Tóth Nándor:
A fehérjék fixációs immunelektroforézise
A vizsgálatok időpontja: 1976
– 1983.
Helye:
Balassa János Kórház Központi Laboratóriuma (Budapest, Vas utca)
Laboratóriumi munkásságom kezdete óta (1959) érdeklődésem az elektroforézis módszereinek megismerése és gyakorlati felhasználása felé irányult. A különböző hordozók: papír- agar- agaróz, polyacrylamid- géllel nyert fehérje frakciók, lipidek, tejsavdehydrogenáz, cholinészteráz izoenzimek nagyszámú vizsgálata után következett az immunelektroforézis. Ez utóbbi eljárással kapott eredmények vizsgálata során – különösen Grabar és Williams , valamint Backhaus2 módszerének megismerése után –, gyorsan világossá vált, hogy a polyvalens ellenanyaggal nyert fehérjefrakciók mérése quantitatíve nem értékelhető meggyőzően. Emiatt, ennek megoldására kerestem lehetőséget. 1
A vonatkozó irodalomban megtaláltam Emidio Afonso indiai immunológus közleményét , amelyben olyan fehérje alakzatokra bukkantam, amelyek felkeltették érdeklődésemet az immunelektroforézis továbbfejlesztésére. 3
Módszerének lényege: Agar-gélben a szérumfehérjék egy pontról történő elektromos elválasztása után, a polyvalens ellenanyagot felhígítva az agar felületére mérte, amely pár óra múlva, abba belediffundálva, létrehozta a kőr alakú, valamint az Ig-G-A–M immunglobulinok esetén az elnyúlt precipitátumokat. Ezek nagy száma miatt nehéz volt egymástól elkülöníteni őket a 8 x 9 cm-es üveglemezen. Egy lemezen 4 szérumot vizsgált: 1 normál (egészséges) szérumot kontrollként, valamint 3 vizsgálati mintát. A vizsgált szérumok mennyisége: 4 mikroliter, a polyvalens ellenanyagé: 0,5 milliliter volt. A módszer továbbfejlesztésére az alábbi célokat határoztam meg: 1. Az eljárás legyen alkalmas: ̶ kisebb számú precipitátum kimutatására, ̶ a quantitatív mérésekre. 2. Anyagköltségek csökkentésével a gazdaságosság növelése. 3. Olyan ideális antigén-szérum arány (ekvivalencia zóna) kialakítása, melynél a megjelenő precipitátumok jól felismerhetők, jelezzék a normális, valamint a normálistól eltérő (csökkent, emelkedett) értékeket, valamint egyértelműen mutassák ki az IgG, IgA frakcióknál a fontos paraproteineket. Hosszas kísérleti időszak után egyértelművé vált, hogy az ellenanyagok rendkívül magas költségei miatt a mennyiségeket csökkenteni kell. Módszerem alkalmazása során a kivitelezéshez szükséges 50-ml agart, megfelelő puffer oldattal megfőztem, majd 53°C-ra lehűtöttem. Hozzámértem 1 ml polyvalens ellenanyagot, majd 5 darab 8x10 cm-es lemezre vízszintező asztalkán 10 ml-ként elosztottam. A lemezeken az agar-gél réteg vastagsága, e mennyiség mellett, ideálisnak bizonyult, egyrészt a vizsgálati anyagok bemérésére illetve a szükséges reservoirok készítésére. A puffer oldat konzerválására literenként 200 mg nátrium-azid-ot használtam. Ezáltal a lemezek hűtőszekrényben hetekig felhasználhatóak voltak. Ahhoz, hogy a legnagyobb mennyiségű fehérjeprecipitátumok jól elkülöníthetőek legyenek, megtaláltam azt az ideális arányt, amely lemezenként antigén esetén 0,2 mikro liternek, antitest esetén 0,2 milli liternek bizonyult. 1
Grabar P., Williams C.A., Jr.: Methode immuno.electrophoretique d’analyse de substances antigeniques. Biochim.Biophys.Acta 10.193-194. o. (1953) 2 Backhausz Richárd: Immunhdiffúziós és immunelektroforézises módszerek Budapest (1968) 3 Emidio Afonso: Quantitative Immunelektrophoresis of serum Proteins- Clin. Chim. Acta 10 114-122. o. (1964)
2
Időközben már rendelkeztem a szükséges hazai gyártmányú futtató kamrákkal és egyenirányító tápegységekkel, az azóta bezárt Balassa János Kórház, ismertebb nevén a Vas utcai kórház vezetősége segítségével. További szükségletek:
A vizsgálati anyag pontos méréséhez a Svájci Hamilton Bonaduz AG által gyártott 1 mikro literes,100-reszre osztott precíziós fecskendő Veronal - veronal-nátrium puffer pH 8,3, µ = 0,1 Nátrium-azid a puffer oldat konzerválásához 200 mg/l Difco-purified agar USA 1,5%-os 8x10 cm-es üveglemezek Erlenmayer lombikok Kapillárisok, pipetták Vízszintező asztalka Petri csészék, az elkészített agar lemezek tárolásához. Papír sablon, a vizsgálati minták megfelelő helyének megjelöléséhez. Macherey Nagel (továbbiakban: MN) gyártmányú 214-es számú szűrőpapír az áram agar-gélen való átvezetéséhez. 10 ml puffer oldatban feloldunk 0,5 gr brómfenolkéket, amelyet jelzőként használunk, mivel együtt halad az albuminnal. a lemezek megfestésére leginkább amidofeketét, vagy nigrozint használtam.
A lemezeken 150 V feszültség és 15 mA áramerősség mellett 3 óra alatt történt meg a fehérjefrakciók szétválasztása. Ezután a lemezeket kiemeltem a futtató kamrából és vízzel átitatott MN szűrőpapírral lefedtem. 24 óra múlva a megszáradt szűrőpapírt eltávolítottam és a lemezt megfestettem. Szükség esetén a lemezek hajszárítóval rövid idő alatt festésre alkalmassá tehetők, ez által értékelésük egy munkanapon belül megtörténhet. A fehérje precipitátumok értékelése elsősorban vizuális, de a quantitatív eredmények is megállapíthatók. A kör alakban kialakult frakciók meghatározása Mancini módszerével megoldható. Az immunglobulinokat – a lemez felnagyítása után, területüket lemérve –, viszonyítjuk a minden lemezen megtalálható normál human szérum azonos frakciójához. A terület meghatározáshoz nagy segítséget nyújt egy magyar gyártmányú planiméter. A mért eredmények normál human szérum ismert paramétereivel való összehasonlítása lehetővé teszik a vizsgálati minta alacsony, normális vagy emelkedett értékeinek meghatározását. Történhet ez tömegmértékegységben (g) vagy tömegszázalékban. A paraproteinek esetén az agar-gél elektroforézis densitometriás értékei, valamint a kappa-lambda láncok stb. meghatározásai biztosítanak diagnosztikai jelentőségű adatokat. Természetesen tisztában vagyok azzal, hogy módszeremet, az elmúlt évtizedekben létrejött automata műszeres vizsgálatok óriási tömege, messze meghaladták. De bízom abban, hogy a szérum és más vizsgálati anyagok: plazma, sebváladékok képei, különös tekintettel a mai vizsgálatok rendkívül magas árviszonyaira, bizonyítják, hogy a manuális eljárások még szolgáltathatnak a gyakorlatban használható adatokat. Az ábrák demonstrálják az archiválás jelentőségét is. Az archiválás lehetővé teszi az adott betegséggel kapcsolatos változások megfigyelését. A következőkben, ábráim segítségével mutatom be, hogy az említett ideális antigén antitest viszonyok kialakítása mellett, a normális és kóros állapotok különbségei meggyőzően kimutathatók.
3
1. ábra A kiindulási pont: Normális és IgG paraprotein agar-gél, illetve immunelektroforézis, amelynek megváltoztatására dolgoztam ki módszeremet.
4
2. ábra Az ábra egy normális kontrol szérum (78 g/l) módszeremmel kialakított képét mutatja, amely egyben segítséget nyújt a következő ábrákon látható precipitátumok felismeréséhez. A gamma globulinok mellett a többi frakció is jól elkülönülve látható, ezáltal a jelenség a szérumfehérjék fixációs immunelektroforézisé-nek tekinthető. A kör alakú precipitátumok Mancini módszerével, a többiek egyéb eljárásokkal (pl.: planimetria) a minden lemezen megtalálható normális kontrol szérum képével összehasonlítva quantitatíve is értékelhetők. Egy lemezen általában 7-10 vizsgálati szérumot és 1-3 normál kontrol mintát tudtam vizsgálni. 5
3. ábra Az ábrán hét vizsgálandó szérumminta és három normál humán szérum képe látható. A vizsgált minták mennyisége: 0,2 μl. 1. Emelkedett α1 antitrypszin, csökkent transzferrin 3. IgA paraprotein 5. IgG paraprotein 7. Csökkent albumin, emelkedett IgG 8-9-10. Normál humán szérum 0,1 – 0,15 – 0,20 µl mennyiségei
6
4. ábra A kilenc vizsgálati minta számos tanulsággal szolgál. 3. 4. 5.
6. 7.
8. 9. 10.
Szülő anya – emelkedett transzferrin szint Újszülött fiú gyermekének köldökzsinór vér széruma Újszülött leány köldökzsinór vér széruma. Az újszülöttek IgM frakciója nem látható, mivel magas molekula súlya miatt a placentán nem jut át az irodalmi adatoknak megfelelően. Újszülött lány anyja – ugyancsak emelkedett transzferrin szint A gél elektroforézisen a gamma globulin normális. Míg itt az IgG jól látható kettős precipitációs zónában jelent meg. Tulajdonosa növényvédő szerrel dolgozó férfi, akinek cholinészteráz aktivitása erősen csökkent. A jelenség magyarázatát további vizsgálatok hivatottak eldönteni. Súlyos, előrehaladott máj cirrhosis, kifejezetten csökkent albumin és transzferrin, extrém mértékben megszaporodott IgG és IgM frakciók. Megnövekedett albumin valamint normális IgG mellett, IgG paraprotein; májtumor! Normál kontrol szérum.
7
5. ábra A módszer továbbfejlesztése: A 8x10 cm-es lemezen 10 ml agar és 0,2 ml Hyland trivalens IgG, IgA, IgM ellenanyag, 20 vizsgálati anyag és 8 normál humán szérum emelkedő mennyiségekkel. Feltűnő az 5. minta IgM hiánya és az IgA csökkent mennyisége. A 7. mintán az IgM kifejezetten emelkedett mennyisége, míg a 15. mintán az IgM hiánya szembetűnő. A szérum minták mennyisége 0,2 mikroliter!
8
6. ábra A fibrinogén vizsgálata Hyland monovalens ellenanyaggal történt. A 11 vizsgálati minta mellett, látható a 12. normál plazma is. A lemezen 0,4 ml hyland monovalens, antifibrinogén ellenanyag, 0,4 mikroliter plazma, illetve szérum szerepel. A fibrinogén, az α és β globulinok, mint acut fázis fehérjék, valamint a paraproteinek felszaporodása fokozzák a vörösvértestek süllyedését. De többek között fontos szerepe lehet a szívizom infarctus kialakulásában is. A 13-14-15 minta szérum mintákat tartalmaz, kicsapódás nem keletkezhetett, mert a szérumban nincs fibrinogén.
9
1
2
3
4
5
6
7
8
7. ábra Az ábrán elhelyezkedő 8 tárgylemezen agar gél elektroforézissel láthatók a paraproteinémiás szérumok. Mindegyik mellett – biztosítva az összehasonlíthatóságot –, látható egy normál humán szérum képe is (jobb oldalon – kivétel a 7. számú, ahol nincs normál szérum és a 4., ahol a baloldali a normál humán szérum). 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Ig – A paraprotein Ig – G paraprotein Ig – G paraprotein Ig – G paraprotein Ig – A paraprotein Ig – G jelzett paraprotein Ig – A paraprotein (Ugyanazon személy két mintája) Erősen megszaporodott Ig – G frakció.
8 a. ábra Az ábrán a kóros minták (1 - 8) Hyland trivalens ellenanyaggal készült IgA, IgM, IgG frakciói láthatók A jobb láthatóság kedvéért a lemezeken 0,5 µl szérumot mértem. A 9 -10-es számú a normál szérum képét mutatja, előbbi 0,25 µl, utóbbi 0,5 µl mennyiséggel. 10
8 b. ábra A 8 a és a 8 b ábrán ugyanazok a szérumok szerepelnek, de a 8 b ábrán a szérumok monovalens lambda-lánc ellenanyaggal kezelt képei láthatók. Sajnos abban az időben, amikor a vizsgálatok folytak kappa-lánc ellenanyagot beszerezni nem tudtam. Célszerű lenne ezen a területen is vizsgálatokat folytatni.
*
A következőkben röviden arról szólok, hogy e vizsgálatot addig ismeretlen területre is kiterjesztettük: a lábszár fekélyek sebváladékának tanulmányozására. Amikor eljárásom már a kórház napi gyakorlatában is helyet kapott, néhai Dr. Mester Endre sebész professzor, aki akkor az Orvos Továbbképző Intézet Lézer Kutató Csoportjának vezetője volt, azzal a megtisztelő ajánlattal keresett fel, hogy a lábszárfekélyek lézer sugárral történő kezelése előtt és után nézzük meg a sebváladékok fehérjéinek immunológiai állapotát.
11
9/a ábra A feladat végrehajtásához meg kellett oldani a minta nyerésének módját és fehérje tartalmának meghatározását. Hematokrit vagy nagyobb méretű kapilláris csővel egyszerű volt a minta biztosítása. A cső egyik végének lezárása és centrifugálása után rendelkezésre állt a vizsgálatokhoz szükséges tiszta felül úszó anyag. A fehérje koncentráció sűrűsége lézerkezelés előtt 2,8-4,5 g/l, lézerkezelés után 5,0-6,0 g/l. Lemezünkre a sebváladékokból 0,4 mikro litert mértem ki, és a korábbiakban leírtaknak megfelelően végrehajtottam az elektroforézist. A változások leméréséhez a kezelés előtti és utáni értékek összehasonlítása adott lehetőséget. Összesen 20 személy, több alkalommal vett sebváladékának mérésével megállapítottuk, ez egyes fehérjefrakciók mennyiségi értékeinek szembetűnő szaporodását, mint a lézersugár biostimulatív hatásának bizonyítékát. Ezen tapasztalatainkról több helyen beszámoltunk. 4 5 6
4
E. Mester, N. Tóth, Zs. Járányi: Die biostimulierende Wirkung der Laserstrahlen auf die wichtigsten Wundsekret nachweisbaren Eiweissfraktionen. Laser in der Medizin (Berlin, 1981) 46-47.o. 5 E.Mester, L. Hazay, M. Fenyo, I. Kertész, N. Toth, Z. Járányi, J. Tóth: The Biostimulating Effect of Laser Beam. Optoelectronics in Medicine (Proceedings of the 5th International Congress,Springer Verlag Berlin-Heidelberg, New York, 1981) 146-152.o. 6 Endre Mester, Nándor Tóth and Ádám Mester: The biostimulative effect of beam (The 4th congress of the International Society for laser surgey,Tokyo 1981) 22-27.o.
12
3
4
Lézer előtt
5
Lézer után
6
Lézer előtt
9/b. ábra 7
9
8
Lézer előtt
Lézer után 9/c. ábra
Lézer után
10
Lézer előtt
9/d. ábra
Lézer után 9/e. ábra
Standard normál szérum
9/f. ábra
9. ábra A sebváladékok immunelektroforézissel előállított képei *
Az immunelektroforézis alakulását, fejlődését később különösen a számítógép adta lehetőségeken belül igyekeztem figyelemmel kísérni. Mivel módszeremhez hasonló kivitelezést és ábrázolásmódot eddig nem találtam, bátorkodtam, ha 30 évvel később is, nyilvánosságra hozni. Tettem ezt abban a reményben, hogy manuális eljárásomnak a mai vizsgálati árak mellet még mindig lehet gyakorlati jelentősége. Az újabb fertőző betegségek előfordulása miatt a módszer egyszerűsége és rendkívüli gazdaságossága mellett, alkalmas lehetne a nagyon hiányzó tömeges immunológiai szűrővizsgálatokra. Budapest, 2015. március A szerző elérhetősége: Dr. Tóth Nándor,
[email protected]
13
