27
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Transformasi genetik Oryza sativa L. dengan gen MaMt2 Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare dilakukan menggunakan eksplan yang berupa kalus skutella yang diperoleh dari biji padi (mature seeds). Kalus ini diperoleh dari skutella yang ditumbuhkan pada media induksi kalus yaitu 2N6 yang mengandung zat pengatur tumbuh (ZPT) 2.4 D dengan konsentrasi 2.0 mg/L. 2,4 D merupakan salah satu zat pengatur tumbuh yang digunakan secara luas untuk menginduksi kalus (Toki et al. 2006; Hiei dan Komari 2008; Wanichanan et al. 2010). Kalus mulai terbentuk pada hari ketiga untuk kultivar Kasalath dan Nipponbare, hal ini sesuai dengan yang dilakukan oleh Toki et al. (2006), penggunaan 2,4 D konsentrasi 2.0 mg/L pada proses induksi kalus dari biji padi Kasalath, menunjukkan diferensiasi sel (kalus) mulai terbentuk pada hari ketiga. Kalus yang dapat ditransformasi minimal berumur 3 4 minggu, dengan penampakan fisik kalus berbentuk butiran globular berwarna kuning muda cerah dengan ukuran > 3 mm (Gambar 8).
Gambar 8 Tahapan induksi kalus dari biji Oryza sativa L. kultivar Kasalath pada media 2N6 yang diperkaya dengan zat pengatur tumbuh (ZPT) 2.4 D, A. biji Oryza sativa L. (gabah), B. biji padi Kasalath. ditanam dalam media 2N6. C. kalus berumur ± 2 minggu dengan ukuran 3 mm, D. kalus berumur 1 bulan dengan ukuran > 3 mm. Penggunaan eksplan yang berupa kalus dari biji (mature seed) pada transformasi genetik Oryza sativa L. dengan perantara A. tumefaciens, memiliki beberapa kelebihan yaitu lebih mudah dilakukan karena dapat diproduksi dalam jumlah yang banyak dan selalu tersedia setiap waktu di laboratorium (Hiei dan Komari 2008).
28
Kalus-kalus yang akan ditransformasi sebelumnya disubkultur pada media baru selama tiga hari dalam kondisi terang, yang bertujuan menyegarkan kalus sehingga kualitas kalus tetap bagus untuk proses transformasi. Kualitas kalus merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan transformasi dan regenerasi tanaman (Kyozuka dan Shimamoto 1991). Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare dilakukan dengan perantara bakteri A. tumefaciens LB4404 yang mengandung plasmid pIG6-SMt2 yang membawa gen MaMt2. Penggunaan bakteri A. tumefaciens sebagai perantara dalam transformasi genetik dilakukan berdasarkan kemampuan bakteri ini dalam mentransfer T-DNAnya. Selain itu, bakteri A. tumefaciens memiliki efisiensi transformasi yang tinggi. Bakteri A. tumefaciens dapat mengintegrasikan sejumlah kecil dari copy T-DNA ke dalam kromosom, dapat mentransfer segmen DNA yang relatif besar dan sedikit mengalami perubahan selama proses transformasi (Hie dan Komari 2008). Kokultivasi dilakukan dengan perendaman eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens yang diperkaya dengan senyawa asetosiringon selama 2-5 menit, yang selanjutnya eksplan dikeringkan dan ditanam pada media kokultivasi padat selama 3 hari dalam kondisi gelap dengan suhu 28οC. Teknik perendaman merupakan teknik yang umum digunakan untuk infeksi dalam proses transformasi genetik (Hong et al. 2007; Li et al. 2007; Hiei dan Komari 2008; Sharma et al. 2009). Penambahan asetosiringon pada media kokultivasi padat maupun cair berfungsi untuk menginduksi A. tumefaciens agar dapat menginfeksi kalus dan mentransfer T-DNA A. tumefaciens ke kromosom tanaman padi. Senyawa ini meningkatkan ekspresi gen vir sehingga dapat meningkatkan frekuensi transformasi. Gen virA dari A. tumefaciens aktif menginfeksi pada kondisi pH asam, adanya senyawa fenolik seperti asetosiringon serta golongan monosakarida yang memiliki efek sinergi dengan senyawa fenolik (Ankenbauer et al. 1990; Winans 1992). Salah satu faktor penentuan keberhasilan transformasi genetik padi menggunakan eksplan kalus adalah mencegah terjadinya pertumbuhan berlebihan dari bakteri A. tumefaciens atau overgrowth. Pertumbuhan berlebih dari A. tumefaciens menyebabkan persentase kalus transforman menurun dratis, yang mana untuk mengatasi overgrowth bakteri A. tumefaciens pada kalus dilakukan pencucian kalus dengan antibiotik cepotaxime. Antibiotik cepotaxime berfungsi untuk membunuh bakteri A. tumefaciens, namun penggunaan cepotaxime dengan konsentrasi tinggi dan dalam durasi yang lama bersifat toksik pada kalus padi. Kalus menjadi mencoklat dan pada akhirnya mengalami kematian setelah dicuci dengan cepotaxime, pada penelitian ini selain antibiotik cepotaxime juga digunakan antibiotik carbecillin yang memiliki fungsi yang sama yaitu membunuh bakteri A. tumefaciens (Hie dan Komari 2008). Penggunaan antibiotik cepotaxime dan carbecillin untuk membunuh bakteri A. tumefaciens pada saat pencucian kalus setelah tahapan ko-kultivasi maupun pada media seleksi menurunkan persentase kalus yang ditransformasi. Untuk mencegah terjadinya overgrowth bakteri A. tumefaciens, nilai OD600 dari kultur bakteri A. tumefaciens yang digunakan harus kecil yaitu 0.01 dan perendaman kalus dilakukan selama 2-5 menit. Teknik ini terbukti mencegah terjadinya
29
overgrowth dari bakteri A. tumefaciens, sehingga tidak diperlukan pencucian kalus setelah ko-kultivasi. Tahap seleksi pada proses penelitian ini, dilakukan sebanyak dua tahapan dengan penggunaan konsentrasi antibiotik higromisin secara bertingkat. Untuk seleksi tahap pertama, konsentrasi antibiotik higromisin yang digunakan adalah sebesar 20 mg/L selama dua puluh hari, dimana setiap sepuluh hari disubkultur di media baru yang mengandung antibiotik dengan konsentrasi yang sama. Kalus yang dapat bertahan dan berproliferasi memiliki warna kuning cerah atau pucat dan berbentuk seperti butiran pasir kering (Hiei dan Komari 2008). Pada seleksi kedua, konsentrasi higromisin dinaikkan menjadi 30 mg/L selama lima-sepuluh hari. Hal ini, sama dengan yang dilakukan oleh Lin dan Zhang (2005) menggunakan higromisin 30 mg/L untuk seleksi kalus transforman pada padi indica. Kalus yang bertahan pada media seleksi ini jumlahnya lebih sedikit dibandingkan pada seleksi pertama. Penggunaan konsentrasi antibiotik higromisin yang bertingkat dilakukan untuk mendapatkan kalus-kalus transforman yang stabil (Anggraito 2012). Menurut Kyozuka dan Shimamoto (1991), seleksi higromisin dengan konsentrasi 30 mg/L sebanyak dua kali yang terbagi atas seleksi pertama dan kedua menjamin bahwa tunas yang diperoleh adalah transforman. Penggunaan antibiotik higromisin B (Hm) sebagai penanda seleksi pada kalus-kalus transforman sangat efektif dan popular pada tanaman, terutama pada transformasi padi dibandingkan dengan penanda seleksi Kmr (nptII) (Kyozuka dan Shimamoto 1991; Hiei dan Komari 2008). Higromisin berfungsi juga sebagai gen reporter, dimana mekanisme higromisin adalah memblok translokasi dari asam amino menjadi peptida, yang diinaktifkan oleh phosphotransferase. Proses kokultivasi dan seleksi kalus transforman pada media higromisin dengan konsentrasi bertingkat 20 mg/L (Gambar 9b) dan 30 mg/L (Gambar 9c).
Gambar 9 Tahapan kokultivasi dan seleksi kalus transforman pada media seleksi higromisin dengan konsentrasi bertingkat yaitu 20 – 30 mg/L. A. kalus ditumbuhkan pada media kokultivasi 2N6 yang diperkaya asetosiringon B. kalus-kalus yang ditumbuhkan pada media seleksi higromisin dengan konsentrasi 20 mg/L. C. kalus-kalus yang dapat bertahan dan berproliferasi selanjutnya ditumbuhkan pada media seleksi higromisin dengan konsentrasi 30 mg/L. Kalus-kalus transforman yang diperoleh selanjutnya diregenerasi pada media regenerasi tanpa higromisin, hal ini sesuai dengan Kyozuka dan Shimamoto
30
(1991), karena penambahan higromisin pada media regenerasi menyebabkan menurunnya kemampuan kalus untuk beregenerasi. Di media regenerasi dengan higromisin bintik-bintik atau bercak hijau yang muncul pada kalus mengalami perubahan warna menjadi coklat dan pembentukan tunas terhambat yang akhirnya kalus mengalami kematian. Tunas-tunas transgenik putatif tumbuh dari bercakbercak hijau yang terdapat di kalus, setelah 3 - 4 minggu di media 2N6R. Tunastunas ini selanjutnya dipindahkan pada media pengakaran (2N6F) tanpa higromisin sampai terbentuk akar dan selanjutnya siap diaklimatisasi (Gambar 10). Faktor penentu keberhasilan regenerasi kalus transforman adalah subkultur terjadwal setiap minggu dan penggunaan media yang segar, hal ini sesuai dengan Kyozuka dan Shimamoto (1991).
Gambar 10 Proses regenerasi dari kalus-kalus transforman pada media regenerasi (2N6R) dan pengakaran (2N6F) hingga terbentuk planlet dan siap untuk diaklimatisasi. A. terbentuknya bercak hijau pada kalus transforman setelah 1-2 minggu disubkultur pada media regenerasi (2N6R ). B. pembentukan tunas dari kalus transforman. C. plantlet cv Kasalath hasil transformasi pada media pengakaran (2N6F). D. plantlet cv Nipponbare hasil transformasi pada media pengakaran (2N6F). E. adaptasi planlet (aklimatisasi). F. padi cv Nipponbare hasil transformasi berumur 6 bulan.
31
Berdasarkan hasil seleksi kalus, efisiensi transformasi Oryza sativa L. kultivar Kasalath adalah sebesar 14.04%, sedangkan untuk Oryza sativa L. kultivar Nipponbare adalah sebesar 19.39% (Lampiran 10). Efisiensi transformasi pada Oryza sativa L. kultivar Nipponbare lebih tinggi dibandingkan pada kultivar Kasalath, yang menunjukkan bahwa efisiensi transformasi sangat dipengaruhi oleh genotipe tanaman. Kalus Nipponbare lebih mudah untuk ditransformasi dan menghasilkan tunas yang lebih tinggi daripada kalus Kasalath (Hiei dan Komari 2008). Umumnya transformasi genetik pada Oryza sativa L. kultivar japonica relatif lebih mudah dibandingkan kultivar indica. Kalus dari kultivar indica sering menjadi coklat dan mengalami kematian (Rashid et al. 1996; Nandakumar et al. 2007; Karthikeyan et al. 2011). Untuk kultivar padi yang rekalsitran, seperti padi indica beberapa modifikasi komposisi medium perlu dilakukan atau memerlukan kondisi kultur tertentu (Kyozuka dan Shimamoto 1991). Selain itu, pertumbuhan A. tumefaciens yang berlebihan pada kalus menyebabkan kematian, dan akhirnya ini mempengaruhi efisiensi transformasi. Oleh sebab itu seleksi dilakukan secara bertahap. Pada penelitian ini seleksi dilakukan dua tahap seperti yang dilakukan oleh Hiei dan Komari (2008). Data jumlah eksplan Oryza sativa L. pada proses transformasi dan seleksi, dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6 Perkembangan jumlah eksplan Oryza sativa transformasi dan seleksi
Galur tanaman Kasalath Nipponbare
Jumlah eksplan yang ditanam 235 165
Seleksi I (2NBKC, 20 Mg/L) Kalus Hidup Mati 100 135 75 90
L. selama proses
Seleksi II (nN6C, 30 Mg/L) Kalus Hidup Mati 33 67 32 43
Transformasi genetik pada Oryza sativa L. memiliki efisiensi transformasi yang bervariasi yaitu padi japonica sebesar 23% (Chan et al. 1993), 27% (Aldemita dan Hodges 1996), 3.8% - 38% (Nishizawa et al. 1999), sedangkan untuk padi indica sebesar 22% (Rashid et al. 1996), 5.6 - 6.2% (Arockiasamy dan Ignacimuthu 2007), 2.0% - 7.6% (Nandakumar et al. 2007), dan 9.33% (Karthikeyan et al. 2011). Hasil ini menunjukkan bahwa padi indica bersifat rekalsitran dan sulit untuk ditransformasi (Zhang et al. 1998; Lin dan Zhang 2005). Efisiensi regenerasi dari kalus transforman Oryza sativa L. kultivar Kasalath adalah sebesar 14.04%, dan untuk kultivar Nipponbare sebesar 19.39% (Lampiran 11). Efisiensi regenerasi Oryza sativa L. disajikan pada Tabel 7. Kemampuan regenerasi dari kalus transforman sangat dipengaruhi oleh kondisi kultur kalus, komposisi media regenerasi seperti zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan, dan subkultur media secara rutin dan teratur hingga tunas terbentuk. Komposisi media regenerasi yang tepat menjadi faktor utama dalam regenerasi tanaman. Selain itu, kemampuan regenerasi juga dipengaruhi oleh genotipe tanaman, padi subspesies japonica relatif lebih mudah beregenerasi dibandingkan padi indica (Zhang et al. 1998; Lin dan Zhang 2005; Hiei dan Komari 2008).
32
Tabel 7 Regenerasi Oryza sativa L. dari kalus transgenik Jumlah eksplan
Jumlah eksplan bertunas
Jumlah tunas
% eksplan bertunas
Kasalath
33
2
2
6.06%
Nipponbare
32
9
9
28.1%
Galur tanaman
4.2 Analisis Tanaman Transgenik 4.2.1 Uji integrasi transgen MaMt2 pada Oryza sativa L. Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare menghasilkan beberapa tunas tanaman transgenik putatif dan berhasil diaklimatisasi sampai menghasilkan biji. Untuk kultivar Kasalath menghasilkan 2 tanaman transgenik putatif dan untuk kultivar Nipponbare menghasilkan 9 tanaman transgenik putatif. Analisis PCR dari 11 tanaman transgenik putatif menunjukkan bahwa 2 dari 11 tanaman transgenik putatif tersebut adalah transgenik yang dianalisis dengan primer UbiQF-SMt2R dan SMt2F-NosTR (Gambar 11). Tanaman transgenik ini selanjutnya disebut TK01 (kultivar Kasalath transgenik generasi nol galur 1) dan TN01 (kultivar Nipponbare transgenik generasi nol galur 1). PCR dengan menggunakan primer UbiQF-SMt2R terhadap tanaman P1 menghasilkan amplikon berukuran 960 pb (Gambar 11a). Ukuran amplikon ini sesuai dengan ukuran DNA dari primer UbiQF yang terdapat pada promoter Ubiquitin, dan primer SMt2R yang terdapat pada gen MaMt2. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman TK01 adalah transgenik yang mengandung transgen MaMt2 utuh dibawah kendali promoter pUbiquitin dan terminator NosT. Sedangkan untuk tanaman Nipponbare transgenik TN0 1 dikonfirmasi dengan PCR yang menggunakan primer SMt2F-NosTR. Hasil PCR adalah amplikon sebesar sekitar 526 pb yang sesuai dengan ukuran daerah antara Mt2 dan terminator Nos (Gambar 11b), yang menunjukkan bahwa tanaman TN01 mengandung transgen Mt2 dan terminator Nos. Untuk dapat diekspresikan gen Mt2 harus dikendalikan oleh suatu promotor dan promotor ubiquitin merupakan promotor yang mengendalikan ekspresi pada tingkat yang tinggi. Untuk tanaman padi transgenik yang mengandung transgen MaMt2 dan Nos harus dikonfirmasi dengan primer UbiQF-SMt2R yang mengamplifikasi dari daerah promotor sampai dengan akhir gen MaMt2. Analisis terhadap tanaman padi non transgenik menunjukkan bahwa PCR dengan menggunakan pasangan primer UbiQF-SMt2R dan SMt2F-NosTR tidak menghasilkan amplikon (Gambar 11a dan 11b). Hasil PCR terhadap tanaman non transgenik menunjukkan bahwa pasangan primer UbiQF-SMt2R dan SMt2FNosTR tidak dapat mengamplifikasi Mt2 endogen dari padi, sehingga bersifat spesifik untuk mengamplifikasi transgen MaMt2. Kedua pasangan primer ini juga
33
tidak bisa mengamplifikasi Mt2 endogen dari kedelai, tembakau dan jatropa (Anggraito 2012; Siregar 2012). PCR dengan primer Actin, baik tanaman transgenik TK01, TN01 dan non transgenik menghasilkan amplikon sekitar 109 pb (Gambar 11c) yang menunjukkan bahwa DNA yang diisolasi dari kedua tanaman tersebut, yaitu P1, P2 dan non transgenik mempunyai kualitas dan kuantitas yang baik.
Gambar 11 Hasil analisis PCR DNA tanaman Oryza sativa L. (a) cv. Kasalath transgenik T0. dengan primer gen spesifik yaitu UbiQF dan SMt2R. M = marker 1 Kb ladder; 1 = plasmid pIG6-MaMt2; 2 = cv Kasalath tipe liar (WT); 3 = Kasalath transgenik T0 . (b) cv Nipponbare transgenik T0. dengan primer gen spesifik yaitu SMt2F dan NosTR. M = Marker 1 Kb ladder; 1= plasmid pIG6-MaMt2; 2 = Nipponbare tipe liar (WT); 3 = Nipponbare transgenik T 0. (c) dengan primer gen internal aktin padi (3’UTR Actin). M = marker 100 bp; 1 = Kasalath non transgenik (WT); 2 = Nipponbare non transgenik (WT); 3 = Kasalath transgenik T0; 4 = Nipponbare transgenik T0. Pada penelitian ini, biji padi dari tanaman padi non transgenik yang ditanam pada media N6 yang mengandung higromisin 30 mg/L, hanya berkecambah saja kemudian mati, sedangkan biji T1 dari tanaman transgenik putatif kultivar Kasalath dapat berkecambah dan tumbuh di media yang mengandung higromisin (Gambar 12). Hasil menunjukkan bahwa tanaman padi non transgenik tidak memiliki ketahanan terhadap antibiotik higromisin pada konsentrasi yang digunakan untuk menyeleksi kalus transgenik. Tanaman transgenik yang diperoleh yaitu TK01, dan TN01 dapat digunakan sebagai sumber transgen MaMt2 untuk dipindahkan kedalam tanaman padi yang mempunyai sifat agronomis yang baik. Proses pemindahan transgen MaMt2 dari tanaman transgenik ini dilakukan dengan persilangan terhadap varietas sasaran yang diikuti dengan silang balik (Back Cross). Proses pemindahan gen mudah dilakukan pada gen yang jumlah salinannya tunggal. Untuk itu tanaman transgenik harus diseleksi sehingga tanaman transgenik yang mempunyai salinan tunggal dapat diperoleh. Analisis jumlah salinan gen sasaran dapat dilakukan dengan hibridisasi southern. Selain itu, agar semua keturunan adalah transgenik, maka tanaman ini harus dalam keadaan homozigot. Untuk mendapatkan tanaman
34
homozigot, tanaman ini dibiarkan menyerbuk sendiri. Hasil silang sendiri diseleksi dengan higromisin, dan keturunan yang tidak bersegresi untuk sifat toleransi terhadap higromisin adalah transgenik homozigot.
Gambar 12 Kontrol positif dan kontrol negatif biji Oryza sativa L. pada media seleksi dilakukan selama 16 hari, A. biji padi cv Nipponbare ditumbuhkan pada media 2N6RH30, B. biji padi cv Nipponbare ditumbuhkan pada media regenerasi (2N6R) tanpa higromisin, C. biji padi Kasalath ditumbuhkan pada media 2N6RH30, D. biji padi Kasalath ditumbuhkan pada media (2N6R) tanpa higromisin, E. biji T1 dari kultivar Kasalath transgenik T0 ditumbuhkan pada media 2N6RH30.
