GKEDHFHY217---I-KAFVEYL228-------NKNKTPIH236 -YAWESSAGGGGSFTVR172TDTGEPMGRGTKVILHLKEDQTEYLEERRIKEIVKKHSQ211FI--------------GYPITLFVEKE224RDKEVSDDEAEEKED239 -EEEEE------EEEEE-------------EEEEEE---HHHHHHHHHHHHHHHHHHH--------------------EEEEEEEE-----------HHHHHH-EEEEE----------------------EEEEE-----HHHHHH-HHHHHHHHHHHH----------------------EEE-----/
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90
------------------------EEEEEEEE-------------EEEEEEE------------------EEEEEE—EE--E------HHHHHHHHHHHHHHHH------------------------QALAIEWQHGD233---------LTLRGWVAD242------------EIQYCYVNGRM262MR—----DRLINHAIRQACEDKL280 -----------------------PNIFYFSTEKD247---------IGVEVALQW257------------ENIYCFTNNIP273QR—----GGTHLAGFRAAMTRTL292 KEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKDGKK274KKKKIKEKYIDQEELNKTKPIWTRNPDDITNEEYGEFYKSLTN317DWEDHLAVKHFSVEGQLEFRALL340 ------------------------HHHHHHHH-------------HHHHHH---------------HHHHHHHHHHHHH---------EEEEEEEEEEEEEEEE
ST M,G MutL GyrB Hsp90 PP Hsp90
-------EEEEEE------------------------------HHHHHHHHHHHHHHHH---------AFVLYLEI294----DPHQVDVNVHPAKHE309------RLVHDFIYQGVLSVLQ331-------IAVVSVKV326----PDPKFSSQTKDKLVS341------SEVKSAVEQQMNELLA357-FVPRRAPFDLFENR354-------KKKNNIKLYVRR366VFIMDNCEELIPEYLNFIRGVVDS389 EE-----HHHHHH----------------EEEEEEEEEEEE—-HHHHHHHHHHHH--EEE---
Illeszkedő másodlagos szerkezeti elemek aminosavainak összege: 89/111 (80%) Lehetséges N-terminális g-foszfát-kötőhely: MutL VNVHPAKHE309 GyrB SQTKDKLVS341 Hsp90 QQSKILKVI411
Illeszkedő másodlagos szerkezeti elemek aminosavainak összege: 73/95 (77%) Lehetséges N-terminális g-foszfát-kötőhely: MutL VNVHPAKHE309 GyrB SQTKDKLVS341 Hsp90 KNIKLGIHE450
Illeszkedő másodlagos szerkezeti elemek aminosavainak összege: 29/116 (25%) Lehetséges N-terminális g-foszfát-kötőhely: MutL VNVHPAKHE309 GyrB SQTKDKLVS341 Hsp90 NNIKLYVRR366
5.3.6.2. ábra Az N-terminális g-foszfát-kötőhely predikciója A részleteket ld. a Vizsgálati módszerek alatt. ST M, G, a MutL és a giráz B konszenzus kristályszerkezete, ST Hsp90, a Hsp90 kristályszerkezete, MutL, GyrB, Hsp90, a fehérjék aminosavsorrendje, PP Hsp90, a Hsp90 jósolt másodlagos szerkezete
A Hsp90 ATP- és ADP-indukálta funkcionális állapota jelentősen különbözik, és az egész fehérjére kiterjed (ld. Irodalmi áttekintés). Mivel az N-terminális ATP kötés (szemben az ADP-vel) okoz mélyreható szerkezeti változást, feltehető, hogy a középső domén g-foszfátkötőhelye játszik szerepet a jelátvitelben, a giráz és a MutL fehérjékhez hasonlóan. A gfoszfát-kötőhely feltérképezésével kapcsolatos bioinformatikai munka diákkörösünk, Rácz Attila képességeit és szorgalmát dicséri. A g-foszfát-kötőhelyet először a giráz B, a MutL és a Hsp90 szekvencia illesztésével próbáltuk megtalálni, de az alacsony szekvencia hasonlóság 91
lehetetlenné tette bármely motívum felismerését. Ekkor eszembe jutott Burkhard Rost és Chris Sander (Rost és Sander, 1994) zseniális mondata, miszerint "nem önmagában a szekvencia, hanem a (harmadlagos) szerkezet homológiája biztosítja a hasonló működést". A harmadlagos szerkezet hasonlósága a másodlagos szerkezeti elemek egymás utáni sorrendjének hasonlósága. Mivel a GHKL-domén térszerkezete a család tagjaiban szinte változatlan (Dutta és Inouye, 2000), ezért feltehetően a fehérjék – és a Hsp90 – másodlagos szerkezeti elemeinek eloszlása is azonos. A lehetséges konzervatív konszenzus szekvenciákat (N/Qx2-7K/R, Dutta és Inouye, 2000) a Hsp90-ben megkerestük, és elneveztük GHKL V. motívumnak (ld. Irodalmi áttekintés, Vizsgálati módszerek). A Hsp90 másodlagos szerkezetét nagy pontossággal megjósoltuk, majd a lehetséges V. motívumoknál illesztettük a Hsp90-et a kristályból ismert motívummal rendelkező giráz B és MutL fehérjékhez (5.3.6.2. ábra). Az illesztett másodlagos szerkezeti elemek pontszáma alapján a g-foszfát-kötőhely feltételezhető helye a ~400-as régió szegmense (5.3.6.2. ábra felül). További
független
bizonyítékként
könyvelhető
el,
hogy
a
tágabb
Hsp90
szupercsaládban, belevéve a mitokondriális homológ Trap1 és a prokarióta HtpG fehérjéket is, csak a ~400-as régió szegmense konzervált. Érdekes módon ebben a szegmensben két lehetséges katalitikus motívum is található:
404
QxK/Qx4K - Hsp90, Qx5R HtpG és Trap1,
illetve NxxR, összes Hsp90. Azt, hogy melyik a tényleges g-foszfát-kötőhely, a szekvenáláson túl affinitás-jelöléssel, mutációs ATPáz kísérletekkel vagy kristályosítással lehet bizonyosan eldönteni. 5.3.6.3. A foszfát-kötőhelyek behatárolása epitop térképezéssel Kísérletesen is megpróbáltam megtámogatni a fenti elméleti eredményeket; ugyanazt a blotot hívtuk elő az LKVIRK és az anti-C-terminális antitesttel. Az LKVIRK antitest epitopja pont ez a régió (408. aminosav). Mivel az antitest felismerte a C36 fragmentumot (5.3.6.3.A ábra, ATP), ennek a C-terminális terméknek még tartalmaznia kell az epitopot, a Johannes Buchner által javasolt foszfát-kötőhely, a
359
NiK (5.3.6.2. ábra alul), ez alapján is
kizárhatónak bizonyult. A fragmentumok hasítási helyét nagy pontossággal a Hsp90 ismert triptikus fragmentumaira történő kalibrációval is megállapítottam (5.3.6.3.B ábra; ld. Vizsgálati módszerek). Elméleti és kísérletes eredmények alapján a g-foszfát-kötőhely a 403
QQsKilK vagy a 396NisR motívum lehet.
92
A
kDa aCterm.
aNterm.
LKVIRK
B aN
80 -
46.9 -
- N39 - N38
- C36 -
33.5 ATP GA+ ATP
ATP GA+ ATP
aC
0 731 fragmentum (as): C39 (365) C36 (392) N38 (360) N39 (390) N42 (422) N46 (448)
- N46 - N42 -
- C39 -
LKVIRK
ATP GA+ ATP
N-terminális g-foszfát kötő szegmentum:
365-392. as
C-terminális foszfát kötő szegmentumok:
360-448. as
5.3.6.3. ábra Az ATP-foszfát-kötőhelyek behatárolása epitop térképezéssel A, az affinitáshasítás és gélelektroforézis után blotmembránra transzferáltam a fragmentumokat, majd a membránt egymás után blotoltam anti-C-terminális (K3725B), LKVIRK és anti-N-terminális (PA3-012) antitestekkel. B, a foszfát-kötőhelyek elhelyezkedése a Hsp90-en.
Ugyanezt a kísérleti felállást használtam a C-terminális ATP foszfát-kötőhely hasítási helyeinek meghatározására: a blotot anti-N-terminális és LKVIRK antitesttel hívtuk elő (5.3.6.3.A ábra, GA+ATP). A kezdetben (5.3.3.3.C ábra) használt ab-reaktív K41218-as antitest helyett az érzékenyebb, b-izoforma specifikus PA3-012-t használtam N-terminális antitestként. Ennek megfelelően az ott feltűnő N48 (Hsp90a) megfelelője az N46 a Hsp90bban. Az érzékenyebb antitest három új fragmentumot (N42, N39, N38) is felismert, amelyek közül az LKVIRK csak az N42-vel reagált. A pontos méret meghatározás elárulta, hogy a Cterminális foszfát-kötőhely a 400±50 aminosavas régióban helyezkedik el (5.3.6.3.B ábra). A dolog legérdekesebb vonatkozása, hogy az N-terminális g-foszfát-kötőhely és a C-terminális foszfát-kötőhelyek az elsődleges szekvenciában átfednek, ami a harmadlagos szerkezet szintjén jelenthet (befolyásoló) közelséget, vagy egymást kizáró átfedést. Marcu és mtsai (2000/b) kísérleteiben a D660-680 mutáns nem kötött a g-foszfátkapcsolt ATP-Sepharose-hoz, ezért ők ide tették az ATP-kötőhelyet. Kísérleteim során a 664680 epitopot felismerő AC88 antitest (Hartson és mtsai, 1999) gátolta az geldanamycin és ATP egyidejű jelenlétében bekövetkező hasítást, megerősítve eredményeiket (nem bemutatott adat). Feltételezéseink szerint ez a szegmens kötheti a purin gyűrűt. 5.3.7. A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek gátolhatósága Míg a Hsp90 N-terminális nukleotid-kötőhelyét geldanamycin gátolja, Marcu és mtsai (2000/b) kísérleteiben a C-terminális domén ATP-Sepharose kötését novobiocin kivédte. 93
Előző tanulmányukban novobiocin a teljes fehérje geldanamycin- és radicicol -gyantához való kötését is gátolta, ugyanakkor geldanamycin vagy radicicol nem hatott a novobiocin-Sepharose kötésre (Marcu és mtsai, 2000/a). Ebből két dologra következtettünk; egyrészt, hogy geldanamycin
nem
gátolja
a
C-terminális
nukleotid-kötőhelyet,
amiről
már
megbizonyosodtunk. Másrészt, novobiocin mindkét nukleotid-kötőhelyet gátolja, amit kísérletileg sikerült igazolnom, ugyanis novobiocin előinkubálás – geldanamycin nélkül és jelenlétében – kivédte az N- és C-terminális fragmentációt (5.3.7.A ábra). A novobiocin gátlás koncentráció-függéséből kiderül, hogy 1 mM-nál a C-terminális kötőhely már jelentősen gátolt, ugyanakkor az átfedő hatástartomány miatt a novobiocin nem C-terminális-szelektív gátlószer (5.3.7.B ábra).
A Gátlószerek: GA
NB
GA
CP
GA NB
80 -
N-terminális hasítás
46.9 -
ATP
C-terminális hasítás ktr
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
B N-terminális
ATP-függő hasítás (kontroll %-a)
100
C-terminális
50
0 -
1
10
-
2
10
100
CP koncentráció (mM)
NB koncentráció (mM)
5.3.7. ábra A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek gátolhatósága A, a Hsp90 ATP-affinitáshasításának gátlása. Az affinitáshasítást megelőzően a Hsp90-et 36 mM geldanamycin (GA), 10 mM novobiocin (NB), illetve 100 mM ciszplatin (CP) jelenlétében előinkubáltam. B, az affinitáshasítás novobiocin- és ciszplatin-koncentráció függése. A hasítás mértékét a C70-es (N-terminális) és az N46-os (C-terminális kötőhely) fragmentumok denzitometriás analízisével határoztam meg, és az ATP, illetve GA-ATP jelenlétében mért értékek százalékában adtam meg.
94
Annak reményében, hogy a C-terminális kötőhelyre szelektíven ható gátlószert találjak, számos vegyületet megvizsgáltam. Egyik reményteljes jelölt a ciszplatin [cisz-diamin-dikloroplatinum(II)], a Hsp90 C-terminálisához köt (aa. 693-731, Itoh és mtsai, 1999). 100 mM ciszplatin előinkubálás a C-terminális kötőhelyet gátolta (5.3.7.A ábra), az előtte adott novobiocin pedig a ciszplatin kötését is kivédte (5.3.7.A ábra), ami felveti, hogy a két antagonista azonos vagy átfedő kötőhelyen köt, mégis (hasonlóan a geldanamycin/ADP illetve ATP általi hatáshoz) eltérő hatást gyakorolnak az N-terminális ATP-kötőhelyre. Ez alapján feltételezhető, hogy a két nukleotid-kötőhely oda-vissza irányuló kommunikációt folytat. Kísérleteim során meglepődve tapasztaltam, hogy a Hsp90 g-foszfát kapcsolt ATPSepharose kötését geldanamycin jelenlétében az SH-tartalmú ditiotreitollal (DTT) gátolni tudtuk (nem bemutatott adat). DTT a C-terminális kötőhely affinitáshasítását is kivédte (nem bemutatott adat). Feltételezve, hogy a középső doménen elhelyezkedő reaktív ciszteinek valamelyike részt vesz az ATP kötésében, újabb kísérleteinkben vizsgáltam, a diaminodikloro-platinum transz izomerje (transzplatin) hogyan hat az ATP-kötésre. A transzplatin viselkedése teljesen egyezett a cisz izomerével, kizárólag a C-terminális kötőhelyet gátolta (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). Fenti eredményeink felvetik a lehetőségét, hogy a platinavegyületek a C-terminális ATP kötésében részt vevő SH-csoport(ok)kal képeznek adduktot, melynek bizonyítására további kísérleteket tervezünk. A tisztított patkány máj Hsp90(b)-n végzett kísérleteimet megismételtem humán rekombináns Hsp90a-val, amely a két kötőhely tulajdonságai és gátolhatósága tekintetében egybehangzó eredményeket hozott. 5.3.8. A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek tulajdonságai Korábbi eredmények alapján ismert volt, hogy a Hsp90 N-terminális doménje nem képes GTP kötésére (Grenert és mtsai, 1997), a teljes molekula viszont igen (Csermely és Kahn, 1991). A növényi Hsp90 homológ CTP-t és NAD-ot is képes kötni (Freitag és mtsai, 1997; Ouimet és Kapoor, 1999), továbbá a Hsp90 középső doménjén egy gyenge Rossmannszerkezet található (Callebaut és mtsai, 1994). Megvizsgálva a kötőhelyek nukleotid specificitását, azt tapasztaltuk, hogy az N-terminális kötőhely mindenféle adenin-nukleotid kötésére képes, beleértve a dATP-t, a NAD származékait és a bakteriális stressz-szignálként funkcionáló adenozin-alarmonokat (ld. irodalom, 5.3.8.A és B ábra). CTP (és UTP) kötése is megfigyelhető volt. Ezzel szemben a kötőhely guanin-nukleotid kötésére képtelen volt, ami a
95
puringyűrű N6-os kölcsönhatásaiból várható volt. A kötőhely affinitása élettani körülmények között feltehetően csak ATP és NAD kötését teszi lehetővé, melynek jelentősége ismeretlen. Az N-terminális kötőhely kedveli a hidrofób ATP-analógokat is (ld. 5.3.9.A ábra), amely a kötőhely hidrofób sajátságairól árulkodik.
A
N-terminális C-terminális
100
50
0
ATP
dATP
CTP
G TP
UTP
B GA - - - + - - + + - - + + - - + + - - + + NAD+ NADH+H+ NADP+ NADPH+H+ aC-term. At 80 -
aN-term. At 46.9 -
ATP
ktr
-
+ + - + - + - + - + - + - + - + - +
5.3.8. ábra A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek tulajdonságai A, az affinitáshasítás nukleotid-specificitása. A nukleotidokat 1 mM-os koncentrációban alkalmaztam, a hasítás mértékét az 5.3.7. ábránál leírt módon határoztam meg. B, nikotinamid-adenindinukleotidok hatása az affinitáshasításra. A reakciót 1-1 mM NAD-származékokkal hajtottam végre.
A C-terminális kötőhely szinte minden nukleotid, így GTP kötésére is képes (5.3.8.A ábra). Eredményeink megerősítik Marcu és mtsai (2000/b) ATP-Sepharose gyantával a trunkált C-terminális doménen végzett kísérleteit. Ezen túlmenően kimutattuk, hogy a Cterminális domén pirofoszfáttal is kölcsönhatásba lép, az ADP-hez hasonló fragmentációt idéz
96
elő (ld. 5.3.9.A ábra). A fragmentációt ATP részlegesen gátolja (5.3.9.A ábra). A C-terminális domén, meglepetésre, NAD-ot nem képes kötni, ami a Rossmann-gomboly klasszikus szerepe és részvétele ellen szól, és alátámasztja, hogy specifikus nukleotid-kötőhellyel állunk szemben (5.3.8.B ábra). A két ATP-kötőhely nukleotid-affinitás-gyantákkal történő vizsgálata megerősítette, hogy a C-terminális kötőhely szintén nem a szokványos kötőhelyek családjába tartozik (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények). A kötőhely széles szubsztrátspecificitásának és a teljes fehérjében mutatott alacsony affinitásának jelentősége egyelőre rejtett, vizsgálata további kísérleteket igényel. Nem szabad azonban megfeledkezni arról, hogy mi vagy az ADP-analóg geldanamycin, vagy rendkívül gyengén kötő ATP-analógok (ld. alább) jelenlétében tudjuk az affinitáshasítással kötőhelyspecifikusan mérni a C-terminális ATP-kötést. A valóságban N-terminálisan kötött ATP mellett volna szükséges a C-terminális affinitását meghatározni, de erre jelenleg csak nagyon zavaros, a két kötőhely összes kötését kiadó módszerek vannak, amit tetéz(nek) a rendkívül alacsony affinitás(ok). Ha csupán a nitrocellulóz filter kötést nézem, a gátolatlan Hsp90 ATPkötése nyugodtan bizonyulhat szigmoid görbének. Ennek ellenőrzésére rendkívül munka-és időigényes, sok pontból álló mérési sorozatot kéne lebonyolítani, ami végeredményben nem adna olyan információt, amit az eddigi mérésekből ne tudnánk vagy sejtenénk. A továbbiakban olyan
eredményekről
számolok
be,
melyek
alátámasztják
a
két
ATP-kötőhely
kommunikációját. 5.3.9. Az N- és C-terminális ATP-kötőhelyek kölcsönhatásai Mivel felmerült a két kötőhely kölcsönös egymásrahatásának lehetősége (ld. előző szekció), a kérdést más módokon is megvizsgáltam. Különböző ATP-analógok (orto-metilfluoreszcein-foszfát, Nardai és mtsai, 1996; fluoro-szulfonil-benzoil-adenozin) önmagukban nem okoztak semmiféle fragmentációt, ATP jelenlétében pedig csak a C-terminális kötőhelynek megfelelő hasítást láttuk (5.3.9.A ábra). Tehát a fenti analógok kötnek az Nterminális kötőhelyhez (viszont nem kötnek vas(II) iont) és hozzáférhetővé teszik a Cterminális kötőhelyet az ATP számára. Ebből arra következtettünk, hogy az N-terminális ADP (geldanamycin) és az ATP (analógok) egyaránt megnyitják a C-terminális kötőhelyet az ATP számára. A másik kísérletet a már elismert g-foszfát-kapcsolt ATP-Sepharose gyantával végeztem el, telítő koncentrációjú N-terminális gátlószer, geldanamycin nélkül és jelenlétében
97
5.3.9. ábra A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek kölcsönhatása A, ATP-analógok és pirofoszfát hatása az affinitáshasításra. Az orto-metil-fluoreszcein-foszfátot (OMFP) 30 mM-os, a pirofoszfátot (PPi) és a fluoro-szulfonil-benzoil-adenozint (FSBA) 1 mM-os koncentrációban alkalmaztam. B, kötőhelyspecifikus nukleotidok hatása a g-foszfát-kapcsolt ATPSepharose kötésre. Az ATP-t és a GTP-t 5 mM-os, az ADP-t 0,1 mM-os koncentrációban alkalmaztam.
(5.3.9.B ábra). A geldanamycin általi gátlás valószínűsítette, hogy a kontroll fehérje mindkét kötőhelyével köt a gyantához, és a két hely affinitása összemérhető. Mint már bemutattam, ATP gátolta az N- és C-terminális kötőhelyet, de ilyen körülmények között a Hsp90 Sepharose-hoz való kötése nem mosódott le teljesen. ADP az N-terminálist már telítő, a Cterminálishoz még nem kötő koncentrációban a geldanamycinhez hasonlóan gátolta a Cterminális kötőhelyet, önmagában viszont a C-terminális domént ATP-kötésre alkalmas konformációba hozta. 5 mM GTP geldanamycin jelenlétében majdnem teljesen gátolta az ATP-Sepharose kötést, önmagában, szemben a várt 34%-kal (a geldanamycin jelenlétében mért C-terminális kötés) 47%-os kötéscsökkenést okozott. Már láttuk, hogy egy C-terminális
98
gátlószer, a novobiocin negatívan hat az N-terminálisra, és a C-terminális támadáspontú molibdát is hasonló hatással rendelkezik. Összefoglalva, a C-terminális nukleotid kötést az Nterminális ATP vagy ADP megkötése teszi lehetővé, és a C-terminális ligand szintén (negatívan) visszahat az N-terminális kötőhelyre. 5.3.10. A p23 partnerfehérje hatása a Hsp90 ATP-kötésére Miután jellemeztem az ATP-kötőhelyeket, megvizsgáltam, hogy a Hsp90-szubsztrát fehérje kölcsönhatás hogyan hat a hasítási reakcióra. Számos hő- és kémiailag denaturált nemspecifikus szubsztrát (citrát szintáz, luciferáz, redukált inzulin) közül egy sem befolyásolta számottevően az N- és C-terminális hasítást (nem bemutatott adat).
5.3.10. ábra A p23 partnerfehérje hatása a Hsp90 ATP-kötésére Az affinitáshasítást 2 mg p23 fehérje és/vagy 20 mM nátrium-molibdát jelenlétében hajtottam végre. Az ATP-t 1 mM, az ADP-t geldanamycin nélkül 0,1 mM, geldanamycin jelenlétében 1 mM-os koncentrációban alkalmaztam.
A p23 kohort fehérje ATP-függő kölcsönhatása a Hsp90-nel in vitro (Sullivan és mtsai, 1997) és in vivo (Obermann és mtsai, 1998) is bizonyított. Az 5.3.10. ábra mutatja a p23 hatását a nukleotid-affinitáshasításra. A p23 gátolta az N-terminális hasítást (5. sáv, felső panel), miközben kis mértékben, de hasítást idézett elő a C-terminálison (5. sáv, alsó panel). Molibdát (a komplex stabilizálója) nem befolyásolta a p23-közvetítette hatást (7-8. sáv), de önmagában mindkét kötőhelyen csökkentette a hasítást (9-10. sáv), összhangban korábbi 99
eredményeinkkel (5.3.4.B ábra). Molibdát gátolta az ADP C-terminális kötését is, p23 nem befolyásolta az ADP-okozta hasítást (11-18. sáv). Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a p23 a Hsp90 chaperon-ciklusában konformáció-váltást segít elő: az Nterminálisan aktív ATP-kötött állapotból a C-terminálisan aktív ATP-kötésre képes állapotba. Ennek jelentősége a C-terminális kötőhely szerepének tisztázásáig ismeretlen. 5.3.11. Taxol megbontja az N-és C-terminális domén kommunikációját A két nukleotid-kötőhely kooperációját farmakológiás alapon meg lehetett bontani. 20 mM Taxol jelenlétében a C-terminális kötőhely az N-terminális nukleotid-állapotától függetlenül képessé vált ATP kötésére, ADP kötésére viszont nem. Taxol nem befolyásolta az N-terminális nukleotid-kötőhelyet (5.3.11. ábra). A Taxol hatása ciszplatinnal gátolhatónak bizonyult. Különböző sorrendben alkalmazva őket, a végső hatás mindig egyezett, ami azt bizonyítja, a Taxol és a ciszplatin nem versengenek a Hsp90 egyazon (vagy allosztérikus viszonyban levő két) kötőhelyéért. Novobiocin szintén gátolta a Taxol hatását (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények).
GA - aC-term. At 80 -
+ - + - + - + TX
TX
aN-term. At 46.9 -
ktr ATP konc. 1 mM
ADP 0,02 1 0,02 1 mM
5.3.11. ábra Taxol hatása a Hsp90 ATP-kötésére Az affinitáshasítást 20 mM Taxol jelenlétében hajtottam végre.
5.3.12. A Hsp90 nukleotid-kötésének meghatározása in situ Az általam alkalmazott Western-blot detektálás alkalmat nyújt arra, hogy a Hsp90 nukleotid-állapotát komplex elegyben, akár sejtes rendszerben is képesek legyünk követni,
100
amelynek
a
Hsp90-et
célzó
terápiás
beavatkozások
tekintetében
messze
vezető
következményei lehetnek. Az 5.3.12. ábra mutatja a kontroll és geldanamycin-kezelt Tsejtekből nyert lizátumok ATP-hasítási reakcióját. Jelenleg a sejtek feltárása nélküli, tényleges in vivo hasítási kísérleteket próbáljuk beállítani.
in situ
in vitro GA
aC-term. At
GA
80 -
aN-term. At
46.9 -
ktr ATP
ktr
- ATP
5.3.12. ábra A Hsp90 ATP-kötésének vizsgálata in situ Az affinitáshasítást a Vizsgálati módszerek alatt leírtaknak megfelelően hajtottam végre.
5.4. Ciszplatin (és Taxol) hatása a Hsp90 biológiai funkciójára A Hsp90 biológiai funkcióját jórészt fehérje-fehérje kapcsolatok kialakításán keresztül fejti ki. A foldoszóma partnereivel és klienseivel létrejövő kölcsönhatások ATP-igényesek. A ciszplatin gátolja a Hsp90 C-terminális ATP-kötőhelyét. Megvizsgáltuk tehát, milyen hatással van in vitro és in vivo a Hsp90-partner komplexekre, és befolyásolja-e a Hsp90 kliensfehérjék irányában kifejtett specifikus chaperon aktivitását. Eredményeinkből következtetetéseket reméltünk levonni a C-terminális nukleotid-kötőhely szerepére, gátolhatóságának és a ciszplatinnak esetleges terápiás hatására. A Hsp90 partnerei közül kiválasztottunk egy az Nterminális doménen és egy a C-terminális doménen kötő fehérjét, majd immunprecipitációs kísérletekben megvizsgáltuk, ciszplatin hogyan hat a komplexekre.
101
5.4.1. Ciszplatin hatása a Hsp90 N-terminális komplexének összeépülésére in vitro A p23 kötése teljes, dimer Hsp90 molekulát igényel, (N-terminális) ATP-kötött állapotban (Sullivan és mtsai, 1997; Prodromou és mtsai, 2000; Chadli és mtsai, 2000). Az Nterminális kötőhely gátlása ADP-vel, geldanamycinnel (Sullivan és mtsai, 1997) vagy novobiocinnal (Marcu és mtsai, 2000/b) szétszedi a komplexet. Kísérletünkben a komplex összeszerelését vizsgáltuk in vitro (5.4.1. ábra). A komplex csak ATP és molibdát, vagy ATPgS jelenlétében stabil és geldanamycin gátolja a kialakulását (Sullivan és mtsai, 1997). 100 mM ciszplatin sem a komplex kialakulását nem befolyásolta, sem a geldanamycin általi gátlásra nem hatott, újabb bizonyítékát adva annak, hogy a ciszplatin – a novobiocinnal ellentétben – nem befolyásolja az N-terminális domént és komplexét. Taxol a komplex kialakulására nem hatott (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények).
CP
CP+GA
nincs p23
GA
Hsp90 p23 ATP MoO4 ATPgS
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+ -
+
+ -
+
+ -
+
+ -
+
-
5.4.1. ábra Ciszplatin hatása a Hsp90-p23 komplex összeszerelésére in vitro A komplex összeépülését 18 mM GA és/vagy 100 mM CP jelenlétében vizsgáltam.
5.4.2. Ciszplatin hatása a Hsp90 C-terminális komplexének stabilitására in vivo Geldanamycin megállítja a glukokortikoid receptor érését félkész állapotban, és stabilizálja Hsp90 C-terminális komplexét a Hop-Hsp70 fehérjékkel (Morishima és mtsai, 2000), azaz a Hop-Hsp70 komplex a Hsp90 üres/ADP-kötött állapotára fogékony. A citoszolban a Hsp90 nagyrészt a Hop-pal és a Hsp70-nel preformált komplexben található. A Hsp90 és a Hsp70 Hop nélkül is keresztköthető, ami felveti a közvetlen kölcsönhatás lehetőségét (Murphy és mtsai, 2001). Novobiocin szétszedi a Hsp90-Hsp70 komplexet retikulocita lizátumban (Marcu és mtsai, 2000/b). Kísérleteinkben Jurkat-sejteket kezeltünk Hsp90-kötő vegyületekkel, majd gyengéd feltárás után immunoprecipitáltuk a Hsp70-et (5.4.2. ábra). Kontroll sejtekben a Hsp90 alig tűnt fel a komplexben, geldanamycin, ciszplatin és
102
Taxol elősegítette, míg novobiocin tejesen gátolta a komplex kialakulását, megerősítve a Neckers-labor in vitro eredményeit. Taxol a novobiocin hatását részlegesen kivédte, ami indirekt bizonyítékát adja annak, hogy a C-terminális ATP-kötőhely felelős a hatásokért.
ctr GA
CP NB
Tx
NB Tx
Hsp90 Hsp70
5.4.2. ábra Hsp90-ligandok hatása a Hsp90-Hsp70 komplexre in vivo A komplex stabilitását a Vizsgálati módszerek alatt leírtaknak megfelelően vizsgáltam.
5.4.3. Ciszplatin hatása a T-sejt-aktivációs jelpálya Hsp90-függő kinázaira in vivo
-
GA
CP TX
-
GA CP TX
Raf-1 OKT3, 20 perc
5.4.3. ábra Hsp90-ligandok hatása a Raf-1 kináz foszforilációjára in vivo A Raf-1 kináz foszforilációját a Vizsgálati módszerek alatt leírtaknak megfelelően vizsgáltuk.
A Hsp90 dajkája a Raf (Schulte és mtsai, 1996) és az Lck (Hartson és mtsai, 1996) kinázoknak. Barátom és kollégám, dr. Schnaider Tamás eredményei alapján vált ismeretessé, hogy geldanamycin hatására az Lck és Raf-1 kinázok T-sejtekben inaktiválódnak és lebomlanak, azaz a T-sejt-aktiváció elmarad (Schnaider és mtsai, 2000). Diákkörösünk, Papp Dóra elvégezte a T-sejtek ciszplatin kezelését, ennek hatására azonban egyik kináz sem mutatott mérhető változást (5.4.3. ábra, nem bemutatott adatok). Taxol a Raf-1 foszforilációjára nem hatott számottevően, viszont stabilitását jelentősen megnövelte (5.4.3. ábra, nem bemutatott adatok). Kísérleteink során a novobiocinnal kapott adatok a szer erős toxicitása miatt nem értékelhetőek (nem bemutatott adatok). A C-terminális ATP-kötőhely
103
szerepének és a ciszplatin terápiás jelentőségének felderítése más Hsp90-függő kliensek bevonását igényli. 5.4.4. Ciszplatin hatása a Hsp90-függő kliensfehérje renaturációjára in vitro
A
B
45
100
+A TP
Luciferáz renaturáció (ATP kontroll %-a)
Luciferáz renaturáció (natív kontroll %-a)
-ATP GA +ATP C P +ATP
30
15
0
CP TP
80 60 40 20 0
0
50
100
150
0
Idõ (perc)
100
200
300
400
500
Koncentráció (mM)
5.4.4. ábra Platinavegyületek hatása a luciferáz renaturációjára in vitro A luciferáz renaturációját a Vizsgálati módszerek alatt leírtaknak megfelelően vizsgáltuk. A, luciferáz renaturáció retikulocita lizátumban, geldanamycin és ciszplatin jelenlétében. B, luciferáz renaturáció a ciszplatin- (CP) és transzplatin- (TP) koncentráció függvényében. A pontok a háromórás enzimaktivitást mutatják a ATP-t tartalmazó lizátumhoz viszonyítva.
A denaturált luciferáz enzim felgombolyításában a Hsp70, Hsp40 fehérjék játszanak központi szerepet, a Hsp90 gyorsítja és javítja a chaperonkomplex működését (Schumacher és mtsai, 1996; Johnson és mtsai, 1998). A hődenaturált luciferáz renaturációját nyúl retikulocita lizátumban Rácz Attila tanulmányozta. Kísérleti körülményeink között a geldanamycin szinte teljesen gátolta a renaturációt, ami arra utal, hogy olyan úton gombolyodik vissza a luciferáz, amelyben a Hsp90 nélkülözhetetlen. 100 mM ciszplatin mintegy 70%-os gátlást fejtett ki (5.4.4.A ábra). Nagyobb koncentrációjú ciszplatin a folyamatot teljesen gátolta. Transzplatin, bár kisebb hatékonysággal, de a ciszplatinhoz hasonlóan viselkedett (5.4.4.B ábra), csakúgy, mint az ATP-hasításos kísérletek során. Eredményeink alapján nem zárható ki, hogy a platinavegyületek a lizátum más komponensét (is) gátolták. Ezeket tisztított fehérjékkel rekonstituált rendszerben és/vagy Hsp90-depletált lizátumban szerettük volna felülvizsgálni, de a kísérleteinkhez nélkülözhetetlen luminométer elromlott, így vizsgálatainkat csak a dolgozat benyújtása után tudjuk újraindítani.
104
6. AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE
Az elkövetkezendőkben összefoglalom a látszólag független kísérletsorozatok által kapott válaszokat, egyértelmű következtetéseket. Továbbá papírra vetem további, a kísérletek által nem teljesen vagy egyáltalán nem megerősített, de rendszerezett gondolatokat, kérdéseket. Ezek részben a kísérletek értékelése, mindennapos olvasmányélmények, másrészt az értekezés írásakor igényelt rátekintő, áttekintő, összefüggésekre érzékenyebb gondolkodás termékeny frigyéből születtek. Fő érdemük, hogy a kutatás további irányainak stabil kiindulási alapjaiként, vezérfonalaként szerepelnek. Végül felvázolom, a szerkezeti tulajdonságok hogyan állhatnak a Hsp90 dajkafehérje funkciójának szolgálatába.
6.1. A Hsp90 kölcsönhatása vanadáttal A molibdát és a vanadát élettani koncentrációja jóval alacsonyabb, mint amelyeket a Hsp90 in vitro kísérletei során alkalmaznak. Jelentőségüket viszont az adja, hogy bizonyos endogén stabilizátor(ok) hatását modellezik (Dahmer és mtsai, 1984, Hutchinson és mtsai, 1992). Ezért a molibdát és vanadát kötésének és kötőhelyének felfedése információt nyújt az endogén stabilizátor(ok) hatásmechanizmusáról, és hozzájárul a Hsp90 működésének megértéséhez. Kísérleteink során bizonyságot szereztünk arról, hogy a Hsp90 képes vanadátot kötni. A vanadátokkal kialakított kölcsönhatás arról is információt nyújtott, hogy a monomeren kívül többféle oligomer is képes a dajkafehérjével kölcsönhatásba lépni. 6.1.1. A Hsp90-oligovanadát kölcsönhatás lehetséges szerepe A monovanadát alacsony disszociációs konstansa (melyet az oldat egyéb oligomer tartalma folytán feltehetően túlbecsültünk) 0,8 mM körüli. Abban a koncentrációtartományban van, amely a Hsp90 konformáció változását létrehozza (Csermely és mtsai, 1993), gátolja a Hsp90 ATPáz aktivitását (Nardai és mtsai, 1996), amivel megszakítja a Hsp90 chaperon-ciklusát, ezért stabilizálja a dajkafehérje komplexeit (Hutchinson és mtsai, 1992, Sullivan és mtsai, 1997). Ezen felül a kísérletek nem olyan savas közegben folynak, ami lehetővé tenné számottevő mennyiségű dekavanadát képződését. Tehát feltehetően a monovanadát, mint egyfajta foszfát-analóg kötése a felelős a Hsp90 funkciójának gátlásáért. Hatásmechanizmusa valószínűleg az ATPáz aktivitás gátlása, amely felveti, hogy az endogén 105
stabilizátor(ok) is hasonlóan modulálják a Hsp90 chaperon-ciklusát. Érdekes gondolatokat vet fel, hogy az endogén stabilizátorok mennyisége növekszik-e, pl. hősokk során, miáltal stabilizálódhatnak a kliensek, így megmenekülnek az aggregációtól. Fontos, hogy a vanadát, molibdát (enyhén) oligomerizálja a Hsp90-et és ATP-kötését, turnoverét gátolja, azaz aktív chaperonból egyfajta (enyhe) passzív chaperonná alakítja. Ennél erőteljesebb hatást fejtenek ki a divalens kationok és a hő. 6.1.2. A Hsp90-dekavanadát kölcsönhatás lehetséges szerepe A dekavanadát polianionos struktúrája a monovanadáttól eltérően polifoszfátokhoz hasonlíthat, ami esetleg az ATP-ben, vagy az alarmonokban, de leginkább a DNS-ben fordul elő. A Hsp90 egy DNS-kötő fehérjekomplex része, és elképzelhető, hogy direktben köt DNS-t (Schnaider, 2000). Érdekes, hogy a DNS-kötést gátolja az LKVIRK antitest (Schnaider, 2000), illetve az N-terminális g-foszfát kötőhely is az LKVIRK régióba esik (Sőti és mtsai, 2002). Az is felmerül az emberben, hogy a töltött régió is hasonlíthat a DNS kettős hélixére (Binart és mtsai, 1989), mind a Hsp90 más részéhez, mind a glukokortikoid receptor DNS-kötő doménjéhez köthet (ld. Irodalmi áttekintés). A dekavanadát bármelyik kölcsönhatásba beleszólhat, így modulálhatja a két fehérje funkcióját, sőt akár a szteroid receptor DNSkötését.
6.2. A Hsp90 kölcsönhatása permolibdáttal 6.2.1. A permolibdát, mint molibdát analóg vagy SH-reagens Kísérleteink során közvetlen Hsp90-molibdát kölcsönhatást technikailag nem volt lehetséges kimutatnunk, de megfigyeltük, hogy a Hsp90 kovalens komplexet képez a permolibdáttal. A kísérletek kapcsán felmerülő legfontosabb kérdés, mennyiben tekinthető a permolibdát molibdát-analógnak. Jelen kísérleteink nyomán erre a kérdésre egyértelmű válasz nem adható. Egyrészt a jelölés már jóval a funkcionális kísérletekben hatásos 10-20 mM-os koncentráció alatt kifejezett, talán a görbe második szakasza képviseli a molibdát-kötőhelyet. A jelölés egyéb átmeneti fém-peroxidokkal nem kiváltható, sem nem gátolható. A hidrogénperoxid koncentrációfüggés is arra enged következtetni, hogy vannak még olyan csoportok a Hsp90-ben, melyek csak nagyobb peroxid-koncentráció esetén lépnek reakcióba. Ezek az eredmények mind azt sugallják, hogy a specifikus molibdát-kötőhely helyett a fehérje 106
szulfhidril-csoportjai módosulnak. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy a permolibdát más szabad SH csoportokkal rendelkező fehérjékkel is reakcióba lép. Számos érv szól amellett is, hogy a jelölésnek van valamiféle specificitása. Egyrészt SDS megnöveli a hozzáférhető SH-csoportok mennyiségét, mégsem fokozza a jelölést. Ugyanakkor az előzetes tripszines emésztés megnöveli a módosított fragmentumok számát. A kísérleteinkben felhasznált egyéb fehérjék mind reaktív SH-csoportokkal rendelkeznek. A Hsp70 több SH-csoportja az ATP-kötésében vesz részt (Liu és mtsai, 1996). A p23 reverzíbilis diszulfid-hidat alakít ki (Weaver és mtsai, 2000). A natív laktalbumin SH-i szintén diszulfidhidakat alkotnak, melyek esszenciálisak a fehérje korrekt felgombolyodásához (Ewbank és Creighton, 1991). Sajnos egyéb fehérjéket nem teszteltünk, pedig közelebb vihetett volna a probléma megválaszolásához. Az irodalmi adatok is azt bizonyítják, hogy a permolibdát a fehérjék különleges reaktivitású SH-csoportjaival reagál, így a glukokortikoid receptor hormonkötő régiójával (Meshinchi és mtsai, 1990) és a foszfotirozin-foszfatázok katalitikus SH-jával (Li és mtsai, 1995). 6.2.2. A Hsp90 reaktív SH-csoportjai Egyre inkább kezd kirajzolódni az a kép, hogy a reaktív SH-csoportok a Hsp90 működésében központi szerepet játszanak. A Hsp90 ugyan nem rendelkezik fehérje diszulfid izomeráz (PDI) aktivitással, de a citokróm c-t képes redukálni (Nardai és mtsai, 2000). Oxidatív körülmények (oxidált glutation) a Hsp90 passzív chaperon aktivitását gátolják (Nardai és mtsai, 2000). SH-reagensek (N-etil-maleimid, jódacetamid) teljesen gátolják a Hsp90 DNS-kötését (Schnaider, 2000). DTT gátolja a geldanamycinnek a Hsp90-re kifejtett hatását (Schneider és mtsai, 1996), és a Hsp90 C-terminális ATP-kötőhelyét (Sőti és mtsai, 2002). A Hsp90-komplexek molibdát általi stabilizálása lényegében a Hsp90 működésének (a kliens vagy kohort disszociációjának) gátlása (Hartson és mtsai, 1999; Young és Hartl, 2000). Molibdát szintén részlegesen gátolja a Hsp90 ATP-kötését (Sőti és mtsai, 2002). Az átmeneti fémek és az SH-reagensek által kifejtett gátlások átfedő spektruma azt a hipotézist veti fel, hogy a két ágens kötőhelye megegyezik, vagy átfed, azaz az átmeneti fémek kötésében vagy a kötés nyomán kialakuló funkcióváltozásban a Hsp90 SH-csoportjainak valamelyike is szerepet játszik. A Hsp90-ben az SH-k a középső doménen oszlanak el (ld. 2.4.1. ábra), és a módosult triptikus fragmentumok is innen származtak. Molibdát a 600. aminosav körüli triptikus hasítást
107
gátolja (Hartson és mtsai, 1999). A két független megközelítés révén kapott hasonló eredmény újfent megerősíti, hogy a molibdát-kötőhelye és/vagy az általa létrehozott hatás, illetve a permolibdát-módosítás helye megegyezik (vagy átfed). Annak eldöntésére, hogy a permolibdát ténylegesen a molibdát analógjaként viselkedik, további funkcionális kísérletek (pl. p23-Hsp90 komplex összeépítés, luciferáz renaturáció) adhatnak választ.
6.3. A Hsp90 kölcsönhatása ATP-vel A Hsp90 kötőhelyeiről natív gélen, SPR-rel és fluoreszcenciával (részben nem közölt eredmények) kapott eredmények birtokában olyan kísérleteket terveztem, melyek az alacsony affinitású kötőhelyekről élettani körülmények között, az eredeti oldatban nyújtanak felvilágosítást: a fotoaffinitás jelölés kovalens kötést hoz létre és a nukleotid-fehérje komplexet befagyasztja; az affinitáshasítás ujjlenyomatot vesz a nukleotid-kötőhelyekről. Bár kísérleteim egybehangzó eredményeket hoztak, kiegészítésképpen g-foszfát-kapcsolt ATPSepharose kötéssel is alátámasztottam őket. A két kötőhely direkt titrációs, kvantitatív jellemzésére újabb módszert, a nitrocellulóz filter kötést állítottam be, amely megerősítette a Hsp90 második, geldanamycin/radicicol-érzéketlen, élettanilag jelentős affinitású ATPkötőhelyének létezését. 6.3.1. Az N-terminális nukleotid-kötőhely A nukleotid-affinitáshasítás oldatban erősítette meg a kristályszerkezetből ismert Mg2+foszfát-kötő motívumok helyét. Szekvenálással azonosítottuk a C70-et GHKL III. motívumot (131GqfGvG), pontos molekulaméret meghatározás alapján a C73 megfelel az ATPáz aktivitásért felelős I. motívumnak (46ElisNssDA; Obermann és mtsai, 1999, Prodromou és mtsai, 1999), a C65 feltehetően a geldanamycin- és p23 kötésben is szerepet játszó IV. motívumnak felelhet meg (182GT; Grenert és mtsai, 1999). Az N-terminális domén kristályszerkezetében a g-foszfát nincs kihorgonyozva (Prodromou és mtsai, 1997), a kötőhely a család más fehérjében is a középső doménen helyezkedik el (Dutta és Inouye, 2000). Bioinformatikai elemzések, epitop térképezés, valamint ismert triptikus helyek hasításával keletkező és trunkált Hsp90 fehérjék mobilitásának segítségével pontosan meghatároztuk, hogy a g-foszfát-kötőhely a vagy
396
403
QQsKilK
NisR szekvenciára eshet, közvetlenül az LKVIRK, rendkívül konzervatív,
108
immunodomináns epitop szomszédságában, amelynek patogenetikai szerepe lehet az invazív kandidiázis kialakulásában (Matthews és mtsai, 1991). A fragmentumok mennyisége két dologtól függhet: a kötőhelyek polipeptidláncai és a hidroxilgyök redoxpotenciál-különbségétől, azaz a hidroxilgyökkel szembeni reaktivitásától, és a kötőhely Fe2+-foszfát iránt mutatott affinitásától. Legalábbis a C70-es fragmentum tekintetében az utóbbi dominál, hiszen a fragmentum mennyisége abszolút értékben is, arányában is tükrözte az ADP illetve az ATP iránti affinitást (5.3.3.B és C ábra, nem bemutatott adat). Az ATP gyengébben köti a fedél-régió szélén elhelyezkedő III. motívumot, aminek következménye lehet az átmeneti/gyenge N-terminális dimerizáció (Prodromou és mtsai 2000). Túlmenően a fedél záródásán, a fehérje egyéb részeinek átrendeződése (entrópia) szintén magyarázatául szolgál a tapasztalt gyenge kötésnek. Sőt, a fentiek alapján az I. és V. motívum gyenge kölcsönhatást alakít ki a g-foszfáttal, ami indokolja az ATPáz alacsony kcat értékét. Eredményeink felvetik, hogy az V. motívum a kulcsszerepet játszik az N-terminális ATP-kötésnek a C-terminális felé történő közvetítésében. Ennek in vivo bizonyítása g-foszfátkötőhely mutánsokat igényel, in vitro az LKVIRK antitest gátolhatja az ATP-kötést, ATPáz aktivitást és a p23 kötését. 6.3.2. A C-terminális nukleotid-kötőhely Marcu és mtsai (2000/b) deléciós és peptid-kompetíciós kísérlettel bizonyította, hogy a C-terminális ATP-kötőhely kialakításában a 666-679. aminosavak közötti szegmentum kulcsszerepet játszik. A régió egyébként a Hsp90 dimerizációjában is elengedhetetlen (Meng és mtsai, 1996; Owen és mtsai, 2002), és szükséges a(z N-terminális) ATPáz aktivitáshoz. A Hsp90 passzív chaperon aktivitásában is részt vesz (Ramsey és mtsai, 2000). Ezek a tulajdonságok kísértetiesen emlékeztetnek az N-terminális domén összefüggő ATP-kötő, dimerizációs és chaperon aktivitására, sőt itt a funkciók még szorosabb együttműködése valósulhat meg, rendkívül megnehezítve független vizsgálatukat. A C-terminális affinitáshasítást gátolni tudtuk az ezt a régiót felismerő AC88 antitesttel, ami megerősíti Marcu és mtsai (2000/b) eredményeit. A hidrofób régió a puringyűrűvel alakíthat ki van der Waals kölcsönhatásokat, míg a benne található töltött aminosavak ionpárokkal stabilizálhatják a kötést. A szegmentum az eukarióta Hsp90 fehérjék mindegyikében szinte változatlan, nem található meg a HtpG és Trap1 fehérjékben (6.3.2. ábra).
109
humán Hsp90a: humán Hsp90b: egér Hsp90b: paradicsom Hsc80: rizs Hsp82: élesztő Hsp82: humán Grp94: egér Grp94:
KNDKSVK660DLVILLYETALLSSGFSLEDP KNDKAVK652DLVVLLFETALLSSGFSLEDP KNDKAVK652DLVVLLFETALLSSGFSLEDP KNDKSVK632DLVLLLFETALLTSGFSLEEP KNDKSVK632DLVLLLFETALLTSGFSLEEP AQDKTVK641DLTKLLYETALLTSGFSLDEP EDDKTVL705DLAVVLFETATLRSGYLLPDT EDDKTVM712DLAVVLFETATLRSGYLLPDT
humán Hsp90a:
KNDKSVK660DLVILLYETALLSSGFSLEDP
6.3.2. ábra A Hsp90 fehérjecsalád feltételezett adeninkötő motívuma A hidrofil oldalláncokat dőlt, a töltötteket félkövér betűkkel, a konzervált aminosavakat kiemeléssel jelöltem.
Különböző ATP-gyantákkal végzett kísérleteink arra utalnak, hogy a C-terminális ATPkötőhely szintén nem klasszikus szerkezetű. Ezzel együtt a feltételezhető motívumok a Walker-típusokba is beleillhetnek (Csermely és Kahn, 1991). Ennél is érdekesebb a Cterminális ATP-kötőhely DTT-vel való gátolhatósága, amely a ciszplatinnal és transzplatinnal kapott eredményeinkkel együtt felvetheti az SH-csoportok aktív szerepét. Sokat ígérő az, hogy az átmenetifém-anionok szintén vonzódnak a ciszteinekhez, illetve az, hogy a Hsp90 permolibdát jelölését DTT-vel gátolni tudtuk. A kötésben szerepet játszó cisztein(ek) azonosítása fellebbentheti a fátylat a Hsp90 működésének műhelytitkairól. Megjegyzendő, hogy az élesztő Hsp82 (és Hsc82) nem tartalmaz egy ciszteint sem. Ez egybevághat azzal, hogy vannak olyan feladatok, melyeket csak a valódi szövetes élőlényekben kap meg a Hsp90, és amelyek a sejt túlélése szempontjából nem fontosak, a szervezet szempontjából azonban nagy fontossággal bírnak. Tudomásom szerint idáig senki nem vizsgálta, hogy pl. a progeszteron receptor felgombolyítását képes-e az élesztő Hsp82 segíteni. Az is elképzelhető, hogy a C-terminális nukleotid-kötőhely csak a „fejlettebb” Hsp90-ek sajátja, vagy talán nem is nukleotid-kötőhelyként funkcionál. Az élesztő Hsp82 ATP-kötését és ATPáz aktivitását Kalmár Éva doktoranduszunk a közeljövőben fogja tanulmányozni. Közleményünk megjelenése után egy francia kutatócsoport (Garnier és mtsai, 2002) megerősítette a Hsp90 C-terminális ATP-kötőhelyének létezését. Kísérleteikben izotermális titrációs kalorimetria és triptofán-fluoreszcencia alkalmazásával mutatták ki, hogy az ATP nagy affinitással köt a csirke Hsp90a 449-731-es C-terminális fragmentumához, melyhez a domén lassú átrendeződése szükséges. Direkt módszerrel az egész fehérjében nem tudták a C-
110
terminális ATP-kötést mérni (ld. lejjebb). A C-terminális ATP kötése gátolta a Hsp90 magnézium-indukálta oligomerizációját. Bár feltételezéseik szerint az ATP-t egy Rossmanngomboly kötné, kísérleteinkben a NAD és származékai nem kötöttek a C-terminális nukleotidkötőhelyre. 6.3.3. Az N- és C-terminális nukleotid-kötőhely kölcsönhatása Az N- és C-terminális domének kommunikációját több tanulmány felvetette (Scheibel és mtsai, 1999/b; Johnson és mtsai, 2000). Eredményeink szerint a teljes Hsp90-molekulában a C-terminális ATP-kötés feltételezi, hogy az N-terminális kötőhely nukleotidot (ATP-t vagy ADP-t) kössön. Ezzel ellentétben, ha a C-terminális kötőhely GTP-t vagy novobiocint – de nem, ha ciszplatint – köt, az gátolja az N-terminális domén ATP-kötését. Taxol a C-terminális kötőhelyet nukleotid-függetlenné teszi, felszabadítja az N-terminális domén konsititutív gátlása alól. Az izolált C-terminális domén az ATP-t 20-40 mikromólos KD-vel köti (Garnier és mtsai, 2002), ami még jobban kiemeli az N-terminális domén által (a töltött régión keresztül) rá kifejtett irdatlan mértékű gátlást. Feltételezhető, hogy a Hsp90 ATP-ciklusa során valamikor a C-terminális kötőhely a rá jellemző affinitással köthet ATP-t. A két nukleotid-kötőhely (g-)foszfát-kötőhelyeinek közelsége a kooperatív kölcsönhatás egyik molekuláris mechanizmusa lehet. A másik mechanizmust korábbi predikciós vizsgálataink valószínűsítették (Sőti és Csermely, 1998/a 3. ábrája). Már ekkor feltételeztük, hogy több Hsp90-függő folyamat (pl. p23-kötés, Sullivan és mtsai, 1997) azért igényel hosszabb ATP-előinkubációt 30°C-on, mert a Hsp90 C-terminális ATP-kötőhelye a töltött régió által lefedett, és az ionpároknak fel kell szakadnia. Azóta több kísérletes bizonyíték látott napvilágot, mely alátámasztja, hogy a töltött régió az N- és a C-terminális doménnel kölcsönhatásba lép: (1) Marcu és mtsai (2000/b) kísérleteiben a Hsp90 N-terminálisan trunkált mutánsai csak akkor kötöttek a g-foszfát-kapcsolt ATP-Sepharose-hoz, ha a töltött régió is hiányzott. Tehát a töltött régió folyamatos gátlást gyakorol a C-terminális ATP-kötő doménre. (2) A töltött régió jelenléte befolyásolja az N-terminális domén peptid- és nukleotidkötését (Scheibel és mtsai, 1999). (3) Radicicol erős kölcsönhatásba lép a Grp94 töltött régiójával (Schulte és mtsai, 1999). (4) Ciszplatin a C-terminális doménen kívül a töltött régió végéhez is köt (a 276. aminosavon túl; Itoh és mtsai, 1999). (5) A teljes hosszúságú Hsp90-en kívül, számos mutáns közül csak a töltött régión túl trunkált C-terminális domén aktív a Hsp90 ATPfüggő működését igénylő luciferáz renaturációs kísérletben (Johnson és mtsai, 2000).
111
[2’]
N
C
TX
TX
6.3.3.1. ábra A Hsp90-monomer ATPfüggő molekuláris kapcsolójának modellje
[1]
C C
N
töltött regió
MoO4, VO4
ATP hidrolízis és/vagy disszociáció
g-foszfát kötő régió ATP GA, NB
[3]
A töltött régiót fekete színnel, a(z átfedő) foszfátkötő motívumot hullámos mintázattal jelenítettem meg. A Hsp90-dimer másik tagjával kialakított kölcsönhatásokat nem tüntettem fel.
[2]
N
N ATP
ATP
N, C, N- és C-terminális domén; GA, geldanamycin; NB, novobiocin; CP, ciszplatin; MoO4, molibdát; VO4, vanadát; TX, Taxol.
ATP
C
ATP CP, NB
CC
Ezekből és saját kísérleti eredményeinkből a Hsp90 ATP-ciklusáról egy olyan modellt alkottunk, melyben a töltött régió molekuláris kapcsolóként működik (6.3.3.1. ábra). ATP hiányában a töltött régió lefedi a C-terminális ATP-kötőhelyet, vagy allosztérikusan gátolja az ATP-kötést [1] Az N-terminálisan kötő ATP felszabadítja a C-terminális domént a gátlás alól [2], és az megköti a második ATP-t [3], miközben a fehérje felveszi a zárt konformációt (Csermely és mtsai, 1993; Maruya és mtsai, 1999), amely kevésbé köt hidrofób felszínekhez, pl. fenil-Sepharose-hoz (Sullivan és mtsai, 1997). A kezdeti állapotot az ATP hidrolízise és/vagy felszabadulása állítja vissza. Taxol a két domén kommunikációját megbontja [2’]. Feltehetően a töltött régió foszforilációja minőségileg nem befolyásolja a molekuláris kapcsoló szerepet, hiszen a tisztított (foszforilált) patkány Hsp90-en túl a humán rekombináns (nem foszforilált) Hsp90a is hasonlóan működik (nem bemutatott adat). A modell körül több kérdés tisztázatlan, melyeket remélhetőleg a közeljövőben megválaszolhatunk. Ilyen pl., hogy az Nterminális ATP mikor hidrolizál, a második ATP-kötőhelynek van-e katalitikus aktivitása, illetve a kliens- és partnerfehérjék kötése és disszociációja hogyan kapcsolódik a ciklushoz. Sokatmondó, hogy a D660-680 Hsp90 elveszti az ATPáz aktivitását (Owen és mtsai, 2002), ami a két kötőhely kooperativitására enged következtetni. A régió dimerizációban játszott 112
szerepe, mint oki tényező, kizárható, hiszen az egyéb monomer mutánsok ATPáz aktivitása a legszélesebb skálán mozgott (ld. Irodalmi áttekintés, 2.6.1.4. táblázat).
N N 2 ADP
ADP ADP
2 ATP ATP ATP
C C
C C 2 ATP
2 ATP v. ADP+Pi ATP ATP ATP
ATP
ATP ATP
2 Pi
6.3.3.2. ábra A Hsp90-dimer ATP-függő molekuláris kapcsolójának modellje Az ATP-ciklus során bekövetkezhet a Hsp90-dimerek átmeneti szétesése.
Másik modellünk szerint a C-terminális ATP-kötőhelyet a Hsp90-dimer másik molekulájának homotop vagy heterotop része fedi le (6.3.3.2. ábra). Ezt úgy kívánjuk ellenőrizni, hogy a Hsp90 dimerizációjának disszociációs konstansa alatt vizsgáljuk az ATPkötést. Sajnos az eddigi kísérletek az öreg antitest gyenge reaktivitása miatt kudarcba fulladtak. Megfontolást érdemel, miszerint maga az N-terminális dimerizáció függesztené fel a C-terminális kötőhely gátlását. Bár ezt egyértelműen elvetni nem tudjuk, valójában csupán geldanamycin jelenlétében figyeltük meg az ATP-hasítást, a gyenge ATP-analógok kivételével. Mivel az ADP és a geldanamyicin nem vezet az N-terminális domének dimerizációjához, (Maruya és mtsai, 1999; Prodromou és mtsai, 2000), ezért az ATP-indukálta N-terminális dimerizáció valószínűleg nem előfeltétele a C-terminális ATP-kötésnek. Az is lehet, hogy az ATP hidrolízise nyomán válik a C-terminális kötőhely hozzáférhetővé. Mégis az a legvalószínűbb, hogy maga az N-terminális ATP megkötése nyitja meg a C-terminális kötőhelyet, amely így mintegy ezerszer szorosabban köthet ATP-t, mint az N-terminális ADP jelenlétében vagy nélkül (Garnier és mtsai, 2002). Ezeket a feltételezéseket a konstitutívan Nterminális dimer GST-fúziós Hsp90-konstrukciókkal, Kalmár Éva fogja ellenőrizni. A két modell egyfajta kombinációja is működhet, melyben a töltött régió a Hsp90-dimer másik feléből származik. A molekuláris fogó a topoizomerázok esetében is úgy működik, hogy
113
a C-terminálisan dimer fehérje N-terminális nyílásán keresztül belép a centrális üregbe a DNS. Az N-terminális ATP megkötése és az egyik(!) ATP hidrolízise vezet a C-terminális domének kinyílásához, és a DNS itt hagyja el az enzimet. A Hsp90 chaperon funkciójának hasonló lehet a molekuláris mechanizmusa. Mivel a kliensfehérjék aktivációjának pontos szabályozása tucatnyi
kochaperon
részvételét
követeli
meg,
továbbá
a
Hsp90-nek
két
aktív
szubsztrátkötőhelye van, ezért nem alaptalan feltételezni, hogy a kölcsönhatások a két funkcionális doménen kötő ATP molekulák révén külön-külön, de nem egymástól függetlenül szabályozódnak. A luciferáz renaturációban működő 449-731 és GST-449-731 mutáns az Nterminálison kötő p23-at is igénylő progeszteron receptort már nem tudta hormonkötő állapotba hozni (Chadli és mtsai, 2000), ami szintén a két domén koordinált együttműködését hangsúlyozza. A Hsp90 működésének molekuláris mechanizmusa természetesen a szakma élvonalát is élénken foglalkoztatja. 6.3.4. Párhuzamok a Hsp104-gyel A Hsp104-fehérjék az AAA-szupercsaládba tartoznak, a család tagjainak jellemzője az AAA- vagy Walker-típusú ATPáz domén. ATPáz aktivitásuk révén szerteágazó biológiai aktivitást fejtenek ki. Csak példaként: az NSF fehérje a vezikuláris fúzióban, a Hsp100fehérjék a termotoleranciában és az ATP-függő fehérje lebontás terén játszanak kulcsszerepet (összefoglalásul ld. Schirmer és mtsai, 1996; Vale, 2000). A Hsp100-család második osztályába tartozó fehérjék – ezidáig a dajkafehérjék körében egyedüliként – két ATPkötőhellyel rendelkeznek. Legismertebb képviselőjük az élesztő Hsp104, a termotolerancia, valamint a genetikai és fehérje-alapú (prion) információ kifejeződésének szabályozásában vesz részt. A Hsp90 és a Hsp140 nukleotidkötő tulajdonságainak összevetése lendületet adhat a további kutatásoknak. A Hsp104 és Hsp90 ATP-kötő tulajdonságait a 6.3.4. táblázatban, a legfrissebb eredmények alapján hasonlítottuk össze (Schirmer és mtsai, 1998; 2001; Hattendorf és Lindquist, 2002). Korábban azt gondolták, hogy a Hsp104 C-terminális doménje nem ATPáz, mert a Hsp90-éhez mérhető aktivitása az N-terminális 300-szoros értéke mögé rejtőzött. Lindquisték
legújabb
közleménye
a
két
nukleotid-kötőhely
és
ATPáz
független
tanulmányozásának nehézségeire hívja fel a figyelmet. A problémát ATP-kötésére képes, ATPáz aktivitással azonban nem rendelkező mutánsok segítségével szépen meg is oldja. A kötőhely-szelektív ATPáz mutációk nem érintették a másik kötőhely ATP-kötését.
114
Helyzetünkben is hasonló mutációkkal lehetne választ adni a két ATP-kötő domén közötti kommunikáció kérdésére. A Hsp104 analógiája jó kiindulási alapot teremthet az ATP-kötés kooperativitásának, az oligomerizációval való kapcsolatának további részletes kutatására. Az N-terminális ligandumok, mint a geldanamycin, az ADP (és talán az ATP, ld. Irodalmi áttekintés) gátolják a Hsp90 hő-indukált oligomerizációját (Chadli és mtsai, 1999). A C-terminálison kötő vagy a Cterminálison ható ligandumok, így a molibdát (Chadli és mtsai, 1999), és ciszplatin (nem bemutatott adat) elősegítik az oligomerizációt, amely azt sugallja, hogy a két nukleotidkötőhely ellentétesen hat a Hsp90 hő-indukált oligomerizációjára. A magnézium-indukált oligomerizációt a C-terminális ATP védi ki (Garnier és mtsai, 2002), ami aláhúzza, hogy a probléma összetett, és összefügg a két kötőhely ATP/ADP-állapotával, és ATPáz aktivitásával.
Tulajdonság
Hsp90
NKD típusa ligandumok KD (mM)
NKD1 GHKL ATP, ADP, CTP, NAD 0,1-0,4
NKD2 ? ATP, GTP 6.61; 0,0052
NKD1 Walker ATP, ADP, CTP, UTP 0,07
Hsp104 NKD2 Walker ATP, ? 0,05
ATPáz kcat (perc-1) KM (mM) modulátorok
igen 0,3-0,8 0,1-0,8 ?
?
igen 75 0,17 hő, ionerő, pH, etanol
igen 0,27 0,005 ?
Másik NKD ATPázra hat? Szerep a di/oligomerizációban Kooperativitás NKD-NKD kommunikáció
? ? ? erős
igen3 fontos ? ?
igen-nem4 elenyésző igen elenyésző
igen5 fontos igen erős
6.3.4. táblázat A Hsp90 és a Hsp104 nukleotidkötő tulajdonságainak összehasonlítása NKD, nukleotidkötő domén; 1radicicol jelenlétében a teljes fehérjén (Sőti és mtsai, 2002), illetve 2 az izolált C-terminális doménen (Garnier és mtsai, 2002) mért érték; 3a D664-680 mutáns nem mutat ATPáz aktivitást (Owen és mtsai, 2002); 4az NKD1 ATPáz mutáns serkenti az NKD2 ATPáz aktivitását; 5az NKD2 ATPáz mutáns gátolja az NKD1 ATPáz aktivitását (Hattendorf és Lindquist, 2002)
6.4. A ciszplatin lehetséges szerepe a Hsp90 működésében A ciszplatin az egyik legelterjedtebben használt kemoterápiás szer, kitűnő hatású a here, a petefészek, a hólyag és más parenchimás szervek daganatainál (Zamble és Lippard, 1995; Jamieson és Lippard, 1999; Jordan és Carmo-Fonseca, 2000). Elsődleges célpontja a DNS,
115
ahol mikromólos koncentrációban szálon belüli (főként ApG és GpG) és szálközti keresztkötéseket hoz létre, amely leállítja a replikációt, a transzkripciót és apoptózist okoz. Fehérjék nukleofil csoportjai szintén a szer célpontjai lehetnek. A hibajavító mechanizmusok, a transzkripciós aktivitás összezavarodása és bizonyos jelátviteli folyamatok felelősek a ciszplatin hatásaiért és a ciszplatin-rezisztenciáért (Zamble és Lippard, 1995; Jordan és Carmo-Fonseca, 2000). Más kemoterápiás szerektől (etopozid, doxorubicin, vincristin) eltérően, a sejtszintű stresszhatások érzékenyítik a sejteket a ciszplatin kezeléssel szemben (Mese és mtsai, 2001). Ugyanakkor a ciszplatin-érzékenység és a stresszfehérjék mennyisége között nem tudtak egyértelmű összefüggést kimutatni (Hettinga és mtsai, 1997), pl. a Hsp27 mennyisége növekedhet (Hettinga és mtsai, 1997) vagy csökkenhet (Yamamoto és mtsai, 2001) különböző ciszplatin-rezisztens sejtvonalakban, ami visszavezethető a rezisztencia mechanizmusának sokrétűségére. Kísérleteink először mutatták ki a ciszplatin és a Taxol különböző Hsp90-komplexekre kifejtett hatását, így elsőként szolgálnak funkcionális bizonyítékkal az N- és C-terminális ATP-kötőhely eltérő hatásáról. Eddigi kísérleteink alapján nem érdemes elhamarkodott következtetést levonni a C-terminális ATP-kötőhely biológiai szerepét illetően. A legérdekesebb talán, hogy a C-terminális kötőhely N-terminális domén-közvetítette gátlását felfüggesztő Taxol és a C-terminális kötőhelyet gátló ciszplatin p23- és Hsp70-komplexekre kifejtett hatása megegyezik, míg mindkettő élesen szembeállítható a novobiocin rombolásával. A komplexek és az ATP-kötések tekintetében megfigyelt hatások gyönyörűen korrelálnak.
Vegyület
N-term. hatás
C-term. hatás
Feltételezett hatásmechanizmus
ATP
p23
ATP
Hsp70
Geldanamycin
-
-
J
+
Ciszplatin
0
0
-
+
C-terminális ATP-agonista-antagonista (?)
Taxol
0
0
J
+
C-term. kötőhely függetlenítő, C-term. stabilizátor (?)
Novobiocin
-
-
-
-
C-és N-term. ATP-antagonista
N-term. ATP-antagonista, C-term. stabilizátor
6.4. táblázat A Hsp90-kötő vegyületek hatásai és hatásmechanizmusa 0, nem befolyásol, +, serkent, -, gátol, J, kiszabadítja a C-terminális kötőhelyet az N-terminális fogságából. A Taxol ATP-állapotot stabilizáló, valamint a ciszplatin ATP-agonista hatására a geldanamycin Hsp70-komplexre gyakorolt hatásából következettünk.
116
Ciszplatin nem befolyásolta az N-terminális Hsp90-p23 komplex kialakulását, és stabilizálta a C-terminális Hsp90-Hsp70 komplexet. Kizárólag ezek alapján nem tudjuk eldönteni, hogy a ciszplatin ATP-agonista vagy antagonista hatású, bár a C-terminális komplexet tekintve a geldanamycinhez és a Taxolhoz hasonlóan viselkedett. Ciszplatin nemcsak a Hsp90 passzív chaperon aktivitását gátolta (Itoh és mtsai, 1999), hanem eredményeink alapján a Hsp90 C-terminális ATP-kötését és aktív chaperon működését is. Ciszplatin nem befolyásolta két Hsp90-függő kináz, az Lck és a Raf-1 aktiválódását Tsejtekben. Ez a luciferázos kísérletekkel együtt arra utalhat, hogy a ciszplatin a geldanamycinnel szemben szelektívebb, vagy eltérő hatásspektrummal rendelkezik. A Hsp90 ciszplatinkötése szerepet játszhat a ciszplatin daganatellenes hatásaiban vagy a ciszplatinrezisztenciában. Ezek felderítése további kísérleteket igényel, amelyeket prof. Aszalos Adorjánnal együttműködésben Papp Dóra diákkörösünk laboratóriumunkban folytat.
6.5. Szerkezet-hatás összefüggések A fehérjéknél a szerkezet a biológiai funkció szolgálatában áll. Előbbi tanulmányozása fényt deríthet az utóbbira. Az átmenetifém-anionok stabilizáló hatása nyilvánvaló, de a háttérben meghúzódó mechanizmus nem teljesen ismert. Eben az esetben azért vizsgáltuk a szerkezeti alapokat, hogy a hatásmechanizmust magyarázhassuk. Eredményeink azt bizonyítják, hogy a vanadát és a molibdát a Hsp90-hez köt (Csermely és mtsai, 1993; Sőti és mtsai, 1998), és feltehetően gátolja ATPáz aktivitását (Nardai és mtsai, 1996). Ez utóbbi ellentétes az elfogadott nézettel, miszerint az ATP hidrolízise után stabilizálja a Hsp90 ATPállapotát (Sullivan és mtsai, 1997). A komplexek stabilizálásához viszont nem elegendő a molibdát és az ADP, ami fenti hipotézisünket támasztja alá. A stabilizáció mechanizmusa a két modellünk szerint vagy (1) az N-terminális dimerek szétesésének gátlása, vagy (2) a Hsp90 laza oligomerjeinek stabilizációja. Sokat segíthet, ha megvizsgáljuk a Hsp90 passzív chaperon aktivitását átmenetifém-anion jelenlétében is. ATP (és geldanamycin) disszociálja a szubsztrátot az izolált N-terminális doménről (Scheibel és mtsai, 1998), feltehetően a dimerizáció lefedi a kötőhelyet. Az első modell értelmében molibdátnak erősíteni kéne az önmagában vagy az ATP hatására bekövetkező szubsztrát disszociációt, azaz a chaperon aktivitást gátolná. Ellenkezőleg, amennyiben az oligomerizáció
117
stabilizációja serkenti a chaperon aktivitást, a molibdáttól a hőkezeléshez hasonló hatást várhatnánk. Természetesen mindkét eset igaznak bizonyulhat, a Hsp90 többféle chaperon- és molibdát/vanadát-kötőhelyeinek ismeretében. Az ATP Hsp90 működésében játszott szerepének titka a szerkezeti átmenetek lehetővé tétele. Az ATP-, ADP- és üres állapotok között az ATP-kötés/hidrolízis/ADP-leválás kapcsolgat. Ez a fluktuáció a Hsp90 (és más dajkafehérjék) chaperon mechanizmusának motorja. Ezért direkt hatástól függetlenül, bármilyen ATP-kötőhelyre ható vegyület, amely képes a Hsp90 ATP-ciklusát „befagyasztani”, leállítja a foldoszóma működését. Lehet ez az ADP-agonista geldanamycin és radicicol, amely az intermedier komplexet stabilizálja. Az ATP-agonista AMP-PNP (Young és Hartl, 2000), vagy az ATP-stabilizátor molibdát (Hartson és mtsai, 1999) az érett komplexet stabilizálja, a klienst aktiválható állapotban tartja, de feladatának végrehajtását meggátolja. Az endogén kismolekulájú stabilizátor mennyisége feltehetően a kliensek aktivációját szabályozza, esetleg arról gondoskodik, hogy stresszes körülmények között ne váljanak le a Hsp90-ről. Ennek hátulütője az, hogy a stabilizátor a Hsp90-et elrejti a komplexben. Ez a védekező mechanizmus az akut stressz esetén beválik, ellenben komoly gondokhoz vezethet az öregedés és a konformációs betegségek okozta krónikus chaperon túlterhelés kapcsán (Csermely, 2001/b; Sőti és Csermely 2002/a; 2002/b). Érdekes, hogy az endogén stabilizátor mennyiségét, vagy akár a chaperon-komplexek mennyiségét, működését ilyen körülmények között nem vizsgálták. Ez utóbbi rövidtávú terveink között szerepel. A dinamikus aktív chaperon működést mind a hőkezelés (Yonehara és mtsai, 1996), mind a denaturált szubsztrátok felszaporodása (Nemoto és mtsai, 2001/b) válthatja át statikus passzív chaperon szerepre. A kapcsolás mechanizmusa jogosan az ATP-kötés gátlása lehet, melyre kezdeti hőkezeléses kísérleteink utalnak. Az oligomerizáció és a Hsp90 chaperonaktivitásának kapcsolatát felvázoló modellt a 6.5. ábrán mutatom be. A C-terminális ATP-kötőhely esetében a szerkezeti tényezőhöz egyelőre nem tudunk jól meghatározott funkciót rendelni. Ez a jövő kutatásaira tartozik. Előrebocsátható viszont, hogy a szerkezeti átmenetek, és a feltételezhető ciklus gátlásának hatása itt is érvényesül. A Hsp90 N-terminális ATP-antagonistáin kívül a ciszplatin és a Taxol újabb eszköze lehet a Hsp90 működés modulálásának, és specifikusabb származékaikból ígéretes daganatellenes szerek vagy egyéb gyógyszerek válhatnak. A biokémikus pedig abban reménykedhet, hogy olyan
118
szereket kapott a kezébe, amelyek segítséget nyújtanak a C-terminális nukleotid-kötőhely jelentőségének felderítésében.
ADP
kis affinitású oligomer
szubsztrát
STRESSZ denaturált fehérje ATP-depléció hő
kliens ADP dimer
kis affinitású oligomer szoros komplex
Pi aktív kliens
denaturált fehérje
ATP
stabil oligomer statikus komplex ATP-kötésre képtelen Hsp90 inaktív kliens
ATP dimer laza komplex
Chaperon túlterhelés
6.5. ábra A Hsp90 nukleotid-állapotának, oligomerizációjának és chaperon aktivitásának kapcsolata
119
7. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
Doktoranduszi munkám legfontosabb kutatási eredményeit az alábbi tézisekben foglalom össze:
7.1. Új kísérleti eredmények 1., Elsőként mutattuk ki a Hsp90 direkt kölcsönhatását különböző átmenetifémanionokkal, melyek modelljeként szolgálhatnak a Hsp90-kliensfehérje komplexek egyelőre ismeretlen szerkezetű endogén stabilizátorainak. Eredményeink szerint a Hsp90 különféle vanadát-oligoanionok kötésére képes. Kimutattuk és jellemeztük a Hsp90 permolibdát-kölcsönhatást, valamint triptikus proteolízis segítségével a permolibdát kötésében részt vevő régiót a Hsp90 középső (290-610. as) doménjére lokalizáltuk. 2., Számos független módszerrel igazoltuk, hogy a Hsp90 rendelkezik egy második, középső-C-terminális doménen elhelyezkedő ATP-kötőhellyel. A második ATP-kötőhely geldanamycin-érzéketlen, novobiocin mellett ciszplatinnal specifikusan gátolható. A nukleotid-foszfátkötő szakaszok feltérképezése során azonosítottunk egy új N-terminális gfoszfátkötő motívumot, és ennek közelében találtunk rá a C-terminális foszfát-kötő szakaszokra. 3., A teljes Hsp90 molekulán végzett kísérleteink megvilágították, hogy a Hsp90 töltött régiója olyan nukleotidfüggő molekuláris kapcsolóként működik, mely alapállapotban elrejti a C-terminális ATP-kötőhelyet. Az N-terminális ATP megkötése felszabadítja a második ATP-kötőhelyet a gátlás alól, amely képessé válik nukleotid kötésére. Eredményeink a két domén közötti oda-vissza irányuló kölcsönhatást igazolják. A két ATPkötő domén kommunikációját farmakológiásan képesek voltunk megbontani. 4., Kísérleteink először mutatták ki a ciszplatin különböző Hsp90-komplexekre kifejtett hatását, így elsőként szolgálnak funkcionális bizonyítékkal az N- és C-terminális ATP-kötőhely eltérő biológiai szerepéről. A Hsp90-partnerfehérje kölcsönhatásokat tekintve: ciszplatin nem befolyásolta a Hsp90 N-terminális (p23-) komplexének kialakulását, de stabilizálta a C-terminális (Hsp70-) komplexet. A Hsp90-függő kliensfehérjék
120
felgombolyodását tekintve: ciszplatin nem hatott az Lck és Raf-1 aktiválódására Tnyiroksejtekben, ezzel szemben gátolta a luciferáz felgombolyodását retikulocita lizátumban.
7.2. Új módszertani eredmények 1., Elsőként alkalmaztuk a felületi plazmonrezonancia (SPR) módszert dajkafehérjék és kismolekulák kölcsönhatásának vizsgálatára. A technika jel/zaj aránya minimális, ezért ígéretes eszköze lehet a sok problémát jelentő, azonban biológiailag fontos alacsony affinitású kölcsönhatások vizsgálatának. 2., Beállítottunk egy módszert, az oxidatív nukleotid-affinitáshasítást, mellyel oldatban, élettani körülmények között tudtuk kimutatni a Hsp90 alacsony affinitású ATP-kötését. A reakció detektálásának anti N-és C-terminális antitestekkel történő optimalizálása lehetőséget nyújtott arra, hogy a foszfátkötő motívumokról helyspecifikus információt nyerjünk. Módszerünk az első, mellyel a Hsp90 szerkezetét és funkcióját közvetlenül, komplex elegyekben, akár a sejten belül tanulmányozhatjuk. 3., Beállítottuk a nitrocellulóz filter kötés módszerét, mellyel ATP-analóg használata nélkül direkt titrációs kísérletben tudtuk meghatározni a Hsp90-ATP kölcsönhatás disszociációs állandóit. A módszer lehetőséget nyújt bármilyen radioaktívan jelölt ligand és fehérje alacsony affinitású kölcsönhatásának kvantitatív jellemzésére, nem időigényes, és nem igényli a ligand kémiai módosítását. 4., Tudomásunk szerint elsőként alkalmaztunk olyan bioinformatikai megközelítést, melyben egy rövid, szekvencia illesztéssel nem fellelhető motívumot a másodlagosharmadlagos szerkezeti homológiára alapozva találtunk meg. A módszer az aminosav szekvencia szintjén eltérő, de funkcionálisan, ezért szerkezetileg konzervált domének kulcsmotívumainak predikciójára alkalmas.
121
8. A KUTATÁS TOVÁBBI IRÁNYAI
Az elkövetkezendőkben szeretném felvázolni további terveimet, terveinket, illetve azokat a főbb együttműködéseket, melyekben részben témavezetőm jóvoltából veszek részt. A tervek másik részét Csermely Profeszorral történt egyeztetést követően önálló kollaborációban igyekszem megvalósítani. 1.) A Hsp90 N-és C-terminális ATP-kötőhelyének és ATPáz aktivitásának biokémiai és funkcionális jellemzésén Kalmár Évával dolgozunk. A C-terminális kötőhely térképezése és a reaktív cisztein(ek) azonosítása dr. Medzihradszky Katalinnal (UCSF, School of Pharmacy) együttműködésben történik. Új Hsp90-gátlószer-jelöltek Hsp90 ATP-kötésére kifejtett hatásának vizsgálatát dr. Hideaki Itoh-val (Akita University) együttműködésben tervezzük. 2.) A bakteriális lipopoliszacharid és a stressz-jelpálya kapcsolatát dr. Hamar Péterrel (Kórélettani Intézet) vizsgáljuk. Ciszplatin és Taxol Hsp90-re gyakorolt hatását Rácz Attilával, Papp Dórával, a Hsp90 ciszplatin rezisztenciában játszott szerepét prof. Aszalos Adorjánnal (US Food and Drug Administration) együttműködésben Papp Dórával tanulmányozzuk. 3.) Arra a kérdésre, mi hozza helyre az elrontott chaperonokat, Vermes Ákos középiskolás diákkal keressük a választ. Részben ezek a kísérletek járulhatnak hozzá annak megválaszolásához, mi működteti a dajkafehérjék aktív és passzív chaperon aktivitása között váltó kapcsolót. A struktúrális átrendeződéseknek (oligomerizáció) a sejtarchitektúrára gyakorolt hatása laboratóriumunk új kutatási irányához kapcsolódik. 4.) A Hsp90 in vitro öregedését Nardai Gáborral vizsgáljuk. A szervezet dajkafehérjéinek túlterhelése egyik fő oka lehet az öregedésnek és egyéb korfüggő betegségeknek. A jelenséget és mechanizmusát egy több európai országra kiterjedő együttműködésben kívánjuk felderíteni, melyre benyújtott EU-pályázatunk elbírálása folyamatban van. Szintén tanulmányozni kívánom a Hsp90 öregedésben betöltött speciális szerepét. 5.) Távolabbi terveim között szerepel a szervezet általános védekező mechanizmusai és az idegrendszer szerteágazó kapcsolatának vizsgálata.
122
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetemet és hálámat szeretném kifejezni mindazok felé, akiktől életem és pályám eddigi alakulásában támogatást és segítséget kaptam: Istennek Családomnak Barátaimnak Tanáraimnak Munkatársaimnak, közülük különösen: prof. Csermely Péternek dr. Schnaider Tamásnak prof. Selmeci Lászlónak prof. Somogyi Jánosnak prof. Mandl József Intézet- és programvezetőnek Rácz Attilának és Papp Dórának Mihály Katalinnak dr. Nardai Gábornak, dr. Steták Attilának, Kalmár Évának dr. Vér Ágotának és dr. Végh Miklósnénak Szabó Csillának, Herkné Bajkó Ágnesnek Erdei Árpádnénak, Lukács Ferencnének és Holly Antalnak Intézetünk többi munkatársának dr. Tretter László csoportjának (Orvosi Biokémiai Intézet) 123
10. IRODALOMJEGYZÉK 1.
Akner G, Mossberg K, Sundqvist KG, Gustafsson JA és Wikström AC. (1992) Evidence for reversible, non-microtubule and non-microfilament-dependent nuclear translocation of hsp90 after heat shock in human fibroblasts. Eur. J. Cell. Biol. 58, 356-364
2.
Aligue R, Akhavan-Niak H és Russell P. (1994) A role for hsp90 in the cell cycle control: Wee1 tyrosine kinase activity requires interaction with Hsp90. EMBO J. 13, 6099-6106
3.
Alonso E és Rubio V. (1995) Affinity cleavage of carbamoyl-phosphate synthetase I localizes regions of the enzyme interacting wit the molecule of ATP that phosphorylates carbamate. Eur. J. Biochem. 229, 377-384
4.
Amos LA és Lowe J. (1999) How Taxol stabilises microtubule structure. Chem. Biol. 6, R65-R69
5.
Arrigo AP. (1998) Small stress proteins: chaperones that act as regulators of intracellular redox state and programmed cell death. Biol. Chem. 379, 19-26
6.
Baird CL, Harkins TT, Morris SK és Lindsey JE. (1999) Topoisomerase II drives DNA transport by hydrolyzing one ATP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13685-13690
7.
Ban C és Yang W. (1998) Crystal structure and ATPase activity of MutL: implications for DNA repair and mutagenesis. Cell 95, 541-552
8.
Ban C, Junop M és Yang W. (1999) Transformation of MutL by ATP binding and hydrolysis: a switch in DNA mismatch repair. Cell 97, 85-97
9.
Bardwell JCA és Craig EA. (1987) Eucaryotic Mr 83,000 heat shock protein has a homologue in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5177-5181
10. Bardwell JCA és Craig EA. (1988) Ancient heat-shock gene is dispensable. J. Bacteriol. 170, 29772983 11. Baskakov I és Bolen DW. (1998) Forcing thermodynamically unfolded proteins to fold. J. Biol. Chem. 273, 4831-4834 12. Basu S, Binder RJ, Suto R, Anderson KM és Srivastava PK. (2000) Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NFkB pathway. Int. Immunol. 12, 1539-1546 13. Bergerat A, de Massy B, Gadelle D, Varutas P-C, Nicolas A és Forterre P. (1997) An atypical topoisomerase II from archaea with implications for meiotic recombination. Nature 386, 414-417 14. Binart N, Chambraud B, Dumas B, Rowlands DA, Bigogne C, Levin JM, Garnier J, Baulieu E-E és Catelli MG. (1989) The cDNA-derived amino acid sequence of chick heat shock protein Mr 90,000 (hsp90) reveals a ”DNA like” structure: potential site of interaction with steroid receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 159, 140-147 15. Biswas SB és Kornberg A. (1984) Nucleoside triphosphate binding to DNA polymerase III holoenzyme of Escherichia coli. A direct photoaffinity labeling study. J. Biol. Chem. 259, 7990-7993 16. Bjergbaek L, Kingma P, Nielsen IS, Wang Y, Westergaard O, Osheroff N és Andersen AH. (2000) Communication between the ATPase and cleavage/religation domains of human topoisomerase IIa. J. Biol. Chem. 275, 13041-13048 17. Blagosklonny MV, Toretsky J, Bohen S és Neckers L. (1996) Mutant conformation of p53 translated in vitro or in vivo requires functional HSP90. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8379-8383 18. Bogatcheva NV, Ma YS, Urosev D és Gusev NB. (1999) Localization of calponin binding sites in the structure of 90 kDa heat shock protein (Hsp90). FEBS Lett. 457, 369-374 19. Borkovich KA, Farelly FW, Finkelstein DB, Taulien J és Lindquist S. (1989) Hsp82 is an essential protein that is required in higher concentrations for growth of cells at higher temperatures. Mol. Cell. Biol. 9, 39919-3930
I
20. Bouhouche-Chatelier I, Chadli A és Catelli MG. (2001) The N-terminal adenosin triphosphate binding domain of Hsp90 is necessary and sufficient for interaction with the estrogen receptor. Cell Stress Chaperones 6, 297-305 21. Bradford MM. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 22. Brino L, Urzhumtsev A, Mousli M, Bronner C, Mitschler A, Oudet P és Moras D. (2000) Dimerization of Escherichia coli DNA-gyrase B provides a structural mechanism for activating the ATPase catalytic center. J. Biol. Chem. 275, 9468-9475 23. Buck M. (1998) Trifluoroethanol and colleagues: cosolvents come of age. Recent studies with peptides and proteins. Q. Rev. Biophys. 31, 297-355 24. Bukau B. (szerk.) (1999) Molecular chaperones and folding catalysts. Regulation, cellular function and mechanisms. Harwood Academic Publishers 25. Bukau B és Horwich AL. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 92, 351-366 26. Busconi L, Guan J és Denker BM. (2000) Degradation of heterotrimeric Gao subunits via the proteosome pathway is induced by the hsp90-specific compound geldanamycin. J. Biol. Chem. 275, 1565-1569 27. Byrd CA, Bornmann W, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Pavletich N, Rosen N, Nathan CF és Ding A. (1999) Heat shock protein 90 mediates macrophage activation by Taxol and bacterial lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5645-5650 28. Callebaut I, Catelli MG, Portetelle D, Meng X, Cadepond F, Burny A, Baulieu E-E és Mornon JP. (1994) Redox mechanism for the chaperone activity of heat shock proteins HSPs 60, 70 and 90 as suggested by hydrophobic cluster analysis: hypothesis. C. R. Acad. Sci. Paris 317, 721-729 29. Caplan AJ. (1999) Hsp90’s secrets unfold: new insights from structural and functional studies. Trends Cell Biol. 9, 262-268 30. Catz SD, Johnson JL és Babior BM. (2001) Characterization of the nucleotide-binding capacity and the ATPase activity of the PIP3-binding protein JFC1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11230-11235 31. Chadli A, LeCaer J-P, Bladier D, Joubert-Caron R és Caron M. (1997) Purification and characterization of a human brain galectin-1 ligand. J. Neurochem. 68, 1640-1647 32. Chadli A, Ladjimi MM, Baulieu E-E és Catelli MG. (1999) Heat-induced oligomerization of the molecular chaperone Hsp90. Inhibition by ATP and geldanamycin and activation by transition metal oxyanions. J. Biol. Chem. 274, 4133-4139 33. Chadli A, Bouhouche I, Sullivan W, Stensgard B, McMahon N, Catelli MG és Toft DO. (2000) Dimerization and N-terminal domain proximity underlie the function of the molecular chaperone heat shock protein 90. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 12524-12529 34. Chang H-C, Nathan DF és Lindquist S. (1997) In vivo analysis of the Hsp90 cochaperone Sti1 (p60). Mol. Cell. Biol. 17, 318-325 35. Chen CF, Chen Y, Dai K, Chen PL, Riley DJ és Lee WH. (1996) A new member of the hsp90 family of molecular chaperones interacts with the retinoblastoma protein during mitosis and after heat shock. Mol. Cell. Biol. 16, 4691-4699 36. Chen S, Prapapanich V, Rimerman RA, Honoré B és Smith DF. (1996) Interactions of p60, a mediator of progesterone receptor assembly, with heat shock proteins hsp90 and hsp70. Mol. Endocrinol. 10, 682-693 37. Chen SY, Sullivan WP, Toft DO és Smith DF. (1998) Differential interactions odf p23 and the TPRcontaining proteins Hop, Cyp40, FKBP52 and FKBP51 with Hsp90 mutants. Cell Stress Chaperones 3, 118-129 38. Chiosis G, Rosen N és Sepp-Lorenzino L. (2001) LY294002-geldanamycin heterodimers as selective inhibitors of the PI3K and PI3K-related family. Bioorg. Med. Chem .Lett. 11, 909-913 39. Chow K-C. (2000) Hsp70 (DnaK) – an evolution facilitator? Trends Genet.16, 484-485
II
40. Cissel DS és Beaven MA. (2000) Disruption of Raf-1/heat shock protein 90 complex and Raf signaling by dexamethasone in mast cells. J. Biol. Chem. 275, 7066-7070 41. Collins P és Webb C. (1999) Estrogen hits the surface. Nat. Med. 5, 1130-1131 42. Connell P, Ballinger CA, Jiang J, Wu Y, Thompson LJ, Höhfeld J és Patterson C. (2001) The cochaperone CHIP regulates protein triage decisions mediated by heat shock proteins. Nat. Cell Biol. 3, 93-96 43. Cragg GM. (1998) Paclitaxel (Taxol): a success story with valuable lessons for natural product drug discovery and development. Med.Res.Rev. 18, 315-331 44. Crevel G, Bates H, Huikeshoven H és Cotterill S. (2001) The Drosophila Dpit47 protein is a nuclear Hsp90 co-chaperone that interacts with DNA polymerase a. J. Cell. Sci. 114, 2015-2025 45. Cutforth T és Rubin GM. (1994) Mutations in Hsp83 and cdc37 impair signaling by the sevenless receptor tyrosine kinase in Drosophila. Cell 77, 1027-1036 46. Czar MJ, Galigniana MD, Silverstein AM és Pratt WB. (1997) Geldanamycin, a heat shock protein 90binding benzoquinone ansamycin, inhibits steroid-dependent translocation of the glucocorticoid receptor from the cytoplasm to the nucleus. Biochemistry 36, 7776-7785 47. Csermely P. (2001/a) A nonconventional role of molecular chaperones: involvement in the cytoarchitecture. News Physiol. Sci. 15, 123-126 48. Csermely P. (2001/b) Chaperone-overload as a possible contributor to “civilization diseases”: atherosclerosis, diabetes, cancer. Trends Genet. 17, 701-704 49. Csermely P. (2001/c) Stresszfehérjék. Sejtjeink ősi védekező mechanizmusa. Vince Kiadó, TudományEgyetem sorozat 50. Csermely P és Kahn CR. (1991) The 90-kDa heat shock protein (hsp-90) possesses an ATP-binding site and autophosphorylating activity. J. Biol. Chem. 266, 4943-4950 51. Csermely P, Kajtár J, Hollósi M, Jalsovszky Gy, Holly S, Kahn CR, Gergely P Jr, Sőti Cs, Mihály K és Somogyi J. (1993) ATP induces a conformational change of the 90-kDa heat shock protein (hsp90). J. Biol. Chem. 268, 1901-1907 52. Csermely P, Kajtár J, Hollósi M, Oikarinen J és Somogyi J. (1994) The 90 kDa heat shock protein (hsp90) induces the condensation of the chromatin structure. Biochem. Biophys. Res. Commun. 202, 1657-1663 53. Csermely P, Martonosi A, Levy GC és Ejchart AJ. (1985) 51V-NMR analysis of the binding of vanadium oligoanions to sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 230, 807-815 54. Csermely P, Miyata Y, Sőti Cs és Yahara I. (1997) Binding affinity of proteins to hsp90 correlates with both hydrophobicity and positive charges. A surface plasmon resonance study. Life Sci. 61, 411-418 55. Csermely P, Schnaider T, Sőti Cs, Prohászka Z és Nardai G: The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol. Ther. (1998) 79, 129168 56. Dahmer MK, Housley PR és Pratt WB. (1984) Effects of molybdate and endogenous inhibitors on steroid receptor inactivation, transformation and translocation. Annu. Rev. Physiol. 46, 67-81 57. Dao-Phan H-P, Formstecher P és Lefebvre P. (1997) Disruption of the glucocorticoid receptor assembly with heat shock protein 90 by a peptidic antiglucocorticoid. Mol. Endocrinol. 11, 962-972 58. Davies TH, Ning Y-M és Sánchez ER. (2002) A new first step in activation of steroid receptors: hormone-induced switching of FKBP51 and FKBP52 immunophillins. J. Biol. Chem. nyomtatás alatt, C100531200 59. de Cárcer G, do Carmo-Avides M, Lallena MJ, Glover DM és Gonzalez C. (2001) Requirement of Hsp90 for centrosomal function reflects its regulation of Polo kinase stability. EMBO J. 20, 2878-2884 60. DolinskiKJ, Cardenas ME és Heitman J. (1998) CNS1 encodes an essential p60/Sti1 homolog in Saccharomyces cerevisiae that suppresses cyclophilin 40 mutations and interacts with Hsp90. Mol. Cell. Biol. 18, 7344-7352
III
61. Donzé O, Abbas-Terki T és Picard D. (2001) The Hsp90 chaperone complex is both a facilitator and a repressor of the dsRNA-dependent kinase PKR. EMBO J. 20, 3771-3780 62. Dutta R és Inouye M. (2000) GHKL, an emergent ATPase/kinase superfamily. Trends Biochem. Sci. 25, 24-28 63. Dyson HJ, Rance M, Houghten RA, Wright PE és Lerner RA. (1988) Folding of immunogenic peptide fragments of proteins in water solution. II. The nascent helix. J. Mol. Biol. 201, 201-217 64. Ellis RJ. (2001) Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem. Sci. 26, 597-604 65. Ewbank JJ és Creighton TE. (1991) The molten globule protein conformation probed by disulphide bonds. Nature 350, 518-520 66. Fang Y, Fliss AE, Rao J és Caplan AJ. (1998) SBA1 encodes a yeast hsp90 cochaperone that is homologous to vertebrate p23 proteins. Mol. Cell. Biol. 18, 3727-3734 67. Felts SJ, Owen BA, Nguyen P, Trepel J, Donner DB és Toft DO. (2000) The hsp90-related protein TRAP1 is a mitochondrial protein with distinct functional properties. J. Biol. Chem. 275, 3305-3312 68. Freeman BC és Morimoto RI. (1996) The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J. 15, 2969-2979 69. Freitag DG, Ouimet PM, Girvitz TL és Kapoor M. (1997) The heat shock protein 80 of Neurospora crassa, a cytosolic molecular chaperone of the eukaryotic stress 90 family, interacts directly with heat shock protein 70. Biochemistry 36, 10221-10229 70. Fujita N, Sato S, Ishida A és Tsuruo T. (2002) Involvement of Hsp90 in signaling and stability of 3phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1). J. Biol. Chem. nyomtatás alatt, M106736200 71. Galigniana MD, Scruggs JL, Herrington J, Welsh MJ, Carter Su C, Housley PR és Pratt WB. (1998) Heat shock protein 90-dependent (geldanamycin-inhibited) movement of the glucocorticoid receptor through the cytoplasm to the nucleus requires intact cytoskeleton. Mol. Endocrinol. 12, 1903-1913 72. Galigniana MD, Housley PR, DeFranco DB és Pratt WB. (1999) Inhibition of glucocorticoid receptor nucleocytoplasmic shuttling by okadaic acid requires intact cytoskeleton. J. Biol. Chem. 274, 1622216227 73. Garnier C, Protashevich I, Gilli R, Tsvetkov P, Lobachov V, Peyrot V, Briand C és Makarov A. (1998) The two-stage process of the heat shock protein 90 thermal denaturation: effect of calcium and magnesium. Bichem. Biophys. Res. Commun. 249, 197-201 74. Garnier C, Lafitte D, Tsvetkov PO, Barbier P, Leclerc-Devin J, Millot J-M, Briand C, Makarov AA, Catelli MG és Peyrot V. (2002) Binding of ATP to heat shock protein 90: evidence for an ATP-binding site in the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 277, 12208-12214 75. Gerloff DL, Cohen FE, Korostensky C, Turcotte M, Gonnet GH és Benner SA. (1997) A predicted consensus structure for the N-terminal fragment of the heat shock protein HSP90 family. Proteins 27, 450-458 76. Gerner C, Frohwein U, Gotzmann J, Bayer E, Gelbmann D, Bursch W és Schulte-Hermann R. (2000) The Fas-induced apoptosis analyzed by high throughput proteome analysis. J. Biol. Chem. 275, 3901839026 77. Grammatikakis N, Vultur A, Chilakamarti VR, Siganou A, Schweinfest CW, Watson DK és Raptis L. (2002) The role of Hsp90N, a new member of the Hsp90 family, in signal transduction and neoplastic transformation. J. Biol. Chem. nyomtatás alatt, M109200200 78. Grenert JP, Johnson BD és Toft DO. (1999) The importance of ATP binding and hydrolysis by Hsp90 in formation and function of protein heterocomplexes. J. Biol. Chem. 274, 17525-17533 79. Grenert JP, Sullivan WP, Fadden P, Haystead TAJ, Clark J, Mimnaugh E, Krutzsch H, Ochel H-J, Schulte TW, Sausville E, Neckers LM és Toft DO. (1997) The amino-terminal domain of heat shock protein 90 (hsp90) that binds geldanamycin is an ATP/ADP switch domain that regulates hsp90 conformation. J. Biol. Chem. 272, 23843-23850
IV
80. Guo Y, Guettouche T, Fenna M, Boellmann F, Pratt WB, Toft, DO, Smith DF és Voellmy R. (2001) Evidence for a mechanism of repression of heat shock factor 1 transcriptional activity by a multichaperone complex. J. Biol. Chem. 276, 45791-45799 81. Hartl FU. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381, 571-580 82. Hartson SD, Barrett DJ, Burn P és Matts RL. (1996) Hsp90-mediated folding of the lymphoid cell kinase p56lck. Biochemistry 35, 13451-13459 83. Hartson SD, Thulasiraman V, Huang W, Whitesell L és Matts RL. (1999) Molybdate inhibits Hsp90, induces structural changes in its C-terminal domain, and alters its interactions with substrates. Biochemistry 38, 3837-3849 84. Hattendorf DA és Lindquist S. (2002) Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 85. Hernández MP, Chadli A és Toft DO. (2002) hsp40 binding is the first step in the hsp90 chaperoning pathway for the progesterone receptor. J. Biol. Chem. nyomtatás alatt, M111445200 86. Hettinga JV, Koonings Aw és Kampinga HH. (1997) Reduction of cellular cisplatin resistance by hyperthermia--a review. Int. J. Hyperthermia 13, 439-457 87. Holt SE, Aisner DL, Baur J, Tesmer VM, Dy M, Ouellette M, Trager JB, Morin GB, Toft DO, Shay JW, Wright WE és White MA. (1999) Functional requirement of p23 and Hsp90 in telomerase complexes. Genes Dev. 13, 817-826 88. Hoyer D, Cho H és Schultz PG. (1990) A new strategy for selective protein cleavage. J. Am. Chem. Soc. 112, 3249-3250 89. Hu J és Seeger C. (1996) Hsp90 is required for the activity of a hepatitis B virus reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1060-1064 90. Hutchison KA, Fox IH. (1989) Purification and characterization of the adenosine A2-like binding site from human placental membrane. J. Biol. Chem. 264, 19898-19903 91. Hutchinson KA, Stancato LF, Jove R és Pratt WB. (1992) The protein-protein complex between pp60vsrc and hsp90 is stabilized by molybdate, vanadate, tungstate, and an endogenous cytosolic metal. J. Biol. Chem. 267, 13952-13957 92. Imai J és Yahara I. (2000) Role of HSP90 in salt stress tolerance via stabilization and regulation of calcineurin. Mol. Cell. Biol. 20, 9262-9270 93. Ishimoto T, Kamei A, Koyanagi S, Nishide N, Uyeda A, Kasai M és Taguchi T. (1998) HSP90 has neurite-promoting activity in vitro for telencephalic and spinal neurons of chick embryos. Biochem. Biophys. Res. Commun. 253, 283-287 94. Itoh H, Ogura M, Komatsuda A, Wakui H, Miura AB és Tashima Y. (1999) A novel chaperone-activityreducing mechanism of the 90-kDa molecular chaperone Hsp90. Biochem. J. 343, 697-703 95. Jakob U, Lilie H, Meyer I és Buchner J. (1995/a) Transient interaction of Hsp90 with early unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for heat shock in vivo. J. Biol. Chem. 270, 7288-7294 96. Jakob U, Meyer I, Bugl H, Andre S, Bardwell JC és Buchner J. (1995/b) Structural organization of procaryotic and eucaryotic Hsp90. Influence of divalent cations on structure and function. J. Biol. Chem. 270, 14412-14419 97. Jakob U, Scheibel T, Bose S, Reinstein J és Buchner J. (1996) Assessment of the ATP binding properties of Hsp90. J. Biol. Chem. 271, 10035-10041 98. Jamieson ER és Lippard SJ. (1999) Structure, recognition and processing of cisplatin-DNA adducts. Chem. Rev. 99, 2467-2498 99. Jibard N, Meng X, Leclerc P, Rajkowski K, Fortin D, Schweizer-Groyer G, Catelli M-G, Baulieu E-E és Cadepond F. (1999) Delimitation of two regions in the 90-kDa heat shock protein (Hsp90) able to interact with the glucocorticoid receptor (GR). Exp. Cell. Res. 247, 461-474
V
100. Johnson BD, Chadli A, Felts SJ, Bouhouche I, Catelli MG és Toft DO. (2000) Hsp90 chaperone activity requires the full-length protein and interaction among its multiple domains. J. Biol. Chem. 275, 3249932507 101. Johnson BD, Schumacher RJ, Ross ED és Toft DO. (1998) Hop modulates hsp70/hsp90 interactions in protein folding. J. Biol. Chem. 273, 3679-3686 102. Jorda P és Carmo-Fonseca M. (2000) Molecular mechanisms involved in cisplatin citotoxicity. Cell. Mol. Life Sci. 57, 1229-1235 103. Joseph K, Tholanikunnel BG és Kaplan AP. (2002) Heat shock protein 90 catalyzes activation of the prekallikrein-kininogen complex in the absence of factor XII. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 896-900 104. Kanelakis KC, Morishima Y, Dittmar KD, Galigniana MD, Takayama S, Reed JC és Pratt WB. (1999) Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 105. Kang J, Kim T, Ko Y-G, Rho SB, Park SG, Kim MJ, Kwon HJ és Kim S. (2000) Heat shock protein 90 mediates protein-protein interactions between human aminoacyl-tRNA synthetases. J. Biol. Chem. 275, 31682-31688 106. Kang KI, Meng X, Devin-Leclerc J, Bouhouche I, Chadli A, Cadepond F, Baulieu EE és Catelli M. (1999) The molecular chaperone Hsp90 can negatively regulate the activity of a glucocorticosteroiddependent promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1439-1444 107. Katschinski DM, Le L, Heinrich D, Wagner KF, Hofer T, Schindler SG és Wenger RH. (2002) Heat induction of the unphosphorylated form of hypoxia-inducible factor-1a is dependent on heat shock protein-90 activity. J. Biol. Chem. 277, 9262-9267 108. Kellermayer MS és Csermely P. (1995) ATP induces dissociation of the 90 kDa heat shock protein (hsp90) from F-actin: interference with the binding of heavy meromyosin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 166-174 109. King FW, Wawrzynov A, Höhfeld J és Zylicz M. (2001) Co-chaperones Bag-1, Hop and Hsp40 regulate Hsc70 and Hsp90 interactions with wild-type and mutant p53. EMBO J. 20, 6297-6305 110. Ki SW, Ishigami K, Kitahara T, Kasahara K, Yoshida M és Horinouchi S. (2000) Radicicol binds and inhibits mammalian ATP citrate lyase. J. Biol. Chem. 275, 39231-39236 111. Kimura Y, Rutherford SL, Miyata Y, Yahara I, Freeman BC, Yue L, Morimoto RI és Lindquist S. (1997) CDC37 is a molecular chaperone with specific functions in signal transduction. Genes Dev. 11, 1775-1785 112. Kosano H, Stensgard B, Charlesworth MC, McMahon N és Toft D. (1998) The assembly of progesterone receptor-hsp90 complexes using purified proteins. J. Biol. Chem. 273, 32973-32979 113. Koyasu S, Nishida E, Kadowaki T, Matsuzaki F, Iida K, Harada F, Kasuga M, Sakai H és Yahara I. (1986) Two mammalian heat shock proteins, HSP90 and HSP100 are actin-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8054-8058 114. Kudlicki W, Fullilove S, Kramer G és Hardesty B. (1985) The 90-kDa component of reticulocyte hemeregulated eIF-2a (initiation factor 2a-subunit) kinase is derived from the b subunit of spectrin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5332-5336 115. Kuduk SD, Zheng FF, Sepp-Lorenzino L, Rosen N és Danishefsky SJ. (1999) Synthesis and evaluation of geldanamycin-estradiol hybrids. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 1233-1238 116. Kumagai J, Fukuda J, Kodama H, Murata M, Kawamura K, Itoh H és Tanaka T. (2000) Germ cellspecific heat shock protein 105 binds to p53 in a temperature-sensitive manner in rat testis. Eur.J. Biochem 267, 3073-3078 117. Kumar R, Grammatikakis N és ChinkersM. (2001) Regulation of the atrial natriuretic peptide receptor by heat shock protein 90 complexes. J. Biol. Chem. 276, 11371-11375 118. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the asssembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-686
VI
119. Lamers MH, Perrakis A, Enzlin JH, Winterwerp HKH, de Wind N és Sixma TK. (2000) The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G×T mismatch. Nature 407, 711-717 120. Lanks KW. (1989) Temperature-dependent oligomerization of hsp85 in vitro. J. Cell. Physiol. 140, 601607 121. Lanks KW, London E és Dong DLY. (1992) Hsp85 conformational change within the heat shock temperature range. Biochem. Biophys. Res. Commun. 184, 394-399 122. Lee HC, Hon T és Zhang L. (2002) The molecular chaperone Hsp90 mediates heme activation of the yeast transcriptional activator Hap1. J. Biol. Chem. nyomtatás alatt, M106951200 123. Lees-Miller SP és Anderson CW. (1989/a) Two human 90-kDa heat shock proteins are phosphorylated in vivo at conserved serines that are phosphorylated in vitro by casein kinase II. J. Biol. Chem. 264, 2431-2437 124. Lees-Miller SP és Anderson CW. (1989/b) The human double-stranded DNA-activated protein kinase phosphorylates the 90 kDa heat-shock protein, hsp90a at two NH2-terminal threonine residues. J. Biol. Chem. 264, 17275-17280 125. Legagneux V, Morange M és Bensaude O. (1991) Heat shock increases turnover of 90 kDa heat shock protein phosphate groups in HeLa cells. FEBS Lett. 291, 359-362 126. Lewis J, Devin A, Miller A, Lin Y, Rodriguez Y, Neckers L és Liu ZG. (2000) Disruption of hsp90 function results in degradation of the death domain kinase, receptor-interacting protein (RIP), and blockage of tumor necrosis factor-induced nuclear factor-kB activation. J. Biol. Chem. 275, 1051910526 127. Li J, Elberg G, Gefel D és Schechter Y. (1995) Permolybdate and pertungstate – potent stimulators of insulin effects in rat adipocytes: mechanism of action. Biochemistry 34, 6218-6225 128. Liao DF, Jin ZG, Baas AS, Daum G, Gygi SP, Aebersold R és Berk BC. (2000) Purification and identification of secreted oxidative stress-induced factors from vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 275, 189-196 129. Liu J és DeFranco DB. (1999) Chromatin recycling of glucocorticoid receptors: implications for multiple roles of heat shock protein 90. Mol. Endocrinol. 13, 355-365 130. Liu Q, Levy EJ és Chirico WJ. (1996) N-Ethylmaleimide inactivates a nucleotide-free Hsp70 molecular chaperone. J. Biol. Chem. 271, 29937-29944 131. Liu Y és Bolen DW. (1995) The peptide backbone plays a dominant role in protein stabilization by naturally occurring osmolytes. Biochemistry 34, 12884-12891 132. Louvion JF, Warth R és Picard D. (1996) Two eukaryote-specific regions of Hsp82 are dispensable for viability and signal transduction functions in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13937-13942 133. Machius M, Chuang JL, Wynn RM, Tomchick DR és Chuang DT. (2001) Structure of a rat BKCD kinase: nucleotide-induced domain communication in a mitochondrial protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11218-11223 134. Marcu MG, Schulte TW és Neckers LM. (2000/a) Novobiocin and related coumarins and depletion of heat shock protein 90-dependent signaling proteins. J. Natl. Cancer Inst. 92, 242-248 135. Marcu MG, Chadli A, Bouhouche I, Catelli M és Neckers LM. (2000/b) The heat shock protein 90 antagonist novobiocin interacts with a previously unrecognized ATP-binding domain in the carboxyl terminus of the chaperone. J. Biol. Chem. 275, 37181-37186 136. Maruya M, Sameshima M, Nemoto T és Yahara I. (1999) Monomer arrangement in HSP90 dimer as determined by decoration with N and C-terminal region specific antibodies. J. Mol. Biol. 285, 903-907 137. Marsh JA, Kalton HM és Gaber RF. (1998) Cns1 is an essential protein associated with the hsp90 chaperone complex in Saccharomyces cerevisiae that can restore cyclophilin 40-dependent functions in cpr7D cells. Mol. Cell. Biol. 18, 7353-7359 138. Masutomi K, Kaneko S, Hayashi N, Yamashita T, Shirota Y, Kobayashi K és Murakami S. (2000) Telomerase activity reconstituted in vitro with purified human telomerase reverse transcriptase and human telomerase RNA component. J. Biol. Chem. 275, 22568-22573
VII
139. Matthews RC, Burnie JP, Howat D, Rowland T és Walton F. (1991) Autoantibody to heat-shock protein 90 can mediate protection against systemic candidosis. Immunology 74, 20-24 140. Mayer MP és Bukau B. (1999) Molecular chaperones: The busy life of Hsp90. Curr. Biol. 9, R322R325 141. McLaren A. (1999) Too late for the midwife toad. Stress, variability and Hsp90. Trends Genet. 15, 169171 142. Mclaughlin SH, Smith HW ;s Jackson SE. (2002) Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J. Mol. Biol. 315, 787-798 143. McLellan T. (1982) Electrophoresis buffers for polyacrylamide gels at various pH. Anal. Biochem. 126, 94-99 144. Megidish T, Takio K, Titani K, Iwabuchi K, Hamaguchi A, Igarashi Y és Hakomori S. (1999) Endogenous substrates of sphingosine-dependent kinases (SDKs) are chaperone proteins: heat shock proteins, glucose-regulated proteins, protein disulfide isomerase, and calreticulin. Biochemistry 38, 3369-3378 145. Meng X, Devin J, Sullivan WP, Toft D, Baulieu EE és Catelli MG. (1996) Mutational analysis of Hsp90 alpha dimerization and subcellular localization: dimer disruption does not impede ‘in vivo’ interaction with estrogen receptor. J. Cell Sci. 109, 1677-1687 146. Ménoret A, Li Z, Niswonger ML, Altmeyer A, Srivastava PK. (2001) An endoplasmic reticulum protein implicated in chaperoning peptides to major histocompatibility of class I is an aminopeptidase. J. Biol. Chem. 276, 33313-33318 147. Mese H, Sasaki A, Nakayama S, Yokoyama S, Sawada S, Ishikawa T és Matsumura T. (2001) Analysis of cellular sensitization with cisplatin-induced apoptosis by glucose-starved stress in cisplatin-sensitive and -resistant A431 cell line. Anticancer Res. 21, 1029-1033 148. Meshinchi S, Matic G, Hutchinson KA és Pratt WB. (1990) Selective molybdate-directed covalent modification of sulfhydryl groups in the steroid-binding versus the DNA-binding domain of the glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 265, 11643-11649 149. Mikalsen S-O és Kaalhus O. (1997) A characterization of permolybdate and its effect on cellular tyrosine phosphorylation, gap junctional intercellular communication and phosphorylation status of the gap junction protein, connexin43. Biochim. Biophys. Acta 1356, 207-220 150. Mimnaugh EG, Worland PJ, Whitesell L és Neckers LM. (1995) Possible role for serine/threonine phosphorylation in the regulation of the heteroprotein complex between the hsp90 stress protein and the pp60v-src tyrosine kinase. J. Biol. Chem. 270, 28654-28659 151. Minami M, Nakamura M, Emori Y és Minami Y. (2001) Both the N- and C-terminal chaperone sites of Hsp90 participates in protein refolding. Eur. J. Biochem. 268, 2520-2524 152. Minami Y, Kawasaki H, Minami M, Tanahashi N, Tanaka K és Yahara I. (2000) A critical role for the proteasome activator PA28 in the Hsp90-dependent protein refolding. J. Biol. Chem. 275, 9055-9061 153. Minami Y, Kawasaki H, Miyata Y, Suzuki K és Yahara I. (1991) Analysis of native forms and isoform compositions of the mouse 90 kDa heat shock protein, hsp90. J. Biol. Chem. 266, 10099-10103 154. Minami Y, Kawasaki H, Suzuki K és Yahara I. (1993) The calmodulin-binding domain of the mouse 90kDa heat shock protein. J. Biol. Chem. 268, 9604-9610 155. Minami Y, Kimura Y, Kawasaki H, Suzuki K és Yahara I. (1994) The carboxy-terminal region of mammalian HSP90 is required for its dimerization and function in vivo. Mol. Cell. Biol. 14, 1459-1464 156. Miyata Y és Yahara I. (1992) The 90 kDa heat shock protein, hsp90, binds and protects casein kinase II from self-aggregation and enhances its kinase activity. J. Biol. Chem. 267, 7042-7047 157. Miyata Y és Yahara I. (1995) Interaction between casein kinase II and the 90-kDa stress protein, HSP90. Biochemistry 34, 8123-8129 158. Mizuno K, Shirogane T, Shinohara A, Iwamatsu A, Hibi M és Hirano T. (2001) Regulation of Pim-1 by Hsp90. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 663-669
VIII
159. Montel V, Gardrat F, Azanza JL és Raymond J. (1999) 20S proteasome, hsp90, p97 fusion protein, PA28 activator copurifying oligomers and ATPase activities. Biochem. Mol. Biol. Int. 47, 465-472 160. Montel V, Gardrat F, Azanza JL és Raymond J. (2000) Heat-shock protein 90: intrinsic peptidase activity and in vitro long-term self-processing. Life-Sci. 67, 1585-1600 161. Morishima Y, Kanelakis KC, Silverstein AM, Dittmar KD, Estrada L és Pratt WB. (2000) The Hsp organizer protein Hop enhances the rate but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900. 162. Murakami K, Fellous A, Baulieu EE és Robel P. (2000) Pregnenolone binds to microtubule-associated protein 2 and stimulates microtubule assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3579-3584 163. Nadeau K, Nadler, SG, Saulnier M, Tepper MA és Walsh CT. (1994) Quantitation of the interaction of the immunosuppressant deoxyspergualin and analogs with Hsc70 and Hsp90. Biochemistry 33, 25612567 164. Nadler SG, Dischino DD, Malacko AR, Cleaveland JS, Fujihara SM és Marqardt H. (1998) Identification of a binding site on Hsc70 for the immunosuppressant 15-deoxyspergualin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 253, 176-180 165. Nakai A és Ishikawa T. (2001) Cell cycle transition under stress conditions controlled by vertebrate heat shock factors. EMBO J. 20, 2885-2895 166. Nardai G, Sass B, Eber J, Orosz Gy és Csermely P. (2000) Reactive cysteines of the 90-kDa heat shock protein, Hsp90. Arch. Biochem. Biophys. 384, 59-67 167. Nardai G, Schnaider T, Sőti Cs, Somogyi J, Hoj BP és Csermely P. (1996) Characterization of the 90 kDa heat shock protein (hsp90)-associated ATP/GTPase. J. Biosci. 21, 179-190 168. Nathan DF és Lindquist S. (1995) Mutational analysis of Hsp90 function: interactions with a steroid receptor and a protein kinase. Mol. Cell. Biol. 15, 3917-3925 169. Nathan DF, Vos MH és Lindquist S. (1997) In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12949-12956 170. Nathan DF, Vos MH és Lindquist S. (1999) Identification of SSF1, CNS1, and HCH1 as multicopy supressors of a Saccharomyces cerevisiae Hsp90 loss of function mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1409-1414 171. Neckers L, Mimnaugh E és Schulte TW. (1999) The Hsp90 chaperone family. Stress proteins. Handbook of Experimental Pharmacology 136, 9-42; Latchman DS (szerk.), Springer 172. Nemoto T, Ohara Nemoto Y, Ota M, Takagi T és Yokoyama K. (1995) Mechanism of dimer formation of the 90-kDa heat-shock protein. Eur. J. Biochem. 233, 1-8 173. Nemoto T és Sato N. (1998) Oligomeric forms of the 90-kDa heat shock protein. Biochem. J. 330, 989995 174. Nemoto T, Sato N, Iwanari H, Yamashita H és Takagi T. (1997): Domain structures and imunogenic regions of the 90-kDa heat-shock protein (HSP90). Probing with a library of anti-HSP90 monoclonal antibodies and limited proteolysis. J. Biol. Chem. 272, 26179-26187 175. Nemoto TK, Ono T, Kobayakawa T, Tanaka E, Baba TT, Tanaka K, Takagi T és Gotoh T. (2001/a) Domain-domain interactions of HtpG, an Escherichia coli homologue of eukaryotic HSP90 molecular chaperone. Eur J. Biochem. 268, 5258-5269 176. Nemoto TK, Ono, T és Tanaka K. (2001/b) Substrate-binding characteristics of proteins in the 90 kDa heat shock protein family. Biochem. J. 354, 663-670 177. Netzer WJ és Hartl FU. (1998) Protein folding in the cytosol: chaperonin-dependent and -independent mechanisms. Trends Biochem. Sci. 23, 68-73 178. Nishida E, Koyasu S, Sakai H és Yahara I. (1986) Calmodulin-regulated binding of the 90 kDa heat shock protein to actin filaments. J. Biol. Chem. 261, 16033-16036 179. Nishigori H és Toft DO. (1980) Inhibition of progesterone receptor activation by sodium molybdate. Biochemistry 19, 77-83
IX
180. Obermann WM, Sondermann H, Russo AA, Pavletich NP és Hartl FU. (1998) In vivo function of Hsp90 is dependent on ATP binding and ATP hydrolysis. J. Cell. Biol. 275, 901-910 181. Ogura T és Wilkinson AJ. (2001) AAA+ superfamily ATPases: common structure – diverse function. Genes Cells 6, 575-597 182. O'Keeffe B, Fong Y, Chen D, Zhou S és Zhou Q. (2000) Requirement for a kinase-specific chaperone pathway in the production of a Cdk9/cyclin T1 heterodimer responsible for P-TEFb-mediated tat stimulation of HIV-1 transcription. J. Biol. Chem. 275, 279-287 183. Ouimet PM és Kapoor M. (1999) Nucleotide binding and hydrolysis properties of Neurospora crassa cytosolic molecular chaperones, Hsp70 and Hsp80, heat-inducible members of the eukaryotic stress-70 and stress- 90 families. Biochem. Cell Biol. 77, 89-99 184. Owen BAL, Sullivan WP, Felts SJ és Toft DO. (2002) Regulation of heat shock protein 90 (HSP90) ATPase activity by sequences in its carboxyl terminus. J. Biol. Chem. 277, 7086-7091 185. Owens-Grillo JK, Czar MJ, Hutchison KA, Hoffmann K, Perdew GH és Pratt WB. (1996) A model of protein targeting mediated by immunophilins and other proteins that bind to hsp90 via tetratricopeptide repeat domains. J. Biol. Chem. 271, 13468-13475 186. Pai KS, Mahajan VB, Lau A és Cunningham DD. (2001) Thrombin receptor signaling to cytoskeleton requires Hsp90. J. Biol. Chem. 276, 32642-32647 187. Panaretou B, Prodromou C, Roe SM, O’Brian R, Ladbury JE, Piper PW és Pearl LH. (1998) ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17, 4829-4836 188. Pandey P, Saleh A, Nakazawa A, Kumar S, Srinivasula SM, Kumar V, Weichselbaum R, Nalin C, Alnemri ES, Kufe D és Kharbanda S. (2000) Negative regulation of cytochrome c-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90. EMBO J. 19, 43104322 189. Pató B, Mihály K és Csermely P. (2001) Chaperones and cytoarchitecture> geldanamycin induces an accelerated efflux of cytoplasmic proteins from detergent-treated cells. 27th FEBS Meeting, poszter (PS4-011), absztrakt: Eur. J. Biochem. 268 Suppl 1, 106 190. Pearl LH és Prodromou C. (2000) Structure and in vivo function of Hsp90. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 46-51 191. Picard D, Khursheed B, Garabedian MJ, Fortin MG, Lindquist S és Yamamoto KR. (1990) Reduced levels of hsp90 compromise steroid receptor action in vivo. Nature 348, 166-168 192. Pratt WB. (1992) Control of steroid receptor function and cytoplasmic-nuclear transport by heat-shock proteins. BioEssays 14, 841-848 193. Pratt WB. (1997) The role of the hsp90-based chaperone system in signal transduction by nuclear receptors and receptors signaling via MAP kinase. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37, 297-326 194. Pratt WB, Silverstein AM és Galigniana MD. (1999) A model for the cytoplasmic trafficking of signaling proteins involving the hsp90-binding immunophilins and p50cdc37. Cell. Signal. 11, 839-851 195. Prodromou C, Roe SM, Piper PW és Pearl LH. (1997/a) A molecular clamp in the crystal structure of the N-terminal domain of the yeast Hsp90 chaperone. Nat. Struct. Biol. 4, 477-482 196. Prodromou C, Roe SM, O`Brien R, Ladbury JE, Piper PW és Pearl LH. (1997/b) Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell 90, 6575 197. Prodromou C, Siligardi G, O’Brien R, Woolfson DN, Regan L, Panaretou B, Ladbury JE, Piper PW és Pearl LH. (1999) Regulation of Hsp90 ATPase activity by tetratricopeptide repeat (TPR)-domain cochaperones. EMBO J. 18, 754-762 198. Prodromou C, Panaretou B, Chohan S, Siligardi G, O'Brien R, Ladbury JE, Roe SM, Piper PW és Pearl LH. (2000) The ATPase cycle of Hsp90 drives a molecular ‘clamp’ via transient dimerization of the Nterminal domains. EMBO J. 19, 1-10
X
199. Rajapandi T, Greene LE és Eisenberg E. (2000) The molecular chaperones Hsp90 and Hsc70 are both necessary and sufficient to activate hormone binding by glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 275, 22597-22604 200. Ramsey AJ, Russell LC, Whitt SR és Chinkers M. (2000) Overlapping sites of tetratricopeptide repeat protein binding and chaperone activity in heat shock protein 90. J. Biol. Chem. 275, 17857-17862 201. Randow F és Seed B. (2001) Endoplasmic reticulum chaperone gp96 is required for innate immunity but not cell viability. Nat. Cell. Biol. 3, 891-896 202. Realini C, Rogers SW és Rechsteiner M. (1994) KEKE motifs. Proposed roles in protein-protein interaction and presentation of peptides by MHC class I receptors. FEBS Lett. 348, 109-113 203. Rehder D. (1982) A survey of 51V-NMR spectroscopy. Bull Magn. Reson. 4, 33-83 204. Richter K, Muschler P, Hainz O és Buchner J. (2001) Coordinated ATP hydrolysis by the Hsp90 dimer. J. Biol. Chem. 276, 33689-33696 205. Richter K és Buchner J. (2001) Hsp90: chaperoning signal transduction. J. Cell Physol. 188, 281-290 206. Roe SM, Prodromou C, O’Brien R, Ladbury JE, Piper PW és Pearl LH. (1999) Structural basis for inhibition of the Hsp90 molecular chaperone by the antitumor antibiotics radicicol and geldanamycin. J. Med. Chem. 42, 260-266 207. Rosenhagen MC, Young YC, Wochnik GM, Herr AS, Schmidt U, Hartl FU, Holsboer F and Rein T. (2001) Synergistic inhibition of the glucocorticoid receptor by radicicol and benzoquinone ansamycins. Biol. Chem. 382, 499-504 208. Rost B és Sander C. (1993) Prediction of protein structure at better than 70% accuracy. J. Mol. Biol. 232, 584-599 209. Rost B és Sander C. (1994) Combining evolutionary information and neural networks to predict protein secondary structure. Proteins 19, 55-72 210. Russell KS, Haynes MP, Caulin-Glaser T, Rosneck J, Sessa WC és Bender JR. (2000) Estrogen stimulates heat shock protein 90 binding to endothelial nitric oxide synthase in human vascular endothelial cells. Effects on calcium sensitivity and NO release. J. Biol. Chem. 275, 5026-5030 211. Rutherford SL és Lindquist S. (1998) Hsp90 as a capacitor for morphological evolution. Nature 396, 336-342 212. Sano M. (2001) Radicicol and geldanamycin prevent neurotoxic effects of anti-cancer drugs on cultured embryonic sensory neurons. Neuropharmacology 40, 947-953 213. Satoh K, Wakui H, Komatsuda A, Nakamoto Y, Miura AB, Itoh H és Tashima Y. (1994) Induction and altered localization of 90-kDa heat-shock protein in rat kidneys with cisplatin-induced acute renal failure. Renal Failure 16, 313-323 214. Sato S, Fujita N és Tsuruo T. (2000) Modulation of Akt kinase activity by binding to Hsp90. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10832-10837 215. Scheibel T, Weikl T és Buchner J. (1998) Two chaperone sites in Hsp90 differing in substrate specificity and ATP dependence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1495-1499 216. Scheibel T, Siegmund HI, Jaenicke R, Ganz P, Lilie H és Buchner J. (1999/a) The charged region of Hsp90 modulates the function of the N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1297-1302 217. Scheibel T, Weikl T, Rimmerman R, Smith D, Lindquist S és Buchner J. (1999/b) Contribution of Nand C-terminal domains to the function of Hsp90 in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol. 34, 701-713 218. Schepartz A és Cuenoud B. (1990) Site-specific cleavae of the protein calmodulin using a trifluoperazine-based affinity reagent. J. Am. Chem. Soc. 112, 3247-3249 219. Schirmer EC, Glover JR, Singer MA és Lindquist S. (1996) HSP100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sci. 21, 289-296 220. Schirmer EC, Queitsch C, Kowal AS, Parsell DA és Lindquist S. (1998) The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J. Biol. Chem. 273, 15546-11552
XI
221. Schirmer EC, Ware DM, Queitsch C, Kowal AS és Lindquist S. (2001) Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 914-919 222. Schleufer C, Brinker A, Bourenkov G, Pegoraro S, Moroder L, Bartunik H, Hartl FU és Moarefi I. (2000) Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elemnts in the assembly of the Hsp70Hsp90 multichaperone machine. Cell 101, 199-210 223. Schliwa M, van Blerkom J és Porter KR. (1981) Stabilization of the cytoplasmic ground substance in detergent-opened cells and a structural and biochemical analysis of its composition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4329-4333 224. Schnaider T, Somogyi J, Csermely P, Szamel M. (2000/a) The Hsp90-specific inhibitor geldanamycin selectively disrupts kinase-mediated signaling events of T-lymphocyte activation. Cell Stress Chaperones 5, 52-61 225. Schnaider T, Sőti Cs, Cheetham ME, Miyata Y, Yahara I és Csermely P. (2000/b) Interaction of the human DnaJ homologue HSJ1b with the 90 kDa heat shock protein, Hsp90. Life Sci. 67, 1455-1465 226. Schnaider T. (2000) A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérjék funkcióinak biokémiai alapjai. Doktori értekezés, Semmelweis Egyetem 227. Scholz GM, Hartson SD, Cartledge K, Volk L, Matts RL és Dunn AR. (2001) The molecular chaperone Hsp90 is required for signal transduction by wild-type Hck and maintenance of its constitutively active counterpart. Cell Growth Differ. 12, 409-417 228. Schulte TW, Blagosklonny MV, Romanova L, Mushinski JF, Monia BP, Johnston JF, Nguyen P, Trepel J és Neckers LM. (1996) Destabilization of Raf-1 by geldanamycin leads to disruption of the Raf-1MEK-mitogen-activated protein kinase signalling pathway. Mol. Cell. Biol. 16, 5839-5845 229. Schulte TW, An WG és Neckers LM. (1997) Geldanamycin-induced destabilization of Raf-1 involves the proteasome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239, 655-659 230. Schulte TW, Akinaga S, Soga S, Sullivan W, Stensgard B, Toft DO és Neckers LM. (1998) Antibiotic radicicol binds to the N-terminal domain of Hsp90, and shares important biologic activities with geldanamycin. Cell Stress Chaperones 3, 100-108 231. Schulte TW, Akinaga S, Murakata T, Agatsuma T, Sugimoto S, Nakano H, Lee YS, Simen BB, Argon Y, Felts S, Toft DO, Neckers LM és Sharma SV. (1999) Interaction of radicicol with members of the heat shock protein 90 family of molecular chaperones. Mol. Endocrinol. 13, 1435-1448 232. Schumacher RJ, Hansen WJ, Freeman BC, Alnemri E, Litwack G és Toft DO. (1996) Cooperative action of Hsp70, Hsp90, and DnaJ proteins in protein renaturation. Biochemistry 35, 14889-14898 233. Scopes RK. (1974) Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Anal. Biochem. 59, 277282 234. Sétáló Gy Jr, Singh M, Guan X, Toran-Allerand CD. (2001) Estradiol-induced phosphorylation of ERK1/2 in explants of mouse cerebral cortex: the roles of heat shock protein 90 (Hsp90) and MEK2. J. Neurobiol. 50, 1-12 235. Shue G és Kohtz DS. (1994) Structural and functional aspects of basic helix-loop-helix protein folding by heat-shock protein 90. J. Biol. Chem. 269, 2707-2711 236. Silverstein AM, Grammatikakis N, Cochran BH, Chinkers M és Pratt WB. (1998) p50cdc37 binds directly to the catalytic domain of Raf as well as to a site on Hsp90 that is topologically adjacent to the tetratricopeptide repeat binding site. J. Biol. Chem. 273, 20090-20095 237. Silverstein AM, Galigniana MD, Kanelakis KC, Radanyi C, Renoir JM és Pratt WB. (1999) Different regions of the immunophilin FKBP52 determine its association with the glucocorticoid receptor, hsp90, and cytoplasmic dynein. J. Biol. Chem. 274, 36980-36986 238. Simizu S és Osada H. (2000) Mutations in the Plk gene lead to instability of Plk protein in human tumour cell lines. Nat. Cell. Biol. 2, 852-854 239. Smart JL és McCammon JA. (1999) Phosphorylation stabilizes the N-termini of a-helices. Biopolymers 49, 225-233
XII
240. Soga S, Kozawa T, Narumi H, Akinaga S, Irie K, Matsumoto K, Sharma SV, Nakano H, Mizukami T és Hara M. (1998) Radicicol leads to selective depletion of Raf kinase and disrupts K-Ras-activated aberrant signaling pathway. J. Biol. Chem. 273, 822-828 241. Song HY, Dunbar JD, Zhang YX, Guo D és Donner DB. (1995) Identification of a protein with homology to hsp90 that binds the type 1 tumor necrosis factor receptor. J. Biol. Chem. 270, 3574-3581 242. Soundar S. és Coleman RF. (1993) Identification of metal-isocitrate binding site of pig heart NADPspecific isocitrate dehydrogenase by affinity cleavage of the enzyme by Fe2+-isocitrate. J. Biol. Chem., 268, 5264-5271 243. Sőti Cs és Csermely P. (1998/a) Characterization of the nucleotide binding properties of the 90 kDa heat shock protein (Hsp90). J. Biosci. 23, 347-352 244. Sőti Cs és Csermely P. (1998/b) Molecular chaperones in the etiology and therapy of cancer. Pathology Oncology Res. 4, 316-321 245. Sőti Cs és Csermely P. (2000) Mapping the nucleotide binding site of Hsp90. 7th International Summer School on Biophysics, poszter (P10), absztrakt könyv: 125 246. Sőti Cs és Csermely P. (2002/a) Chaperones come of age. Cell Stress Chaperones nyomtatás alatt 247. Sőti Cs és Csermely P. (2002/b) Chaperones and ageing: role in neurodegeneration and in other civilizational diseases. Neurochem. Internat. nyomtatás alatt 248. Sőti Cs, Rácz A és Csermely P. (2002) A nucleotide-dependent molecular switch controls ATP binding at the C-terminal domain of Hsp90: N-terminal nucleotide binding unmasks a C-terminal binding pocket. J. Biol. Chem. 277, 7066-7075 249. Srethapakdi M, Liu F, Tavorath R és Rosen N. (2000) Inhibition of Hsp90 function by ansamycins causes retinoblastoma gene product-dependent G1 arrest. Cancer Res. 60, 3940-3946 250. Srivastava PK, Menoret A, Basu S, Binder RJ és McQuade KL. (1998) Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. Immunity 8, 657-665 251. Stebbins CE, Russo AA, Schneider C, Rosen N, Hartl FU és Pavletich NP. (1997) Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an antitumor agent. Cell 89, 239250 252. Sullivan W, Stensgard B, Caucutt G, Bartha B, McMahon N, Alnemri ES, Litwack G és Toft DO. (1997) Nucleotides and two functional states of hsp90. J. Biol. Chem. 272, 8007-8012. 253. Szyszka R, Kramer G és Hardesty B. (1989) The phosphorylation state of the reticulocyte 90-kDa heat shock protein affects its ability to increase phosphorylation of peptide initiation factor 2a subunit by the heme-sensitive kinase. Biochemistry 28, 1435-1438 254. Tanaka E, Nemoto TK és Ono T. (2001) Liberation of the intramolecular interaction as the mechanism of heat-induced activation of HSP90 molecular chaperone. Eur J. Biochem. 268, 5270-5277 255. Tanioka T, Nakatani Y, Semmyo N, Murakami M és Kudo I. (2000) Molecular identification of cytosolic prostaglandin E2 synthase that is functionally coupled with cyclooxygenase-1 in immediate prostaglandin E2 biosynthesis. J. Biol. Chem. 275, 32775-32782 256. Taulés M, Rius E, Talaya D, Lopez-Girona A, Bachs O és Agell N. (1998) Calmodulin is essential for cyclin-dependent kinase 4 (Cdk4) activity and nuclear accumulation of cyclin D1-Cdk4 during G1. J. Biol. Chem. 273, 33279-33286 257. Taylor P, Dornan J, Carrello A, Minchin RF, Ratajczak T and Walkinshaw MD. (2001) Two structures of cyclophilin 40. folding and fidelity in the TPR domains. Structure 9, 431-438 258. Thirumalai D, Lorimer GH. (2001) Chaperonin-mediated protein folding. Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30, 245-269 259. Tran PT és Liskay RM. (2000) Functional studies on the candidate ATPase domains of Saccharomyces cerevisiae MutLa. Mol. Cell. Biol. 20, 6390-6398 260. Traut TW. (1994) The functions and consensus motifs of nine types of peptide segments that form different types of nucleoyide-binding sites. Eur. J. Biochem. 222, 9-14
XIII
261. Trent JD, Kagawa HK, Yaoi T, Olle E és Zaluzec NJ. (1997) Chaperonin filaments: the archaeal cytoskeleton? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5383-5388 262. Trent JD, Kagawa HK és Yaoi T. (1998) The role of chaperonins in vivo: the next frontier. Ann. N. Y. Acad. Sci. 851, 36-47 263. Triantafilou K, Triantafilou M és Dedrick RL. (2001) A CD14-independent LPS receptor cluster. Nat. Immunol. 2, 338-345 264. Tumlin JA, Lea JP, Swanson CE, Smith CL, Edge SS és Someren JS. (1997) Aldosterone and dexamethasone stimulate calcineurin activity through a transcription-independent mechanism involving steroid receptor-associated heat shock proteins. J. Clin. Invest. 99, 1217-1223 265. Tzivion G, Luo Z és Avruch J. (1998) A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature 394, 88-92 266. Vale RD. (2000) AAA proteins. Lords of the ring. J. Cell Biol. 150, F13-F19 267. Vancurova I, Vancura A, Lou W és Paine PL. (1997) A domain distinct from nucleoplasmin’s nuclear localization sequence influences its transport. Biochem. Biophys. Res. Commun. 235, 19-25 268. Weaver AJ, Sullivan WP, Felts SJ, Owen BA és Toft DO. (2000) Crystal structure and activity of human p23, a heat shock protein 90 co-chaperone. J. Biol. Chem. 275, 23045-23052 269. Weikl T, Muschler P, Richter K, Veit T, Reinstein J és Buchner J. (2000) C-terminal regions of Hsp90 are important for trapping the nucleotide during the ATPase cycle. J. Mol. Biol. 303, 583-592 270. Welch WJ. (1992) Mammalian stress response: cell physiology, structure/function of stress proteins, and implications for medicine and disease. Physiol. Rev. 72, 1063-1081 271. Whitesell L, Mimnaugh EG, De Costa B, Myers CE és Neckers LM. (1994) Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8324-8328 272. Wiech H, Buchner J, Zimmermann R és Jakob U. (1992) hsp90 chaperones protein folding in vitro. Nature 358, 169-170 273. Wigley DB, Davies GJ, Dodson EJ, Maxwell A és Dodson G. (1991) Crystal structure of an N-terminal fragment of the DNA gyrase B protein. Nature 351, 624-629 274. Wong I, és Lohman TM. (1993) A double-filter method for nitrocellulose-filter binding: application to protein-nucleic acid interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432 275. Wright PE és Dyson HJ. (1999) Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structurefunction paradigm. J. Mol. Biol. 293, 321-331 276. Wright PE. (2001) Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. 27th FEBS Meeting, plenáris előadás, absztrakt: Eur. J. Biochem. 268 Suppl 1, i 277. Yahara I, Iida H és Koyasu S. (1986) A heat shock-resistant variant of Chinese hamster cell line constitutively expressing heat shock protein of Mr 90,000 at high level. Cell Struct. Funct. 11, 65-73 278. Yamamoto K, Okamoto A, Isonishi S, Ochiai K és Ohtake T. (2001) Heat shock protein 27 was upregulated in cisplatin resistant human ovarian tumor cell line and associated with the cisplatin resistance. CancerLlett. 168, 173-181 279. Yamamoto M, Takahashi Y, Inano K, Horigome T és Sugano H. (1991) Characterization of the hydrophobic region of heat shock protein 90. J. Biochem. 110, 141-145 280. Yonehara M, Minami Y, Kawata Y, Nagai J és Yahara I. (1996) Heat-induced chaperone activity of HSP90. J. Biol. Chem. 271, 2641-2645 281. Yonezawa N, Nishida E, Sakai H, Koyasu S, Matsuzaki F, Iida K és Yahara I. (1988) Purification and characterization of the 90-kDa heat shock protein from mammalian tissues. Eur. J. Biochem. 177, 1-7 282. Young JC, Schneider C és Hartl FU. (1997) In vitro evidence that hsp90 contains two independent chaperone sites. FEBS Lett. 418, 139-143
XIV
283. Young JC és Hartl FU. (2000) Polypeptide release by Hsp90 involves ATP hydrolysis and is enhanced by the co-chaperone p23. EMBO J. 19, 5930-5940 284. Young JC, Moarefi I és Hartl FU. (2001) Hsp90: a specialized but essential protein-folding tool. J. Cell. Biol. 154, 267-273 285. Xu Y és Lindquist S. Heat-shock protein hsp90 governs the activity of pp60v-src kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 7074-7078 286. Xu Y, Singer MA és Lindquist S. (1999) Maturation of the tyrosine kinase c-src as a kinase and as a substrate depends on the molecular chaperone Hsp90. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 109-114 287. Zhao Y-G, Gilmore R, Leone G, Coffey MC, Weber B és Lee PWK. (2001) Hsp90 phosphorylation is linked to its chaperoning function: assembly of the rheovirus cell attachment protein. J. Biol. Chem. 276, 32822-32827
XV
11. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények: 1. Csermely P, Kajtár J, Hollósi M, Jalsovszky Gy, Holly S, Kahn CR, Gergely P Jr, Sőti Cs, Mihály K és Somogyi J. (1993) ATP induces a conformational change of the 90-kDa heat shock protein (hsp90). J. Biol. Chem. 268, 1901-1907 (IF. 6,8; CIT. 69) 2.
Sőti Cs és Csermely P. (1998) Characterization of the nucleotide binding properties of the 90 kDa heat shock protein (Hsp90). J. Biosci. 23, 347-352 (IF. 0,5; CIT. 2)
3.
Sőti Cs, Radics L, Yahara I, és Csermely P. (1998) Interaction of vanadate oligomers and permolybdate with the 90 kDa heat shock protein, Hsp90. Eur. J. Biochem. 255, 611-617 (IF. 3,2; CIT. 8)
4.
Sőti Cs, Rácz A és Csermely P. (2002) A nucleotide-dependent molecular switch controls ATP binding at the C-terminal domain of Hsp90: N-terminal nucleotide binding unmasks a Cterminal binding pocket. J. Biol. Chem. 277, 7066-7075 (IF. 7,4; CIT. -)
Az értekezés témaköréhez szorosan nem kapcsolódó közlemények: 1.
Nardai G, Schnaider T, Sőti Cs, Ryan MT, Hoj PB, Somogyi J és Csermely P. (1996) Characterization of the 90 kDa heat shock protein (hsp90)-associated ATP/GTP-ase. J. Biosci. 21, 179-190 (IF. 0,4; CIT. 6)
2.
Csermely P, Miyata Y, Sőti Cs és Yahara I. (1997) Binding affinity of proteins to hsp90 correlates with both hydrophobicity and positive charges. A surface plasmon resonance study. Life Sci. 61, 411-418 (IF. 2,3; CIT. 7)
3.
Csermely P, Schnaider T, Sőti Cs, Prohászka Z és Nardai G. (1998) The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol. Ther. 79, 129-168 (összefoglaló) (IF. 4,7; CIT. 94)
4.
Sőti Cs és Csermely P. (1998) Molecular chaperones in the etiology and therapy of cancer. Pathology Oncology Res. 4, 316-321 (összefoglaló) (IF. 0; CIT. 6)
5.
Sőti Cs és Csermely P. (2000) Molecular chaperones and the aging process. Biogerontology 1, 225-233 (összefoglaló) (IF. 0; CIT. 2)
6.
Schnaider T, Sőti Cs, Cheetham ME, Miyata Y, Yahara I és Csermely P. (2000) Interaction of the human DnaJ homologue HSJ1b with the 90 kDa heat shock protein, Hsp90. Life Sci. 67, 1455-1465 (IF. 1,8; CIT. 3)
7.
Sőti Cs és Csermely P. (2002) Chaperones come of age. Cell Stress Chaperones nyomtatás alatt (összefoglaló) (IF. 3,4; CIT. -)
8.
Sőti Cs és Csermely P. (2002) Chaperones and ageing: role in neurodegeneration and in other civilizational diseases. Neurochem. Internat. nyomtatás alatt (összefoglaló) (IF. 2,7; CIT. -)
XVI
