Základy interpretace MS spekter získaných měkkými ionizačními technikami
Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Pravidlo sudého počtu elektronů v (kvazi)molekulárním iontu a fragmentech EE → EE+ → EE+ + N nebo
EE → EE- → EE- + N narozdíl od EI techniky dochází k následujícím procesům v případě měkké ionizace jen výjimečně !
EE nebo
EE+
→ OE+. → OE+. +R.
Double bond equivalent (DBE) = Saturation index (R+DB) DBE = x - 1/2y +1/2z +1 kde x je počet uhlíků (přesněji a obecně čtyřvazných atomů, např. Si), y je počet vodíků (přesněji a obecně jednovazných atomů,např. halogenů, tedy F, Cl, Br, I), z je počet dusíků (přesněji a obecně trojvazných atomů, např. P) poznámka 1: počet atomů kyslíku a síry ve výpočtu nefiguruje (poznámka 2: pro EE+ dostáváme neceločíselné hodnoty)
Dusíkové pravidlo pro ionty EE+ (vznikající měkkou ionizací téměř výhradně) platí, že pokud mají lichou hodnotu m/z obsahují sudý počet atomů dusíku (0, 2, 4, 6,…)
toto pravidlo platí pro běžné prvky v organických látkách (C, H, N, O, S, P, Si, F, Cl, Br, I)
toto pravidlo je tedy obrácené ve srovnání s technikou EI !
Základní pravidla interpretace ESI/APCI spekter 1.
Téměř výhradě vznikají ionty se sudým počtem elektronů, EE+. Případný vznik iontů s lichým počtem elektronů není běžný a je třeba se jej vždy pokusit zdůvodnit, může k němu docházet např. u organokovů a polyaromátů; k záchytu elektronu a vzniku M-. může dojít u nitrolátek, apod.
2.
Fragmentace bývá méně rozsáhlá než v případě EI techniky. Poměrně často spektrum prvního stupně obsahuje pouze molekulární adukty a/nebo (de)protonované molekuly, tj. fragmenty nemusí být přítomny prakticky vůbec.
3.
Fragmentaci je možno vyvolat technikou CID (Collision Induced Dissociation).
4.
Knihovny ESI/APCI spekter obdobné EI knihovnám neexistují. Jen pro některé skupiny látek platí výjimky, např. v oblasti proteomiky (peptidy). Pro interpretaci fragmentů je třeba mít zkušenosti, využít literaturu nebo naměřit spektra většího počtu podobných látek se známou strukturou.
Obecný postup interpretace ESI/APCI spekter 1. Při interpretaci spektra je vhodné začít určením kvazimolekulárního iontu a tedy (sekundárně) molekulové hmotnosti neznámé látky. K tomu je třeba vyhledat ve spektru vzájemně související ionty, adukty, např. vedle iontu [M+H]+ (v pozitivním modu) i ionty typu, [M+Na]+, [M+K]+. Navíc ve spektru mohou být přítomny také adukty se solventem, např. [M+H+methanol]+ nebo zdvojené molekuly [2M+H]+, [2M+Na]+. Často mají některé uvedené adukty malou až velmi malou intenzitu, ale pro zjištění molekulové hmotnosti je jejich přítomnost ve spektru velmi důležitá, protože tyto adukty většinou poskytuje jen molekula a ne fragmenty. Adukt [M+Na]+ bývá nejintenzivnější. Při měření v negativním modu mohou být vedle iontů [M-H]- přítomny také ionty [M+Cl]-, [M+HCOO]-, [M+CH3COO]-, apod. Typ a relativní zastoupení jednotlivých aduktů je velmi silně závislé na složení solventu/mobilní fáze užité k měření MS spekter (na poměru organické a vodné složky, na koncentraci solí, apod.).
Obecný postup interpretace ESI/APCI spekter - pokračování 2. Aplikace dusíkového pravidla s předpokladem výhradního vzniku iontů se sudým počtem elektronů, EE+.
3. Zjištění přítomnosti “M+2“ prvků, především Cl a Br, odhad jejich počtu v molekule, pak podobně odhad pro S a Si.
4. Vždy je třeba uvážit, zda pozorované ionty nepocházejí z pozadí nebo paměťového efektu, to platí jak pro měření přímým vstupem, tak pro techniku LC-MS. Při LC-MS je důležité ověřit, zda jednotlivé ionty ve spektru pochází z jedné látky či nikoliv, a sice extrahováním vybraných iontů z chromatogramu a porovnáním poloh maxim píků.
5. Měření CID spekter. Interpretace fragmentů na základě znalostí, zkušeností, případně využití pomocných interpretačních programů.
6. Vyhodnocení všech získaných informací, včetně dat z jiných detektorů při LC-MS měřeních, chování látky na koloně a včetně informací od zadavatele analýzy. Pokus o návrh struktury neznámé látky.
7. V ideálním případě porovnání retenčního chování a spekter identifikované látky s identickým standardem.
MS techniky a jejich aplikace při zjišťování identity neznámých látek Ukázky skutečných řešených praktických případů
Finding Substitute Active Pharmaceutical Ingredients in Counterfeit Medicines LCGC-Europe, 21, 2008, 84
MS dnes v oblasti farmaceutického průmyslu patří k hlavním metodám užívaným pro analýzu léčiv Nejdůležitějším úkolem MS je zde identifikace a charakterizace nových chemických individuí MS má také své velmi důležité místo při odhalování falešných léčiv na trhu
The World Health Organization (WHO) defines counterfeit medicines as: Those medicines that are deliberately and fraudulently mislabelled with respect to identity and/or source. Counterfeiting can apply to both branded and generic products. Counterfeit products may include products with the correct ingredients or with the wrong ingredients, without active ingredients, with insufficient active ingredient, or with fake packaging.
1. Případ, kdy je podvržena aktivní látka konkrétní případ léku proti malárii Obecně platí, že podvržená aktivní látka musí být relativně levná a komerčně dostupná, ale na druhou stranu nemusí být nutně obsažená v knihovnách a databázích Obecně vhodné MS techniky: přímý vstup, GC, LC – následně s tím souvisí volba ionizační techniky, EI, CI, ESI, APCI, DESI atd. možnost využití MS-MS a měření přesné a správné hmotnostizjištění elementárního složení (FT-ICR, Q-Tof, Orbitrap)
Jako nejvhodnější přístup se ukazuje LC ve spojení s MS(-MS) poskytující informaci o elementárním složení (a fragmentaci) podvrženého analytu: - separace složek od pomocných látek (excipients) - omezení problému s potlačením ionizace - možnost zapojení dalších detektorů v sérii s MS (např. DAD) - informace o chromatografických a tedy některých fyzikálních vlastnostech látky
1. Aplikace generické LC-MS-ES+ metody: kolona RP; krátký ~10min gradient; 1,8 um sorbent; 0,05mol/l octan amonný ve vodě a acetonitrilu
2. Aktivní složka měla mít [M+H]+ m/z nominální 500, ve skutečnosti [M+H]+ bylo 152 a je navíc přítomen adukt s acetonitrilem, m/z 193, ten svědčí pro molekulu 151.
3. v chromatogramu nebyl žádný další výrazný pík ani signál m/z 500 4. následovalo měření správné a přesné hmotnosti na Q-TOF ke zjištění elementárního složení, zjištěná hmotnost byla m/z 152.0679
SW prostředky a přístup k vyhodnocení informace o naměřené hmotnosti Podstatné aspekty - zastoupení prvků v neznámém analytu, možnost omezení na nejčastější prvky v léčivech: C, H, O, N, (Cl, Br, F, S,...) - vyhodnocení iontového klastru->přítomnost/nepřítomnost některých prvků, např. Cl, Br, S, kov… - úvaha o možnostech instrumentu, rozlišení a míře správnosti měření hmotnosti=> volba vhodných limitů; pro Q-TOF ~2-5ppm(10ppm), pro ICR-FR a Orbitrap ~1ppm; vhodné nastavení těchto parametrů má kritický význam!
Výchozí bod - předpoklad možné přítomnosti C, H, N, O, F(3), S(1), Cl, Br ⇒ kombinace zjištěné správné hmotnosti s tvarem klastru vedla k vyloučení Br a Cl a za tolerance do 5 mDa bylo získáno 6 kombinací/možných elementárních složení; (rozšíření na 10 mDa by dalo 8 možností)
-0.5
-1.5
Mlčky se v prvním přiblížení počítá s tím, že vznikají ionty se sudým počtem elektronů, ale pozor např. fotoionizace může poskytovat i ionty s lichým počtem elektronů Jak vybrat ze 6 kombinací jednu - tu správnou? - hledání elementárních složení v Merck Index(u) a CAS (Chemical Abstracts) -> může vést k acetaminofenu (paracetamol), C8H9NO2, ale pro vyšší molekulové hmotnosti je uvedený postup hledání v Merck Indexu a CAS málo efektivní - obecně je vhodnější detailně prozkoumat tvar iontového klastru, odhad počtu C v iontu (1,1% 13C) - zde je poměr iontu m/z 153 ku 152 ~10% (přitom nejistota ve velikosti klastru je přibližně 15% ), tedy v iontu [M+H]+ je 8 až 10 C, a to je v souladu s C8H9NO2, kromě toho iontový klastr není v souladu s případnou přítomností síry (32S:33S:34S, 100:1:4), ale zde pozor, pro vyšší molekulové hmotnosti je třeba uvažovat i přítomnost 2 13C. - Nakonec je ideální provést porovnání chromatografického a MS chování neznámé látky s chováním standardu, tj. porovnat retenční časy a MS spektra včetně fragmentace, viz dále
také je možno na MS-MS instrumentu fragmentovat [M+H]+ ion a měřit správné hmotnosti produktových iontů, fragmentů, to je zásadní hlavně pro látky s vyšší molekulární hmotností opět se předpokládá vznik sudo-elektronových iontů, tedy neutrální ztráta, ale je nutno být připraven i na alternativu lichou zde pro sudo-elektronové ionty za tolerance 10mDa existuje 5 kombinací pro fragment o nominální hodnotě m/z 110
1.3
11.8
-0.5
-2.7
-24.5
3.5
-3.8
-34.5
-0.5
4.9
44.5
-0.5
-9.9
-90.0
-0.5
Ale jen dvě kombinace jsou z chemického hlediska “rozumné”, a to C6H8NO a C3H9NO2F; nicméně dále je třeba vzít v úvahu i DBE (změna DBE by měla být malá vzhledem k prekurzorovému iontu, při fragmentaci byla pozorována jen malá ztráta, 42), tuto podmínku dobře splňuje pouze C6H8NO;
kromě toho je také vidět rozumná souvislost s prekurzorovým iontem C8H10NO2, který ztratil C2H2O, což je běžná ztráta dále jsou jasné také minimální počty některých atomů v prekurzorovém iontu m/z 152, musí v něm být nejméně jeden atom N a nejméně jeden atom O (pokud se jedná o dusík, je tomu tak kvůli sudé hodnotě prekurzorového iontu 152 a současně sudému fragmentu 110; pokud jde kyslík je tomu tak proto, že pokud je ve fragmentu 110 jeden atom kyslíku, musel být nejméně jeden také v prekurzoru) nakonec je možné provést také fragmentaci celého iontového klastru m/z 152, a pak analýzu produktového klastru m/z 110
- H2O
Upozornění, obecně tedy platí: a) uvažovat dusíkové pravidlo: pokud je protonovaná molekula lichá a MS-MS dává sudé i liché fragmenty, je pravděpodobné, že molekula obsahuje nejméně 2 N (platí ale jen za předpokladu, že předpokládáme možnost jenom neutrálních ztrát) b) Fragmentování celého iontového klastru může vést k fragmentovým klastrům charakteristických tvarů, a tím usnadnit zjištění elementárního složení fragmentového klastru
2. Případ, kdy je k dispozici jen degradační produkt podvržené aktivní látky konkrétní případ jednoho antibiotika Chromatografie LC-MS zfalšovaného léčiva vedla ke složitějšímu chromatogramu:
Sled úvah: - hlavní pík může být zbytek podvržené aktivní látky nebo její degradační produkt - bylo změřeno, že nominální molekulová hmotnost látky hlavního píku je 308, hmotnost iontu [M+H]+ byla změřena na MS instrumentu poskytujícím přesnou a správnou hmotnost, výsledek měření byl 309,1282 - předpoklad složení: C, H, N, O, F(3), S, limit 5mDa - výsledek => 33 kombinací elementárních složení (pro sudo-elektronová elem. složení) s nejlepší shodou ve smyslu rozdílu teor. a naměř. hmotnosti pro C4H18N8O7F a DBE –0,5 => to je ale velmi nepravděpodobná struktura - analýza izotopového klastru : a) [M+H+1]+ s intenzitou 18% (vztaženo k [M+H]+) vede k předpokladu 14-18 atomů C v molekule b) [M+H+2]+ s intenzitou 7% (vztaženo k [M+H]+) vede k domněnce o přítomnosti 1 atomu S v molekule
- potvrzení uvedéné doměnky o přítomnosti S v molekule lze také ověřit cestou HRMS, tedy třeba Orbitrap s rozlišením 60.000 34S
2 x 13C experimetální data
simulováné spektrum
(upozornění: tato konkrétní výše uvedená data byla získaná pro jinou podobnou látku podobné hodnoty m/z jako má měřená neznámá látka)
- počet uhlíku omezen na 14-18, nutná přítomnost 1 S, 5mDa => jen 3 kombinace: C15H21N2O3S, C17H22O2FS, C16H19N2F2S - navíc, pokud by byl nastaven limit na 2mDa (snadno v praxi na Orbitrap dosažitelné), pak jen jedna možná kombinace - žádná kombinace ale nebyla nalezena v Merck Indexu => asi nejde přímo o podvrženou látku, ale už o její degradační produkt - v CA ovšem nalezena pro C15H21N2O3S (protonovaná molekula) následující molekula:
C15H20N2O3S
Tato látka je známý degradační produkt penicilinového antibiotika, penicilinu G
další dva degradační produkty penicilinu G, potvrzeny i ve standardu
3. Případ, kdy je podvržena aktivní látka a kdy jen MS bez LC nestačí k jednoznačné identifikaci - při hledání potenciálních analytů podle zjištěného elementárního složení je vždy třeba počítat s tím, že může existovat více izomerů - proto je pak někdy nutné MS informaci kombinovat s chromatografickými daty Příklad: jako podvržená aktivní složka byla identifikována látka s elementárním složením C12H15N4O2S pro [M+H]+ v literatuře (Merck index) jsou ale uvedeny 2 možnosti (izomery):
- uvedené látky byly k dispozici ve formě standardů a byly podrobeny MS-MS fragmentaci se stejnou kolizní energií
- na základě MS-MS je neznámá látka asi sulfametazin, ale není to jednoznačné - retence obou izomerů na LC je ale zásadně odlišná a vede k jednoznačnému potvrzení identity
4. Případ, kdy je podvržena aktivní látka a nejvhodnější metoda analýzy není LC-MS, ale GC-MS nebo dokonce přímý vstup EI - měření správné hmotnosti na LC-MS vedlo ke zjištění elementárního složení falešné aktivní látky -> C16H14O3, nominalní hmotnost m/z 254 - opět aplikace Merck Indexu -> návrh 2 látek -> ketoprofen nebo fenbufen - místo měření MS-MS spekter a retenčních časů na LC byl užit systém GC-MS:
podvržená aktivní složka
NIST knihovní spektrum standardu ketoprofenu
- EI knihovní spektrum ketoprofenu poskytlo dobrou shodu s podvrženou aktivní složkou - v uvedeném případě je i možné, že by pro identifikaci stačil EI s přímým vstupem a nebyla by nezbytná znalost elementárního složení - v každém případě cesta k identifikaci byla mnohonásobně snazší než s užitím kombinace LC-MS-MS, ale takto nelze postupovat obecně, je to spíše výjimka, protože látka musí být těkavá
Obecné závěry: Možnost měřit přesné a správné hodnoty m/z je velmi důležitá Protonovaný klastr prekurzoru, tedy [M+H]+, poskytuje mnoho podstatných informací Kromě LC-MS ve spojení s ESI, je někdy vhodné užít techniku EI nebo GC-EI
Další příklad tentokrát z naší praxe
Analýza surového vzorku laktondiolu-B
O O
OH OH
C18H22O4 Mw mono = 302,1518 [M+H]+ 303,1596 [M+Na]+ 325,1416 [M+K]+ 341,1155
UV-VIS: 210 nm
2 1
MS: 100-1000 m/z
3 4
5
2 1
m/z 325.1
pík 1 a pík 2
[M+Na]+
[M+K]+
3
m/z 359.1
[M+Na]+
pík 3
4
m/z 403.0
[M+Na]+
pík 4
5
[X+Na]+
pík 5 m/z 461.0
[M+Na]+
m/z 451.0
pík 3
pík 5: 461,1 m/z
pík 5: 451,0 m/z
pík 3: 361,1 m/z
pík 3: 359,1 m/z
3
5
TIC 100-1000 m/z
Další příklad z naší praxe tentokrát vysokomolekulární biologicky významná látka 1. Charakterizace surového desoktapeptidu lidského insulinu pomocí RP-HPLC-MS 2. Preparativní izolace a charakterizace jeho jednotlivých forem, -OH a –NH2
DOI primary structure
RP-HPLC-MS - surový DOI
UV: 218 nm
1
2
MS: 100-2000 m/z
pík 2 -OH
pík 1 -NH2
pík 2 -OH
pík 1 -NH2
Originální MS spektrum
1622,7
1217,6
MS spektrum po dekonvoluci
4864,1
