A Caskin1 állványfehérje vizsgálata Doktori értekezés
Balázs Annamária Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Buday László egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr. Schlett Katalin egyetemi adjunktus Dr. Czirják Gábor egyetemi adjunktus Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Enyedi Péter egyetemi tanár Dr. Nyitrai László egyetemi docens Dr. Mócsai Attila egyetemi docens
Budapest 2009
Tartalomjegyzék
1. Rövidítések jegyzéke ....................................................................................... 3 2. Bevezetés........................................................................................................... 5 2.1. Fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakítására képes domének ....................................... 6 2.1.1. Prolinban-gazdag régió és SH3 domének ................................................................ 8 2.1.2. SAM domének........................................................................................................ 11 2.1.3. ANK ismétlődések ................................................................................................. 13 2.1.4. PDZ domén ............................................................................................................ 15 2.1.5. SH2 domén............................................................................................................. 17 2.1.6. PH (Pleksztrin homológ) domén ............................................................................ 19 2.2. Caskin fehérje................................................................................................................ 21 2.3. Az Abi2 fehérje .............................................................................................................. 24 2.4. A Cortactin fehérje ........................................................................................................ 27 2.5. Rendezetlen fehérjék...................................................................................................... 29 2.6. A kémiai szinapszis és a posztszinaptikus denzitás ....................................................... 34
3. Célkitűzések ................................................................................................... 40 4. Anyagok és módszerek.................................................................................. 41 4.1. Plazmidok és DNS konstrukciók.................................................................................... 41 4.2. Ellenanyagok, reagensek és sejtvonal ........................................................................... 42 4.3. Sejtvonalak, sejttenyészetek........................................................................................... 43 4.4. Élesztő két-hibrid rendszer............................................................................................ 44 4.5. Tranziens transzfekció................................................................................................... 44 4.6. COS7 sejtek szétterülése fibronektinnel bevont felszínen, és immunfluoreszcencia ..... 44 4.7. Precipitáció, immunprecipitáció és Western blot ......................................................... 45 4.8. Limitált proteolízis vizsgálatok ..................................................................................... 46
1
4.9. CD spektroszkópia......................................................................................................... 46 4.10. Gélfiltrációs kromatográfia......................................................................................... 46 4.11. In vitro kináz mérés ..................................................................................................... 47 4.12. In vivo foszforiláció..................................................................................................... 47
5. Eredmények ................................................................................................... 48 5.1. Cortactinhoz kötődő fehérjék azonosítása .................................................................... 48 5.2. A Caskin1 klónozása ..................................................................................................... 52 5.3. Caskin1 ellenanyag előállítása ..................................................................................... 56 5.4. A Caskin1-hez számos fehérje kötődik élesztő két-hibrid rendszerben ......................... 59 5.5. Az Abi2 SH3 doménjén keresztül kapcsolódik a Caskin1 prolinban-gazdag régiójához ......................................................................................... 64 5.6. A Caskin1 és az Abi2 in vivo is kapcsolódnak .............................................................. 67 5.7. A Caskin1 C-terminális fele rendezetlen szerkezetű ..................................................... 70 5.7. A PKA és a PKC képes foszforilálni a Caskin1 prolinban-gazdag szakaszát............... 76
6. Eredmények megbeszélése............................................................................ 81 7. Következtetések ............................................................................................. 85 8. Összefoglalás .................................................................................................. 87 9. Summary ........................................................................................................ 88 10. Irodalomjegyzék .......................................................................................... 89 11. Saját közlemények..................................................................................... 101 12. Köszönetnyilvánítás .................................................................................. 102
2
1. Rövidítések jegyzéke
Abi2: Abl-kötő fehérje-2 Abl: Abelson tirozin kináz ANK: ankirin ismétlődés BSA: marha szérum albumin cAMP: ciklikus-adenozin monofoszfát Caskin1: Cask kötő fehérje-1 dbcAMP: dibutiril-cAMP DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium EGF: epidermális növekedési faktor Eph: Ephrin receptor FCS: fötális borjú szérum GFP: zöld fluoreszcens fehérje GST: glutation-S-transzferáz IP: immunprecipitáció IPTG: izopropil-β-tiogalaktozid IP3: inozitol-triszfoszfát MAGUK: membránhoz asszociálódó guanilát-kináz Nap125: 125 kDa Nck-asszociált fehérje NMDA: N-metil-D-aszpartát ORF: nyílt olvasási keret PCR: polimeráz láncreakció PH: pleksztrin homológ PIP: foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát PIR121: 121 kDa p53-indukált mRNS PKA: protein-kináz A PKC: protein-kináz C PMSF: fenil-metil-szulfonil fluorid PRD: prolinban-gazdag domén PSD: posztszinaptikus denzitás
3
PTB: foszfotirozin kötő SAM: steril alfa motívum SDS-PAGE: nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis SH2: Src homológia 2 SH3: Src homológia 3 SMART: Simple Modular Architecture Research Tool siRNS: kis inhibitoros RNS TPA: tetradekanoil forbol acetát WAVE: WASP család verprolin homológia fehérje WB: Western blot
4
2. Bevezetés
Az evolúció során az egysejtű élőlények 2,5 milliárd évvel megelőzték a többsejtűek kialakulását. A többsejtű szerveződési szint késői megjelenésének egyik oka az, hogy hiányoztak a sejtek közti kommunikáció feltételei. Abban, hogy az egyedi sejtek saját viselkedésüket a többsejtű szervezet szolgálatába állíthassák, alapvető volt a jelátviteli rendszerek kialakulása. Ugyan az egysejtűek világában is létezik kommunikáció a különálló sejtek között, gondoljunk csak az élesztők ivaros szaporodására, a szignalizációs hálózat azonban sokkal szerteágazóbb a magasabbrendűekben. Osztódni vagy differenciálódni, letapadni vagy mozogni, túlélni vagy elpusztulniezek a legfontosabb döntések egy többsejtű szervezet sejtjeinek fejlődése és későbbi élete során. E döntéseket a külső és belső környezeti körülmények együttesen határozzák meg, a sejtválaszoknak pontosnak és szabályozottnak kell lennie. Azt a folyamatot, amely során egy sejt a külső és belső környezeti hatásokra válaszol, jelátvitelnek nevezzük. A jelátvitel, idegen szóval szignál transzdukció, része a celluláris kommunikációs rendszernek, irányítja a sejt alapműködéseit és összehangolja reakcióit. A szignál transzdukcióban résztvevő legtöbb fehérje moduláris szerkezetű, fehérjefehérje kapcsolatok kialakítására képes, illetve katalitikus aktivitással rendelkező elemekből, úgynevezett doménekből áll. Ezt először a receptor tirozin-kinázok jelpályáiban szereplő fehérjék esetén írták le Pawson és munkatársai 1995-ben (Pawson 1995). Dolgozatomban a fehérjék közti interakciók létrehozásáért felelős doménekkel is foglalkozom. Miért is olyan fontosak a fehérje-fehérje kölcsönhatások a jelátviteli folyamatokban? Két fehérje interakciójának számos következménye lehet, például a szignálfehérje más fehérjékhez kapcsolódva aktiválódásának helyére lokalizálódhat. A fehérjék közti kölcsönhatások következménye konformáció változás is lehet, amelynek hatására egyéb kötő-, illetve katalitikus helyek szabadulhatnak fel. Természetesen a két folyamat nem zárja ki egymást. Számos esetben a fehérje lokalizációjának változása együtt jár konformációjának átalakulásával. Két fehérje kapcsolatának patológiás következménye is lehet. Számos fehérjemutáció
hatása
rendellenes
interakciók
átprogramozhatja a sejt működését.
5
létrejöttében
nyilvánul
meg,
amely
2.1. Fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakítására képes domének
A fehérjék közti kölcsönhatások tehát az interakciós doméneken keresztül jönnek létre. Azok felismerhetik partner fehérjéjükben a prolinban-gazdag régiókat, a C-terminális motívumokat, a poszttranszlációs módosításokat, doméneket, a másodlagos hírvívő molekulákat, stb. Kötődhetnek a membránok foszfolipidjeihez is, kialakíthatnak több fehérjéből és lipidből álló jelátviteli komplexeket. A fehérjék közti interakciókat kialakító domének a katalitikus aktivitással rendelkező doménekkel együttműködve járulnak hozzá a sejt dinamikus állapotának fenntartásához. A tirozin-kinázok például foszforilált tirozin oldalláncokat hoznak létre szubsztrátjaikon, amelyekhez SH2 (Src homológ 2), illetve PTB (foszfotirozin-kötő) szekvenciák kapcsolódnak. Az egyes domének aminosav sorrendjük alapján azonosíthatók, így ismerve egy fehérje szekvenciáját, megjósolhatjuk kötőképességét, esetleg biológiai funkcióját. Az interakciós modulok kb. 30-200 aminosavból állnak, néhány közös tulajdonsággal jellemezhetők. Az azonos csoportba tartozó modulok mind szekvenciájukban, mind struktúrájukban hasonlóak. N- és C-terminálisuk általában egymás közelében helyezkedik el, míg kötőfelszínük a domén ellentétes oldalán található. Ez az elrendezés lehetővé teszi, hogy fehérjékbe ékelődve is képesek kölcsönhatásba lépni ligandjaikkal. Fiziológiás partnereiket önállóan expresszálva is megkötik. Általában több, kölcsönhatások kialakítására képes domén helyezkedik el a polipeptid láncon. Mivel különböző kombinációban fordulnak elő a fehérjékben, így alapját képezik a bonyolult jelátviteli rendszer létrejöttének. E szerkezeti egységek biztosítják tulajdonképpen a jelátvitel specifikusságát. Végül jellemző, hogy ezek a modulok széleskörűen elterjedtek az eukarióta sejtekben. Az interakciós domének csoportosíthatók szerkezetük, illetve kötőképességük alapján. Felépítésük szerint lehetnek: 1, SH2-SH3 típusú domének. Ebbe a csoportba sorolható struktúrák specifikus és karakterisztikus kötőképességet kölcsönöznek azoknak a fehérjéknek, amelyekben előfordulnak. Ide tartoznak az SH2 (Src homológia 2), SH3 (Src homológia 3), PDZ (PSD95 (posztszinaptikus denzitás fehérje-95), Dlg (Disc-large) ZO1 (zona occludens1)), SAM (steril alfa motívum), Chromo, Bromo, stb. domének. 2, A másik osztály az ankirin vagy armadillo típusú ismétlődések csoportja. E domének esetén a szekvenciahomológia csak harmadlagos szerkezetbeli hasonlóságot tükröz, nem rendelhető ezekhez jellemző kötőképesség. Az ismétlődő szekvenciák akár ötvenszer is előfordulhatnak egy fehérjében. 6
Ide sorolhatók a HEAT (huntingtin, elongációs faktor 3, a protein-foszfatáz 2A A alegysége, TOR1), TPR (tetratrikopeptid), Arm (Armadillo), ankirin, Pumilio-homológ, stb. szekvenciák. A másik csoportosítás alapja a különböző domének kötőképessége. Vannak rövid peptideket, módosított peptideket, nukleinsavakat, foszfolipideket felismerő struktúrák. Léteznek olyan domének is, amelyek más fehérjékben lévő doméneket ismernek fel, így homo-, vagy heterodimerek kialakításásra képesek. A ma ismert közel 2000 interakciós domén mindegyikének ismertetése meghaladná az értekezés kereteit, ezért csak azon modulok bemutatására szorítkozom, amelyek az általunk vizsgált fehérjékben fellelhetők, illetve leggyakrabban fordulnak elő.
7
2.1.1. Prolinban-gazdag régió és SH3 domének Az SH3 doméneket először az Src tirozin kinázokban írták le (Mayer és Gupta 1998), mára azonban nyilvánvalóvá vált, hogy számos fehérje felépítésében részt vesznek. Megtalálhatók
például
a
foszfolipázokban,
foszfatidil-inozitol-3-kinázokban,
adapter
fehérjékben, a Ras GTP-áz aktivátor fehérjékben, stb. A prolinban-gazdag régiókat felismerő domének családjába tartoznak, ide sorolhatók még a WW (nevüket a bennük található két konzervált triptofánról kapták) (Kato és mtsai 2004), EVH1 (Enabled/VASP (vazodilatátorstimulált fehérje) homológ) (Ball és mtsai 2002), (Prehoda és mtsai 1999) GYF domének (nevét a benne előforduló glicin, tirozin, fenilalanin alapján kapta) (Freund és mtsai 1999), stb. A prolinban-gazdag szekvenciák nagyon gyakoriak mind a prokarióta, mind az eukarióta proteomban. Ennek oka magában a prolinban keresendő. Nyilvánvaló, hogy a peptid szekvenciának, amely a kölcsönhatásban részt vesz, a fehérje felszínén kell elhelyezkednie. A prolin ismert tulajdonsága, hogy megtöri a másodlagos szerkezeti elemeket, emiatt a több prolint tartalmazó struktúrák gyakran a fehérjék felületén találhatók. Fontos az is, hogy a prolin egy szekunder amin, így csak meghatározott konformációt vehet fel a poliprolin szakasz. Legkedvezőbb struktúra számára a balra csavarodó hélix, amely fordulatonként három aminosavat tartalmaz. Ezt nevezik II-es típusú poliprolin hélixnek. A struktúra jellegzetessége, hogy megőrzi szerkezetét akkor is, ha viszonylag nagyszámú prolint helyettesítünk más aminosavval. Mivel merev ez a motívum, entrópiája eleve kisebb, mint egy flexibilis szakaszé, kötése így kevéssé csökkenti rendezetlenségét egy α-helix, vagy egy β-redős
szerkezethez
képest.
Kölcsönhatásainak
létrejötte
tehát
molekuladinamikai
szempontból is előnyös. Az SH3 domének a gerincesekben leggyakrabban előforduló, mint ahogy már említettem, prolinban-gazdag szekvenciákat felismerő struktúrák. Az emberi genomban becslések szerint 409 kópiában fordulnak elő. A II-es típusú poliprolin hélixet ismeri fel, központi elemként általában a PXXP szakaszt. Itt az X bármely alifás aminosav lehet (Sparks és mtsai 1998). Rickles és munkatársai random peptidkönyvtárat teszteltek fág bemutatás módszerével (Rickles és mtsai 1995), így azonosítottak SH3-kötő peptideket. Kimutatták, hogy a kapott szekvenciák két csoportba sorolhatók. Az egyes osztályba a ZP(L/P)PPΦP, a
8
kettes osztályba pedig a PPΦPPZ peptidek tartoznak, ahol a Z egy, az adott SH3 doménre specifikus aminosavat, a Φ pedig egy hidrofób aminosavat jelent. Egyre több kísérleti eredmény utal azonban arra, hogy az SH3 domének nagy változatosságot mutatnak specificitásukban. Az említett szekvencián kívül képesek felismerni más motívumokat is. Ligandjaik jelentős része tartalmaz R/KXXR/K motívumot (Berry és mtsai 2002), (Liu és mtsai 2003), (Lewitzky és mtsai 2001), amely nem tartalmaz prolint. Úgy tűnik ez a motívum az SH3 domének által felismert szekvenciák harmadik osztályának tekinthető. Megtalálható például a Gab1 és a Gab2 (Lewitzky és mtsai 2004), a BLNK (B-cell linker protein), SLAP130/Fyb, HPK1 (haematopoietic progenitor kinase), a T-sejt specifikus adaptor fehérje, a SLP-76 (Berry és mtsai 2002), amelyek a Grb2 és/vagy Gad fehérjék SH3 doménjéhez kapcsolódnak. A pozitív töltésű aminosavak nemcsak a kötési energiát növelik azáltal, hogy elektrosztatikus kölcsönhatásokat alakítanak ki a kötőzsebben lévő aminosavakkal, de irányítják is a ligandot a kötőhely felé. A további diverzitást mutatja, hogy például az amfifizin olyan szekvencián keresztül kapcsolódik a dinaminhoz, amely prolinban és bázikus aminosavakban is gazdag (PXRPXR(H)R(H)). A STAM (signal transducing adaptor molecule), EAST (epidermal growth factor receptor-associated protein with SH3 and tyrosine-based
activation
motif
domains)
és
a
Hbp
(Hrs-binding
protein)
a
PX(V/I)(D/N)RXXKP konszenzus szekvenciákhoz kapcsolódik. Szerkezetüket tekintve az SH3 domének öt, antiparallel állású β-lemezből és az azokat összekötő RT- és n-Src hurokból, továbbá 310 hélixből állnak (2.1. ábra). Az RT-hurok nevét a benne előforduló, konzervált arginin és treonin aminosavakról kapta. Kötőfelszínük három jól elkülöníthető területet alkot. Aromás aminosavak két hidrofób, sekély árkot formálnak XP dipeptidek számára. Oldalláncaikon keresztül erős van-der-Waals kölcsönhatásokat alakíthatnak ki a liganddal. A kötőhely harmadik tagja a kapcsolat specifikusságát meghatározó zseb. Ezt az RT és az n-Src hurok együttesen formálja meg (Lim és mtsai 1994), (Musacchio és mtsai 1994). Legújabb adatok alapján az SH3-ligand kötés kialakításában a specifikus szekvenciákon kívül a fehérje felületek között kialakuló harmadlagos kapcsolatoknak is van szerepe.
9
310 hélix
n-Src hurok
RT-hurok
2.1. ábra: Az SH3 domén szerkezete prolinban-gazdag régióval asszociálódva, a SEM5 C-terminális SH3 doménje köti az SOS peptidet (piros). Szerkezetüket tekintve az SH3 domének öt, antiparallel állású β-lemezből és az azokat összekötő RT- és n-Src hurokból, és 310 hélixből állnak. Kötőfelszínük három jól elkülöníthető területet alkot. Aromás aminosavak két hidrofób, sekély árkot formálnak XP dipeptidek számára. Oldalláncaikon keresztül erős van-der-Waals kölcsönhatásokat alakíthatnak ki a liganddal. A kötőhely harmadik tagja a kapcsolat specifikusságát meghatározó zseb. Ezt az RT és az n-Src hurok együttesen formálja meg.
10
2.1.2. SAM domének 1995-ben Ponting 14 fehérjében azonosított egy-egy, kb. 70 aminosavból álló, konzervált szekvenciát (Ponting 1995). Mivel elsőként olyan fehérjékben mutatta ki, amelyek az élesztők szexuális differenciációjában játszanak szerepet, másodlagos szerkezetük pedig helikális elrendezésű, ezért SAM, azaz steril alfa motívumnak nevezte el ezt a domént. Kimutatta továbbá azt is, hogy az addig Pointed, SEP (yeast sterility), NCR (N-terminal conserved), illetve HLH (helix-loop-helix) néven ismert domének valójában mind SAM motívumok. Becslések szerint kb. 1300 prokarióta és eukarióta fehérjében fordul elő ez a domén (Schultz és mtsai 1997), így például az összes Ephrin családba tartozó receptor tirozinkináz C-terminálisán megtalálható. Azok a fehérjék, amelyek tartalmazzák ezt a szekvenciát és funkciójuk is ismert, mind a fejlődésében játszanak fontos szerepet (Schultz és mtsai 1997). A különböző SAM domének szerkezete eltérő funkciójuk ellenére nagyon hasonló, öt α-hélix alkotja. A 2.-5. hélix kompakt struktúrát alkot, az 1. hélix különálló (2.2. ábra). Kristályszerkezeti elemzések rámutattak, hogy a steril alfa motívumok felszínén két intermonomer-kötő felszín található, ez arra utal, hogy egyidejűleg több fehérje kapcsolódhat egymáshoz SAM moduljaikon keresztül. Ez figyelhető meg például a posztszinaptikus denzitásban, ahol a ProSAP/Shank fehérjék SAM szakaszaikon keresztül asszociálódva lemezszerű struktúrát hoznak létre (Valtschanoff és Weinberg 2001), (Baron és mtsai, 2006). A SAM domének kötőpartnerei sokfélék. Kezdeti vizsgálatok, melyeket az Eph receptor tirozin-kinázokon végeztek, azt mutatták, hogy homo-, illetve heterooligomerek kialakítására képesek (Stapleton és mtsai 1999), (Thanos és mtsai 1999). Később megállapították, hogy a SAM domének olyan fehérjékkel is képesek kapcsolódni, amelyek nem tartalmaznak steril alfa motívumot. Több bizonyíték született arra, hogy a SAM modult tartalmazó fehérjék foszfoprotein-foszfatázokat kötnek. A LAR (leukocyte common antigen related) interakcióba lép a LIP (LAR-interacting protein) SAM motívumával (Serra-Pages és mtsai 1995). Kimutatták, hogy az EphB1 receptor SAM doménjén keresztül köti meg a kis molekulasúlyú foszfoprotein-foszfatázt (Stein és mtsai 1998). Egy Ras kötő fehérje, az AF6 PDZ doménjével kapcsolódik az Eph receptorok SAM doménjéhez (Hock és mtsai 1998). A legérdekesebb eredményre egy Drosophila fehérje, a Smaug vizsgálatával jutottak (Green és mtsai 2003), (Aviv és mtsai 2003), Chongwoo és mtsai 2003). Ez a fehérje a Nanos transzlációjának gátlásával a morfogén grádiens kialakításában játszik szerepet a fejlődő
11
embrióban. Azt találták, hogy a Smaug SAM doménjén keresztül kölcsönhatásba lép a Nanos fehérje mRNS-ével. A nukleinsav kötőhely kialakításában a domén felszínén elhelyezkedő pozitív töltésű aminosavak vesznek részt. Li és munkatársai feltehetően a SAM domének egy új altípusát azonosították a DLC-2 (deleted in liver cancer-2) fehérjében. Steril alfa motívumának szekvenciája csak kis mértékben homológ (15-30%) más, eddig jellemzett SAM doménnel. Harmadlagos szerkezete is eltérő, csupán négy hélixből áll. Oldatban csak monomerként fordul elő és lipidkötő képességgel rendelkezik (Li és mtsai 2007).
2.2. ábra: A SAM domén szerkezete az S. cerevisiae Ste50 fehérje példáján. A SAM domént öt α-hélix alkotja. A 2.-5. hélix kompakt struktúrát alkot, az 1. hélix különálló. Kristályszerkezeti elemzések rámutattak, hogy a steril alfa motívumok felszínén két intermonomer-kötő felszín található, ez arra utal, hogy egyidejűleg több fehérje kapcsolódhat egymáshoz SAM moduljaikon keresztül.
12
2.1.3. ANK ismétlődések Az 1990-es évek végén Heringa mutatott rá arra, hogy számos fehérjében rövid, ismétlődő szekvenciák fordulnak elő. Biokémiai és szerkezetvizsgálati módszerekkel megállapították, hogy az ismétlődések moduláris fehérjekötő felületek építőkövei (Heringa 1998). Ellentétben az addig ismert fehérje-fehérje interakciós doménekkel, nem specifikus aminosav szekvenciákat ismernek fel, hanem egy elnyúlt kötőfelszínt hoznak létre, amelyhez különböző partnerek kapcsolódhatnak. Az ismétlődéseket tartalmazó fehérjék számos fiziológiás folyamatban vehetnek részt. Szerepük van a sejtváz integritásának fenntartásában, a sejtciklus szabályozásában, a jelátvitelben, fejlődési, differenciálódási folyamatokban, bakteriális invázióban, stb. (Andrade és mtsai 2001), (Forrer és mtsai 2003). Napjainkig több mint 20, leginkább állványfehérjékben előforduló ismétlődő szekvenciát írtak le, például: leucin-gazdag (LRR), ankirin (ANK), armadillo, tetratrikopeptid repetitív motívumok. Az ankirin modul 33 aminosavból áll. Először egy élesztő sejtciklus szabályozó fehérjében, a Swi6/Cdc10-ben írták le, majd a Drosophilából származó Notch-ban (Breeden és Nasmyth 1987). Nevét a sejtváz-alkotó ankyrinről kapta (Lux és mtsai 1990), amelyben 24 kópiában szerepel. Azóta számos prokarióta, eukarióta és a virális fehérjében is azonosították (Sedgwick és Smerdon 1999). A SMART adatbázisban jelenleg 19276 ankirin ismétlődést tartanak nyilván 3608 fehérjében. Az egyes fehérjékben változó számban fordulnak elő, legtöbbet eddig egy Giardia lambliából származó proteinben, az ORF-ban találtak, amely 34 ismétlődést tartalmaz. Az egyes motívumok két, antiparalel állású hélixet formálnak. Egyetlen ismétlődés nem képes megfelelően tekercselődni, legalább két motívumra van szükség a helyes térbeli szerkezet kialakításához (Zhang és Peng 2000), (Mosavi és mtsai 2002) (2.3. ábra). A szomszédos modulok csaknem lineárisan kapcsolódnak egymáshoz. A hélixek közti intra-, és interhelikális hidrofób kölcsönhatások stabilizálják a struktúrát, az összekötő régiók pedig flexibilis β-lemezszerű szerkezetet alkotnak (Tevelev és mtsai 1996). Az ankirin ismétlődések két állapotban fordulhatnak elő a fehérjékben, kitekeredett, illetve natív konformációban (Tang és mtsai 1999), (Zeeb és mtsai 2002), (Yuan és mtsai 1999), (Zweifel és Barrick 2001), (Zweifel és Barrick 2001), (Zweifel és mtsai 2003). Az előzőekben már utaltam rá, hogy az ANK domének nem specifikus aminosavszekvenciákat ismernek fel, hanem elnyúlt felszínükhöz különböző fehérjék
13
kötődhetnek. Partnereikkel számos ponton kapcsolódnak, az interakciók kialakításáért felelős aminosavak elszórtan helyezkednek el a modul teljes hosszában. Jellemző, hogy egy adott fehérje több ANK ismétlődéshez is kapcsolódhat, illetve egy modul több fehérjét is felismer.
2.3. ábra: Az ANK domének szerkezete a Swi6 fehérje példáján bemutatva Az egyes motívumok két, antiparalel állású hélixet formálnak. Egyetlen ismétlődés nem képes megfelelően tekercselődni, legalább két motívumra van szükség a helyes térbeli szerkezet kialakításához. A szomszédos modulok csaknem lineárisan kapcsolódnak egymáshoz. A hélixek közti intra-, és interhelikális hidrofób kölcsönhatások stabilizálják a struktúrát, az összekötő régiók pedig flexibilis βlemezszerű szerkezetet alkotnak.
14
2.1.4. PDZ domén A PDZ domének a legelterjedtebb szerkezeti motívumok közé tartoznak, a nyílt olvasási keretek 0,2-0,5%-át alkotják. Eredetileg ezt a strukturális elemet három fehérjében azonosították, a PSD95-ben (posztszinaptikus denzitás fehérje-95), a Drosophila „septate junction” fehérjében, a Disc-large-ban (Dlg) és az epitéliális „tight junction” fehérjében, a ZO-1-ben (zona occludens-1) (Kennedy 1995). A PDZ doméneket még DHR-nak (Disc-large homology regions) és GLGF motívumoknak nevezik, a bennük konzervatívan előforduló négy aminosav alapján. Ezek a domének 80-100 aminosavból állnak, partner fehérjéik, amelyek általában transzmembrán receptorok, vagy ioncsatornák, C-terminálisán elhelyezkedő, úgynevezett PDZ-kötő szekvenciákat ismernek fel. Újabb vizsgálatok arra utalnak, hogy foszfatidilinozitol származékokkal, illetve más fehérjékben előforduló azonos motívumokkal is interakcióba léphetnek. Egyetlen PDZ domén több partnert is felismer, illetve ugyanaz a ligand több PDZ motívumhoz is kapcsolódhat. Egy fehérjében általában több kópiában fordulnak elő, molekuláris ragasztóként viselkedve hatalmas fehérjékomplexek kialakulását segítik elő. A PDZ domének a metazoák körében széleskörűen elterjedtek, az egysejtűekben ritkán fordulnak elő. A SMART adatbázis alapján 1163 PDZ domén taláható 484 humán fehérjében, míg Escherichia coliban mindössze 5 lelhető fel. Szerkezetüket tekintve hat β-szálból (βA-βF) és két α-hélixből (αA, αB) állnak, βszendvics konformációt alkotnak (2.4. ábra). A ligand a βB szál és az αB hélix által formált árokba kötődik. A molekuláris ligandfelismerés alapjait felfedő kutatások rámutattak, hogy a kötődő peptid C-terminálisának 0 pozíciójában lévő aminosav döntő fontosságú. Ez általában valin, illetve néhány PDZ domén esetén izoleucin vagy leucin. Ez a relatív kis méretű hidrofób zseb jelenlétével magyarázható, amely nem képes aromás oldalláncok befogadására (Doyle és mtsai 1996). A PDZ domének kötőképessége a felismert peptidszakasz foszforilációjával szabályozható (Cao és mtsai 1999). A kötés affinitása közepesnek mondható, disszociációs konstansa az alacsony nanomoláris tartománytól a magas mikromoláris koncentrációig terjed (Harris és mtsai 2001), hasonlóan az SH2, SH3 doménekéhez. E tulajdonsága alkalmassá teszi szabályozó funkciók ellátására, mert így a kötés reverzibilis és az intracelluláris körülményektől függ. 15
Ahogy az előzőekben már utaltam rá, a PDZ doméneket eredetileg protein-protein interakciós modulokként írták le (Kennedy és mtsai 1995). Több fehérje esetén kimutatták, hogy a PDZ doménjeiken keresztül multimereket formálnak. Például a GRIP1 (glucocorticoid receptor interacting protein 1), amely hét PDZ domént tartalmaz, negyedik, ötödik és hatodik PDZ modulján keresztül kapcsolódhat más fehérjék azonos doménjéhez (Srivastava és mtsai 1998). Zimmermann és munkatársai 2002-ben leírták, hogy a syntenin, a CASK és a Tiam1 PDZ doménje foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfátot köt. Kimutatták, hogy a peptid és a PIP2 kötőhely átfed, élő sejteken végzett kísérletek pedig arra utalnak, hogy egy PDZ domént tartalmazó fehérje PIP2-, illetve peptid függő módon is kötődhet a membránhoz (Zimmermann és mtsai 2002). A PDZ doméneket tartalmazó fehérjéknek különösen fontos szerepet játszanak a posztszinaptikus denzitásban, ahol számos ilyen fehérje megtalálható. Legismertebb közülük a PSD95, amelyről később részletesen írok.
2.4. ábra: PDZ domén szerkezete a PSD95 fehérje 3. PDZ doménjének példáján. Szerkezetüket tekintve a PDZ domének hat β-szálból (βA-βF) és két α-hélixből (αA, αB) állnak, βszendvics konformációt alkotnak. A ligand a βB szál és az αB hélix által formált árokba kötődik.
16
2.1.5. SH2 domén Az SH2 domének kb. 100 aminosav hosszúságú modulok. E doméneket tartalmazó fehérjék leginkább a tirozin-kináz jelpályákban fordulnak elő (Pawson és Gish 1992), (Pawson és Schlessingert 1993). Ligandjaikban tirozinon foszforilált szekvenciákat ismernek fel (Koch és mtsai 1991). A növekedési faktorok receptoraikhoz kötődve azok dimerizációját váltják ki, tirozinkináz doménjeik így megfelelő közelségbe kerülnek és a receptorok intracelluláris része autofoszforilálódik, illetve egyéb fehérjék is foszforilálódnak. A foszforilált tirozin oldalláncok dokkolóhelyként szolgálnak az SH2 domének számára, így a receptor aktivációja az attól távolabb elhelyezkedő fehérjékre is átterjed. Az SH2 doméneket eredetileg az Src tirozin-kinázokban azonosították (Sadowski és mtsai 1986). Egysejtűekben nem találunk ilyen modulokat, ez az intercelluláris kommunikációban betöltött szerepükre utal (Brown és Cooper 1996), (Kawata és mtsai 1997). A human genomban eddig körülbelül 110 SH2 domént azonosítottak 100 fehérjében. Az
SH2
modulok
funkcionális
vizsgálatával
jutottak
két
nagyon
fontos
következtetésre a kutatók. Az egyik alapvető megfigyelés az a ma már jól ismert tény volt, hogy számos intracelluláris fehérje kis szerkezeti egységekből, protein-protein interakciók kialakítására képes doménekből áll. Targetjeikben specifikus szekvenciákat ismernek fel, ezáltal a domént tartalmazó fehérjét adott helyre lokalizálják. A második paradigma szerint az így kialakuló fehérje-fehérje interakciók szabályozhatók. Ez például az SH2 domének esetén abban nyilvánul meg, hogy a foszforilált tirozin oldalláncokat ismeri csak fel, míg a nem foszforilálthoz nem képes kötődni. Szerkezetüket tekintve az SH2 domének viszonylag egyszerű modulok. Két centrális helyzetű, antiparallel állású β-lemezt két α-hélix köt össze. A β-lemezeket hét β-szál alkotja (2.5. ábra). Az SH2 domének szerkezete nagymértékben konzervált, nagyon kis különbségek lelhetők csak fel az egyes fehérjék SH2 doméjeiben (Kuriyan és Cowburn 1997). A modulok funkcionálisan két régióra oszthatók, az egyik a foszforilált tirozin oldallánccal lép kapcsolatba, a másik pedig, a kötés specifikusságát biztosítva, az attól C-terminálisan elhelyezkedő aminosavakkal. A foszfotirozin-kötő hely a modul N-terminálisán, a specifikusságért felelős régió pedig a C-terminális felén található. Bradshaw és munkatársai kutatásaiból világossá vált, hogy az SH2 doméneknek a kötés specifikusságát meghatározó
17
régiója csak kevéssé diszkriminatív, lehetőséget biztosítva ezáltal a különböző jelpályák közti „cross-talk”-ra, átbeszélésre (Bradshaw és mtsai 2000), (Bradshaw és mtsai 1999).
2.5. ábra: Az Src SH2 domén foszfotirozin kötése. Szerkezetüket tekintve az SH2 domének viszonylag egyszerű modulok. Két centrális helyzetű, antiparallel állású β-lemezt két α-hélix köt össze. A β-lemezeket hét darab β-szál alkotja. Az ábrán az Src fehérje SH2 doménje látható a megkötött foszfotirozin peptiddel.
18
2.1.6. PH (Pleksztrin homológ) domén A közel száz fehérjében előforduló domén a mai ismereteink szerint fehérje-lipid interakciókat közvetíthet. Néhány újabb közlemény alapján azonban lehetséges, hogy fehérjefehérje kapcsolatok kialakításában is részt vesz (Varnai és mtsai 2005). Annak ellenére, hogy a különböző PH domének aminosavszerkezete jelentősen eltér egymástól, a térbeli szerkezetük hasonló. Két, egymásra merőleges β-lemez egy hengert alkot, melynek fenekén egy α-hélix helyezkedik el (2.6. ábra). A β-lemezek közti hurkok variábilisak, s az egyes PH modulokban különböző inzerciókat tartalmazhatnak. A hurkokban találhatók meg azok a bázikus aminosavak is, melyek a lipid kötéséért felelősek. A lipidekhez való affinitás alapján a PH doméneket három csoportba sorolhatjuk. Az első két osztályba tartozók nagy affinitással kötik a PIP2-t (például foszfolipáz C δ1), illetve a foszfatidilinozitol-3-foszfátokat (például Akt és Btk). A PH domének harmadik típusa kapcsolódhat lipidekhez, de a kötés kis affinitású és sokszor nem specifikus. Az ilyen PH doménnel rendelkező fehérjék esetében az oligomerizáció biztosíthatja a lipidekkel való asszociációt. Ez jellemző például a dinaminra, amelynek PH modulja kis affinitással kapcsolódik a PIP2-höz, az oligomerizáció hatására azonban az egyes PH domének kötődése összegződik, s a fehérjekomplexum a lipidhez rögzül. A kis affinitású PH domének mellett a fehérjében más modulok is segédkezhetnek a membrán transzlokáció létrehozásában. A βArk membránhoz kötődéséhez például szükség van a PH domén és a membrán kapcsolódása mellett arra is, hogy a fehérje a heterotrimer G fehérjék membránba rögzülő βγ alegységével is asszociálódjon (Goldman és mtsai 1997).
19
2.6. ábra: A patkány PLC δ1 PH doménje inozitol-1,4,5-triszfoszfátot köt. Annak ellenére, hogy a különböző PH domének aminosavszerkezete jelentősen eltér egymástól, a térbeli szerkezetük hasonló. Két, egymásra merőleges β-lemez egy hengert alkot, melynek fenekén egy α-hélix helyezkedik el. A β-lemezek közti hurkok variábilisak, s az egyes PH modulokban különböző inzerciókat tartalmazhatnak. A hurkokban találhatók meg azok a bázikus aminosavak is, melyek a lipid kötéséért felelősek.
2.1. táblázat: Fontosabb fehérje-fehérje kapcsolatokat kialakító domének összefoglalása.
Név
Méret/
Szerkezet
Kötésspecificitás
5 antiparallel állású β-lemez, és az azokat összekötő α-hélixek 5 α-hélix
Prolinban-gazdag szekvenciák Homo-, és hetero oligomerek formálása Nem azonosított
aminosav SH3
60
SAM
70
ANK
33
PDZ
90
SH2
100
PH
120
1 pár antiparallel α-hélix, melyek βhajtű motívumokon keresztül kapcsolódnak össze 5-6 β-lemez és 2 α-hélix β-szendvics konformációt alkot Centrális, antiparallel β-lemezeket 2 α-hélix vesz körül 2, orthogonálisan álló β-lemez βszendvics konformációt alkot, Cterminálisán egy α-hélix található
20
a, C-terminális peptidek b, fehérjén belüli peptidek c, PDZ-PDZ dimerizáció d, lipidek pTyr peptidek foszfatidilinozitolok
2.2. Caskin fehérje
A fehérjét 2002-ben írták le először Tabuchi és munkatársai. Cask-kötő fehéjeként azonosították affinitástisztítási rendszerben, ahol csaliként a Cask N-terminális CaM kináz doménjét használták (Tabuchi és mtsai 2002). Neve innen ered, Caskin: Cask-interacting protein. A Cask fehérje az agyban, a szinapszisokban expresszálódik a legnagyobb mennyiségben, s megoszlik a pre- és a posztszinaptikus denzitás között. Alacsony szinten minden szövetben kifejeződik. A membrán-asszociált guanilát kináz (MAGUK) családba tartozik, C-terminálisán egy katalitikusan inaktív guanilát kináz domént hordoz. Szerkezetét tekintve állványfehérje, fehérje-fehérje interakciók kialakítására képes. Középső szakaszán elhelyezkedő PDZ doménjén keresztül sejtfelszíni mlekulákhoz kapcsolódik, neurexinekhez, szindekánokhoz, glikoforinokhoz (Hata és mtsai 1996), (Cohen és mtsai 1998), (Hsueh és mtsai 1998), (Martinez-Estrada és mtsai 2001). N-terminális szakaszával egy evolúció során megőrzött komplex formálásában vesz részt, a Mint1-gyel és a Velis-szel asszociálódik. Ennek a komplexnek C. elegansban a vulva prekurzor sejtekben az EGF receptor homológjának transzportjában van szerepe, magasabbrendű élőlényekben pedig a NMDA receptorok transzportjában vesz részt (Setou és mtsai 2000). A gerincesek fejlődésében betöltött szerepére utal, hogy transzgénikus inzerciós mutáns egerekben, amelyekben megváltozik a Cask expresszója, farkastorok jelentkezik. Ezeken túl kapcsolatba lép még az aktin citoszkeletonhoz kötődő 4.1 fehérjével (Cohen és mtsai 1998), (Biederer és Sudhof 2001), Ca2+ csatornákkal (Maximov és mtsai 1999). A Caskin fehérjének két izoformája létezik, Caskin1 és Caskin2 (Tabuchi és mtsai 2002). Ellentétben a gerinctelekben is expresszálódó Caskkal, az evolúció során a gerincesekben jelennek meg, konzervált szerkezetűek a különböző fajokban (Tabuchi és mtsai 2002). Érdekes, hogy a Cask fehérje összes egyéb ismert interakciós partnere kifejeződik gerinctelenekben is. A Caskin1 és -2 szerkezetét tekintve leginkább a Shank, a posztszinaptikus denzitásban kifejeződő állványfehérjére hasonlít. Úgy tűnik azonban, hogy ez a hasonlóság nem evolúciós kapcsolatot jelent, csupán hasonló funkciót. A Caskin fehérjék N-terminálisán hatszoros ankirin ismétlődés található, ezt egy SH3 domén, majd két SAM domén követi. A
21
fehérjék C-terminálisán egy hosszú prolingazdag régió, majd egy C-terminális domén helyezkedik el (2.7. ábra). A két izoforma N-terminális szakasza nagyon hasonló, eltérések a C-terminálison figyelhetők meg, de azon a szakaszon is tartalmaznak azonos szekvenciákat (Tabuchi és mtsai 2002). In situ vizsgálatok kimutatták, hogy a Caskin1 csak az agyban expresszálódik, immuncitokémiai festéssel pedig azt igazolták, hogy csupán a neuronkban fejeződik ki, leginkább a posztszinaptikus denzitásban. Mint említettem, a fehérje neve Caskkal való kapcsolatára utal (Tabuchi és mtsai 2002). Azt találták, hogy a Caskin1 a Cask fehérje CaM kináz doménjéhez kötődik, a Mint1gyel versengve. Kimutatták, hogy a Cask-Caskin1-Velis és a Cask-Mint1-Velis komplex egyaránt előfordul az agyban, sejtfelszíni molekulához, neurexinekhez, szindekánokhoz kapcsolódva. A Caskin1 SH3 és SAM doménjei közti szakaszával kapcsolódik a Caskhoz, ez a szakasz a két Caskin izoformában eltérő, a Caskin2 nem kötődik a Caskhoz. A hármas komplex számos interakciós domént tartalmaz, alapját képezheti nagy molekulatömegű fehérje asszociátumok kialakulásának. Mivel a Caskin1, ellentétben az ubikviter Mint1-gyel, csak az agyban expresszálódik, esetleges funkciója lehet a Cask-Mint1 komplex kialakulásának agyi szabályozásában (Tabuchi és mtsai 2002). Middleton és munkatársai egy kísérletsorozatban azt vizsgálták (Middleton és mtsai 2009), hogy az embrionális korban alkalmazott etanol diéta hogyan befolyásolja a bulbus olfactoriusban a génexpressziót. Kísérleteik alapját az a korábbi megállapítás képezte, hogy a magzatot a méhen belül ért etanol hatás nagyban befolyásolja a kamaszkori alkoholfüggőség kialakulását. Úgy tűnik, hogy a folyamatban az embrionális kemoszenzoros plaszticitásnak van szerepe. Ennek molekuláris mechanizmusát próbálták feltérképezni. Úgy találták, hogy a bulbus olfactoriusban néhány gén mellett a Caskin1 expressziója jelentősen csökkent. Azon gének
expressziója
csökkent
leginkább,
amelyeknek
az
idegsejtek
nyúlványainak
kinövésében, illetve a dendritikus tüskék formálódásában van szerepe. A tanulmányból úgy tűnik tehát, hogy a Caskin1 részt vehet ebben a folyamatban.
22
ANK ismétlődések
SH3
SAM SAM
Prolin gazdag régió
2.7. ábra: A Caskin1 fehérje szerkezete. A Caskin1 fehérje N-terminálisán jól ismert domének helyezkednek el. Amino-terminálisa felől hatszoros ankirin ismétlődés, prolinban-gazdag régiót kötő SH3 domén, homo-és heterodimerizációt kialakító SAM domének lelhetők fel. A Cterminális felét prolinban-gazdag régió alkotja. A fehérjének nincs enzimaktivitásért felelős doménje.
23
2.3. Az Abi2 fehérje
Az Abi (Abl interactor) fehérjéket az Abl tirozin-kináz és a Rac GTP-áz jelpályarendszereiben írták le (Shi és mtsai 1995), (Dai és Pendergast 1995). Az Abi családnak több tagja ismert, az emlős Abi1, Abi2, és a NESH/Abi3, a Drosophila Abi, a Xenopus Xlan4, a Dictyostelium Abi és a Caenorhabditis Abi (Blagg és mtsai 2003), (Dai és Pendergast 1995), (Echarri és mtsai 2004), (Juang és Hoffmann 1999). Az emlősökben expresszálódó Abi1 és az Abi2 két gén terméke, az Abi2-nek két variánsa ismert az Abi2a és az Abi2b, ezek leginkább N-terminálisukban különböznek egymástól. Az Abi1 jobban, az Abi2 máig kevésbé jellemzett fehérje. Az Abi1 egy háromtagú komplex tagja, az Sos1-el és egy EGF receptor szubsztráttal, az Eps8-al kapcsolódva az Sos fehérje Rac guanin nukleotid kicserélődési faktor aktivitását serkenti (Scita és mtsai 1999). Overexpressziója Eps8 dependens Rac aktivációt idéz elő (Innocenti és mtsai 2002). Depléciója fibroblasztokban gátolja a PDGF, vagy Rac aktiváció hatására kialakuló lamellipódiumok formálódását (Scita és mtsai 1999). Stradal és munkatársai leírták, hogy az Abi fehérjék a sejtek mozgását irányító sejtmembrán kitűrődések, a lamellipódiumok csúcsába lokalizálódnak, az Abi család fehérjéiben konzervált N-terminálisuk irányítja arra a helyre a proteineket (Stradal és mtsai 2001). Az Abi2 fehérjét élesztő két-hibrid rendszerben azonosították, ahol csaliként az Abl regulátor szakaszát használták. A fehérje N-terminálisán egy homeodomén homológ régiót hordoz. A homeodomén fehérjék az embrionális fejlődés alatt pozícionális információkat közvetítenek, illetve sejtspecifikus gének kifejeződését szabályozzák. A homeobox domént prolinban-gazdag régiók követik, amelyek PXXP szekvenciákat, SH3 domén kötőhelyeket tartalmaznak. A fehérje középső szakaszán PEST szekvenciák, és szerinben gazdag szakasz helyezkedik el. A PEST szekvenciák prolin, szerin/treonin, glutamát/aszpartát aminosavakat tartalmaznak, az ilyen szekvenciákat tartalmazó fehérjék rendkívül érzékenyek a degradációra, általában rövid féléletidejűek (Rogers és mtsai 1986). A protein C-terminálisa egy SH3 domént kódol (2.8. ábra). Az Abi2 aminosav szekvenciája alapján számolt molekulatömege 44 kDa, SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel azonban 55 kDa-nál detektálható. Ilyen viselkedést leírtak több, SH3 domént tartalmazó fehérje esetén is, például cortactinnál, a HS1-nél, a LckBp1 (Lck-binding protein 1)-nél. Ezekben a fehérjékben sok
24
savas aminosav és prolin fordul elő, amino-terminálisuk bázikus és hélix-turn-hélix motívumot, vagy motívumokat tartalmaz. Aberráns gélen belüli migrációjuk magyarázata, hogy az SDS savas régióikhoz kevéssé kötődik, ezért lassabban mozognak, valós méretüknél magasabb molekulatömegnél detektálhatók. Az Abi2 az embrionális fejlődés utolsó szakaszában jelenik meg (Courtney és mtsai 2000), minden szövetben kifejeződik, expressziója az agyban és a szemben a legkifejezettebb (Grove és mtsai 2004). Ismert néhány fehérjével való kapcsolata. Dai és Pendergast az Abl tirozin kinázzal való interakciója alapján azonosította (Dai és Pendergast 1995). Az Abi2 prolinban-gazdag régióin, illetve SH3 doménjén keresztül kapcsolódik a kinázhoz. Az a tény, hogy az Abi2 több ponton is kapcsolódik az Abl-hez, és egyben szubsztrátja is, azt sugallja, hogy a kinázt szabályozó szerepe lehet. Az Abi2 N-terminális csonkolt formáját, amely csak egy helyen képes kötődni a kinázhoz, együtt expresszálva a c-Abl-el, fokozott kináz aktivitást és a sejtek transzformációját eredményezte. Számos közleményben leírták, hogy a c-Abl transzformáló képességét valaminek gátolnia kell (Pendergast és mtsai 1991), (Mayer és Baltimore 1994). Welch és Wang kimutatta, hogy a c-Abl kölcsönhatásba lép a retinoblasztóma fehérjével, amely gátolja a kináz aktivitását (Welch és Wang 1995). Úgy találták azonban, hogy az Ablnek mindössze 5-25%-a alkot komplexet a retinoblasztóma fehérjével, de az összes fehérje gátolt, tehát lennie kell egy másik szabályozónak is. Úgy tűnik, a másik regulátor az Abi2. Hatását kétféle módon fejtheti ki, vagy inaktív konformációban tartja az Abl-t, vagy meggátolja effektoraihoz való kötődését (Dai és Pendergast 1995). Arra, hogy az Abi2 csonkolt formája miért eredményezte a kináz aktiválását, illetve a sejtek transzfomációját, több elmélet is született. Az egyik szerint az Abi2 sejten belüli lokalizációja változik meg, így teret enged más fehérjék kináz általi foszforilációjának. Egy másik elmélet szerint az Nterminális nélküli Abi2 visszatartja az Abl-t a citoplazmába, nem engedi a magba transzlokálódni, az Abl szaporodást gátló hatásához pedig a magba kell transzportálódnia, amit overexpressziós kísérletek bizonyítanak (Sawyers és mtsai 1994). Úgy tűnik tehát, hogy az Abi2 az Abl tirozin-kináz citoplazmatikus és magi funkcióit szabályozhatja. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy a kinázhoz hasonlóan az Abi2 is egyaránt megtalálható a sejtek citoplazmájában és magjában is. Az Abi2 fehérje szerepét leírták egy, az aktin citoszkeletont szabályozó komplexben is, melyben az Abi2, a Nap1/Nap125, PIR121, és a HSPC300 fehérje vesz részt, WAVE gátló hatása van. Aktív Rac-ot adva a rendszerhez, a WAVE felszabadul a gátlás alól, és beindulhat az Arp2/3 komplex irányította aktin polimerizáció (Eden és mtsai 2002). Az említett 25
komplexnek szerepe lehet a mozgó sejtek lamellipódiumai kialakulásának szabályozásában (Grove és mtsai 2002). 2002-ben Grove és munkatársai elkészítették az Abi2 génkiütött egeret. Legsúlyosabb eltéréseket az agyban és a szemben találtak, abban a két szervben, amely legnagyobb mennyiségben expresszálja a fehérjét. Súlyos zavart szenvedett a másodlagos szemlencse rostok orientációja és migrációja. E jelenség hátterében valószínűleg az áll, hogy Abi2 hiányában rendellenes aktin polimerizáció figyelhető meg. Defektusok jelentkeznek a sejtek közötti kapcsolatokban is, amely azt mutatja, hogy a fehérjének szerepe lehet a cadherin aktiváció
és
az
aktin
citoszkeleton
átrendeződés
összekapcsolásában.
Abnormális
sejtmigrációt tapasztaltak a neokortexben és a hippokampuszban. A szinapszisok kialakulásában fontos dendritikus tüskék alakja és sűrűsége is jelentősen eltért a vad típustól. Hasonló jelenséget tapasztaltak amikor hippokampális sejtekben domináns negatív Rac-ot expresszáltak. Ez a jelenség arra utal, hogy az Abi2 valószínűleg a Rac függő jelátviteli folyamatokban vehet részt. Végül Abi2 hiányos egerekben súlyos zavarok léptek fel az állatok rövid-, és hosszútávú memóriájában, amely a dendritikus tüskék csökkent számára, végső soron az aktin citoszkeleton rendellenes formálódására vezethető vissza (Grove és mtsai 2002).
Pro gazdag régió
HHR
SH3
2.8. ábra: Az Abi2 fehérje szerkezete A fehérje N-terminálisán homeobox régió található. Azok a fehérjék, amelyek tartalmaznak ilyen szekvenciát, az embrionális fejlődés alatt pozícionális információkat közvetítenek, illetve sejtspecifikus gének kifejeződését szabályozzák. A fehérje Nterminálisán SH3 domén kötő prolinban-gazdag régió és SH3 domén helyezkedik el. Az SH3 doménhez prolinban-gazdag szekvenciák kapcsolódhatnak.
26
2.4. A Cortactin fehérje A Cortactint másfél évtizede azonosították először, Kanner és munkatársai. Rous szarkóma vírussal fertőzött csirke embrió fibroblaszt sejtekben találták, mint az Src által foszforilált 80/85 kDa tömegű fehérjepárost (Kanner és mtsai 1990). Már ekkor megfigyelték, hogy a fehérje a v-Src-vel transzformált sejtekben a membrán szélén, az ún. podoszómák területén dúsul, az F-aktinnal kolokalizációt mutatva. Nem transzformált sejtekben szintén a sejt szélén található, a stressz rostokhoz kapcsolódva (Wu és mtsai 1991). Nevét is arról kapta, hogy különböző stimulusok hatására a sejtszélre transzlokálódik és ott részt vesz a kortikális aktin citoszkeleton átrendeződésének szabályozásában (Wu és Parsons 1993). Northern blot kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a Cortactin a hematopoetikus szövetek, a lép, a B- és a plazmasejtek kivételével gyakorlatilag minden szövetben kifejeződő fehérje (Miglarese és mtsai 1994). Szerepét a fent említett vérképző szövetekben a hasonló szerkezetű HS1 fehérje tölti be (Uruno és mtsai 2003). A Cortactin szerkezete evolúciós szempontból rendkívül konzervatív, utalva arra, hogy a fehérjének fontos szerepe lehet a sejtek működésében. N-terminálisán egy savas domén (NTA) található, melyen keresztül az Arp2/3 komplexhez kapcsolódik. (Az Arp2/3 komplex az aktin citoszkeleton átrendeződésekor az új aktin elágazódások kialakulását katalizálja.) Az NTA domént követően a Cortactin hat és fél ismétlődést tartalmaz, mely ismétlődések egy-egy hélix-turn-hélix másodlagos struktúrát alakítanak ki. E régió felelős a fibrilláris aktin polimer kötéséért. A fehérje N-terminális felével szemben, mely szükséges és elégséges is az Arp2/3 komplex aktin polimerizációhoz vezető aktiválásához, C-terminális felének fehérje-fehérje interakciók kialakításában, valamint a molekula működésének szabályozásában lehet szerepe. A két fél közti kapcsolatot egy 48-52 aminosav hosszúságú, egyenlőre ismeretlen funkciójú α-hélix struktúra teremti meg. Ezt követően a fehérjében egy prolinban-gazdag struktúra következik, amely a meglehetősen konzervatív fehérje leginkább variábilis része. Amellet, hogy kötőhelyéül szolgálhat más, SH3 domént tartalmazó fehérjék számára, e domén tartalmazza a fehérje szerin/treonin és tirozin foszforilációs helyeit is. A Cortactin Cterminális végén SH3 domén helyezkedik el (2.9. ábra). E domén evolúciós szempontból olyannyira konzervatív, hogy a humán szekvencia még a csirke Cortactin SH3 doménjével is 100%-ban egyezik. Úgy tűnik tehát, hogy e doménnek igen fontos, ám egyelőre csupán részben tisztázott szerepe lehet a fehérje működésében. A Cortactin SH3 doménjéhez kötődni
27
képes konszenzus szekvencia a +PPΨPXKPXWL (ahol a + bázikus, a Ψ pedig alifás oldalláncú aminosavat jelöl) (Sparks és mtsai 1996). Elsőként a CortBP1 (Cortactin-binding protein 1) fehérjét azonosították, mint interakciós partnert, ami a Shank2 alternatív „splice” variánsa és így az idegrendszeri állványfehérjéket tartalmazó család tagja. Cortactin-kötő fehérje továbbá a CBP90 (Cortactin-binding protein 90) (Ohoka és Takai 1998), az epiteheliális sejtek közti „tight-junction” kialakításában résztvevő ZO1 (zonula occludens 1) (Katsube és mtsai 1998), a dinamin2 (McNiven és mtsai 2000), a sejtalak szabályozásában szerepet játszó Cdc42 GEF Fgd1 (facio-genital dysplasia 1) (Hou és mtsai 2003), a NADPHoxidáz p47phox alegysége (Lin és mtsai 2005), stb.
Src, MAPK
P
NTA
Arp2/3
Tandem repeat
alfa
P
P
Pro-rich
SH3
CortBP1/Shank2, Dyn2, ZO-1, stb.
F-aktin
2.9. ábra: A Cortactin szerkezete. A fehérje N-terminálisán egy savas domén található, mellyel az Arp2/3 komplexhez kötődik. A tandem ismétlődéseken keresztül a fibrilláris aktinhoz asszociálódik a Cortactin. A fehérje C- és N-terminálisát egy alfa helikális struktúra kapcsolja össze. Az azt követő prolinban-gazdag régió számos foszforilációs helyet tartalmaz, továbbá SH3 doménnel rendelkező fehérjék kapcsolódhatnak. A C-terminális SH3 doménhez prolinban-gazdag régión át kötődnek fehérjék, például a CortBP1/Shank2, dinamin2 és a ZO1.
28
2.5. Rendezetlen fehérjék
A rendezetlen szerkezetű fehérjéket csupán az elmúlt néhány évben írtak le. Addig a fehérjebiológia egyik alapköve a szerkezet-funkció elmélet volt. Ez az elmélet kimondta, hogy a fehérjék csak jól definiálható háromdimenziós szerkezeti formában működőképesek. Létezik azonban számos fehérje és fehérjedomén, például a kalpasztatin (Konno és mtsai 1997), a mikrotubulus asszociált fehérje tau (Schweers és mtsai 1994), vagy a transzkripciós faktorok transzaktivátor doménje (Triezenberg 1995), amelyeknek nincs, vagy csak részben van az ismert másodlagos fehérjeszerkezetekhez, és egyáltalán nincs a harmadlagos fehérjeszerkezetekhez hasonló meghatározott struktúrája. Fiziológiás körülmények között flexibilis, letekeredett szerkezetet mutatnak. Egyre több bizonyíték születik arra vonatkozóan, hogy ez a natív konformációja e fehérjéknek, úgy tűnik tehát, hogy a fehérjéket jellemző klasszikus elméletet újra kell gondolni (Wright és Dyson 1999). Az utóbbi időben drasztikusan megnőtt a rendezetlen fehérjékről közölt cikkek száma, bizonyossá vált, hogy általános jelenséggel állunk szemben. Bioinformatikai predikciós módszerekkel 29 proteomban 15000 rendezetlen fehérjét, vagy domént találtak. Ebből több mint 200 esetben bizonyították is, hogy az adott protein, illetve fehérjerész nem, vagy csak részben rendelkezik másodlagos, és nem rendelkezik harmadlagos
szerkezettel.
Ezt
általában
három
módszerrel
igazolják:
röntgen
krisztallográfiával, CD spektroszkópiával és mágneses magrezonanciás vizsgálattal. Megállapították, hogy a rendezetlen fehérjék előfordulási gyakorisága korrelációt mutat a szervezet komplexitásával (Dunker és mtsai 2002), (Ward és mtsai 2004). A rendezetlen fehérjéket in vitro, híg oldatokban vizsgálják, sejten belül egyensúlyi konformációjuk
eltolódhat
a
rendezett
szerkezet
felé,
a
makromolekulák
magas
koncentrációja mellett ezek a fehérjék is feltekerednek. Ezt tapasztalták például a szigma 28 transzkripciós faktor inhibítora esetén is (Daughdrill és mtsai 1997), (Dedmon és mtsai 2002). Ez a fehérje in vitro rendezetlen, de E. coliban expresszálva rendeződik. Ez a jelenség megkérdőjelezheti a rendezetlen szerkezetű fehérjék in vivo létezését. E kétségek eloszlatására számos kísérletet végeztek magas fehérjekoncentrációjú oldatokban is, a molekuláris „crowding” hatását vizsgálták különböző rendezetlen fehérjék esetében. Bár megfigyeltek a hidrodinamikai sugárban bizonyos csökkenést, de meggyőzően bizonyítják, hogy nem a fehérje teljes hossza válik rendezetté, csupán csak lokális jelenségről van szó (Flaugh és 29
Lumb 2001), (Morar és mtsai 2001). Ugyanakkor gyakran megfigyelhető jelenség in vivo a ligandkötő rendezetlen fehérjék esetén, hogy a partnerrel való kölcsönhatás a fehérje bizonyos régióinak rendeződéséhez vezet. Gyakran fordul elő a coil-hélix átmenet (Dunker és mtsai 2001). A másodlagos és harmadlagos szerkezet nélküli proteinek in vivo létét igazolják továbbá olyan extracelluláris rendezetlen fehérjék, amelyek definíció szerint alacsony fehérjekoncentrációjú környezetben fordulnak elő fiziológiás körülmények között, például: tej kazeinek, bakteriális fibronektin kötő fehérjék, nyál glikoproteinek stb. (Tompa 2002). Indirekt bizonyítékként megemlíthető még, hogy számos megfigyelés szerint egy-egy fehérjén belül a rendezetlen szakaszok jóval gyorsabban evolválódnak, mint a rendezett domének, tehát jóval kevesebb olyan aminosavat tartalmaznak, amelyek fontosak lennének egy rendezett struktúra megőrzésében (Holt és Sawyer 1988). Szembetűnő, hogy a rendezetlen fehérjék szerkezetében gyakoriak a rendezetlenséget elősegítő aminosavak (A, R, G, Q, S, P, E, K), és ritkábban fordulnak elő a rendezett harmadlagos szerkezet kialakulását előmozdító aminosavak (W, C, F, I, Y, V, L, N). Jellemző még, hogy nettó töltésük jelentős és kevéssé hidrofóbok (Uversky és mtsai 2000). Ezek az adatok is az bizonyítják, hogy rendezetlen szerkezetük nem in vitro műtermék. Aminosav szekvencia alapján tehát megjósolható egy fehérje rendezetlensége, ezen alapul néhány predikciós program: PONDR (Bracken és mtsai 2004), DISOPRED (Ward és mtsai 2004), GLOBPLOT (Linding és mtsai 2003), IUPred (Dosztanyi és mtsai 2005) működése. Mára több olyan modell is napvilágot látott, melyek a rendezetlen fehérjék funkcionális állapotának konformációját igyekeznek leírni. A rendezetlen fehérjék szerkezete a rendezett proteinek denaturált állapotára hasonlít legjobban. Olyan, egymásba gyorsan átalakuló alternatív struktúrákkal jellemezhetők, amelyek az alapváz torziós szögeiben térnek el egymástól. Uversky és Ptitsyn leírták (Ptitsyn és Uversky 1994), hogy az ilyen fehérjék két termodinamikai állapotban lehetnek, premolten globula, illetve random tekercs formában. Az elmélet tehát, amely leírja, hogy a fehérjék rendezett, molten globula, vagy random tekercs, vagyis denaturált állapotban létezhetnek (Dunker és mtsai 2001), kiegészítésre szorul. Negyedik állapotként be kell vezetni a premolten globula fogalmát. A premolten globula egy denaturált stádium, a harmadlagos szerkezet teljes hiányával írható le, jellemző azonban bizonyos fokú másodlagos szerkezet megléte. A molten globulával összehasonlítva, ahol a natív másodlagos struktúra csaknem 100%-ban megőrződik, premolten globula állapotban ugyanez 30%. A natív, illetve molten globulához képest kevésbé kompakt, a random tekercsnél azonban kompaktabb. Hidrofil szakaszok megjelenése jellemző, tulajdonképpen ez 30
az állapot a random tekercs részlegesen rendezett formájának tekinthető. Random tekercs esetén nem figyelhető meg másodlagos szerkezet, a molekula kitekeredett, denaturált állapotban van, jellemző a hidrofil szakaszok nagyobb aránya. A fizikokémiai adatok alapján úgy tűnik, hogy a rendezetlen fehérjék szerkezetében is fellelhető számos másodlagos elem. Ezek igen fontosak lehetnek a globuláris partnermolekulával való kölcsönhatásban, mivel az előre meglévő szerkezeti elemek mintegy előrejelzik a végső, funkcionális állapot szerkezetét. Az ismert háromdimenziós szerkezettel rendelkező komplexek vizsgálatakor, amelyekben egy rendezetlen fehérje kötődik a szerkezettel bíró partnerhez, fény derült arra, hogy a rendezetlen fehérjékben megfigyelhető erős preferenciákkal rendelkező régiók (főként hélixek) megfelelnek a végső, funkcionális állapotokban felfedezhető szerkezeti elemeknek, míg az erős preferenciákkal nem rendelkező részek a fenti régiók közti flexibilis linkereket reprezentálják. A már meglévő szerkezeti elemek biztosítják a kezdeti kölcsönhatási helyeket, amelyek kötődése megkönnyíti a fehérje többi, flexibilis részének partnerre való feltekeredését. A rendezetlen fehérjék szerkezetéből következik néhány jellemző tulajdonságuk, proteolitikus hasításra különös módon érzékenyek, ezen alapul egyik azonosítási módjuk is, miszerint nagyon alacsony enzim koncentráció mellett, limitált poteolízis körülményei között is hasadnak. Mivel a rendezetlen fehérjék nem rendelkeznek kompakt hidrofób maggal, magas hőmérsékleten is megőrzik oldhatóságukat. Jellemző továbbá, hogy a rendezetlen fehérjék a szokatlan aminosav összetételüknek köszönhetően kevesebb SDS-t kötnek, és ezért a látszólagos molekulatömegük 1,2-1,8-szor nagyobb, mint a tömegspektroszkópiával meghatározott tényleges molekulatömegük. Mi is lehet a rendezetlen szerkezet előnye? A rendezetlen fehérjék funkcionális fontossága intenzíven kutatott terület (Dunker és mtsai 1998), (Dunker és mtsai 2001), (Plaxco és Gross 1997), (Wright és Dyson 1999). A nagyrészt nyújtott, letekeredett konformáció igen fontos a rendezetlen fehérjék esetében, mivel ezeknek a fehérjéknek a funkciója vagy közvetlenül ebből a szerkezeti állapotból ered vagy bizonyos estekben a lokális feltekeredés, rendeződés szükséges a funkció ellátásához. Megállapították, hogy a rendezetlen szakaszok fontosak lehetnek a hatékony molekuláris felismerésben, molekulák közti kölcsönhatás kialakításában. Ennek megfelelően fontos szerepet játszanak például a sejtciklus szabályozásában, transzkripció, transzláció regulációjában, más fehérjék aktivitását befolyásolhatják és az idegsejtek funkcióinak szabályozásában is részt vehetnek. E fehérjék érdekes jellemzője, hogy működésük közben rendezetlen-rendezett konformáció átalakuláson mehetnek keresztül. Ennek számos haszna 31
van: 1.) nagy specifikussággal, s alacsony affinitással tudnak kötni partnereikhez (Kriwacki és mtsai 1996); 2.) számos különböző targetet köthetnek (Wright és Dyson 1999); 3.) nagy interakciós felületet képeznek (Meador és mtsai 1992); 4.) szerkezetükből adódóan a proteolitikus hasításra rendkívül érzékenyek, így csökkent sejten belüli életidejükkel a fontos regulációs fehérjék újraszintézisét segítik elő (Wright és Dyson 1999). A rendezetlen fehérjék és domének osztályozására több elmélet is született. A legfrissebb és legelfogadottabb osztályozás Tompától származik (Tompa 2002). Az első osztályba az entropikus láncok tartoznak. Ezeknek a fehérjéknek a funkciói közvetlenül a rendezetlenségükből adódik, és ezért a globuláris fehérjék nem tudják ellátni ezeket a feladatokat. A többi osztályba tartozó fehérjék a molekuláris felismerésben játszanak szerepet, a partner pedig, amelyet nagy specificitással kötnek, lehet DNS, RNS, egy másik fehérje vagy kisebb ligandumok. A rendezetlen fehérjék különböző módon tudják befolyásolni a partner működését. Az effektorok egy vagy több, komplexben lévő fehérje aktivitását módosítják. Ezidáig úgy tűnik, hogy csak inhibítorok tartoznak ebbe a funkcionális osztályba. A raktározók raktározni, és/vagy neutralizálni képesek kisebb ligandokat. Az összeszerelők segítik a nagy, több fehérjéből álló komplexek, mint például a riboszóma, a citoszkeleton, transzkripciós preiníciációs komplex stb. összeszerelődését, stabilizálják, illetve módosítják azokat. Ezen kívül az utóbbi időben derült fény arra, hogy számos fehérje- és RNS chaperon hosszabb rendezetlen régiókat, illetve bizonyos esetben a teljes fehérje rendezetlen (Tompa és Csermely 2004). A fenti funkcionális osztályok azonban nem kizárólagosak. Például a mikrotubulus-asszociált fehérje, a MAP-2 projekciós doménje entrópikus láncként funkcionál, míg mikrotubulus-kötő doménje segít a mikrotubulusok összeszerelődésében.
32
2.2. táblázat: A rendezetlen fehérjék és domének funkcionális osztályai (Tompa 2002). A táblázat a rendezetlen fehérjék funkcionális osztályait tartalmazza példákkal illusztrálva, amelyeknél a partnermolekulát, illetve a fehérje funkcióit is feltüntettem.
Rendezetlen fehérje / domén
Target / partner
Funkció / működés
Entrópikus láncok MAP2 projekciós domén Titin PEVK szegmens SNAP25 linker régió
nem releváns
Entrópikus sörte
nem releváns
Entrópikus rugó Flexibilis linker a kötő domének között
nem releváns Effektorok
2+
p21 / p27
Ca -aktivált proteáz (kalpain) Ciklin-dependens kinázok
Szekurin
Szeparáz
FlgM
Szigma 28 transzkripciós faktor
Kalpasztatin
Kalpain inhibítor Sejtciklust szabályozó inhibítorok Kromoszóma szeparációban szerepet játszó inhibítor Flagellin-specifikus gének expressziójának inhibítora baktériumban
Raktározók Kazeinek
Ca3(PO3)2
Nyál Pro-gazdag fehérje (PRP)
tannin
Dsp16
víz
A Ca3(PO3)2 precipitáció gátlása tejben A növényi polifenolos összetevők kötése és neutralizációja Megakadályozza a növény kiszáradását a víz visszatartása révén
Összeszerelők MAP2 mikrotubuluskötő doménje
Tubulin dimerek
Mikrotubulus polimerizáció
Bob1
Oct1 transzkripciós faktor, Igκ promoter és TAFII105
Immunoglobulin gének B-sejt specifikus expressziója
2+
Caldesmon CREB TAD MAP2 mikrotubuluskötő domén PKC linker régió hnRNP A1 Hsp90
Ca / calmodulin, F-aktin, miozin, tropomiozin Módosítási helyek Protein kinázok Protein kinázok Proteázok (kalpain) Chaperonok RNS fehérjék
33
Aktin polimerizáció Szabályozás foszforiláció révén Szabályozás foszforiláció révén Szabályozás limitált proteolízis által Komplementer szálak renaturációja Aggregáció elleni védelem
2.6. A kémiai szinapszis és a posztszinaptikus denzitás
Az általunk vizsgált Caskin fehérje irodalmi adatok alapján a neuronokban expresszálódik, legfőképp a posztszinaptikus denzitásban (PSD), ezért ismertetem röviden a kémiai szinapszisokat, és az azok részét képező PSD-t. Mivel szerkezetét tekintve a Caskin állványfehérje, említést teszek a PSD legismertebb, hasonlóan fehérje-fehérje interakciók kialakítására alkalmas doménekből álló egyéb „scaffold” fehérjéiről is. A központi idegrendszerben a sejtek közti kommunikáció speciális kapcsolódási zónákon, a kémiai szinapszisokon keresztül zajlik (2.10. ábra). A „szinapszis” elnevezést Sherrington vezette be 1897-ben. Megállapította, hogy a kapcsolódó neuronok szoros közelségben vannak, a sejtek között azonban nincs folytonosság. Észrevételét az 1950-es években elektronmikroszkópos vizsgálatok erősítették meg. Palade és Palay, illetve De Robertis és Bennett rámutatott, hogy a szinapszisok polarizált neuronális struktúrák, speciális membránszerkezettel rendelkeznek mind a transzmittert felszabadító aktív zónában, a preszinaptikus oldalon, mind pedig az afferens, posztszinaptikus oldalon. Ez utóbbi, különösen a serkentő szinapszisok esetén erősen elektronszóró, 30-40 nm vastag, néhány száz nm átmérőjű megvastagodott membránképet mutat, ezért posztszinaptikus denzitásnak (PSD) nevezték el (Palay és Palade 1955), (De Robertis és Bennett 1955). Gray 1959-ben a szinapszisokat oszályokba sorolta (Gray 1959), két csoportot állított fel. Az egyik típusba a kifejezett posztszinaptikus megvastagodással rendelkező neuronális kapcsolatokat sorolta, a kettes típusba pedig a kevéssé intenzív PSD-vel rendelkező szinapszisokat. Később kiderült, hogy az általa I-es típusúként definiált, a glutamáterg, a II-es típusú pedig a GABA-erg szinapszisoknak felel meg (Peters és Harriman 1990). A tipikus PSD korong alakú, átmérője 200-300 nm, vastagsága 30-60 nm (Spacek és Harris 1998). A neurobiológia máig intenzíven kutatott területe e hatalmas jelátviteli komplex fehérjekomponenseinek azonosítása. Legújabb kutatási eredmények szerint egy-egy posztszinaptikus denzitás 1,1±0,36 GDa és 200-400 fehérjét tartalmaz (Chen és mtsai 2005), (Sugiyama és mtsai 2005), nagyon fontos szerepe van a beérkező ingerület integrálásában, továbbításában. Nagy
felbontású
elektronmikroszkópos
és
fagyasztva
szárításos
technikák
alkalmazásával vált lehetővé a kémiai szinapszisok ultrastruktúrájának felderítése. Efferens része a preszinaptikus aktív zóna, amely szinaptikus vezikulákat tartalmaz, illetve azokat
34
szabadít fel. A két sejt között a szinaptikus rés, a posztszinaptikus membrán alatt pedig a PSD helyezkedik el. Jelenlegi ismeretek alapján a PSD-ben expresszálódó fehérjék négy csoportba sorolhatók. Membrán- (pl: GABA-, glutamát receptorok, Ca2+-, K+ csatornák, inzulin receptor),
sejtváz- (pl: aktin, α-fodrin, α-aktinin, drebrin, cortactin, Abp1, profilin) és
szabályozó fehérjék (pl: CaMKII, calcineurin, cAMP-dependens protein-kináz, proteinfoszfatáz 1, inzulin receptor szubsztrát p53) (Collins és mtsai 2006). Külön csoportot képeznek, és az említett fehérjék között teremtenek kapcsolatot a protein-protein interakciók kialakítására képes doménekből álló állványfehérjék. A PSD jellemző eleme egy, a membrán alatt kb. 25 nm mélyen elhelyezkedő 5 nm-es lemez, amely főként ProSAP/Shank (proline-rich synapse-associated protein/SH3 and ankyrin repeat-containing protein) és más állványfehérjékből áll (Valtschanoff és Weinberg 2001), (Zuber és mtsai 2005), (Sheng és Kim 2000), (Boeckers és mtsai 2002), (Baron és mtsai 2006). Ehhez a lemezhez kapcsolódnak a receptorok, és olyan aktinkötő fehérjék, amelyek mélyen benyúlnak a dendritek citoplazmájába és ott a citoszkeletonhoz kötődnek. A ProSAP/Shank fehérjék SAM doménjeiken keresztül asszociálódnak. Ezt a kapcsolatot a preszinapszisból felszabaduló Zn2+ ionok befolyásolják (Gundelfinger és mtsai 2006), így egy dinamikus egység alakul ki, amely az aktuális szinaptikus aktivitásnak megfelelően képes átrendeződni (Toni és mtsai 1999), (Hering és Sheng 2001), (Yuste és Bonhoeffer 2001). Újabb vizsgálatokból világossá vált, hogy a PSD egyéb fehérjéire is jellemző a tangenciális, illetve a radiális eloszlás. Megfigyelhető, hogy a glutamát receporok közül az NMDA receptorok a posztszinaptikus denzitás centrális részén helyezkednek el, míg az AMPA receptorok egyenletes eloszlást mutatnak (Racca és mtsai 2000), (Kharazia és Weinberg 1997), (Inoue és Okabe 2003). Valtshanoff és Weinberg a ProSAP/Shank fehérjéken kívül további állványfehérjék lamináris eloszlást is vizsgálta. Megállapították, hogy a membránhoz legközelebb a PSD95 fehérjék helyezkednek el, kb. 12 nm mélyen, ezt követően 25 nm mélységben a már említett Shank fehérjék alkotta lemez található. Az alsóbb rétegekben expresszálódik a dinein könnyű lánc, és a Homer (Xiao és mtsai 1998). A citoplazma felől CAMK-II pozitív betűrédések figyelhetők meg (Petersen és mtsai 2003). Látható tehát, hogy az úgynevezett „scaffold”, vagy állványfehérjék különösen fontosak a PSD ultrastruktúrájának kialakításában, ezért a jelentősebb, itt expresszálódó tagjaikról részletesebben írok (2.11. ábra). Két csoportba sorolhatók a posztszinaptikus denzitásban kifejeződő állványfehérjék (Okabe 2007): az egyik osztályba azok tartoznak,
35
amelyek a glutamát receptorokhoz is kapcsolódnak, a másik csoport tagjai adhéziós molekulákhoz kötődnek. PSD95 és Maguk fehérjék: A PSD95 (vagy SAP90) fehérjét azonosították először a PSD-ben kifejeződő állványfehérjék közül (Cho és mtsai 1992), (Kistner és mtsai 1993). A PSD95 rokon fehérjéit azonosították a posztszinaptikus denzitásban, a SAP97/hGLG-t, a SAP102-t és a chapsyn-110/PSD93-at. Ezek mindegyike a PSD95-höz hasonlóan három PDZ domént tartalmaz N-terminálisán, ezt követi egy SH3 domén és egy guanilát kináz-szerű domén. Ez utóbbi alapján ezeket a fehérjéket membrán-asszociált guanilát kinázoknak, azaz MAGUK fehérjéknek nevezik. A PSD95 N-terminálisán két cisztein aminosav található, amely palmitilálódva biztosítja a fehérje posztszinaptikus denzitásba való irányítódását (elHusseini Ael és Bredt 2002). A MAGUK fehérjék PDZ doménjei a posztszinaptikus membrán fehérjéinek
C-terminálisához
kötődnek.
A
membránfehérjék
közül
legfontosabb
kötőpartnerük az NMDA receptorok NR2 alegysége (Kornau és mtsai 1995). A MAGUK fehérjék fontosak az említett receptorok kihorgonyzásában. A MAGUK proteinek kapcsolódnak a neuroliginhez is (Scheiffele és mtsai 2000), amely sejtadhéziós molekula. A TARP fehérje C-terminálisa is kötődik a PSD95-höz, ennek a komplexnek szerepet tulajdonítanak az AMPA receptorok kihorgonyzásában (Chen és mtsai 2000). A PSD95 posztszinaptikus szignálmolekulákkal is kölcsönhatásba lép, például az ErbB4-el (Huang és mtsai 2000), synGAP (Chen és mtsai 1998), SPAR (Rap GAP) (Pak és mtsai 2001) és a Karilin-nal (Rac GEF) (Penzes és mtsai 2001). Öszzefoglalva elmondható, hogy a MAGUK fehérjék feltehetően fontosak a PSD ultrastruktúrájának szerveződésében és funkciójának biztosításában, beleértve a szinaptikus junkcionális komplex kialakítását, az AMPA és NMDA receptorok kihorgonyzását és a posztszinaptikus jelátvitelt. Homer: A fehérjéket három gén kódolja (Homer1-3) (Xiao és mtsai 1998), (Tu és mtsai 1999). Alternatív splicinggal a Homer1 hosszú és rövid formája keletkezik. A Homer1 hosszú alakja, a Homer2 és 3 hasonló doménszerkezetű. N-terminálisukon Ena/VASP homológ1 (EVH1) domén helyezkedik el, C-terminális felén pedig coiled-coil struktúra található, amely a fehérje összeszerelődését irányítja. A Homer1 rövid variánsából hiányzik ez a régió, így természetes domináns negatív mutánsként funkcionál (Sala és mtsai 2003). A Homer fehérjék EVH1 doménjének legfontosabb interakciós partnere a metabotróp glutamát receptorok I-es típusa(Tu és mtsai 1998). A Shank fehérjék szintén interakciós partnerei a Homer proteineknek (Tu és mtsai 1999). Egyéb azonosított kötőpartnerei az IP3 receptorok, és a dinamin III (Gray és mtsai 2003).
36
Shank és GKAP: A Shank fehérjéket (más néven ProSAP, SSTRIP, CortBP, Synamon és Spank) három gén kódolja (Shank1-3), alternatív splicinggal számos változatuk expresszálódik (Lim és mtsai 1999), (Naisbitt és mtsai 1999). N-terminálisukon ankirin ismétlődések találhatók, ezt SH3-, PDZ domén, prolinban gazdag régió és SAM motívum követi. A Shank2-ben hiányoznak az ismétlődések, amelyen keresztül a többi fehérje az αfodrinhoz kapcsolódik (Boeckers és mtsai 2002), illetve a protein-kináz C-t kötő Sharpinhoz (Lim és mtsai 2001). PDZ doménjeiken keresztül a GKAP-hoz (Naisbitt és mtsai 1999), a kálcium-független latrotoxin receptorhoz (Kreienkamp és mtsai 2000), a II-es típusú szomatosztatin receptorhoz és a Rac1/Cdc42 GEF βPIX-hez (Park és mtsai 2003). A prolinban-gazdag régió Homer kötőhelyeket (Tu és mtsai 1999), aktin filementum szabályozó cortactin (Naisbitt és mtsai 1999), inzulin receptor szubsztrát, IRSp53 (Soltau és mtsai 2002). A SAM doménjein keresztül homo-oligomerizációra képes, így kialakítva az előzőekben már említett lemezszerű struktúrát (Baron és mtsai 2006). A guanilát kináz-asszociált fehérjecsalád (GKAP/SAPAP) négy tagot számlál (SAPAP1-4), hasonló doménszerkezettel (Kim és mtsai 1997). Szekvenciájuk közepén 14 aminosavas ismétlődést tartalmaznak. A GKAP a SAPAP1 rövid transzkripciós variánsának felel meg, amely nem tartalmazza az amino-terminális szakaszt. C-terminálisukon PDZ-kötő szekvenciát hordoznak, amely a Shank fehérjékhez kapcsolódhat (Naisbitt és mtsai 1999). Az ismétlődésekből álló szakasz a PSD95 molekula GK doménjével lép kölcsönhatásba. Így tehát a GKAP két jelentős állványfehérjét képes összekapcsolni, így hatalmas fehérjekomplexek alakulnak ki. Ugyanezen szakaszán keresztül a GKAP a szinaptikus „scaffold” fehérjéhez (SSCAM) kötődik, amely számos PDZ domént tartalmaz (Hirao és mtsai 1998). A PSD filamentáris aktin hálózata fejlett (Fischer és mtsai 1998). Valószínű, hogy az aktin szálakkal való kapcsolat fontos a mélyebb rétegekben elhelyezkedő állványfehérjék eloszlásának kialakításában. Drogok hatására végbemenő F-aktin depolimerizáció a Shank és Homer lokalizációjának megváltozását eredményezi, nincs hatása viszont a membránhoz horgonyzódott PSD95 fehérje elhelyezkedésére (Kuriu és mtsai 2006). Egyéb sejtalkotók, mint például a sima endoplazmás retikulum is az aktin filamentumokon keresztül kapcsolódnak a PSD-hez. A posztszinaptikus denzitás morfológiája nem állandó, számos stimulus vagy esemény hatására megváltozik alakja, sőt funkciója is. Ezt a jelenséget szinaptikus plaszticitásnak nevezik, melynek hátterében az aktin citoszkeleton dinamikus átrendeződése áll. A különböző ingerek hatására létrejövő szerkezeti és molekuláris változás az alapja a tanulásnak és a hosszú távú memória kialakulásának (Hering és Sheng 2001), (Yuste és Bonhoeffer 2001), (Carlisle és Kennedy 2005), (Fukazawa és mtsai 2003). 37
Az egyes, posztszinaptikus denzitásban kifejeződő fehérjék azonosítása és karakterizálása előfeltétele a PSD ultrastruktúrájának illetve dinamikus tulajdonságainak megértésének. Ezért is tűztük ki munkám során az itt expresszálódó Caskin1 fehérje részletes jellemzését. Az elmúlt 30 évben a kutatócsoportok két különböző megközelítéssel próbáltak PSD fehérjéket találni. Egy részük, ide tartozunk mi is, könyvtárak szűrését végezte más-más módszerrel, például PSD preparátumok ellen készített ellenanyagokkal, biokémiai technikákkal, élesztő két-hibrid módszerrel, majd azt követő koimmunprecipitációval (Langnaese és mtsai 2007), (Walsh és Kuruc 1992), (Kim és Sheng 2004). A kutatócsoportok másik része proteomikai metodikákkal analizált glutamát receptor komplexeket, vagy egyéb PSD preparátumokat (Husi és Grant 2001), (Walikonis és mtsai 2001), (Li és mtsai 2004), (Peng és mtsai 2004), (Cheng és mtsai 2006). A PSD-ben expresszálódó proteinek leírása azért is elengedhetetlen fontosságú, mert egyre több adat utal arra, hogy bizonyos mentális zavarok kialakulása egy-egy fehérje hibás, vagy hiányzó kifejeződéséhez köthető.
Preszinaptikus aktív zóna
Szinaptikus rés Posztszinaptikus denzitás
2.10. ábra: A serkentő kémiai szinapszis szerkezete. A serkentő kémiai szinapszis részei a következők: preszinaptikus aktív zóna a neurotranszmittert tartalmazó exocitotikus vezikulákkal, a szinaptikus rés és a fehérjékben gazdag posztszinaptikus denzitás.
38
(Garner és mtsai 2000)
2.11. ábra: A posztszinaptikus denzitás fontosabb állványfehérjéi és az azokhoz kapcsolódó molekulák. A posztszinaptikus denzitás a szervezet fehérjékben legsűrűbb területe, ez az oka mikroszkóp alatt észlelhető megjelenésének. A hatalmas fehérjehalmaz szerveződésében kiemelkedő szerep jut az állványfehérjéknek, melyek egyszerre több partnert is képesek kötni. Kapcsolatot teremtenek például a sejtfelszíni receptorok és az aktin citoszkeleton között. Ebben nagyon fontos szerepe van a SHANK fehérjéhez és az aktinhoz is kötődő Cortactinnak. A posztszinaptikus denzitásban expresszálódó legismertebb állványfehérjéi a PSD95, a GRIP/ABP és a SHANK család fehérjéi. A PSD-ben kifejeződő „scaffold” fehérjék új tagja a Caskin caslád. A PSD fehérjehálózatának szerveződése a neurobiológia jelenleg is intenzíven kutatott területe.
39
3. Célkitűzések A Caskin1 fehérjéről eddig az irodalomban gyakorlatilag egyetlen cikk jelent meg, amelyben leírták, hogy Cask-kötő fehérjeként azonosították élesztő két-hibrid tesztben (Tabuchi és mtsai 2002). Kimutatták, hogy a Cask fehérje CaM-kináz doménjéhez kötődik a Mint1 fehérjével versengve. Northern blot analízissel azt találták, hogy csak az agyban expresszálódik. Immuncitokémiai vizsgálattal rámutattak, hogy neuronokban, azokon belül is leginkább a posztszinaptikus denzitásban fejeződik ki. Tabuchiék azonban a fehérje szerepét részletesen nem vizsgálták. A Caskin1 doménszerkezete alapján egy nagy állványfehérje, mely számos proteinprotein interakció kialakítására alkalmas doménnel rendelkezik és nincs enzimaktivitásért felelős doménje. Ezért is keltette fel munkacsoportunk figyelmét, hisz az évek óta foglalkozik fehérje-fehérje kölcsönhatásokkal. Mint már többször utaltam rá, a fehérje a neuronok posztszinaptikus denzitásásban expresszálódik, s ismert tény, hogy az a szervezet fehérjékben legdúsabb területe. A PSD fehérjehálózatának szerveződése a neurobiológia intenzíven kutatott területe, s mivel a Caskin1
vélhetően
egy
állványfehérje,
szerepe
lehet
annak
organizálásában.
Munkacsoportunk ezért arra vállalkozott, hogy a fehérjéhez kötődő egyéb proteineket keres, majd interakciós partnerein keresztül felderíti annak szerepét. A Caskin1 C-terminálisának szerkezetéről nem szerepel adat az irodalomban. Ez a szakasz számos prolint tartalmaz, prolinban-gazdag szekvenciákba rendeződve. Ismert, hogy prolin megtöri a fehérjeláncot és a másodlagos fehérjeszerkezeti elemekben viszonylag ritkán fordul elő, viszont a rendezetlen fehérjékben gyakran megjelenő aminosav. Célul tűztük ki ezért, hogy szerkezeti vizsgálatokkal felderítsük e fehérjeszakasz esetleges rendezetlenségét.
40
4. Anyagok és módszerek
4.1. Plazmidok és DNS konstrukciók
A GFP-Cortactin (1-334 aminosav), valamint a GFP-Cortactin (336-542 aminosav) konstrukciókat Kapus Andrástól kaptuk, ebből hoztuk létre Quick Change site-directed mutagenezis eljárással a GFP-Cortactin C-terminális SH3 mutáns W525K konstrukciót. A teljes hosszúságú Cortactin cDNS-ét PCR reakcióval sokszorosítottuk, majd EcoRI/SalI restrikciós enzimek segítségével pGEX4T1 vektorba ligáltuk. A teljes hosszúságú Caskin1 cDNS-t Thomas Südhof-tól (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, USA), a teljes hosszúságú Abi2 cDNS-t Ann Marie Pendergast-tól (Duke University Medical Center, Durham, USA) kaptuk. A Caskin1 cDNS-ét nagy hűségű DNS polimerázzal sokszorosítottuk, majd a pcDNA 3.1/V5-His TOPO vektorba (Invitrogen) ligáltuk. A teljes hosszúságú Abi2 cDNS-ét PCR reakcióval sokszorosítottuk, majd BamH1 restrikciós enzim segítségével EGFP-C1 vektorba (BD Biosciences Clontech) klónoztuk. A Caskin1 cDNSének különböző szakaszait, az ankirin ismétlődéseket és az SH3 domént együtt (1-346 aminosav), a SAM doméneket (347-610 aminosav), a prolinban-gazdag régió első részét (603-804 aminosav), a prolinban-gazdag régió második szakaszát (804-1199 aminosav), a prolinban-gazdag régió harmadik részét (1200-1430 aminosav), illetve a teljes prolinbangazdag szakaszát (603-1430 aminosav) PCR reakcióval amplifikáltuk, majd EcoRI/SalI restrikciós enzimek segítségével pGEX-4T1 vektorba klónoztuk. Az Abi2 cDNS SH3 doménjének megfelelő szakaszt PCR reakcióval felszaporítottuk, a EcoRI/SalI restrikciós enzimekkel emésztett DNS-t a szintén emésztett pGEX-4T1 vektorba ligáltuk. A Caskin1 teljes hosszúságú prolinban-gazdag szakasza, illetve annak fragmentjeit (603-1430 aminosav, 603-804 aminosav, 804-1199 aminosav, 1200-1430 aminosav) PCR reakcióval amplifikáltuk, majd BamHI/XhoI restrikciós enzimek segítségével pQE2 (Qiagen) expressziós vektorba klónoztuk. A Caskin1 PRR2 szakaszát négy részre bontva GST vektorba klónoztuk EcoRI/SalI restrikciós enzimek segítségével, PCR reakcióval történt ampilfikáció után. A négy szakasz a következő: PRR2/1: 786-900 aminosav, PRR2/2: 905-992 aminosav, PRR2/3: 1005-1105 aminosav, PRR2/4: 1115-1201 aminosav.
41
Az előállított konstrukciókat minden esetben DNS-szekvenálással, valamint a GFPkonstrukciók esetén COS7 sejtekben történt expressziójuk után SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, majd ezt követő anti-GFP monoklonális antitesttel elvégzett Western blottal is ellenőriztük. A GST fúziós fehérjéket Glutation-agaróz (Sigma) gyantához kötöttük és affinitás kromatográfia segítségével tisztítottuk. Az így nyert fúziós fehérjéket SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel elválasztva, majd a géleket Coomassie-blue fehérje festékkel festve a legtöbb esetben egyetlen, határozott csíkot láttunk a fehérje GST-vel megnövelt molekulatömegének megfelelő mérettartományban. A His-címkével jelölt fehérjéket NiNTA (Qiagen) gyantához kötöttük és affinitás kromatográfia segítségével tisztítottuk. Az így nyert fúziós fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztva, majd a géleket Coomassie-blue fehérje festékkel festve a legtöbb esetben egyetlen, határozott csíkot
láttunk
a
fehérje
His-címkével
megnövelt
molekulatömegének
megfelelő
mérettartományban.
4.2. Ellenanyagok, reagensek és sejtvonal
A kereskedelmi forgalomban nem kapható Caskin1 ellenanyag, ezért nekünk kellett készítenünk. Nyúlban állítottunk elő poliklonális anti-Caskin1 ellenanyagokat. Az egyik esetben a fehérje C-terminálisának megfelelő szintetikus, 16 aminosavat tartalmazó peptiddel immunizáltuk a nyulat, a másik esetben a GST fúziós fehérjeként kifejezett SAM doménjeinek megfelelő fehérjeszakasszal oltottunk. A glutation-agaróz gyantáról szabad glutation segítségével leszorítottuk a fúziós fehérjét, majd dialízist követően a fehérjeoldatot azonos térfogatú Freund adjuvánssal együtt oltottuk a nyúl bőre alá. Ugyanígy jártunk el a szintetikus peptid esetén is. Az oltást először elölt TBC baktériumot is tartalmazó „komplett” adjuvánssal végeztük, majd az oltást megadott időszakonként ismételtük, összesen háromszor. Ekkor már elölt TBC baktériumot nem tartalmazó „inkomplett”adjuváns segítségével. A humán monoklonális ellenanyagot az AbDSerotec céggel együttműködve két hónap alatt, immunizálás nélkül, rekombináns technikával állítottuk elő. Módszerük lényege röviden annyi, hogy 1,5 milliárd, egymástól a hipervariábilis régióikban eltérő baktériumokban expresszált ellenanyaguk van. Ebből választják ki az adott epitóppal specifikusan és nagy affinitással reagáló néhány klónt.
42
A GenScript céggel együttműködve poliklonális, foszforilált Caskin1-et felismerő ellenanyagokat állítottunk elő. Az egyik ellenanyag az 1065. foszfo-treonint ismeri fel, s a CVVNRRR(pThr)LSGPVTG szekvencia ellen állítottuk elő. A másik antitest az 1067. foszfo-szerint ismeri fel, CVNRRRTL(pSer)GPVTG szekvencia ellen termeltettük. Az anti-GFP monoklonális ellenanyag a Cancer Research UK Hybridoma Development Unit ajándéka. Az anti-V5 monoklonális antitestet az Invitrogen cégtől vásároltuk.
4.3. Sejtvonalak, sejttenyészetek
A munkánk során használt COS7 epitél sejtvonalat 10%-os fötális borjú szérumot, valamint penicillint (100 U/ml) és streptomycint (50 µg/ml) tartalmazó Dulbecco’s modified Eagle’s médiumban (DMEM) tenyésztettük. A 18 napos vemhes nőstény patkányt előzőleg éterrel túlaltattuk, majd az embriókból izoláltuk a hippocampust. A szövetdarabokat magas glukóztartalmú DMEM-be helyeztük, majd többszöri fel-le pipettázással homogenizáltuk/lizáltuk a hippocampusokat. A sejtszuszpenziót 70 um pórusméretű szűrőn átszűrtük, majd előzőleg poly-L-lizinnel bevont fedőlemezekre ültettük a sejteket, 10%-os fötális borjú szérumot, valamint penicillint (100 U/ml) és streptomycint (50 µg/ml) tartalmazó magas glukóztartalmú médiumban, amely 10%os fötális borjú szérumot, valamint penicillint (100 U/ml) és streptomycint (50 µg/ml) tartalmazott. A következő naptól a sejteket 2% B27 szérumot, valamint penicillint (100 U/ml) és streptomycint (50 µg/ml) tartalmazó Neurobasal médiumban tartottuk. A tápfolyadékot naponta, egyszeri mosással cseréltük a sejteken az első négy napban, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket. Ezt követően kétnaponta cseréltünk médiumot a tenyészeten.
43
4.4. Élesztő két-hibrid rendszer
Az élesztő két-hibrid tesztet alapvetően a Hybrigenics S.A. cég (Párizs, Franciaország) végezte. Csaliként a Caskin1 SH3 doménjét, SAM doménjeit, illetve a prolinban-gazdag régiójának egy szakaszát (280-970 aminosav) tartalmazó konstrukciót használták, amelyet az általuk küldött pB27 vektorba klónoztunk, majd juttattunk el a céghez. A vektor tartalmazta a LexA transzkripciós faktor DNS-kötő doménjét. A csalival humán embrionális agy cDNS könyvtárat teszteltek.
4.5. Tranziens transzfekció
A sejtek transzfekciójára Lipofectamine (Invitrogen) reagenst használtunk, követve a használati útmutató leírását. 75 cm2-es petricsészékre a transzfekciót megelőző napon 106 COS7 sejtet ültettünk. A DNS konstrukciók 7 µg-jához 50 µl Lipofectamine-t raktunk 500500
µl
OptiMEM
(Gibco)
médiumba,
majd
a
két
elegyet
összekevertük
és
szobahőmérsékleten 30 percig állni hagytuk. Ezt követően a sejekről a DMEM médiumot eltávolítottuk és helyére 4-4 ml szérum- és antibiotikummentes OptiMEM tápoldatot mértünk, majd a sejtekre csepegtettük a DNS-Lipofectamine keveréket is. Öt óra elteltével az OptiMEM-et szérumos DMEM-re cseréltük.
4.6. COS7 sejtek szétterülése fibronektinnel bevont felszínen, és immunfluoreszcencia
Hatlyukú sejttenyésztő edényekbe helyezett 20x20 mm-es fedőlemezeket 24 órán át 11-1 ml, 20 µg/ml koncentrációjú fibronektin-PBS oldattal 4oC-on inkubáltunk, majd PBS-sel történő mosás után a szabadon maradt üvegfelszíneket 1%-os BSA-PBS oldattal blokkoltuk egy órán át. Ismételt mosás után a fedőlemezek fölé 1-1 ml, -adott DNS konstrukcióval transzfektált, az előző éjszakán át szérummentes körülmények közt tartott, majd 44
feltripszinezett, 2000 fordulat/perc centrifugálással ülepített, 0,3 mg/ml szója tripszin inhibítorral felszuszpendált és végezetül 1 órán át 0,5%-os BSA-DMEM tápoldatban tartottCOS7 sejteket mértünk. Tíz perc után a sejteket 37oC-os foszfát pufferrel mostuk, majd fixáltuk. A fixálást 4%-os paraformaldehid oldattal végeztük, 15 percig. Ezt követően a sejteket 5 perces 0,2%-os Triton X-100-PBS kezeléssel permeabilizáltuk, majd az aspecifikus kötőhelyeket 0,1%-os BSA-PBS oldattal blokkoltuk. Az F-aktint láthatóvá tevő TRITCphalloidinnel 20 percig festettük a sejteket, végül pedig négyszer 15 percig PBS-sel mostuk azokat. A fedőlemezeket 10% Mowiol 4-88-at (Calbiochem), 25% glicerint és 2,5% 1,4diazobiciklo-(2,2,2,) oktánt (DABCO, Sigma Aldrich) tartalmazó 100 mM Tris-HCl, pH 8,5 puffer felhasználásával a tárgylemezekhez rögzítettük. Az így elkészített minták kiértékelésére fluoreszcens (Nicon Eclipse E400) és konfokális mikroszkópot (Zeiss LSM 510) használtunk.
4.7. Precipitáció, immunprecipitáció és Western blot
A GST fúziós fehérjéket, E.coli baktériumokban fejeztettük ki, majd Glutation-agaróz (Sigma) gyantához kötöttük és affinitás kromatográfia segítségével tisztítottuk. A COS7 sejteket jéghideg foszfát pufferrel (PBS) mostuk, majd 1000 µl lízis puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 20 nM NaF, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM p-nitrofenil-foszfát, 10 mM benzamidin, 1 mM fenil-metil-szulfonil fluorid (PMSF), 25 µg/ml aprotinin, 25 µg/ml leupeptin, 25 µg/ml szója tripszin inhibítor) segítségével a tenyésztőedény faláról sejtkaparóval eltávolítva feltártuk. Az így kapott kivonatokat ezt követően 14000/perces fordulatszámon, 10 percig centrifugáltuk. A patkány agyakat 5 ml lízis pufferben levágott hegyű pipetta segítségével tártuk fel, néhányszor fel-le pipettázva, majd a sejtkivonathoz hasonlóan centrifugáltuk. A kivonatokaból 20-20 µl gyantán immobilizált GST fúziós fehérje jelenlétében 1 órát, 4oC-on forgatva precipitáltuk a kötődő fehérjéket. A mintákat ezt követően 0,5% Triton X-100-at tartalmazó foszfát pufferrel háromszor mostuk. A gyantához kötödő fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk és nitrocellulóz membránra történő blottolásuk után a megfelelő elsődleges és peroxidázzal konjugált másodlagos antitest segítségével a kemilumineszcencia elvén működő eljárással (ECL, Amerscham Pharmacia Biotech) detektáltuk.
45
Immunprecipitációs kísérletekhez a leírt módon készítettünk sejt-, illetve patkány agy kivonatot. A kivonatot 20 µl protein-G-, vagy protein-A-Sepharose gyantához mért 5-5 µg ellenanyag jelenlétében 4oC-on, 1 órát forgatva immunprecipitáltuk. A gyantákat ezt követően 0,5% Triton X-100-at tartalmazó foszfát pufferrel háromszor mostuk. A gyantához kötödő fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, majd Western blot technikával a leírt módon detektáltuk.
4.8. Limitált proteolízis vizsgálatok
A Caskin1 prolinban-gazdag régiójának és egy kontrollként használt globuláris fehérjének, a BSA-nak limitált proteolízisét egy széles szubsztrátspecificitású proteázzal, a szubtilizinnel (Sigma) végeztük. A szubtilizint nagyon alacsony koncentrációban használtuk. Az enzimet 20 mM Tris (pH 7,5), 15 mM NaCl pufferban oldottuk. Az emésztést 25oC-on , azonos pufferban végeztük. A reakciót SDS-poliakrilamid gélelektroforézis mintapuffer adásával és az elegy forralásával állítottuk le.
4.9. CD spektroszkópia
A CD spektrumokat 0,1 mg/ml fehérjekoncentrációnál, 10 mM Na2HPO4 és 150 mM NaCl pufferban, 1 mm úthosszú küvettában rögzítettük Jasco J-720 spektropolariméterrel, folyamatos módban, 1 nm sávszélességgel, 8 s válaszidőkkel és 20 nm/perc szkennelési sebességgel. Az eredményeket a puffer értékeit kivonva mutatjuk be. Minden spektrum 10 független mérés átlagát tükrözik.
4.10. Gélfiltrációs kromatográfia
A
Caskin1
prolinban-gazdag
régiójának
rendezetlen
voltát
gél
szűréses
kromatográfiával is vizsgáltuk. 200 µl fehérjét Amersham Biosciences Superdex 200 (1 x 30 cm) oszlopon futtattuk, 0.5 ml/perc sebességgel, 50 mM Na2HPO4 , 150 mM NaCl, pH 7.0 pufferban, Amersham Biosciences FPLC rendszerben. A fehérjét 280 nm-en detektáltuk. Az 46
oszlopot a következő globuláris fehérjékkel kalibráltuk (molekulatömeg): ribonukleáz A (13.7 kDa), kimotripszinogén A (25.0 kDa), ovalbumin (43.0 kDa), BSA (67 kDa), éa alkohol dehidrogenáz (146.8 kDa). A fehérjék molekulatömegét a kalibrációs görbe alapján határoztuk meg, a kalibrációs görbén a fehérjék molekulatömegének logaritmusát az elúciós térfogat függvényében ábrázoltuk.
4.11. In vitro kináz mérés
A kináz assay során használt szubsztrát a V5 címkével jelölt Caskin1 volt, amelyet előző nap COS7 sejtekbe transzfektáltam. Anti-V5 immunprecipitációt követően a gyantát mostuk 0,5-0,5 ml-ben, kétszer PBS-sel és egyszer 20 mM, pH7,4 Tris pufferrel, majd 50 µl végtérfogatú reakcióelegyet állítottunk össze. A reakcióelegy: 40 mM Tris, pH7,4; 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 200 µM ATP és 0,5 µg PKA, illetve PKC. A kináz reakciót az ATP hozzáadásával indítottuk el. 1 órát, 30oC-on, erős rázatás mellett inkubáltuk az elegyet, majd a folyamatot 10 µl 4-szeresen tömény SDS-mintapuffer hozzáadásával állítottuk le. A gyantához kötődő fehérjéket ezt követően SDS-poliakrilamid gélelektroforézis segítségével elválasztottuk, majd anti-foszfo-Caskin ellenanyaggal történő Western blottal tettük láthatóvá az eredményt.
4.12. In vivo foszforiláció V5 címkével jelzett Caskin1-el transzfektált COS7 sejteket 10-10 percig kezeltem 80 nM végkoncentrációban TPA-val, és 500 µM végkoncentrációban dbcAMP-vel. A Caskin1-et Protein G gyantához kötött monoklonális Caskin1 ellenanyaggal immunprecipitáltam, majd a fehérjéket
SDS-poliakrilamid
gélelektroforézissel
választottam
szét.
A
Caskin1
foszforilációját a foszforilált 1065. treonin, és a foszforilált 1067. szerin ellen termeltetett ellenanyagokkal detektáltam.
47
5. Eredmények
5.1. Cortactinhoz kötődő fehérjék azonosítása
Munkacsoportunk
a
Cortactin
nevű
fehérjével
foglalkozott,
mikor
csatlakoztam. COS7 sejtek fibronektin felszínen való szétterülését, illetve a Cortactin ebben betöltött szerepét vizsgáltuk. Úgy találtuk, hogy a fehérje C-, vagy N-terminálisát külön expresszálva gátolja a sejtek szétterülését (5.1. ábra). Feltételeztük, hogy ennek oka lehet, hogy a két fehérjeszakasz domináns negatív konstrukcióként hatva szekvesztrál, megköt olyan fehérjéket, melyek szabályozhatják, irányíthatják a sejtek szétterülését. Ezen elgondolások alapján mutációval elrontottuk a Cortactin SH3 doménjének kötőképességét, az abban található két konzervatív triptofán közül a másodikat lizinre cseréltük. Azt tapasztaltuk, hogy a mutáns SH3 domént tartalmazó Cortactin C-terminális felét transzfektálva COS7 sejtekbe nem gátolta meg a szétterülést (5.2. ábra). Kísérleteink eredményei tehát valóban arra utaltak, hogy a folyamatban fontos szerepet játszhatnak Cortactinhoz kötődő fehérjék, így azonosítani próbáltunk új, kapcsolódó proteineket. Irodalmi adatok alpján ismert, hogy a Cortactin a posztszinaptikus denzitásban zajló aktin citoszkeleton átrendeződésének szabályozásában is fontos szerepet játszhat. Így felmerült bennünk, hogy patkány agykivonatban keresünk interakciós partnereket. A kísérlethez GST fúziós fehérjeként állítottam elő a teljes hosszúságú Cortactin fehérjét, majd azt glutation-agaróz gyöngyökön immobilizálva patkány agykivonattal inkubáltam. A kötődő fehérjéket SDS-poliakrilamid gélen elválasztottam, majd Coomassie blue fehérje festékkel tettem láthatóvá azokat (5.3. ábra). Találtunk egy specifikusan a GST-Cortactinhoz kötődő kettős csíkként megjelenő fehérjepárt, amit tömegspektrometriás analízissel azonosíttattunk. A GST-Cortactinhoz specifikusan kötődő proteinek a Caskin1 és Caskin2-nek felelt meg. Annak ellenére, hogy a Cortactin és a Caskin fehérjék közti interakciót csak in vitro tudtuk kimutatni, A Caskin fehérjék számunkra érdekesnek bizonyultak, mert szerkezetüket tekintve hatalmas állványfehérjék, számos fehérje-fehérje kölcsönhatás kialakítására képes domént tartalmaznak és munkacsoportunk hosszú ideje foglalkozik fehérjék közti interakciók vizsgálatával.
48
GFP
TRITC-Phalloidin
GFP-N-term.
TRITC-Phalloidin
GFP-C-term.
TRITC-Phalloidin
5.1. ábra. N- és C-terminális Cortactinfél hatása COS7 sejtek fibronektin felszínen való szétterülésére. COS7 sejteket GFP plazmiddal, illetve GFP-Cortactin N-, illetve C-terminális konstrukcióval transzfektáltam, majd a transzfektált sejtek fibronektinen való szétterülését vizsgáltam. Látható, hogy a GFP-t expresszáló sejtek szétterülnek, míg a Cortactin két felét külön kifejeztetve meggátolja a sejtek szétterülését. Az ábra alsó részén a fibrilláris aktinhoz kötődő TRITCPhalloidinnel végzett festés látható.
49
GFP
GFP-C-terminális SH3 mutáns
TRITC-Phalloidin
TRITC-Phalloidin
5.2. ábra. A Cortactin SH3 doménjének mutációja felfüggeszti a C-terminális Cortactinfél szétterülést gátló hatását. A Cortactin SH3 doménjének kötőképességét elrontottuk mutációval, az egyik konzervált triptofánt lizinre cseréltük. GFP-vel és a mutációt tartalmazó Cterminális Cortactinféllel transzfektáltunk COS7 sejteket és azok szétterülését vizsgáltuk. Látható, hogy a mutáció felfüggeszti a vad típusú fehérje szakasz gátló hatását. Az ábra alsó részén a filamentáris aktint festő TRITC-Phalloidinnel történt jelölés képe látható.
50
WB: α-Caskin1
Caskin1, Caskin2 170 kDa
GST-Cortactin+agykivonat
GST-Cortactin
GST+ agykivonat
GST-Cortactin
5.3. ábra: Cortactinhoz kötődő fehérjék azonosítása. A kísérlethez GST fúziós fehérjeként fejeztem ki a teljes hosszúságú Cortactint, majd patkány agykivonattal inkubáltam. A kötődő fehérjéket SDS poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottam, majd a gélt Coomassie blue fehérjefestékkel festettem. A GST-Cortactinhoz specifikusan kötődő fehérjepárt tömegspektrometriával azonosították. A két fehérje a Caskin1 és a Caskin2.
51
5.2. A Caskin1 klónozása
A Caskin1 180 kDa tömegű fehérje, melynek cDNS-e 4500 bázispár hosszúságú. cDNS-ét Thomas Südhof laboratóriumából kaptuk meg Bluescript vektorban, mely az 5’ és a 3’ végén is tartalmazott nem transzlálódó szekvenciát. A kapott konstrukcióban nem találtunk megfelelő pozícióban restrikciós enzim hasítási helyeket, így nem tudtuk egyszerűen kiemészteni a pBluescriptbol, és áttenni expressziós vektorba a teljes hosszúságú cDNS-t. Primereket kellett ezért rendelnünk, melyekkel amplifikáltuk a DNS-t. A klónozáshoz az Invitrogen cég TOPO rendszerét (Invitrogen) használtuk, a metodikát Dr Geiszt Miklós munkacsoportjától vettük át. Ebben a rendszerben a PCR reakciót egy „high fidelity”, nagy hűségű, kifejezetten hosszú termékek amplifikálására alkalmas PCR polimeráz végzi, mely a termék két végére egy-egy túllógó adenint illeszt. A pcDNA TOPO vektor, amelybe a terméket klónoztuk, egy-egy túllógó timint tartalmaz, így a terméket restrikciós hasítás nélkül tudjuk a vektorba klónozni. A ligálást egy, a vektorhoz kovalensen kötött olyan topoizomeráz végzi, melynek ligáz aktivitása is van. A reakció 5-10 perc alatt lejátszódik. A vektor tartalmaz még egy V5 címkét is, amely ellen monoklonális ellenanyag kapható. TOPO klónozási rendszerrel sikerült megklónoznunk a Caskint, majd expresszálnunk COS7 sejtekben. Az 5.4. ábrán látható, hogy az anti-SAM elleni ellenanyag egyetlen csíkként ismeri fel a 180 kDa-os fehérjét Caskint expresszáló sejtekben. Így a kezünkbe került egy jól működő emlős expressziós rendszer, amelynek segítségével expresszálni tudjuk a Caskin1-et. Ezek után a Caskin1 fehérje különböző szakaszait GST fúziós fehérje formájában E. coli baktériumokban termeltettük. Erre egyrészt azért volt szükség, mert a fehérje egyes doménjeit külön vizsgálva pontosan meghatározhatók a kötőpartnerek kapcsolódási helye, másrészt a fehérje ellen termeltetett ellenanyag előállításánál is ezen konstrukciók egyikét használtuk. Az egyes fragmentumok a fehérje következő részeit tartalmazták: 1, az ANK ismétlődéseket és az SH3 domént (1-346 aminosav); 2, a SAM doméneket (347-610 aminosav); 3, 4, 5, a prolinban-gazdag régió egyes részleteit (PRD1: 603-804 aminosav, PRD2: 804-1199 aminosav, PRD3: 1200-1430 aminosav), illetve 6, a teljes hosszúságú prolinban-gazdag szakaszt (PRD: 603-1430 aminosav) (5.5., 5.6. ábra). Az első két fragmentumot problémák nélkül sikerült megklónoznunk, az utóbbi fragmensekkel
52
nehézségeink akadtak, ezek okát a későbbiekben magyarázom meg. Végül sikerült mind a hat szakaszt GST fúziós fehérjeként előállítanunk.
WB: anti-SAM
Caskin 170 kDa
K
Caskin
5.4. ábra: A Caskin1 fehérje expressziója COS7 sejtekben. A Caskin1 fehérjét TOPO emlős expressziós vektorba klónoztuk, majd COS7 sejtekben kifejeztettük. A sejtek feltárása után a fehérjéket SDS gélelektroforézissel választottuk szét. Nitrocellulóz membránra történő blottolás után a Western blotot az általunk előállított poliklonális ellenanyaggal hívtuk elő. Látható, hogy az antitest egyetlen csíkként ismeri fel a fehérjét a sejtkivonatban, míg a nem transzfektált COS7 sejtek kivonatában (K) nem ismer fel fehérjét.
53
5.5. ábra: A Caskin1 egyes doménjei GST fehérjeként kifejeztetve. A Caskin1 különböző szakaszait GST fúziós fehérjeként fejeztük ki. Külön expresszáltuk az ANK és SH3 domént, a SAM doméneket, a teljes hosszúságú prolinban-gazdag régiót, illetve annak három szakaszát. A konstrukciókkal végeztünk GST precipitációs kísérleteket, illetve a GST-SAM domént ellenanyag előállításához is felhasználtuk.
54
5.6. ábra: A Caskin1 fehérje különböző doménjeinek expressziója Coomassie festéssel ellenőrizve. A Caskin1 fent jelzett szakaszait E. coli baktériumokban fejeztettük ki, majd a fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk szét. A fehérjéket Coomassie blue fehérjefestékkel detektáltuk. A különböző Caskin1 fragmentumok a GST tömegével megnövelt mérettartartományban láthatók.
55
5.3. Caskin1 ellenanyag előállítása
Utaltam rá, hogy a kereskedelmi forgalomban nem kapható Caskin1 ellenanyag, ezért, hogy a fehérjét vizsgálni tudjuk, nekünk kellett azt előállítanunk. A fehérjét leíró munkacsoport
a
fehérje
N-terminális,
16
aminosavas
peptidjét
(szekvenciája:
CSMFDDLADQLDAMLE) használta nyulak immunizálásra. Munkacsoportunk is követte ezt (anti-peptid ellenanyag), illetve a fehérje egy másik szakaszával, GST-SAM doménjeivel is immunizáltunk (anti-SAM ellenanyag). Azért választottuk a fehérjének ezt a szakaszát, mert a 6.2 ábrán bemutatott GST fehérjék közül a talán ennek expressziója volt a legerősebb. Az általunk előállított mindkét antitest határozott csíkként ismeri fel a Caskin1-et, alkalmas immunprecipitációra és Western blot technikával történő detektálásra (5.7. ábra).
56
5.7. ábra: A Caskin1 ellenanyag tesztelése. A kísérletben mindkét ellenanyaggal immunprecipitáltam a Caskint patkány agykivonatból. A Western blotot az anti-SAM ellenanyaggal végeztem el. Látható, hogy a Caskin az agykivonatban vékony csíkként jelenik meg, az immunprecipitáció során azonban bekoncentrálódik. Figyelemre méltó, hogy az anti-peptid ellenanyaggal immunprecipitált fehérjét a másik, anti-SAM ellenanyag is felismeri, tehát a Caskin1 két különböző része ellen termeltetett ellenanyag ugyanazt a fehérjét ismeri fel. Elmondható tehát, hogy sikerült előállítanunk két ellenanyagot, mindkettő immunprecipitálja a Caskint, és használhatók Western blotra is.
A későbbiekben szerettük volna a Caskin1 fehérje sejten belüli lokalizációját is vizsgálni immunfluoreszcenciás eljárással. Sajnos erre azonban alkalmatlanok voltak az általunk előállított poliklonális ellenanyagok, ugyanis a Caskin1 mellett egyéb fehérjéket is felismernek. A megfelelő, monoklonális antitestet egy német céggel, az AbDSerotec-el együttműködve sikerült előállítanunk. Két hónap alatt, immunizálás nélkül, rekombináns technikával humán ellenanyagot állítottunk elő (5.8. ábra). A módszer lényege röviden annyi, hogy 1,5 milliárd, egymástól a hipervariábilis régióikban eltérő, baktériumokban expresszált ellenanyaga van a cégnek. Ebből válsztják ki az adott (általunk küldött) antigénnel specifikusan és nagy affinitással reagáló néhány klónt.
57
5.8. ábra: A monoklonális Caskin1 ellenanyag kipróbálása. Az AbDSerotec céggel együttműködve monoklonális Caskin1 ellenanyagot állítottunk elő, ami a fehérje SAM doménje ellen készült. COS7 sejteket V5 címkével jelzett Caskin1-el transzfektáltuk. A sejtek és a patkány agy feltárása után a fehérjéket SDS gélelektroforézissel választottuk szét, majd nitrocellulóz membránra blottoltuk. Az azt követő Western blot analízist a Caskin1 monoklonális ellenanyaggal végeztük. A transzfektált sejtek kivonatában és a patkány agy kivonatában is egyetlen csíkként ismeri fel az ellenanyag a fehérjét.
58
5.4. A Caskin1-hez számos fehérje kötődik élesztő két-hibrid rendszerben
A Caskin1 doménszerkezete alapján egy hatalmas állványfehérje, számos proteinprotein kölcsönhatás kialakítására alkalmas doménje van. Ezen meggondolások alapján munkacsoportunk interakciós partnereinek felderítése révén próbált közelebb jutni a fehérje funkciójának megértéséhez. Elsőként GST-precipitációs kísérlet elvégzésével szerettünk volna kötőpartnereket azonosítani. A munkához a 6.1 ábrán látható fúziós fehérjékkel kerestünk Caskin1-hez kapcsolódó fehérjéket patkány agykivonatban. Ezzel a módszerrel nem sikerült azonosítanunk interakciós partnereket, így a továbbiakban a számos egyéb fehérje-fehérje interakció detektálására alkalmas módszer közül az élesztő két-hibrid metodikát választottuk. A Hybrigenics céggel együttműködve végeztük el a tesztet. Előzetes megbeszéléseink alapján nem a teljes hosszúságú fehérjét vizsgáltuk, ugyanis rendszerükben annak expressziója gyenge lett volna. A tesztelt szakasz tartalmazta az SH3 domént, a SAM doméneket és a prolinban-gazdag szakasz jelentős részét (5.9. ábra). Az említett fehérjerészletet az általuk küldött pB27 vektorba klónoztuk, majd humán embrionális agykönyvtárral szemben tesztelték.
59
5.9. ábra: Élesztő két-hibrid rendszerben tesztelt Caskin1 fehérjeszakasz. Az ábrán a Caskin1 szerkezetét tüntettem fel. A fehérje N-terminálisa fehérje-fehérje kölcsönhatás kialakítására alkalmas doméneket tartalmaz, C-terminálisa pedig egy hosszú prolinban-gazdag szakaszt, amelyhez SH3 és WW domének kötődhetnek. A fehérje szerkezete alpján feltételeztük, hogy számos más protein kapcsolódhat hozzá, állványfehérjeként viselkedhet. Bizonyításként a francia Hybrigenics céggel együttműködve élesztő két-hibrid tesztben vizsgáltuk a Caskin1-et. A cég javaslata alapján a fehérje egy szakaszát teszteltük rendszerükben, mivel a teljes hosszúságú forma expressziója gyenge lett volna. A vizsgált proteinrészletet tüntettem fel a teljes fehérjén jelölve, amely tartalmazta a fehérje SH3 doménjét, a SAM doméneket és a prolinban-gazdag régió jelentős részét (280. aminosavtól a 963. aminosavig).
A két-hibrid tesztben számos fehérje kapcsolódott a Caskin1-hez. Az eredményt az alábbiakban tüntettem fel (6.1 táblázat). A Hybrigenics cég évek alatt szerzett tapasztalatai alapján kiszűri az ún. ragadós fehérjéket, például: transzkripciós faktorokat és csak a legvalószínűbb interakciókat adja meg eredményként. Fontos megemlíteni, kötőpartnerként a többi fehérje mellett a Cask-ot is azonosítottuk. Ez is jelzi tulajdonképpen a rendszer hiteles működését, mivel a Caskin1-et Südhof és munkatársai Cask-kötő fehérjeként írták le (Tabuchi és mtsai 2002).
60
6.1. táblázat: Az élesztő két-hibrid teszt eredményeként kapott Caskin1-hez kötődő fehérjék. A Caskin1 fehérje számos fehérje-fehérje kapcsolat kialakítására alkalmas domént és hosszú, prolinban-gazdag szakaszt tartalmaz, amelyhez SH3 és WW domének kapcsolódhatnak, ezért azt feltételeztük, hogy számos fehérje kötődhet hozzá. Bizonyításként élesztő két-hibrid rendszerben vizsgáltuk humán embrionális agykönyvtárral szemben. A teszt eredménye alapján több fehérje kapcsolódik a Caskin1-hez. A táblázat első oszlopában tüntettem fel azoknak a pozitív klónoknak a számát, amelyekben az adott kötőfehérje előfordult, majd annak neve és funkciója olvasható a következő oszlopokban.
Klónok száma 12
Fehérje Abl inreractor 2
Funkció Abl-kötő fehérje
2
Cask
Adapter fehérje
1
Ephrin A2
Tirozin-kináz receptor
1
L1 sejtadhéziós
Sejtadhéziós molekula
molekula 2
miozin B1
Kontraktilis fehérje
1
NCK1
Adapter fehérje
1
neurexin2
Sejtadhéziós molekula
1
sztatmin 3
Mikrotubulus regulátor
1
szinaptotagmin1
Ca2+ szenzor
7
septin 4
Osztódási ciklus regulátor élesztőben
12
Siah1
61
Ubikvitin ligáz
Ismerve a Caskin1 kötőpartnereiként azonosított fehérjék doménszerkezetét, megjósoltuk az interakcióban résztvevő fehérjeszakaszokat (5.10. ábra).
5.10. ábra: A Caskin1-hez kapcsolódó fontosabb fehérjék és a megjósolt kötőhelyek. Az élesztő két-hibrid teszt eredményeként kapott fehérjék doménszerkezetét ismerve megjósoltuk a kötőhelyeket. A neurexin-2 és a Szeptin-4 prolinban-gazdag régiójukon keresztül feltehetően a Caskin1 SH3 doménjéhez köt, az Ephrin-A2 SAM doménjén át a Caskin1 SAM doménjéhet kapcsolódik, míg az Abelson interacting protein-2 és az Nck SH3 doménjeik segítségével asszociálódnak a Caskin1-hez.
62
A továbbiakban teszteltük az eredményként kapott fehérjék és a Caskin1 közti kölcsönhatásokat. Először ezért GST fúziós fehérje formájában állítottam elő az adott proteineket és patkány agykivonatból próbáltam kihalászni a glutation agaróz gyöngyökhöz kötött fehérjékkel a Caskin1-et. Megklónoztam és teszteltem az említett rendszerben az EphA2-t, a Siah1-et, a Sept4-et, az Nck-t, és az Abi2-t. Valós interakciónak csupán az Abi2vel és az Nck-val való kapcsolat bizonyult, amely nagyon meglepő volt számunkra, ugyanis úgy gondoltuk, hogy az élesztő két-hibrid teszt, mint in vivo metodika, nagyobb arányban eredményez valós kapcsolatokat. Az említett két fehérjével sejten belül is bizonyítottam az interakciót GFP címkével jelzett konstrukciók felhasználásával. Dolgozatomban a két fehérje közül csak az Abi2-vel kialakított kapcsolat bizonyításával foglalkozom.
63
5.5. Az Abi2 SH3 doménjén keresztül kapcsolódik a Caskin1 prolinbangazdag régiójához
Az Abi2-t két-hibrid tesztben azonosították, mint a c-Abl tirozin kinázhoz kötődő fehérjét. A sejtekben a dinamikus aktin citoszkeleton átrendeződés helyére lokalizálódik. Szerepe lehet az epiteliális sejt-sejt kapcsolatok kialakulásában, a dendritikus tüskék formálódásában. A dendritikus tüskék tulajdonképpen a szinapszisok helyeit jelölik ki, ezekhez kapcsolódnak más neuronok axonjai. 2004-ben elkészítették az Abi2 génkiütött egeret. Az Abi2 hiányos egerekben súlyos deficienciák lépnek fel. Abnormalitások jelentkeznek az agyban és a szemben, a két szövetben, melyekben a legnagyobb mennyiségben expresszálódik a fehérje. A Caskin1 és az Abi2 közti kapcsolatot in vitro és in vivo módszerekkel is sikerült igazolnunk. Első lépésben in vitro GST precipitációs mérést végeztünk. A kísérletben GST fehérjeként előállítottam a Caskin1 különböző szakaszait, ANK és SH3 doménjét, SAM doménjeit, prolinban-gazdag régiójának három szakaszát (PRD1-3), illetve a teljes hosszúságú prolinban-gazdag régiót (PRD) (5.4. ábra). A glutation agaróz gyantához kötött fúziós fehérjéket inkubáltam GFP-Abi2-t tranziensen overexpresszáló COS7 sejtek kivonatával. A mintákat többszöri mosás után SDS poliakrilamid gélelektroforézisen elválasztottuk. Nitrocellulóz membránra törnénő blottolás után az Abi2 fehérje kötődését antiGFP ellenanyaggal tettem láthatóvá. Az ábrán látható, hogy a GFP-Abi2 a Caskin1 prolinbangazdag régiójához kötődik. A domén második szakasza köti legnagyobb affinitással a fehérjét, bár láthatóan az első szakaszhoz is képes kötődni az Abi2. A teljes hosszúságú prolinbangazdag régió esetében ugyanazt az intenzitású kötést tapasztaltuk, mint a második szakasz esetén (5.11. ábra).
64
5.11. ábra: A Caskin1 és az Abi2 in vitro kapcsolata. A Caskin1 egyes doménjeit GST fúziós fehérje formájában állítottuk elő, majd a gyantához kötött fúziós fehérjéket GFP-Abi2-t tranziensen expresszáló COS7 sejtek kivonatával inkubáltuk. A precipitált fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, és az egyes fragmentumok Abi2 kötését anti-GFP Western blot segítségével vizsgáltuk. Az Abi2 a Caskin1 prolinban-gazdag régiójának első és második szakaszához kötődik.
A kapcsolatot más módon is alá kívántuk támasztani. Az előző kísérletben kimutattuk, hogy a Caskin prolingazdag régiójához kötődik az Abi2. Mivel a prolinban-gazdag régióhoz SH3 domén kötődhet, ezért megvizsgáltuk, hogy az Abi2 valóban SH3 doménjével kötődik a Caskin1-hez. A GST fehérje formájában E.coli baktériumokban kifejezett és glutation agaróz gyantához kötött Abi2 fehérje SH3 doménjét patkány agykivonattal inkubáltam, majd SDSpoliakrilamid gélelektroforézis és nitrocellulóz membránra való blottolást követően a kötődést az általunk előállított anti-SAM antitesttel vizsgáltam. Látható, hogy az Abi2 SH3 doménje patkány agykivonatból megkötötte a Caskin1-et (5.12. ábra).
65
5.12. ábra: Az Abi2 SH3 doménje megköti a Caskin1-et patkányagy kivonatból. Az Abi2 SH3 doménjét GST fúziós fehérje formájában állítottuk elő, majd a gyantához kötött fúziós fehérjét patkányagy kivonattal inkubáltuk. A gyantához kötött GST-Abi2 SH3 fehérjéhez kapcsolódó fehérjéket többszöri mosás után SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, és a Caskin1 kötődést az általunk előállított poliklonális Caskin1 ellenanyaggal vizsgáltuk. Az Abi2 SH3 doménje patkány agykivonatból megkötötte a Caskin1-et.
66
5.6. A Caskin1 és az Abi2 in vivo is kapcsolódnak
Előző kísérletsorozatunkban kimutattuk, hogy a két fehérje in vitro körülmények között kötődik egymáshoz, az Abi2 SH3 doménjén keresztül a Caskin1 prolinban-gazdag régiójához köt. A továbbiakban a kölcsönhatást in vivo módszerekkel kívántuk igazolni. A kísérletben V5 címkével jelzett Caskint, és GFP-Abi2-t koexpresszáló COS7 sejtkivonatot használtam. Kontroll, illetve V5 címke elleni ellenanyaggal immunprecipitáltam a Caskint a kivonatból, majd a fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel választottam el. Nitrocellulóz membránra történő blottolás után anti-GFP antitesttel detektáltam az Abi2 fehérjét. Látható, hogy a sejtkivonatban megjelenő Abi2 sejten belül kötődik a V5 ellenanyaggal precipitált Caskinhoz azokban a sejtekben, ahol mindkét fehérjét expresszáltuk (5.13. ábra).
5.13. ábra: A Caskin1 és az Abi2 kapcsolatának in vivo bizonyítása. GFP-Abi2-t és V5 címkével jelzett Caskin1-et expresszáló COS7 sejtkivonatból kontroll, illetve a V5 epitópot felismerő antitesttel precipitáltuk a Caskin1-et. SDS-PAGE és nitrocellulóz membránra történő blottolás után a kötődést anti-GFP ellenanyaggal vizsgáltuk. Eredményeink arra utalnak, hogy a két fehérje sejten belül kapcsolódik egymáshoz.
67
Tekintve, hogy az Abi2 a Caskin1 PRD2 régiójához kötődik a legnagyobb affinitással, lokalizálni szerettük volna azon belül a pontos kötőhelyet. Ehhez a PRD2-t további négy, közel azonos hosszúságú szakaszra bontva GST vektorba klónoztuk és baktériumokban kifejeztettük (PRR2/1-4). A glutation-agaróz gyantához kötött fehérjékkel patkány agykivonatból próbáltuk kihalászni a Caskin1-et. A második PRD2 szakasz, a PRD2/2 kötötte meg a fehérjét. E régión belül egyetlen prolinban-gazdag szekvencia található, feltehetően ehhez kötődik a Caskin1 (5.14. ábra) .
5.14. ábra: Az Abi2 pontos kötőhelyének meghatározása. A PRD2-t négy, közel azonos hosszúságú szakaszra bontva GST vektorba klónoztuk és baktériumokban kifejeztettük (PRR2/1-4). A glutation-agaróz gyantához kötött fehérjékkel patkány agykivonatból próbáltuk kihalászni a Caskin1et. A kötődő fehérjéket SDS gélelektroforézissel választottuk el, majd nitrocellulóz membránra blottoltuk. A Western blotot monoklonális anti-Caskin1 ellenanyaggal hívtuk elő. A második PRR2 szakasz, a PRR2/2 kötötte meg a fehérjét. E régión belül egyetlen prolinban-gazdag szekvencia található, feltehetően ehhez kötődik a Caskin1. A PRR2/2 szakasz szekvenciáját tüntettem fel az ábrán, jelölve az egyetlen prolinban-gazdag szekvenciát.
68
A két fehérje interakciója tehát valós kapcsolatnak bizonyult, az Abi2 SH3 doménjén keresztül kötődik a Caskin1 prolinban-gazdag régiójához (5.15. ábra). Ez nagyon érdekes eredmény, mert mint azt a bevezetésben említettem az Abi2-nek nincs még idegrendszerben leírt interakciós partnere, és az Abi2 nagyon fontos lehet az idegrendszer kialakulásában, fejlődésében, amelyet a génkiütött egér súlyos idegrendszeri zavarai mutatnak.
5.15. ábra: A Caskin1 prolinban-gazdag régiójához kötődik az Abi2 SH3 doménjén keresztül. A fehérjék kapcsolatát in vitro és in vivo módszerekkel is igazoltuk. Kísérleteinkben bizonyítást nyert, hogy az Abi2 SH3 doménjén keresztül kötődik a Caskin1 prolinban-gazdag régiójához.
69
5.7. A Caskin1 C-terminális fele rendezetlen szerkezetű
Előzőekben már utaltam rá, munkánk során próbáltuk előállítani GST-fúziós fehérje formájában a Caskin1 prolinban-gazdag doménjének egyes szakaszait (PRD1-3), illetve a teljes hosszúságú régiót (PRD). A különböző konstrukciók esetén azonban a PCR reakciók sokszor nem működtek megfelelően, illetve aspecifikus csíkokat láttunk. Ugyanakkor, ha sikerült amplifikálni a megfelelő cDNS-t, illetve sikerült expresszálni a fehérjéket, gyakran fokozott proteolízist tapasztaltunk. Felvetődött ezért, hogy a Caskin1 C-terminálisa rendezetlen szerkezetű, ezért Tompa Péter munkacsoportjával megvizsgáltuk feltevésünket. A Caskin1 fehérje N-terminálisán több ismert, fehérje-fehérje kapcsolatok kialakítására képes domén helyezkedik el, ankirin ismétlődések, SH3 domén, SAM domének. Ezen struktúrák háromdimenziós szerkezete jól ismert. A fehérje C-terminálisán nem található hasonló domén, azonban számos prolint tartalmaz. Mivel ez az aminosav megtöri a fehérjeláncot, így a sok prolin nem jellemző az ismert másodlagos fehérjeszerkezeti elemekre (Williamson 1994), ellenben gyakran előfordul a rendezetlen fehérjékben (Tompa 2002). A leírtak alapján feltételeztük, hogy a Caskin1 ezen szakasza rendezetlen. Feltevésünk igazolására elsőként bioinformatikai módszereket hívtunk segítségül, az IUPred (rendezetlen fehérjék detektálására alkalmas predikciós program) azt mutatta, hogy vélhetően a Caskin1 Cterminális szakasza rendezetlen (5.16. ábra).
70
ANK
SH3
SAM
PRD1
PRD2
PRD3
5.16. ábra: A Caskin1 C-terminálisának vizsgálata IUPred algoritmussal. Az ábrán a Caskin1 sematikus szerkezete, felette pedig az IUPred program predikciója látható. A fehérje Nterminálisán jól ismert domének, ankirin ismétlődések, SH3 domén, SAM domének helyezkednek el, Cterminálisán pedig prolinban-gazdag szekvencia található, melyet munkánk során három részre vágva klónoztuk meg, illetve vizsgáltuk. Mivel a prolin a fehérjeláncot megtöri, ritkán fordul elő az ismert másodlagos szerkezeti elemekben, azonban kimutatták, hogy gyakran előfordul a rendezetlen fehérjékben, illetve rendezetlen fehérjeszakaszokban, így felmerült, hogy az adott szakasz rendezetlen. Az IUPred predikciós programmal vizsgált fehérjék esetében, a 0,5 feletti érték nagy valószínűség szerint rendezetlen szerkezetre utal. Ez alapján elmondható, hogy a fehérje teljes C-terminális része rendezetlen szerkezetű. Érdekes megjegyezni, hogy a Caskin1 ismert kötőpartneréhez, a Caskhoz SH3 és SAM doménje közti régióban kötődik, amely a predikció alapján szintén rendezetlen szerkezetű, hasonlóan az Abi2-kötő PRD2 régióhoz.
A bioinformatikai igazolás mellett természetesen még egyéb, kísérleti módszerrel is bizonyítottuk a fehérjeszakasz rendezetlen voltát, Tompa ugyanis rámutatott (Tompa 2002), hogy így bizonyítható csak meggyőzően a másodlagos és harmadlagos szerkezet hiánya. A Caskin1 teljes hosszúságú prolinban-gazdag régióját C-terminálisára helyezett His címkével klónoztuk meg. Erre azért volt szükség, mert a GST címke túl nagy, illetve rendezett szerkezetű, ami megzavarhatja a mérést. A fehérjeszakasz kifejeztetésével problémák merültek fel a rendezetlen fehérjékre jellemző kifejezett proteolitikus érzékenység, ennek következtében nagyfokú degradáció miatt. Emiatt kis mennyiségű fehérjét tudtunk preparálni és csupán cirkuláris dikroizmus, gél-filtrációs és limitált proteolízises vizsgálatokat tudtunk 71
végezni a teljes hosszúságú prolinban-gazdag régióval. A részletesebb vizsgálatok kivitelezéséhez a teljes prolinban-gazdag szakaszt 3, megközelítőleg azonos hosszúságú régióra osztottuk, His címkét tartalmazó PQE2 és pET20b vektorba klónoztuk és E. coli baktériumokban fejeztettük ki. A rendezetlen fehérjék szintén jellemző tulajdonsága a hőstabilitás. A PRD régiók preparálásának első lépésében 100oC-on forraltuk 5 percig a mintát, majd Ni-Agaróz affinitás kromatográfiás oszlopon tisztítottuk a fehérjéket. A teljes hosszúságú PRD, illetve az egyes fragmentumok hőstabilitása nyújtotta az első kísérletes bizonyítékot az adott szakaszok rendezetlenségére. A fehérjék szerkezetét CD spektroszkópiával is vizsgáltuk. A teljes hosszúságú PRDHis konstrukció spektruma 202 nm-en minimumot mutat (5.17. A ábra), amely egyértelműen jelzi rendezetlenségét. A PRD2-his és a PRD3-his fehérjék spektrumában kis váll figyelhető meg 220 nm-en, amely feltételez meglévő másodlagos szerkezeti elemeket is a fehérje e szakaszaiban, azonban a három régió összegzett spektruma a teljes hosszúságú szakasz képét mutatja (5.18. A, B ábra). A rendezetlen fehérjék másik jellemző tulajdonsága, a fokozott proteolítikus érzékenységük (Tompa 2002). Olyan proteáz koncentráció mellett, amelynél a globuláris fehérjék még nem emésztődnek, a rendezetlen fehérjék gyorsan és teljesen degradálódnak. Kísérleteinkből kiderült, hogy a PRD jóval érzékenyebb a széles spektrumú proteázra, a szubtilizinre, mint a kontrollként használt, globuláris szerkezetű borjú szérum albumin (5. 17. B ábra). Ez a tény is a PRD rendezetlenségére utal. A gélszűréses vizsgálatok eredményei is szintén a másodlagos szerkezetek hiányát mutatják, miszerint a PRD-His molekulatömege 334,5 kDa, amely a tényleges tömegénél 3,9szer nagyobb (5.17. C ábra). Hasonló adatokat nyertünk három szakasz esetén is, a PRD1-His konstrukció tömege 95,5 kDa a tényleges 21 kDa-hoz képest, a PRD2-His 91,9 kDa 41,7 helyett, míg a PRD3 esetén 125,4 kDa 23,2 kDa helyett (5.18. D ábra). Az oszlopot globuláris fehérjével kalibráltuk, így a kapott eredmények a rendezetlen szerkezetre utalnak, mivel a kapott és a tényleges molekulatömegek aránya 4-5 között van (Csizmok és mtsai 2006). Feltevéseinket végül NMR spektroszkópiás módszerrel is igazoltuk.
1
H NMR
mérésekkel megállapítható, hogy mennyi vizet kötnek a fehérjék hidrátburkukban. Ez lényegesen nagyobb érték rendezetlen fehérjék esetén, mint globuláris proteineknél. Mind a négy fehérjeszakasz spektrumáról leolvasható, hogy jóval több vizet kötnek hidrátburkukban, mint a kontrollként használt borjú szérum albumin. Spektrumuk egy ismert rendezetlen fehérje, az ERD10 spektrumára hasonlít (Tompa és mtsai 2006). A PRD2 fragmentum NMR 72
spektruma alapján sejthető, hogy a fehérjeszakaszban rövidebb szakaszra kiterjedő, lokális rendezettség fordul elő (5.18. C ábra).
5.17. ábra: A Caskin1 prolinban-gazdag régiójának szerkezeti jellemzése. A, a PRD-His távoli UV fényben felvett CD spektruma. A spektrum 202 nm-en határozott minimumot mutat, amely a rendezetlen szerkezet jellemzője. B, a Caskin1 PRD, illetve egy kontroll fehérje, a BSA limitált proteolízise
A rendezetlen fehérjékre jellemző, hogy a globuláris fehérjkhez képest jóval
érzékenyebbek a proteolízisre. Olyan enzimkoncentrációnál, amelynél a globuláris fehérjék nem emésztődnek, a rendezetlen fehérjék gyorsan és teljesen degradálódnak. A limitált proteolízis vizsgálatokat 1:2000 enzim:szubsztrát koncentrációkkal végeztük, 0, 10, 30, 60 s múlva állítottuk le a reakciót, majd a mintákat SDS-PAGE gélen választottuk el. Látható, hogy a PRD jóval érzékenyebb a proteolízisre, mint a globuláris BSA. Ezek az adatok a PRD rendezetlen szerkezetét jelzik. C, egy kontroll globuláris fehérje, a borjú szérum albumin (
) és a teljes PRD (
) gél filtrációs
kromatográfiája. Elmondható, hogy a PRD egy kinyúlt, random coil-szerű fehérje, amelynek a látszólagos molekulatömege 3,9-szer nagyobb, mint a valódi molekulasúlya.
73
5.18. ábra: A PRD1, PRD2, PRD3 szakaszok szerkezeti jellemzése. A, a különböző PRD régiók távoli UV fényben felvett CD spektruma: a rendezetlen fehérjékre jellemző, hogy CD spektrumuk 200 nm körül határozott minimumot mutat, amely nem figyelhető meg a másodlagos szerkezettel rendelkező fehérjék esetén. Az ábrán a PRD1 (fekete), a PRD2 (piros) és a PRD3 (kék) CD spektruma látható, mindhárom esetben megfigyelhető a határozott minimum 202 nm-nél. A PRD2 és PRD3 spektrumában fellelhető kis váll kis kiterjedésű másodlagos elemek meglétét jelenti. B, a teljes hosszúságú prolinban-gazdag régió (-) és az egyes szakaszainak összesített spektrumának összehasonlítása (--). Látható, hogy az összesített spektrum lefutása megegyezik a teljes régió spektrumával, bizonyítva azt, hogy a PRD teljesen rendezetlen szerkezetű, nem fordul elő benne hosszú távú rendezett struktúra. C, a PRD1 (kék), a PRD2 (zöld), a PRD3 (piros), egy globuláris fehérje, a BSA (világoskék) és a rendezetlen ERD10 (fekete) fehérjék hidrátburkában kötött víz mennyiségének meghatározása. A PRD konstrukciók magas hidratációs potenciálja a kitekeredett, rendezetlen struktúrájukra utal. D, PRD1, PRD2, PRD3 gél filtrációs kromatográfiája. Mindhárom szakasz esetén azt tapasztaltuk, hogy a látszólagos molekulasúly/ valós molekulasúly arányok (4,5; 2,2; 5,4) a rendezetlen fehérjékre jellemző adatokat tükrözik.
74
Kutatásainkat kiterjesztve bioinformatikai módszerekkel 74 állványfehérjét vizsgálva kimutattuk, hogy általánosan jellemző azokra a nagyfokú rendezetlenség. A globuláris, határozott szerkezetű interakciós doméneket hosszabb-rövidebb flexibilis, rendezetlen régiók kötik össze. Három algoritmussal vizsgálva (IUPred, VSL2 és FoldIndex) az irodalomból válogatott állványfehérjék szerkezetét, úgy találtuk, hogy rendezetlenségük (az egyes adatbázisok szerint 49,7;, 63,36; 47,82%-ban, tehát átlagosan az egyes fehérjék 53,6%-a rendezetlen) mértéke a leginkább rendezetlen RNS chaperonok adataival hasonlítható össze. Tovább vizsgálva a fehérjék szerkezetét, arra a megállapításra jutottunk, hogy leginkább a doméneket összekötő régiók nem rendelkeznek másodlagos és harmadlagos fehérjészerkezeti elemekkel (az egyes adatbázisok szerint 61,13; 77,53; 54,84%-ban, tehát a kapocsrégiók átlagosan 64,5%-ban rendezetlenek). A vizsgált állványfehérjék példáján bizonyítani szerettük volna, hogy az egyes doméneket összekötő régióknak egyéb funkciók is tulajdoníthatók, ezért hosszúságeloszlás analízist végeztünk a doménekre és a kapocsrégiókra kiterjedően. Azt találtuk, hogy a domének átlagosan 86 aminosavból állnak, az eredmények kevéssé tértek el az átlagtól. A kapocsrégiók esetén jóval nagyobb szórást tapasztaltunk, az átlagos hossz 140 aminosavnak bizonyult, a leghosszabbat a BRCA-1 fehérjében találtuk, az 1579 aminosavat tartalmazott.
75
5.7. A PKA és a PKC képes foszforilálni a Caskin1 prolinban-gazdag szakaszát
Irodalmi
adatok
alapján
ismert,
hogy
a
rendezetlen
szakaszok
gyakran
poszttranszlációs módosítások célpontjai (Fuxreiter és mtsai 2007), (Iakoucheva és mtsai 2004). A módosítások többek közt a fehérje-fehérje kapcsolatok létrejöttét is befolyásolhatja (Bhattacharyya
2006),
ezáltal
fontos
kötő/szabályozó
funkciót
kölcsönöz
az
állványfehérjéknek. Kísérleteinkben a Caskin1 esetleges foszforilációját vizsgáltuk. A NetPhos (www.cbs.dtu.ck/services/NetPhos) program segítségével in silico kerestünk foszforilációs helyeket a fehérjén. Az algoritmus szerint a legnagyobb valószínűséggel a PKA (protein-kináz A) és a PKC (protein-kináz C) képes foszforilálni a Caskin1-et, prolinban-gazdag régióján belül. A legvalószínűbb PKA foszforilációs helynek az 1067. szerin, a legvalószínűbb PKC szubsztrát helynek az 1065. treonin bizonyult. A PKA konszenzus foszforilációs szekvenciája RRxS/Tx, a PKC-é RxxS/TxRx, ahol x bármely aminosavat jelentheti. A program által jelölt foszforilációs helyek megfeleltek az említett szekvenciáknak,
PKA
esetén
CVVNRR(pThr)LSGPVTG,
PKC
esetén
pedig
CVNRRRTL(pSer)GPVTG. In
vivo
adatok
tömegspektrometriás
is
alátámasztották
analízissel
azonosított
a
feltevésünket.
több
száz
Egy
munkacsoport
foszforilálódó
fehérjét
a
posztszinaptikus denzitásban. Úgy találták, hogy számos fehérje mellett a Caskin1 1065. treoninja és a 1067. szerinje is foszforilálódik (Peng és mtsai 2004). A foszforiláció legkönnyebben
foszfo-specifikus
ellenanyaggal
vizsgálható.
A
GeneScript
céggel
együttműködve a megadott foszforilációs helyek ellen ellenanyagot állítottunk elő, hogy bizonyítsuk az in silico, illetve tömegspektrometriás adatokat. Első lépésben V5 címkével jelzett Caskin1-gyel transzfektált COS7 sejteket kezeltük protein-kináz C aktivátor tetradekanoil forbol acetáttal (TPA) és protein-kináz A aktiváló dibutiril-cAMP-vel (dbcAMP). Eredményeink szerint TPA hatására foszforilálódik a 1065. treonin és a 1067. szerin, míg dcAMP kezelés hatására a 1065. treonin (5.19. ábra)
76
5.19. ábra: Caskin1 foszforilációjának vizsgálata. Az in silico és tömegspektroszkópiás analízissel azonosított Caskin1 foszforilációs helyek ellen a GeneScript céggel együttműködve elleanyagot készítettünk, melynek segítségével a fehérje foszforilációját vizsgáltuk. COS7 sejteket transzfektáltunk V5 címkével jelzett Caskin1-el, majd másnap a sejteket protein-kináz C aktivátor tetradekanoil forbol acetáttal (TPA) és protein-kináz A aktiváló dibutiril ciklikus AMP-vel (dbcAMP) 10 percig kezeltük. Feltárás után a sejtkivonatban lévő fehérjéket SDS gélen választottuk szét, majd nitrocellulóz membránra blottoltuk. A foszforilációt az említett foszforilációs helyek (1065. tirozin és 1067. szerin) ellen tervezett ellenanyagokkal detektáltuk (a foszforilált 1065. tirozin elleni ellenanyag:
α-pT1065., a foszforilált 1067. szerin ellen tervezett ellenanyag: α-pS1067.). A kísérlet értékeléseként elmondható, hogy mind a TPA, mind a dbcAMP hatására foszforilálódik a Caskin1 1065. tirozinja, míg a 1067. szerin TPA hatására foszforilálódik.
77
Az in vivo foszforilációt ezek után in vitro kinázaktivitás méréssel is próbáltuk bizonyítani (5.20., 5.21. ábra). A kísérletben V5 címke elleni monoklonális antitesttel immunprecipitáltam a fehérjét Caskin1-et expresszáló COS7 sejtek kivonatából, majd különböző PKC izoenzimek, PKCα, illetve PKCε hozzáadásával foszforiláltam a gyantához kötött fehérjét. Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézist követő Western blot eljárás során a foszforilációt a foszforilált 1065. treonin ellen tervezett ellenanyaggal detektáltuk. Eredményeink szerint mindkét kináz képes foszforilálni a fehérjét. Érdekes, hogy általunk adott kinázt nem, csak ATP-t tartalmazó mintában is észleltünk foszforilációt. Ennek magyarázata feltehetően az, hogy egy kináz sejten belül kapcsolódott a Caskin1-hez, ezáltal jelen volt az immunprecipitátumban is, majd ATP hozzáadásával foszforilálta a fehérjét.
5.20. ábra: A Caskin1 in vitro PKC-függő foszforilációja. A kísérletben V5 címke elleni ellenanyaggal immunprecipitáltam a fehérjét Caskin1-et expresszáló COS7 sejtek kivonatából, majd az enzimek hozzáadásával foszforiláltam azt. A fehérje foszforilációját SDS-poliakrilamid gélelektroforézis után az 1065. foszforilált treonin ellen tervezett ellenanyaggal mutattam ki. Az ábrán látható, hogy mindkét kináz képes foszforilálni a Caskin1-et. Érdekes, hogy a kinázt nem, csak ATP-t tartalmazó kontrollban is megfigyelhető foszforiláció. Ennek magyarázata feltehetően az lehet, hogy a Caskin1-hez sejten belül kötődhet egy kináz, amely így az immunprecipitátumban is jelen van és ATP hozzáadásával képes foszforilálni a fehérjét.
78
In vitro kinázaktivitás méréssel a fehérje PKA-függő foszforilációját is vizsgáltuk. A kísérletben monoklonális antitesttel immunprecipitáltam a Caskin1-et patkány agykivonatból, majd PKA hozzáadásával foszforiláltam a gyantához kötött fehérjét. Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézist követő Western blot eljárás során a foszforilációt a foszforilált 1065. treonin ellen tervezett ellenanyaggal detektáltam. Megfigyelhető, hogy a Caskin1 mindhárom mintában foszforilálódik, a foszforilációja fokozódik ATP, de leginkább ATP és PKA hozzáadására. A kontroll pontban detektálható alacsony szintű foszforiláció magyarázata feltehetően az, hogy a Caskin1 már a patkányagyban foszforilálódik. Erre utal Peng és munkatársai eredménye (Peng és mtsai 2004), akik a PSD-ban foszforilált formában azonosították a fehérjét. Az ATP hozzáadására észlelhető foszforilációs szint fokozódás oka a PKC esetén leírtak lehetnek, miszerint a Caskin1-hez feltehetőleg sejten belül kapcsolódik egy kináz, amely így az immunprecipitátumban is jelen van, és ATP adásával fokozza az alap foszforilációt. A PKA hatására pedig jelentős foszforilációt tapasztaltunk.
79
5.21. ábra. A Caskin1 in vitro PKA-függő foszforilációja. A kísérletben Caskin1 ellenanyaggal immunprecipitáltam a fehérjét patkányagy kivonatából, majd ATP és PKA hozzáadásával foszforiláltam azt. A fehérje foszforilációját SDS-poliakrilamid gélelektroforézis után a 1065. foszforilált treonin ellen készített ellenanyaggal mutattam ki. Megfigyelhető, hogy a Caskin1 foszforilálódik az agyban, ez a foszforiláció fokozható ATP hozzáadásával. Ennek magyarázata az lehet, hogy a Caskin1-hez in vivo egy kináz kapcsolódik, ami a hozzáadott ATP-vel képes foszforilálni a fehérjét. Látható, hogy PKA adására jelentősen fokozódik a foszforiláció.
80
6. Eredmények megbeszélése
Munkánk során megklónoztuk a teljes hosszúságú Caskin1 fehérjét és annak vizsgálatával foglalkoztunk. Mivel Caskin1 ellenanyag a kereskedelmi forgalomban nem elérhető
és
a
fehérje
vizsgálata
megfelelő
ellenanyag
nélkül
nehézkes,
ezért
laboratóriumunkban készítettünk két poliklonális antitestet. Az általunk előállított ellenanyagok immunprecipitálják a Caskin1-et, illetve Western blot analízisre is alkalmasak, ám immunfestésre nem használhatók. Az AbDSerotec céggel együttműködve immunfestésre is alkalmas monoklonális ellenanyagot állítottunk elő. A Caskin1-et 2002-ben azonosították Tabuchi és munkatársai (Tabuchi és mtsai 2002). Cask-kötő fehérjeként írták le, egy hármas molekuláris komplex formálódásában vesz részt, a Velis fehérjével együtt kötődik a Caskhoz (Tabuchi és mtsai 2002). A fehérje főként az idegsejtek posztszinaptikus denzitásában fejeződik ki. Szerkezetét tekintve N-terminális fele jól definiálható, fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakítására képes doménekből áll, míg C-terminálisán hosszú prolinban-gazdag szakasz található, amelynek szerkezetét nem vizsgálták. A fehérje struktúrája alapján úgy véltük, hogy számos kötőpartner kapcsolódhat hozzá, és állványfehérjeként részt vehet a PSD hatalmas fehérjeállományának szervezésében. Bizonyításként élesztő két-hibrid rendszerben vizsgáltuk, melynek eredménye igazolta feltételezésünket. A lehetséges interakciós partnerek közül az Abi2-vel való kapcsolatát in vitro és in vivo módszerekkel is kimutattuk. GST precipitációs kísérletekkel bizonyítottuk, hogy az Abi2 SH3 doménjén keresztül kapcsolódik a Caskin1 prolinban-gazdag szakaszához. Az in vivo interakciót immunprecipitációs kísérletek elvégzésével igazoltuk. Pontosan felderítettük a Caskin1 C-terminális szakaszán belül azt a prolinban-gazdag szekvenciát, amely felelős az Abi2 fehérje kötéséért. Az azonosított szekvencia kiválóan alkalmas SH3 domének kötésére, mert a kötő poliprolin régióhoz képest N-, és C-terminális irányban is bázikus aminosavak találhatók, amely azt jelzi, hogy mindkét irányban kötődhet hozzá az Abi2 fehérje SH3 doménje. Az Abi (Abl interactor) fehérjéket az Abl tirozin kinázok szubsztrátjaiként írták le. Feltehetően a számos növekedési faktor által kiváltott Rac-függő aktin citoszkeleton átrendeződésében lehet szerepük (Shi és mtsai 1995), (Dai és mtsai 1995), (Scita és mtsai 1999), (Stradal és mtsai 2001). Mindkét fehérje, az Abi1 és az Abi2 is kifejeződik a fejlődő
81
idegrendszerben (Courtney és mtsai 2000), bár az Abi2 expressziója jelentősebb az érett, posztmigratórikus idegsejtekben (Courtney és mtsai 2000). A Caskin1 szintén a neuronokban fejeződik ki (Tabuchi és mtsai 2002), főként a posztszinaptikus denzitásban. Érdekes tény, hogy mind a Caskin1, mind pedig az Abi2 esetén fokozott fehérje expresszió figyelhető meg a kisagy területén (Tabuchi és mtsai 2002), (Courtney és mtsai 2000). Az Abi2 és a Caskin1 kapcsolatának szerepét jósolhatjuk a két fehérje lokalizációja és az Abi2 ismert funkciója alapján. A dendritikus tüskék az idegsejtek rövid nyúlványain helyezkednek el, és a serkentő szinapszisok posztszinaptikus részét képezik (Tada és mtsai 2007). Ismert, hogy morfológiai plaszticitásuk alapját részben az aktin citoszkeleton dinamikus átrendeződése biztosítja (Tada és mtsai 2006). Az Abi2 fehérjék bizonyítottan részt vesz az aktinváz átrendeződésének folyamatában, és a posztszinaptikus denzitásban is kifejeződik,
így
feltételezhetően
szerepe
lehet
a
dendritikus
tüskék
dinamikus
átformálódásában. 2004-ben Pendergast munkacsoportja elkészítette az Abi2 génkiütött egeret. Mind a heterozigóta, mind a homozigóta génkiütött egér esetén súlyosan károsodott a rövid- és hosszútávú memória, amely a dendritikus tüskék számának nagyarányú csökkenésével magyarázható (Grove és mtsai 2004). A Caskin1 is jórészt az idegsejtek posztszinaptikus denzitásában fejeződik ki, és a Caskon keresztül sejtfelszíni molekulákhoz, neurexinekhez és szindekánokhoz kapcsolódik. Feltételezésünk szerint az Abi2/Caskin1 kapcsolatnak szerepe lehet a sejtfelszíni molekulákon keresztül kiváltott aktin citoszkeleton átrendeződésben, így a dendritikus tüskék dinamikájának szabályozásában. Az állványfehérjékről szerzett ismereteink jórészt a meghatározott szerkezettel rendelkező domének vizsgálatából származik. Azonban, ha meggondoljuk, egy viszonylag rigid, globuláris szerkezettel rendelkező protein kevéssé alkalmas arra, hogy egyszerre több fehérjét kössön meg. Feltételezhetjük ezért, hogy az állványfehérjék tartalmaznak flexibilis, rendezetlen szakaszokat is. Ezek a rendezetlen régiók összeköthetik a jól ismert doméneket, esetleg kötőfelszínt jelenthetnek interakciós partnereknek. A Caskin1 C-terminális része nem tartalmaz ismert doméneket, de számos prolin található ebben a régióban, prolinban-gazdag szekvenciákba rendeződve. Ismert tény, hogy a prolin az ismétlődő másodlagos fehérjeszerkezeti elemekben ritkán fordul elő, ellenben a rendezetlen fehérjékben gyakori (Tompa 2006).
Ezek alapján feltételeztük, hogy a fehérje C-terminálisa rendezetlen
szerkezetű. Az IUPred algoritmus predikciója alapján valóban nem rendelkezik ez a szakasz másodlagos és harmadlagos szerkezettel. Állításunk meggyőző bizonyításához kísérleti adatokra is szükség volt. Ehhez a Caskin1 teljes hosszúságú prolinban-gazdag régióját Cterminálisán His címkével jelölve megklónoztuk és baktériumokban kifejeztettük (PRD-His). 82
A fehérjeszakasz jelentős mértékű degradációja miatt, amely egyébként jellemző tulajdonsága a rendezetlen fehérjéknek, az expressziója gyenge volt. Ezért cirkuláris dikroizmus spektroszkópiával,
gélszűréses
technikával
és
limitált
proteolízissel
vizsgáltuk
a
fehérjeszakaszt, mivel az említett vizsgálatok elvégzéséhez elegendő volt a preparálható fehérje mennyisége. A részletes analízishez a teljes hosszúságú prolinban-gazdag régiót három szakaszra bontva szintén C-terminálison His címkével jelölve klónoztuk és baktériumokban expresszáltuk (PRD1-His, PRD2-His, PRD3-His). E konstrukciókkal is elvégeztük az említett kísérleteket. Eredményeink szerint a Caskin1 prolinban-gazdag régiója rendezetlen, csupán a PRD2 esetén figyeltünk meg némi rendezettséget. Általában a helyi rendezettséget mutató régiók vesznek részt a fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakításában (Fuxreiter és mtsai 2004), (Vacic és mtsai 2007), feltételezhető, hogy a prolinban-gazdag régión belül ez a szakasz jelenti az elsődleges interakciós felszínt, ezt támaszja alá kísérleti eredményünk, miszereint pontosan ehhez a régióhoz kapcsolódik az Abi2. A rendezetlenség számos funkcionális előnyt jelent a fehérjéknek. Az egyik jelentős előnyt a kitekeredett szerkezetű fehérjék esetén a megnövekedett interakciós kapacitás jelenti. Ez megnyilvánul a nagy molekuláris komplexek középpontjában szereplő fehérjék nagyarányú rendezetlenségében (Dosztanyi és mtsai 2006),(Ekman és mtsai 2006) , (Haynes és mtsai 2006), (Patil és Nakamura 2006), illetve abban, hogy az említett komplexek nagyságának növekedésével nő az abban szereplő fehérjék rendezetlenségének aránya (Hegyi és mtsai 2007). A rendezetlenség az előnyök mellett veszélyt is jelenthet a sejtek számára, onkogén fúziós fehérjék és neurodegeneratív betegségeket okozó amiloid aggregátumok megjelenési valószínűségét is növeli. Ez lehet az oka annak, hogy a rendezetlen fehérjék szintje sejten belül szigorúan szabályozott (Gsponer és mtsai 2008). Előzetes adatok (Dyson és Wright 2002), (Bhattacharyya és mtsai 2006), (Mark és mtsai 2005), és saját eredményeink alapján, továbbá figyelembe véve, hogy a molekuláris felismerés szempontjából funkcionális előnyt jelenthet a rendezetlenség (Gunasekaran és mtsai 2003), (Dyson és Wright 2002), (Fuxreiter és mtsai 2007) felvetettük, hogy az állványfehérjékre vajon általában jellemző-e ez a tulajdonság. Bioinformatikai módszerekkel kimutattuk, hogy a „scaffold” fehérjék nagy arányban rendezetlenek, vagy tartalmaznak rendezetlen szerkezetű
szekvenciákat,
fehérjerészleteket
(átlagosan
53,6%).
Három
algoritmussal vizsgálva (IUPred, VSL2 és FoldIndex) az irodalomból válogatott állványfehérjék szerkezetét, úgy találtuk, hogy rendezetlenség mértéke az ismert, leginkább rendezetlen RNS „chaperonok” adataival hasonlítható össze (Tompa és Csermely 2004). Tovább vizsgálva a fehérjék szerkezetét, arra a megállapításra jutottunk, hogy leginkább a 83
doméneket
összekötő
régiók
nem
rendelkeznek
másodlagos
és
harmadlagos
fehérjeszerkezettel (átlagban 65,8%). Úgy véljük, hogy e szakaszok nem csupán összekötik az ismert funkciójú doméneket, hanem interakciós felszínt is jelentenek. Néhány kísérleti adat is alátámasztja elképzelésünket. A BRCA1 fehérjében például centrálisan 1500 aminosavnyi rendezetlen régió található az N-terminális RING doménje és a C-terminális BRCT doménje között (Mark és mtsi 2005). E régión keresztül kapcsolódik a DNS-hez, és ide kötődik számos, a DNS károsodásának javításában szerepet játszó fehérje (Wang és mtsai 1998), (Zhang és mtsai 1998). A Mypt1 állványfehérje N-terminális, rendezetlen szakaszához kötődik a protein-foszfatáz 1c (Toth és mtsai 2000). A CREB-kötő fehérje nukleáris receptor interakciós doménje és a magi receptor koaktivátor kötő doménje szintén rendezetlen szerkezetű (Dyson és Wright 2005). A Ste5 fehérje esetén a Fus3 kötő szakasz rendezetlen (Bhattacharyya és mtsai 2006). A rendezetlen szakaszokon belüli interakciós helyek, a preformált szerkezeti elemek (Fuxreiter és mtsai 2004), lineáris motívumok (Fuxreiter és mtsai 2007), elsődleges kapcsolódási helyek (Csizmok és mtsai 2005), vagy molekuláris felismerő szekvenciák (Vacic és mtsai 2007) csupán néhány aminosavnyi nagyságúak, így több fehérjét is képesek egyidőben megkötni. Irodalmi
adatok
alapján
ismert,
hogy
a
rendezetlen
szakaszok
gyakran
poszttranszlációs módosítások célpontjai (Fuxreiter és mtsai 2007), (Iakoucheva és mtsai 2004). A módosítások többek közt a fehérje-fehérje kapcsolatok létrejöttét is befolyásolhatják (Bhattacharyya és mtsai 2006), ezáltal fontos kötő/szabályozó funkciót kölcsönözve az állványfehérjéknek. A Caskin1 esetleges poszttranszlációs módosítását, foszforilációját vizsgálva arra az eredményre jutottunk, hogy mind a PKA, mind a PKC képes foszforilálni a fehérjét. Ennek a foszforilációnak fontos szerepe lehet a fehérje lokalizásában, illetve egyéb fehérjékkel való interakciójának regulálásában, a fehérje féléletidejének szabályozásában, stb.
84
7. Következtetések A Caskin1 fehérje funkciója még jórészt ismeretlen, kísérleti eredményeink arra utalnak, hogy az állványfehérjék családjába tartozhat. Az állványfehérjék a jelátvitelben fontos
fehérjék,
fehérjekötő
doménjeiken
keresztül
egyszerre
több
partnerrel
is
kölcsönhatásba léphetnek. Katalitikus aktivitásuk nincs, szignálfehérjéket horgonyoznak ki, ezáltal biztosítják a jelátviteli útvonalak irányát és specificitását. A Caskin1 állványfehérje voltát több adat is alátámasztja: a, szerkezetében több fehérje-fehérje kapcsolat kialakítására képes domén, illetve prolinban-gazdag régió is megtalálható; b, nincs katalítikus aktivitása; c, élesztő két-hibrid rendszerben számos, jelátvitelben szerepet játszó interakciós partnerét azonosítottuk, köztük az Abi2-t; d, főképp az idegsejtek posztszinaptikus denzitásába lokalizálódik. A posztszinaptikus denzitás egy dinamikusan változó hatalmas fehérjekomplex, több száz fehérjét tartalmaz, köztük receptorokat, ioncsatornákat, sejt adhéziós molekulákat, sejtváz alkotó fehérjéket, G fehérjéket és azok modulátorait, jelátviteli proteineket, például kinázokat és foszfatázokat. Számos állványfehérje, például a MAGUK család tagjai, a Shank és Homer vesz részt a hatalmas fehérje halmaz organizálásában. Kísérleti eredményeink szerint a Caskin1 prolinban-gazdag régiójához kötődik az Abi2 fehérje in vitro és in vivo is. Ez jelentheti, hogy a Caskin1 tagja az Abl tirozin kinázok jelátviteli útvonalának, illetve fontos lehet az aktin citoszkeleton átrendeződésében, másrészt arra utal, hogy a prolinban-gazdag, rendezetlen régiónak szerepe van fehérje-fehérje kapcsolatok kialakításában. Hasonló jelenséget írtak le a BRCA-1 esetén, melynek hosszú, a fehérje közepén elhelyezkedő rendezetlen szerkezetű szakasza több kötőhelyet tartalmaz a DNS javításban szerepet játszó partnerei számára. Az Abi2 fehérje tagja az aktin citoszkleton dinamikus átrendeződését szabályozó egyik komplexnek. Ennek a folyamatnak fontos szerepe van az idegrendszerben, a dendritikus tüskék formálódásában és átalakulásában. A dendritikus tüskék képezik a serkentő szinapszisok posztszinaptikus részét. Plasztikus morfológiájuk alapja az aktin citoszkeleton dinamikus átrendeződése. A Caskin1 szintén a PSD-ben fejeződik ki, a CASK fehérjén keresztül neurexinekhez és szindekánokhoz kapcsolódik. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a Caskin1/Abi2 interakciónak a dendritikus tüskék formálódásában és átalakulásában lehet szabályozó szerepe, sejtfelszíni molekuláktól továbbítja a jelet az aktin citoszkeleton felé.
85
A Caskin1 szerkezetében több ismert funkciójú fehérjekötő domén, és egy hosszú, eddig szerkezetileg nem jellemzett prolinban-gazdag szakasz található. Munkánk során a PRD struktúráját is vizsgáltuk. Eredményeink arra utalnak, hogy ebben a régióban nem lelhetők fel másodlagos és harmadlagos szerkezeti elemek. Az előzőekben már utaltam rá, hogy ez a rendezetlen szakasz funkcionális része a fehérjének. Ezt mutatja az is, hogy vizsgálataink alapján a középső, PRD2 szegmens mutat némi helyi rendezettséget, rövid szakaszra kiterjedően másodlagos szerkezeti elemek meglétét. Ismert, hogy a rendezetlen fehérjék szekvenciáján belül az ilyen, némi rendezettséget mutató szakaszok jelentik az elsődleges interakciós felszínt, úgy gondoljuk, hogy a Caskin1 esetén is a PRD2-höz kötődik a legtöbb partner. Ezt támasztja alá az is, hogy az Abi2 is ehhez a régióhoz kapcsolódik. Az állványfehérjékre általában jellemző, hogy a jól meghatározott szerkezetű és funkciójú interakciós doménekből és az azokat összekötő hosszabb-rövidebb kapcsoló régiókból állnak, amelyeknek a szerkezete nem jellemzett. Ha elgondoljuk, hogy egy rigid struktúrával rendlkező fehérje kevéssé alkalmas arra, hogy egyszerre több partnert is kössön, feltételezhetjük, hogy az állványfehérjék tartalmaznak flexibilis, rendezetlen szakaszokat. 74 állványfehérjét vizsgálva, bioinformatikai módszereket alkalmazva megállapítottuk, hogy a globuláris doméneket összekötő kapocs régiók nagy százalékban rendezetlenek. A rendezetlenség számos előnnyel jár. A kitekeredett rendezetlen szakaszok például megnövekedett interakciós lehetőséget biztosítanak a fehérjéknek, ezt mutatja, hogy a hub fehérjékre jellemző rendezetlenség, és a rendezetlenség mértéke nő a fehérjék által létrehozott kompexek növekedésével. A rendezetlenség az előnyök mellett veszélyt is hordozhat magában, ugyanis megjelenhetnek például onkogén fúziós fehérjék és a neurodegeneratív betegségek kialakulásához vezető amiloid aggregátumok is. A Caskin1 esetleges szabályozását vizsgálva arra az eredményre jutottunk, hogy a fehérje prolinban-gazdag régióját mind a PKA, mind pedig a PKC is képes foszforilálni. Ennek a foszforilációnak fontos szerepe lehet a fehérje lokalizásában, illetve partnereivel való kapcsolatának regulálásában. Jellemző, hogy a rendezetlen fehérjék elsődleges interakciós felszíne, amelyet némi másodlagos szerkezet megléte jelöl, gyakori célpontja a poszttranszlációs módosításoknak, lehetőséget biztosítva a fehérje-fehérje kölcsönhatások szabályozásának. Eredményeink is erre utalnak, az Abi2 kötéséért felelős régióban foszforilálódik a Caskin1
86
8. Összefoglalás A
Caskin1-et
2002-ben
azonosították,
mint
az
idegsejtek
posztszinaptikus
denzitásában (PSD) kifejeződő fehérjét. N-terminális fele jól definiálható funkciójú és szerkezetű, fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakítására képes doménekből áll, míg Cterminálisán hosszú prolinban-gazdag szakasz található, amelynek struktúrája eddig ismeretlen volt. A fehérje szerepe nem pontosan ismert, struktúrája alapján azonban úgy véltük, hogy számos kötőpartner kapcsolódhat hozzá, és állványfehérjeként részt vehet a PSD hatalmas fehérjeállományának szervezésében. Élesztő két-hibrid rendszerben vizsgálva sikerült jónéhány Caskin1-kötő fehérjét azonosítanunk. A lehetséges interakciós partnerek közül az Abi2-vel való kapcsolatát in vitro és in vivo módszerekkel is bizonyítottuk, laboratóriumunkban előállított poliklonális ellenanyagok felhasználásával. Kimutattuk, hogy a Caskin1 prolinban-gazdag régiójához kötődik az Abi2 SH3 doménjén keresztül. Az Abi2 fehérje az Abl tirozin kinázok és a Rac jelpályarendszereinek tagja. Szerepe lehet az Abl tirozin kinázok transzformációjának gátlásában és az aktin citoszkeleton átrendeződésében. Idegrendszerben betöltött fontos funkciójára utal, hogy az Abi2 génkiütött egérben súlyos defektusok jelentkeznek. Zavart szenved a másodlagos szemlencserostok migrációja és orientációja, abnormális sejtmigráció tapasztalható a neokortexben és a hippokampuszban. A vad típusú egérhez képest jelentősen csökkent a dendritikus tüskék száma, amely az állatok rövid-, és hosszútávú memóriájának sérülésében is megnyilvánult. Az Abi2 fehérjének idegrendszer specifikus kötőpartnere nem ismert, ezért is nagy jelentőségű, hogy munkacsoportunk elsőként kimutatta Caskin1-el való kapcsolatát. Tompa Péter munkacsoportjával együttműködve kimutattuk, hogy a Caskin1 Cterminális prolinban-gazdag szakasza rendezetlen szerkezetű. Ez azt jelenti, hogy nem rendelkezik másodlagos és harmadlagos fehérjeszerkezettel. Kutatásainkat kiterjesztve bioinformatikai módszerekkel 74 állványfehérjét vizsgálva kimutattuk, hogy szerkezetükben nagyfokú rendezetlenség figyelhető meg, a globuláris, határozott szerkezetű interakciós doméneket hosszabb-rövidebb flexibilis, rendezetlen régiók kötik össze. A Caskin1 esetleges szabályozását vizsgálva arra az eredményre jutottunk, hogy a fehérje prolinban-gazdag régióját mind a PKA, mind pedig a PKC is képes foszforilálni. Ennek a foszforilációnak fontos szerepe lehet a fehérje lokalizásában, illetve kötőpartnereivel való kapcsolatának regulálásában.
87
9. Summary Caskin1 was cloned in 2002, as a Cask binding protein and it is expressed in the postsynaptic density (PSD) of the neurons. There are some well-defined protein-protein interaction domains in the N-terminal part of the protein and the C-terminal contains a large proline-rich region which is uncharacterised. The function of Caskin1 is not well defined, but its structure suggests that it is a scaffold protein, it may form several interactions and may have a role in the organization of the large number of proteins in the PSD. To test our hypothesis, we took advantage of the yeast two hybrid screening and obtained several interacting partners. Out of them, we verified the connection between Caskin1 and Abi2 using in vitro and in vivo methods and antibodies developed in our laboratory. We showed that Abi2 binds to the proline-rich region of Caskin1 with its SH3 domain. Abi2 participates in the signalling pathway of Abl tyrosine kinase and Rac. It may have an inhibitory effect on the transforming activity of Abl kinases and in the dynamic rearrangement of the actin cytoskeleton. Abi2 knock-out mice was shown to have serious problems in the nervous system, showing its important role. In the absence of Abi2, secondary lens fiber orientation and migration were defective in the eye. Loss of Abi2 also resulted in cell migration defects in the neocortex and hippocampus, abnormal dendritic spine morphology and density, and severe defects in both short-term and long-term memory. Neuron specific binding partner of Abi2 has not been identified so far, that is why our results are so important, showing the interaction between Abi2 and Caskin1. In collaboration with the laboratory of Peter Tompa, we showed that the C-terminal proline-rich region of Caskin1 is unstructured. It means that this part of the protein does not have secondary and tertiary structure. Some secondary ordering can be seen at the contact site of Abi2. Using bioinformatical prediction programs, we examined 74 scaffold protein and showed that their structure considerably disordered. We suppose that the well defined interaction domains are linked by shorter or longer unstructured regions. Finally we found, that protein-kinase A and protein-kinase C can phosphorylate the proline-rich region of Caskin1. This phosphorylation may regulate the function, localization, and/or the half life of the protein.
88
10. Irodalomjegyzék Andrade, M. A., C. Perez-Iratxeta and C. P. Ponting (2001). "Protein repeats: structures, functions, and evolution." J Struct Biol 134(2-3): 117-31. Aviv, T., Z. Lin, S. Lau, L. M. Rendl, F. Sicheri and C. A. Smibert (2003). "The RNAbinding SAM domain of Smaug defines a new family of post-transcriptional regulators." Nat Struct Biol 10(8): 614-21. Ball, L. J., T. Jarchau, H. Oschkinat and U. Walter (2002). "EVH1 domains: structure, function and interactions." FEBS Lett 513(1): 45-52. Baron, M. K., T. M. Boeckers, B. Vaida, S. Faham, M. Gingery, M. R. Sawaya, D. Salyer, E. D. Gundelfinger and J. U. Bowie (2006). "An architectural framework that may lie at the core of the postsynaptic density." Science 311(5760): 531-5. Berry, D. M., P. Nash, S. K. Liu, T. Pawson and C. J. McGlade (2002). "A high-affinity ArgX-X-Lys SH3 binding motif confers specificity for the interaction between Gads and SLP-76 in T cell signaling." Curr Biol 12(15): 1336-41. Bhattacharyya, R. P., A. Remenyi, B. J. Yeh and W. A. Lim (2006). "Domains, motifs, and scaffolds: the role of modular interactions in the evolution and wiring of cell signaling circuits." Annu Rev Biochem 75: 655-80. Biederer, T. and T. C. Sudhof (2001). "CASK and protein 4.1 support F-actin nucleation on neurexins." J Biol Chem 276(51): 47869-76. Blagg, S. L., M. Stewart, C. Sambles and R. H. Insall (2003). "PIR121 regulates pseudopod dynamics and SCAR activity in Dictyostelium." Curr Biol 13(17): 1480-7. Boeckers, T. M., J. Bockmann, M. R. Kreutz and E. D. Gundelfinger (2002). "ProSAP/Shank proteins - a family of higher order organizing molecules of the postsynaptic density with an emerging role in human neurological disease." J Neurochem 81(5): 903-10. Bracken, C., L. M. Iakoucheva, P. R. Romero and A. K. Dunker (2004). "Combining prediction, computation and experiment for the characterization of protein disorder." Curr Opin Struct Biol 14(5): 570-6. Bradshaw, J. M., V. Mitaxov and G. Waksman (1999). "Investigation of phosphotyrosine recognition by the SH2 domain of the Src kinase." J Mol Biol 293(4): 971-85. Bradshaw, J. M., V. Mitaxov and G. Waksman (2000). "Mutational investigation of the specificity determining region of the Src SH2 domain." J Mol Biol 299(2): 521-35. Breeden, L. and K. Nasmyth (1987). "Similarity between cell-cycle genes of budding yeast and fission yeast and the Notch gene of Drosophila." Nature 329(6140): 651-4. Brown, M. T. and J. A. Cooper (1996). "Regulation, substrates and functions of src." Biochim Biophys Acta 1287(2-3): 121-49. Cao, T. T., H. W. Deacon, D. Reczek, A. Bretscher and M. von Zastrow (1999). "A kinaseregulated PDZ-domain interaction controls endocytic sorting of the beta2-adrenergic receptor." Nature 401(6750): 286-90. Carlisle, H. J. and M. B. Kennedy (2005). "Spine architecture and synaptic plasticity." Trends Neurosci 28(4): 182-7. Chen, H. J., M. Rojas-Soto, A. Oguni and M. B. Kennedy (1998). "A synaptic Ras-GTPase activating protein (p135 SynGAP) inhibited by CaM kinase II." Neuron 20(5): 895904. Chen, L., D. M. Chetkovich, R. S. Petralia, N. T. Sweeney, Y. Kawasaki, R. J. Wenthold, D. S. Bredt and R. A. Nicoll (2000). "Stargazin regulates synaptic targeting of AMPA receptors by two distinct mechanisms." Nature 408(6815): 936-43. 89
Chen, X., L. Vinade, R. D. Leapman, J. D. Petersen, T. Nakagawa, T. M. Phillips, M. Sheng and T. S. Reese (2005). "Mass of the postsynaptic density and enumeration of three key molecules." Proc Natl Acad Sci U S A 102(32): 11551-6. Cheng, H. H., S. H. Liu, H. C. Lee, Y. S. Lin, Z. H. Huang, C. I. Hsu, Y. C. Chen and Y. C. Chang (2006). "Heavy chain of cytoplasmic dynein is a major component of the postsynaptic density fraction." J Neurosci Res 84(2): 244-54. Cho, K. O., C. A. Hunt and M. B. Kennedy (1992). "The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein." Neuron 9(5): 929-42. Cohen, A. R., D. F. Woods, S. M. Marfatia, Z. Walther, A. H. Chishti and J. M. Anderson (1998). "Human CASK/LIN-2 binds syndecan-2 and protein 4.1 and localizes to the basolateral membrane of epithelial cells." J Cell Biol 142(1): 129-38. Collins, M. O., H. Husi, L. Yu, J. M. Brandon, C. N. Anderson, W. P. Blackstock, J. S. Choudhary and S. G. Grant (2006). "Molecular characterization and comparison of the components and multiprotein complexes in the postsynaptic proteome." J Neurochem 97 Suppl 1: 16-23. Courtney, K. D., M. Grove, H. Vandongen, A. Vandongen, A. S. LaMantia and A. M. Pendergast (2000). "Localization and phosphorylation of Abl-interactor proteins, Abi1 and Abi-2, in the developing nervous system." Mol Cell Neurosci 16(3): 244-57. Csizmok, V., M. Bokor, P. Banki, E. Klement, K. F. Medzihradszky, P. Friedrich, K. Tompa and P. Tompa (2005). "Primary contact sites in intrinsically unstructured proteins: the case of calpastatin and microtubule-associated protein 2." Biochemistry 44(10): 395564. Csizmok, V., E. Szollosi, P. Friedrich and P. Tompa (2006). "A novel two-dimensional electrophoresis technique for the identification of intrinsically unstructured proteins." Mol Cell Proteomics 5(2): 265-73. Dai, Z. and A. M. Pendergast (1995). "Abi-2, a novel SH3-containing protein interacts with the c-Abl tyrosine kinase and modulates c-Abl transforming activity." Genes Dev 9(21): 2569-82. Daughdrill, G. W., M. S. Chadsey, J. E. Karlinsey, K. T. Hughes and F. W. Dahlquist (1997). "The C-terminal half of the anti-sigma factor, FlgM, becomes structured when bound to its target, sigma 28." Nat Struct Biol 4(4): 285-91. De Robertis, E. D. and H. S. Bennett (1955). "Some features of the submicroscopic morphology of synapses in frog and earthworm." J Biophys Biochem Cytol 1(1): 4758. Dedmon, M. M., C. N. Patel, G. B. Young and G. J. Pielak (2002). "FlgM gains structure in living cells." Proc Natl Acad Sci U S A 99(20): 12681-4. Dosztanyi, Z., J. Chen, A. K. Dunker, I. Simon and P. Tompa (2006). "Disorder and sequence repeats in hub proteins and their implications for network evolution." J Proteome Res 5(11): 2985-95. Dosztanyi, Z., V. Csizmok, P. Tompa and I. Simon (2005). "IUPred: web server for the prediction of intrinsically unstructured regions of proteins based on estimated energy content." Bioinformatics 21(16): 3433-4. Doyle, D. A., A. Lee, J. Lewis, E. Kim, M. Sheng and R. MacKinnon (1996). "Crystal structures of a complexed and peptide-free membrane protein-binding domain: molecular basis of peptide recognition by PDZ." Cell 85(7): 1067-76. Dunker, A. K., C. J. Brown and Z. Obradovic (2002). "Identification and functions of usefully disordered proteins." Adv Protein Chem 62: 25-49. Dunker, A. K., E. Garner, S. Guilliot, P. Romero, K. Albrecht, J. Hart, Z. Obradovic, C. Kissinger and J. E. Villafranca (1998). "Protein disorder and the evolution of
90
molecular recognition: theory, predictions and observations." Pac Symp Biocomput: 473-84. Dunker, A. K., J. D. Lawson, C. J. Brown, R. M. Williams, P. Romero, J. S. Oh, C. J. Oldfield, A. M. Campen, C. M. Ratliff, K. W. Hipps, J. Ausio, M. S. Nissen, R. Reeves, C. Kang, C. R. Kissinger, R. W. Bailey, M. D. Griswold, W. Chiu, E. C. Garner and Z. Obradovic (2001). "Intrinsically disordered protein." J Mol Graph Model 19(1): 26-59. Dyson, H. J. and P. E. Wright (2002). "Coupling of folding and binding for unstructured proteins." Curr Opin Struct Biol 12(1): 54-60. Echarri, A., M. J. Lai, M. R. Robinson and A. M. Pendergast (2004). "Abl interactor 1 (Abi-1) wave-binding and SNARE domains regulate its nucleocytoplasmic shuttling, lamellipodium localization, and wave-1 levels." Mol Cell Biol 24(11): 4979-93. Eden, S., R. Rohatgi, A. V. Podtelejnikov, M. Mann and M. W. Kirschner (2002). "Mechanism of regulation of WAVE1-induced actin nucleation by Rac1 and Nck." Nature 418(6899): 790-3. Ekman, D., S. Light, A. K. Bjorklund and A. Elofsson (2006). "What properties characterize the hub proteins of the protein-protein interaction network of Saccharomyces cerevisiae?" Genome Biol 7(6): R45. el-Husseini Ael, D. and D. S. Bredt (2002). "Protein palmitoylation: a regulator of neuronal development and function." Nat Rev Neurosci 3(10): 791-802. Fischer, M., S. Kaech, D. Knutti and A. Matus (1998). "Rapid actin-based plasticity in dendritic spines." Neuron 20(5): 847-54. Flaugh, S. L. and K. J. Lumb (2001). "Effects of macromolecular crowding on the intrinsically disordered proteins c-Fos and p27(Kip1)." Biomacromolecules 2(2): 53840. Forrer, P., M. T. Stumpp, H. K. Binz and A. Pluckthun (2003). "A novel strategy to design binding molecules harnessing the modular nature of repeat proteins." FEBS Lett 539(1-3): 2-6. Freund, C., V. Dotsch, K. Nishizawa, E. L. Reinherz and G. Wagner (1999). "The GYF domain is a novel structural fold that is involved in lymphoid signaling through proline-rich sequences." Nat Struct Biol 6(7): 656-60. Fukazawa, Y., Y. Saitoh, F. Ozawa, Y. Ohta, K. Mizuno and K. Inokuchi (2003). "Hippocampal LTP is accompanied by enhanced F-actin content within the dendritic spine that is essential for late LTP maintenance in vivo." Neuron 38(3): 447-60. Fuxreiter, M., I. Simon, P. Friedrich and P. Tompa (2004). "Preformed structural elements feature in partner recognition by intrinsically unstructured proteins." J Mol Biol 338(5): 1015-26. Fuxreiter, M., P. Tompa and I. Simon (2007). "Local structural disorder imparts plasticity on linear motifs." Bioinformatics 23(8): 950-6. Garner, C. C., J. Nash and R. L. Huganir (2000). "PDZ domains in synapse assembly and signalling." Trends Cell Biol 10(7): 274-80. Goldman, P. S., A. J. DeMaggio, M. F. Hoekstra and R. H. Goodman (1997). "The betaadrenergic receptor kinase interacts with the amino terminus of the G protein beta subunit." Biochem Biophys Res Commun 240(2): 425-9. Gray, E. G. (1959). "Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study." J Anat 93: 420-33. Gray, N. W., L. Fourgeaud, B. Huang, J. Chen, H. Cao, B. J. Oswald, A. Hemar and M. A. McNiven (2003). "Dynamin 3 is a component of the postsynapse, where it interacts with mGluR5 and Homer." Curr Biol 13(6): 510-5.
91
Green, J. B., C. D. Gardner, R. P. Wharton and A. K. Aggarwal (2003). "RNA recognition via the SAM domain of Smaug." Mol Cell 11(6): 1537-48. Grove, M., G. Demyanenko, A. Echarri, P. A. Zipfel, M. E. Quiroz, R. M. Rodriguiz, M. Playford, S. A. Martensen, M. R. Robinson, W. C. Wetsel, P. F. Maness and A. M. Pendergast (2004). "ABI2-deficient mice exhibit defective cell migration, aberrant dendritic spine morphogenesis, and deficits in learning and memory." Mol Cell Biol 24(24): 10905-22. Gsponer, J., M. E. Futschik, S. A. Teichmann and M. M. Babu (2008). "Tight regulation of unstructured proteins: from transcript synthesis to protein degradation." Science 322(5906): 1365-8. Gunasekaran, K., C. J. Tsai, S. Kumar, D. Zanuy and R. Nussinov (2003). "Extended disordered proteins: targeting function with less scaffold." Trends Biochem Sci 28(2): 81-5. Gundelfinger, E. D., T. M. Boeckers, M. K. Baron and J. U. Bowie (2006). "A role for zinc in postsynaptic density asSAMbly and plasticity?" Trends Biochem Sci 31(7): 366-73. Harris, B. Z., B. J. Hillier and W. A. Lim (2001). "Energetic determinants of internal motif recognition by PDZ domains." Biochemistry 40(20): 5921-30. Hata, Y., S. Butz and T. C. Sudhof (1996). "CASK: a novel dlg/PSD95 homolog with an Nterminal calmodulin-dependent protein kinase domain identified by interaction with neurexins." J Neurosci 16(8): 2488-94. Haynes, C., C. J. Oldfield, F. Ji, N. Klitgord, M. E. Cusick, P. Radivojac, V. N. Uversky, M. Vidal and L. M. Iakoucheva (2006). "Intrinsic disorder is a common feature of hub proteins from four eukaryotic interactomes." PLoS Comput Biol 2(8): e100. Hegyi, H., E. Schad and P. Tompa (2007). "Structural disorder promotes assembly of protein complexes." BMC Struct Biol 7: 65. Hering, H. and M. Sheng (2001). "Dendritic spines: structure, dynamics and regulation." Nat Rev Neurosci 2(12): 880-8. Heringa, J. (1998). "Detection of internal repeats: how common are they?" Curr Opin Struct Biol 8(3): 338-45. Hirao, K., Y. Hata, N. Ide, M. Takeuchi, M. Irie, I. Yao, M. Deguchi, A. Toyoda, T. C. Sudhof and Y. Takai (1998). "A novel multiple PDZ domain-containing molecule interacting with N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal cell adhesion proteins." J Biol Chem 273(33): 21105-10. Hock, B., B. Bohme, T. Karn, T. Yamamoto, K. Kaibuchi, U. Holtrich, S. Holland, T. Pawson, H. Rubsamen-Waigmann and K. Strebhardt (1998). "PDZ-domain-mediated interaction of the Eph-related receptor tyrosine kinase EphB3 and the ras-binding protein AF6 depends on the kinase activity of the receptor." Proc Natl Acad Sci U S A 95(17): 9779-84. Holt, C. and L. Sawyer (1988). "Primary and predicted secondary structures of the caseins in relation to their biological functions." Protein Eng 2(4): 251-9. Hou, P., L. Estrada, A. W. Kinley, J. T. Parsons, A. B. Vojtek and J. L. Gorski (2003). "Fgd1, the Cdc42 GEF responsible for Faciogenital Dysplasia, directly interacts with cortactin and mAbp1 to modulate cell shape." Hum Mol Genet 12(16): 1981-93. Hsueh, Y. P., F. C. Yang, V. Kharazia, S. Naisbitt, A. R. Cohen, R. J. Weinberg and M. Sheng (1998). "Direct interaction of CASK/LIN-2 and syndecan heparan sulfate proteoglycan and their overlapping distribution in neuronal synapses." J Cell Biol 142(1): 139-51. Huang, Y. Z., S. Won, D. W. Ali, Q. Wang, M. Tanowitz, Q. S. Du, K. A. Pelkey, D. J. Yang, W. C. Xiong, M. W. Salter and L. Mei (2000). "Regulation of neuregulin signaling by PSD-95 interacting with ErbB4 at CNS synapses." Neuron 26(2): 443-55.
92
Husi, H. and S. G. Grant (2001). "Isolation of 2000-kDa complexes of N-methyl-D-aspartate receptor and postsynaptic density 95 from mouse brain." J Neurochem 77(1): 281-91. Iakoucheva, L. M., P. Radivojac, C. J. Brown, T. R. O'Connor, J. G. Sikes, Z. Obradovic and A. K. Dunker (2004). "The importance of intrinsic disorder for protein phosphorylation." Nucleic Acids Res 32(3): 1037-49. Innocenti, M., P. Tenca, E. Frittoli, M. Faretta, A. Tocchetti, P. P. Di Fiore and G. Scita (2002). "Mechanisms through which Sos-1 coordinates the activation of Ras and Rac." J Cell Biol 156(1): 125-36. Inoue, A. and S. Okabe (2003). "The dynamic organization of postsynaptic proteins: translocating molecules regulate synaptic function." Curr Opin Neurobiol 13(3): 33240. Juang, J. L. and F. M. Hoffmann (1999). "Drosophila abelson interacting protein (dAbi) is a positive regulator of abelson tyrosine kinase activity." Oncogene 18(37): 5138-47. Kanner, S. B., A. B. Reynolds, R. R. Vines and J. T. Parsons (1990). "Monoclonal antibodies to individual tyrosine-phosphorylated protein substrates of oncogene-encoded tyrosine kinases." Proc Natl Acad Sci U S A 87(9): 3328-32. Kato, Y., K. Nagata, M. Takahashi, L. Lian, J. J. Herrero, M. Sudol and M. Tanokura (2004). "Common mechanism of ligand recognition by group II/III WW domains: redefining their functional classification." J Biol Chem 279(30): 31833-41. Katsube, T., M. Takahisa, R. Ueda, N. Hashimoto, M. Kobayashi and S. Togashi (1998). "Cortactin associates with the cell-cell junction protein ZO-1 in both Drosophila and mouse." J Biol Chem 273(45): 29672-7. Kawata, T., A. Shevchenko, M. Fukuzawa, K. A. Jermyn, N. F. Totty, N. V. Zhukovskaya, A. E. Sterling, M. Mann and J. G. Williams (1997). "SH2 signaling in a lower eukaryote: a STAT protein that regulates stalk cell differentiation in dictyostelium." Cell 89(6): 909-16. Kennedy, M. B. (1995). "Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains." Trends Biochem Sci 20(9): 350. Kharazia, V. N. and R. J. Weinberg (1997). "Tangential synaptic distribution of NMDA and AMPA receptors in rat neocortex." Neurosci Lett 238(1-2): 41-4. Kim, E., S. Naisbitt, Y. P. Hsueh, A. Rao, A. Rothschild, A. M. Craig and M. Sheng (1997). "GKAP, a novel synaptic protein that interacts with the guanylate kinase-like domain of the PSD-95/SAP90 family of channel clustering molecules." J Cell Biol 136(3): 669-78. Kim, E. and M. Sheng (2004). "PDZ domain proteins of synapses." Nat Rev Neurosci 5(10): 771-81. Kistner, U., B. M. Wenzel, R. W. Veh, C. Cases-Langhoff, A. M. Garner, U. Appeltauer, B. Voss, E. D. Gundelfinger and C. C. Garner (1993). "SAP90, a rat presynaptic protein related to the product of the Drosophila tumor suppressor gene dlg-A." J Biol Chem 268(7): 4580-3. Koch, C. A., D. Anderson, M. F. Moran, C. Ellis and T. Pawson (1991). "SH2 and SH3 domains: elements that control interactions of cytoplasmic signaling proteins." Science 252(5006): 668-74. Konno, T., N. Tanaka, M. Kataoka, E. Takano and M. Maki (1997). "A circular dichroism study of preferential hydration and alcohol effects on a denatured protein, pig calpastatin domain I." Biochim Biophys Acta 1342(1): 73-82. Kornau, H. C., L. T. Schenker, M. B. Kennedy and P. H. Seeburg (1995). "Domain interaction between NMDA receptor subunits and the postsynaptic density protein PSD-95." Science 269(5231): 1737-40.
93
Kreienkamp, H. J., H. Zitzer, E. D. Gundelfinger, D. Richter and T. M. Bockers (2000). "The calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin from human and rodent brains interacts with members of the ProSAP/SSTRIP/Shank family of multidomain proteins." J Biol Chem 275(42): 32387-90. Kriwacki, R. W., L. Hengst, L. Tennant, S. I. Reed and P. E. Wright (1996). "Structural studies of p21Waf1/Cip1/Sdi1 in the free and Cdk2-bound state: conformational disorder mediates binding diversity." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11504-9. Kuriu, T., A. Inoue, H. Bito, K. Sobue and S. Okabe (2006). "Differential control of postsynaptic density scaffolds via actin-dependent and -independent mechanisms." J Neurosci 26(29): 7693-706. Kuriyan, J. and D. Cowburn (1997). "Modular peptide recognition domains in eukaryotic signaling." Annu Rev Biophys Biomol Struct 26: 259-88. Langnaese, K., K. Richter, K. H. Smalla, M. Krauss, U. Thomas, G. Wolf and G. Laube (2007). "Splice-isoform specific immunolocalization of neuronal nitric oxide synthase in mouse and rat brain reveals that the PDZ-complex-building nNOSalpha beta-finger is largely exposed to antibodies." Dev Neurobiol 67(4): 422-37. Lewitzky, M., M. Harkiolaki, M. C. Domart, E. Y. Jones and S. M. Feller (2004). "Mona/Gads SH3C binding to hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1) combines an atypical SH3 binding motif, R/KXXK, with a classical PXXP motif embedded in a polyproline type II (PPII) helix." J Biol Chem 279(27): 28724-32. Lewitzky, M., C. Kardinal, N. H. Gehring, E. K. Schmidt, B. Konkol, M. Eulitz, W. Birchmeier, U. Schaeper and S. M. Feller (2001). "The C-terminal SH3 domain of the adapter protein Grb2 binds with high affinity to sequences in Gab1 and SLP-76 which lack the SH3-typical P-x-x-P core motif." Oncogene 20(9): 1052-62. Li, H., K. L. Fung, D. Y. Jin, S. S. Chung, Y. P. Ching, I. O. Ng, K. H. Sze, B. C. Ko and H. Sun (2007). "Solution structures, dynamics, and lipid-binding of the sterile alphamotif domain of the deleted in liver cancer 2." Proteins 67(4): 1154-66. Li, T., D. Saro and M. R. Spaller (2004). "Thermodynamic profiling of conformationally constrained cyclic ligands for the PDZ domain." Bioorg Med Chem Lett 14(6): 13858. Lim, S., S. Naisbitt, J. Yoon, J. I. Hwang, P. G. Suh, M. Sheng and E. Kim (1999). "Characterization of the Shank family of synaptic proteins. Multiple genes, alternative splicing, and differential expression in brain and development." J Biol Chem 274(41): 29510-8. Lim, S., C. Sala, J. Yoon, S. Park, S. Kuroda, M. Sheng and E. Kim (2001). "Sharpin, a novel postsynaptic density protein that directly interacts with the shank family of proteins." Mol Cell Neurosci 17(2): 385-97. Lim, W. A., F. M. Richards and R. O. Fox (1994). "Structural determinants of peptidebinding orientation and of sequence specificity in SH3 domains." Nature 372(6504): 375-9. Lin, J., J. Liu, Y. Wang, J. Zhu, K. Zhou, N. Smith and X. Zhan (2005). "Differential regulation of cortactin and N-WASP-mediated actin polymerization by missing in metastasis (MIM) protein." Oncogene 24(12): 2059-66. Linding, R., R. B. Russell, V. Neduva and T. J. Gibson (2003). "GlobPlot: Exploring protein sequences for globularity and disorder." Nucleic Acids Res 31(13): 3701-8. Liu, Q., D. Berry, P. Nash, T. Pawson, C. J. McGlade and S. S. Li (2003). "Structural basis for specific binding of the Gads SH3 domain to an RxxK motif-containing SLP-76 peptide: a novel mode of peptide recognition." Mol Cell 11(2): 471-81.
94
Lux, S. E., K. M. John and V. Bennett (1990). "Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cellcycle control proteins." Nature 344(6261): 36-42. Mark, W. Y., J. C. Liao, Y. Lu, A. Ayed, R. Laister, B. Szymczyna, A. Chakrabartty and C. H. Arrowsmith (2005). "Characterization of segments from the central region of BRCA1: an intrinsically disordered scaffold for multiple protein-protein and proteinDNA interactions?" J Mol Biol 345(2): 275-87. Martinez-Estrada, O. M., A. Villa, F. Breviario, F. Orsenigo, E. Dejana and G. Bazzoni (2001). "Association of junctional adhesion molecule with calcium/calmodulindependent serine protein kinase (CASK/LIN-2) in human epithelial caco-2 cells." J Biol Chem 276(12): 9291-6. Maximov, A., T. C. Sudhof and I. Bezprozvanny (1999). "Association of neuronal calcium channels with modular adaptor proteins." J Biol Chem 274(35): 24453-6. Mayer, B. J. and D. Baltimore (1994). "Mutagenic analysis of the roles of SH2 and SH3 domains in regulation of the Abl tyrosine kinase." Mol Cell Biol 14(5): 2883-94. Mayer, B. J. and R. Gupta (1998). "Functions of SH2 and SH3 domains." Curr Top Microbiol Immunol 228: 1-22. McNiven, M. A., L. Kim, E. W. Krueger, J. D. Orth, H. Cao and T. W. Wong (2000). "Regulated interactions between dynamin and the actin-binding protein cortactin modulate cell shape." J Cell Biol 151(1): 187-98. Meador, W. E., A. R. Means and F. A. Quiocho (1992). "Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex." Science 257(5074): 1251-5. Middleton, F. A., K. Carrierfenster, S. M. Mooney and S. L. Youngentob (2009). "Gestational ethanol exposure alters the behavioral response to ethanol odor and the expression of neurotransmission genes in the olfactory bulb of adolescent rats." Brain Res 1252: 105-16. Miglarese, M. R., J. Mannion-Henderson, H. Wu, J. T. Parsons and T. P. Bender (1994). "The protein tyrosine kinase substrate cortactin is differentially expressed in murine B lymphoid tumors." Oncogene 9(7): 1989-97. Morar, A. S., X. Wang and G. J. Pielak (2001). "Effects of crowding by mono-, di-, and tetrasaccharides on cytochrome c-cytochrome c peroxidase binding: comparing experiment to theory." Biochemistry 40(1): 281-5. Mosavi, L. K., S. Williams and Z. Y. Peng Zy (2002). "Equilibrium folding and stability of myotrophin: a model ankyrin repeat protein." J Mol Biol 320(2): 165-70. Musacchio, A., M. Wilmanns and M. Saraste (1994). "Structure and function of the SH3 domain." Prog Biophys Mol Biol 61(3): 283-97. Naisbitt, S., E. Kim, J. C. Tu, B. Xiao, C. Sala, J. Valtschanoff, R. J. Weinberg, P. F. Worley and M. Sheng (1999). "Shank, a novel family of postsynaptic density proteins that binds to the NMDA receptor/PSD-95/GKAP complex and cortactin." Neuron 23(3): 569-82. Ohoka, Y. and Y. Takai (1998). "Isolation and characterization of cortactin isoforms and a novel cortactin-binding protein, CBP90." Genes Cells 3(9): 603-12. Okabe, S. (2007). "Molecular anatomy of the postsynaptic density." Mol Cell Neurosci 34(4): 503-18. Pak, D. T., S. Yang, S. Rudolph-Correia, E. Kim and M. Sheng (2001). "Regulation of dendritic spine morphology by SPAR, a PSD-95-associated RapGAP." Neuron 31(2): 289-303. Palay, S. L. and G. E. Palade (1955). "The fine structure of neurons." J Biophys Biochem Cytol 1(1): 69-88.
95
Park, E., M. Na, J. Choi, S. Kim, J. R. Lee, J. Yoon, D. Park, M. Sheng and E. Kim (2003). "The Shank family of postsynaptic density proteins interacts with and promotes synaptic accumulation of the beta PIX guanine nucleotide exchange factor for Rac1 and Cdc42." J Biol Chem 278(21): 19220-9. Patil, A. and H. Nakamura (2006). "Disordered domains and high surface charge confer hubs with the ability to interact with multiple proteins in interaction networks." FEBS Lett 580(8): 2041-5. Pawson, T. (1995). "Protein-tyrosine kinases. Getting down to specifics." Nature 373(6514): 477-8. Pawson, T. and G. D. Gish (1992). "SH2 and SH3 domains: from structure to function." Cell 71(3): 359-62. Pawson, T. and J. Schlessingert (1993). "SH2 and SH3 domains." Curr Biol 3(7): 434-42. Pendergast, A. M., A. J. Muller, M. H. Havlik, Y. Maru and O. N. Witte (1991). "BCR sequences essential for transformation by the BCR-ABL oncogene bind to the ABL SH2 regulatory domain in a non-phosphotyrosine-dependent manner." Cell 66(1): 161-71. Peng, J., M. J. Kim, D. Cheng, D. M. Duong, S. P. Gygi and M. Sheng (2004). "Semiquantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry." J Biol Chem 279(20): 21003-11. Penzes, P., R. C. Johnson, V. Kambampati, R. E. Mains and B. A. Eipper (2001). "Distinct roles for the two Rho GDP/GTP exchange factor domains of kalirin in regulation of neurite growth and neuronal morphology." J Neurosci 21(21): 8426-34. Peters, A. and K. M. Harriman (1990). "Different kinds of axon terminals forming symmetric synapses with the cell bodies and initial axon segments of layer II/III pyramidal cells. I. Morphometric analysis." J Neurocytol 19(2): 154-74. Petersen, J. D., X. Chen, L. Vinade, A. Dosemeci, J. E. Lisman and T. S. Reese (2003). "Distribution of postsynaptic density (PSD)-95 and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II at the PSD." J Neurosci 23(35): 11270-8. Plaxco, K. W. and M. Gross (1997). "Cell biology. The importance of being unfolded." Nature 386(6626): 657, 659. Ponting, C. P. (1995). "SAM: a novel motif in yeast sterile and Drosophila polyhomeotic proteins." Protein Sci 4(9): 1928-30. Prehoda, K. E., D. J. Lee and W. A. Lim (1999). "Structure of the enabled/VASP homology 1 domain-peptide complex: a key component in the spatial control of actin assembly." Cell 97(4): 471-80. Ptitsyn, O. B. and V. N. Uversky (1994). "The molten globule is a third thermodynamical state of protein molecules." FEBS Lett 341(1): 15-8. Racca, C., F. A. Stephenson, P. Streit, J. D. Roberts and P. Somogyi (2000). "NMDA receptor content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area." J Neurosci 20(7): 2512-22. Rickles, R. J., M. C. Botfield, X. M. Zhou, P. A. Henry, J. S. Brugge and M. J. Zoller (1995). "Phage display selection of ligand residues important for Src homology 3 domain binding specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 92(24): 10909-13. Rogers, S., R. Wells and M. Rechsteiner (1986). "Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis." Science 234(4774): 364-8. Sadowski, I., J. C. Stone and T. Pawson (1986). "A noncatalytic domain conserved among cytoplasmic protein-tyrosine kinases modifies the kinase function and transforming activity of Fujinami sarcoma virus P130gag-fps." Mol Cell Biol 6(12): 4396-408.
96
Sala, C., K. Futai, K. Yamamoto, P. F. Worley, Y. Hayashi and M. Sheng (2003). "Inhibition of dendritic spine morphogenesis and synaptic transmission by activity-inducible protein Homer1a." J Neurosci 23(15): 6327-37. Sawyers, C. L., J. McLaughlin, A. Goga, M. Havlik and O. Witte (1994). "The nuclear tyrosine kinase c-Abl negatively regulates cell growth." Cell 77(1): 121-31. Scheiffele, P., J. Fan, J. Choih, R. Fetter and T. Serafini (2000). "Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons." Cell 101(6): 657-69. Schultz, J., C. P. Ponting, K. Hofmann and P. Bork (1997). "SAM as a protein interaction domain involved in developmental regulation." Protein Sci 6(1): 249-53. Schweers, O., E. Schonbrunn-Hanebeck, A. Marx and E. Mandelkow (1994). "Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for beta-structure." J Biol Chem 269(39): 24290-7. Scita, G., J. Nordstrom, R. Carbone, P. Tenca, G. Giardina, S. Gutkind, M. Bjarnegard, C. Betsholtz and P. P. Di Fiore (1999). "EPS8 and E3B1 transduce signals from Ras to Rac." Nature 401(6750): 290-3. Sedgwick, S. G. and S. J. Smerdon (1999). "The ankyrin repeat: a diversity of interactions on a common structural framework." Trends Biochem Sci 24(8): 311-6. Serra-Pages, C., N. L. Kedersha, L. Fazikas, Q. Medley, A. Debant and M. Streuli (1995). "The LAR transmembrane protein tyrosine phosphatase and a coiled-coil LARinteracting protein co-localize at focal adhesions." EMBO J 14(12): 2827-38. Setou, M., T. Nakagawa, D. H. Seog and N. Hirokawa (2000). "Kinesin superfamily motor protein KIF17 and mLin-10 in NMDA receptor-containing vesicle transport." Science 288(5472): 1796-802. Sheng, M. and E. Kim (2000). "The Shank family of scaffold proteins." J Cell Sci 113 ( Pt 11): 1851-6. Shi, Y., K. Alin and S. P. Goff (1995). "Abl-interactor-1, a novel SH3 protein binding to the carboxy-terminal portion of the Abl protein, suppresses v-abl transforming activity." Genes Dev 9(21): 2583-97. Soltau, M., D. Richter and H. J. Kreienkamp (2002). "The insulin receptor substrate IRSp53 links postsynaptic shank1 to the small G-protein cdc42." Mol Cell Neurosci 21(4): 575-83. Spacek, J. and K. M. Harris (1998). "Three-dimensional organization of cell adhesion junctions at synapses and dendritic spines in area CA1 of the rat hippocampus." J Comp Neurol 393(1): 58-68. Sparks, A. B., J. E. Rider, N. G. Hoffman, D. M. Fowlkes, L. A. Quillam and B. K. Kay (1996). "Distinct ligand preferences of Src homology 3 domains from Src, Yes, Abl, Cortactin, p53bp2, PLCgamma, Crk, and Grb2." Proc Natl Acad Sci U S A 93(4): 1540-4. Sparks, A. B., J. E. Rider and B. K. Kay (1998). "Mapping the specificity of SH3 domains with phage-displayed random-peptide libraries." Methods Mol Biol 84: 87-103. Srivastava, S., P. Osten, F. S. Vilim, L. Khatri, G. Inman, B. States, C. Daly, S. DeSouza, R. Abagyan, J. G. Valtschanoff, R. J. Weinberg and E. B. Ziff (1998). "Novel anchorage of GluR2/3 to the postsynaptic density by the AMPA receptor-binding protein ABP." Neuron 21(3): 581-91. Stapleton, D., I. Balan, T. Pawson and F. Sicheri (1999). "The crystal structure of an Eph receptor SAM domain reveals a mechanism for modular dimerization." Nat Struct Biol 6(1): 44-9. Stein, E., A. A. Lane, D. P. Cerretti, H. O. Schoecklmann, A. D. Schroff, R. L. Van Etten and T. O. Daniel (1998). "Eph receptors discriminate specific ligand oligomers to
97
determine alternative signaling complexes, attachment, and assembly responses." Genes Dev 12(5): 667-78. Stradal, T., K. D. Courtney, K. Rottner, P. Hahne, J. V. Small and A. M. Pendergast (2001). "The Abl interactor proteins localize to sites of actin polymerization at the tips of lamellipodia and filopodia." Curr Biol 11(11): 891-5. Sugiyama, Y., I. Kawabata, K. Sobue and S. Okabe (2005). "Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique." Nat Methods 2(9): 677-84. Tabuchi, K., T. Biederer, S. Butz and T. C. Sudhof (2002). "CASK participates in alternative tripartite complexes in which Mint 1 competes for binding with caskin 1, a novel CASK-binding protein." J Neurosci 22(11): 4264-73. Tada, T., A. Simonetta, M. Batterton, M. Kinoshita, D. Edbauer and M. Sheng (2007). "Role of Septin cytoskeleton in spine morphogenesis and dendrite development in neurons." Curr Biol 17(20): 1752-8. Tang, K. S., B. J. Guralnick, W. K. Wang, A. R. Fersht and L. S. Itzhaki (1999). "Stability and folding of the tumour suppressor protein p16." J Mol Biol 285(4): 1869-86. Tevelev, A., I. J. Byeon, T. Selby, K. Ericson, H. J. Kim, V. Kraynov and M. D. Tsai (1996). "Tumor suppressor p16INK4A: structural characterization of wild-type and mutant proteins by NMR and circular dichroism." Biochemistry 35(29): 9475-87. Thanos, C. D., S. Faham, K. E. Goodwill, D. Cascio, M. Phillips and J. U. Bowie (1999). "Monomeric structure of the human EphB2 sterile alpha motif domain." J Biol Chem 274(52): 37301-6. Tompa, P. (2002). "Intrinsically unstructured proteins." Trends Biochem Sci 27(10): 527-33. Tompa, P. and P. Csermely (2004). "The role of structural disorder in the function of RNA and protein chaperones." FASEB J 18(11): 1169-75. Tompa, P., Z. Dosztanyi and I. Simon (2006). "Prevalent structural disorder in E. coli and S. cerevisiae proteomes." J Proteome Res 5(8): 1996-2000. Toni, N., P. A. Buchs, I. Nikonenko, C. R. Bron and D. Muller (1999). "LTP promotes formation of multiple spine synapses between a single axon terminal and a dendrite." Nature 402(6760): 421-5. Toth, A., E. Kiss, P. Gergely, M. P. Walsh, D. J. Hartshorne and F. Erdodi (2000). "Phosphorylation of MYPT1 by protein kinase C attenuates interaction with PP1 catalytic subunit and the 20 kDa light chain of myosin." FEBS Lett 484(2): 113-7. Triezenberg, S. J. (1995). "Structure and function of transcriptional activation domains." Curr Opin Genet Dev 5(2): 190-6. Tu, J. C., B. Xiao, S. Naisbitt, J. P. Yuan, R. S. Petralia, P. Brakeman, A. Doan, V. K. Aakalu, A. A. Lanahan, M. Sheng and P. F. Worley (1999). "Coupling of mGluR/Homer and PSD-95 complexes by the Shank family of postsynaptic density proteins." Neuron 23(3): 583-92. Tu, J. C., B. Xiao, J. P. Yuan, A. A. Lanahan, K. Leoffert, M. Li, D. J. Linden and P. F. Worley (1998). "Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors." Neuron 21(4): 717-26. Uruno, T., P. Zhang, J. Liu, J. J. Hao and X. Zhan (2003). "Haematopoietic lineage cellspecific protein 1 (HS1) promotes actin-related protein (Arp) 2/3 complex-mediated actin polymerization." Biochem J 371(Pt 2): 485-93. Uversky, V. N., J. R. Gillespie and A. L. Fink (2000). "Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions?" Proteins 41(3): 415-27. Vacic, V., C. J. Oldfield, A. Mohan, P. Radivojac, M. S. Cortese, V. N. Uversky and A. K. Dunker (2007). "Characterization of molecular recognition features, MoRFs, and their binding partners." J Proteome Res 6(6): 2351-66.
98
Valtschanoff, J. G. and R. J. Weinberg (2001). "Laminar organization of the NMDA receptor complex within the postsynaptic density." J Neurosci 21(4): 1211-7. Varnai, P., T. Bondeva, P. Tamas, B. Toth, L. Buday, L. Hunyady and T. Balla (2005). "Selective cellular effects of overexpressed pleckstrin-homology domains that recognize PtdIns(3,4,5)P3 suggest their interaction with protein binding partners." J Cell Sci 118(Pt 20): 4879-88. Walikonis, R. S., A. Oguni, E. M. Khorosheva, C. J. Jeng, F. J. Asuncion and M. B. Kennedy (2001). "Densin-180 forms a ternary complex with the (alpha)-subunit of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and (alpha)-actinin." J Neurosci 21(2): 423-33. Walsh, M. J. and N. Kuruc (1992). "The postsynaptic density: constituent and associated proteins characterized by electrophoresis, immunoblotting, and peptide sequencing." J Neurochem 59(2): 667-78. Wang, Q., H. Zhang, K. Kajino and M. I. Greene (1998). "BRCA1 binds c-Myc and inhibits its transcriptional and transforming activity in cells." Oncogene 17(15): 1939-48. Ward, J. J., J. S. Sodhi, L. J. McGuffin, B. F. Buxton and D. T. Jones (2004). "Prediction and functional analysis of native disorder in proteins from the three kingdoms of life." J Mol Biol 337(3): 635-45. Welch, P. J. and J. Y. Wang (1995). "Disruption of retinoblastoma protein function by coexpression of its C pocket fragment." Genes Dev 9(1): 31-46. Williamson, M. P. (1994). "The structure and function of proline-rich regions in proteins." Biochem J 297 ( Pt 2): 249-60. Wright, P. E. and H. J. Dyson (1999). "Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm." J Mol Biol 293(2): 321-31. Wu, H. and J. T. Parsons (1993). "Cortactin, an 80/85-kilodalton pp60src substrate, is a filamentous actin-binding protein enriched in the cell cortex." J Cell Biol 120(6): 1417-26. Wu, H., A. B. Reynolds, S. B. Kanner, R. R. Vines and J. T. Parsons (1991). "Identification and characterization of a novel cytoskeleton-associated pp60src substrate." Mol Cell Biol 11(10): 5113-24. Xiao, B., J. C. Tu, R. S. Petralia, J. P. Yuan, A. Doan, C. D. Breder, A. Ruggiero, A. A. Lanahan, R. J. Wenthold and P. F. Worley (1998). "Homer regulates the association of group 1 metabotropic glutamate receptors with multivalent complexes of homerrelated, synaptic proteins." Neuron 21(4): 707-16. Yuan, C., J. Li, T. L. Selby, I. J. Byeon and M. D. Tsai (1999). "Tumor suppressor INK4: comparisons of conformational properties between p16(INK4A) and p18(INK4C)." J Mol Biol 294(1): 201-11. Yuste, R. and T. Bonhoeffer (2001). "Morphological changes in dendritic spines associated with long-term synaptic plasticity." Annu Rev Neurosci 24: 1071-89. Zeeb, M., H. Rosner, W. Zeslawski, D. Canet, T. A. Holak and J. Balbach (2002). "Protein folding and stability of human CDK inhibitor p19(INK4d)." J Mol Biol 315(3): 44757. Zhang, B. and Z. Peng (2000). "A minimum folding unit in the ankyrin repeat protein p16(INK4)." J Mol Biol 299(4): 1121-32. Zhang, H., G. Tombline and B. L. Weber (1998). "BRCA1, BRCA2, and DNA damage response: collision or collusion?" Cell 92(4): 433-6. Zimmermann, P., K. Meerschaert, G. Reekmans, I. Leenaerts, J. V. Small, J. Vandekerckhove, G. David and J. Gettemans (2002). "PIP(2)-PDZ domain binding controls the association of syntenin with the plasma membrane." Mol Cell 9(6): 121525.
99
Zuber, B., I. Nikonenko, P. Klauser, D. Muller and J. Dubochet (2005). "The mammalian central nervous synaptic cleft contains a high density of periodically organized complexes." Proc Natl Acad Sci U S A 102(52): 19192-7. Zweifel, M. E. and D. Barrick (2001). "Studies of the ankyrin repeats of the Drosophila melanogaster Notch receptor. 1. Solution conformational and hydrodynamic properties." Biochemistry 40(48): 14344-56. Zweifel, M. E. and D. Barrick (2001). "Studies of the ankyrin repeats of the Drosophila melanogaster Notch receptor. 2. Solution stability and cooperativity of unfolding." Biochemistry 40(48): 14357-67. Zweifel, M. E., D. J. Leahy, F. M. Hughson and D. Barrick (2003). "Structure and stability of the ankyrin domain of the Drosophila Notch receptor." Protein Sci 12(11): 2622-32.
100
11. Saját közlemények
A doktori értekezéshez közvetlenül kapcsolódó közlemények:
1, Balazs A, Csizmok V, Buday L, Rakacs M, Kiss R, Bokor M, Udupa R, Tompa K, Tompa P. High levels of structural disorder in scaffold protein as exemplified by a novel neuronal protein, Caskin1. FEBS J. In press
2, Illés A, Enyedi B, Tamás P, Balázs A, Bogel G, Melinda, Lukács, Buday L. Cortactin is required for integrin-mediated cell spreading. Immunol Lett. 2006 Apr 15;104(1-2):124-30. Epub 2005 Dec 7.
A doktori értekezéshez közvetlenül nem kapcsolódó közlemény:
1, Illés A, Enyedi B, Tamás P, Balázs A, Bogel G, Buday L. Inducible phosphorylation of cortactin is not necessary for cortactin-mediated actin polymerisation. Cell Signal. 2006 Jun;18(6):830-40. Epub 2005 Aug 16.
101
12. Köszönetnyilvánítás
Szeretném megköszönni mindazok segítségét, akik nélkül sem ezen értekezés nem jött volna létre, sem pedig a megírásáig elvezető út nem lett volna sikeres. Mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. Buday László professzornak, aki amellett, hogy maximálisan támogatott a dolgozat elkészítésében, bevezetett a tudományos módszerek, a tudományos gondolkodás világába. Köszönöm laborunk összes dolgozójának segítségét, külön is megemlítve Haidarné Solti Zitát, akinek munkája nagy segítséget jelentett számomra, Illés Andrást, Tamás Pétert, Roopesh Udupa-t és Bőgel Gábort, akikhez minden felmerült problémámmal bátran fordulhattam, segítettek, ha arra szükségem volt. Köszönettel tartozom Dr. Mandl József professzornak, intézetünk igazgatójának, a Pathobiokémia PhD program vezetőjének, aki lehetővé tette, hogy a doktori iskola hallgatója legyek, és az intézetben végezhessem munkámat. Köszönet illeti továbbá az intézet valamennyi dolgozóját segítségükért, külön kiemelve Kukor Zoltánt, aki a stiláris és helyesírási hibák javításában segített. Végül és elsősorban hálával tartozom családomnak, férjemnek és szüleimnek, hogy a biztos hátteret megteremtve lehetővé tették számomra, hogy eljussak e dolgozat megírásáig.
102
