6. gyakorlat: Immunszerológia 1. precipitáció, agglu;náció Az immunológia alapjai PTE-KK, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécs, 2016.
A szerológia fogalma • •
• •
•
A vérszérum és más testnedvek laboratóriumi vizsgálata, a gyakorlatban elsősorban az azokban található an*testek kimutatását ér;k alaMa. Emlékeztek? – Vérplazma: alvadásgátolt vér felülúszója – Vérszérum: alvadt vér felülúszója Ezek is an*gén-an*test reakción alapulnak (mindkeMő kimutatható). Milyen módszerek tartoznak ide? – Precipitáción alapulók – Agglu*náción alapulók – Immunoassay vizsgálatok (ELISA, ELISPOT, radioimmunoassay, stb., lásd jövő héten) – Immunoblot technikák (Western blot, Dot blot, lásd jövő héten) – Indirekt immunfluoreszcens mikroszkópia Főbb klinikai felhasználás: – Fertőző betegségek diagnosz;kája (pl. a kórokozók ellen termelt an;testek kimutatása) – Autoimmun betegségek diagnosz;kája (kóros autoan;testek kimutatása) – Immunhiányos állapotok diagnosz;kája (an;testek szintjeinek mérése) – Vércsoport meghatározás
Specificitás, szenzi;vitás FN = Fals negaEv FP = Fals poziEv Határérték Nega^v
Fogalmak:[1.] 𝐒𝐩𝐞𝐜𝐢𝐟𝐢𝐜𝐢𝐭á𝐬= Valódi negatív/Összes Pozi^v
𝐒𝐳𝐞𝐧𝐳𝐢𝐭𝐢𝐯𝐢𝐭á𝐬= Valódi pozitív/Össze
Egészséges
Beteg
Az ideális vizsgálat 100%-os szenzi;vitással és specificitással rendelkezik, de ilyen vizsgálat NINCSEN.
FN FP Normális tartomány
?
Kóros tartomány
Fals pozi^v eredmény
Fals nega^v eredmény Ön nem várandós.
Ön gyermeket vár.
Precipitáció An;gén An;test
Ha az oldatban lévő an;gén melleM megfelelő arányban van jelen az azt felismerő an;test is, akkor nagyobb fehérje komplexeket hoznak létre.
An;test mennyisége
Precipitátum képződik
An;test túlsúly An;gén mennyisége
Ekvivalencia zóna
An;gén túlsúly
A nagyobb komplexeknek csökken az oldékonysága és kicsapódnak (precipitáció). Ezen alapul: • Immundiffúzió • Immunelektroforézis
Immundiffúzió I. Radiális immundiffúzió
An*test az agar gélbe ágyazva
Az an;gén körkörös diffúziója An*gén
Precipitációs ív KeKős immundiffúzió An*test
Agar gél
An*gén
Precipitáció
Egyszerűen kivitelezhető, d e m a m á r e l a v u l t technikák.
Immundiffúzió II. Mancini-féle[2.] radiális immundiffúzió:
Az agar gél egyenletes koncentrációban tartalmaz an;gént. Hozzáadják a vizsgált szérumot, az abban található an;test kör irányba elkezd diffundálni. Amint az an;gén-an;test arány eléri az ideális tartományt, kicsapódnak. Szemikvan*taEv módszer.
O u c h t e r l o n y - f é l e [ 3 . ] k e M ő s immundiffúzió:
A gél középső rése az an;gént, a körülöMe található rések pedig a különböző szérumokat tartalmazzák. Ahogy az an;gén és a szérumokban található an;test egymás felé diffundál, precipitációs íveket hoznak létre. Szemikvan*taEv módszer.
Fehérje elektroforézis • Áramforrás •
+
-
Anód
Elektródák
Katód •
-
-
+ +
-
+
•
A z e l e k t r o m o s t ö l t é s s e l b í r ó molekulák, köztük a fehérjék is, elektromos erőtér hatására a töltésükkel ellentétes pólus irányába vándorolnak. A vándorlási sebességük függ: – A k ö z e g e l l e n á l l á s á t ó l (standardizálható) – Az alkalmazoM feszültségtől (standardizálható) – A f e h é r j é k m é r e t é t ő l é s töltésétől (utóbbi pH-függő) Az eltérő sebességgel futó fehérjék így fizikailag elválaszthatók. A közeg lehet: – Szilárd (pl. papír, nitrocellulóz) – Fél-folyékony (pl. agaróz vagy poliakrilamid gél) – Folyékony
Szérum protein elektroforézis •
A vérszérumot enyhén alkalikus közegben fuMatják, ilyen körülmények közöM a szérum fehérjék többsége a pozi^v elektróda felé mozdul el, láthatóvá pedig nem-specifikus fehérje festékekkel tehetők.[4.]
Albumin Minta
α1-globulinok α2-globulinok β-globulinok γ-globulinok
Arne Tiselius 1948-as Kémiai Nobel-díj: „Az elektroforézis és az adszorpciós analízis terén végzeM kutatásaiért, különös tekinteMel a szérum fehérjék k o m p l e x t e r m é s z e t é t f e l t á r ó eredményeiért.”[5.]
Szérum elektroforézis analízise Néhány példa az egyes frakciókban futó fehérjékre:[6.] • Legnagyobb frakció az albumin. ↓ • α1-globulinok: – α1-an*tripszin ↑ – Szérum amiloid A ↑ – Re;nol-kötő fehérje ↓ – Transzkor;n ↓ • α2-globulinok: – Cöruloplazmin ↑ – Angiotenzinogén Szérum elektroforézis normális – Haptoglobin ↑ mintázata és az abból készült • β-globulinok: denzitometriás diagram. – β2-mikroglobulin ↑ Gyulladásos citokinek hatására (pl. TNFα, IL-1, IL-6) az akut – Transzferrin ↓ fázis reakció során a termelésük: – Plazminogén • Növekszik (pozi^v akut fázis fehérjék, legfőbb • γ-globulinok: képviselőjük a CRP, ami a β- és a γ-frakció közöM fut[7.]) – Immunglobulinok • Csökken
Példák kóros szérum elektroforézisre I. Poliklonális gammopathia
Monoklonális gammopathia
„M” csúcs
T ö b b B - s e j t k l ó n á l t a l t e r m e l t immunglobulin többlet, valamilyen gyulladásos folyamat áll mögöMe:[7.] • Fertőzés • Autoimmun betegség • Daganat • Májbetegség (pl. hepa;;s, cirrhosis)
Egyetlen B-sejt klón által termelt immunglobulin többlet, plazmasejtes daganat áll mögöMe:[7.] • Myeloma mul;plex • Waldenström macroglobulinaemia • MGUS (Monoclonal gammopathy of undetermined significance)
Példák kóros szérum elektroforézisre II. α1-an*tripszin hiány [8.]
Csökkent α1-globulin frakció
P A S - r e a k c i ó v a l p o z i ^ v , felhalmozódoM A1AT szemcsék
α1-an*tripszin (A1AT): • Májban termelődik. • A neutrophilek által termelt elasztázt semlegesí* a gyulladásos reakciókban. α1-an*tripszin deficiencia: • Gene*kai betegség. • Nem szekretálódik, hanem a májsejtekben felhalmozódik az α1-an;tripszin. • A vérben jelentősen csökken a szintje, ami már fiatalkorban szövődményekhez vezet: • Májkárosodás (felhalmozódó A1AT miaM) • Tüdőkárosodás (hiányzó A1AT miaM a tüdőben zajló gyulladásos folyamatok fokozoMan károsítják a tüdőszövetet) • Krónikus hasnyálmirigy-gyulladás (hiányzó A1AT miaM)
Egyéb tesxolyadékok elektroforézise Liquor cerebrospinalis (CSF) Kontroll CSF Beteg CSF Kontroll szérum
A beteg esetében több, különböző csík látszik a gamma-globulin frakcióban, ami azonban eltér a szérumában található mintázaMól.
Beteg szérum albumin
γ-globulin
Vizelet elektroforézis: Myeloma mul;plex gyanúja esetén, szérum elektroforézissel egy időben végzik, a vesében kórosan filtrálódó immunglobulin könnyű láncot (Bence Jones fehérje[11.]) keresik.
Kóros immunglobulin termelődik helyileg a közpon; idegrendszerben. (oligoklonális gammopathia, pl. sclerosis mul*plex esetén[9.] ) HáMér információ: Az immunglobulinok normálisan nem jutnak át a vér-agy gáton.[10.]
Immunelektroforézis I. 1. Szérum minták elektroforézise
4. Precipitációs ívek keletkeznek
1. minta (kontroll)
2. minta (páciens)
2. An;-humán ellenanyag hozzáadása
An;-humán ellenanyag 3. Diffúzió
5. Ívek megfestése
6. Ívek összehasonlítása a kontrollal
Immunelektroforézis II.
albumin
α2-makroglobulin IgM transzferrin
IgA
IgG
A látható íveket mindig normál kontrollal hasonlítják össze.[12.] Poliklonális ellenanyagok használata esetén a formálódó ívek száma aMól függ, milyen an;-humán szérumot használnak (ló, nyúl, kecske, stb.). Monoklonális ellenanyagok segítségével egy-egy szérumfehérje specifikusan azonosítható a mintában. Szemikvan*taEv vizsgálat, a klinikai gyakorlatban ma már nem használják.
1. Poliklonális hipergammaglobulinémia (Magyarázat: (Rheumatoid arthri*s) An;-λ An;-κ Az 1. betegnél autoimmun folyamat eredményeként több B1:1 1:2 1:4 1:8 1:1 1:1 Norm. sejt klón ak;válódoM és termelt ellenanyagot, míg a 2. betegnél e g y e t l e n d a g a n a t o s k l ó n szaporodoM fel, az utódsejtek mindegyike ugyanolyan izo^pusú immunglobulint termel.) Szérum ELFO Norm.
Poliklonális iELFO 1:1
1:2
1:4
1:8
An;-IgG 1:8
1:32 1:64
An;-λ 1:1
1:4
An;-κ 1:1
2. Monoklonális gammopathia (IgG λ immunglobulint termelő myeloma mul*plex)
Immunfixáció I. 1. Több párhuzamos szérum elektroforézist végeznek ugyanabból a betegmintából.[13.] 2. Ezt követően az egyes megfuMatoM géleken an;testekkel mutatnak ki meghatározoM fehérjéket. (A hozzáadoM an;test az an;génnel precipitátumot képez, mely vagy szabad szemmel, vagy valamilyen festék hozzáadásával látható. Az an;gének az esetek többségében maguk a humán immunglobulinok.) Felhasználás: • Általában plazmasejtes daganatok diagnosz;kája a rájuk jellemző kóros monoklonális an;testek („paraprotein”) kimutatásán keresztül a szérumban.[14.]
-
An;-λ
An;-κ
An;-IgM
An;-IgA
IgG κ izo^pusú monoklonális ellenanyagot termelő myeloma mul;plex An;-IgG
+
An;-humán
Elektroforézis
„M” csúcs
Immunfixáció II. 1.
1. Normális szérum 2. Myeloma mul;plex IgG paraproteinnel 3. Waldenström macroglobulinaemia IgM paraproteinnel 4. Myeloma mul;plex IgA paraproteinnel
Körülírt csonthiányos gócok a koponyáról készült röntgenfelvételen myeloma mul;plexben.[15.]
2.
3.
4.
Rakéta immunelektroforézis +
Elektroforézis
An;test az agaróz gélben
Precipitációs ív („rakéta”)
BetöltöM an;gén
- Növekvő an;gén koncentráció
A p r e c i p i t á c i ó s í v e k távolsága az an;gének b e t ö l t é s é h e z h a s z n á l t vályútól arányos a vizsgált an*gén koncentrációjával.
Alkalmas a koncentráció meghatározására.[16.]
2D Immunelektroforézis Precipitációs ív
An;test a gélben Ag2
Ag1
Minta
Első fuMatás
Második fuMatás
• Az első elektroforézis során a mintában található fehérjék méret szerint elválnak. • A második fuMatásnál a korábban méret szerint szeparált an;géneket belefuMatják a poliklonális szérumot tartalmazó gélbe. → Precipitációs ívek jönnek létre. • A precipitációs ív helyzete a vizsgált an*gén méretével, az ív alaj terület pedig az an*gén koncentrációjával arányos.[17.]
Nefelometria, turbidimetria Az oldatban található makromolekulák (pl. immunkomplexek) a molekulatömegükkel arányosan szórják a fényt. Spektrofotométer (turbidimetria) Lencse Fényforrás Detektor (90°-os fényszórás, nefelometria)
N e f e l o m é t e r s e g í t s é g é v e l a fényszórás alapján azonosítható a vizsgált komplex, turbidimetria esetén Szemköz; pedig a küveMán átjutoM fény detektor csökkenését mérik. (nefelometria) intenzitásának [18.]
Felhasználásuk: Immunkomplexek mérése, pl. össz IgA, IgM, IgG szintek meghatározása, könnyű lánc szint mérése (pl. myeloma mul;plexben)
Agglu;náció •
• • •
Ha az an;testek nagyobb par*kulumokat (pl. sejteket, latex gyöngyöket) kötnek keresztbe, azok összecsapzódnak. = agglu*náció (ha vörösvérsejtek csapzódnak össze, akkor hemagglu*náció) Az agglu;náció az an*testek egyik éleKani funkciója is, a kórokozók agglu;nációja hátráltatja a fertőzések terjedését.[19.] Lehet direkt vagy indirekt, illetve akEv vagy passzív. Számos laboratóriumi teszt agglu;náción alapul, melyek szabad szemmel is láthatók.
An;-„A” IgM
Vörösvérsejt „A” an;génnel
Hemagglu;náció
Vércsoport meghatározás: A, Rh(D)
Az agglu;náció éleMani szerepe Epitóp
Vírus
An;test
Direkt vagy indirekt Direkt agglu*náció:
Indirekt agglu*náció:
IgM Epitópok
Baktérium
• Ugyanaz az an;test képes keresztbe kötni a par;kulumokat. • Az IgM izo^pusú an;testekre jellemző.
• Egy másodlagos an;test kö; keresztbe a részecskéket.
Ak^v vagy passzív AkEv agglu*náció:
Passzív agglu*náció:
IgM Epitópok
Baktérium
• A sejt a saját, sejxelszíni an*génjével • A reakcióban résztvevő hordozó vesz részt a reakcióban. részecskére mesterségesen van rákötve • Példa: az an*gén. • Vércsoport meghatározás • Példa: • Bakteriális sejxelszíni an;gén • Latex agglu;nációs tesztek (lásd kimutatása következő diákon)
Az agglu;náció orvosi jelentősége • • •
Az an;testek egyik éleMani funkciója, a kórokozók elleni védelem része. Bizonyos kórállapotokban (pl. autoimmun haemoly;cus anaemia, AIHA) in vivo is létrejöhet hemagglu;náció. Diagnosz;kai tesztek: – Latex agglu*nációs tesztek: • Autoimmun kórképek (autoan;testek kimutatása) • Fertőzések (kórokozó an;génjét vagy az ellene termelt an;testet mutatják ki) • Egyéb fehérjék (pl. CRP, hCG, D-dimer) kimutatása – Hemagglu*nációs tesztek: • Vércsoport meghatározás • Coombs-teszt • Hemagglu;nációs assay – Hemagglu;náció-gátláson alapuló vizsgálatok: • Vírus hemagglu;ninek azonosítása • Vírus hemagglu;nineket neutralizáló an;testek tesztelése
Latex agglu;nációs teszt Latex gyöngyök felszínére van kötve a reakcióban résztvevő an;gén/an;test.
Pozi^v Nega^v
Ha a hozzáadoM mintában jelen van a vizsgált an;test/an;gén, akkor az a gyöngyök összecsapzódását idézi elő.
Felhasználás: • Autoimmun kórképek diagnosz*kája, pl.: • Rheumatoid arthri;s (rheumatoid faktor, RF[20.]) , SLE (különböző autoan;testek) • Fertőző betegségek diagnosz*kája • Kórokozó elleni an;testek kimutatása (pl. an;-streptolizin O an;test, ASO/ AST[21.]) • Bakteriális an;gének kimutatása • Egyéb fehérjék kimutatása, pl.: • C-reakEv protein (CRP, akut fázis fehérje[22.]), D-dimer[23.] (vérrögképződés jele lehet), humán choriogonadotropin (hCG, terhességben)
Terhességi gyorsteszt Pozi^v hCG Mobilis enzimjelölt an;-hCG IgG
Nega^v Vizelet
A megtermékenyülést követően az embrió által termelt hCG megjelenik a vizeletben. A hCG számos immunológiai módszerrel (ELISA, agglu;náció) kimutatható, a gyorstesztek kromatográfián alapulnak.[24.]
KötöM an;-hCG
KötöM an;-IgG
Csík akkor jön létre, ha megkötődik az enzim-jelölt an;test. Ha nincs hCG a vizeletben, akkor ez csak a kontroll esetében következik be és egy csík látható.
Agglu;náció gyakorlat Gyakorlat menete: 1. Az asztalokon különböző latex agglu;nációs kitek vannak kihelyezve. 2. Szérumminta nincsen, csak a kithez adoM nega^v és pozi^v kontrollt vizsgáljátok. 3. A kit leírása szerint külön karikákba cseppentsetek egy-egy cseppet a nega^v és a pozi^v kontrollból is. 4. Keverjétek össze a mellékelt pálcikákkal vagy döntögessétek. 5. Kis idő elteltével a pozi^v kontrollban szemmel látható agglu;náció megy végbe.
HÚZZATOK KESZTYŰT!
[25.] Direkt Coombs-teszt (DAT ) Vérvétel
+ An;-humán immunglobulin an;test
Beteg vörösvérsejtjein kóros autoan;testek
Hemagglu;náció
In vivo hemagglu;náció AIHA-s betegben. AIHA (autoimmun haemoly;cus anaemia, anaemia=vérszegénység) Erythroblastosis foetalis (Alloimmun magza; haemoly;cus vérszegénység)
Felhasználása: Immun-mediált haemolysisek diagnosz;kája,[26.] pl.: • •
Indirekt Coombs-teszt (IAT) Recipiens széruma
+ Donor vörösvérsejtjei
+ An;-humán immunglobulin an;test
Hemagglu;náció
Felhasználás: • Vérátömlesztések elő‚ an;test szűrés[27.] (ABO és Rh melleM egyéb an;testek jelenlétét keresik a recipiens szérumában.) • Terhesgondozás során a placentán átjutó, erythroblastosist okozó Rh(D)-ellenes an;testek szűrése.[28.]
Hemagglu;nációs assay 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 Kontroll
Minden résbe ugyannyi vörösvérsejtet helyeznek, majd a mintát sorozatos feles hígításokban adják hozzájuk. PoziEv reakció esetén a vörösvérsejtek összecsapzódnak és nem tudnak lesüllyedni a rés aljára. (HA ;ter: a legkisebb hígítás, ami még agglu;nációt okoz)
Hemagglu;náció
Nega^v
• NZB: New Zealand Black egértörzs[29.] (autoimmun állatmodell) • BALB/c: albínó házi egér (kontroll)
Hemagglu;náció-inhibíciós assay Összetevők Vvt
Vvt
Vírus
Vírus
An;test
Reakció
Értékelés
Egyes vírusok olyan fehérjékkel r e n d e l k e z n e k , m e l y e k Nincs reakció s e g í t s é g é v e l i n v i t r o h e m a g g l u ; n á c i ó t t u d n a k létrehozni („hemagglu;ninek”). Pl.: Hemagglu;náció • Influenza hemagglu*nin • Kanyaró hemagglu;nin • Mumpsz hemagglu;nin H5 N1 Nincs reakció
Vvt • Az egyes hemagglu;ninek azonosítására használható módszer, gyakorla; jelentősége a vírusok an*gén-szerin* besorolása,[30.] pl.: H5N1 = 5-ös ^pusú hemagglu;nint (és 1-es ^pusú neuraminidázt) hordozó influenza vírus. • Védőoltások hatására a hemagglu;ninek ellen termelt ellenanyagok vizsgálata az oltoM egyénekben.[30.]
Hivatkozások 1. 1.
Akobeng AK1: Understanding diagnos*c tests 1: sensi*vity, specificity and predic*ve values. Acta Paediatr. 2007 Mar;96(3):338-41. 2. Mancini G, Carbonara AO, Heremans JF: Immunochemical quan*ta*on of an*gens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 1965 Sep;2(3):235-54. 3. Ouchterlony O: In vitro method for tes*ng the toxin-producing capacity of diphtheria bacteria. Acta Pathol Microbiol Scand. 1948;25(1-2):186-91. 4. Tiselius A1: Electrophoresis of serum globulin: Electrophore*c analysis of normal and immune sera. Biochem J. 1937 Sep;31(9):1464-77. 5. Nobelprize.org: The Nobel Prize in Chemistry 1948 (hMp://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/ laureates/1948/) 6. Jain S1, Gautam V, Naseem S: Acute-phase proteins: As diagnos*c tool. J Pharm Bioallied Sci. 2011 Jan; 3(1):118-27. doi: 10.4103/0975-7406.76489. 7. O'Connell TX1, Horita TJ, Kasravi B: Understanding and interpre*ng serum protein electrophoresis. Am Fam Physician. 2005 Jan 1;71(1):105-12. 8. Stoller JK1, Aboussouan LS: Alpha1-an*trypsin deficiency. Lancet. 2005 Jun 25-Jul 1;365(9478):2225-36. 9. Link H1, Huang YM: Oligoclonal bands in mul*ple sclerosis cerebrospinal fluid: an update on methodology and clinical usefulness. J Neuroimmunol. 2006 Nov;180(1-2):17-28. Epub 2006 Sep 1. 10. AbboM NJ1, Patabendige AA, Dolman DE, Yusof SR, Begley DJ: Structure and func*on of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 2010 Jan;37(1):13-25. doi: 10.1016/j.nbd.2009.07.030. Epub 2009 Aug 5. 11. Marshall T1, Williams KM: Electrophore*c analysis of Bence Jones proteinuria. Electrophoresis. 1999 Jun; 20(7):1307-24.
Hivatkozások 2. 12. Csako G1: Immunoelectrophoresis: a method with many faces. Methods Mol Biol. 2012;869:339-59. doi: 10.1007/978-1-61779-821-4_28. 13. Csako G1: Immunofixa*on electrophoresis for iden*fica*on of proteins and specific an*bodies. Methods Mol Biol. 2012;869:147-71. doi: 10.1007/978-1-61779-821-4_13. 14. Rajkumar SV1, Kyle RA1: Protein electrophoresis and immunofixa*on for the diagnosis of monoclonal gammopathies. JAMA. 2014 Nov 26;312(20):2160-1. doi: 10.1001/jama.2014.8237. 15. Vincent Rajkumar S1: Mul*ple myeloma: 2014 Update on diagnosis, risk-stra*fica*on, and management. Am J Hematol. 2014 Oct;89(10):999-1009. doi: 10.1002/ajh.23810. 16. Walker JM 1 : Rocket immunoelectrophoresis. Methods Mol Biol. 1984;1:317-23. doi: 10.1385/0-89603-062-8:317. 17. Walker JM1: Two-dimensional (crossed) immunoelectrophoresis. Methods Mol Biol. 1988;3:299-310. doi: 10.1385/0-89603-126-8:299. 18. Mali B1, Armbruster D, Serediak E, OMenbreit T: Comparison of immunoturbidimetric and immunonephelometric assays for specific proteins. Clin Biochem. 2009 Oct;42(15):1568-71. doi: 10.1016/ j.clinbiochem.2009.06.016. Epub 2009 Jun 26. 19. Cooper NR, Nemerow GR: The role of an*body and complement in the control of viral infec*ons. J Invest Dermatol. 1984 Jul;83(1 Suppl):121s-127s. 20. Anuradha V1, Chopra A: In the era of nephelometry, latex agglu*na*on is s*ll good enough to detect rheumatoid factor. J Rheumatol. 2005 Dec;32(12):2343-4. 21. Kodama T1, Ichiyama S, Morishita Y, Fukatsu T, Shimokata K, Nakashima N: Determina*on of an*streptolysin O an*body *ter by a new passive agglu*na*on method using sensi*zed toraysphere par*cles. J Clin Microbiol. 1997 Apr;35(4):839-42. 22. Komoriya T1, Terashima Y, Ogawa M, Moriyama M, Kohno H: Development of a high-sensi*vity latex reagent for the detec*on of C-reac*ve protein. J Immunol Methods. 2011 Oct 28;373(1-2):63-6. doi: 10.1016/j.jim.2011.08.001. Epub 2011 Aug 26.
Hivatkozások 3. 23. Froehling DA1, Elkin PL, Swensen SJ, Heit JA, Pankratz VS, Ryu JH: Sensi*vity and specificity of the semiquan*ta*ve latex agglu*na*on D-dimer assay for the diagnosis of acute pulmonary embolism as defined by computed tomographic angiography. Mayo Clin Proc. 2004 Feb;79(2):164-8. 24. Braunstein GD1: The long gesta*on of the modern home pregnancy test. Clin Chem. 2014 Jan;60(1): 18-21. doi: 10.1373/clinchem.2013.202655. Epub 2013 Sep 11. 25. Zantek ND1, Koepsell SA, Tharp DR Jr, Cohn CS: The direct an*globulin test: a cri*cal step in the evalua*on of hemolysis. Am J Hematol. 2012 Jul;87(7):707-9. doi: 10.1002/ajh.23218. Epub 2012 May 6. 26. Barcellini W1: Immune Hemolysis: Diagnosis and Treatment Recommenda*ons. Semin Hematol. 2015 Oct;52(4):304-12. doi: 10.1053/j.seminhematol.2015.05.001. Epub 2015 May 19. 27. Bri;sh CommiMee for Standards in Haematology1, Milkins C, Berryman J, Cantwell C, EllioM C, Haggas R, Jones J, Rowley M, Williams M, Win N: Guidelines for pre-transfusion compa*bility procedures in blood transfusion laboratories. Bri*sh CommiKee for Standards in Haematology. Transfus Med. 2013 Feb; 23(1):3-35. doi: 10.1111/j.1365-3148.2012.01199.x. Epub 2012 Dec 6. 28. Abbey R1, Dunsmoor-Su R: Cost-benefit analysis of indirect an*globulin screening in Rh(D)-nega*ve women at 28 weeks of gesta*on. Obstet Gynecol. 2014 May;123(5):938-45. doi: 10.1097/AOG. 0000000000000224. 29. Yoshida S1, Castles JJ, Gershwin ME: The pathogenesis of autoimmunity in New Zealand mice. Semin ArthriHs Rheum. 1990 Feb;19(4):224-42. 30. Pedersen JC1: Hemagglu*na*on-inhibi*on assay for influenza virus subtype iden*fica*on and the detec*on and quan*ta*on of serum an*bodies to influenza virus. Methods Mol Biol. 2014;1161:11-25. doi: 10.1007/978-1-4939-0758-8_2.
