2015/16 MĚŘENÍ TLOUŠTKY LIDSKÉHO VLASUA ERYTROCYTU MIKROSKOPEM Teoretický úvod: Cílem úlohy je naučit se pracovat s mikroskopem a s jeho pomocí měřit velikost mikroskopických útvarů. Mikroskop Optickou soustavu tvoří objektiv, okulár, které slouží k vlastnímu zobrazování, kondenzor, který zajišťuje správné osvětlení pozorovaného předmětu. Pomocí objektivu se vytváří obraz předmětu (zvětšený, převrácený a skutečný), který bývá umístěn mezi ohniskovou a dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností objektivu. Tento obraz prohlížíme okulárem jako lupou, tj. obraz vytvořený objektivem je mezi okulárem a jeho ohniskovou vzdáleností. Pomocí okuláru se vytváří zvětšený, převrácený a neskutečný obraz. Toto je však přibližné a schématické vysvětlení vzniku obrazu v mikroskopu. Ve skutečnosti jsou poměry poněkud složitější a lze je vysvětlit na základě ohybu a interference světla. Pokud je prostor mezi předmětem a objektivem vyplněn vzduchem, index lomu ≅ n 1 (tzv. suchý objektiv), je nejvyšší hodnota numerické apertury, které lze dosáhnout, rovna jedné, (prakticky nejvýše 0,9). Hodnotu numerické apertury lze zvýšit použitím tzv. imerze. To znamená, že prostor mezi objektivem a krycím sklíčkem preparátu se vyplní prostředím o indexu lomu n > 1 (voda, cedrový olej, monobromnaftalén). U paprsku vycházejícího z krycího sklíčka pak nedojde k lomu od kolmice a do objektivu se dostanou paprsky, které by se tam nedostaly. Mechanickou část mikroskopu tvoří stativ, spojený s držákem tubusu a stolkem pro umístění pozorovaného objektu. Tubus má v dolní části v otočném revolverovém měniči objektivy a v horní části okulár. Jeho hrubý a jemný posuv umožňuje makro a mikrometrický šroub. Pohybovat lze také stolkem mikroskopu pomocí dvou mikrometrických šroubů (obr.1.)
Obr.1- Popis mikroskopu Na obr.2je znázorněn systém dvou čoček–objektivu (Ob) a okuláru (Ok), kterýmpozorujeme předmět (P). Pomocí objektivu se vytvoří zvětšený, převrácený a skutečný obraz (O1). Tento obraz pak prohlížíme okulárem jako lupou (okulár umístíme tak, aby obraz vytvořený objektivem ležel mezi okulárem a jeho ohniskem).
obr. 2 Schéma vzniku obrazu v mikroskopu
Základními parametry objektivu jsou jeho ohnisková vzdálenost fob, příčné zvětšení Zoba numerická apertura A. Příčné zvětšení objektivu je dáno vztahem: Zob =
f ob + ∆ ∆ ≈ f ob fob
kde Δ je optický interval mikroskopu (vzdálenost ohnisek objektivu a okuláru). Optický interval bývá kolem 15 - 20 cm, fob kolem 1,5 mm. Proto maximálně dosažitelné zvětšení objektivu je kolem 100. Numerická apertura je dána vztahem: A = n . sin γ kde γ je polovina úhlu pod kterým paprsky vycházející z bodu preparátu P ležícího na optické ose, vstupují do objektivu a n je index lomu prostředí mezi preparátem a objektivem. Zvětšení okuláru Zok je dáno vztahem:
Z ok =
δ f ok
kde δ je konvenční zraková vzdálenost (25 cm) a fok je ohnisková vzdálenost okuláru (v mm).
Celkové zvětšení Z mikroskopu vyjadřuje vztah: Z = Zob . Zok =
∆. δ f ob . f ok
MĚŘENÍ TLOUŠTKY LIDSKÉHO VLASU MIKROSKOPEM Přístroje a pomůcky: 1) Mikroskop 2) Objektivový mikrometr 3) Sada podložních a krycích sklíček , nůžky , kapátko
POSTUP PRÁCE S MIKROSKOPEM Zdroj světla nastavíme tak, aby střední paprsek procházel středem kondenzoru a přivřeme clonu. Preparát položíme na stolek mikroskopu tak, aby byl v optické ose mikroskopu. Pomocí revolverového měniče nastavíme do svislé polohy nejméně zvětšující objektiv. Pomocí mikrometrického šroubu přiblížíme objektiv co nejvíce k preparátu. Přibližování kontrolujeme pohledem ze strany, abychom nepoškodili a preparát nebo mikrometr!!!. Pozorujeme zorné pole a pomocí mikrometrického šroubu pomalu zvedáme tubus, dokud nespatříme obraz preparátu. Obraz doostříme mikrometrickým šroubem a clonou nastavíme optimální osvětlení. Před výměnou objektivu nebo preparátu zvedneme tubus.
Úkol: Změřte tloušťku lidských vlasů.
Provedení: 1) Připravte 5 preparátů vlasů od různých osob: ustřihněte asi 5 mm dlouhý vzorek vlasu, dejte jej na podložní sklíčko, kápněte na něj několik kapek vody a přikryjte krycím sklíčkem. 2) Okalibrujte okulárový mikrometr objektivovým mikrometrem pro objektiv 40x zvětšující. Na stolek mikroskopu položte objektivový mikrometr a zaostřete jej, nejprve pro objektiv 10xzvětšující, pak opatrně vyměňte za objektiv 40xzvětšující a doostřete.Okulárový a objektivový mikrometr nastavte na sebe a pozorováním dílků obou mikrometrů stanovte velikost 1 dílku okulárového mikrometru (celá stupnice objektivového mikrometru je dlouhá 1 mm).
Obr.3 -Objektivový mikrometr a jeho zvětšený obraz v mikroskopu 3) Otočením revolverového nosiče objektivů zařaďte objektiv 10x zvětšující, abyste rychleji našli pozorovaný předmět v zorném poli. Na stolek mikroskopu položte jeden preparát lidského vlasu, zaostřete jeho obraz a posuvem stolku ho umístěte do středu zorného pole. 4) Zasuňte objektiv 40x zvětšující, zaostřete obraz, posuvem stolku ho umístěte do středu zorného pole a otočením okuláru nastavte polohu okulárového mikrometru tak, aby bylo možno měřit tloušťku vlasu. 5) Změřte tloušťku vlasu prvního preparátu na pěti místech a stejným způsobem změřte tloušťky vlasů ve zbývajících preparátech (viz foto mikroskopického obrazu vlasu).
6) Z pěti měření tloušťky vlasu, provedených na jednom preparátu vypočítejte nejpravděpodobnější hodnotu a pravděpodobnou chybu výsledku. Výsledky zapište do protokolu.
MĚŘENÍ VELIKOSTI ERYTROCYTŮ
Obr.4.Erytrocyty
Fyziologická hodnota průměru erytrocytu je 7,2 ± 0,2 μm. Jak je vidět na obr.4 erytrocyty majíbikonkávní (piškotovitý) tvar, který se v krevním nátěru projeví jako projasnění uprostřed.Při různých onemocněních, např. vzniklých vlastní poruchou tvorby erytrocytů, dochází ke změně jejich tvarunebo přihyperosmolaritě krevní plazmy dochází k jejich smrštění. Při hypoosmolaritě jsou naopak zvětšeny. Přesné stanovení průměru erytrocytu je nezbytným požadavkem lékaře na hematologickou laboratoř.
Přístroje a pomůcky: 1) Mikroskop 2) Objektivový mikrometr 3) Fixované obarvené nátěry periferní krve
Úkol: Změřte velikost 10 erytrocytů v krevním nátěru
Provedení: 1) Okalibrujte okulárový mikrometr objektivovým mikrometrem pro objektiv zvětšující 40x(postup viz předchozí úloha). 2) Změřte velikost 10 erytrocytů. Měření provádějte v okrajovéčásti krevního nátěru,kde erytrocyty nejsou nahuštěny(viz fotografie erytrocytů v mikroskopickém obraze).
3) Výsledky měření zapište do protokolu.
Kontrolní otázky: 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Jaké je největší prakticky použitelné zvětšení optického mikroskopu ? Co je to optický interval mikroskopu ? Jaký obraz vytvoří objektiv ? Jak lze vypočítat zvětšení mikroskopu ? Co je rozlišovací schopnost mikroskopu ? Nakreslete chod paprsků optickým mikroskopem.
