3. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2009 hingga bulan April 2010 bertempat di Laboratorium Kultivasi Mikroalga di Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini dicantumkan pada Tabel 1. Tabel 1. Alat dan Bahan Alat dan Bahan
Unit
Erlenmeyer 1000 ml Oven Selang Gas CO2 Batu Pemberat Mikroskop Haemocytometer Pipet tetes
3 buah 1 buah 3 buah 1 3 buah 1 set 1 set 3 buah
Media Guillard Termometer Air Laut Hand-held Refraktometer ATAGO Handylab pH 11 SCHOOT Tisu Kertas label Alumunium foil
10 ml 1 buah 3 liter 1set
Bibit Nannochloropsis sp. Akuades
2.5 liter 1L
1 set 1 rol 1 set 2 rol
Keterangan Wadah kultivasi (1 L) Mengeringkan peralatan-peralatan gelas Aerasi Sumber karbondioksida Aerasi Menghitung kelimpahan mikroalga Menghitung kelimpahan mikroalga Pengambilan sampel kultur untuk perhitungan kelimpahan mikroalga Nutrien Mengukur suhu ruangan Media kultivasi Mengukur salinitas Mengukur pH kultivasi Membersihkan Haemocytometer Pemberian label pada sampel Penutup Erlenmeyer/peralatan ketika disterilisasi Bibit kultivasi Bahan bilasan dan alat pencuci
11
12
3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Tahap Persiapan Tahap persiapan ini terdiri dari sterilisasi alat dan bahan sebelum proses kultivasi dilakukan.
3.3.1.1 Sterilisasi Alat Kegiatan sterilisasi ini diawali dengan mencuci dan merendam alat-alat yang terbuat dari kaca, yaitu labu erlenmeyer dan pipet tetes, di dalam larutan detergen. Bilas dengan air kran, sebelum dimasukkan ke dalam oven terlebih dahulu erlenmeyer dan pipet tetes ditutup dengan alumunium foil. Erlenmeyer dan pipet tetes dioven selama 5 jam dengan suhu 105 °C (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995).
3.3.1.2 Sterilisasi Bahan Bahan dan media kultivasi yang digunakan dalam penelitian ini juga dilakukan sterilisasi untuk menghindari kontaminasi. Air laut yang digunakan terlebih dahulu disaring dengan menggunakan kertas saring 0,45 µm, selanjutnya disterilisasi dengan cara direbus hingga mendidih (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995). Nutrien yang digunakan disimpan dalam botol gelap dan disimpan di dalam kulkas. Jika nutrien akan digunakan, terlebih dahulu dikeluarkan dari kulkas dan didiamkan hingga suhunya sama dengan suhu ruang (27 °C). Bibit mikroalga diperoleh dari koleksi batch mikroalga yang ada di laboratorium Laboratorium Kultivasi Mikroalga di Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi, IPB.
13
3.3.2 Metode Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengamati pertumbuhan Nannochloropsis sp. dengan penambahan karbondioksida pada salah satu perlakuan. Hal ini dilakukan untuk menguji apakah penambahan karbondioksida dapat dilakukan pada kultivasi mikroalga. Pengujian dapat dilihat dari jumlah sel mikroalga yang bertambah atau tidak atau bahkan mati dalam kurun waktu tertentu. Tahapan pada penelitian pendahuluan ini adalah kultivasi 1000 ml pada tiga buah erlenmeyer ukuran 1000 ml. Spesies yang digunakan adalah Nannochloropsis sp., lalu dimasukkan air laut steril dan bibit mikroalga dengan perbandingan 2/3 air laut steril dan 1/3 bibit mikroalga (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995). Ketiga labu erlenmeyer diberi label/tanda agar tidak tertukar; erlenmeyer pertama berisi air laut, bibit mikroalga media Guillard dan tidak diberi aerasi dinamakan kontrol; erlenmeyer kedua berisi air laut, bibit mikroalga media Guillard dan diberi aerasi dinamakan P1; erlenmeyer ketiga berisi air laut, bibit mikroalga media Guillard, diberi aerasi dan penambahan karbondioksida dinamakan P2, selanjutnya dilakukan di kultivasi selama 10 hari. Pada penelitian pendahuluan ini tidak dilakukan ulangan pada tiap kultivasi, karena pada hari ke-8 kultivasi flowmeter mengalami kebocoran. Perhitungan kelimpahan sel dilakukan dengan menggunakan haemocytometer dan mikroskop dihitung setiap hari sejak hari pertama kultivasi. Pengukuran suhu, salinitas dan pH dilakukan 1 kali setiap hari selama 10 hari. Pengukuran suhu pada penelitian pendahuluan menggunakan thermometer, pengukuran salinitas menggunakan hand refraktometer dan pengukuran pH
14
menggunakan indikator pH universal. Perhitungan alkalinitas pada penelitian pendahuluan tidak dilakukan, karena pada hari ke-8 kultivasi terdapat kebocoran pada flowmeter sehingga pengukuran pH tidak dilakukan. Pemberian karbondioksida sebanyak 0,5 cc/min selama 6 jam atau ± 180 cc setiap 2 hari, banyaknya pemberian karbondioksida pada kultur didasarkan pada penelitian Chiu et al. (2008). Hasil yang diperoleh dari penelitian pendahuluan akan dijadikan acuan pada penelitian selanjutnya yaitu penelitian utama. Berdasarkan penelitian pendahuluan didapatkan bahwa dengan penambahan karbondioksida pada perlakuan P2 dapat meningkatkan pertumbuhan mikroalga. Data penelitian pendahuluan disajikan pada Lampiran 1. Ringkasan penelitian pendahuluan tercantum dalam Gambar 3. Sterilisasi Alat dan Bahan
Kontrol (Tanpa Aerasi)
P1 (Menggunakan Aerasi)
P2 (Menggunakan karbondioksida)
Kultivasi (10 hari)
Pengukuran parameter suhu, salinitas dan pH
Perhitungan kelimpahan sel Gambar 3. Diagram Alir Prosedur Penelitian Pendahuluan
15
3.3.3 Metode Penelitian Utama Penelitian utama ini banyak erlenmeyer yang digunakan sama seperti pada penelitian pendahuluan. Hal ini dilakukan berdasarkan hasil dari penelitian pendahuluan yang menunjukkan bahwa penambahan karbondioksida pada P2 mempengaruhi pertumbuhan sel mikroalga. Pertumbuhan sel mikroalga dengan penambahan karbondioksida lebih tinggi daripada kontrol dan P1 . Data penelitian utama disajikan pada Lampiran 2. Sterilisasi Alat dan Bahan
Kontrol (Tanpa Aerasi)
P1 (Menggunakan Aerasi)
P2 (Menggunakan Karbondioksida)
Kultivasi (10 hari) Pengukuran pH pada P2 dilakukan dua kali, sebelum dan sesudah diberikan karbondioksida
Pengukuran parameter suhu, salinitas dan pH
Perhitungan kelimpahan sel
Gambar 4. Diagram Alir Prosedur Penelitian Utama Tahapan kultivasi pada penelitian ini tidak terlalu berbeda dengan penelitian pendahuluan. Penelitian utama terdiri dari kontrol dan 2 perlakuan yaitu pada erlenmeyer kontrol berisi air laut bibit mikroalga media Guillard dan tidak diberi aerasi, erlenmeyer dua merupakan P1 berisi air laut bibit mikroalga
16
media Guillard dan diaerasi dan erlenmeyer tiga merupakan P2 berisi air laut bibit mikroalga media Guillard diberi aerasi dan penambahan karbondioksida. Sedikit berbeda pada penelitian pendahuluan pada penelitian utama ini penambahan karbondioksida dilakukan setiap hari sebesar 0,5 cc/min selama 5 jam atau ± 150 cc setiap hari. Hal ini dilakukan agar pertumbuhan Nannochloropsis sp. menjadi lebih maksimum. Ulangan yang dilakukan sebanyak 3 kali untuk mendapatkan hasil yang terbaik. Data parameter suhu, salinitas dan pH disajikan pada Lampiran 3.
3.3.4 Metode Analisis Data 3.3.4.1 Perhitungan Sel Mikroalga Perhitungan kelimpahan sel mikroalga dari masing-masing Erlenmeyer pada penelitian pendahuluan dan penelitian utama dilakukan setiap hari. Perhitungan kelimpahan sel menggunakan Haemocytometer dan mikroskop. Kelimpahan mikroalga dihitung dengan menggunakan formula Improved Neubaeur Haemocytometer sebagai berikut: ………………………. (1)
(ind/ml) = dimana, N = jumlah sel mikroalga yang teramati
Perhitungan kelimpahan sel mikroalga disajikan pada Lampiran 4. Selain menghitung kelimpahan sel mikroalga, juga dilakukan penghitungan laju pertumbuhan spesifik (µ) (Krichnavaruk et al, 2004) dengan menggunakan formula:
17
dimana, Nt = kelimpahan populasi pada waktu t No= kelimpahan populasi sel pada waktu o To = waktu awal Tt = waktu pengamatan Laju pertumbuhan spesifik maksimum (µ maks) dihitung dari kelimpahan pada saat awal kultur hingga puncak kelimpahan maksimum. Perhitungan laju pertumbuhan spesifik disajikan pada Lampiran 5.
3.3.4.2 Sidik Ragam Uji statistik yang dilakukan pada penelitian ini adalah untuk melihat perbedaan tiap perlakuan dengan kontrol. Untuk sidik ragam (ANOVA) menggunakan metode Rancangan Acak Kelompok (RAK) (Mattjik dan Sumertajaya, 2006). ………………………….. (3)
dimana, Yij = nilai pengamatan pada perlakuan ke-i, kelompok ke-j µ = rata-rata umum populasi τi = pengaruh aditif perlakuan ke-i βj = pengaruh aditif perlakuan ke-j Σij = galat percobaan.
18
Hipotesis yang diuji dalam analisis ini adalah sebagai berikut: Ho : Karbondioksida yang diberikan tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan Nannochloropsis sp. H1 : Karbondioksida berpengaruh terhadap pertumbuhan Nannochloropsis sp. Perhitungan sidik ragam dapat dilihat pada Lampiran 6.
3.3.4.3 Alkalinitas Alkalinitas merupakan kemampuan suatu larutan untuk menetralkan asam ke titik ekuivalen karbonat atau bikarbonat. Perhitungan alkalinitas dilakukan untuk mendapatkan jumlah total karbondioksida pada larutan. Untuk menentukan alkalinitas dilakukan pengukuran pH pada larutan, lalu dihitung dengan menggunakan rumus (Strickland dan Parsons, 1972): 1.
Apabila pH < 4 maka menggunakan rumus : Alk tot = 2,5 (1250 H ) ………………….. (4) f
Apabila pH > 4 maka menggunakan rumus : Alk tot = 3 (1300 H ) ………………………(5) f dimana, Alk tot = alkalinitas total αH
= aktivitas ion hidrogen
f
= faktor perhitungan total alkalinitas Nilai αH dan f diperoleh dari tabel pada Lampiran 7 dan 8
19
2.
Hitung alkalinitas karbonat (CA), menggunakan rumus : CA
= Alk tot – A ……………………….. (6)
dimana, CA
= alkalinitas karbonat
A
= konversi alkalinitas total menjadi alkalinitas karbonat Nilai A diperoleh dari tabel pada Lampiran 9
3.
Hitung konsentrasi total karbondioksida dengan rumus : Σ CO2
= CA x FT ………………………….. (7)
dimana, Σ CO2 = karbondioksida total FT
= faktor konversi alkalinitas karbonat menjadi karbondioksida total Nilai FT diperoleh dari tabel pada Lampiran 10
4.
Hitung tekanan parsial dengan rumus : PCO2
= CA x FP …………………………… (8)
dimana, PCO2
= tekanan parsial karbondioksida
Fp
= konversi karbondioksida total menjadi tekanan parsial karbondioksida Nilai FP diperoleh dari tabel pada Lampiran 11
5.
Hitung karbondioksida terlarut dengan menggunakan rumus : [CO2]
= PCO2 x γ ……………………………. (9)
dimana, γ
= daya larut karbondioksida Nilai γ diperoleh dari tabel pada Lampiran 12 Maka akan didapatkan hasil dengan satuan mmol/L CaCO3, agar sesuai
dengan satuan alkalinitas lainnya maka dilakukan konversi menjadi satuan yang
20
diinginkan yaitu mg/L CaCO3. Perhitungan konversi dari mmol/L CaCO3 menjadi mg/L CaCO3 dapat dilihat pada Lampiran 13. Gambar alat dan bahan yang digunakan pada penelitian disajikan pada lampiran 14. Dokumentasi penelitian pendahuluan disajikan pada Lampiran 15 dan dokumentasi penelitian utama disajikan pada Lampiran 16.
