9. BIOMOLEKULÁK, BIOREAKCIÓK 9.1. Élő kémiai rendszerek általános tulajdonságai Biomolekuláknak az élő rendszereketi felépítő molekulákat nevezzük. Az élő rendszerek önfenntartó kémiai rendszerek, amelyek állandóságát a bennük végbemenő kémiai átalakulások (bioreakciók) biztosítják. Ezt a dinamikus egyensúlyt (a folytonos kémiai változáson alapuló termodinamikai egyensúlyt) nevezzük homeosztázisnak. A kémiai rendszereket szabályozó termodinamika törvényei szerint a homeosztázist biztosító kémiai folyamatok nélkül egy kémiai rendszer az energiaminimum és az entrópiamaximum irányában változik, és megfelelő idő elteltével beáll a további változást már nem megengedő statikus termodinamikai egyensúly.ii A továbbiakban egy sejt szintjén vizsgáljuk a homeosztázist fenntartó kémiai feltételeket. A homeosztázis fenntartásához az önfenntartó kémiai rendszer folyamatos és szelektív anyagcserét folytat a környezetével, a környezetből felvett anyagokat (tápanyagok) megfelelő kémiai körfolyamatokkaliii (bioreakciókkal) folyamatosan átalakítja, a dinamikus egyensúly fenntartásához szükséges energiát o egyrészt a nagy energiájú tápanyagok kis energiájú végtermékekké történő átalakításával, o másrészt a napfény hasznosításával (fotoszintézis) biztosítja, a környezet változásaira megfelelően reagáló önszabályozó körfolyamatokkal rendelkezik. Azaz összefoglalva az élő kémiai rendszer (sejt) egy a környezetével folyamatos anyag- és energiacserét folytató, önfenntartó, önszabályozó, nagyrendezettségű (kis entrópiájú), dinamikus egyensúlyban lévő kémiai körfolyamat-rendszer.iv i
Az élő rendszerek és alkotórészeik nem teljes hierarchikus felsorolása: Bioszféra (a teljes földi élővilág), biom (élőlények egy adott területen élő közössége), élőlények, szervek, szövetek, sejtek, sejtszervek, szupramolekuláris rendszerek (molekulatársulások, asszociátumok, mint pl. hártyák, enzim-komplexek, stb.); biomolekulák. Az élő rendszerek legkisebb önállóan létképes formája a sejt. ii A statikus termodinamikai egyensúly esetén is végbemehetnek a kémiai rendszerben kémiai átalakulások, azonban ezek a rendszer szabadentalpiájában (G) már nem okoznak változást (ΔG=ΔH-TΔS=0). Egy egyszerű kémiai egyensúly esetén ez azt jelenti, hogy időegység alatt ugyanannyi anyagmennyiség alakul át az egyik, mint a másik irányban, azaz a rendszer kémiai összetétele már nem változik. Ha a rendszer elérte az entrópia (S) maximális értékét (a továbbiakban már az entrópia sem változik, ΔS=0), ez azt is jelenti, hogy a rendszer és környezete között már a hőmérséklet is kiegyenlítődött (a továbbiakban nincs már hőátadás sem, ΔH=0). Dinamikus termodinamikai egyensúlyban akkor van egy kémiai rendszer, ha a belső kémiai összetétele nem változik és a rendszer szabadentalpiája (G) állandó, ellenben az entrópiája (S) nem érte el a maximális értéket. Ezt a rendezett állapotot (az entrópia a rendezetlenség mértéke) csak úgy tudja a rendszer fenntartani, ha a környezetétől folyamatosan energiát vesz fel, és a környezetével folyamatosan anyagcserét végez. Az anyagcsere során a dinamikus egyensúlyban lévő kémiai rendszer a környezetből felvett nagy szabadentalpiával és kis entrópiával rendelkező tápanyagot kis szabadentalpiájú nagy entrópiájú végtermékké alakítja át, és azt kibocsátja a környezetébe. Azaz a dinamikus egyensúlyban lévő kémiai rendszerre a környezetével együtt érvényes a termodinamika második főtétele: csak olyan folyamat mehet végbe, amelyben az entrópia folyamatosan növekszik (a dinamikus egyensúlyban lévő kémiai rendszer entrópiája változatlan, miközben a környezete entrópiája folyamatosan nő). Az anyagcsere egy másik formája, amikor a dinamikus egyensúlyban lévő kémiai rendszer a környezetéből kis szabadentalpiájú és nagy entrópiájú anyagot vesz fel, és azt a környezetből felvett energia (pl. fotoszintézis esetén a napfény) segítségével alakítja át nagy szabadentalpiájú és kis entrópiájú termékké, aminek segítségével tovább csökkenti a rendszer saját entrópiáját, azaz növeli belső rendezettségét. Ez esetben a környezet entrópiája annál nagyobb mértékben nő, mint amennyivel a rendszer entrópiája csökken, azaz a dinamikus egyensúlyban lévő kémiai rendszerre a környezetével együtt (beleértve a napfény forrását, a napot is) most is érvényes a termodinamika második főtétele. Ha az élő kémiai rendszer befejezi működését, és megszűnnek a dinamikus egyensúlyt fenntartó anyagcsere-folyamatok és bioreakciók, a holt rendszer feltartóztathatatlanul halad a statikus termodinamikai egyensúly felé. iii Körfolyamatnak nevezzük azt a többlépéses kémiai reakciósorozatot, amikor a folyamat végére a rendszer visszatér a kiindulási állapotába. iv Az életnek még nincs mindenki által elfogadott definíciója, az itt közölt meghatározás csak az élő rendszert, mint kémiai rendszert jellemzi, és nem foglalkozik az ezen túlmutató tulajdonságokkal.
1
Az élő kémiai rendszert (sejtet) alkotó biomolekuláknak ehhez az alábbi funkciókat kell biztosítaniuk: szelektív anyagtranszportot biztosító határfelület; a körfolyamatok lépéseit megfelelő sebességgel „végrehajtó” biokatalizátorok (önszabályozás); a környezetben található tápanyagforrás változó mennyiségét kiegyensúlyozó tápanyagraktár. T
G E
A
B
R
S
C
D
F
1. ábra:
Az önfenntartó kémiai körfolyamat-rendszer egyszerűsített modellje. A, B, C, D, E, F: körfolyamatban résztvevő biomolekulák; S: tápanyag, T: végtermék, R: tápanyagraktár; kettős vonal: határfelület, kék négyzetek: szelektív anyagtranszport helyei; lila ellipszisek: biokatalizátorok (enzimek); pirossal a tápanyag – végtermék szabadentalpia-változást jelöltük
A fenti minimumfeltételek ellenben nem nyújtanak biztosítékot a környezeti feltételek drasztikusabb változása ellen. Ezért a bioszféra fennmaradása érdekében szükséges az alkalmazkodás lehetőségét biztosító reprodukció.v Így az előző három funkció mellé az alábbi negyediket is fel kell sorolnunk: a reprodukciót irányító információtár. A földi élővilág erre a négy funkcióra általánosan négy fő biomolekulatípust alkalmaz: lipidek, szénhidrátok, fehérjék, nukleinsavak. A négy biomolekulatípus egyes jellemző képviselőjét a 2. ábra ábrázolja, e vegyülettípusok fő biológiai funkcióit az 1. táblázat mutatja be. A lipidek kismolekulás vegyületek, amelyek egyrészt tápanyagraktárként kapnak szerepet (trigliceridek), másrészt önszerveződő képességük alapján biológiai membránokat hoznak létre, azaz határfelület-képző funkciójuk van (foszfolipidek). A membránokba más típusú lipidek (pl. a koleszterin) és szénhidrátok, illetve fehérjék is beépülhetnek. A szénhidrátok (mono-, oligo- és poliszacharidok) közül a poliszacharid amilóz és amilopektin (a növényi keményítő és az állati glikogén jellemző struktúrái) funkcionálnak tápanyagraktárként, míg a poliszacharid cellulóz a növények a kitin pedig a gombák sejtfalképző anyagai.
v
A környezeti feltételek drasztikus változása hirtelen, míg a folyamatosan nem kielégítő környezeti feltételek lassabb folyamatban okozzák az élő kémiai rendszer (sejt) diszfunkcióját, hibás működését, végső soron az elmúlását. Amennyiben a szaporodás sebessége meghaladja az elhalás sebességét, a bioszféra (még ha más egyedekből állóan is) fennmarad. Ha a szaporodás során nem tökéletesen azonos másolatok születnek, létrejön a változó környezethez való alkalmazkodás, a fejlődés, az evolúció lehetősége.
2
Határfelületképző + + + –
Biomolekula lipidek szénhidrátok fehérjék nukleinsavak
Tápanyag-raktár
O C17H35
C17H35
C17H35 C17H35
trisztearoilglicerin
H R1
N H
H2C O O H H2C O O O P O O
CH3
CH3
H N
CH3 HO koleszterin
NH3
O
NH2
O
N
H R3
N O
Polipeptid N-terminális vége
H OH
OO NH
H H N O O NH2 OH O P O N H OH N O H H N O N HO H H OH HO OH H H HO O P O N H OH O H OH O O H H O HO H H H OH HO H N OH HO O H O OH H H O P O H O H H O HO O amilóz szakasza H H O OH O P O O ribonukleinsav CUAG szakasza H OH O
H HO
HO H
H OH
H
disztearoilfoszfatidiletanolamin
O R2 H H3N
Reprodukciós információtár – – – +
Alapvető biomolekula-típusok fő funkciói
O
C17H35
– – + +
+ + – –
1. táblázat:
H2C O O H H2C O O O
Biokatalizátor
H
HO H OH
NH N
NH2
H OH
H OH O
O OH H
O
HO H
H OH OH H
O
cellulóz szakasza 2. ábra: A biomolekulák négy alapvető típusa. Felső sor: lipidek képviselői (triglicerid, foszfolipid, szteroid) Középen: egy fehérje peptidláncának N-terminális vége Alul baloldalt: két szénhidrát (amilóz és cellulóz) részlete Alul jobboldalt: egy nukleinsav részlete C: citozin, U: uracil, A: adenin, G: guanin
3
Az aminosavakból felépülő fehérjék a földi élet legfontosabb molekulái, sok egyéb funkciójuk mellett részt vesznek a biológiai membránok felépítésében, felelősek a szelektív anyagtranszportért, továbbá e molekulák közül kerülnek ki a jellemző biokatalizátorok, az enzimek. A nukleotidokból felépülő nukleinsavak, a ribonukleinsav (RNS) és a dezoxiribonukleinsav (DNS) fő funkciója a szaporodáshoz szükséges információk tárolása és szállítása, valamint a fehérjeszintézishez szükséges aminosavak szállítása, továbbá a fehérjeszintézis katalízise. A biokatalizátor RNS molekulákat, pl. a fehérjeszintézist végző riboszómákban helyet foglaló ribonukleinsavakat, hívjuk ribozimeknek. A többsejtű élőlények esetén egy további funkció jelenik meg, a szervezet szintű szabályozás, azaz az élőlény sejtjei működésének az összehangolása. Ezt a feladatot a földi élővilág egyrészt kémiai közvetítőmolekulákkal, másrészt a fejlettebb élőlényekben kifejlődött idegrendszerrel oldotta meg. Az idegsejtek csatlakozásánál (szinapszis) azonban itt is kémiai ingerületközvetítő molekulák (neurotranszmitterek) játszanak szerepet. A legtöbb neurotranszmitter speciális aminosav, illetve aminosav-származék (lásd 3. ábra). Ebben a fejezetben az idegi ingerületvezetéssel nem foglalkozunk. O
OH N
O
acetilkolin
OH
H N
HO
NH2 HO
OH
OH
O NH3
HO
noradrenalin
adrenalin
COO
NH2 NH2
glutaminsav
HO HO
O NH3
O GABA
N H
OH dopamin
szerotonin
3. ábra:
Legfontosabb neurotranszmitter anyagok. acetilkolin a szerin származéka, γ-aminovajsav (GABA) a glutaminsav származéka adrenalin, noradrenalin és dopamin a tirozin származékai szerotonin a triptofán származéka
Meg kell különböztetnünk az ún. normálállapotú és vészhelyzeti szabályozást. A normálállapotú szabályozás a többsejtű élőlény normálkörülmények közötti működését szabályozza. Ebben közvetítőmolekulákként speciális lipid és peptid vegyületek, köztük a hormonok, és egyes speciális nukleotidok (pl. ciklikus adenozin-monofoszfát, cAMP) vesznek részt. A vészhelyzeti szabályozás valamilyen a szervezet számára káros külső hatásra adandó választ szabályozza. Ebben ugyancsak lipid és peptid típusú vegyületek játsszák az üzenetközvetítő szerepet. Néhány a szabályozásban résztvevő hormont és egyéb molekulát a 4. ábra mutat be.
4
OH
HO COOH O H2N HO
OH S S
PGF2 O H2N
H
H N O
H3C
N H
N
H
O
O
H
H
NH2 O
OH
H
H3C
O
NH2
oxitocin
O H
O H
HN H HN
H N
N H H O
O O
H N H
O H3C
H
O
H H
progeszteron
O OH
H3C
H
O kortizon
OH COOH H
S H3N
H
COO
LTE4
NH2
N O
N
O H P O H OH O O cAMP
N N
4. ábra: Néhány a szabályozásban résztvevő molekula. prosztaglandin-F2α (PGF2α): a méhösszehúzódást szabályozó lipid; oxitocin: az agyalapi mirigyben termelődő peptidhormon, progeszteron: szteroid női nemi hormon; kortizon: cukorháztartást szabályozó kortikoszteroid hormon; leukotrién-E4 (LTE4): a gyulladásos folyamatot szabályozó lipid ciklikus adenozin-monofoszfát (cAMP): ún. másodlagos hírvivő nukleotid
9.2. A bioreakciók általános jellemzése A bioreakciók biokatalizátorok (enzimek) által katalizált szerves kémiai reakciók. Röviden tekintsük át azokat a legfontosabb tulajdonságokat, amelyekkel az enzimkatalizált reakciók rendelkeznek: szubsztrátszelektivitás; reakciószelektivitás; regioszelektivitás; sztereoszelektivitás; hőmérséklet optimum; pH optimum. Az élővilág által használt szerves kémiai reakciók számára biokatalizátor alkalmazása nélkül nagyon különbözőek az optimális reakciókörülmények. Vannak olyan reakciók, amelyek számára az apoláris, vannak, amelyek számára a poláris oldószer a kedvező. Egyes reakciók erősen savas, mások bázikus körülmények között játszódnak le. Ismerünk olyan reakciókat, amelyek optimális hőmérséklete 0°C alatt van, és ismerünk olyanokat, amelyek 100°C felett játszódnak le. Egyes reakcióknak a nagyobb 5
nyomás, másoknak a csökkentett nyomás a kedvező. A biológiai rendszerben mindezen kémiai reakcióknak közel azonos körülmények között (a citoplazma közel semleges pH-val rendelkező vizes közegében, 20–40°C – szélsőségesebb körülmények között 0–100°C – közötti hőmérséklettartományban, a külsővel azonos nyomáson) kell megfelelő sebességgel lejátszódniuk. Egy többkomponensű oldatban számtalan különböző sebességgel lejátszódó kémiai reakció mehet végbe egymás mellett. Katalízis nélkül a reakciók sebességét a rendelkezésre álló kinetikus energia (hőmérséklet) és az adott reakció aktiválási energiagátjának viszonyától függő k reakciósebességi állandó, valamint a szubsztrát(ok) és reagens(ek) találkozási valószínűségét kifejező koncentrációszorzat határozza meg. A reakciósebesség – egy szubsztrát és egy reagens ütközésével lejátszódó reakció esetén – az alábbi módon írható fel:vi S+R
P + R'
𝑣 = 𝑘[𝑆][𝑅]
(1) egyenlet
ahol [S] a szubsztrát, [R] a reagens koncentrációját jelöli. A k reakciósebességi állandó hőmérsékletfüggésére pedig az alábbi összefüggések – Arrheniusegyenlet (2), illetve Eyring-egyenlet (3) – írhatóak fel:vii 𝐸#
𝑘 = 𝐴𝑒 − 𝑅𝑇 𝑘=
𝑘𝐵 ℎ
𝑇𝑒 −
∆𝐺# 𝑅𝑇
=
𝑘𝐵 ℎ
(2) egyenlet
𝑇𝑒 −
∆𝐻# −𝑇∆𝑆# 𝑅𝑇
(3) egyenlet
ahol A az ún. preexponenciális tag, amely arányos az összes ütközés azon hányadával, amely terméket eredményez, és tartalmazza az aktiválási entrópiát (ΔS#), E# pedig az aktiválási energiagát, amely az aktiválási entalpiát (ΔH#) tartalmazza.viii A biológiai rendszerben ellenben csak azoknak a reakcióknak szabad meghatározott sebességgel lejátszódnia, amelyek fenntartják a homeosztázis dinamikus egyensúlyát. Ezt az teszi lehetővé, hogy az adott közegben biokatalizátor (enzim) jelenléte nélkül nem, vagy csak nagyon lassan lejátszódó reakciók sebességét a biokatalizátorok gyorsítják fel a kívánt értékre. A biokatalizátorok sok esetben koenzimként tartalmazzák a reagenst, és a reakció lejátszódása előtt enzim–szubsztrát-komplex formájában megkötik a szubsztrát molekulát is. Ezért jelentősen megváltozik a reakció kinetikai képe.ix k1 S + ER
ERS k1'
5. ábra:
k2
k ER'P k'
P + ER' k2'
Egyensúlyra vezető koenzimet tartalmazó enzimreakció általános modellje.
Általánosan az enzim reakciók is megfordíthatóak (5. ábra), azaz a szubsztrát megkötésével létrejön az enzim–szubsztrát-komplex, amely az enzim katalitikus hatására átalakul enzim–termék-komplexszé,
vi
S: szubsztrát, R: reagens, P: termék, R’: reagensből keletkező vegyület R: egyetemes gázállandó, T: hőmérséklet, kB: Boltzmann-állandó, h: Planck-állandó, ΔG#: aktiválási szabadentalpia, amelyre igaz, hogy: ΔG#=ΔH#–TΔS# viii Az átmeneti állapotok itt nem ismertetett elmélete alapján bimolekuláris oldatreakciók esetén: 𝐸 # = 𝛥𝐻 # + 𝑅𝑇, és vii
𝐴=
𝑘𝐵 ℎ
𝑇𝑒
𝛥𝑆# +𝑅 𝑅
ahol a kB/h*T tag határozza meg az ütközések gyakoriságát, az 𝑒
𝛥𝑆# +𝑅 𝑅
tag határozza meg, hogy ezen
𝛥𝐻# +𝑅𝑇 − 𝑅𝑇
ütközések közül mekkora hányadnak megfelelő a geometriai elrendeződése, az 𝑒 tag pedig azt határozza meg, hogy az ütköző molekulák mekkora hányadának elégséges a kinetikus energiája az aktiválási energiagát leküzdésére. ix ER: enzim–koenzim-addukt, ERS: enzim(koenzim)–szubsztrát-komplex, ER’P: enzim(módosult koenzim)–termékkomplex, ER’: enzim–(módosult koenzim)-addukt
6
amely egyensúlyi reakcióban szétesik a termékké, és a módosult koenzimet tartalmazó enzimmé. Ez esetben a három egyensúlyi állandó szorzata határozza meg a bruttó egyensúlyi állandót (Kbr). 𝑘
[𝐸𝑅𝑆]
𝑘
𝐾1 = 𝑘1′ = [𝑆][𝐸𝑅] ; 𝐾 = 𝑘 ′ = 1
[𝐸𝑅 ′ 𝑃] [𝐸𝑅𝑆]
𝑘 𝑘𝑘
𝑘
; 𝐾2 = 𝑘2′ = 2
𝐾𝑏𝑟 = 𝐾1 𝐾𝐾2 = 𝑘 ′1𝑘 ′ 𝑘2′ = 1
[𝑃][𝐸𝑅 ′ ] [𝐸𝑅 ′ 𝑃]
(4a,b,c) egyenletek
[𝑃][𝐸𝑅 ′ ]
2
(5) egyenlet
[𝑆][𝐸𝑅]
Nagyon sok bioreakció ellenben egyirányú, mert a termék egyáltalán nem kötődik az enzimhez, így keletkezése pillanatában elválik az enzimtől. Ez esetben a bioreakció kinetikai képe leegyszerűsödik egy az enzim–szubsztrát-komplexet létrehozó egyensúllyá, és az azt követő egyirányú reakcióvá (6. ábra). k1
k
S+E 6. ábra:
ES
P+E
k1' Egyirányú koenzimet nem tartalmazó enzimreakció Michaelis–Menten-modellje.
Állandósult dinamikus egyensúlyi rendszerekben az [ES] enzim–szubsztrát-komplex koncentrációt konstansnak tekinthetjük és ez alapján felírható az alábbi (6) egyenlet:x 𝑘1 ([𝐸]0 − [𝐸𝑆])[𝑆] = 𝑘1′ [𝐸𝑆] + 𝑘[𝐸𝑆] azaz ([𝐸]0 −[𝐸𝑆])[𝑆] [𝐸𝑆]
=
𝑘1′ +𝑘 𝑘1
[𝐸]0 [𝑆]
= 𝐾𝑀 , illetve [𝐸𝑆] = 𝐾
𝑀 +[𝑆]
(6) egyenlet (7a,b) egyenletek
ahol KM az enzim-működésre jellemző Michaelis–Menten-állandó. Ezen összefüggés alapján felírható a termékképződés sebessége: [𝐸]0 [𝑆]
𝑣 = 𝑘[𝐸𝑆] = 𝑘 𝐾
𝑀 +[𝑆]
(8) egyenlet
Egyértelműen látható a klasszikus oldatreakciók (1) egyenlet, illetve az enzimreakciók (8) egyenlet által leírt kinetikai képe közötti különbség. A Michaelis–Menten-modell alapján értelmezhető az enzimreakciók jellemző sajátosságai. A klasszikus oldatreakciók esetén a reakció végbemeneteléhez szükséges geometria elrendeződés az ütközés során előálló átmeneti állapotban jön létre. Rendezett szerkezetű ütközési komplexxi esetén az aktiválási entrópia (ΔS#) nagy negatív értékű, így az aktiválási szabadentalpia (ΔG#) nagy pozitív értékű lesz, azaz a reakciósebességi állandó (k) kis értéket vesz fel (lásd (3) egyenlet). A reakciósebesség vagy a hőmérséklet növelésével, vagy az aktiválási entalpiát (ΔH#) csökkentő katalízissel gyorsítható. A reakciósebesség (v) az (1) egyenlet szerint függ a szubsztrát és reagens találkozási valószínűségétől,xii azaz koncentrációjuk szorzatától is. Enzimreakció esetén a reakció végbemeneteléhez szükséges geometria elrendeződés az enzim– szubsztrát-komplex képződése során jön létre. Sőt az enzim–szubsztrát-komplex koenzim formájában tartalmazhatja a reagenst, illetve az enzim aktív centrumában foglalnak helyet a kémiai átalakulás aktiválási entalpiáját csökkentő katalitikus hatást kifejtő szerkezeti részek. Így az enzim–szubsztrátkomplexből kiinduló reakció (6. ábra) (8) egyenletben szereplő reakciósebességi állandójához (k) tartozó aktiválási szabadentalpia (ΔG#) kis pozitív értéket vesz fel, és a reakciósebesség pedig a (8) x
A sejtben lévő eredeti enzimkoncentráció [E]0, az enzimmolekulák egy része azonban enzim–szubsztrát-komplexként van jelen, ezért a pillanatnyi szabadenzim-koncentráció az [E]0–[ES] képlettel adható meg. xi A kémiai reakció során a reagáló molekulák (pl. szubsztrát és reagens) ütközésével jön létre az ütközési komplex, amelyhez a reakció energiadiagramja lokális maximuma, az ún. átmeneti állapot tartozik. xii A találkozási valószínűség valamekkora 0
7
egyenlet szerint az enzim–szubsztrát-komplex koncentrációjától függ.xiii Az enzim–szubsztrátkomplexképződés egyensúlyára felírhatjuk az alábbi egyenleteket: ∆𝐺 = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆 = −𝑅𝑇𝑙𝑛𝐾1 𝑘 𝐾1 = 𝑘1′ 1
(9) egyenlet (10) egyenlet
Az enzim–szubsztrát-komplex egy nagyon rendezett szerkezet, ezért a keletkezéséhez tartozó entrópiaváltozás (ΔS) nagy negatív értéket vesz fel. Ezért az enzim–szubsztrát-komplex képződéshez tartozó szabadentalpia-változás (ΔG) csak akkor lehet a komplexképződésnek kedvező negatív értékű, ha az entalpiaváltozás (ΔH) is negatív, és igaz, hogy ΔH < TΔS.xiv Az entalpiaváltozás akkor lehet nagy negatív érték, ha az enzim–szubsztrát-komplexképződés során jelentős mértékű stabilizáló kölcsönhatás jön létre az enzim és a szubsztrát molekula között. Ezek a kölcsönhatások lehetnek ionos kötések, hidrogénhidak vagy van der Waals típusú másodlagos kémiai kötések. A termodinamikai/kinetikai és sztereokémiai megfontolások alapján: enzimreakció csak az enzimmel stabil enzim–szubsztrát-komplexet képző szubsztráttal mehet végbe (szubsztrátszelektivitás); enzimreakció során a szubsztráton csak az a kémiai változás következhet be, amelyet az adott enzim katalitikus helye (aktív centruma) katalizál (reakciószelektivitás); az enzimek aszimmetrikus szerkezete miatt az enzimmel csak a szubsztrát megfelelő sztereokémiájú izomere tud stabil enzim–szubsztrát-komplexet képezni (diasztereomer- és enantiomerszelektivitás); az enzimek aszimmetrikus szerkezete miatt az enzim a szubsztrátnak az enzim aktív centrumába került szerkezeti részletének meghatározott pozícióján hajtja végre a kémiai átalakítást (regioszelektivitás, valamint diasztereo- és enantioszelektivitás); a hőmérséklet emelkedése növeli az ES → P + E reakció sebességi állandóját, ellenben csökkenti az enzim–szubsztrát-komplex képződésének a mértékét, azaz a két hatás eredőjeként létezik az enzimreakció hőmérséklet optimuma; az enzim–szubsztrát-komplex képződése az enzim, illetve a szubsztrát megfelelően protonált/deprotonált alakjai között mehet végbe, azaz létezik az enzimreakció pH optimuma. 9.3. A zsírsav-szintézis és a zsírsav-lebontás A bioreakciók működését a zsírsav-bioszintézis és zsírsav-lebontás példáján mutatjuk be, összehasonlítva az analóg kémiai reakciókkal. 9.3.1. Zsírsav-bioszintézis kémiai folyamata A zsírsav-bioszintézis kulcslépése a szénlánc-kapcsolás. A földi élet a Claisen-kondenzáció (lásd 5.3.1. fejezet) biokatalizált változatát valósítja meg. A Claisen-kondenzáció során észtereket kapcsolunk össze úgy, hogy erősen bázikus vízmentes közegben az egyik észterből enolátot képzünk. A bio-Claisen-kondenzáció során tioészterek összekapcsolása valósul meg úgy, hogy az enolátot képző komponens pKa értékét aktiváló segédcsoport bevezetésével 14-es érték alá transzformálja a biokémiai rendszer.
xiii
Az enzim–szubsztrát-komplexen belül a szubsztrát és a reagens (az enzim aktív centrumában helyet foglaló aminosavoldallánc, vagy koenzim) találkozási valószínűsége maximális (P=1). xiv Vizsgáljuk meg a glicerinaldehid-3-foszfát–dihidroxiaceton-3-foszfát izomerizációt katalizáló triózfoszfát-izomeráz enzim esetét. Az enzim KM = 4,710-4 M Michaelis–Menten-állandóval és k = 4,3103 1/s katalitikus sebességi állandóval rendelkezik. A
𝑘1′ +𝑘 𝑘1
= 𝐾𝑀 = 4,7 × 10−4 =
𝑘1′ +4,3×103 𝑘1
k1’.
azaz k1 több nagyságrenddel nagyobb, mint hogy: K1 >> 1; ΔG = ΔH–TΔS < 0; ΔH < TΔS.
összefüggésből kifejezhető, hogy 𝑘1 = 2,1 × 103 𝑘1′ + 9,1 × 106 ,
Ezen arányt a (9) és (10) egyenletekbe behelyettesítve megállapítható,
8
O
O + OEt
H3C
H2C H
OEt
+ H3C 7. ábra:
H3C
O
O SQ
A
CH H
O
NaOEt
C H2 O
enzim SQ
O
H3C
OEt
+ EtOH
O C H2
SQ
+ A + QS
Az acetecetészter előállítása Claisen-kondenzációval és a bio-Claisen-kondenzáció bruttó egyenlete. QS: A biokémiai acil-carrier segédcsoport; A: aktiváló segédcsoport (CO2).
Az aktiváló segédcsoport a karboxilcsoport, ennek kiépítése során a szervezetben az ecetsavból történő malonsav előállítás (lásd 6.2. fejezet) biokatalizált változata valósul meg. Míg az ipari szintézis nagy nyomás és magas hőmérséklet alkalmazásával történik, addig a bioreakció a sejt hőmérsékletén, normál nyomáson a citoplazmában játszódik le. A biotin nevű koenzim segítségével a megfelelő enzim az acetil-KoA-ból malonil-KoA-t állít elő. A koenzim-A (KoA) egy acil-carrier segédcsoport, amely tiol funkciós csoportja acileződik a szállítandó acilcsoporttal. O CH3
O
K
p, T
O KoA
8. ábra:
S
O
K2CO3
+ CO2
O
K
+ M HCO3
enzim
C H2 O
Biotin CH3
O
KoA
S
O K O
C H2
O M
A malonsav előállítása karboxilezéssel és az acetil-koenzim-A karboxilezése. M+: a citoplazmában oldott valamely kation
A bio-Claisen-kondenzációt egy multienzim-komplex katalizálja, amelyen több az acilcsoport megkötésére képes ún. acil-carrier-protein (ACP) található. Ezek közül az egyikhez kapcsolódik az acetilcsoport és egy megfelelő pozícióban levő másikhoz a malonilcsoport. Így a két reagálandó szubsztrát molekula megfelelő geometriai pozícióban rögzül a multienzim-komplex kondenzáló egységében. O KoA
S
O C H2
O O M
KoA
S
CH3
M O O
SH ACP
9. ábra:
ACP
ACP
O CH2
S
HS
2 KoA-SH
O
CH3 S ACP
Az acetil- és malonil-csoportok megkötése a multienzim-komplex ACP-segédcsoportjain.
Az ACP-hez kötött malonilcsoporthoz tartozó karbonsav és metiléncsoport pKa értéke között több nagyságrend különbség van. A pKT tautomer egyensúlyi állandó e két pKa érték különbségeként számítható (lásd 1.2. fejezet) 𝑝𝐾𝑇 = 𝑝𝐾𝐶𝐻2 − 𝑝𝐾𝐶𝑂𝑂𝐻
9
Ezen összefüggésből becsülhető, hogy az enolátképződés mértéke nagyon kicsi, de mivel a bioClaisen-kondenzáció másik komponense megfelelő helyzetben megkötve ugyanabban az aktív centrumban található, a reakció az enolátképződés pillanatában lejátszódik.xv H O
M O O
O
O
M
CH2
O
S
O
CH3
O
S
S
S ACP
CO2 O O
O CH
S
CH3
ACP
ACP
ACP
CH
H2 C
O
H O
S
gyors reakció O
CH3
M
ACP
ACP
CH3
S
ACP 10. ábra: A bio-Claisen-kondenzáció főbb lépései. Alul baloldalt a dekarboxileződő trikarbonil-vegyület, sárgával kiemelve az acetecetsav-részt.
A bio-Claisen-kondenzáció lejátszódása során egy átmeneti trikarbonil-vegyület jön létre, amely képződésével egyidőben dekarboxileződik. A trikarbonil-vegyület szerkezetét megvizsgálva megállapíthatjuk, hogy a belépő acetilcsoport a malonilcsoport karboxilcsoportjával könnyen dekarboxileződő acetecetsav-részt hoz létre. (Vö. 6.2. fejezettel) A bioszintézis további lépéseiben az 5.5.1. fejezetben ismertetett reakciókkal analóg átalakításokkal redukálódik a β-helyzetű karbonilcsoport. Első lépésben az oxocsoport hidridion-addícióval alkohollá redukálódik. Kémiai szintézis során hidridion-donor lehet pl. a nátrium-[terahidrido-borát], a bioszintézis során a hidridion-donor a redukált nikotinsavamid–adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) koenzim.xvi H2 C
O Et
O
O
NaBH4
CH3
H+/H2O
H2 H OH C
O Et
O
CH3
racém H2 C
O S ACP
O CH3
NADPH
H2 H OH C
O
+
H
S ACP
NADP+
CH3 (R)
11. ábra: Az acetecetészter kémiai redukciója és a 3-oxobutanoil-S-ACP biokémiai redukciója. Lilával a hidridionként pirossal a protonként átkerülő hidrogént jeleztük.
xv
Klasszikus oldatreakcióban az enolarány kis mértéke miatt nem valósul meg hasonló reakció, hiszen a nagyon kis mértékben képződő malonsav-monoészter-enolát és az ecetsav-észter találkozási valószínűsége elhanyagolhatóan kicsi. xvi A NADPH redukált koenzim hidridion leadással NADP+ kationos koenzimmé alakul. A NADP+ oxidált koenzim hidridion felvétellel visszaalakul NADPH redukált koenzimmé. Azaz míg a NADPH redukáló koenzimként, addig NADP + oxidáló koenzimként szolgál a bioreakciókban. Hasonló redox-bioreagens páros a NADH–NAD+ koenzim-pár.
10
A kémiai redukció során a [tetrahidrido-borát]-anion közelíti meg a karbonilcsoportot úgy, hogy egy hidrogénatom a karbonil-szénatomhoz, a központi bóratom pedig az oxigénatomhoz kerül közel. Az átmeneti állapotban lejátszódó elektronáramlások eredményeképp létrejövő bórsav-észter köztitermék savas hidrolízisével jön létre a végtermék β-hidroxikarbonsav-észter. Mivel a [tetrahidrido-borát]anion ugyanolyan valószínűséggel közelítheti meg a karbonilcsoport mindkét oldalát racém termék keletkezik. A bioredukció során az aszimmetrikus enzim aktív centrumában helyet foglaló aszimmetrikus felépítésű NADPH koenzim az aszimmetrikus ACP által megkötött 3-oxobutanoilcsoport keton funkciós csoportjához csak egyik oldalról fér hozzá, ezért a termék kizárólag az (R) enantiomer lesz. H BH3
H BH3 C O A Me H+
A Me C O
H A C O H Me
A H Me C O H
A Me C O H BH3
racém elegy
pro-R
H H
H
N Q
A = EtOCOCH2-
X
X
A' Me C O
N Q
H A' C O H Me (R)
H+
A' = ACP-SCOCH2X = H2NCO-
12. ábra: Az acetecetészter kémiai redukciója és a 3-oxobutanoil-S-ACP biokémiai redukciója. Felső sor: A [tetrahidrido-borát]-anion két oldalról történő közelítése, és az e reakciókból származó termékmolekulák. A köztitermék bórsav-észter csak az egyik úton került feltüntetésre. Alsó sor: Az enzim aktív centrumában lejátszódó, egyfajta sztereoizomer terméket eredményező folyamat. A NADPH és a NADP+ koenzimeknek csak a reakcióban résztvevő nikotinsavamid részletét ábrázoltuk, a további részt Q-val jelöltük.
A következő lépés a β-hidroxikarbonsav-észterből történő savkatalizált vízelimináció. Kémiai szintézis során a katalizátor valamilyen ásványi sav, bioreakcióban a dehidratáz enzim aktív centrumában helyet foglaló aminosav savas tulajdonságú oldallánca. Az ásványi sav katalizált reakcióban főtermékként, az enzimatikus reakcióban kizárólag a termodinamikailag stabilabb (E)-sztereoizomer keletkezik. O Et
H
H2 C O
OH
H+
CH3
O Et
CH3 H
O
racém
O S ACP
H
H2 H OH C
H+
CH3
enzim
O
CH3 S
H
ACP
13. ábra: Az etil-[(E)-but-2-enoát] előállítása etil-(3-hidroxibutanoát)-ból, illetve az (R)-3-hidroxibutanoil-S-ACP biokémiai dehidratálása.
Az utolsó lépés az α,β-telítetlen karbonsav-észter szénláncának a redukciója. A redukció megvalósítása újra hidridion-donor reagenst igényel, hiszen az α,β-telítetlen karbonsav-észter négy atomra kiterjedő delokalizált π-rendszere a β-szénatomon δ+ töltést létrehozva erősen polarizált. (Vö. 5.5. fejezettel)
11
O Et
H
O
O
H
S
NaBH4
CH3
H
H+/H2O
CH 3
NADPH
O Et
O
H+
H
H
H
CH3
H
O
H
H
H
S
H
CH3
NADP+
H
ACP
ACP
14. ábra: Az etil-[(E)-but-2-enoát] kémiai redukciója és az (E)-but-2-enoil-S-ACP biokémiai redukciója. Lilával a hidridionként pirossal a protonként átkerülő hidrogént jeleztük.
Az így elkészült telített szénláncú karbonsav acilcsoportja végül átkerül arra az ACP-re, amelyhez eredetileg az acetilcsoport kapcsolódott, és a másik ACP-hez malonilcsoportot kapcsolva újra indul a ciklus. H O
M O O
O CH2
S
Ri CH2
O
M O
CH
ACP
S ACP
ACP
CO2 Ri = (CH2)xH x = (i-1)*2
3)
NADPH/H+ 2) -H2O 1) NADPH/H+
Ri CH2
O
S
S
ACP
O
O
H2 C S H2C
ACP
gyors reakció O Ri
M
S ACP
15. ábra: A szénlánc kapcsolási ciklus lépései. Színes ellipszisekkel a ciklusban résztvevő enzimeket jelölve. piros: β-ketoacil-szintáz, rózsaszín: β-ketoacil-reduktáz, zöld: dehidratáz, kék: enoil-reduktáz
A bioszintézis további részleteivel itt nem foglalkozunk. 9.3.2. Zsírsav-lebontás kémiai folyamata A zsírsavlebontás lépései ellenkező sorrendben megfeleltethetőek a zsírsav-bioszintézis lépéseinek. A zsírsavlebontás során az acil-carrier segédcsoport a koenzim-A (KoA). Első lépésben a karbonilcsoporthoz képest α,β-helyzetben hoz létre az enzimrendszer (E)sztereokémiájú kettőskötést. A telített szénlánc apoláris tulajdonságú, ezért a dehidrogénezéhez a poláris csoportokkal hidridion-transzporttal reagáló NAD+ nem megfelelő reagens. Az alkalmazott dehidrogénező koenzim ez esetben a flavin-adenin-dinukleotid (FAD), mely két hidrogénatom felvételével FADH2-vé alakul.
12
O
H S
H
H
H C2n+1H4n+3
O
FAD
H
C2n+1H4n+3
KoA
FADH2
H
S KoA O N
H N
O
N Q
N H
NH
N Q
N
O
FAD
NH O
FADH2
16. ábra: Az acil-S-KoA dehidrogénezése FAD koenzimmel. Kékkel a hidrogénatomként átkerülő hidrogéneket jeleztük. A FAD és a FADH2 koenzimeknek csak a reakcióban résztvevő flavin részletét ábrázoltuk, a további részt Q-val jelöltük.
Hasonló kémiai dehidrogénezéshez dehidrogénező katalizátorokat, mint pl. Pt vagy Raney-Ni, lehet használni. A következő lépésben a létrejövő α,β-telítetlen karbonsav-tioészter funkciós csoporton játszódik le egy enzimkatalizált vízaddíció. A nukelofil hidroxidion az 5.5. fejezeben ismertetetteknek megfelelően a βhelyzetű szénatomra kerül. Az enzimkatalizált folyamat az enzim sztereoszelektivitása miatt kizárólag (S)-izomert szolgáltat.xvii H O Et
CH3
H+/H2O
H
O
H2 C
O Et
OH CH3
O
racém H C2n+1H4n+3
O S KoA
H
H2O
H2 H OH C
O
enzim
C2n+1H4n+3
S KoA (S)
17. ábra: Az etil-[(E)-but-2-enoát] savkatalizált vízaddíciója, illetve az (S)-3-hidroxiacil-S-KoA-t eredményező biokémiai vízaddíció.
A harmadik lépés a hidroxiszármazék oxidációja. Az oxidálószer a hidridion-transzporttal reagáló NAD+. Az enzimatikus oxidáció során az alkoholos hidroxilcsoportról protonként leváló hidrogén a közegbe, míg a β-helyzetű szénatomról hidridionként leváló hidrogén a NAD+ kationra kerül. Az enzim, aktív centrumának aszimmetrikus felépítése miatt, csak az (S)-3-hidroxi-karbonsav-tioészter enantiomert fogadja el szubsztrátként, amelyről leváló hidridion a NAD+ kation ún. pro-R pozíciójába kerül.
xvii
A zsírsav-bioszintézis során az (R)-3-hidroxikarbonsav-tioészter, míg a zsírsavlebontás során az (S)-3-hidroxikarbonsav-tioészter a bioreakciósor köztiterméke.
13
H
N Q
H H
pro-R
X H R C O H A (S)
N Q
R = C2n+1H4n+3-
X
R C O A
A = KoA-SCOCH2H+
X = H2NCO-
18. ábra: Az (S)-3-hidoxiacil-S-ACP biokémiai oxidációja. Az enzim aktív centrumában lejátszódó, egyfajta sztereoizomerből kiinduló folyamat. A NAD+ és a NADH koenzimeknek csak a reakcióban résztvevő nikotinsavamid részletét ábrázoltuk, a további részt Q-val jelöltük.
Az így elkészült β-oxokarbonsav-tioészter bio-retro-Claisen-reakció alkalmas szubsztrátja. A retroClaisen-reakció során (lásd 6.2. fejezetet) egy megfelelő nukleofil reagens támad a β-helyzetű karbonilcsoport szénatomjára, amely támadás az α- és β-helyzetű szénatomok közötti kötés hasadását eredményezi. Míg a kémiai retro-Claisen-reakció erősen bázikus közegben játszódik le (pl. az amidanion a támadó nukleofil és az észter enolátja a távozó csoport), addig a bioreakció során a koenzim-A tiolát anionjaxviii a támadó nukleofil és az enzim aktív centrumában megfelelő pozícióban lévő aminosav savas karakterű oldallánca protont átadva segíti a folyamatot. Így a bio-retro-Claisen-reakció a sejt közel semleges pH-jú közegében is könnyen végbemegy. Na O H3C
O C H2
Na
Na
O O
Et
H3C
O
O O
NH2
Et
H2C O
NH2
H3C
R M
O
O C H2 S KoA
O S
KoA
R
R = C2n+1H4n+3
S
S
H2C
S
R
OEt
S
O
KoA
O
KoA
H2C H
H
O KoA
O
H+
NH2
H O
OEt
H2C H
S
KoA
KoA
19. ábra: Az etil-acetoacetát nátrium-amiddal kiváltott retro-Claisen-reakciója, illetve a 3-oxoacil-S-KoA KoA-S– anionnal kiváltott bio- retro-Claisen-reakciója.
A folyamat eredményeként képződött acetil-KoA más biokémiai reakcióknak a kiinduló alapanyaga, míg a két szénatommal lerövidült zsírsav-tioészter visszakerül a folyamat elejére, és az ismertetett lépésekkel újabb két szénatommal rövidül.
xviii
A tiolok savas karakterük miatt vizes közegben is deprotonálhatóak. (Lásd 4.3. fejezetet)
14
O
H2 C S H2C
KoA
Ri = (CH2)xH x = (n-4)-(i-1)*2
O
O Ri
M
S
CH3 S
KoA
KoA
3) NAD+ 2) +H2O
O
1) FAD KoA
H2 C
CH2 S H2C i R
HOOC Cn-1H2n-1
20. ábra: A szénlánc lebontási ciklus lépései. Színes ellipszisekkel a ciklusban résztvevő enzimeket jelölve. piros: tioláz, rózsaszín: acil-dehidrogenáz, zöld: hidratáz, kék: L-β-hidroxiacil-dehidrogenáz
A zsírsavlebontás további részleteivel itt nem foglalkozunk.
15
