MIKOLÓGIA
Gombák • eukaryoták • ipari jelenőségük nagy: kenyér, sajt, italok, gyógyszerek • legtöbb szabadon él, gazdaszervezet nélkül • néhány obligát patogén, de ált. opportunisták • általuk okozott betegségek: allergia
mikotoxikózis: pl. aflatoxin mikózis: - szuperficiális - kután - szubkután - szisztémás
A gombák metabolizmusa • Heterotrófok, szinte minden szerves anyagon megélnek • Obligát aerob a legtöbb • Savas pH-t kedvelik • Nedvességigényük nagy - intertrigók fertőzése • Hőmérsékletigényük változó - földrajzi eloszlás • Anyagcseretermékeik mérgezőek/allergizálóak lehetnek
A gombasejt felépítése
- sejtfal: fő építőelem kitin (glükán vagy mannán) - plazma membrán ergosterol tartalmú - 80S rRNA - citoszkeleton rendszer: mikrotubulusok, mikrofilamentumok
Felosztásuk: - fonalas gombák sok sejtből álló fonal = hifa ált. szeptumok osztják részekre, elágazhatnak szövedékük a micélium – szabad szemmel látható - élesztőgombák = sarjadzó egyedi, ovális sejteket képeznek (3-15 µm) bimbózással szaporodnak - pseudohifa táptalajon telepeket képeznek - dimorf gombák szobahőmérsékleten fonalasként, 37°C-on sarjadzóként viselkednek
Rhizopus sp.
Candida sp.
Dimorf gombák • környezeti tényezőktől függően sarjadzó és fonalas alakban
is létezhetnek • Szövetben, 37 oC-on tenyésztve : sarjadzás, • Környezetben, szobahőmérsékleten (25 oC) tenyésztve: fonalas alak, micélium képzés Egyéb befolyásoló körülmény • CO2 • pH • Cystein vagy más sulfhydryl cc. • • • • •
Sporothrix schenkii Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatitidis Paracoccidioides immitis Coccidioides immitis
Gombák szaporodása 1. aszexuális: ANAMORPH
Osztódással conidiumok képzése (spórák) formái: sporuláció, sarjadzás, hifák fragmentációja 2. szexuális: TELEOMORH hím és nőnemű sejtmagok fúziója spórák képzése 3. paraszexuális: mitotikus rekombináció Pl. Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aszexuális - Anamorph
a) chlamydospórák: hifa megvastagodásaiból, kettősfalú (Candida albicans) b) arthrospórák: hifa feltöredezéséből (Coccidioides immitis) c) sporangiospórák: zsákszerű képletben módosult hifa végén (Rhizopus sp.) d) conidiumok: hifa végén vagy oldalán keletkezik , vázaalakú képlet (phialide) (Aspergillus fumigatus) e) blastosporák: bimbózással Conidium képzés (élesztőgombák, cladosporium)
Laboratóriumban a klinikai mintákból ezt a formát tenyésztjük/azonosítjuk!
Taxonómia 3. Szexuális spóraképzés alapján => Filogenetikai azonosítás: Spóra
Osztály
Zygospóra
I. Zygomycetes
Nemzetség
Rend: Mucorales Rend :Entomophthorales
Rhizopus, Mucor, Absidia, Saksenaea Basidiobolus, Conidiobolus
Basidiospóra
II. Basidiomycetes
Amanita, Agaricus, Filobasidiella (Cryptococcus neoformans teleomorph formája)
Ascospóra
III. Ascomycetes
Rend :Eurotiales
Saccharomyces, Pichia Arthroderma (Trychophyton és Microsporum teleomorph formája), Ajellomyces (Histoplasma és Blastomyces teleomorph formája) Aspergillus, Penicillium teleomorph formája
IV. Archiascomycetes
Pneumocystis jirovecii
Rend :Endomycetales Rend :Onygenales
Taxonómia A legtöbb humán patogénnek csak aszexuális (anamorph) szaporodási formája ismert V. Osztály: Deuteromycetes: FUNGI IMPERFECTI Rend: Cryptococcales Nemzetségek: Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Malassezia Rend: Moniliales Család: Moniliaceae Nemzetségek: Epidermophyton, Coccidioides, Paracoccidioides, Sporothrix, Aspergillus Család: Dematiaceae Nemzetségek: Phialophora, Fonsecaea, Exophiala, Wangiella, Bipolaris, Alternaria
Rendszerezés, elnevezés - A legtöbb humán patogénnek csak aszexuális (anamorph) szaporodási formája ismert FUNGI IMPERFECTI Pl.Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis - Mindkét szaporodási forma ismert Pl.. Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Penicillium - A teleomorph és anamorph forma elnevezése különböző! pl. Ajellomyces capsulatum = Histoplasma capsulatum - Rendszerezés alapja: teleomorph - Mikrobiológiai leleten szereplő név: anamorph
Gombák virulenciafaktorai: • Exotoxinok pl. aphlatoxin • Tok: antifagociter pl. Cryptococcus neoformans • Proteolitikus enzimek pl. Trichophyton rubrum
A szervezet védekezése: • Aspecifikus: normál flóra, hüvelyi pH, légutak csillói,
phagocytosis, vaskötő fehérjék, komplement • Specifikus: főleg celluláris • Sérülésük, hiányaik hajlamosítanak gombás fertőzésekre
Gombák csoportosítása pathogenezisük szerint I. Obligát pathogen: - hajlamosító tényező nélkül is fertőzést okoz - nem tagja a normál flórának - dermatophytonok - dimorf gombák II. Fakultatív pathogen (opportunista): - hajlamosító tényező kell a fertőzéshez - szervezet normál flórájának, környezetének tagja - sarjadzó gomba, - penészek III. Apathogen gombák: hajlamosító tényező esetén sem okoz fertőzést
Gombás megbetegedések osztályozása • Dermatomycosisok • Dermatophytonok által okozott kórképek:
bőr, haj, köröm fertőzései • Subcutan mycosisok: kötőszövetek, fasciák fertőzései, granulomák • Superficiális mycosisok: főleg trópusokon • Szisztémás fertőzések bőrmanifesztációi • Szisztémás és opportunista mycosisok • szisztémásak ált. spórák belégzésével,
tüdőből indulnak (endémiás mycosisok) • opportunisták: immunszupresszáltak fertőzései
Superficiális mycosisok Malassezia furfur ⇒ Pityriasis/tinea versicolor halvány tejeskávé színű foltok a bőrön (bárhol) ⇒ fungaemia - lipofil gomba - ritka, /gyerekeknél/: teljes parenterális táplálás Diagnózis: - Wood lámpa: aranysárga fluoreszcencia - cellux-minta: Mikroszkópos vizsgálat (tenyésztés)
Pityriasis versicolor KOH készítmény – lactophenol kék festett készítmény
Kezelés: lokálisan azolok (samponok, krémek) /többi superficiális mycosis csak trópusokon/
Dermatophytosisok • Bőr, haj, köröm fertőzéseit okozzák • Keratinophilia • zoofilek, geofilek vagy antropofilek - terjedés módja: kontakt • Krónikus gyulladás, allergia kísérheti • Trichophyton genus
T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, T. schonleinii • Microsporum: M. canis (zoofil), M. gypseum (geophil) • Epidermophyton: E. floccosum • Prediszponáló tényezők!
Trichophyton rubrum T. Mentagrophytes
Tinea pedis
Tinea corporis
Tinea cruris
+ +
+ + + +
+ +
T. Tonsurans T. Verrucosum T. Equinum T. Violaceum T. Schoenleinii
Tinea capitis
+ + + + + +
T. Megninii Epidermophyton floccosum Microsporum canis M. audouinii
+
onychomycosis
+ + + +
+ +
+ +
Tinea barbae
+ +
Egy faj különböző kórképet képes okozni; egy kórképet különböző fajok képesek okozni
Dermatophytonok által okozott kórképek
Tinea: körkörösen terjedő, hullámos szélű, pirosas bőrelváltozás (viszketés)
Tinea barbae
Favus:hajas fejbőr fertőzése (T.schoenleinii) többivel ellentétben maradandó kopasz foltokhoz vezet
Tinea pedis – „atléta láb” - akut: viszkető, égő érzés, vörös vesikulák - krónikus: viszkető, égő érzés, berepedések
Subcutan mycosisok - Kötőszövet, fascia, csont fertőzései - földben, környezetben élnek, sérülés/trauma juttatja be - proteolytikus enzimek, sérült szövetek fakultatív microaerophiliája biztosítja szaporodásukat - Magyarországon is: Sporothrix schenckii - főleg trópusokon: chromoblastomycosis
Sporotrichosis - Sporothrix schenckii - sérülés pl. tövisszúrás kapcsán jut a szövetek közé - bőralatti tályog, fekélyek
Dimorf!
Szisztémás ( endémiás) mycosisok Talaj: szaprofita → belégzés ⇒ tüdő → spontán gyógyuló pneumonitis (~ 90 %) → krónikus lassan progrediáló gennyes, tályogos elváltozások → direkt vagy hematogén úton terjedhet: disszemináció, halál Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatitidis Paracoccidioides brasiliensis
Histoplasmosis - Histoplasma capsulatum • talajban, főleg Amerikában, de máshol is előfordul • nincs tokja!, dimorf • ivaros és ivartalan szaporodás is • blastosporák, micro-és macroconidiumok • főleg madarak, denevérek székletében • ember a conidiumok belégzésével fertőződik
Opportunista mycosisok Candida genus • Legfontosabb: C.albicans • Normál flóra tagja légúti, GI, hüvely nyálkahártyán • fontos patogének még: C.krusei, C.parapsilosis,
C.glabrata, C. tropicalis C. albicans megjelenési formái: • sarjadzó gombasejtek • pseudohifák • chlamydosporák
Patogenitás: • prediszponáló tényező esetén tud patogénné válni Lokális, normál immunrendszer esetén: • soor: csecsemőknél, szájnyálkahártyán fehér felrakódások, gyulladásos udvarral
• Akut/krónikus atrophiás candidiasis, • • • • • • •
krón. hyperplasticus candidiasis: felnőttek szájnyálkahártyáján kialakuló kórképek Vulvovaginitis, fluor: a hüvelyban normálisan is jelen lévő gomba egyensúlya a normál flórával felborul, túlsúlyba kerül általában a hüvelyi pH emelkedése miatt hormonális hatások szerepe Interdigitális közök, intertrigók gyulladása: Candidás paronychia:
Diagnózis: Direkt mikroszkópos vizsgálata a megfelelő mintának (köpet, váladék) Tenyésztés (Saboraud , chrom-agar) Identifikálás: „régi”módszerek - Chlamydoconidia képzés – kukorica-agar - Germ tube test / csíratömlőképzés szérumban újabban - Biokémiai azonosítás (semi-, teljes automata test) - Molekuláris módszerek - MALDI-TOF
Csíratömlő ~ 3 h
chlamydoconidia
„ Gram +”, sarjadzó sejtek, pseudohypha
Cryptococcosis - Cryptococcus neoformans • természetben gyakori, pl. galambürülékben • tokja van • blastosporák belégzése után, immunszupresszió esetén alakul ki a megbetegedés • pneumonia • lassan kifejlődő, krónikus meningitis • más szervekben granulomatosus laesiók Diagnózis: liquor tusfestése tenyésztés ciklohexidimet nem tartalmazó táptalajon antigénkimutatás a liquorból (latexagglutinációs tesztek)
Aspergillosis - A. fumigatus, A. flavus, A. niger • környezetben mindenütt
előfordulnak • kenyér, ételek, falak penészei • opportunista patogének Kórképek: • Allergiás forma • Asztmás rohamok (bronchospazmus) • pneumonitis, allergiás bronchopulmonáris
aspergillosis: • égési sebek, fül, cornea fertőzései
Pneomocystis jirovecii (carinii) - Protozoon-nak tartották (cysta és trophozoit forma) - Molekuláris biológiai vizsgálatok alapján gomba (Ascomycetes-hez hasonló) - Pneumocystis fajok számos állat tüdejében található(patkány, egér, kutya, macska, nyúl…) - Normál immun státusz esetén nem okoz fertőzést! - P. carinii patkányban - P. jirovecii – human pathogén - Gyakorisága nő - HIV - Transzplantáció
Gombás fertőzések labordiagnózisa
1. Mikroszkópos vizsgálat - Natív: lapos csepp, tuskészítmény, KOH-os - Festések: PAS, Gömöri-Grocott ezüstnitrát, Gram, Giemsa, Calcofluor
Mikroszkópos vizsgálat nemcsak kenetek, hanem szövettani metszetek is használhatók mikroszkópos vizsgálat céljára a laboratóriumi diagnosztika az aszexuális (anamorf) alakok alapján történik Natív készítmények Natív mikroszkópos készítmény - vizsgálati anyag + fiz.só, fedőlemez (fénymikroszkóp, fáziskontraszt) - a gombasejteket sejtfaluk éles kontúrja alapján ismerhetjük fel Tuskészítmény higított tus a mintához liquor vizsgálata cryptococcus gyanú esetén!
KOH-os preparátum - szövettörmelék, szövetelemek feloldására 10-20%-os KOH-oldatot adunk tárgylemezre helyezett vizsgálati anyaghoz és fedőlemezzel lefedjük - láng felett néhányszor áthúzzuk - dermatomikózisok diagnózisában használt, alapvető módszer a mintában jelenlevő gombafonalak szabálytalan lefutásúak, üvegszerűen fénylenek és kontúrjuk éles; a conidiumok jól kivehetőek
Laktofenol gyapotkék - a festékoldattal (tejsavat, fenolt és 5% gyapotkéket tartalmaz) néhány óráig festünk a tejsav és a fenol áttűnővé teszi a keratinrészeket, a gyapotkék pedig megfesti a gombákat
Malassezia furfur kimutatására hámkaparékban
Gram-festés - minden gomba „Gram-pozitív” Giemsa festés - vér-, csontvelőkenetek festésére (histoplazmózis gyanú) Immunfluoreszcencia vizsgálati anyagban közvetlen kimutatás indirekt IF-val
Tenyésztés
Sabouraud-medium •Dextrózt magas cc.ban tartalmazó, agarral szilárdított általános táptalaj • pH 5.6 •a kórokozó gomba izolálását zavaró baktériumok és gombák növekedését : chloramphenicol vagy gentamicin ill. cycloheximid gátolja ! Crytococcus neoformans érzékeny cycloheximid-re
Tenyésztés körülményei (A) Aerob (B) Hőmérséklet parallel 26 és 37 °C (Note: dimorphism!) (C) Idő - Élesztőgomba: 1-5 nap (2 hét) - Penészgomba: 3 nap – 3 hét
Chromagarr
Chromagar: A leggyakoribb humán kórokozó candida fajok eltérő színnel nőnek, elkülöníthetőek (eltérő biokémiai tulajdonságaik miatt) ! Párhuzamosan tenyésztés és identifikálás ! Intrinsic rezisztencia a faj ismeretében hamarabb tudott ! Kevert fertőzések
Egyéb speciális táptalajok: Kukoricaliszt-agar => C.albicans chlamydospórát képez benne Infúziós agar: agy-, szívkivonatot tartalmaz => belsőszervi mikózist okozó gombák sarjadzó alakjának tenyésztésére Élesztőkivonat-agar:~előző Czapek-Dox Szaharózt és különböző fémsókat tartalmaz Penészgombák tenyésztésére Nigermagos agar:C.neoformans differenciáló táptalaja (a gomba telepek körül megjelenő sötétbarna szín a fenoloxidáz aktivitás következménye)
Identifikálás (A) Sarjadzó Biokémiai vizsgálatok - klasszikus módszer - 3 hét Morfológiai Telep színe, pigmentképződés Sejtek alakja, mérete Tok jelenléte vagy hiánya Hifák, pseudohifák jelenléte vagy hiánya Csíratömlő, chlamydospóra képzése
- automata, gyors módszer (API-ATB) - 24-48 h
- MALDI-TOF - percek (B) Penészek – makroszkópos, mikroszkópos vizsgálat Telepmorfológia:szín, alak, méret Mikromorfológia: conidiumok típusa, mérete, alakja, képződési módja, száma, …
Érzékenységi vizsgálatok E-test (MIC/MFC meghatározás) microdilúció
Antifungális szerek támadáspontjai
Köszönöm a figyelmet
