1621 Ll M u. Simeon Penggoam Marselinos Laga Nor

1621 Ll M u

LAPORAN AKHIR

_;:ENDERITA TB DI KUPANG DAN DISTRIBUSI BERBAGAI POLIMORFISME

PADA GEN

TLR. VOR, NRAMP, lFN, TNF DALAM PANEL INFEK.SI-IMUNOLOGI DENGAN METODE PC�-BEADS

Oleh

Simeon Penggoam Marselinos Laga Nor Theophilus Rengga

PEMERlNTAH PROVINSI NUSA TENGGARA TIMOR

RUMAH SAKIT UMUM DAERAH Prof. 2012

Dr W.Z JOHANNES KUPANG

-- _,__._........

..

........

·----

LAPORAN AKHIR PENDERITA TB DI KUPANG DAN DISTRIBUSI BERBAGAI POLIMORFISME PADA GEN TLR, Vl)R, NRAMP, IFN, TNF DALAM PANEL INFEKSI-IMUNOLOGI DENGAN METODE PCR-BEADS

I Oleh Simeon Penggoam Marselinus Laga Nur Theophilus R�ngga

PEMERINTAH PROVINSI NUSA TENGGARA TIMUR RUMAH SAKIT UMUM DAERAH Prof. Dr W.Z JOHANNES KUP ANG •

2012

---::-: :-:::= == === �

LAPOEAN AKHIR

KEGIATAN PENELITIAN RISBIN IPTEKDOK TAHlJN ANGGARAN 2012

ProgramPenelitian Unit Kerja Sumber Dana l.

: RISBI N IPTEKDOK : RSUD Kupang : Badan Litbangkes

Tahun

:2012

KETERANGANUMUM

Judul penelitian:PENDERITA TB DI KUPANG DAN DISTRIBUSI BERBAGAI POLIMORFISME PADA GEN TLR, VDR, NRAMP, IFN, TNF DALAM PANEL INFEKSI-IMUNOLOGI DENGAN METODE METODE PCR-BEADS

1.

2.

Dibiayai melalui

: DIPA Badan Litbangkes

NomorPKS

: HK.06.01/111708/2012, 12

Tanggal

:1

Tahun 2012

Maret. 2012

3.

Biaya tahun 2012 : Rp 149.541.000 (setatus empat puluh sembilan juta lima ratus empat puluh satu rit,u rupiah)

4.

Jangka waktu

5

Susunan tim peneliti No

Nama

1.

Simeon Pcnggoam

: 12

Bulan

�SUD

Kupang.

11

Moch

Hatta No. 19 Kupang

�-

Marselinus L Nur

FKM

Undana

Jenderal

Kupang.

Soeharto

Theofilus Rengga

neno[2enggoam@:x:ahoo.<:om/O

Tugas Kctua

81237904363

No.

Jl 72

Kupang

3.

Emailltelp

Alamat Kelembagaan

nurdhienln@y:ahoo.eo.id/0852 53014500

[email protected]/08 RSUD Kupang Jl M9ch Hatta

Peneliti 1

1237933588

Peneliti 2

No. 19 Kupang

6

Lo kast· penerf 1 1an Lokasi/Laboratorium

Alamat

Pemilik/Pengelola

RSU D Kupang

Jl. Moch 1-Iatta No. 19 Kupang NIT

Gubemur NTT

UPKFK UNPAD

Jl. Eyckman No. 38 Bandung

Dekan FK UNPAD

l: t l ; r n

.

/·.·llf.lll

f\:n·•:1a�;rrl �\·t!ai'�J

'\:tl -�-� .l;lkul'ta I 0:'()0 !(,_l!;lk f'n, i 226

T�.·kp�>!i · ( n' I) -1 �hI ns:-< 1-';lbllnik: !0:?!) 1 � � �I);_\

w-.b;rn

u

-

lll!';Pt;.' dl.'p!-e-..gtl

HI.

II d•,/1,

hllp

·

litb.rn;;.lkpk..-:s.gp td

\\\\\\

KEPUTUSAN KEPALA BAOAN PENELIT!AN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN NOMOR : HK.03.05/2/1273/2012 TENTANG PENETAPAN TIM PELAKSANA RfSET PEMBINAAN !LMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGI KEOOK TERt,:� TAHUN 2012

KEPALA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN, Menimbang

:

a. bahwa

untuk

meningkatkan

pengembangan

di

bidang

kapasitas

penelitian

kesehatan

perlu

dan

dilakukan

pembinaan kepada para peneliti rnuda; b.

bahwa peneliti

dalarn

rangka

muda

perlu

pernbinaan dilakukan

dan

menggali

Riset

potensi

Pembinaan

llmu

Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran; c.

bahwa berdasarkan pertimbangan sebagaimana dirnaksud pada huruf a dan b perlu ditetapkan Badan

Keputusan

Kepala

Penelitian dan Pengernbangan Kesehatan tentang

Pembentukan

Tim

Pelaksana

Riset

Pembinaan

llmu

Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran T ahun 2012: Mengingat

1,

Undang-Undang

Nomor 18

Tahun 2002 tentang

Nasional Penelitian, Pengernbangan dan

Sistern

Penerapan llmu

Pengetahuan dan Teknologi (lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2002 Nomor 84.

Tambahan

Lembaran

Negara Republik Indonesia Nomor 4219): 2.

Undang-Undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan (lembaran

Negara

Tahun

2009

Nomor

144,

Tarnbahan

Lembaran Negara Nomor 5063}: 3.

Peraturan Penelitian Negara

Pernerintah dan

HepubHk

Tarnbahan

Nom or

39

Pengembangan Indonesia

Lernbaran

Negara

Ta hun

1995

Kesehatan

Tahun Republik

1995

tentang

(Lembaran Nornor

Indonesia

67,

Nomor

3609): 4.

Peraturan Pres:den Nomor 76 Tahun 2011 Perubahan atas Peraturan

Presiden

NomcH

47

Tahun

2009

Pembentukan dan Organisasi Kementenan Negara:

Tentang

. .. .r_,J',·, "':,r7"""'r �.-�-��y - ....-'-";·.··- . · . ....

_ ..._._ , _

_ __

.. lahul P�·n ._:rakan '\o,::;ara ._

__ _

:-.;,•

_

_

......

- - ·---

.l,tkart,r I O.:'f•ll Koi.ol- Po.� 1226

�•1

.

kh:.pllll (0� l} -l 'fdli�� I :d,�lllllk; (02i I·�->U'l�.1 1-. I!J,lfc · illlp: W\\ \\' iitb:lttg.dcpk��-g•l.ld

5. Keputusan

Menteri

791 /Menkes/SKtVII/1999 Penyelenggaraan

Nomor

Kesehatan tentang

Penelitian

dan

Koordinasi Pengembangan

Kesehatan;

6.

Peraturan

Menteri

Kesehatan

1144/Menkes/PerNill/2010

tentang

Nomor

Organisasi

dan

Tata

Kerja Kementerian Kesehatan Rl; MEMUTUSKAN: Menetapkan

KEPUTUSAN

KEPALA

BADAN

PENELITIAN

DAN

PENGEMBANGAN •<ESEHATAN TENTANG TIM PELAKS/\NA RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGl KEDOKTERAN TAHUN 2012: KESATU

Tim

Pelaksana

Riset

Teknologi Kedokteran lptekdok

2012)

Pembinaan

llmu

Pengetahuan

dan

Tahun 2012 (se!anjutnya disebut Risbin

sebagaimana

tercantum

dalam

lampiran

keputusan ini bertugas; 1

Melaksanakan penelitian sesuai kaidah

ilmiah dan

etika

dengan waktu yang telah ditetapkan; 2 3.

Mempertanggungjawabkan

penggunaan

anggaran

sesuai

peraturan yang berlaku:

Membuat dan menyampaikan laporan kemajuan dan laporan

akhir penelitian:

4.

Membuat ringkasan eksekutif berdasarkan hasil penelrtian sebagai bahan masukan kepada pengambi!an keputusan dan pengelola program yang terkait dengan hasi! penelitian:

KEDUA

Tim

Pelaksana

Risbin

lptekdok

Tahun

2012

sebagaimana

dimaksud pada dikturn kesatu diberikan honor sesuai dengan ketentuan yang berlaku: KETIGA

Oalam melaksanakan tugasnya, Tirr-1 Pelaksana Risbin lplekdok Tahun 2012 berpedoman pada peraturan perundang-undangan yang berlaku;

KEEMPAT

Dalam rnelaksanakan tugasnya, Tim Pelaksana Risbin lptekdok Tahun 2012 dapat berkonsultasi dan berkoordinasi dengan Tim Panel Pakar dan Tim Penge!ola Administrasi Risbin lptekdok:

KELIMA

Braya kegiatan Tirn Pelaksana Risbin lptekdok Tahun 2012 dibebankan pada DIPA Sekretariat Badan Litbangkes tahun anggaran 2012 Nornor · 0682/024-111.01/00/20'12 T�nggal 9

Desernber 201 ·1:

'

Jalan l\:rn:tahan :'\.._·ganl

......... __-'··---·

-

-

���- .�lJ J;ikJrla I 11"60 1-\.i)l<JI-. p,,, 122
klqht !L ill� I J-121>1\IS� Fak�1tn1k 10::! i-l�-1 ��q_l 1· 111r11f -.�·-;han:,, hth;lllg.d
KEENAM

Oengan Badan

berlakunya Keputusan ini, maka Keputusan Kepala Penelitian

dan

HK.03 05/1/393/2011

Pengembangan Tanggal

19

Kesehatan

,lanuari

201 1

Nomor

:

tentang

Penetapan Tim Pelaksana Riset Pembinaan llmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran Tahun 201 1 dinyatakan tidak beriak •

lagi; KETUJUH

Keputusan ini berlaku sejak tanggal ditetapkan.

Ditetapkan di Jakarta

Pada tan gal17 FEBRUARI 2012

�

Kep

:i&.

/

f/1//,,/'/ --

--;;-

�ONO

Ill

,ilwl "

LAMPl RAN KEPUTUSAN KEPALA BADAN LITBANG KESEHATAN NOMOR

: HK 03.051211273/2012

TANGGAL; 17 Februari 20t2 SUSUNAN TIM PELAKSANA RISET PEMBINMN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGI KEDOKTERAN (RISBIN IPTEKDOK)2012

BALAI LITBANG, BP2 GAKI, MAGELANG

SP N urya nt Wahy.:ntngrum SSi R

Agus Wtbowo SSt. MSc Tauf;q Hldayat. dr

Catur Wijayantr .A.Md

Pengaruh Suplementasi Mikroatgae Sptrullna terhadap Status Kltnis GAKI dan Fungsi Ttroid

149,883,500

Uiam; M:.;iyanrngrum f.ir MSc

Endang Setyan'. AMAK

Produksi Antibod< 1•Aonoklonal Spes1f1k

140.521.000

Y�.;n•ar Lestan dr MKes

JOn! Herman SE

8ALAillTB.t1NG. P282 BANJARNEGARA Cyah '!>h:Jiastutt SS

MSc

B1na :v.awat1 SKM MKes

Leptosptra

FK UNJVfRSI TAS ANDALAS, PAOANG

Desn":a'lrvot· c�r

Rony Y dr SpPO

Pengaruh Retnks• Natrium dan Ekspres1 Gen AGT M235T terh;:�dap Tekanan pada

f;{a Ncf.:?- d'

Nora Ham r tnartt dr.

Pendenta Hipertens1 Etnik

Oarah

·48 780 000

Mmangkabau

Mana Magdalena Mart•nt

M810mec

Ka1sar SS1

LtltS SpPA

Shee!ia R 8oronng. 1.1r

Fitra Mauled;_ SSos

ldentifikasl Subtipe Blastocystis pada

134.514 050

lnd1vidu dengan Oiare can Tanpa Oiare dengan Mer.ggu!'lakan PCR

FK UNI\'ERSJT/>,S ATMAJAYA, JAKARTA Stefa":us Lem ba r t:tr SpPK

FK UNIVERSITAS BRAWIJAYA, MALANG

y,,;,a,.. V'll;l utam' SKp. MKes

Romanah

SpPK

Wtw;k Agust1r.a. SKp, Ners Dw1 Setyo;ini. SKep Ners

Ana Lutf1a SSos

Stud1 Protein Disulfide isomerase Family A Member 4 {PDIA4) pada Karsmoma Mammae: ldent•f:kas; Mutas; Gen PDIA4 sebaga1 Jn<:J,kator pada Deteksr D 1n1 Metastasts Kars1non;a Mammae

�04 627 ooc

Respon imun slgP. molekui adhes1n S"1gelia

"38,400.000

dyseNenae 7.9 kDa dan 49.8 kOa terhadap

sekres1 catran usus mencit

2

T \'n Andri VV:"lastut' SKp MKes

Saturnan. SSi MKes

Nov1 K!1:1la FirarH. dr. MKes

Dyah Catunn:. AMd

Optimalisast dan Uj1 Pote nsi Mesenchymal Stem Cell {MSC) untuk

Perbaikan Pankreas

P ad a T1kus Modei Diabetes Mellitus yang

Oundukst Streptozotocyn

110,000.000

Ill

LPPM UNIVERSITAS AIRLANGGA, SURABAYA La)(sm1 Wu1anoan dr UA1 Ade '�'/!ian Kns'la SS; MKed SpP(K)

..,

P··yc 8t.K!, Pu:wor.o dr

Rendra BraMantt-1. dr

A;d•se Mareta Nasri SKM

Zen! Ram•ta SE

Eksp•es; CD95 dan ApcoptoSJs p ada Sel

12<� 4o3 soc

Stud1 Anai1sis Molekuler Genct1pe oan

144,930000

yang rennfei\S! Virus !n1iuenza A sut>tme

H1 N 1 dan H5N1 fStudi lnv,trc;

Mocharnmad Am;n SSl

w,u, Utam1

SubT1pe serta Vacc;ne escape Mutant wus Hepatitis B pasca Program lmun1sas; anak di Sorong Indonesia

LPPM UNIVERSITAS SEBELAS MARET. SURAKARTA YJi;a

Sar;. SS1 fi/1S•

Suyatmi. dr MBiomed

Lely Saptawat1 dr SpMK

Sari Fitriani, AMd

Prote:n Rekombinan Virus hepatitis B Core IHBc)- Virus Hepatitis G-Ccre yang

150.000.000

berpotens; rnembentuk Virus hke parttde rvt.P)

RSU KliPANG

S,rr:eor·, P"
Marselrnus Laga Nur SKM

Tr1eolil"s Rengga. SS

Dwi D1ana Sr:m

Penderita TB ·dengan �>lOR MTB eli Kupang dan distribusi berbaga! po!imorphrsrn pade gen TLR2, VDR2. NRAM � dalam panei PCR Beads

� -

/_,· 7"-jv Kepala .•.

·1;/7/-.-_

l't _;t-TRIHONO

�� #t::--

11111111 i••

:,'1

,

,

Il i .

�

IFN.TNF INFGR

:nfeksi-immunofogi metoda

149,541 000

KATAPENGANT AR

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas bePcatnya, rabmatNyalah sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul" Penderita Tuberkulosis di Kupang dan distribusi berbagai polimorfisrne pada gen TLR, VDR, NRAMP IFN, TNF dalam panel infeksi-imunologi dengan metode metode PCR-Beads" ,

penelitian ini dilatar belakangi oleh penyakit tuberkulosis masih merupakan masalah kesehatan dcngan angka kesakitan dan angka keroatian yang tinggi baik di Negara

m

l_;

1

maupurt di negara yang sedang berkembang, Manifestasi klinis tuberkulosis adalah hus;. interaksi antara bakteri dan respon imun host. Selain strain bakteri, faktor genetik manusi<� juga berperan dalam kerentanan terhadap infeksi Mycobacterium tuberkulosis, terutama gen yang berhubungan dengan imunitas seluler yang meliputi makrofag, T helper 1 dan sitokin. Sesuai SK Kepala Balitbangkes Judul penelitian ini adalah "Penderita TB dcng:1••. MDR MTB di Kupang dan distribusi berbagai polimorphism p�da gen TLR2, VDR2, NRAPl,IFNG, TNF dalam panel iofcksi imuoologi metode PCR-Beads" tetapi setelah

dilakukan studi pendahuluan didapatkan MDR TB sangat rendah sehingga dirubah judul menjadi penderita TB di Kupang dan distribusi berbagai polimorfisme pada gen TLR, VDR,

NRAMP, IFN, TNF dalam panel infeksi-imunologi dengan metode metode PCR­

Beads" Dalam penelitian ini penulis mengambil

sampel dari populasi penderita

tuberkulosis di RSUD prof Dr WZ Johannes Kupang yang dipilih dengan metode co71Venience sampling karena rancangan penenlitian adalah

case

kontrol studi, rnak:a

kontrol dian1bil orang sehat serumah (serumah dengan pesien TB tetapi tidak sakit dikon.firmasi dengan TST positif), setelah diambil darah EDTA untuk isolasi DNA, dilakukan analisis berbagai gen yang telah dipilih berdasarkan studi pustaka single nucleotide polimorphisms (SNP) yang banyak ditemukan be.rhubungan dengan kerentanan

terhadap penyakit TB dari penelitian berbagai etnik diberbag�i negara Untuk melihat frekuensl

distribusi polimorfisme berbagai gen., maka nilai

signiflkansi antara genotipe menggunakan tabel kontingensi 2x2 kemudian perbedaan genotipe diuji menggunakan c.oefisien contigensi. Hasil penelitian distribusi frekuensi beberapa gen rnenunjukkan tidak ada perbedaan namun khusus gen VDR rs7975232 rnenunjukkan Nilai p dibawah 0.05, artinya terdapat perbedaan yang signifikan antara

viii

pasien tuberkulosi� dan kontrol tuberkulosis. Walaupun demikian, perbandingan alel A dan aiel C pada pasien dan kontrol tidak berbeda bermakna (p Melalui kesempatan ini

=

0.39).

penulis menyampaikan terimakasih kepada Badan

penelitian pengembangan kesehatan melalui RlSBIN IPTEKDOK 2012 yang telah memblayai penelitian ini. Selanjutnya penuli� mengucapkan terimakasih yang sebesar­ besarnya kepada drg. Ani Melani Maskun, PhD sebagai kepala UPK FK Unpad dan secr�­ khusus kepada dr. Edhyana Sahiratmadja, PhD sebagai konsultan sekaligus kolaborat�_,.· penelitian yang telah banyak memberikan bimbingan dan arahan sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.

Sulit bagi

penulis menda,patkan kata-kata

disampaikan s.ebagai penghargaan dan rasa terim$asih.

yang

tepat untd\

Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada yang terhormat direktur RSUD pr..,.f Dr WZ Johannes Kupang yang telah memberikan kescmpatan dan dorongan unt-.Jk mengikuti scmua kegiatan penelitian hingga selesai. Penulis mengucapkan terimaka.,;. , yang tak tcrhingga untuk semua yang tak dapat disebutkan satu per satu, penulis tak dapat membalas kebaikannya hanyalah ucapan terimakasih dan doa selalu menyertai. semuanya. Penulis menyadari semua ini berkat bantuan dan kerjasama dari sem:ua pihak, sehingga mulai proposal, proses penelitian dan penulisan laponm dilalui dengan baik dengan segala keter.batasan dan kekurangan dalam laporan ini, semoga basil penelitian ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan kedokteran dan masyarakat Indonesia. SYALAM

Kupang, akhir Desember 2012

Penulis

ix

PENDERITA TUBERKULOSIS DI KUPANG DAN DISTRIB USI BERBAGAI POLIMORFISME GEN TLR2, VDR, NRAMP1, IFNG, TNF DALAM PANEL INFEKSI IMUNOLOGI METODE PCR BEADS 1 Simeon Penggoam1, Marselinus LagaN�, Theophilus Rengga 1

Devisi Mikrobiologi l.aboratorium RSUD Prof Dr WZ Joharu1es Kupang 2

Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Nusa Cendana Kupang

ABSTRAK merupakan patoge.o. intraz-: yang dapat bertahan hidup dan berkembang biak di dalan1 fagosom makrofag. fa; ,.-. genetik pejamu sangat berperan dalam kerentanan terhadap infeksi Mycobacterium tuberculosis terutama gen yang berhubungan dengan imunitas seluler. Gen-gen tcrs�'- · :. menyandi fungsi antigen reseptor pada mak.rofag seperti VDR, TLR2, fimgsi transpot besi pada membran fagosom seperti NRAMP1, sitokin reseptor sel T seperti ILl 2R, dan sitokin pro-inflamatori seperti IFNG, TNF, ILJ2. Penelitian ini bertujuan untuk menganatis;s hubungan masing-masing gen TLR, VDR, NRAMP, 1FN, TNF dan kerentanannya terhadar pasien tuberkulosis dan kontrol sehat se�ah

LATAR BELAKANG: Mycobacterium tuberculosis

·

METODE: Rancangan penelitian ini adalah case control sludy dengan kelompok case adalah pasien TB paru berusia 15-75 tahun dengan pemerik:saan basil tahan asam posit'� sedangkan kelompok kontrol adalah keluarga pasien yang serumah dengan pasien tanpa keluhan TB atau riwayat pengobatan TB. Data demografis dan sampel darah diambil untuk pemetiksaan polimorfisme. Untuk melihat hubungan polimorfismc digunakan PCR-Beads untuk beberapa gen sekaligus.

HASIL: sebanyak I 15 pasien dengan 64 kontrol ikllt dalam penelitian ini. Hasil penelitian

menunjukkan tidak terdapat pcrbedaan yang signifikan pada gen TLR2, NRAMPl, TNF dan IFN. Sedangkan gen VDR rs7975232 genotipe A>C Terdapat perbedaan yang signifikcm (p=0,039) Walaupun demikian, perbandingan aiel A dan alel C pada pasien dan control tidak berbeda bermakna (p=0,39), VDR adalah gen yang terletak pada

kromosoml2q dan mempunyai varian aiel dan bersalila-sama dengan NRAMPJ berfungsi menyandi antigen reseptor pada makrofag. Vitamin D tidak mempunyai efek antimikobakterial secara langsung, namun mampu memodulasi respon imun pejamu dengan menginduksi sekresi IL-10 vitamin D3 secara signifikan memperkuat potensi fagositosis. mak.rofag.

KESIMPULAN: Terdapat perbedaan yang signifikan gen VDR antara pasien dan kontrol sehat serumah, walau.pun demikian, perbandingan alel A dan alel C pada pasien dan kontrol sehat serumah tidak. berbeda bennakna. KATA KUNCI: Polimorfisme, Tuberkulosis, TLR2, NRAMPl, VDR.7, IFNG, TNF

X

DAFTARJSI Judul.............................. . ,

.......................

.

..................

...

..

.................... .

.

......

.......

Susunan Tim Peneliti ...........................................................................

.

.. .

11

.

, ..........

... ..

111

Surat Keputusan Penelitian .................................................................................

..

K_ata Pengantar Abstrak

�

. ,................................... �,······t····················�········

· ······················ ... .

...................................................................................................................

Daftar lsi ..............................................................................................................

.

Da:ftar Tabel ........................................................................................................ Daftar Gambar, .............

, ..... .. . .

....

.....

.

.....

..

........

. ..... .

.. .

......

.

.........

. .

.. . ... .

..... . .. ..

.

xu

..

xiii

.

.... . .

Daftar Lampiran ....................................................................................................

XIV

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................

1

.

Latar Belakang ..............................................................................................

..

Tujuan Penelitian ............................................................................................

3

Manfaat Penelitian .........................................................................................

3

Hipotesis ........................................................................................................

3

Lokasi Penelitian ...........................................................................................

4

Waktu Penelitian ............................................................................................

4

.

.

.

.

Prosedur Penelitian

.

......

.................

..

.......

.. . . .. .

.......

.. .. . .

..

...........................

.

......

·

5

Alur Peneljtian ...............................................................................................

6

BAB II KAJIAN PUST AKA .................. .............................................................

.

4

. . ..

4

.

Struktur dan Fun �si Vitamin 0., ................................... .

, . ....

..

...

... .. . .

..

............ .

..

Kerangka Pelilikiran ............................................................................................

.

6

BAB III METODE PENELITIAN ......................................................................

.

8

Bahan dan Peralatan Penelitian ............................................................................

8

J;>rosedur Penelitian .............................................................................................. .

9

Perneriksaan drug susceptability test ...................................................................

9

.

Pemeriksaan Genotipe manusia ...........................................................................

.

Desain penelitian ................................................................................................. Tahapan Penelitian ..............................................................................................

..

Alur Penelitian ..................................................................................................... BAB IV HASIL PENELITIAN ..........................................................................

.

9 10

.

12

..

13

Subjek penelitian dan karakteristik sampel .........................................................

.

Latar belakang genetik pada pasien TB dan kontrol serumah ............................ . .

xi

9

13 16

PEMBAHASAN ......... .......................................................................................... .

22

Infeksi human immunodefisiensi virus pada tuberkulosis....................................

22

Diabetes mellitus pada infeksi M Tuberculosis ..................................................

.

22

.

23

Laju Endap Darah sebagai prediktor infeksi M Tuberculosis ............................ Gen yang berhubungan dengan kerentanan terhadap TB ....................................

.

23

Limitasi Penelitian ................................................................................................

25

BAB V PENUTUP ..............................................................................................

26

.

Simpulan .............................................................................................................

26

Saran

.............................. ...................................................................................... .

26

UCAPAN TERIMAKASlli ................................................................................ .

27

DAFTAR PUSTAKA ................ .. .

19

..

, ..

.

......

....

...

.....

. . . . . .... ...

.

..

.

....

.. . .. . ..

.

.....

.

.... . .

....

..

...

LAMPIRAN ........................................................................................................

xii

.

32

DAFTAR TABEL Tabel.l Karakteristik pasien dan kontrol �nelitian ................................................

14

Tabel.2 Karakteristik klinik pasien TB paru dan kontrol ........................................

15

Tabel 3. Tipe pasien tuberkulosis ........................ ,...................................................

15

Tabel4. Distribusi frekuensi geootipe gen TLR2rs5743708 genotip A>C pasien TB Paru dan kontrol.... . . ..... .. .................... . ........ ........................... ............ .

.

..

20-

Tabel 5. Distribusi frekuensi genotipe gen VDRrsl 544410 genotip A>G pasien TB Paru dan kontrol

ueeU•uuu••• .. ••••••••••u.oHHUO O OO•u uu•

!.(\

Tabel 6. Distribusi frekuensi genotipe gen VDRrs7975232 genotip A>G pasien TB Paru dan kontrol ................ ................................. Tabel 7. Distribusi frekuensi genotipe gen NRAMP1rs2276631 genotip 1>C pasien TB Paru dan kontrol............................... ,..................

20

2.\

Tabel8. Distribusi frekuensi genotipe gen genotipe gcn IL12Brs2312227 genotip 1>G pasien TB Paru dan kontrol........ ......... ........ .......... ........ .......

21

TabeL9. Distribusi frekuensi genotipe gen TNFrs3093661 genotip A>G pasien TB Paru dan kontrol .................................................

21

Tabell 0. Distribusi frekuensi genotipe gen IFNGrs2069718 genotip 1>C pasien TB Paru dan kontrol..................................................

xiii

·:�

20

DAFTARGAMBAR

Gambar 1 Distribusi

single nucletotide polymorphism (SNP) gen VDR rs1544410 ............ .

Gambar 2. Distribusi single

nucletotide polymorphism (SNP) gen NRAMP 1 rs 17221959

1'

.

1'

polymorphism (SNP) gen NRAMPl rs2276631 . .

1:

Gambar 4. Distribusi

single nucletotide polymorphism (SNP) gen TNF rs3093661 ............

1:

Gambat 5. Distribusi

single nuc/etotide polymorphism (SNP) gen IFNG rs20697 18 ..........

1�

Gambar 3 Distribusi single T?Ucletotide

..

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Uji Statistik tabel kontigensi 2x2 Prosedur Kerja BeadsEXPress

dan coefisien contigensi

................ .....................

32

................................... , . . . . . ........................................

36

XV

BAB I PENDAHULUt\N 1.1 Latar Belakang

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit infeksi menular yang disebabkan

oleh

Mycobacterium tuberculosis (Mtb ). Menurut Japoran penanggulangan TB global, Indonesia merupakan penyumbang kasus penderita TB terbesar ke lima di dunia setelah India, Cina, Afrika Selatan dan Nigeria. Walaupun Indonesia sudah berhasil m�nurunkan posisi dati posjsi ke�3 pada tahun sebelumnya, namun angka insidensi di

indonesia masih tinggi yaitu 189 per 100.000 penduduk, prevalens TB 289 per

100.000 penduduk, dan angka kematian TB 27 per I 00.000 penduduk.1 Penularan melalui inhalasi droplet akan mencapai alveoli, dan bakteri akar. r:!'

fagositosis oleh makrofag

alveoler.

Pengobatan

yang kurang berhasil dap.:...!

disebabkan oleh ban yak faktor antara lain faktor perilaku pasien, age n/baktc:-:, lingkungan dan genetik host.

Selain strain, faktor genetik manusia juga berperan

dalam kerentanan terhadap infeksi Mtb, terutama gen yang berhubungan dengan imunitas seluler yang meliputi makrofag, T helper I dan sitokin?·3 Beberapa gen berperan pada kerentanan terhadap Mtb, terutama gen yang berhubungan dengan imunitas seJuler yang meliputi makrofag, T helper 1 dan sitokin.3 Gen-gen tersebut menyandi fungsi reseptor Mtb pada makrofag (a.l. VDR,

TLR2), fungsi transport besi pada merrtbran fagosom dimana Mtb hidup (a.l.

NRAMP 1), sitokin reseptor sel T (a.l. IL12R), dan sitokin proinflamatori (a.l. IFNG, TNF: JLJ).4 Mengingat kerentanan terhadap infeksi Mtb dapat berhubungan dengan etnik tertentu, dirnana populasi �i Indonesia Timur berbeda dengan di Barat5, maka tujuan usulan penelitian ini adalah untuk melihat adanya hubungan _genetik popubs: Timor yang terinfeksi Mtb. Latar belakang genetik populasi Timor dibuat dengan membuat suatu panel

imunogenetik. TB dengan berbagai single m1cleotide

polymorphisms (SNP) dari gen yang berhubungan dengan kerentanan terhadap

infeksi Mtb dengan metoda PCR-Beads. Hasil distribusi SNP dihubungkan dengan kelompok pasien dengan infeksi Mtb dibandingkan dengan kelompok kontrol serumah yang sehat.

1

Penelitian sebelurnnya menunjukkan adanya perbedaan disttibusi

Beijing, sementara di Timor 33% strain Mtb Indian

(Parwati,

strain Mtb

strain Mtb m:erupakan strain

berasal

dari Family F

East

Africa­

2008). Mengingat kerentanan terhadap infeksi Mtb dapat

berhubungan dengan etnik tertentu, dimana populasi di Indonesia Timur berbeda dengan

NRAMP l(D543N) banyak sekali polimorfisme yang diperkirakan

berperan dalarh kerentanan terhadap TB Walaupun masih banyak

perdebatan

mengenai latar belakang genetik manusia di Kupang, dikatakan genetik manusia di Kupang berhubuhgan erat dengan beberapa ras di Afrika. Letak demografik dan !aL;c belakartg genetik manusia setta Mtb yang menginfeksinya telah diteliti di Afrika

(Campbell,

2008; Hardy, 2008). Walaupun dilaporkan bahwa NRAMPl(D543N)

tidak mempunyai hubungan yang signifikan dengan kerentanan pada penderita TB dibandingkan dengan kontrol sehat di Jawa6, maupun di Sulawesi7 tetapi pada analisis lanjut polimorfisme

NRAMP1 memiliki kerentanan di antara penderita TB 8 ya�g terinfeksi Mtb strain Beijing. Penelitian awal yang dilakukan di Kupang menunjukkan adanya hubungan antara

NRAMP1 (D543N) dengan kerentanan

terhadap TB.9 Tampak:nya ada perbedaan kerentanan diantara populasi di Indonesit! Barat, Tengah dan Timur.5 Penelitian genetik dengan menggunakan

Polymerase Chain Reaction dan

J?.estriction Fragment Length Polymorhpism (PCRJRFLP) dapat mudah dilakukan, sederhana dan murah untuk mencari distribusi polimorfisme pada populasi. Dengan kemajuan teknologi, jumlah polimorfisme yang ditemukan sangat banyak mengingat gen manusia yang berjumlah ribuan banyaknya. Akhir�akhir ini banyak penelitian yang menganalisis puluhan, ratusan bahkan ribuan SNP bersama-sama secara terintegrasi dalam penelitian-penelitian sehingga mekanisme

switu

penyakit

Genome Wid e Association Studies (GWAS) dapat

dipelajari

mulai

dari

bagaimana

pertabanan tubuh manusia da]am melawan kuman sampai dengan respons imun.10 Dengan menggunakan alat BeadsExpress dengan teknologi Vera Code, pada sekali

2

pemeriksaan dapat dideteksi beberapa puluh polimorfisme sekaligus hanya dengan jumlah DNA yang sangat

sedikit.11•12•13

Berdasarkan lat{rr belakang d iatas maka masalah hubungan antara

peneJitian adal ah

apakah terdapat

masing-masing gen TLR, VDR, NRAMP, IFNG, r.r �'

kerentanan terhadap Mtb pada penderita TB di Kupang? 1.2 Tujoan Umum

Melakukan studi genetika pada pasien tuberkulosis terhadap kerentanunn;, ,. terhadap infeksi

Mycobacterium tuberculosis di Kupang

1.3 Tujuan Khusus

1. Menganalisis hubungan masing-masing gen TLR, VDR, NRAMP,

TNF dan kerentanannya terhadap pasi.en Tuberkulosis dan kontrol

1.. sc.t:''.

serumah (Tahun 1) 2. Menganalisis hubungan antara masing-masing gen TLR, VDR, NRAW,

IFN, TNF dan kerentanannya terhadap pasien TB dilihat dari kumar1 yang menginfeksinya (Tahun ke 2) 1.4 Manfaat

1. Manfaat Ilmiah Memberikan infonnasi tentang gen yang berhubungan dengan ker<:

terhadap penderita TB di kupang 2. Manfaat Praktis

Dengan di.ketahuinya gen yang berhubungan dengan kerentanan tc;r!.�· ' :-­ pasien TB di Kupang, maka dapat digunakan sebagai bahan referensi daiam tatalaksana pasien TB t erutama dalam hal preventif dan kuratif

1.5 Hipotesis

Terdapat perbedaan latar belakang genetik antar pas1en terinfeksi tl.t�b

dengan kontrol sehat di Kupang.

3

BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1

Kajian Pustaka Mycobacterium tuberculosis ditularkan melalui inhalasi droplet dari orang yang

terinfeksi saat batuk, bersin, atau berbicara. Droplet akan mencapai alveoli dimana bakteri akan difagosit oleh makrofag alveolar, dimana kejadian ini adalah satu serial interaksi antara pejamu dan patogen. Tigapuluh persen individu yang terekspos akan mengalami infeksi dimana 90 infeksi Iaten, dan 10

% dari individu yang terinfeksi tadi akan mengalami

% akan berkembang secara progresif menjadi tuberkulosis

primer. Manifestasi klinis penyakit infeksi adalah basil kese�mbangan antara respons imun pejamu dan virulensi agen penyebab.3 Mikobakteria adalah patogen intrasel ular yang dapat bertahan

hidup dan

berkembang biak di dalam makrofag. Selama infeksi primer makrofag yang terinfeksi .akan terbawa masuk sistem limtatik ke kelenjar limfe regional dan <;fapat tersebar ke seluruh tubuh melalui aliran darah. Dapat terjadi penyebaran ekstra pulmonar dimana infeksi menjadi dorman sampai saat reaktivasi atau infeksi menyebar aktif dan luas.

Lima persen individu

dengan

infeksi laten akan

berkembang menjadi aktif dalam jangka waktu dua tahun, dan lima persen lainnya akan berkembang pada satu waktu tertentu selama hidup penderita. 2•3'4 Selain

strain, faktor genetik manusia juga berperan dalam kerentanan terhadap

infeksi Mtb, terutama gen yang berhubungan dengan imunitas seluler yang meliputi makrofag, T helper 1 dan sitokin?·10 Gen-gen tersebut menyandi fungsi antigen reseptor pada makrofag (a.l. VDR, TLR2), fungsi tran�port besi pada membran fagosom (a.l.

NRAMP 1), sitokin reseptor s_el T (a.l. IL12R), dan sitokin pro­

inflamatori (a.l. IFNG,.TNF,

ILJ2). 4

Struktur dan Fungsi Vitamin D Reseptor VDR adalah anggota dari superfamili reseptor inti honnon-honnon steroi d. VDR membentuk komplek heterod imer dengan reseptor retinoid X

(RXR)

dan berfungsi

sebagai suatu ligan regulator transkripsi yang teraktifasi. VDR tampak sebagai struktur yang moduler yang mempunyai terminal N DNAyang berikatan dan

4

- ·= -= = · · = ==---::-::-=:::;::;:::

berhubungan dengan suatu daerah yang fleksibel terhadap ligan terminal C yang terrnasuk. dimerisasi berhadapan RXR. Komplek RXR-VDR mengatur ekspresi gen melalui vitamin D responsive elements (VDRE) pada promoter gen responsif dari l a.,25�(0H)2D3.22 VDRE terdiri dari dua bagian tengah heksamer yang tcn�usu'!

sebagai pengulangan, langsung dipisahkan oleh tiga pasangan basa ac.ak. Gen

CYP24A1mempunyai dua VDRE dalam promotemya_ Protein inti dari VDR yang

berikatan dengan DNA disusun di dalam bentuk dua modul nukleasi zink. B agian tengah heliks yang dibentuk oleh residu pada sisi terminal C dari gugus zink yang

pertama secara langsung ke dalam lekukan utama dari bagian tengah VDRE. Perpanjangan terminal C memberi spesifisitas tambahan. Sinyal inti terletak d� npt;-,r'

jari..jari dua zink. Ligan pe;ngikat VDR mempunyai heliks yang teraktifasi

:d ,,_,

melaksanakan pengubahan utama atas ligan pengikat. Reposisi heliks yang terakr: ::1:,:

memberi jalan pada komplek VDR-RXR untuk mengambil protein interaksi VDR

yang

dinamakan

koaktifator

untuk

mempromosikan

remodeling

k.romatin,

pengambilan holoenzim polimerase II RNA dan transkripsi gen. Sub domain VDR

p�nting untuk pengikatan DNA, pengikatan hormon, dimerisasi, dan transaktifasi. Penelitian pada beberapa spesies menunjukkan bahwa reseptor ini mempunyai fungsi pleiotropik yang terkoordinasi dengan ketersediaan cahaya, interpretasi biologik 1 a,25- (OH)2D3 dengan berbagai variasi dari proses�proses biologis.22 Fungsi klasik

VDR adalah regulasi konsentrasi kalsium dan fosfat darah dan metabolisme tulang melaui kontrol ekspresi gen pada usus, tulang, ginjal, dan kelenjar paratiroid. Variasi allela dari kromosom 12 gen VDR · banyak tetjadi secara alamiah pada manusia. Varian

alamiah

dapat

dibedakan

dari

sensitifitas

DNA

terhadap

restriksi

endonuklease Fokl (VDRf), Apal (VDRa), Bsmi(VDRb), dan Taql (VDRt) dengan sedikit kasus pada presentasi tempat endonu,klease?3'24,25 Pada orang Eropa dan Asia

tiga bentuk haplotip yang umum adalah pada akhir 3' polimorfisme yaitu baTL,. BatS. dan bATL; dengan haplotip BatS menjadi kurang aktif dalam traskripsi?6

5

. .. ,=: . · · P.AYUNG PENELITIAN · · 0,1 RS'U,D KtJPANG :· • . · "·' ,:,,:

/.:

"

I

· . MDR '

MTB

o;�g susp Test

1

GENETIK MDR/MTB MAHASISWA S21KD,2010

J

STRAI N MTB

PARWATI (Z009�

l

Case control study

GENETIK

2.2 Kerangka Pemikiran

Manifestasi klinis TB adalah hasil interaksi antara Mtb dan respon imun pejamu. Distribusi strain Mtb yang menginfeksi penderita TB di Pulau Timor dan di Jawa berbeda. Di Timor lebih banyak terinfeksi strain Mtb Famili F East Africa-Indian, sementara di Jawa lebih banyak terinfeksi oleh Beijing strain. Selain strain, faktor genetik manusia juga berperan dalam kerentanan

tethadap infeksi Mtb, terutama gen yang bet:hubungan dengan imunitas seluler yang meliputi makrofag, T helper 1 dan sitokin. Gen-gen tersebut menyandi fungsi antigen reseptor pada makrofag (a.l. VDR, TLR2), fungsi transport be$i pada membran fagosom (a.l. NRAMP 1), sitokin reseptor sel T (a. I. IL12R), dan sitokin pro-inflamatori (a.l. IFNG, TNF, IL12). Walaupun dilaporkan bahwa NRAMPJ(D543N) tidak mempunyai hubungan yang signifikan dengan kerentanan pada penderita TB dibandingkan dengan 6

....._

�II

J

kontrol sehat di Jawa, maupun di Sulawesi tetapi pada analisis lanjut polimorfisme

NRAMP J memiliki kerentanan di antara penderita TB yan,?

terinfeksi Mtb

strain Beijing. Penelitian awal yang ·dilakukan di Kupang

menunjukkan adanya hubungan antara

NRAMPI (D543N). Tampaknya �d

perbedaan kerentanan diantara populasi di Indonesia Barat, Tengah dan Timur.

7

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Bahan dan Peralatan

Samp�l diambil pada populasi pasien TB di RSUD Kupang karenu p;;:.nc.Jiii w

ini merupakan bagian dari kohor penelitian yang dibangun di Kupartg, d-�n!i
yang

dimiliki

Unit

Penelitian

Kesehatan

FK

Universit<:\s

Padjadjaran Bandung. Penelitian ini merupakan penelitian kolaboratif dirtuma sampel material merupakah hak milik RSUD Kupang. Akan dilakukan Uateriv;

Transfer Agreement untuk mengatur hal ini. Jumlah sampel:

100 orang pasien TB (kasus baru) di RSUD dipilih dengan metode convwieil"

·

sampling,50 orang pasien TB kambuh/gagal pengobatanm Kontrol: 100 Orang sehat yang tinggal serumah dengan pasien

3.2 Prosedur Penelitian Rekrutmen pasien adalah

setelah hasil pemeriksaan dahak sewaktu, p6gi,

sewaktu, dua dari tiga kali pemeriksaan positif, pemeriksaan sputum dHaku} .-:w dilaboratorium mikrobiologi rumah sakit umum daerah kupang, kemudian di!nkt·\·:.:��

persetujuan informed consent dan wawancara untuk mengisi quisioner yang teiah disiapkan, setalah itu diambil darah vena untuk masing-masing pasien dan k�n'ro! sebanyak

5 mL untuk sreening dan isolasi DNA.

Khusus untuk kontrol harus

dilakukan tes mantoux sesuai araban panel pakar. Kelompok kontrol adalah subtek sehat yang tinggal serumah dan sering membantu pasien ketika sakit.

1. Pasien TB baru

Kriteria Ink1u$i:

2. Menyetujui untuk berpartisipasi Kriteria ekslusi:

1. Kadar Glukosa tinggi 2. HJV/AJDS positif

8

-

· ---

-

-·

3.3 Pemeriksaan drugs susceptibility test:

Pemeriksaan drugs susceptibility test dilakukan di RSUD Kupang dan di supervisi ol�h Balai Pengembangan L'\boratorium Kesehatan Bandung sebagaj upaya peningkatan fasilitas dan kapasitas RSUD Kupang. (untuk tahun ke-2) 3.4 Pemeriksaan genotipe manusia:

Pemeriksaan genotipe manusia dilakukan di UPK FK Unpad dengan menggunakan alat BeadsExpress dari Illumina.

DNA diisolasi dad darah,

kemq.dian dilakukan PCR dan diberi beads yang sesuai dengan Single Nucleotide Polymorphism (SNP) yang dipilih lalu di scan dengan alat laser pada

sistem BeadsExpress.

IltuminaBeadXpress Reader adalah

suatu

sistem

Genotyping SNP yang efisien dan hemat yang dapat mendeteksi puluha:; bahkan ratusan SNP sekaligus (48-384). Teknologi Veracode dan Sistem Bead.Xpress Reader menggunakan digital holographic code untuk mendapatkan

metode deteksi yang robust untuk multiplex bioassays yang mempunyai ketepatandan kecepatan yang tinggi. Variabel:

Dependen

: Kerentanan terhadap Mtb

lndependen

: gen TLR, VDR, NRAMP, IFNG, TNF

3.5. Desain Penelitian Case-control study dengan studi qross sectional pada pasi�n TB. Case 1 adalah pasien TB yang terinfeksi Mtb (pasien baru) Case 2 adalah pasien TB

yang sudah mendapatkan OAT lengkap tapi kambub

(Pasien lama) kontrol adalah orang sehat yang tinggal serumah (konfirmasi dgn tes mantoux) Rancangan adalah case control study desainnya adalah cross sectional. Data polimorfisme dianalisis dengan

menggunakan tabel kontigensi 2x2 kemudian

melihat nilai p menggunakan coefisien contigensi. Case adalah penderita TB dengan basil BTA positif. kontrol adalah keluarga pasien yang serumah dengan pasien tetapi sehat

9

3.6 Tahapan Penelitian Isolasi DNA

Darah dengan antikoagulan EDTA sebanyak

1 , 5-2 m:L

baik pasien drm k('tl��ror

disimpan pada suhli 2-8°C untuk dilakukan isolasi DNA, isolasi DNA dilakukan berdasarkan prosedur Darwis RW, 1980; Bufone GS, 1985 menggunakan kit DNA genomic preparation dari Phannacia, Bahan: 1.

RBC (Red Blood Cell) Lysis Solution, mengandung 150mM Amonium Klorida 0,5mM EDTA, l OmM Sodium Bikarbonat

2. Cell Lysis Solution, mengandung lOmM Tris-HCI pH 8,0, 25mM Diso.J:.:.::rn EDTA, Sodium Dodecyl Sulfat 0,5% 3.

RNA-se 4 mg/mL

4. Protein Precipitation solution, mengandung Ammonium Acetat 5 M 5. Isopropanol absolut 6.

Etanol 70%

7. TE Bufer IX

10

Prosedur Kerja Isolasi DNA: 1. 300 J.LL darah masukkan ke dalam eppendorf 2. Tarnbahkan 900 �L RBC Lysis solution dan inkubasi I 0 menit dalam suhu

ruangan 3.

Sentrifuga 13.000 - 16.000 rpm selama 20 detik untuk mendapatkan p;:;k leukosit, huang supernatan (apabila pelet leukosit masih terlih�t merah, ulangi step 2 dan 3)

4. Tambahkan 300 �L cell lysis pada tabung yang berisi pelet le1,.1kosit, dicampur

hingga homogen dengan cara pipeting atau di vortex 5. Lalu tambahkan 1,5 J.!L RNA-se dan inkubasi 15 menit pada suhu 37°C 6. Tambahkan lar(ttan protein precipitation sebanyak 1 00 f.!L, divortex 1 5 d:�tik

kemudian dicentrifuga selama 3 menit dan supernatannya dipindahkao ke tabung ependorf baru 7. Selanjutnya supernatan ditambahkan 600 JIL isopropanol, untuk mengendapkan DNA,

campur dengan cara membalik-balikkan tabung ± I 0 kali, lalu disentrifuga

selama 1 menit untuk mengendapkan pelet DNA, supetnatan dibuang 8. Pelet DNA dicuci dengan alkohol 70% dengan cara menambahkan 600 f.!L etanol 70% dingin. Disentrifuga selama 1 menit untuk mendapatkan pelet DNA, bmL'1g

aikohol dan keringkan dengan memb�likkan tabung diatas k�rtas tissue sampai alkohol menguap 9.

Selanjutnya pelet dilarutkan d!:mgan 50 f.!L TE Bufer I X. Sediaan ini disimpan dalam freezer -20°C.

Pengukuran kadar DNA menggunakan NanoDrop:

Pengukuran DNA menggunakan NanoDrop bertujuan unt].lk mengetahui kadar DNA dalam sarnpel. Sampel yang digunakan dalam pengukuran BeadsXpress adalah sarnpel dengan kadar DNA 50 ng disimpan pada suhu -20°C. Pers.apail:

Alat Nano Drop di sambungkan ke konek:tor, dan mulai hidup komputer tunggu sampai ready. Alat yang digunakan: Nano Drop, Pipet 25 f.!L

11

--- '==:!!!!! !! !

Prosedur Ke_rja:

1 . Siapkan Suspensi DNA yang akan diukur, pada suhu kamar selama 1 5 menit

2. Bersihkan sumbu nano drop dengan tisue dan tutup. 3. Pipet TE Bufer 15 flL dan masukan pada sumbu read sampel nano drop kemudian tutup dan klik pada blanko, hasil yang keluar harus 0 (alat siap pakai) 4. Bersihkan sumbu read nano drop dengan tissue yang baru

5. Campur DNA agar homogen (gerakkan suspensi DNA b�berapa kali), input data pasien kemudian pipet

1 5 flL suspensi DNA masukkan ke sumbu nano drop dan

tutup klik pada measure

6. Ulangi step 4 dan 5 ketika masukan sampel baru

ALUR PENELITIAN CASE 1

CASE2 � � .... '!l1P � � � 4): o;; ,W., ".;. .,.,...,.,. " . . .....

3;?'' k:� e��6 b1tahtim a Jut��.·:� mu<11ali' k ·�."i���;:1�<:.'::���0.J�6W·:. 1: :··.. ::·. :..:

CATATAN: Sesuai rekomendasi panel pakar bahwa kontrol sehat harus dikonfirmasi dengan tes mantoux (mantoux +}

BAB IV HASIL PENELITIAN

4.1 Subjek penelitian dan karakteristik Sampel Selama kurun waktu pengumpulan data dan sampel dari buia�1 J;··�·

�. ...;

!C· I?

sampai dengan bulan September 2012, sampel yang terkumpul sebanyak 124 n:::-o · ··l TB paru dan kontrol serumah sebanyak 124. Walaupun demikian t:C.;•k

:::-:·:1

•

.•

responden dapat dimasukan dalam penelitian ini karena harus sesua£ t.r�u··: i,j i,;. · ��t maka yang dapat dipak.ai untuk isolasi DNA adalah sebanyak I I 0 hal ini �·"' \.;.;tJ . oleh karena ada 1 (satu) orang HIV positif, demikian pula denga:t memiliki seropositive terhadap HlV (wanita) memiliki suami yang

:. . ·Jilt"

�-:�,

:

kr:

.,.�,

•

,

_

�

)

dengan status HIV non reaktif. .Kriteria inklusi lain adalah diabetes rr.itiu··· r '}

'-IS.!'i.... 1 yang menurut Persatuan diabetes seluruh Indonesia (PERSADIA) 5

c

didiagnosis kadar gula darah sesaat �200 mgldL, jumlah responden yang diduga masuk kriteria DM terdapat 9 (pasien tuberkulosis n= 6, sedangkan kor':-"!

·c1.. ·'

•

n=3). Pasien dan kontrol lain yang tidak memiliki data lengkap untuk ffi.\/. ,_;, 1Q t..i.·n pemeriksaaan darah rutin dikeluarkan dari penelitian. Laju endap darah (LEI.\ •·::ag tinggi merupakan petanda adanya infeksi.Walaupun demikian ada 1 9 pasien TB paru aktif yang tidak. menunjukkan adanya peningkatan LED. Pasien dengan LTl) ;·�.rg normal tetap diinklusi karena mempunyai gambaran TB paru yang positif yaitu dengan adanya basil tahan asam pada sputum. Kontrol yang memiliki L}�;;

>

1.0

mm/jam juga diekslusi. Ternyata cukup banyak kontrol yang memiliki LED diatas batas normal (n=S l), bahkan diantaranya sangat tinggi diatas 50mm/jam (n""'14). Dari hasil wawancara, temyata 3 orang kontrol tidak benar-ben�r tin�gai serumah, tetapi tetangga sebelah rumah yang sering membantu pasien di

n:!:la·

at�11

diantar berobat di puskesmas dan rumah sakit. Untuk menyeragamkan kriL.:-.ia serumah maka kontrol ini di ekslusi.

13

Tabel. l Karakteristikpasien dan kontro1 penelitian

Kriteria Ekslusi

'

Pasien TB

JUMLAH

9

· Kontrol serumah

60

Catatan: Tuberkulosis (TB); Suspek diabetes militus (DM) adalah pastisipan yang rnemiliki rulai gula darah sewal-'tu (GDS) � 200 mgldL; **Laju Endap Darah (LED) > 20 mm/Jam untu:k kc•,uxoi rnerupakan parameter ekslusi

Semua responden baik pasien tuberkulosis maupun kontrol serumah dilakukan skreening darah rutin menggunakan pemeriksaan

hematology analyzer sysmex XT-2000i, Li::.c:'.

gula darah menggunakan alat

chemical analizer Tokyo Boelcy TRX

7010 dan ABX Pentra 400 sedangkan ffiV rnenggunakan dispstik Detennine. Dari basi penapisan parameter ekslusi seperti HIV, suspek DM, LED yang tinggi pada kontro l, status kontrol sebagai orang serumah dan data penunjang lain yang tidak le!lgkap, didapat hanya 1 1 5 pasien TB dan 64 kontrol serumah yang kenmdim1. dilanjutkan dengan pemeriksaan genetik untuk melihat gen-gen yang mempengaruhi kerentanan terhadap penyakit TB.

14

Tabel.2 Karakteristik klinikpasien TB paru dan kontrol Parameter

·

·

Pasien 1'B

Kontrol

n=64

n=l15

t��#Uimt j � � c Z *l :)*fr� * i i � � �� � ���;;w;�:Sf Yr�t� ��f J# 1��g � � { � :t � � 1 f !Z�� T � �:ii.�(���} i�� ;� )� 4f.� tf�? i& � �t� � � t � � �tr$ J%t�;g�� i �:l: �� �� t; J� � .t 5 Laki-laki (n) 58 (50.4%) 29 (45.3%) ·� -� � 1 f� �f� 1 : � � � Jt!J.�� � IDPH��:;{ pj �i�5� �:�;f! � f. 8 � .�;, 1 Y � { � � �f:�:t:1� ?;$%·)�� 1'f. � � )�;� � g � i � 0 � t � � � � l i r M. � � : � � f l� \ � � � ��i l �:fi.���% ):� � f����i�i1 � t � JZ1 � ;;�t!� 11t.� . Umur Median

33.5

34

( glm ) IMT k

: �;��: ��; J �;����Y.:er,�� �!!P8����l�[�6.l��f t i � f {J� :; :::�L� ) � !�;Y .0:i2��� {l �ji� ���� i� � 0 � � r�� :tir:} tt s:�� k �i � � ���fr &�:I :�a �tl¥ : !.�� � � t t � f � � q t 1�:1 )� ;�,;�;!-�:-t.i.-... - .):·.·: Moderate wasting 16-l 7(n)

No wasting >l 8,5(n)

17

l

14

53

Rata-Rata

1 1.06

:

.

�i!l�ffi�grg �!Jl ;: { W.l d.ti )i f( r�l £ W \ � V��Wli;:��t �1��::��;;}·�ri.�-� ��-;������:�1 j �;� � ���f.� �· �K:������·-��r:�t:'�·�Y:Y�I�i�:{;;�-���l 0�t ����t� � if:� ?t � H :�i��� f�:;l;!t?' :::· 13.5

Catatan: IMT: indeks masa tubuh=BB/TB dalam m2, Anemia sesuai dengan standar WHO ada!atl""�j3mgldL untuk laki-laki dan <12 mgldL untuk wanita

Data diatas menunjukkan bahwa pasien TB di Kupang sebany::;Jz !F-' : i 5

berdasarkan gender 50,4% adalah Jaki-laki dan 49,5% adalah perempu-:. ' nL --r �< J

umur responden pasien 35,5 tahun. Hal ini menunjukkan bahwa pasien TB ad<:.h:1h

usia produktif Data diatas juga membuktikan bahwa Perbedaan morbiditas

berdasarkan jender ini dapat bervariasi pada kelompok umur, daerah maupun ctnik.

Rata-rata indeks masa tubuh (IMT) pasien lebih rendah daripada kontrol, indeks masa

tubuh berhubungan dengan pasien TB yang kurang gizi. Jumlah kontrot senJr:lah

yang di inklusi dalam penelitian ini sebanyak n='64 dengan 45,3% adalah laki�laki dan 54,6% adalah perempuan rata-rata umur responden kontrol adalah 37,5 taf.mn. Tab�l 3. Tipepasien tuberkulosis

Tipe Pasicn TB

------·-..--

Jumlah

- --- __ %· ·

- ;j?,l{��7 -� �f�11��� �!)J.::� } ; �_�� 1J� j f�� ·�� :N'% : £ 1 1 :f·} t:��t _ ;�; � � �} £;-� :?t?�:.:t iJ H fr ( � � �� ):��� �; ;?�;: -� �-\ : ;�\ :;·;, :� S n;_) ! f:-�� � \��{;1X��:)�·... . , . � i� �����ft1-:�>Y�:��t .? Lama

22

19.1

Total

1 15

100

Catatan: pasien TB Barn adalah pasien TB dengan hasil BTA

mendapatkan/minum obat antituberkulosis DOTS, pasien TB

positif

Lama adalah

;-� .. .

. .·/; '. c j •, ,J

- ·�-----

yang bdum r•�t7iah

pasien TB deo.gan insil

BTA pos.itif dan pemah minuro obat lebib dari 2 bulan atau tuntas atau sudah 1 atau 2 whun yang l.;i,>, pasien TB gaga! adalah pasien TB dengan hasif BTA positifsetelah bulan ke�2 atau btika fd!vw up akhir pengobatan bulan ke-6.

15

Dari data diatas dapat dilihat bahwa dari 1 1 5 pasien TB terdapat 91 (79, I%) pasien TB yang belum pemah minum obat antituberkulosi.s sebelumnya (pasien barn) dan

22 (19,1%) pasien TB sudah pernah minum obat antituberkulosis tetapi kembaii

lagi dengan basil BTA positif (pasien

lama), dart ada

2

(1 ,7%) pasien TB setelah

dipantau dalam pengobatan 6 bulan pada akhir bulan ke-6 pengobatan basil BTA masih positif. Seharusnya

dikategorikan dalam case

2 penelitian ini, tetapi kar:::;B

kasusrtya sedikit sehingga data tidak dapat dianalisis.

4.2 Latar bclakang genetik pada pasien tuberkuJosis dan kontrol serumah Dari darah 1 1 5 pasicn TB dan 64 kontrol serumah diisolasi DNA dan dilakukan pemeriksaan genotipe gen-gen yang berperan dalam kerentanan terhadap penya1dt TB. Gen tersebut adalah gen yang menyandi reseptor

TLR2, VDR dimana bagiart d<-cd

Mtb dapat dikenali; gen NRAMP1 yang berfungsi sebagai ion terutama transporter zat besi; dan

proinflamatori sitokjn kunci pada imunitas seluler yaiti.I

TNF dan JFNG.

Dari tiap gen ditelusuri dengan studi pustaka single nucleotide polimorphi sms (SNP) yang banyak ditemu:kan berhtJbungan dengan kerentanan terhadap pehyakit TB dari penelitian berbagai etnik diberbagai n�gara. Karena keterbatasan waktu, analisa hanya di lakukan untuk I single nucleotide per gen saja. Berikut adalah gambaran distribusi genotipe dari gen diatas, dcngan menggunakan program Genom Studio. Berbeda dengan

conventional electrophoresis di

mana

visualisasi

pita

DNA

ditampilkan dengan gel agarosa, disini dilakukan scanning yang kemudian dibaca secara in silica. Analisis 96 sampel dalam 1 plate yang terdiri dari campuran pasien dan kontrol, dilakukan secara manual karena program untuk automatisasi tidak ada. Pada tampilan SNP graph, terbagi menjadi

3 genotipe, AA, AB dan BB yang tidak

dapa,t dipisahkan antara pasien qan kontrol. Secara manual dihitung frekwensi jumlah genotipe AA, AB dan BB untuk masing-masing pasien dan kontrol.

16

��G� fr��1��:bJrno �::,p-:-it.-rEr·- ------�"-----"--:-----�-"--�-���!����¢�LJ�f�f'1�1£��-���:��

i

rs\5444 10

682 718 no

47

rs\80b872

732 742 747 7$3 7S6

Gambar 1 Distribusi sing{e nucletotide polymorphism (SNl') gen VDR rs 1544410 Sr-. � PGuph ' 'Y i�:

,,A J ��1

-

-

0Jt.:.. ; rJ ·- -.- ril '•-rc�:·:e-, <::;-_p

·

__

.,.::j�1 rs

17221959

-:

�

��,�:.��-..:-:t.-;t_��:,�-�-�-�-;-���t:;�]��,;:;��� r� ; : jl� cJ ,. IL gO . .i.1 f) iJ - � � ::_: ... ,._

cr

�

z

t

Gambar 2. Distribusi single nucletotide polymorphism (SNP) gen NRAMPl

17

ft14

rsl7221959

L

.i�P G��h "[j;��: t:f;�:. �·-�;t: � ��--------�·-' -·-·r=-�--------�-·-· - ------· 1,\i_ik. !l] •

..

• Ill

{Q:f.� I� Q .P

;r. L!�:

'' '-":·.-" .....·...-------·-· -c�'''"·"·''·•., ,,,._.," ""'··"

..-- .. -----·-·-

rs2276E3l

l.I� Jro),., laZ5BlCl snssm

1541607... 76!ll68 12924826 1545163... Z!JJ!549 2 192526... 7812733 1191597... 323&418 7

6 9%19! Z 4l Sllll4 t

"6855501!

482398)5 . 12323681 t s qJ ?so...

Gar.1bar 3 Distribusi single rlucletotide polymorphism (SNP) gen NRAMPl rs227663 t

' '� ·:J:c·:· - ""' iJ;

I

17 ' 18 19

10

21

U 13 . VI .. l> ..

·.

26 .. 17 • 28

l9 30

.

..... . .

2

Jt

32

rsl1�g93o

6

II

ll1

8

18156lOJ

398

l 6

559 5S5

r<J764SSO

. ll

rs7662029

rslrJ5717S rs374Sl74 152069705

1175405...

265 300

ll4

rs5743 708 ls4149056

rsl721t959

7 6 ll

1215700... 1192500... 76133% 1261628.. 1543606...

233

<JO

. JS

36 ' 37

186 �� liS

1!352139 rs!79<J911 rS7JS239

IS4B04S03 rsl7235409

: 34

13

rS4tJOJ34J

rs2l347t l rs<J9J799 rsl7lt865 rs7J5240 tS7931766 1>1799972

441 480 51� 607 614 619 629 634 651

1 19

1� X 4

12 2 19 2 ll 4 19 12

.

51158371 1543607... 751J2o8 11924826 15�62!;3... 2113!59 4 l19Z526... 7812733 1192597... 32364187 "69961912

4151184! 68555011

Gambar 4. Distribusi single nucletotide polymorphism (SNP) gen 1NF rs3093661

18

L

a:

� J

z

i

i

' 2.5 ! 26

·1

'

I

•

•

'

! 27 I zs I 29 ! 30 i

rs41490S6

U

Gambar 5. Distribusi sinzle nucletotide polymorphism (SNP) gen lFNG

·-�------·-----·-·---------------

rs206971 8

Perlu dilakukan kerja sama team untuk menentukan apakah satu sampel diluar Iingkqran akan diikutsertakan dalam analisis atau diekslusi. Dari gen-gen yang­

diteliti, semua gen memberikan basil penampilan yang dapat dianalisa. Bahkan satu gen telah dirancang dengan beberapa SNP, sehingga dapat dilakukan analisis lanj utan untuk melihat adanya

linkage disekuilibrium. Untuk itu diperlukan waktu analisis

yang lebih lama lagi dan review oleh pakar genetik untuk mendapatkan hasil yang lebih optimal sehingga dapat dipublikasikan dengan baik.

Untuk frekuensi genotipe gen yang berhubungan dengan kerentanan pasien tuberkulosis dan kontrol ditampilkan pada tabel-tabel dibawah ini. HasH distribusi frekwensi genotipe ini masih bersifat sementara karena masih harus diverifikasi bersama dengan kolaborator dan

expert vendor, mengingat secara in silica beberapa

parameter dapat diubah. Demikian pula dengan titik titik yang merepresentasikan subjek, apabila ter1alu jauh dari Iingkaran/c/ustemya dapat di

delete, sehingga jumlah

subjek dari satu SNP dan yang lain dapat berubah-ubah. Untuk itu perlu adanya kesepakatan untuk mencapai pada pelaporan

ini

hanya

agreement hasil genotipe. Karena keterbatasan waktu, diberikan

nilai

signifikansi

antara genotipe

dikontingensi menjadi 2x2 tabel. Beh.1m dilakukan uji untuk

Hardy Weinberg

Equilibrium karena genotipe beh.rm ada agreement dari semua pihak.

19

yang

Tabel 4. Distribusi frekuensi gen TLR2 genotipe A>G pasien TB Paru dan kontrol

Polimorfisme-

Aiel

Frekuensi pada

Frckuensi pada

P

kontrol

asien

TLR2rs5743708

Catatan: *P value .dihitung dengan menggunakan tabel kontigensi 2x:2 dengan referensi GG

Tabel 5. Distribusi frekuensi gen VDR genotipe A>G pasien TB Patu dan kontroi

Polimorfisme

Aiel

Frekucnsi pada

Frekuensi pada

pasien

kontrol

.

_

P

VDRrs1544410

Total

90

38

Catatan: *P value dihitung dengan menggunakan tabel kontigensi 2x:2 dengan rderensi GG

Tabel 6. Distribusi frekuensi gen VDR genotipe A>G pasien TB Paru dan kontrol P Aiel Frekuensi pada Frckuensi pada

.Polimorfism.e

_

_ _ �g� (\:��- �-� n�?;.:� 4 ItX:.r.!t�5{�1�);;r 6;.::����:�!i : t.iftf;�.;�-�� :;J:;:;: y& r 'w ·:�;.d!� . ���,i� �� -�i; �:t � �;'hi-�:::�7�:·:;:�: � - ;..:_:;>�� -1 ·�·:.��

. asien p

kontrol

Catatan: *P value dihitung dengan menggunakan tabel kontigensi 2x:2 dengan referensi CC Tabel 7. Distribusi frekuensi gen SLCl l A l genotipe T > C TB Paru dan k<mtrol Polimor-fisme

Total

Aiel

e

Fr kuensi pada pasicn

87

Frekuensi pada

p

kontrol

46

=-=--= � --:-:-:� --=:--:--: ::: ·--­ � ::-''-:---: � --: Cata tan: *P value dihitung dengan menggun aka n--:tabe l kont igensi 2x:2 dengan re-:: f erensi C:-;:-C -

-

-

-

20

-

-

-

-

Tabel 8. Distribusi frekuensigen IL12B rs3212227 genotipe T>G pasien tB Pam dan kontrol

Aiel

Polimorfis.me

Frekuensi pada kasus

Frekuensi pada kontrol

p

·

IL12Brs2312227

Total

95

48

Catatan *P value �ih.itung dengan menggunakan tabel koritigensi 2x2 dengan referensi TI

Tabel 9. Distribusi frekuensi gen sitokin proinflamatori TNF genotipe kontrol

Polimorfisme

Aiel

Frekuensi pada pasien

A>G pada pasien TB Paru drm.

Frekuensi pada kontrol

p

TNFrs3093661 AG

Total

5

5.4

0

91

0

�'�:\;� .0352'!4·iAt

38

Catatan *P value dihitung dengan menggunakan tabel kontin�ensi

2x2 dengan referensi

TT

Tabel 10. Distribusi frekuensi genotipe gen sitokin proinflamatori IFNG genotipe T>C pasien TB

Aiel

Polimorfisme

Paru dari kontrol

Frekuensi pada pasien

Frekuensi pada kontrol

P

IFNGrs20697l 8

. .

..

. . ..

..

.

.

TC

Total

49

55.6

.

88

52.6

38

Catatan *P value dihitung dengan menggunakan tabel kontingensi

21

-� ,...,-

20

2x2 dengan referensi TT

·ih62f�t1'; i!

L

PEMBAHASAN

W-orld Health Organisasi (WHO) menyatakan tuberlqii9sis di negara berke.tnhl:ill.g paling banyak menyerang kelompok usia produktif (15-55 tahun). tingginya resiko

pada kelompok ini mungkin karena pada usia produktif kesempatan kontak der�g
4.3 Infeksi human

immllnotleficiency virus pada tuberkulosis

TB adalah penyakit yang menular melalui udara. Hal ini diperparah den;;�m

adanya HlV yang menurunkan sistem imunitas seluler. Pada penelitian ini, Hl'.'

bukan menjadi masalah utama, karena rendahnya prevalensi dalam subjek pen:!ii irn

maupun kontrolnya. Mennurut data nasional, jumlah }-:IIV di Nusa Tenggarc. �-;1<.1ur sampai dengan bulan Juni 2012 adalah 1.232.11 Pada penelitian ini, kasus TB dengan

HIV positif perlu ditangani secara serius, apalagi mengingat kontrol serumah yang merupakan pasangannya tidak HIV positif. Karena permeriks�n HIV ini blind di laboratorium harus dilakukan upaya u,ntuk memberitahukan kepada pasien dan . diberikan pre visite maupun post visite untuk menanganinya. Demikian seba!ikny:: dengan passion TB dengan kontrol serumah yang IllY positif, perlu dilakukan pendekatan yang serius. Walaupunpada orang dengan HIV pada orang serumah perlu ditanganj dengan serius. 4.4 Diabetes Mellitus pada infeksi M. tuberculosis

Diabetes merupakan salah satu faktor predisposisi untuk terjadinya reaktivasi

kuman Mycobacterit,Jm tuberculosis dalam tubuh karena diduga adanya penurunan imunitas. Pada penelitian di Jawa, pasien DM ditemukan pada kurang lebih 25% pasien TB 12 sementara pada penelitian ini jumlah pasieri DM tidak menunjul.<-.kan jumlah yang signifikan dibandingkan dengan control (n=2 dari 124) tetapi jumlah ini tidak dapat diuji secara statistik karena jumlah yang terlalu kecil. Secara keseluruhan,

kemungkioan prevalensi OM di daerah ini tidak terlalu banyak, sehingga DM tidak

berkontribusi secara signifikan tvhadap terjadinya infeksi TB

22

4.S Laju endap darah scbagai prediktor infeksi M. tuberkuloss i

Banyak dari kontrol yang diekSiusi karena LED yang tinggi (n=51), bahka:rr

diantaranya (n=l4) memiliki LED yang sangat tinggi, walaupun basil rontgen pada paru tidak menunjukkan adanya kelainan. Hal ini perlu mendapatkan perhatian, health worker untuk partisipasi aktif dalam TB tracing diantara kontrol sermuah.

Kontrol ini perlu di follow up untuk melihat apakah ada perkembangan kearnh TR. sehingga nilai LED dapat digunakan sebagai nilai prediktif yang sederhana di Jaeral:.

Pada penelitian ini Tuberculin Skin Test (TST) juga perlu dilakukan pada b·ntrol serumah supaya dapat diberikan pengobatan preventif TB. Penelitian follow up juga

perlu dilakukan untuk melihat apakah kontrol benar-benar berkembang :n,;il_;,:.J , ( pasi�n TB. Sehiugga dengan demikian penelitian genetik untuk melihat adar, ...-:� .. :�··, ;­ gen yang berhubungan dengan kerentanan TB dapat dikaji ulang.

4.6 Gen yang berhnbungan dengan kerentanan terhadap infeksi daJJ pemJy:!'krf

tuberkulosis Gen-gen yang telah diteliti berhubungan dengan kejadian infeksi aktif Mtb

adalah gen human

leukocyte antig�n (HLA), natural-resistam;e-associatcd

macrophage protein 1 (NRAMP l), vitamin D receptor (VDR), mannose-binding lectin (MBL), interferon- y receptor ligand binding (IFN- yRI), dan interleukin-12

(IL-12).20

Makrofag dan limfosit T berperan dalam respon itntm terhadap tuberkulosis. Makrofag alveolar memiliki reseptor khusus (tool-like receptors= TLRs) yang dapat mengenali bahan-bahan asing seperti lipoprotein Mycobacterium. Makrofag melawan

bakteri dan menghasilkan sitokin, khususnya IL-12 dan IL- 1 8 yang akan merangsang

pertumbuhan limfosit T CD4+ melepaskan IFN-y. IFN-y penting dalam a.ktivasi

mekanisme mikrobisid makrofag dan merangsang makrofag melepaskan Tumour necrosisfactor-alpha (TNF-a.) yang diperlukan dalam pembentukan granuloma. 20-21 Makrofag akan memproses antigen mycobacterium dan mempresentasikannya ke limfosit T CD4+ (helper T-cell) kemudian limfosit T CDS+ (cytotoxic T-cell), akan berbentuk ekspansi klonal dari limfosit T yang spesifik.21

23

L

NRAMP1 adalah homolog manusia dari gen tikus Nramp 1 yang terdapat pada kromosom rnanusia 2q35. VDR adaJah gen yang lokasi pada krornosom 12q dai1

mempunyai beberapa allel varian, modulasi,

yang

mengaktifkan

mycobacterium didalam makrofag.

gen-gen diatas mempunyai efek immuno­

monosit

dan

menghambat

perkembang::
Tumor Necrosis factor-a adalah salah satu jenis

sitokin lokasinya pada MHC klas III, fungsinya mengatur dan memediasi respon pro inflamatory terhadap mycobacterium, dan Interferon

r

(IFN 1) merupakan salah satu

jenis sitokin utama T helper tipe I yang dihasilkan oleh natural killer dan T cell, produksinya

memainkan

peran

penting

dalam

aktivasi

m:akrofag

untuk

4. mengendalikan infeksi mycobaderium. 2° Dari hasil penelitian ini, yang signifikan adalah VDR rs7975232 A>C, NU�ti

p$0.05, berarti terdapat perbedaan yang signifikan antara pasien TB dn kontrol TB.

Walaupun demikian, perbandingan aiel A dan ale! C pada pasien dan kontrol tid�k berbeda bermak.na (p=0.39). Defisiensi vitamin D berhubungan dengan insiden infeksi yang tinggi, kadar 25-0Hase yang rendah berhubungan dengan peningkatan infeksi terhadap Mtb dan M leprae.22 Hal di atas berhubungan dengan lokus

polimorfisme VDR danjenis respon imun antimikobakterial yang terjadi. Aiel VDRt yang kurang aktif berhubungan dengan respon Th 1 terhadap antigen tuberkulin pada

penduduk di India.23 Alel ini mempunyai hubungan dengan rendahnya rasio terhadap

4 infeksi kronik Mtb dan Hepatitis B di Gambia.2 Aiel VDRf yang kurang aktif juga mempunyai resiko rendah terhadap infeksi kronik Mikobakterium malrnoense pada penduduk di Inggris?5 Hal yang penting adaJah bahwa hubungan antara genotip VDR dengan TB dan Hepatitis B serta infeksi M leprae banyak terjadi pada subjek dengan kadar 25-(0H)D3 serum yang rendah dibandingkan subjek dengan kadar yang normal.22 Pada kondisi ini faktor genetik seperti fenotip VDR dan fa�or lingkungan, seperti kurangnya sinar matahari, menyebabkan risiko timbulnya infeksi suatu penyakit. Vitamin D tidak mempunyai efek antimikobakterial secata langsung, namun mampu memodulasi respon imun pejamu dengan menginduksi sekresi IL-10 , 6· 22 2 Chandra, menyatakan bahwa vitamin D3 secara signifikan memperkuat potensi fagositosis makrofag?7 Martineau, menyatakan bahwa pemberian vitamin D 2,5 mg

24

dosis tunggal perhari setelah enam

minggu pada kelornpok

case menunj).Jkkan

imunitas terhadap mikobakterium lebih k.'Uat 20% dibanding kelompok Selanjutnya Martineau mengusulkan �gar menggunakan "Vitamin tambahan pada

Ti3

control.

D sebag�i ·;.;;·.��:::·::

paru. penelitian Martineau juga mendapatkan bahwa kej11dian

defisiensi vitamin D lebih banyak terjadi pada penderita TB.

28 Ustiano'NS�i,

mengatakan bahwa kejadian TB berhubungan dengan defisiensi vitamin D bd ir.:

disebabkan mungkin karena kurangnya pajanan sinar matahari dan pola diet pada

kelompok vegetarian.29 sedangkan Zmuda, menyatakan bahwa defisiensi vimr:-.:.1 D

dan polimorfisme gen VDR pada kelompok Asia Gujarat berhubungan dengan resi'lJ., tinggi terinfeksi

mycobacteriutn.30 Amin menyatakan bahwa kelompok pender>·� i 't'

paru yang mendapat tambahan vitamin D menunjukkan perbaikan gejala lcliDh de!'' konversi positivitas pada sputum, serta perbaikan gambaran lesi radiologis yang lebih baik dibandingkan kelompok kontrol.32

Limitasi penelitian Pemeriksaan genotipe pasien dan kontrol yang mepet waktu sehingga analisis menyeluruh bel�m dliakukan. Perlu adanya agreement hasil dari 3 pihak untuk dapat memastikan genotipe yang diperoleh secant

diubah-ubah.

25

in silica, mengingat parameter dapat

BAB V PENUTUP

5.1 Simpulan 1.

Dari hasil penelitian diatas dapat disirnpulkan distribusi polimorfisme tidak ada hubungan (p2::0.05), tetapi untuk gen VDRrs rs7975232 A>C, Nilai p�.05, berarti terdapat perbedaan yang signifikan antara pasien TB dan kontrol TB. Walaupun demikian, perbandingan aiel A dan ale! C pa(Ja pa�ien dan kontrol tidak berbeda bermakna(p

2.

=

0.39)

Di Indonesia khususnya di Kupang beberapa SNP yang dianalisis dari gen NRAMP, TLR2, IFNG dan TNF kernungkin�m tiqak berperan.

5.2 Saran Melakukan studi operasional dan partisipasi aktif RSUP untuk melakukan TST pada kontrol serumah dalarn upaya pencegahan. Melakukan pendekatan terhadap pasien dan kontrol yang terkena HIV. Melakukan penelitian lanjutan dengan pemeriksaan spoligotyping untuk dapat membuktikan adanya hubungan antara gen kerentanan tersebut dengan strain Mycobacterium tuberculosis. Melakukan penelitian lanjutan dengan mengembangkan pemetaan epidemiologi molekular kuman Mycobacterium tuberculosis yang kemungkinan spesifik di daerah NTT. Berkolaborasi dengan konsotsium vaksin TB Nasional untuk melakukan

sequencing whole genom Mtb spesifik dari daerah NTT

26

UCAPAN TERIMA KASlli Terimakasih disampaikan kepada Badan penelitian dan pengembangan kesehatan d&lam hal ini RISBIN IPTEKDOK 2012 yang telah membiayai penelitian ini. kepada yang terhormat Dekan FK UNPAD yang telah memberikan kesempatan kepada

peneliti untuk melakukan anailisis di UPK FK UNPAD. Kepada koho::'or�u-•r

penelitian ini dr Edhyana Sahiratmadja� PhD, dr Ani Melani Maskun, PhD k.;' Jt ;L�

mengucapkan banyak terimakasih karena semua bantuan dan kebersamaanya sehingga penelitian dapat diselesaik:an, untuk Mbak Tri, Mbak Nun.il yang telah

membimbing tintuk melakukan isolasi DNA. Juga kepada sdri. Dias dari FMIPA Biologi UNPAD yang m�bantu untuk melakukan isolasi dan merapikan sampd

_

Terimakasih juga kepada dr Trevino Pakasi di FK U I (kedokteran korn-..m i(s<

yang telah banyak memberikan masuls:an tentang penelitian ini. Untuk Direktur RSUD Prof Dr WZ Johannes Kupang dr. Alphonsius Anapaku, SpOG yang tel.ah memberikan kesempatan kepada kami untuk ikut dalam proyek ini. Dr Samson

E. �'eron sebagai kepala SMF patologi Klinik yang memberikan masukan dan supm:

dalam penelitian ini. Juga ternan-ternan yang telah membantu dalam menyelesaikm:

penelitian ini dalam pengambilan sampel dan data paskn un,tuk ternan-ternan di poli DOTS dan Laboratorium RSUD Prof Dr WZ Johannes Kupang Dwi Dianasari, Kristina Lika, Yudiana I. Saputri, Ita, Ayorince Banunu, Maria Tersilde B. Ternan­ ternan di Dinas Kesehatan Provinsi NIT, Dinas Kesehatan Kota Kupang, Dinas

Kesehatan Kabupaten Kupang yang turut andil dalam penelitian saya ucapkan terima kasih.

27

T DAFTAR PUSTAKA

1 . Aditama YJ. Indonesia berhasi l turunkan TB sebesar 45'%. Seminar Hari TB Sedunia 2012, 3 1 Maret 2012 di Jakarta. Di unduh tangga1 29 November 2012 tersedia d�ri: http://www .sehatnews.com/20 12/04/02/indonesia-berhasilturunkan-insiden -tb-sebesar-45-persen/ 2. Kleinnijenhuis J, Costing M, Joosten LAB, Netea MG and van Crevel R. Inn ,' Immune Recognition of Mycobacterium tuberculosis. Clin and development imunology.2011

, ·

3. Hoal EG, Moller M. Host genetics and predisposition to tuberculosis. Curr Allergy C/in /mmuno/ 2004; 17(4):160-165 4. Merza M, Farnia P, Anoosheh S, et at. The NRAMPI, VDR and 11\Jl ', gcn Polymorfisms in iranian Tuberculosis Patients: The study on Host Susccp��biW.f. The BrazJ oflnfec Diseases. 2009;13(4):252-256 5. HUGO Pan-Asian SNP Consortium, Abdulla MA, Ahmed I, Assawamakin A, Bhak J, Brahmachari SK, Calacal GC et.al. Mapping human genetic diversity in Asia. Science 2009;326(5959): 1541-1 545 6. Sahiratmadja E, Wieringa FT. van Crevel R, de Visser A W, Adnan I, Alisja!•l:2?:..:: B. Slagboom E, Marzuki. S, Ottenhoff TH, van de Vosse E. Marx JJ. lron deficiency and 'NRAM.P l polymorphisms (INT4, D543N and 3'UTR) do not contribute to severity of anaemia in tuberculosis in the Indonesian population. Br J Nutr. 2007;98(4):684-690 7. Hatta M, Ratnawati, Tanaka M, Ito J, Shirakawa T, Kawabata M. NRAMP l /SLC I I A gene polymorphisms and host susceptibility to Mycobacterium tuberculosis and M. Leprae in south sulawesi, Indonesia, Southeast Asiant J Trop Med Public Health. 201 0;41 (2):386-394 8. van Crevel R, Parwati 1, Sahiratmadja E, Marzuki S, Ottenhoff TH, Netea MG, van der Ven A, Nelwan RH, van der Meer JW, Alisjahbana B, van de Vossc L. Infection with Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains is associated with polymorphisms in SLC l l A 1/NRAMPl in Indonesian patients with tuberculosis. J Infect Dis.2009(1 1):1671-1674. 9. Pak.rasi TA, Melani A, Bramantyo A, Putera I, Syahmar I, Karyadi E, Sahiratmadja E. Distribution of 0543 NRAMP l polymorhism in tuberou1osis patients from Kupang, East region of Indonesia. Med J Indonesia. 20 12;21: 160165

28

10. Bellamy R. Genome-wide approaches to identifying genetic factors in host susceptibilityto tuberculosis. Microbes Jnfoct. 2006;8(4): 1 119-1 123. 1 1. Dhiman N, Ovsyannikova IG, Vierkant RA et. a!. Associations between cytokine/cytokine

receptor

single

nucleotide

polymorphisms

and

humoral

immunity to measles, mumps and rubella in a Somali popu lation.

Tissue

Antigens. 2008.72(3):21 1-220 12. Segat L, Brandao LA, Guimaraes RL, et.al. Polymorphisms in innate immunity genes andpatients response to dendritic cell-based HIV immune-

treatment. VacCine. 201 0.28( 1 0) :2201 -2206.

13. Sikora M, Ferrer-Admetlla A, Laayouni H et.al. A variant in the gene FUT9 ..h'! . associated with susceptibilitY to placental malaria infection.Hum Mol Geud . 2009.18(16):3136-3144 14. Dirjen PPL&PL Kemekes RI. Laporan situasi perkembangan HIV&AIDS di Indonesia s/d Juni 2012. 2012 p. 10 15. Alisjahbana B, Sahiratmadja E, Nelwan JE, Purwa MA, Ahmad Y, Ottenhorf THM et al. The Effect of Type 2 Daibetes Mellitus on The presentation and treatment

response

of

pulmonary

Tuberculosis.

Clin

lnfec

Diseases.

2007;45(4):428-435 16. J3ellamy R, Beyers N, McAdam KP, et al. Genetic Susceptibility to tubeculosis in Afrie<1n: a genom- wide scan. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 8005-8007 17. Shukla RK, Kant S, Bhattacharya S, Mittral B. Association of Cytokine gene

Polymorphisms in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Oman

medical Journal. 2012;27(4):285-290

1 8 . Angraini 19. Parwati I, van Crevel R, Sudiro M, Alisjahbana B , Pakasi T, Kremer K, van der Zanden A, van Soolingen D. 2008,. Mycobacterium tuberculosis population structures differ significantly on two Indonesian Islands. J Clin Microbiol. 46(1 1):3639-3645. 20. Van Crevel R, Ottenhoff THM, Van der Meer JWM: Innate immunity to mycobacterium tuberculosis. Clin Microbial Rev 2002; 15(2):294-309

29

2 1 . Schluger NW: Recent advances in our understand ing of human host responses to tuberculosis. Respir Res 200 I ;2: 1 57-1 63

22. Overbergh L, Decallonne B, Valckx D et al: Identification and immune

regula�ion

of 25-hydroxyvitam in D-1 -a.-hydroxylase in murine macrophages. Clin Exp

Immunol 2000; 120:139-146 23. Rook GAW, Seah G,

Ustianowski A: M. tuberculosis: immunology and

vaccination. Eur Respir J 2001;17:537-557 24. Bellamy R, Ruwende C, Corrah T et al: Tuberculosis and chron ic hep·t:.�.; iJ

virus infection in africans and variation in the vitamin D receptor gene. J Infect

Dis 1999: 179:721-724 25. Cantorna MT, Zhu Y, Froicu M, et al : Vitamin

D

status, 1,25-dihydrc.:.;:·, ·

D3, and the immune system. Am J Clin Nutr 2004;80(suppi): 1 7 1 7S-1 720S 26. Hayes CE, Nashold FE, Spach KM et al. The immunological functions

....r

the

vitamin D endocrine system. Cell Mol Bioi 2003;49(2): 1 - 1 9 27. Chandra G, Sel varaj P, Jawahar M S et al: Effect of vitamin D 3 on phagocytic Potential

of

macrophage

lymphoproliferative response 2004;24(3):249-257

with in

live

mycobacterium

pulmonary tuberculosis.

tuberculosis J

Clin

.:-, - n J

Immunol

28. Martineau AR, Honecker F, Wilkonson RJ et al: Vitamin D in the trcaune11t pulmonary tuberculosis:a review. Center for health sciences, Barts and t 1·:; London school of medicine and dentistry United Kingdom 2006. p 1-13

29. Ustianowski A, Shaffer R, Wilkinson RJ et al: Prevalence and associaf0•1s of vitamin D deficiency in foreign-born persons with tubercuJosis in london. J Infect

2005;50:432-437

30. Zmuda JM, Cauley JA, Ferrell RE. Molecular epidemiology of vitamin D receptor gene variants. Epidemiol Rev 2000;22(2):203-2 17 3 1 . Adam JS. Vitamin D as a defesin. Journal Musculoskelet Neuron Interact. 2006;6 (4): 344-346

30

¥4

32

illu m l n a�

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

Experi enced User Card Day 1 ·Make ODNA rnput:"t.ambdio DNA, P"!CoGreen dsONA. 1X TE :OutPut; Standa,-d and .S;�mple QDNA Plates -i�ead QDNA

MDkc PCR

·. InpUtStandard a�d

· S:.mple QONA- Plates

. o;rtput:.Fil" idcn:tifying 'qu_a_ntity 9_f:DNA .in ,the . . · .·: : sampl.epl�ta

l

Bi'ld PCR

Add MEL

Hends...,: -30 (!lin Incubation: 15 min · RoegGf'ts: MEL; AMI, UBt Output: ASE. Plate

_H�()�: -30min

•

D ay 2

. Hond..:O�: -15 min

Reagonts: MMP, UDG, DNA Polymerns'o 0<�tP'1: PCR Pl•to

. Hands--<1fl: -30 min . lncubitl . Reagent$: MP.> . Output: PCR Plate. Makc !N1 '•L

-

Hand�tl..:--� .0 m'� e agerit o: .u£.:.. . !-<-' " .R .

. NoOH . ·qutput: INT Flaoo .

·,

lnoc PCR

. Make SUD .

H�nds-on: -1 S min

fncUbaon: it 30 min Reagent.: MS1 Output: SUO Plate

Hands-�: -30 min Reogents: UB \1 IPI Output: PCR Plate .

Cyde t'CR

Cyclo: 2 hours 45 min

PrecipSUD

Hanc;b-on; -30 min Dry: 1:5 min Reagent.: 2i"'P"nol, PSI Output: SUC> Plate

Hold ovemight at

10"C Output: PCR Plate

·HybVB''

tlands-o'" • .':

,,,, , Incubation: 3 hours

. R_.,u: Na<JH, Mi-G' :·_Output: VJr f' �.:"I

!

WashVBP

Ha�-on: -15m·� R
J:r.age VBP

llcsuspand

SUD

Hand.S-<:>r.: -15 min Reagent.: RS1 0�: SUD PlotQ

1

Mal<� ASE

Hands..on: -20 min Incubation: 2 to 16 hours R<>agerru: OPA, OS1 Output: ASE Plat<>

Scan �mples/hoW'): 91>-plex: 60

3e4-plex: 27

Output: Image and Data Fifes ·

m ne-P
� mJdstorcva

-�·

"!'·t / C\7t�on� step,

�q� i:c'�lon

For optimal sample trackin9 and quality control, fill out the Sample Sheet and Lab Tracking Worksheet as you perform the assay.

C�!�lc:>!J # VC-901-1001 Part# 1 1275211 Rev. A

i l l u m l n a� 'l

Go!denGate Gene>typing Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre-PCR)

Experienced User Card

Make ODNA Plate (Optional)

This process uses the Ouant-iT PicoGreen dsDNA quantitation reagent

to quantitate double-stranded DNA samples for the GoldenCate Genotyping Assay for Vera Code .

Estimated Time Hands-on: 20 minutes per plate, plus 1 0 min tes to prepare the PicoGreen

u

Consumables

, !ouantity .. F):J=..d Hy ;storage ,.._,). -�·--·-···"'�--� -+ --+ i see instructions \f -20"C PicoGreen quantitation reagent , ;

tm

I

dsDNA

,,,

...�-.-·-�._o,••·•o,.� "'' '�' '•'O> �0 ,.

1X TE

}

,, � 0 ,• �-•.-�

,o,• �-�.No•o �

.

,.,.,._ "�-·· .�M. .·-�·�·

00-·

··� � ••

·

.... --

(MIDI)

.. -. ·-

-

-

Preparation [ 1

. '-"·-·

.

... -- ·--- + ----------- ----· - - ---- ! 1 per 96 samples ------- --- ·--· .....J. . .. .... -·

.

-

.

Fluotrac 200 (96-well black flat-bottom) plate .-

'•'

.

;

2·per 96 samples J.

.

.. ..

(

_

.

-·- ·

----

,

..... . ·• .

-

S· ,�.

__

_

)�20:c;·· - - ·-·-- - i·u�r

----·

i

..

-.-...... - .......

1

,

---- ..... -·--·- . .... . ... .......

__

··!' (Room iUser J temperature i

••• ••�M-' �•••··-··0

'See instructions

96-well 0.65 ml microplate

.

:v_,,_,

j - - . · Lambda oNA-- ··-- .. . · ··:.'·s�:·;�;���i��� .

-. ..... . . .. ..

-

i

e

.

l .,1 1'

.

..

....

...___

--- -

i

�

----- ------- ...

l' User ! -

.. -- .. ...., ... ,

i User

L_

Remove PicoG reen reagent from freezer and thaw at room tempemture for 60 minutes in a light-impermeable container.

[ 1

Label a 96-well MIDI plate "Standard QDNA"

[ ]

Label a 96-well black flat-bottom plate "Standard ODNA. �

[ 1

Label a. 96-well black flat-bottom plate "Sample ODNA."

Steps Make Standard ODNA MIDI Plate

( ] 1.

Place stock Lambda DNA in well A1 of the Standard ODNA M!�...?! pi ate and dilute it to 75 ng!JJI in a final volume of 233.3 JJL

] 2.

Add 66.7 tJi lX TE to well Bl ofthe same plate.

] 4.

Pipette the contents of A1 up and down 10 times to mix.

) 3. Add 100 t-�1 1 X TE to wells C, D, E, F, G, and H of column plate .

1 of the same

) 5. Transfer 133.3 JJI of Lambda DNA from well A1 into well 8 1 , and then pipette the contents of well B1 up and down 10 bmes. ] 6.

Catalog # VC-'101-1001

Part# 11275211 Rev. A

Change pipette tips. Transfer 100 JJ! from we!! 81 into we!! C 1 , and then pipette the contents of well C1 up and down 1 0 times. __

Golden0ate Genotyping Assay for VeraCode M anual Protocol (Pre-PCR)

Experienced User Card [ ] 7.

Ch ange pipette tips. Transfer 100 !JI from well C1 into well D1, and then pipette the contents of well D 1 up and down 10 times.

] 8.

Change pipette tips. Transfer 100 !JI from well D1 into well E1, a nd then pipette the contents of well E1 up anq down 1 0 times.

] 9.

Change pipette tips. Transfer 100 !JI from well E1 into well F1 , and ther. pipette mix the contents of well r1 up and do wn 10 times.

] 10. Change pipette tips. Transfer 100 fJI from well F1 into well G 1, and then pipette the contents of we ll G 1 up and down 10 times.

] 1 1 . Do not transfer solution from w el l G1 to well H1. Well H 1 serves as the blank 0 ng/f-11 Lambda DNA. •.

·

( I 12. Cover the plate with a cap mat. [ ] 13. Do one of the following: •

•

P roceed to Prepare Standard QDNA Fluotrac Plate with PicoGreen Dilution.

Store the plate at 4°C for future use.

Prepare Standard QDNA Fluotrac Plate with PicoGreen Dilution

[ ]1.

1 2. J 3.

] 4. ] 5. [ ! �[ ] 7.

Prepare a 1 :200 dilution of PicoGreen to 1X TE, using t�e kit su pp!ie: and a sterile 100 ml plastic container wrapped in aluminum foil.

Cap the ste rile plastic container and vortex to mix. Pour the PicoG reen/1 X TE dilution into a sterile reservoir.

Using an 8-channel pipette, tra nsfer 195 !JI PicoGreen/1X TE dilution into each well of columns 1 an d 2 of the Standard ODNA Fluotrac plate. Add 2 �! of each stock Lambda DNA dilution from column 1 of the orig inal Standard ODNA MIDI plate into the corresponding wells of columns 1 and 2 in the Standard ODNA Fluotrac plate. Pipette rnix. the <;Qntents of the new St�md<�.rd QDNA plate.

Immediately cover the plate with an aluminum adhesive seal.

Prepare Sample QDNA Fluotrac plate with PicoGreen a.nd DNA

[ ] 1.

I ] 2.

Transfer 1 9 5 iJI of the PicoGreen/1 X TE d ilution that you made earlier into each well of the new black flat-bottom plate labelled " Sample ODNA".

t. dd 2 1-11 sample DNA to each well of the Sample ODNA plate.

. .

[ j 3.

Pipette mix the contents of the Sample ODNA plate.

( ] 5.

Proceed to Read ODNA Plate (Optlonai).

[ ] 4.

Immediately cover the new p late with an a lumi n um adhesive seal.

(<�t<.�I05J # VC-901-1001

Part # 11275211 Rev. A

� · -

GoldenGa.te Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre-PCR)

Experienced User Card

2

Read ODNJ.\ Plate (Optional)

This process uses the Gemini XS or XPS Spectrofluorometer to provide DNA-specific quantitation. lllumina recommends using a fluorometer, because fluorometry provides DNA-specific-quantitation, whereas spectrophotometry may also measure RNA and yield values that are too high.

Estimated Time Fluorometer: 5 minutes per plate

Steps [ ]1.

Turn on the fluorometer.

[ 1 2.

At the PC, open the SoftMax Pro program.

[ I 3.

Load the ltlumina QDNA.ppr file.

! 4.

Se.!ect Assays f N!,!deic A!:ids f !!lumina QDNA.

1 5.

Place the Standard ODNA Plate into the fluorometer ioadiilS ! ,,_:, ''";;;� , well A1 in the upper-left corner.

1 6.

Click the blue arrow next to Lambda Standard.

J 8.

Remove the Standard ODNA Plate from the drawer.

1 7.

] 9..

Click Read in the SoftMax Pro interface.

C!ick the b!ue arrov-; next to Stand ard Curve to viev-1 the standard curve graph. If the standard cuNe is acceptable, continue with the sampk�

plate. Otherwise, click Standard Curve again.

.

] 10. Place the Sii.lmRI� QQNA Rlet.� in th� r�ii.lc:l�r vvith w�ll A1 ir th$ '·'PR�r l�ft. corner.

) 1 1 . Click the blue arrow next to QONA#1 and dick Read.

) 1 2. Remove the plate from the drawer.

) 1 3. Repeat steps 1 0 through 1 2 for all sample plates that you want to quantitate.

] 14. Once a!! plates have been read, dick Fi!e I Save to save the output data file (*.pda).

} 1 5. Proceed to Make SUD Plate.

C<�t<�I<J9 # VC-901-1001

Part# 1 1275211 Rev. A

illu m l na� 3

Make Plate

SUD

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre-PCR)

Experienced User Card

I This proces activates sufficient DNA of �ach individual sample to be in the GoldenGate Genotyping A;>say for VeraCode. used I

I

once

s

I

Estimated Time Hands-on: - 1 5 minutes Incubation: 30 mil")utes

Consumables

Item 10 mM Tris-HCI pH 8.0, 1 EDTA (TE)

oNA·��pi�s and controls 96-well 0.2 ml skirted ic pla ro

I

l user

e j -t����:�r - - i -20°C ; 1 tube per SUD ! Iliumina j j plate [ 3s4 196rio:c:· ----- lus�r . l ! - - - iu�� i1 persa�-���-piate- -;l i . .! . - - . . _L J

mM

MS 1 reagent

m

j See -I

jsupp"·1 ' ""

I iStorage

. 1Iauanttty instructions __

_

1 Room

--

or

_

-

!

-�

te

- -- -

_ _ _ _____

-

_ _

_ __ _

Preparation Preheat the heat block to 95°C .

Turn on the heat sealer to preheat it. Allow 1 5 minutes.

Thaw the MS1 re agent tube to room temperature. Vortex to mix t!-... c9ntents, and pour the entire tube into a new, non-sterile reservofr. Thaw the DNA samples and controls to re>om temperature and vortex to mix the contents.

Apply a SUD barcode label to a new m icrop late.

Steps [ } 1.

Normalize DNA samples to 50 ng/1-11 with 1 0 m M Tris-HCI pH 8.0, 1 mM EDTA

) 2.

Add 5 !JI MS1 reagent to each well of the SUD plate.

J 3.

Using an 8-channel pipette, transfer 5 !JI normalized DNA sample to each well of the SUD plate. Change tips between column dispenses.

[ I 4. Apply a microplate foil heat seal to the SUD plate and seal it witi1 the heat sealer (3 seconds).

the SUD plate to 250 xg.

1 5.

Pulse centrifuge

] 8.

Place the SUD plate in the preheated heat block and close the

1 6. Vortex at 2300 rpm for 20 seconds. ] 7. Pulse centrifuge to 250 xg. Catalog # VC-901-1001

Part# 1 1275211 Rev. A

-

lid.

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre-PCR)

Experienced User Card [ } 9.

Incubate the SUD plate at 95°C for exactly 30 minutes.

[ 1 10. Pulse centrifuge the plate t6 250 xg.

1 ) 11. If you plan to perform the Make ASE protocol today, then immediatdy set the heat block to 70°C.

] 12. Proceed to Precip SUD Plate.

C�t<�log # VC-901-1001 Part# 11275211 Rev. A

..

illuml n a® 4

Precip SUD Plate

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol (Pre-PCR)

Experienced User Card

In this process, PS1 and 2-propanol are added to the SUD plate to precipitate the DNA and remove excess DNA activation reagent MS1 .

Estimated Time Hands-on: -30 minutes Drying: 1 5 minutes

Consumables

!Storage

Item

!

PS1 reagent 2-propanol ·---··-- ··-----

... -· .......

' - ·

.. ,,.,

I

. . ..... ..... . . i,

'

.

.. ....,_ .,, ..� ......

Preparation [ ] [ ]

Pour

1 ml PS1 into a reagent reservoir.

Pour 2 ml 2-propanol into a second reservoir.

Steps { ] 1.

Remove the heat sea l from the heated SUD plate..

.

[ ] 2.

Add 5 1-JI PS1 reagent to each wE;!II ofthe SUD plate.

[ ] 3.

Seal the SUD plate with clear adhesive film.

[ ] 4. [ ] 5.

[ ] 6. j 7.

] 8. J 9.

Pu!se centrifuge the plate to 250 xg.

Vortex at 2300 rpm for 20 seconds or until the solution is uniform ly blue.

Remove the film and add 15 f.JI 2-propanol to each we II of the SUD plate.

Seal the SUD plate with clear adhesive fiim.

Vortex at 1600 rpm for 20 seconds or until the sol.ution is uniformly plue. Centrifuge the sealed SUD plate to 3000 xg for 20 minutes. A faint blue

pellet should be at the bottom of each well.

Perform the next step i mmediately to avoid dislodging the activated DNA pellets. If any delay occurs, recentrifuge to 3000 xg for 1 0 minutes before proceeding.

] 1 0. Remove the SUD plate seal and decant the supernatant by inverting the SUD plate and smacking it down onto an absorbent pad. '

!

Do not tilt the plate, as this can cause cross-contamination i between wells. Tap the plate firmly enough to decant ali i the supernatant; tapping lightly will not work as well.

1

[ ] 1 1 . lap the inverted plate onto the pad to blot excess supernatant. Catalog # VC-901-1001

Part# 1 1275211 Rev. A

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre-PCR)

Experienced User Card } 1 2. P[ace the inverted SUD pla�e on an absorbent pad and centrifuge to 8 xg for 1 minute.

VwARNING ! 1

!

Do not spin the inverted p!pte to more than 8 xg, or the

sample will be lost!

] 1 3. Set the plate upright and allow it to dry at room temperature for 1 5 mjnutes.

) 14. Do one of the following: � •

Proceed to Resuspend SUD Plate.

Seal the plate with adhesive film and store at -20°C for up to 24 hours.

C->ta!og # VC-901-1QQ1 Part# 11275211 Rev. A

.- - - --:;·

·l �== � l ·n:: :: ; z,I �T I s-:,= -! , ,�: :I :BB �� ,:I ·_:l'- = · ==::::

-

_ -· _ _

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protoco l

(Pre-PCR)

Experienced User Card

5

Resuspend S U D Plate

In this process, RS1 is added to the SUD plate to resuspend the DNA.

Estimated Time Hands-on: -15 minutes

Consumables

Item

j auantity

+j Bottle ... J.. . ..

-

RS 1

reagent .

--·- - · - ------ -···· _

___

Preparation

l I

j storage

__

!supplied

..;. ! e .!t���- �-�-r�- j

By -+' --·� - --·->o <" '-W 1 Room Iliumiii<

-

.

_

Pour 1.2 ml RS1 into a reagent reservoir.

Steps [ ] 1.

[ I ;l.

[ J 3.

Add 1 0 f.!l RS 1 reagent to each well of the SUD plate. Seal the SUD plate with microp late clear adhesive film. Pulse centrifug·e to 250 xg.

1 Jl. J �·

Vertex at 2300 rpm for 1 minute or unti! the blue p�!!et is comp!ete!y dissolved.

] 5.

Do one of the following: • •

C:
Proceed immediately to Make ASE Plate.

Store the SUD plate at 4°C overnight or at -20°C for one month.

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre-PCR)

Experienced User Card

6

Make ASE Plate

This process combines the biotiriylated gONAs frotn the SUD plate with query ol igos, hybridization reagents, and paramagnetic pa rtides in an

i

Allele Specific Extension (ASE) plate. The ASE plate is placed in a heat block and the query oligos for each sequence target of nterest are allowed to an nea l to the biotinylated gDNA samples. The gDNA is simultaneously ca ptu red by paramagnetic particles.

Estimated Time Hands-on: -20 minutes Incubation: 2-1 6 hours

Consumables

081 reagent

- -- --- -·

�Quantity

!Storage

I

Item

'

i 1 tube per plate .. ,...,_. ... . ..... . . .. .. ]. .. ..._ ..

····· ''"' '•'"' .

OPA reagent

96-well 0.2 ml microplate

.

. ...

.

.

... j .. . . . . ! 1 per SUD plate .

. .

..

.

..............."..._......

1 1 tube per plate . .

skirted

� • •. ��t..•�- -- ,.

.

.

.

. . , -- .

.

-

.....

- ...

·

ti -20°C

· .. .... . ..........

i -20°C

jlllumina jlltumina

......... . ... .. . - ..... •j·�

.

�ru��;�

. J

I

'

. � •.. --�--

---�-

. ..

. ..

!

. . . __, .

.... ..

..

...

..

Preparation Preheat the hea t block tb 70°C. Turn on the heat sealer to preheat it. Allow 1 5 minutes.

Thaw the OPA reagent tube to room temperature. Vortex the tube, and then pulse centrifuge to 250 xg. Pour the con tents of the OPA tube into a reagent reseNoir.

[ ]

Thaw the 081 reagent tube to room temperature. Vortex the tube to

[ 1

Apply an ASE barcode label to a new microplate.

completely resuspend the beads. Pour the contents of the OB1 tube Into a second reagent r�seNoir. Do not centrifuge the O B 1 tube.

Steps [ }1.

Pulse centrifuge the SUD plate to 250 xg.

[ 1 2. Add 10 !JI OPA reagent to each well of the ASE plate. [ ] 3. Add 30 1-11 081 reagent to each weH of the ASE plate. ] 4. Carefu!!y remove the heat seal from the SUD plate.

] 5. Transfer 1 0 !JI of biotinylated sample from each well of the SUD plate

(where 10 !JI is the entire volume) to the corresponding well of the ASE plate.

] 6.

Using a microplate heat seal, heat-seal the ASE plate (1 seconds).

] 8.

Vortex the ASE p!ate at 1600 rpm for 1 minute com pl etely resuspended.

J 7.

) 9. Catalog # VC-901-1 001

Part # 1 1 275211 Rev. A

Pulse centrifug e the ASE plate to 250 xg.

or

unti! a!!. beads

are

P lace the sealed ASE plate on the 70°C heat block and close the lid .

"

i l luml n a®

GofdenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocbl

(Pre-PCR)

Experienced User Card } 1 0. Immediately reset the temperature to 30°C

J 1 1 . Allow the ASE plate to cool to 30°C for about 2 hours. The ASE pfate may remain in the heat block for up to 1 6 hours.

] 12. Proceed to Add MEL.

CataiQg # VC-901-1 OQ1 Part # 1 1 27521 1 Rev. A

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(F're-.PCR)

Experienced User Card

7

Add

MEL

In this process, AM1 and UB1 reagents are added to the ASE plate to wash away non-specifically hybridized and excess oligos. An enzymatic extension and ligation master mix (MEL) is add@d to each DNA sample. The extension and li!;jation reactior,� occurs at 45°C. Work quickly during the washes to prevent the beads from

dry;· :;:: c�·Jt.

Estimated Time Hands-on: -30 minutes Incubation: 15 minutes

Consumables . IQ ( uantlty [storage Item !---- --� -. ....... -. ... ..... . . , -+ !-

AM1 reagent UB1 reagent

MEL reagent

-·-· -·'-�--� ---�·-

- -

..,_

_,

•

.. . .._

.�.·-·

.....

• ••v

--��J

i Bottle

.{

..

-�

.. -··..

Bottle !

. ..... ...., ··-··· �--�-.--

·· -- - ···--

--

l4°C

. .... ....... . . .. ...... . .

i1 tube per plate

,•._.�j•·-�·-�•· • • '

-

-

:L!,w, ..

........---.. L---��--� ·----�--- .............. .

• •• •

f 4°C

l ,

; -zooc

-'·••

· --

tltl'

,

li.l-

-

.

. . l •tl•J.

·jui,;,.;;��;: -

·

Preparation Remove the ASE plate from the heat block. Preheat the heat block to 45oC for about one hour. Thaw the MEL tube to room temperature. Pour 1 1 ml AM 1 into a reagent reservo ir .Add 1 0 m! for each additional .

plate.

Pour 1 1 ml UB1 into a second reagent reservoir. Add 10 ml for e<Jch additional plate.

[ I

Pour the thawed MEL tube contents into a third reagent reservoir.

Steps [ } 1. [ ] 2. I 3.

I 4.

Centrifuge the ASE plate to 250 xg. Place the ASE plate on the raised-bar magnetic plate for approximately. 2 minutes, or until the beads are completely captured. Carefully remove the heat seal from the ASE plate.

Using an 8-channel pipette with new tips, remove and c-J:s,�c-,rc liquid (50 !JI) from the wells. Leave the beads in the wells.

<'

!i the

] 5< Visually inspect p.ip�tte. tips after removing solu�iQn fro_rn B
I 6.

and change th-e pipette tips.

With the ASE plate on the raised-bar magnetic plate, use

Part # 1 127521 1 Rev. A

o:o�=tte tips,

;m

8-channel

pipette with new tips to add 50 1-11 AM 1 to each well of th,,: i\SE F,iate.

1 7 . Seal the ASE plate with microplate clear adhesive film . Catalog # VC-901-1001

'n

re·c{;;:ect beads,

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol (Pre-PCR)

Experienced User Card J 8. Vortex the ASE plate at 1600 rpm for 20 seconds or until all beads are resuspended.

} 9.

Place the ASE plate on the raised-bar magnetic plate for approximately 2 minutes, or until the beads are completely captured.

l ] 10. Remove the seal from the ASE plate. [ 1 1 1 , Using the same 8-channel pipette with the same tips, remove all AM 1 reagent from each welL Leave the beads in the wells.

J 12.

Repeat steps 6 through 1 1 once.

1 13. Remove the ASE plate from the raised-bar magnetic plate.

} 14. Using an 8-channel pipette with new tips, add 50 111 UB1 to each wei! ot

the ASE plate.

] 1 5.

Place the ASE plate onto the raised-bar magnetic plate for appror.in>;:rl:ely

2 minutes, or until the beads are completely captured.

J 16. Using the same 8-cnannel pipette with the sa!J1e tips, remove erf U8 : reagent from each well. Leave the beads i n the wells.

) 17. Repeat steps 1 3 through 16 once.

) 18. Using an 8-channel pipette with new tips, add 37 the ASE plate.

11l MEL to each w ,,

] 19. Sea! the plate with microplate dear adhesive mm.

! 2Q, Vortex the plate at 1600-1700 rpm for 1 minute or until the beads are resuspended.

I 21.

Incubate the ASE plate on the preheated 45°C heat block for exactly

] 22. J 23.

During the incubation, perform the Make PCR Plate procedure.

1 5 minutes.

Proceed to lnoc PCR Plate. Leave the ASE plate at r.oom temp'-" c"2Li",� ;:;

yotJ.

pro<;;��d imrn�d\9t�ly, or $tore it ;;�t 4°C for

up to 1 hoiJr.

Cat<'lc>g # VC:-901-1001

Part# 1127521 1 Rev. A

: L. .

i l l u m l n a� 8

Make PCR Plate

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol (Pre-PCR)

Experienced User Card

This process adds the Jllumina-recommended DNA Polymerase and optional Uracil DNA Glycosylase (UDG) to the master mix for PCR (MMP reag�nt) and creates a 96-well plate for th"e l noc PCR process.

Estimated Time Hands-on: - 1 5 minutes

Consumables Item

MMP reagent Titanium

lauantity

Taq DNA

Polymerase

Uracil DNA Glycosylase (UDG, Optional)

0.2

96-well ml skirted microplate

S

l 1 tube per plate

j_ ·

•.. ··•···· . . • . . .--. . ..

�64 j

!.JI

-·

-

150 !.JI

.!.

· ·

-- . .J, _

�

----

- . . . -.

o

a

··--··

--- -

i

-·-···- -

.. ....J -----

S�·

..

- .-

----

-

!User

--

-

- ---------

•

!-20°C i --- .

-- . . - i

l 1 per ASE plate

I

� t r ge jsupoliecl !-20ac ·--�-.L-�,..:.��:· h ! -20°C - ·- ·· ....

;

1 Use�

1

..L -

-·- --·----

Preparation Thaw the MMP tube to room temperature. Apply a PCR barcode label to a new microplate.

Steps [ } 1 . Add 6 4 )-II DNA Polymerase to the MMP tube. [ ] 2. [Optional] Add 50 J.JI Uracil DNA Glycosylase to the MMP tube. ] 3.

] 4.

Invert the tube several times to mix the contents, and ther. pot:< f-·;· contefli:s of the tu be int:e a reagent.-reservoir:

Using an 8-channel pipette, add 30 1-JI of the mixture into each well of the

PCR plate.

1 5.

(:;�t�!og # VC-901-1001

Part It 11275211 Rev. A

Seal the PCR plate with microplate clear adhesive fi!m.

] 6.

Pulse centrifuge to 250 xg, and then place the PCR pb:e ''"� a l"g'1t· protected location.

1 7.

Proceed to lnoc PCR Plate.

i l l um l n a� 9

lnoc PCR Plate

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre--PCR)

Experienced User Card

I This process uses the template formed in the extension and ligation

I

process in a PCR reaction. This PCR reaction uses three universal primers (MMP reagent): two are labeled witfi fluorescent dyes and the third is biotinylated. The biotinylated primer allows capture of the PCR product and elution of the strand containing the fluorescent signal. rr eluted samples are transferred from the ASE plate to the PCR plate.

. _

Estimated Time

Hands-on: -30 minutes

Consumables Item

UB1 reagent IP1 reagent

I

)Storage

Bottle l··- .. .. 1 1 tube per plate

J

-.....

--

I

I

. IQ ! uant1ty !

·�-�·

.. . .

�--

i SupplieJ E>.:

!jlllumin,.

i

j4°C f·

"- - ·

�··

-···-··-·- ··- · · -- -·

1-2ooc

.!.,. __ _ __ .

:

__

l

-------

l _ ____

____ _ _________ _

-·

! IliumiT'<� ---

�-

Preparation [ ]

[ I [ 1

[ 1

Remove the ASE plate from the heat block. Reset the heat block to 95°C. Pour 6 ml UB1 into a reagent reservoir.

Thaw the IP1 reagent to room temperature. Pour the contents c: U1e tube into a reagent reservoir.

Steps [ ] 1. ] 2.

J 3.

P l ace the ASE plate on the raised-bar magnetic plate for approximately 2 minutes, or until the beads are completely captured. Remove the microplate clear adhesive film frqm the ASE plate.

Using an 8-channel precision pipette, remove and discard the

su pern ata nt (-50 J.ll) from all wells of the ASE pla te Leave the beads in the wells. .

[ 1 4. Visually inspect pipette tips after removing solution from each column to ensure no beads have been removed. If beads are visible in pipetl.e tips, return the solution to the same wells, allow magnet to re-collect boads, and change the pipette tips.

) 5.

Leaving the plate on the magnet and using an 8-channel precisior. pipette with new tips, add 50 jJI UB1 to each well of the ASE pl�.e.

1 6.

Leave the ASE plate on the raised-bar magnetic plate for approximately 2 minutes, or until the beads are completely captured.

1 7.

Remove and discard the supernatant (-50 !JI) from all wells of the ASE plate. Leave the beads in the wells.

j 8.

Remove the plate from the magnet.

] 9.

Catalog # VC-901-lOOl

Part # 11275211 Rev. A

Using an 8-channel precision pipette with new tips, add 35 J.1I IP1 to each column of the ASE plate.

iII urrll n a�

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Pre-PCR)

Experi enced User Card -[ } 1 0. Seal the plate with microplate clear adhesive film.

j 1 1 . Vortex at 1800 rpm for 1 m inute, or until all the beads are resuspended.

} 1 2. Place the plate on the 95°C heat block for 1 minute. ] 13. Place the ASE plate back onto the raised-bar magnetic plate for 2 minutes or until the beads have been completely captured.

) 1 4. Using an 8-channel pipette with new tips, transfer 30 1-11 supernatant from each well in the first column of the ASE plate to the first column of the

PCR plate.

] 1 5.

Repeat for each column of the ASE plate. Change tips between colum,., dispenses.

) 16. Seal the PCR plate with the appropriate PCR plate-sealing film fo' iOT thermocyder.

} 1 7. Immediately transfer the PCR plate to the thermocyder.

1 1 B.

Proceed to

Cycle PCR.

This concludes the Pre-PCR processes for the manual GoldenGa�"' (:H . Assay for VeraCode. If you remove materials such .as experienced us-: <.a ... the Pre-PCR lab, do not return with them into the Pre-PCR lab at c 'f l·,:t• •.

Ct�taiQg # VC-901-1001 Part# 1 1 275211 Rev. A

i l l uml n a� 10

GoldenGate Genotyping Assay fo'r VeraCode Manual Protocol (Post-PCR)

Experienced User Card

Cycle PCR

ocess thermal cycles the PCR plate to fluorescently label and This pr amplify the templates generated in the pr:-PCR process.

Estimated Time Thermal Cyde: -2 hours 45 minutes

Steps Place the sealed plate into the thermocycler and

[ } 1. 7

Table

....._.., -�

.

...

program shown in this table. Thermocycler Program

{

!Temperature i!Time j 37°C

! 1 0 minutes

i95°C

{ 3 minutes

.-

- ·-- --·

-

.

--

X 34

'". i__ ... . .

![

19soc -·

�----

... ... ........... ...

[ ] 2.

1 .--

-

•

. .. .,.__

.. --- · . .

-

\

1· ------

..

;?2°C

:

-

-

-

-

·-----

-

---

···---······

- .•

···-·

-� . j 10 minutes is �i��t�� J,.

··- · -

..... ---...- -----··

·· - .....-....

·

-

j35 seconds

)2 minutes

........ . .

.._

.... 00-'0''0'' -

..... . ..... . ..

; 35 seconds

--· 1

!72°C

.

.....

"0 ,>•o >'O � 00 00 o 00 0o<> 0 ..

.... ..

·· -

....

·

....

-

.

.

- -- -··--·

0

, ..

.

-

-

-- ----·

· ··

··· ·· · ·

. ......... . .... . . . .............. .... .

Do one of the following: •

•

Catalog # VC-901-1001

.

-·--

, 56°C

!4�C: ... L..

Part# 11275211 Rev. A

.�-�-HU 00� #.,_

... -·· ...,,.,.._.OW 00°0WUO·� oOO"Y ••,o � � - -� -- --··· ·-�· 0 •• "'W �- �0 0�'#,��� . ·�·· · 0·�- .-.

.......-···

the thermocyder

run

Proceed immediately to Bind PCR. Store the PCR pl<;tc: ;;t �oorn

temperature (22°C) in a light-protected d rawer.

Sea! and Store the PCR p!ate at -20°C overnight..

i l l uml n a� 11

B i n d PCR

GoldenGate Genotyping Assay. for VeraCode Manual Protocol

(Post--PCR)

Experienced User Card

In this process, MPB reagent is added to the PCR plate and the solution is transferred to a filter plate. The filter plate is incubated at room

temperature to bind the biotinylated strand to paramagnetic particles, thus immobilizing the double-stranded PCR products.

Estimated Time Hands-on; -30 minutes

Incubation: 1 hour

Consumables . j uanttty

iQ \

Item MPB reagent •••• .

M.-�..

,•

0.45 !JM clear Styrene filter •,..,.,.�-··�··-·-�---�···_, �-- •

plate with lid

,,....._..,,v_,, ,. ,,, ...�•"•'....,'••·•'·'

•'

• ,,.,, • �

-

(1

tube per PCR plate

- --�r- �---��-·A• ��----��v"....

-•·�-- - ,. ·•-•·•·•

i1

\storage

.....,.

-�..-··"....

per PCR plate

i ,.},._.,..,,...,,,_. ,'"

'

!4°C

�

-�·�·-··�·-·-�··

[ f

.,

"' .,,.,, ,,,,., ,_ ,, _,, ,•. _ , , ,�,•

,

,., �·

,,

h

]supplied Bj!

..� .� .......�.,,A..

pllumir.t;

�

--.......-�-····�-·

l User r

......... .._. • ••..

L ..

•.,._....,. ••• • ...

,..,. .....,,,.. ...........,..., • ,,..

_

Preparation [ 1

Vortex the MPB tube several times or until the beads are well resuspended. Pour the contents of the tube into a non-sterile reagent reservoir.

[ J

Write the PCR plate barcode number in the space provided on Plate: GS

a

"Fi;�,

:·

-PCR" label. Apply the label to the tor. surface of

the filter plate, adjacent to column 1 2 .

Steps [ 1 1.

[ } 2. [ 1 3. ] 4,

] 5.

Pulse centrifuge the PCR plate t o 250 xg.

Place new tips onto an 8-channel pipette.

Add 20 1-11 resuspended MPB into each well of the PCR plate. Set an 8�channel pipette to 85 tJ! to a!!ow space for bubbles, and attach new tips. Pipette the solution in the PCR plate up and down several times to mix the beads with the PCR prod4ct.,

] 6. Transfer the mixed solution into the first co[umri of the filter p late . There should be about 70 J.-1[ fluid in each welL

] 7.

Repeat step 6 for e ach co!umn of the PCR p!ate. Change tips betv110en

] 8.

Cover the filter plate with its lid and sto.re it at room temperature,

] 9,

Proceed to Make /NT Plate.

column dispenses.

protected from light

for 60 minutes.

CA�illog # VC-901-1 001

Part# 1 1 275211 Rev. A

II •

i l l uml na·

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol (Post-PCR)

Experienced User Card

1 2 Make I N T Plate

In this process, the PCR product is washed in the filter plate with UB2 and NaOH. The single-stranded, fluor-labeled material is then eluted into an INT plate containing MH2 reagent. •

Estimated Time Hands-on: -30 minutes

Consumables

tem

I

MH2 reagent UB2 reagent 0.1N NaOH

96-well V-bottom plate

Preparation [ 1

[ 1 [ ]

[ ]

j t rage jsupp1'd ::1 IIlumina lat jRoom temperature

jouantity

l1 tube per PCR p � ..... ! Bottle , .... L... - . .

e

S

o

;

! ! -----------------·---{ ... lBottle 14°C ! -.. J�se·-- �-. -·_ -�: E ���--�-����l.�.. � . j :_

, ._---

·-----

•.

.•

!

--

t

: ,

Room

temperature

-.t-... !ntumi:--:1 jUser � .

.

_

rJ.·1

_ _ _ _ _ ....

_

.

_

Apply a INT barcode label to a new 96-well V-bottom plate. Using a serological pipette, transfer 6 ml UB2 into a sterile reservoir.

u

Po r 4 ml 0.1 N NaOH into a second sterile reservoir. Pour the contents of the MH2 tube into a third sterile reservo.

Steps [ ] 1. 1 2.

1 3. 1 4.

Place the f1lter plate adapter on an empty, unlabelled 96-wel\ V-bottom plate (waste plate).

Place the filter plate containing the bound PCR products onto he ! filterplate adapter. Centrifuge to 1000 xg for 5 minutes at 25°C. Remove the filter plate lid.

} 5. Using an 8-channel pipette with new tips, add 50 !JI UB2 to each woli of the filter plate. Replace the filter plate lid.

1 6.

Centrifuge to 1 QOO xg for 5 minutes at 25°C.

] 7.

Using an 8-channel pipette with new tips, add 30 1-1! MH2 to ea.::h well of the !NT plate.

1 8.

Replace the waste plate with the INT plate. Orient the INT plate so that well A1 of the filter plate matches well A1 of the INT plate.

J 9. Place new tips onto the 8-channel pipette. ] 10. Dispense 30 1-11 0.1 N NaOH to all wells of the filter plate.

] 1 1 . Replace the fi!t@r plate lid. Catalog # VC-901-1001

Part li 1 127S211 Rev.A

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol (Post-PCR)

Experienced User Card } 1 2. Centrifuge immediately at 1 000 xg for 5 minutes at 25°C. At the end, no beads should be visible in the wells of the INT plate.

] 13. Gently mix th� contents of the INT plate by moving it frpm side to side without splashing.

] 14. Cover the INT plate with clear adhesive seal.

) 15. Do • •

Catalog # VC-901-1001

Part# 11275211 Rev. A

one of the following:

Proceed to Hyb VeraCode Bead Plate.

Seal the INT plate with a cap milt and store it at -zooc.

GofdenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Post-PCR)

Experienced User Card

'1 3 Hyb

VeraCode Bead Plate

This process uses the VeraCode Vortex Incubator, an incubating microplate shaker, to hybridize the VeraCode Bead Plate (VBP). Once the sa111ples are transferred to the VBP. they are ready for hybridization at 45°C.

Estimated Time Hands-on: -20 minutes Incubation: 3 hours

Consumables '

Item

l

:Quantity

i I

t

1 1 tube per plate

MH2 reagent

i

f! Bottle

0.1 N NaOH

.

--

-

-

) Iliumina

!temperature j .. ·j ! User l4°C I

..

.

.. ···- -+- --- ..

.. ---·-··········- ....... .. . . -····· . ·--···- .... '" )··· ................ .

! Supplied By

) Room

... . . .. .

e - ���a��d�-��.�.� ��at ·····--· C ��� ��� r.{���

i

Storage

--

.... 1.

.

· -- ·- _

-·

___

..j ..

.. .

....

..

... .

--··· .. .. . . -

j_lll_��i�-� -- -- ·· · · ·

Preparation

[ ] [ 1

If the INT plate has been frozen, thaw to room temperature in a

protected drawer, then pulse centrifuge to 250 xg.

light­

Preheat the VeaCode r Vortex Incubator to 45°C .

Steps Add Neutralized MH2 to /NT VBP

1 1.

1 2.

Using a serological pipette, transfer 3 ml MHZ into a 1 5 m l conical t�;Jbe. Using a d ifferent serological pipette, transfer 3 ml 0.1 N NaOH to the

1 5 ml tube.

I 3. Vortex the tube until the contents are mixed. ] 4. Pour the mixture into a sterile reservoir. 1 5.

Using an 8-channe! pipette, add 50 ;J! of neutralized MH2 to each of the ! NT plate wells that contain sample.

Hybridize VBP

[ I 1.

Remove the VBP from the 46C refrigerator and pulse centrifuge to

250 xg. If the beads are not at the bottoms of the wells, · pulse centrifuge again.

] 2. 1 3. ] 4.

C"'t;;�log # VC-9Q1 -1 QQ1 Part# 1 1275211 Rev. A

Remove the cap mat from the VeraCode B�ad Plate. Using an 8-channel pipette with new tips, pipette each column of sample

i n th-e INT plate up and down 4-5 hmes.

e

, ,

c ""..., O ">rh · ,._,-� or+ f'""''-'_._.. ....,. from the INT a.:t-.1\oA.:J tran sfer · 1 o'o J.l' n-1' ""OO.A'"-11 plate into the corresponding well of the VeraCode Bead Plate. l ,lc;.-.ro .... ._,,,, '=:::1 +ho \o i i V c-, ..o w.-...·o • • • - j.;..-,c '"'t"'""'J

o

o

I

VI

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol (Post-PCR)

Experienced User Card } 5. ] 6.

.

Place the cap mat back Qn the VeraCode Bead Plate

Place the VeraCode Bead Plate Bead Plate, which now contains samples, into the VeraCode Vortex Incubator. You can load up to 2 VBP plates in the vortexer.

[ 1 7.

Close the lid and make the following settings: •

Push the Encoder knob until RPM is highlighted. Rotate the knob to

85 (850 rpm). •

•

Push the Encoder knob until Time is highlighted. Rotate the knob below 0.30 or above 99.5 until HLD appears. This sets the Vc'"'

Incubator to run continuously.

v

Push the Encoder knob until Temperature is highlighted. fi:.�tC�.te �; -

knob to 45 (45°C}.

·

} 8.

Press Start/Stop and incubate for 3 hours.

J 9.

Proceed to Wash VBP Plate.

Catalog #VC-901-10Q1

Part# 1 1275211 Rev. A

'!'. Ipl 9E !I g W!

-

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol (Post-PCR)

Expe rienced User Card

1 4 Wash VBP Plate

l in this process, the VeraCode Bead Plate is removed from the VeraCode ' Vortex Incubator and washed two times with the VW1 reagent.

Estimated Time Hands-on: - 1 5 minutes

Consumables I

Item VW1

jsott l e

reagent

' I

Preparation [ )

j supplied !:tv

.

1auantety

Pour 45 ml of VW1 into a

rile reservoir.

nonste

Steps [ 1 1.

Stop the VeraCode Vortex Incubator. When the speed indicator reaches

0, open the lid and remove the VeraCode Bead Plate.

I 2.

Pulse centrifuge the plate to 250 xg.

I 3.

Remove the cap mat.

) 4.

Using an 8-channel pipette, add 200 I-ll VW1 buffer to each we:'. �.-lake

sure to agitate the bead pellet.

] 5.

Gent!y �wirl the plate in � c;:irc;vl<:lr mQtiQn Qn th� b�n<;htqp.

]7

Aspi ate the supernatant with the vact.�um manifold at a pressure of

I 6. Wait 2 m inutes for the beads to collect in the bottom of the well. _

1 8. ) 9.

r

50 mbar.

Repeat steps 4 through 7 once. Do one ofthe following:

[ 1 a. [ I b.

��ta!og # VC-901-1001

Part# 1 1275211 Rev. A

Proceed to Scan VBP Plate.

Seal the VBP plate with an adhesive seal and

at room temperature for up to 24 hours.

store it in th") dark

GoldenGate Genotyping Assay for VeraCode Manual Protocol

(Post-PCR)

Experienced User Card

15

Scan VBP Plate

The BeadXpress Reader uses lasers to excite the Cy3 and CyS fluors of the single-stranded PCR products bound to the VeraCode beads. Light emissions from these fluors are then recorC:Ied in a data file.

Estimated Time 80 samples/hour at 96-plex 27 samples/hour at 384-plex Preparation [ ]

Prepare a scan settings file containing information about youe :::� · ·e�' .­ the BeadXpress Reader settings, and VeraCode be ,'

Steps For instructions on scanning VeraCode Bead Plate, see th� £" System Guide.

Ceta!og # VC-901-1001

Part# 1127521 1 Rev. A

IE

h ""1im ; z£

-·

···•

.;;p·� R

Lampiran 5. Penyampaian Laporan Hasil Penelitian Tahun

Nomor

2012 : Januari 2013

Tanggal

LAMPIRAN REAUSASI ANGGARAN PENELITIAN TAHU N 2012 : PENDERITA TB 01 KUPANG DAN DISTRIBUSI BERBAGAI POLIMORFISME Pr· �. GE

JUDUL

. .

TLR2, VDR2, NRAMP1, IFN, TNF DALAM PANEL INFEKSI -IMUNOLOGI DENGA.-< METODE PCR BEADS KETUA PENELITI

: SIMEON PENGGOAM, S.Si

PAGU PENELITIAN

: Rp 149. 541.000

No

1

Uraian Realisasi (Rp)

Realisasi

Total (Rp)

149,091 ,800

Honor Tetap

1 9,540,000

Belanja Bahan

101 ,745,000

BNO

21 ,980,000

: . .c !!lfl!t � tL:j! [ IIT p -i !H H t 1 'ffl" • !!!3 " · ' * '

Peja!anan Dina

5,826,8

Lampiran 4. Penyampaian Laporan Hasil

Penelitian Tahun 2012 Nomor

Tanggal :·

Januari 2013

Check List Kelengkapan Sistematika Laporan Penelitian Ta h u n 2 0 1 2 I

Sistematika

Ada

Tidak

Susunan Tim penelitian Sural Keputusan Penelitian Kata Pengantar Ringkasan Eksekutif Abstrak Daftar lsi Daftar Tabei/Gambar/Grafik/peta Dattar Lampiran II

lsi Laporan Penelitian --

Pendahuluan ..

Tinjauan Pustaka Tujuan dan Manfaat

-·

I

·-

Hipotesis

--------

Metod e

-·

Has il Pembahasan

"" --

Kesimpulan dan Saran '

--

--

Ucapan Terima Kasih Dattar Kepustakaan

--

Lampiran Lembar

Pengesahan

(dit.andatangani

oleh PPI dan Kepala Satker)