1589. UMU .;
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Aktivitas Fitokimia Ekstrak Etanol Gembili
(IJioscorea esculanta)
Pada Kultur Set Kanker Payudara T470 Secara Invitro
Nama Penyusun Laporan
1. Sumarno 2. Dina Fatmawati
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG
JI. Raya Kaligawe KM.4 PO.BOX 1235 SEMARANG
2012
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Aktivitas Fitokimia Ekstrak Etanol Gembili
(Dioscorea esculanta)
Pada Kultur Sel Kanker Payudara T47D Secara Invitro
L__ _·
- ------� --� � w --�- =
____
Nama Penyusun Laporan I. Sumamo
2. Dina Fatmawati
FAKULTASKEDOKTERAN UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG
Jl. Raya Kaligawe KM.4 PO.BOX 1235 SEMARANG
2012
HALAMANPENGESMfAN
1. Judul Penelitian
:
Aktivitas
Fitokimia
(D.esculanta)
Ekstrak
Etanol
Gembili
pada kultur sel payudara T47D secara
invitro 2. Bidang Penelitian
: Kesehatan
3. Ketua Peneliti a.
dr. Sumarno, M.Si., Med., Sp.PA
Nama Lengkap
b.
Jenis Kelamin
Laki-laki
c.
NIP
210103076
d.
Disiplin Ilmu
e.
Pangkat/Golongan
f.
g.
h. 1.
J.
k.
Jabatan Fakultas/Jurusan Alamat
: Patologi Anatomi
: Penata Muda Tingkat I I IIIb : Asisten Ahli
: Kedokteran/ Kedokteran Umum
: Jl. Raya Kaligawe Km. 4 PO. BOX. 1054 Semarang
Telpon!Faks/E-mail :
(024)65 83 84/(024)6594 3 66/informasi@fk_unissula.ac.id
Alamat Rumah
: Jl. jl. Mulawarman Selatan 20 Semarang
Telpon!FaksE-mail : 024-76481283
4. Jumlah Anggota Peneliti : 1 orang a.
Nama Anggota I
5. Lokasi Penelitian
: Dina Fatmawati, S.Si : Fakultas Kedokteran UNISSULA, Semarang dan UGM, Yogyakarta
6. Jumlah biaya yang diusulkan: Rp. 104.956.000,
Semarang, 15 Februari 2012.
�iti,
Dr. Slm1arno, M.SL Med., Sp.PA NIK. 210103076
KATAPENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan penelitian
dengan judul "Aktivitas
Fitokimia Ekstrak Etanol Gembili Pada Kultur Sel Kanker Payudara T47D Secara Invitro"
yang
dibiayai
oleh
Badan
Penelitian
dan
Pengembangan
Keseatan
Kementrian Kesehatan RI tahun anggaran 2011dalam rangka RISBIN IPTEKDOK Bidang penyakit degeneratif dan tidak menular.Melalui kegiatan penelitian ini, penulis berharap dapat memberikan kontribusi penelitian di bidang kesehatan, khususnya untuk pengembangan senyawa kandidat antikanker payudara dengan pendekatan molekuler Penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada semua pihak yang telah memberikan
pendaanaan penelitian
ini, mengorbankan waktu, tenaga maupun
pikirannya dalam membantu penyelesaian laporan ini terutama kepada : 1.
Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementrian Kesehatan Republik Indonesia
2. DR. dr. H. Taufiq R. Nasihun, M.Kes, Sp. And selaku dekan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung 3.
Prof. Mae Sri Hartati Wahyuningsih, M.Si., Apt., Dra. Atina Hussaana, M.Si., Apt., dan dr. Hadi Sarosa, M.Kes. selaku supervisor pada penelitian ini
4.
Prof.
dr. Sofia Mubarika Harjana, M.Med. Sc., PhD., dr. Hamim Sadewa, PhD.,
dr. Alida Harahap, PhD., dr. Nurjati Chairani Siregar, MS., PhD., Dr. rer. physiol. dr. Septelia Inawati Wanandi., dan Prof. Sultana M H Farad.z, PhD. selaku para panel pakar RISBIN IPTEKDOK bidang penyakit degenerative dan tidak penular yang telah banyak memberikan masukan selama penelitian ini berlangsung. 5.
Dr. H. Iwang Yusuf, M.Si selaku Kepala Laboratorium Biologi Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung
6. Prof dr. Supargiyono dan para analis Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada 7.
Dr. Ummi Solekhah Intansari, M.Kes., Sp.PK.
dan para analis Laboratorium
Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
ii
Kek:urangan yang ada dalam laporan ini, semoga tidak mengurangi minat panitia seleksi laporan yang budiman untuk membaca dan mengevaluasi laporan ini. Kritik dan saran yang mendukung semakin baiknya laporan ini, senantiasa penulis harapkan. Segalanya akan lebih bermakna, ketika keikhlasap. mengiringi setiap amalan kita. Semoga karya sederhana ini dapat bermanfaat bagi Bangsa Indonesia.
Semarang, 15 februari 2012 Penulis
DAFTAR ISI
HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................................ i DAFTAR lSI ................................................................................................................ iv DAFTAR TABEL
.........
. .........
.
.........................................
.
....
. . .. ...
..
. ....
..
.
......................
vi
DAFTAR GAMBAR ............................................................... .................................... vii DAFTAR LAMPIR.AN .............................................................................................. viii RWGKASAN EKSEKUTIF BAB
1
......
. .....
.
. . . . . ................
.
......
.
..............
.
.
........
..............
.
.
......
ix
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...........
PENDAHlJLUAN
........
1.1 Latar Belakang
.
...........
. . . . . . . . . . . . . . . . . . ....
.. . .
.......................
...
1.2 Formulasi masalah
............... . . . . . . . . .
1.3 Tujuan penelitian 1.3.1 Tujuan ummn
...............
..........
.. . . . .
.
...............
..............
.
..
. ............... .
.......................
.
....................
. . . . . . . . ................... . . . . . . . . .
.
. ...............
..
.
. ..................
.
.
.........
. ........
.
.
....
............
.. . . . . . . . . .
. ..
.
.
.
............. .
. ...
. .. ..
......
.
........
.
..............
.
1
....
2
. ........
3
. ........
3
. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
........
1
1.3.2 Tujuan khusus ............................................ ................ ..................... ...................... 3 1. 4 Manfaat Penelitian BAB II
.....
......
.
.......
..
. . . . . . . . ....................
TINJAUAN PUSTAKA
.
.
......
..........
..
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ..
. .
. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .. ...
..
........
.
........
..
......
....................
. .. . ..
.
..
............
.
.
.....
.......
.
. ........... .
...
.
.
....
.. .
................
.
..
.. . . . . . . . .
...........
3
....
4
.
....
. .. 4 ..
.
2.1 Kank:er Payudara ...................................................................................................... 4 2.2 Kultur Sel Kanker Payudara T47D 2.3 Disregulasi Apoptosis 2.4 Siklus sel..
.....
2.5 Uji Sitotoksik
..
.
.........
.
....
.
. . . . . . . . .......................
.
.....................
.
4
.....
5
......................... .................................................•..................
...............
.. . ..
........
.........................
.
..
. ........
.
.....
. .....
.
.. .. .
..
.
..................
.
........
.
....
.
...
. ... . ...
.
.
...........................
........
.
...
.
...
. . . . . . ..
. .7 .
8
...........................
2.6 Mekanisme Kerja Gembili Pada Kultur Sel Kanker Payudara T47D terhadap aktivitasproliferasi dan apoptosis .. . . . 9 ......
BAB Ill .
. . . . . . . . . . . . . . ...............
:rvffi.TODE PENELITIAN
.
...
...................
.
..
...
. ........
.
............................
3. 1. Rancangan penelitian
................
3.2 Waktu dan tempat penelitian 3.3 Alat dan bahan penelitian
...........
......
.
.....
.............................
..............................
.
................
Persiapan sampel gembili
.
..
.
................ . . . . . . .
.
......................
3.4 Tahapan penelitian 3.4.1
.............. . . . . . . .
.
. ..... . .............. . .... . ...... . ....
. ...........
.
....................
.
.
.......
. ...............
.
.
.
....
.
.
.
.....
.
.
...
.
. . ...
...
......
.
.
...
....
.
..
. ...
.
. . . . . . .....
................
.......
.
.
.........
...........
.
......................
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .................
...
.
11
.
.....
11
.. . . . .
11
. .....
11
. .....
12
.
.....
12
. .....
12
.
............
........................................
....................
. . . . . . . . . . . . . . .........
. . . . . ...................
...
.
iv
3.4.2 Ekstraksi etanol gembili .................................................................................... 12 3.4.3 Uji sitotoksisitas................................. ................................................................. 13 3.4.4 Pengamatan terhadap aktivitas proliferasi sel kanker T47D dengan metode flowcytometri.......................................................................................... ..................... 14 3.4.5 Pengamatan terhadap induksi apoptosis ............................................................. 14 3.5. Analisis hasil. ........................................................................................................ 15 BAB IV ............................................... ........ ....................... .......................................... 17 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................... 17 4.1 Hasil penelitian ...................................................................................................... 17 4 . 1 . 1 Uji sitotoksisitas.................................................................................................. 17 4.1.2 Aktivitas Proliferasi ............................................................................................ 21 4 .1. 3 Induksi Apoptosis ............................................................................................... 22 4.2 Pembahasan ........................................................................................................... 24 BAB V
.......................................................... . . . ............................................................
28
KESllvfPULAN DAN SARAN ................................................................................... 28 5.1 Kesimpulan ............. ................................................... ............................................ 28 5.2 Saran ...................................................................................................................... 28 DAFTAR PUSTAKA . ........ .. .... ..
.
.
. . . .......
. .... . .. .. . .. .... ... .. .. ......... .. .
. .
LAMPIRAN .. .. ..... ...... . .. .... .. . ... .. .. .
..
.
..
..
...
.
..
...
.
..
.
...
.......
...
.
.
.
..
.
.
.....
.. . . ... 29 ...
.
.
. ... ... ... . ... ....... ... .... ... . . . 32 ..
..
.
..
.
..
.
.
.
.
.
..
..
,.
v
DAFTAR TABEL
Tabel
1. Rerata
absorbansi dan prosentase viabilitas kultur sel T47D dan Vero
setelah pemberian ekstrak etanol gembili (D.esculanta) selama 24 jam ...................... 18 Tabel
2.
Rerata absorbansi dan prosentase viabilitas kultursel T47D setelah
pemberian ekstrak etanol gembili (D.esculanta) selama 24 jam ................................ 20 Tabel 3. Analisis rerata aktivitas proliferasi sel T47D setelah pemberian ekstrak
etanol gembili terhadap kontrol selama 24 jam
............................... .............................
21
•
vi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 . Mekanisme apoptosis melalui jalur intrinsik dan ekstrinsik (KEGG diakses 5 September 20 II) Gambar 2. Siklus sel
...
..
.....
. .. .
.....
. . ..
......
...
.
..
......
........... ...................
. .. . .. .. . . .
.
.
..
.
.
.....
. . ...
.......
.
....
.
............
.
....
. . 6 ..
...
. Error! Bookmark not defined.
Gambar 3. Sel T47D diamati dibawah mikroskop inverted perbesaran 400x. (A) kondisi sel T47D sebelum pemberian ekstrak etanol gembili; (B) kondisi sel T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembili dosis 401Jg/mL selama 24 jam
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
Gambar 4. Hubungan variasi konsentrasi ekstrak etanol gembili (D.esculanta) (log dosis) terhadap prosentase viabilitas sel T47D . ........................................ 19 Gambar 5. Hubungan variasi konsentrasi ekstrak etanol gembili (D.esculanta) (log dosis) terhadap prosentase viabilitas sel T47D ......................................... l9 Gambar 6. Hubungan variasi konsentrasi doxorubicin (log dosis) terhadap prosentase ·viabilitas sel T47D .................................................................................... 21 Gambar 7.
Aktivitasproliferasisel
T47D
setelah
pemberian ekstrak
etanol
gemhili/crude extract (D.esculanta) selama 24 jam.................................. 22 Gambar 8. Rerata prosentase sel T4 7D setelah dipapar dengan beberapa perlakuan selama 24 jam.Hasil prosentase diperoleh dari analisis flowsitometri dengan menggunakan pewarna annexin V-PI (AV/PI).CE (crude extract) merupakan ekstrak etanol gembili.
*
menunjukk:an p<0,05 pada analisis
anova CI 95%........................................................ ............... ..................... 24 Gambar 9. Gambaran sel T47D dengan pewarnaan acridine orange-ethidium bromide yang diamati pada mi.kroskop fluorescence 40x. gambar diambil dengan menggunakan kamera canon LEXUS. L menunjukkan sel yang hidup, FD menunjukkan adanya fragmentasi DNA, N menunjukkan sel nekrosis, Ab menunjukkan terbentuknya apoptotic body ..... ......................................... 23
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil analisis flowsitometri siklus sel T47D kelompok kontrol dengan menggunakan pewarna P I................................................................. 32 .
Lampiran 2
Hasil analisis flowsitometri siklus sel T47D kelompok ekstrak etanol gembili 40 J.lg/ml dengan menggunakan pewarna PI ....................... 33
Lampiran 3
Hasil analisis flowsitometri siklus sel
T47D
kelompok ekstrak etanol
gembili 20 J.tg/ml dengan menggun.akan pewarna PI ....................... 34 Lampiran 4 Hasil analisis flowsitometri apoptosis sel T47D dengan menggunakan pewarnaan annexin V-PI pada kelompok ekstrak gembili 40 J.lg/rn135 Lampiran 5 Hasil analisis flowsitometri apoptosis sel T47D dengan menggunakan pewarnaan annexin V-PI pada kelompok ekstrak gembili 20 Lampiran
6
J.tg/ml36
Hasil analisis flowsitometri apoptosis sel T47D dengan menggunakan pewarnaan annexin V-PI pada kelompok kontrol sel.. ..................... 3 7
Lampiran
7 Hasil analisis flowsitometri apoptosis sel T47D dengan menggunakan pewarnaan annexin V-PI pada kelompok doxorubicin .................... 38
Lampiran
8.
Data absorbasi pada kultur sel T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembili selama 24 jam...................................................................... 39
Lampiran 9 Data absorbasi sel vero setelah pemberian ekstrak etanol gembili selama 24 jam ............................................................................................... 40 Lampiran 10 Data absorbansi sel T47D setelah pemberian doxorubicin selama 24 jam ..........................................................................................................
41
Lampiran 11 Cara kerja uji sitotoksik .................................................................. 42 Lampiran 12 Cara kerja uji apotosis metode double staning dan flowsitometri annexin V/PI................................................................................................... 45 Lampiran 13. Cara kerja uji aktivitas proliferasi dengan flowsitometri pewarna PI49 Lampiran 14. Biodata peneliti utama..................................................................... 51 Lampiran 15. Biodata peneliti pertama ................................................................. 52 viii
K.anker payudara merupakan penyebab kematian kedua terbesar di beberapa \Yilayah dunia termasuk di Indonesia. Beberapa strategi untuk perperlama usia harapan hidup dan mengurangi gejala telah dilakukan tetapi, masih diperlukan terapi
baru yang dapat menghilangkan tumor primer dan sekunder dengan pentargetan yang lebih efisien. Tanaman gembili
(D.esculenta) tanaman asli Indonesia dan merupakan
family Dioscoreaceae yang mengandung steroidal saponin dan terbukti secara signifikan sebagai agen antiinflamasi melalui penekanan ekspresi protein NFKB. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik, ekstrak etanol gembili pada kultur sel kanker payudara T47D, aktivitas proliferasi dan induksi apoptosis sel T47D. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan menggunakan kultur sel kanker payudara
T47D. Efek sitotoksik ekstrak etanol
gembili ditentukan dari nilai ICso berdasarkan analisis probit. Aktivitas proliferasi dilakukan dengan flowsitometri dan induksi apoptosis ditentukan dengan secara
kualitatif metode double staning dan kuantitatif dengan flowsitometri Pada basil penelitian diketahui ekstrak etanol gembili memiliki nilai ICso sebesar 39,61J.tg/ml dan terdapat akumulasi prosentase sel pada fase sub Go sebesar
5
kali lipat dari kontrol, sedangkan pada konsentrasi YJCso menunjukkan peningkatan akumulasi pada fase G2-M sebesar
1,1 kali kontrol. Berdasarkan hasil penelitian pada
kelompok kontrol, rata-rata prosentase sel apoptosis sebesar 7,29% dan terjadi peningkatan rata-rata prosentase sel yang mengalami apoptosis setelah pemberian ekstrak etanol gembili dosis 20 J.tg/mL dan 40 J.tg/rnL menjadi 1 5,5 2% dan 36,60%. .
Ekstrak etanol gembili memiliki efek sitotoksik cukup kuat terhadap sel T47D ditandai dengan hambatan aktivitas proliferasi pada fase preG0 dan induksi apoptosis •
sebesar
5 kali lipat kontrol.
ix
BAB l PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang Kanker merupakan
suatu
penyakit
neoplasma
ganas
yang
mempunya.t
spektrum yang sangat luas dan kompleks. Perkembangan kanker ditandai dengan meningkatnya aktivitas proliferasi dan gangguan terhadap apoptosis. Berdasarkan data penyebab kematian di dunia tahun
2005,
kanker merupakan penyebab
kematian tertinggi kedua setelah penyakit kardiovascular. Sampai sekarang hampir tidak ada kanker yang dapat sembuh dengan spontan dan bila kanker terus dibiarkan tumbuh akan berujung pada kematian penderitanya (Rasjidi,
2009). Saat
ini, kanker payudara merupakan penyebab kematian kedua akibat kanker pada wanita setelah kanker leher rahim dan merupakan kanker yang paling banyak dijumpai diantara wanita. Data yang diperoleh dari menyebutkan bahwa kurang lebih terdeteksi pada tahun tahun (Ferlay j, et al.,
2007
40.190
kasus kematian kanker payudara
dan meningkat sekitar
2001 cit R a sjidi, 2009).
American Cancer Society
21,69% 2009).
dan cenderung meningkat
kanker yang
2007
teijadi
kanker payudara
pada wanita sebesar
dari tahun 2004 sampai tahun 2007 (Rasjidi,
Di Semarang kanker payudara menempati urutan kedua dengan tingkat
insidensi •
pertama diantara
25
Di Indonesia berdasarkan data dari
SIRS (Sistem Informasi Rumah Sakit) pada tahun menempati urutan
dalam kurun waktu
30%
1 2,16% pertahun.
Tjindarbumi
(2002)
mengemukakan di Indonesia terdapat berbagai jenis
terapi yang dilakukan untuk kanker diantaranya radioterapi
(20-25%),
kemoterapi
(5-10%)
tetapi Meiyanto
(70%),
(2002) cit
pembedahan
Hamid
(2008)
menyatakan bahwa pengobatan kanker tersebut hanya efektif untuk beberapa periode waktu saja dan bersifat merusak seluruh sel termasuk set yang normal sekalipun.
Beberapa
strategi
untuk
perperlama
usia
harapan
hidup
dan
mengurangi gejala telah dilakukan tetapi, masih diperlukan terapi baru yang dapat menghilangkan tumor primer dan sekunder dengan pentargetan yang lebih efisien. 1
tanaman obat
Penggunaan
tradisional
yang diharapkan tidak
banyak
menimbulkan efek samping saat ini mulai digalakkan oleh pemerintah, salah satunya dengan memanfaatkan potensi swnber daya alam Y!illg ada di Indonesia. Steroidal saponin merupakan metabolit sekunder tanaman yang terdapat pada family dioscoreacea
dan diduga memainkan peran penting dalam proteksi
antikankanker melalui induksi apoptosis dan hambatan terhadap sinyal siklus sel (Podolak et al., 2010). Family dioscoreaceae memiliki kandungan kandungan steroidal sapogenin berupa diosgenin dan dioscin. Srinivasan et al. (2009) menyebutkan bahwa diosgenin menghambat Akt signaling pada sel kanker payudara estrogen positif dan negatif sehingga ekspresi Bcl-2 tertekan dan menyebabkan penghambatan pada fase Gl melalui downregulasi siklin Dl, cdk-2 dan cdk-4 Pada
namun,
penelitian
tidak toksik terhadap sel epitel payudara normal (MCF-lOA).
lain, diosgenin menginduksi penghentian fase G2/M dan
2 apoptosis. Aktivasi disrupsi interselular Ca +, dan aktivasi caspase (Liu et
al.,
2005). Tanaman gembili
(D.esculenta)
tanaman asli Indonesia dan merupakan
family Dioscoreaceae yang mengandung steroidal saponin dan terbukti secara signifikan sebagai agen antiinflamasi melalui penekanan ekspresi protein NFKB (Olayemi et al.,2007; Riswana
et al., 2010) namun, potensi ekstrak etanol gembili
terhadap sel kanker payudara belwn diketahui begitupula untuk mekanisme sitotoksisitasnya. Berdasarkan Jatar belakang
diatas maka,
penelitian mengenai aktivitas fitokimia ekstrak etanol gembili
perlu dilakukan
(D.esculanta) yang
ada di Indonesia terhadap kultur sel kanker payudara T 47D yang diamati •
dari efek
sitotoksitas, aktivitas proliferasi dan indeks apoptosisnya .
1.2 Formulasi masalah 1. Bagaimana efek sitotoksik ekstrak etanol gembili (Dioscorea esculenta) pada T47D 2.
cell line
Bagaimana aktivitas proliferasi sel kanker payudara T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembili
(Dioscorea esculanta) secara in vitro
2
3.
Bagaimana induksi apoptosis ekstrak etanol gembili
(Dioscorea esculenta)
pada kultur sel kanker payudara T47Dsecara in vitro
1.3 Tujuan
penelitian
1.3.1 Tujuan umum Mengkaji aktivitasekstrak
etanol gembili pada kultur sel
kanker
payudara T47D secara in vitro sebagai kandidat antikanker.
1.3.2 Tujuan khusus 1.
Mengkaji
esculenta)
efek
sitotoksisitas
ekstrak
etanol
pada kultur sel kanker payudara T47D
gembili
(Dioscorea
dan sel vero secara in
vitro
2.
Mengkaji
aktivitas proliferasi sel kanker payudara
pemberian ekstrak etanol gembili (Dioscorea
3.
Mengkaji
induksi
apoptosis
esculenta) pada kultur
ekstrak
T47D
setelah
esculanta)
etanol
gembili
(Dioscorea
sel kanker payudara T47D dan sel vero secara in
vitro
1.4 Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan landasan informasi ilmiah mengenai pentargetan
potensi yang
gembili lebih
sebagai
efi.sien
kandidat
pada
tingkat
antikanker molekuler
payudara sehingga
dengan dapat
dikembangkan menjadi senyawa obat barn untuk terapi kanker payudara secara efektif dan murah .
•
3
BABII TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Kanker Payudara
Kanker payudara
Kanker
payudara (Carcinoma mammae) adalah suatu
penyakit neoplasma yang ganas yang berasal dari parenchyma. Penyakit ini oleh Word Health Organization (WHO) dimasukkan ke
dalam International
Classification of Diseases (ICD) dengan kode nomor 174. Kanker payudara menempati
urutan
tertinggi di dunia setelah penyakit
kardiovaskuler dan Sekitar 50% kasus kanker payudara merupakan kanker yang tergantung estrogen dan sekitar 30% kasus merupakan kanker yang positif mengekspresi HER-2 berlebihan (Gibbs, 2000). Pada umumnya tumor pada payudara bermula dari sel epitelial, sehingga kebanyakan kanker payudara dikelompokkan sebagai
karsinoma (keganasan
tumor epitelial).Sedangkan
sarkoma, yaitu keganasan yang berangkat dari jaringan penghubung, jarang dijumpai pada payudara. Sampai saat ini, mekanisme molekuler penyebab kanker payudara belum diketahui secara pasti namun aktivasi onkogen yang disebabkan oleh modiflkasi genetik (mutasi, ampliflkasi atau penyusunan ulang kromosomal) atau oleh modifikasi epigenetik (ekspresi berlebihan) dilaporkan mampu mengarahkan pada teijadinya multiplikasi dan migrasi sel. Perubahan ekspresi maupun fungsi dari gen supresor tumor seperti BRCAI, BRCA2 dan p53 tidak sepenuhnya bertanggungjawab dalam tingginya prevalensi •
kanker payudara spontan. Mutasi atau ketiadaan BRCAI terdapat pada <10% kanker payudara, sementara itu mutasi p53 teJjadi pada lebih dari 30% kanker payudara (Kumar at al., 2005). Diperkirakan perkembangan tumor dari perubahan seluler pertama kali sampai kemudian terlihat melalui mammografl memerlukan waktu 6 sampai 8 tahun. 2.2
Kultur Sel Kanker Payudara T47D
Salah satu model sel kanker payudara yang banyak digunakan dalam penelitian adalah sel T47D. Sel kanker payudara T47D merupakan continous 4
cell/ines
yang morfologinya seperti sel epitel yang diambil dari jaringan payudara
seorang wanita berumur 54 tahun yang terkena ductal carcinoma. Sel ini dapat ditumbuhkan dengan media dasar penmnbuh RPMI (Ro�well Park Memorial Institute) 1640. Untuk memperoleh media kompleks, maka ditambahkan 0,2 U/ml bovine insulin dan Foetal Bovine Serum (FBS) hingga konsentrasi akhir FBS dalam media menjadi 10%. Sel ditumbuhkan pada suhu 37°C dengan kadar C02 5%. Sel ini termasuk cell line adherent (Abeam, 2007) yang mengekspresikan ER
� (Zampieri et al., 2002) dibuktikan dengan adanya respon peningkatan proliferasi sebagai akibat pemaparan 17�-estradiol Sel ini memiliki doubling time 32 jam dan diklasifikasikan sebagai sel yang mudah mengalami diferensiasi karena memilik:i reseptor estrogen + (Verma et al., 1998). Sel ini sensitif terhadap doxorubicin (Zampieri et al., 2002) dan mengalami missense mutation pada residu 194 (dalam zinc binding domain L2) gen p53. Loop L2 ini berperan penting pada pengikatan DNA dan stabilisasi protein.Jika p53 tidak dapat berikatan dengan response element pada DNA, kemampuannya untuk regulasi cell cycle dapat berkurang atau hilang (Schafer et al., 2000).
Pada sel tumor dengan mutasi p53,
diketahui terjadi pengurangan respons terhadap agen-agen yang menginduksi apoptosis dan tumor-tumor tersebut kemungkinan menjadi resisten.
2.3 Disregulasi Apoptosis Proses apoptosis merupakan proses penting dalam mengatur homeostasis sel maupun
jaringan. Dalam
apoptosis sel
mengalami
serangkaian perubahan
morfologi meliputi pengerutan sel sehingga ukuran sel menjadi lebih kecil, terjadi kondensasi
kromosom
dan
fragmentasi
DNA,
kemudian
diikuti
dengan
pembentukan apoptotic bodies (Kumar et al., 2005). Regulasi apoptosis melibatkan banyak molekul protein dan secara mnum melibatkan 2 mekanisme yaitu jalur intrinsik
(mitochondrial pathway)
dan jalur
ekstrinsik (Death receptor pathway).
5
t
( ��.:=.) J:lopOOia -· ��-----llKAo� �� - ·• ��se' ..
ILJR 11...3
--
;
- -
IW1\
�----\
' ..... o cAMP
+p
s_.
f
�-----------------) �
-=------------------------------------�-----.,
•· · n>o\- -- �------------. n��--
�
·-
- --�-------------�-----+
Gambar 1 Mekanisme apoptosis melalui jalur intrinsik dan ekstrinsik (KEGG diakses 5 September 2011) Apoptosis merupakan kematian sel yang terprogram sebagai respon terhadap rangsangan tertentu dan merupakan proses penting dalam perkembangan normal dan homeostasis jaringan, termasuk dalam mekanisme kunci dimana terapi antikanker menampakan efek sitotoksik. Obat antikanker dan radiasi ion yang merusak DNA
akan
menginduksi apoptosis melalui jalur p53-dependent.
Pengikatan P53 dan protein nuklear lainnya akan menginduksi apoptosis. Mekanisme lainnya yang dapat menginduksi apoptosis melibatkan interaksi protein seperti Fas (CD95) atau tumor nekrosis faktor dan reseptor permukaan sel (Basco et al., 2000). Gangguan atau hambatan pada proses apoptosis mengarah ke keganasan atau kanker. Kegagalan jalur apoptosis normal akan menyebabkan timbulnya lingkungan permisiv bagi sel yang tidak stabil secara genetik dan menyebabkan akumulasi mutasi gen, dapat berakibat sel resisten terhadap penghancuran oleh sistem imun, set menjadi tidak patuh pada checkpoint siklus sel dimana seharusnya terjadi induksi apoptosis. Kelompok antiapoptotik Bcl-2 diketahui 6
mencegah
apoptosis. Pada
sel
tumor, ekspresi
Bcl-2
yang anti-apoptotik
ditemuk:an overekspresi sebaliknya, mutasi dan berkurangnya ekspresi
dari Bax
dan BAK yang proapoptotik ditemukan pada beberapa tumo � (Malik, 2010).
2.4 Siklus sel Berdasarkan kinetika sel yang berproliferasi, dalam suatu populasi sel terdapat empat kompartement yang berbeda. Kompartemen pertama adalah sel yang aktif membelah dikenal sebagai growth fraction. Kedua adalah sel dalam keadaan tenninal diferensiasi yang
akan meninggalkan siklus pertumbuhan dan
mengalami kematian. Ketiga, sel dalam fase mati, dan mungkin
GO yang tidak membelah tetapi tidak
akan memasuki si.ldus sel kembali saat diperlukan atau
mengalami kematian. Keempat, adalah kelompok sel mati yang berasal
dari
kelompok kedua dan ketiga (Gondhowiardjo, 2010). Waktu di antara dua mitosis dikenal sebagai waktu siklus sel. Fase
antara
mitosis dan dimulainya proses mitosis berikutnya dikenal dengan interfase. Interfase terbagi dalam periode waktu diantaranya adalah fase gap
1 (Gl), sintesis
(S), gap 2 (G2). Fase G1 adalah fase persiapan sel untuk melakukan replikasi DNA, pembentukan RNA dan protein yang diperlukan untuk: proses replikasi. Pennulaan replikasi DNA terjadi saat peralihan fase akhir G 1 dan fase selanjutnya yang dikenal sebagai fase S. Selama fase S keseluruhan DNA akan bertambah dari 2N menjadi 4N. Fase G2, sel akan mempersiapkan diri untuk membelah.
..
� !Of.-
-
Gambar 2. Siklus sel (Kumar2005)
7
Sel harus secara kontinyu berintegrasi dengan sinyal ekstra seluler untuk melanjutkan mekanisme kontrol terhadap replikasi dan pembelahan sel. Nutrisi,
cell-cell contact, peptida ekstraseluler merupakan faktor- fak!or ekstra seluler yang berpengaruh.
Growth
factor
dilingkungan ekstra seluler
(GF)
adalah
suatu
molekul
yang
terdapat
dan mempengaruhi proliferasi dan diferensiasi sel
sasaran. Molekul GF akan dikenal oleh reseptor yang terdapat pada permukaan sel yang disebut sebagai growth factor receptor (GFR). Adanya proliferasi tidak terkontrol salah satunya akibat produksi GFR yang berlebihan sehingga sel menjadi sensitif terhadap GF. Sel kanker dapat memiliki abnormalitas fenotif yang berlaina.n, termasuk hilangnya
diferensiasi,
peningkatan
mortalitas
atau
tingkat invasi
maupun
perbedaan sensitivitas obat. Percepatan pertumbuhan sel dapat terjadi melalui
3
mekanisme yaitu perpendekan siklus sel, sehingga akan menghasilkan lebih banyak sel yang terproduksi dalam satuan waktu, penurunan jumlah kematian sel akibat gangguan proses apoptosis atau nekrosis, dan masuknya kembali populasi sel yang tidak aktiv berproliferasi ke dalam siklus proliferasi. Tumor suppersor gene
yang menghambat
pertumbuhan
sel salah satunya melalui
ekspresi
berlebihan Bcl2, penurunan ekpresi Bax. Adanya mutasi pada tumor supresor gene akan mengakibatkan perubahan pola proliferasi sel dan menyebabkan tetjadinya keganasan (Gondhowiardjo, 2010). 2.5 Uji Sitotoksik
Dalam pengembangan obat antikanker baru sebagai agen-agen kemoterapi kanker, evaluasi preklinik merupakan salah satu hal yang penting untuk
..
mengetahui potensi aktivitas neoplastiknya.Evaluasi ini tidak hanya digunakan untuk obat-obat antikanker, tetapi juga untuk obat-obat lainnya, kosmetik, zat tambahan makanan, pestisida dan lainnya.Evaluasi yang telah terstandarisasi untuk menentukan apakah suatu material mengandung bahan yang berbahaya (toksik) secara biologis disebut uji sitotoksisitas.Saat ini penggunaankultur sel untuk uji toksisitas seluler cenderung meningkat.Hal tersebut disebabkan karena
8
-
" "�]I t! .::�!
- --
ot����
-----==---
�> ; _:___ _J � _-�
: .� ·
::;_-=_�_
-�- -
""�-
- _-.:: �=-;::� --
.
" -
--==--= -
;�:. -
•
kondisi lingkungan yang lebih mudah terkontrol sehingga mekanisme toksisitas dapat dipelajari secara efektif. Syarat yang harus dipenuhi untuk sistem uji sito�oksisitas diantaranya adalah sistem pengujian harus dapat menghasilkan kurva dosis-respon yang reprodusibel dengan variabilitas yang rendah, kriteria respon harus menunjukan hubungan linier dengan jumlah sel serta informasi yang didapat dari kurva dosis respon harus sejalan dengan efek yang muncul pada in vivo. Ada 2 jenis uji sitotoksistas yang umum digunakan yaitu metode direct counting dengan menggunakan pewama tripan blue dan metode kolorimetrik dengan pereaksi MTT
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) yang ditetapkan secara spektrofotometri pada panjang gelombang 550 nm (Cancer Chemoteraphy Research Center, 2010). 2.6 Mekanisme Kerja Gembili Pada Kultur Set Kanker Payudara T47D terhadap aktivitasproliferasi dan apoptosis Gembili (Diosecorea esculanta) merupakan familia dioscoreacea yang memiliki kandungan steroid
saponin diosgenin.
Berdasarkan
pendekatan
kemotaksonomi kandungan diosgenin dan dioscin diasumsikan juga terdapat pada gembili. Hasil penelitian Rizwana et al. (2010) menyebutkan bahwa gembili
(Diosecorea esculanta) memiliki kandungan steroid saponin berupa diosgenin dan dioscin. Diosgenin berperan dalam menghambat aktivitas proliferasi sel dan menginduksi apoptosis pada beberapa jenis kanker melalui modulasi siklus sel dan
induksi apoptosis. Penelitian yang dilakukan Saetung et al. (2005)
menyebutkan bahwa kandungan diosgenin tanaman Dioscorea membranaceae mempunyai efek sitotoksik yang poten pada kultur sel kanker paru. Diosgenin memiliki aktivitas penghambatan pada Akt signaling, dan downregulasi Bcl-2, sehingga dapat menurunkan rasio Bcl-2:Bax. Penurunan rasio Bcl-2:Bax mengakibatkan pelepasan cytokrom c dari mitokondria dan berikatan dengan apaf-1 membentuk apoptosom. Apoptosom akan mengaktivkan caspase
cascade
dimulai dari aktiviasi procaspase 9 menjadi caspase 9. Caspase 9 berperan dalam mengaktivkan procaspase 3 menjadi caspase 3 (Bruce, 2008� Podolak, 2010). 9
Nuklear
factor-kappa B (NF1d3) merupakan faktor transkripsi yang
memoduJasi aktivitas proliferasi dan induksi apoptosis Olayemi et al. (2007) menyebutkan bahwa ekstrak etanol Dioscorea esculan� dengan kandungan diosgenin berperan sebagai agen antiinflamasi melalui penghambatan NF1d3.. Adanya penghambatan
NF1d3
mengakibatkan peningkatan aktivitas p21 yang
merupakan inhibitor cyclin D/B sehingga dapat mengakibatkan akumulasi sel pada fase G1-S/G2-M dan penurunan ekspresi Bcl-2 yang mengarah ke induksi apoptosis (Bruce, 2008; Podolak� 2010).
,.
10
BABm METODE PENELITIAN
Pada penelitian ini digunakan metode quasi-eksperimental secat-a in vitro untuk mengetahui efek sitotoksisitas, aktivitas proliferasi, dan induksi apoptosis setelah pemberian ekstrak etanol gembili terhadap kultur sel kanker payudara T47D.
3.1 Rancangan penelitian Rancangan penelitian in vitro dengan menggunakan kultur sel kanker T47D dan sel vero sebagai kontrol sel normal. Adapun parameter pengamatan meliputi: 1.
Sitotoksisitas ekstrak etanol gembili pada kultur sel T47D Ditentukan berdasarkan nilai ICso yang disesuaikan dengan
kriteria National
Cancer institute. 2.
Aktivitas proliferasi sel kanker payudara T47D Ditentukan dari prosentase akumulasi sel pada fase G 1, S, G2, M siklus sel pada masing-masing perlakuan.
3.
Induksi apoptosis sel kanker payudara T47D Dilakukan dengan menggunakan metode flowsitometri pewarna annexin
V
PI, dimana induksi apoptosis ditentukan berdasarkan prosentase sel yang terwarna annexin pada masing-masing perlakuan.
3.2 Waktu dan ternpat penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu "
(LPPT), laboratorium parasitologi FK, dan CCRC UGM Yogyakarta dalam
waktu 6
kurun
bulan yang terdiri 2 bulan pertama persiapan penelitian dan perijinan, 1
bulan ketiga pelaksanaan penelitian, 1 bulan keempat analisis basil dan
2 bulan
terakhir pembuatan laporan.
11
3.3 Alat dan
baban penelitian
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah gembili
(D.esculenta) yang
diperoleh dari pasar tradisionat di daerah Semarang dan diklariflkasikan di Laboratorium Biologi Universitas Negeri Semarang. Peralatan yang digunakan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara 'lain: botol stok larutan, neraca analitik, lampu UV B, flash, microwell 96, incubator C02, mikroskop
cahaya
Olympus CH-12,
elisa reader,
vortex,
mikroskop, almunium foil, erlenmeyer, gelas beker, tabung reaksi, mikropipet, pipet tetes, pipet pasteur, pipet ukur, batang pengaduk, yellow tip, corong pisah, autoklaf, oven, neraca analisis, digital
Canon Power Shot
rotary evaporator, magnetic stirer, dan
A430 12 :MP,
conical tube,
kamera
rnikroskop flouresensi,
obyek glass, Becton Dickinson FACS-calibur, water bath. Bahan kimia yang digunakan meliputi: etanol p.a (E. merck), HCl p.a (E.merck), , tripsin -EDTA, fungizone, natrium bicarbonate, penstrep, RPMI, aquabidest, reagen etidimn bromide-akridin orange, DMSO, SDS 10% dalam HCl, tripsin EDTA, RNase solution, Media Kultur, PBS, MTT, Propium Iodine, Triton X, PBS, dan akuabides, Doxorubicin, triton X. 3.4 Tahapan 3.4.1
penelitian
Persiapan sampel gembili Sampel diperoleh dari petani di daerah Kendal kemudian dilakukan
detenninasi galur di fakultas Biologi UNNES Semarang. Sampel gembili yang diberikan untuk membantu detenninasi meliputi tanaman utuh dengan batang, •
akar, daun dan umbinya.Hasil determinasi menunjukkan sampel merupakan tanaman spesies Dioscorea escu/anta. 3.4.2
Ekstraksi etanol gembili Gembili
dicuci,
dikupas
kulitnya,
dipotong
tipis-tipis
kemudian
dikeringkan dengan oven pada suhu 100°C selama 3-4 jam. Selanjutnya gembili kering diblender sampai berbentuk serbuk. Sebanyak 100 g serbuk gembili diperkolasi pada etanol 95% selama 3 hari selanjutnya Ekstrak etanol gembili 12
basil filtrasi selanjutnya diuapkan menggunakan rotary evaporator (Saetung et al., 2005). Lima Kg tanaman gembili di potong dan dij emur kering kurang lebih 7
hari, setelah itu diblender halus. Sebanyak 300 g serb� gembili dimaserasi dengan etanol 95% sampai volume 500 ekstraksi
dengan
perkolasi
sampai
ml selama 3 hari, selanjutnya didilakukan diperoleh ekstrak
cair.
Ekstrak:
cair
diasumsikan masih mengandung etanol, untuk menghilangkan kandungan etanol maka ekstrak cair dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental dan pekat kemudian diserbukkan.Hasil ekstrak sebanyak 1,469 gram.
3.4.3 Uji sitotoksisitas Uji sitotoksik dilakukan dengan rrienggunakan metode MfT pada sel T47D dan sel Vero. Ekstrak etanol gembili diberikan dengan dosis tertinggi 1000 f..lg/ml. adapun cara pembuatannya Diawali dengan pembuatan larutan stok dari 1 ,469 gram serbuk ekstrak etanol gembili dilarutkan dalam DMSO 3,5 ml sehingga diperoleh larutan ekstrak etanol gembili dalam DMSO dengan konsentrasi 0,4197 gr/ml DMSO. Dari larutan stock dibuat larutan uji dengan dosis tertinggi 1000 f..lg/ml dan dilakukan pengenceran 2 kali sampai dosis terrendah 1,953 f..lg/ml melalui rumus pengenceran: Vt X Nt
=
v2 X N2.
Suspensi sel kanker T47D (5xl04 sel/ml) dimasukkan ke dalam mikrowell dan diinkubasi dengan satu seri konsentrasi ekstrak etanol gembili (D.esculenta) (triplo) pada medium kultur (37°C, C02 5%) selama 24-48 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur pada sel dibuang dan dicuci dengan5%) selama 24-48 jam. ,.
Pada akhir inkubasi, media kultur pada sel dibuang dan dicuci dengan PBS 1 x kemudian ditambahkan MTT 100 mikroliter, termasuk untuk kontrol media. Sel yang telah diberi
MTT diinkubasi selama 2-4 jam dalam incubator (sampai
terbentuk garam fonnazan). Setelah terbentuk garam formazan jelas terbentuk, pada kultur sel ditambahkan stopper SDS 10% dalam O,IN HCI diinkubasi pada tempat gelap semalam Setelah kurang lebih 24 jam sel diperiksa di elisa reader dengan panjang gelombang 550 membentuk
warna
nm.
Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT
ungu, intensitas warna ungu yang terbentuk berbanding 13
terbalik den gan jumlah sel yan g mati. Presentase pen ghambatan per tumbuhan sel diperoleh den gan r umus :
(absorbansi kontrol -absorbansi media)-(absorbansi samoel-absorbansi media) x 100 (absorbansi kontrol-absorbasi media) Potensi sitotoksik ekstrak etanol gembili Berdasarkan nilai
Institute (NCI)
pada sel
T47D
ditentukan
IC50 dan dikategorikan sesuai dengan kriteria National Cancer
yai tu :
-
berpotensi sangat kuat jika n i lai IC50 � 20 J.lg/mL
-
berpotensi cukup kuat jika ni lai IC50
-
berpotensi lemahjika nilai
=
21 J.lg/mL
-100 J.lg/mL
ICso > 100 J.lg/mL
3.4.4 Pengamatan terhadap aktivitas proliferasi sel kanker T47D dengan metode flowcytometri Sel dilabel fluoresen, dilewatkan celah sempit, dan ditembak sinar.Pada suatu populasi set kanker
T47D
yan g diberikan ekstrak etanol gembili, dapat
dilakukan analisis terhadap fase-fase daur sel, sel apoptosis, serta sel yan g mengalami poliploidi. Masing-masi n g jenis sel tersebut memiliki perbedaan pada jumlah set kr omosom di mana pada fase GO/Gl, fase S, fase memiliki 2,
G2/M ber turut-turut
3, dan 4 set kromosom. Semakin banyak jumlah set kromosom, maka
intensitas sin yal optik yan g di berikan semakin kuat karena kemampuan fluoresen
untuk beri n terkalasi pada DNA semakin besar. Pada sel yan g mengalami apoptosis (sub
GO), intensitas fluoresen sangat lemah karena kromosom telah
mengalami fragmentasi. Sedangkan pada sel poliploidi, intensitas yan g diberikan sangat
kuat karena
flowcytometry
jumlah
set kromosom
dianalisis dengan program
cell quest untuk
pada fase-fase daur sel sub G l (apoptosis), S, poliploidi.
Pen ghambatan
yan g lebih dari 4
set.
Data
melihat distribusi sel
G2/M, dan sel yan g men galami
daur sel yan g terjadi dapat di ketahui den gan
membandin gkan antara efek perlakuan larutan uji dengan kontr ol.
3.4.5 Pengamatan terhadap induksi apoptosis Pada pen elitian ini digunakan 2 metode untuk men deteksi induksi apoptosis yaitu den gan metode
double staning
akridin oranye - etidium bromide dan 14
metode flow sitometri dengan pewarnaan annexin V-PI. Metode
double staning
diamati dengan bantuan mikro.kskop flouresense berdasarkan pada perbedaan
fluoresensi DNA pada sel yang hidup dan mati karena pen�atan akridin oranye - etidium bromida. Akridin oranye diserap baik oleh sel hidup maupun sel mati dan menampakan warna hijau jika berinterkalasi dengan DNA
double strand
sebaliknya akan menampakan warna merahjika berinterkalasi dengan RNA single
strand. Etidium bromide
hanya diserap oleh sel yang mati menyebabkan sel akan
berwarna merah (Baskic et al., 2006). Berdasarkan emisi flouresense dan morfologi kondensasi kromatin pada nukleus yang tampak, keadaan sel pada penelitian ini dibedakan menjadi : sel yang hidup dengan karakteristik sel berwarna hijau dengan struktur yang intact, sel apoptosis dengan karakteristik nukleus berwama hijau, tetapi kondensasi kromatin perinuklear tampak hijau terang atau nukleus berwama
merah
orange
dengan
kondensasi
maupun
fragmentasi DNA, sedangkan sel nekrosis ditandai dengan nukleus yang uniform berwama merah orange. Metode flow sitometri menggunakan pewarna annexin V/PI berdasarkan kemampuan Annexin V untuk mendeteksi adanya sel yang mengalami apoptosis dengan berikatan secara
kuat dan spesifik pada phosphatidylserine (PS). Annexin
V tidak dapat berikatan dengan sel yang viable (Hidup) karena sifat sel yang impermeable terhadap annexin
V. Pada analisis ini untuk membedakan antara sel
mati akibat nekrosis maupun
apoptosis ditambahkan pewama DNA yang
impermeable terhadap membran sel sehingga dapat dibedakan antara sel yang mengalami nekrosis maupun apoptosis. Pada analisis flowsitometri sel dibedakan menjadi
4 populasi diantaranya double negative cells (AV/Pf) untuk sel hidup,
single positive cells apotosis,
(AV+/PI-) untuk
early apoptosis
dan (AV-/PI+) untuk
late
dan double positive cells (AV+/PI+) untuk nekrosis (Baskic et al.,
2006).
3.5. Analisis basil Hasil uji sitotoksisitas yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis probit untuk menentukan IC50. Dataj/owcytometry dianalisis dengan 15
program cell quest untuk melihat distribusi sel pada fase-fase daur sel sub Gl (apoptosis), S, G2/M, dan sel yang mengalami poliploidi. Penghambatan daur sel yang terjadi
dapat
diketahui dengan memban�ngkan
antara
efek
perlakuan Jarutan uji dengan kontrol. lndeks apoptosis diuji normalitas dan homogenitas selanjutnya, jika data normal dan homogen dilakukan analisis sidik ragam (Anova) dengan bantuan SPSS ver.15 untuk menentukan perbedaan antara beberapa kelompok perlakuan pada taraf signifikasi 5% dan dilanjutkan dengan uji Tukey-LSD.
,.
16
BAB IV BASIL DAN PEMBABASAN
4.1 Basil penelitian 4.1.1 Uji sitotoksisitas Penelitian ini menggunakan ekstrak gembili
(D.esculanta)
yang diekstrak
secara perkolasi dengan pelarut etanol 95%. Hasil yang diperoleh merupakan ekstrak dengan kandungan beberapa senyawa yang bersifat polar. Olayemi et
al.
(2007) menyebutkan pada ekstrak etanol gembili terkandung beberapa senyawa yang bersifat polar diantaranya saponin, diosgenin. Uji sitotoksik ekstrak etanol gembili dilakukan pada
T47D dan vero cell line dengan doxorubicin sebagai
kontrol positif. Sebelum
dilakukan penilaian aktivitas sitotoksik ekstrak etanol
gembili, kultur T47D
dan vero diinkubasi dengan bahan nuji pada incubator C02
5%, 3'f selama 24 jam untuk memberikan kesempatan bahan uji berinteraksi dengan sel uji.
..
Gambar 3 Sel T47D diamati dibawah mikroskop inverted perbesaran 400x. (A) kondisi sel T47D sebelum pemberian ekstrak etanol gembili; (B) kondisi sel T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembili dosis 40J1g/mL selama 24 jam. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanol gembili pada sel pada
T47D dan vero tersaji
tabel 1. Ekstrak etanol gembili dibagi menjadi 10 seri konsentrasi yaitu 1000
f.1g/ml; 500 flg/ml; 250 f.1g/m1; 125 flg/ml; 62,5 f.1g/m1; 3 1 ,25 f.1g/ml; 15,625 f.1g/ml; 7,81 f.1g/ml; 3,90 f.1g/ml; 1,95 J.Lg/ml. Pada penelitian ini diperoleh prosentase viabilitas tertinggi setelah pemberian ekstrak etanol gembili pada sel
T47D 17
sebesar 89,24% pada konsentrasi 1 ,95 llg/ml dan terrendah sebesar 9,43% pada konsentrasi 1000 llg/ml
(tabel 1). Pada sel vero prosentase viabilitas tertinggi
setelah pemberian ekstrak etanol gembili pada sel T47D sebesar 155,71% pada _
dan terrendah sebesar 0,37% pada konsentrasi 1000 !J.g/ml
konsentrasi 1,95 !J.g/ml
(tabel l). dan prosentase viabilitas kultur sel T47D dan Vero setelah pemberian ekstrak etanol gembili (D.esculanta) selama 24 jam
Tabel l .Rerata absorbansi
Kultui sel T470
Konsentrasi ekstrak
Kultui sel Vero
etanol gembili
Rerata
Rerata
(flg/ml)
%
%
absorbansi*
viabilitas
absorbansi *
Viabilitas
1 000
0,224
500
0,194
.
9,43
0,148
0,37
6'24
0,107
4,27
250
0,361
23,15
0,128
8,37
125
0,466
33,61
0,268
32,66
62,5
0,629
49,82
0,531
85,62
3 1 ,25
0,773
64,2
0,843
148,59
15,625
0,790
65,89
0,906
1 6 1 ,22
7,81
0,890
67,52
0,819
143,75
3,9
0,926
79,44
0,859
1 5 1 ,75
1,95
1 ,025
89,24
0,879
155,71
*Keterangan: Rerata absorbasi sel diperoleh setelah dilrurangkan dengan media .k:ultur.
Nilai absorbansi diukur dengan menggunakan elisa reader pada panjang gelombang 595 nm.
Nilai IC50 diperoleh dengan melakukan analisis probit terhadap prosentase viabilitas untuk cell line T47D dan vero. Hasil analisis probit untuk eel/ line T47D diperoleh nilai IC5o sebesar 39,61 llg/ml yang berarti ekstrak etanol gembili memiliki efek
sitotoksik yang
sedang (21
kanker
payudara T47D. Peningkatan konsentrasi ekstrak etanol gembili mengak:ibatkan penurunan prosentase viabilitas sel kanker payudara T47D. Hal tersebut dapat dilihat dari persamaan regresi y
=
-31,482
+ 100,65, dari persamaan tersebut
terdapat kencendrungan peningkatan konsentrasi perlakuan yang berbanding terbalik dengan respon dimana semakin tinggi dosis yang diberikan maka, semakin rendah prosentase sel yang hidup. Keeratan hubungan antara ekstrak etanol gembili dengan prosentase viabilitas sel T47D sebagai respon terhadap
18
1
perlakuaan dapat dilihat
dari nilai R2 sebesar 0,96 18 yang berarti 96,18 % respon
viabilitas sel T47D dipengaruhi variasi konsentrasi yang diberikan
0 ,...
� "i fit
�
:a nl ·s: '*'
100 80 60
(Gambar 2).
y =.-31,48x + 100,6 R2= 0,961
:: 1 0
1
0,5
2
1,5
2,5
3
3,5
log konsentrasi ekstrak etanol gembill
Gambar 4. Bubungan variasi konsentrasi ekstrak etanol (D.esculanta) (log dosis) terhadap prosentase viabilitas sel T47D.
gembili
Hasil perhitungan analisis probit terhadap sel vero diperoleh nilai ICso sebesar
108,49 flg/ml yang berarti ekstrak etanol gembili memiJiki efek sitotoksik yang lemah terhadap sel vero sebagai sel normaldengan persamaan regresi y
=
-71,156x+206,28 yang menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi
ekstrak etanol gembili yang diberikan maka, semakin rendah prosentase viabilitas sel vero. Keeratan variasi konsentrasi dengan prosentase viabilitas sel vero dapat dilihat dari nilai R2 sebesar 0,8425 yang berarti 84.25 % respon sel yang hidup dipengaruhi variasi dosis yang diberikan (Gam bar 3). 200
•
f150 Qj >
y = -71,1Sx + 206,2
•
R2= 0,842
�100 Ill
� so ..c nl
> '*'
0 -50
+-----�--�--��-4���0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
log konsentrasl ekstrak etanol gembill
Gambar 5. Hubungan variasi konsentrasi ekstrak etanol (D.esculanta) (log dosis) terhadap prosentase viabilltas sel T47D
gembili
19
Pada uji sitotoksik sel T47D digunakan kontrol positifberupa doxorubicin dengan 1 0 seri konsentrasi yaitu 100 llg/ml� 50 llg!ml; 25!lg/ml; 12,5!lg/ml; 6,25 !lg!ml; 3,751lg/ml. Rerata absorbansi pada
dan prosentase viabilitas sel T47D dapat diamati .
tabel 2.
TabeJ
2. Rerata absorbansi dan prosentase viabilitas kultur sel T47D setelah
pemberian ekstrak etanol gembili (D.esculanta) selama 24 jam Konsentrasi
Rerata
doxorubicin(f.lg/rnl)
100
50 25
absorbansi * 0,137
% viabilitas sel T47D 44,02
0,137
44,23 45,95
0,14
12,5
0,155
49,86
3,75
0,158
50,77
6,25
0,169
54,35
*Keterangan: Rerata absorbasi sel diperoleh setelah dilrurangkan dengan media kultur.
Nilai absorbansi diukur dengan menggunakan elisa reader pada panjang gelombang 595 nm.
Hasil analisis probit menunjukkan nilai
ICso doxorubicin terhadap sel T47D
sebesar 9,96 llg/ml. berdasarkan kriteria sitotoksik
National Cancer Institute
doxorubicin menunjukkan aktivitas sitotoksik yang sangat kuat
(ICso� 20�g!mL).
Hubungan antara variasi konsentrasi (log konsentrasi) dengan prosentase sel hidup dapat diamati pada gam bar mengakibatkan
penurunan
persamaan regresi y
=
4 dimana peningkatan konsentrasi doxorubicin
prosentase
viabilitas
sel
T47D
sesuai
dengan
-6,8171+56,794. Keeratan hubungan antara konsentrasi
doxorubicin dengan prosentase viabilitas dapat diarnati dari nilai R2 sebesar 0,799 yang berarti 79,9% respon penurunan prosentase viabilitas sel T47D diakibatkan oleh variasi konsentrasi doxorubicin. Pada penelitian
ini uji sitotoksik doxorubicin
tidak dilakukan pada sel vero dikarenakan pada beberapa penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa doxorubicin bersifat toksik pada sel normal termasuk vero.
20
60
•
c 50 ,....
j! Ul
�
•
40
•
•
..
30
1i JS! 20
y = -6,817x + 56,79
>
R2= 0,799
� 10 0 0
0,5
1
2
1,5
2,5
log konsentrasl doxorubicin
Gambar 6 Hubungan variasi konsentrasi doxorubicin (log dosis) terhadap prosentase viabilitas sel T47D 4.1.2 Aktivitas Proliferasi Data jlowcytometry dianalisis dengan program
cell quest
distribusi sel pada fase-fase daur sel sub G l (apoptosis),
untuk melihat
S, G2/M, dan sel yang
mengalami poliploidi. Aktivitas proliferasi set T47D yang terjadi diketahui dengan membandingkan antara efek perlakuan larutan uji berupa ekstrak etanol gembili dengan kontrol setelah 24 jam inkubasi
(Tabel 3).
Tabel 3. Analisis rerata aktivitas proliferasi sel T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembili terhadap kontrol selama 24 jam Kelompok perlakuan
,QreGO
Rerata aktivitas sel
GO-G l
s
G2-M
M
kontrol
3,806*
49,75 *
21,8
22,4*
2,53
CE 40 jlg/rnl
23,95*
34,37*
19,26
19,57*
4,08
CE 20 jlg/ml
4,17*
45,1*
22,19
26,37*
3,89
Keterangan :
* menunjukkan nilai p
Pada kelompok ekstrak etanol gembili 40 jlg/ml terdapat peningkatan akumulasi sel secara signifikan (p<0,05) pada fase pre GO sebesar menjadi 23,95%
dari 3,8%
(6x), seiring dengan penurunan prosentase sel secara signifikan
(p<0,05) pada fase GO-G 1 dari 49,74% menjadi 34,37% dan pada fase G2-M dari 22,4% menjadi 19,57%. Kelompok ekstrak etanol gembili 20 Jlg/ml menunjukkan peningkatan akumulasi sel pada fase G2-M secara signifikan dari 22,4% menjadi 26,37% ( l ,lx) (Gambar 5).
21
60 50 Qj
Ill c
J!!
40
E
30
• kontrol sel
20
• CE 40
mcg/ml
• CE 20
mcg/ml
Ill .a
Ill .c 110 c cu a.
�
10 0 preGO
GO-Gl
s
G2-M
M
fase slklus sel
Gambar 7 Aktivitasproliferasisel T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembililcrude extract (D.esculanta) selama 24 jam. Penggunaan doxorubicin tidak dilak:ukan pada penelitian ini dikarenakan pada penelitian Meiyanto et al. (20 1 1 ) menyebutkan doxorubicin dengan konsentrasi 4 J.t.g/ml memiliki aktivitas penghambatan pada fase G2-M pada sel T47D yaitu sebesar 25,46% setelah 24 jam pemaparan. Berbeda dengan penelitian Eom (20 1 1) yang menyebutkan bahwa pemaparan doxorubicin sebesar 10 f,lg/ml selarna 24 jam mengakibatkan akumulasi sel Huh-7 pada fase sub GO. 4.1.3 lnduksi Apoptosis Apoptosis sel T47D diamati menggunakan metode double staning akridin orange-ethidium bromide untuk mengamati morf?logi sel yang mengalami ..
apoptosis. Sel yang mengalami apoptosis menampakan morfologi sel berupa pengurangan ukuran sel, membrane blebbing, konsensasi kromatin, fragmentasi DNA, dan pembentukan apoptotic bodies (Mooney et al., 2002). Hasil pewarnaan dengan acridine orange-ethidium bromide menunjukkan pada perlakuan CE 40 J..lg/ml sel tampak mengalami apoptosis yang ditandai dengan sel berwarna hijau atau orange dengan fragmentasi DNA dan beberapa sel dengan adanya kondensasi kromatin dan adanya apoptotic bodies sedangkan, sel hidup berwarna bijau
22
dengan struktur intact. Pada kelompok kontrol sel banyak dijumpai sel dengan struktur intak dan wama hijau (gambar 7).
Gambar 8 Gambaran sel T47D dengan pewarnaan acridine orange-ethidium bromide yang diamati pada mikroskop fluorescence 40x. gambar diambil dengan menggunakan kamera canon LEXUS. L menunjukkan sel yang hidup, EA menunjukkan early apoptosis ditandai dengan fragmentasi DNA, N menunjukkan sel nekrosis, Ab menunjukkan terbentuknya apoptotic body Berdasarkan hasil analisis flowsitometri sel yang hidup (AV-/PI-) pada kelompok kontrol memiliki nilai tertinggi yaitu sebesar 92,25%. Berbeda dengan kelompok perlakukan ekstrak gembili (CE) 40 j.lg/ml dan 20 j.lg/ml maupun doxorubicin dimana prosentase sel mengalami penurunan secara signifikan (gambar 6). Populasi sel pada AV+/PI- menunjukkan peningkatan pada doxorubicin yaitu sebesar 20,28% dan secara signifikan berbeda bermakna dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya (gambar 6). Hal tersebut menunjukkan keadaan sel yang mengalami perubahan integritas membran sehingga PS terekspose keluar dan berikatan dengan annexin V namun belum teijadi peningkatan pennabilitas membran (early apoptosis). Populasi sel pada AV+/PI+ mengalami peningkatan pada penggunaan CE 40j.lg/ml. populasi double positive cells (AV+/PI+) menunjukkan adanya perubahan integritas membran plasma dan peningkatan adanya fragmentasi DNA.sehingga annexin V dan PI dapat masuk dan berikatan DNA
Fragmentasi DNA merupakan karakteristik dari sel yang mengalami
apoptosis pada tahap akhir (late apoptosis), sedangkan pada nekrosis teijadi peningkatan permeabilitas membran plasma akibat perubahan integritas membran, 23
narnun tidak dijumpai adanya fragmentasi DNA. Berdasarkan hal tersebut pada populasi
double positive cells diduga terdapat sel
yang mengalarni late apoptosis
dan nekrosis.Populasi sel pada AV-/PI+ mengalami pen!ngkatan secara pada
pemberian doxorubicin terhadap kelompok yang lainnya. 100 ..,-a•:r-c:-o.-----90 80 70
60
• kontrol
so
• CE40 �g/ml
40
CE 20 �/ml
30
• doxorubicin
20 10 0 AV-/PI-
AV+/PI-
AV+/PI+
AV-/PI+
Gambar 9 Rerata prosentase sel T47D setelah dipapar dengan beberapa perlakuan selama 24 jam.Hasil prosentase diperoleh dari analisis flowsitometri dengan menggunakan pewarna annexin V-PI (AV/PI). CE (crude extract) merupakan ekstrak etanol gembili. * menunjukkan p
assay. wama
ini digunakan metode MIT
Aktivitas dehidrogenasae mitokondria sel yang hidup akan mereduksi kuning
MTT
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium
bromide) membentuk wama ungu. Absorbansi warna yang terbentuk dapat diukur secara kuantitatif dengan panjang gelombang 595
reader.
nm
dengan menggunakan
elisa
Reduksi tersebut terjadi hanya ketika enzim reduktase mitokondria aktif
sehingga konversinya dapat langsung berhubungan denganjumlah sel yang hidup. Efek sitotoksik ditunj ukkan oleh nilai
ICso yaitu konsentrasi yang menyebabkan
kematian 50% dari populasi sel. American National Cancer Institute menyebutkan berdasarkan nilai
IC50 efek sitotoksik suatu senyawa dapat dikategorikan menjadi
sitotoksik sangat kuat jika nilai
ICso <20 Jlg/mL, sitotoksik cukup kuat jika nilai
IC50 21-100 mg/ml, dan sitotoksik lemah jika nilai ICso >lOO mglml. 24
Berdasarkan basil uji sitotoksik ekstrak: etanol gembili terhadap sel kanker
payudara T47D menunjukkan potensi yang cukup k:uat dengan nilai IC50 sebesar 39,6l J.1.g/mL namun, pada sel vero menunj ukkan potensi s!totoksik yang lemah dengan
ICso sebesar 108,49 Jlg/mL. Perbedaan tersebut mengindikasikan ekstrak:
etanol gembili memiliki mekanisme kerja yang spesiftk pada sel kanker payudara T47D. Riswana et al. (2010) menyebutkan pada cell line vero menunjukkan bahwa ekstrak etanol gembili memiliki nilai
IC5o sebesar 1 1 1,8 Jlg/mL. Penelitian
ini menggunakan doksorubicin sebagai agen standar yang telah diketahui kisaran nilai
ICso dan mekanisme kerjanya terhadap modulasi siklus sel dan induksi
apoptosis pada sel T47D. Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol gembili pada sel T47D dapat disebabkan oleh modulasi terhadap siklus sel
dan induksi apoptosis. Modulasi siklus sel T47D
dibuktikan dengan pengamatan terhadap profit siklus sel yang memperlihatkan distribusi sel T47D pada masing-masing fase akibat perlakuan. Pada pemberian ekstrak etanol gembili sebesar 40 �glmL menunjukkan adanya peningkatan akumulasi set pada fase pre GO sebesar 6,2 kali lipat lebih tinggi dibandingan kontrol sel (3,80% menjadi 23,95%). Hal tersebut mengambarkan bahwa fase tersebut merupakan fase terlama yang dialami oleh sel sehingga terakumalasi pada fase tersebut. Akumulasi sel pada fase pre
(]{) terjadi akibat sel mengalarni
kematian sebelurn memasuki siklus sel dimana kematian tersebut dapat melalui mekanisme apoptosis. Pozarowski (2004) menyebutkan sel yang mengalami apoptosis sering kali memiliki DNA fraksional akibat fragmentasi DNA Pada fase sub Go hanya fraksi DNA dalam sel apotosis yang tampak. Pada
pemberian ekstrak
etanol
gembili
sebesar 20
Jlg/mL
(Y2ICso)
menunjukkan adanya akumulasi pada fase G2-M yaitu sebesar 26,37% yang berarti 1,1 kali lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol sel. Fase G2 adalah waktu untuk perbaikan kerusakan DNA yang terjadi selarna memasuki fase-fase siklus sel
dan untuk reorganisasi struktur DNA sebelum DNA dapat dibelah
selama mitosis. Pada fase G2-M Siklin B 1 terkespresikan secara maksirnal (Pozarowski, 2004 ).
25
Proses kematian sel melalui mekanisme apoptosis penting digunakan sebagai indikasi selekstivitas ekstrak etanol gembili sebagai kandidat antikanker payudara. lnduksi apoptosis ditunjukkan dengan adanya pe_ningkatan prosentase sel yang mengalami apoptosis. Berdasarkan hasil penelitian pada kelompok kontrol, rata-rata prosentase sel apoptosis sebesar
7,29% dan teJjadi peningkatan
rata-rata prosentase sel yang mengalam.i apoptosis setelah pemberian ekstrak
etanol gembili dosis
20 J.lg/rnL dan 40 J.lg/mL menjadi 15,52%. dan 36,60%. Sel
yang mengalami apoptosis pada pengamatan mikroskopis menggambarkan adanya fragementasi kromatin (gambar
8). Pada penelitian ini digunakan doxorubicin
sebagai agen standar yang dapat memicu apoptosis pada berbagai sel line melalui beberapa mekanisme. Kelompok pemberian doxorubicin menunjukkan adanya peningkatan rata-rata apotosis sebesar
32,86% ditandai dengan terbentuknya
apoptotic bodies. Doxorubicin sebagai agen kemoterapi mampu mengaktivasi caspase 3 melalui mekanisme p53-Jndependent (Gamez, 2005). Kemampuan
induksi
pada
apoptosis
sel
kanker
merupakan
dasar
pengembangan agen kemoterapi yang cukup efektif Modulasi apoptosis sangat bermanfaat dalam management terapi
dan pencegahan
timbulnya
kanker
(Taraphdar, 2001). Kematian sel melalui jalur apoptosis diharapkan tidak menimbulkan respon inflamasi dan mengurangi efek samping pada pasien. Pada penelitian ini apoptosis terdiri dari dan
late apoptosis (annexin
2 tahap yaitu early apoptosis (annexin v+!Pr)
v+IP:r) (gambar 9). Early apoptosis,
sel mengalami
gangguan potensial transmembran mitokondria menyebabkan pelepasan
apoptosis
inducing factor dan teJjadi eksternalisasi phosphatidilerine (PS). Late apoptosis "
menunjukkan sel mengalami fragmantasi DNA (Engeland, Tanaman
gembili
merupakan
famili
1998; Basco, 2000).
Dioscorecea
yang
steroidal saponin diantaranya berupa diosgenin dan dioscin (Man, apoptosis pada sel
mengandung
2010). Induksi
T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembili diduga
disebabkan oleh penurunan ekspresi protein BcL-2 akibat penghambatan NFKB. BcL�2 merupakan protein antiapoptotik yang berperan dalam menjaga integritas membran mitokondria, sehingga penurunan ekspresi BcL-2 pada terpicunya apoptosis. Diosgenin memiliki aktivitas penghambatan pada
Akt signaling, dan 26
downregulasi Bcl-2, sehingga dapat menurunk:an rasio Bcl-2:Bax. Penurunan rasio Bcl-2 :Bax mengakibatk:an pelepasan cytokrom c dari mitokondria dan berikatan dengan apaf-1 membentuk apoptosom. Apoptoso� akan mengaktivkan caspase cascade dimulai dari aktiviasi procaspase 9 menjadi caspase 9. Caspase 9 berperan dalam mengaktivkan procaspase 3 menjadi caspase 3 (Bruce, 2008; Podolak, 2010). Hasil penelitian Olayemi et al., (2007) menyebutk:an kandungan diosgenin pada ekstrak etanol gembili secara signifikan menurunkan respon inflamasi melalui penghambatan terhadap aktivitas NFKB. Nuklear factor-kappa B (NFKB) merupakan faktor transkripsi yang memodulasi aktivitas proliferasi dan induksi apoptosis Olayemi et al. (2007) menyebutk:an bahwa ekstrak etanol Dioscorea esculanta dengan kandungan diosgenin berperan sebagai agen antiinflamasi .melalui penghambatan NFKB.. Adanya penghambatan
NFKB
mengak:ibatk:an
peningkatan aktivitas p21 yang merupakan inhibitor cyclin D/B sehingga dapat mengakibatkan akumulasi sel pada fase G,-S/G2-M dan penurunan ekspresi Bcl-2 yang mengarah ke induksi apoptosis (Bruce, 2008; Podolak, 2010). Penelitian ini secara in vitro terbukti bahwa ekstrak etanol ge.mbili berperan dalam menginduksi apoptosis dan menghabat aktivitas proliferasi sel T47D namun, aktivitas ekstrak etanol gembili secara in vivo belum diketahui.
27
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa 1.
Ekstrak etanol gembili memiliki efek sitotoksik sedang terhadap sel kanker Payudara T47D namun, memiliki efek sitotoksik yang lemah terhadap sel vero
2.
Ekstrak etanol gembili menunjukkan aktivitas penghambatan pada fase G2-M dengan konsentrasi sebesar 20
f.lg'ml
3. Ekstrak etanol gemhili menunjukkan induksi apoptosis pada konsentrasi 40 f.1g/ml
5.2 Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai potensi ekstrak etanol gembili sebagai kandidat antikanker secara in vivo menggunakan hewan coba.
..
28
DAFfAR PUSTAKA
Abeam, 2007.
T47D (Human Ductal Breast Epitelial Tumor Cell Line) Whole
Lysate (ab l4899) datasheet.
www.abcam.com.
Basco z., Richard B . , Everson, Eliason
J
Diakses februari 2007,
F., 2000. The DNA of Annexin V
Binding Apoptotic Cells is Highly Fragmented.
Cancer Research 60,
4623-4628 Bruce A, 2008.
Molecular Biology of Cell
5111
ed Garland Science Publishing. •.
New York. Cancer chemoprevention research. 2009.
Prosedur Flow sitometri. Fakultas
Farmasi Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Cancer chemoprevention research. 2009.
Prosedur Uji Sitotoksisitas. Fakultas
Fannasi Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta Engeland VM., Nieland LJW., Ramaekers FCS, Schutte B., Ruetelingsperger CPM., 1998. Annexin V-Affinity Assay: A Review on an Apoptosis Detection System Based on Phosphatidylserine Exposure.
Cytometry
31 : 1 -9 ( 1998). Eom
YM, Kim MA, Park SS, Goo MJ, Kwon HT, Sohn S, Kim Choi
KS.,
2005.
Two
Distict Modes
of Cell
WH, Yoon S,
Death
Inducedby
Doxorubicin: Apoptosis and Cell Death Through Mitotoic Catastrophe Accompanied by Senescence-Like Phenotype.
Oncogene (2005) 24,4765-
77. Nature publishing Group. Gamez MJA, Oliva DM, Quesada RA, Canuelo A, Isabel M, Valenzuela MT, Almodovars JMR, Murcia GD, Oliver FJ., 2005. PARP Inhibition Sensitizes p53-deficient Breast Cancer Cells to Doxorubicin-induced Apoptosis.Biochem. J. (2005),119-125. Gibbs, J B. 2000. Mechanism-Based Target Identification and Drug Discovery in Cancer Research. Science Vol 287. 1969-1973 Gondhowiardjo S., 2010. Disregulasi Proliferasi Sel dan Keganasan.
Basic
Science of Oncology: Ilmu Dasar Onkologi. Badan Penerbit FKUI, Jakarta. 29
Hamid Iwan Sahrial, 2008. Histopatologi dan Aktivitas Proliferasi Sel Kelenjar Mammae Setelah Pemberian Ekstrak Rimpang Temu Putih Curcuma zedoaria dan Inisiasi DMBA (Dimethylbenz(a)antrasen) pada Tilrus Galur Sprague dawley.Veterina Medika. Vol. 1 No. 3, Nopember 200&. Kumar V, Abbas A.K, Fausto N., 2005. Robbins and Cotran Pathology Basic of t Disease 7 h ed. Elsevier Saunders. Pennsylvania. Liu M-J, Wang Z, Ju Y, et al., 2005. Diosgenin Induces Cell Cycle Arrest and 2+ Apotosis in Human Leukemia K562 Cells with the Disruption of Ca Homeostasis. Cancer Cbemother Pharmacol 55:79-90 Malik S.
G. 2010. Disregulasi Apoptosis Sel Kan.ker. Basic Science of Oncology: Dmu Dasar Onkologi. Badan Penerbit FKUI, Jakarta.
Man S, Gao W, Zhang Y, Huang L, Liu C. 2010. Chemical Study and Medical Application of Saponins as Anti-cancer Agents. Fitoterapia Elsevier B V. Oct�&1(7)�703-14. Epub 2010 jun 13. Meiyanto E, Aditya F, Hermawan A, Junedi S, Susidarti RA . , 201 1. The Improvement of Doxorubicin Activity on Breast Cancer Cell Lines by ·Tangerti Through Cell Cycle Modulation. Orient Pharm Exp Med (20 1 1) 1 1�183-190 Olayemi J 0 dan Ajaiyeoba E 0. 2007. Anti-inflammatory studies of yam (Dioscorea esculenta) extract on wistar rats. African Journal of Biotechnology. Vol 6 (16), pp. 1913-1915, 20 August 2007 Podolak I, Galanty A, Sobolewska D., 2010. Saponins as Cytotoxic Agents: a review. Phytbo Rev (2010) 9:425-474. DOl 10.1007/s1 1 101-0 10-9183-z Pozarowski P, Darzynkiewick Z., 2004. Method in molecular biology Vol281. Humana Press. Tonowa New Jersey. "
Rasjidi Imam, 2009.Deteksi Dini dan Pencegahan Kanker Pada Wanita. Sagung Seto. Jakarta Rizwana et al., 2010 .A survey on phytochemical and bioactivity of plant extracts from Malaysian forest reserves. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 4(3), pp. 203-210, 4 February 2010 Saetung A, et al., 2005. Cytotoxicity actlvtty of Thai Medicinal Plant.Songklanakarin J. Sci.TechnoL Vol 27 (Suppl. 2), 2005 : Thai Herbs 30
Schafer, J.M., Lee, E.S., O'Regan, R.M., Yao, K., dan Jordan, V.C., 2000, Rapid Development ofTamoxifen-stimulated Mutant p53 Breast Tumors (T47D) in Athymic Mice, Clinical Cancer Research, 6, 4373-4380 Srinivasan S, Koduru S, Kumar R et al., 2009. Diosgenin targets Akt-mediated Prosurviacl Signaling in Human Breast Cancer Cells. Int J Cancer 125�961-967 Taraphdar, Amit K., Madhumita, Roy, dan Bhattacharya R.K., 200 1 . Natural Product as Inducers of Apoptosis: Implication for Cancer Theraphy and Prevention. Current Science, 80( 1 1 ),1391 Tjindarbwni D, Mangunkusumo R. 2002. Cancer in Indonesia, present and Future. Japan Journal Clinic Oncology. 32 (Supplement 10 817-82 1). Verma, S.P., Goldin, B.R., and Lin, P.S., 1998, The Inhibition of the Estrogenic Effects of Pesticides dan Enviromental Chemicals by Curcumin and Isoflavonoids, Envir. Health Presp, 106 (12), 807-812. Wang Y, Che CM, Chiu JF, He QY. 2007. Dioscin (saponin)-induced Generation of Reactive Oxygen Species Through Mitochondria Dysfunction: a .proteomic-based study. J Proteome Res. Dec;6(12);4703-10, Epub 2007 Nov 2. Zampieri, L., Bianchi, P., Ruff, P., dan Arbuthnot, P., 2002, Differential modulation by estradiol of P-glycoprotein drug resistance protein expression in cultured MCF7 and T47D breast cancer cells, Anticancer Res., 22(4):2253-9.
31
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil analisis flowsitometri siklus sel T47D kelompok kontrol dengan menggunakan pewarna PI
�l �
kontrol sel.T47D .00 1
j
M1
b
200
,.
"100
FL2-A"""'
obo
Tooai EYentl: 20000
X p,.,,.,_� R2-A R2./vN (Une&l) Matker
Eve7> ts
All
49
M1
ns2
GO-G1
S-plla5e
�7
G2-M
35eG 571
M5
![
""
M1
I
� ;,,� ..
82.16
271.53
Mean
r::v
0.24
132.98
10.01
38.76
201.84
6.12
201.00
22.73
381.30
286.20
1UO
2&1.00
'll Total
100.00
0.30 47.18 27.tr1 21.n
17.84 2.85
3.�7
PK. OOl
All
GO-GI
$-phose
I
Evanls
20000
11S5
FL2-Are.._
-
" Gatlld
10000
S.trT
"TOilil . 00 100
S.trT
50.50
4623
23.11
23.11
3789 1.01
18.95 2.04
18.95
2.04
Mean
254.08
24.75
�
CN
�2.42
181.13
197.11
4.92
289.53
11.85
376.45
3.79
600.89
�4.91
Median
207.00 0.00
195.00
289.00
378.00
566.00
,...,--�'\,..--.
MS
M1
C>
FL2-Area.
T ol al Events: 20000
Semple 10: PK2
X Parameter. FL2·A F�-Area (linear)
Marker
AI
M1 GO-G1
S-phase
G2-M M5
Event s
20000
1069
10316 3703
4472
415
'!6 Gated
100.00
5.45
51.58 18.77 22.38
2.08
'16 T o al t 100.00
5.45
51.56
Mean 25 3 . 50
CN
42.00
29.34
16305 11.81
197.65
4.77
I
101oo
abo
� �
Ji
437.00
Tollll Evan1S: 20000
50.50
M5 FSC�eighl;
3811.00
�� 5.61
t>bO
10099
G2-M
239.00 153.00
M5
X Pllramet..-: Fll-A Fll · AI .. (lln8Brj -
Medi an
29.73
444.94
Sample10: PK
M1
"
%Goted
16432
I 1 000
abo
SornploD: i
nUdMLT�70
j
I
MS
Median 205.00 0.00 196.00 288.00
18.77
288.33
22.36
377.19
3.75
379.00
2.08
591.47
28.07
504.00
Lampiran 2 Hasil analisis flowsitometri siklus sel T47D kelompok ekstrak etanol gembili 40 �g/ml dengan menggunakan pewarna PI � :58
M5
��
"' 2 M1
� 0
FL2...,.,. . ._ sample ID: CRUDE EXTRACT 1.T470 X Parameter: FU-A FL2-Area (Linear) Mallrer
All
Eventa
3462
451
'-�'
GO-G1
S-phase
Mean
261.27
134.42
•
40.53
7.02
205.26
8.09
3.97
296.65
12.!l9
18.75
3.25
392.28
849
3.8<1
133
t P4
0.66
456.98
20000
4829
6582 3593
5-phase
4164
G2-M M5
891
j�i:m"',lsftl;, � 200
4 0
%Ga ted
100.00
M1
GO-G1
5-llhase
G2-M M5
4.02
454.00
% Tclal
32.91
100.00
24.14 32.91
Mean 232.49
53.95
197.25
17.96
17.96
285.95
20.82
20.82
376.05
4.46
4.46
577.24
Event s 20000
6937 !5937
Median
205.00
99.28
39.00
6.8<1
196.00
11.77
285.00
4. 19
376.00
26.77
540.00
I
M5
FL2....Na ..
I 600
•
%Ga t ed
100.00
34.69
I
I 1000
�
8 0
Toral Events; 20000 % Total 100.00
Mean
01
2()3.27
71.29
29.68
197.02
34.69
3377
29.68 16.89
3037
15.19
15.19
3.93
3.93
786
01
61.18
P4 2 . 0 08
.. ,
l
� to �o
Total Events: 20000
24.14
XParameter: FU-A FU-Aiea (li.-) All
391.00
FL2....Na ..
Sample10' P42 Mar1<er
294.00
4.62
.... """" .. ' � '1 1111 0 .... 111 ...,. ... .... _ .. ..,_ _ 06bo.... .. ' ....•• 0 , 1 e& o ___
Events
GO-G1
204.00
MS
sample ID; P41
N1
229 . 00
134.00
10.31
7 .00
X Parameter: FU-A FL2-Area (Linear) All
Median
36 .29
22.93
4 o
Mall<er
01
794
G2
M
2 o
17.31
1403
� .��w. . �; i� 1
;••
% Tclal
2.25
M5
" . .- ' •
100.00 13.03
G2-M
J!l �
%Gated
Total Ev!!nts: 20000
16.89
52.30
106.32
7.52
285.35
11.77
566.63
26.42
376.68
4.27
Median
19 7 .00 25.00 196.00
283.00
377.00
517.50
33
Lampiran 3 Hasil analisis flowsitometri siklus sel T47D kelompok ekstrak etanol gembili 20 �glml dengan menggunakan pewarna PI � �
.. �
j;&
�
M1
C>
FL2""'re• Sample 10: CRUDE EXTRACT 2.T47D
Total Evonbl; 20000
X Parameter. FL2·A FL2·Area (Unear) Marl<er
Events All
16'293
!,II
203
8 1 .47
1.01
Go-G1
6865
Si>hase
4605
28.26
23.03
3748
23.00
18.74
873
5.38
M5
"34.n
4.37
Moan
c:v
1�.67
10.68
291.57 394.75
12.71
2 8 6.6 8
30 . 7 5
207.16
7.'>1
4.46
4.33
458.19
Median
257.00
14800
205.00 286.00
395.00
455.00
P21.005
c:>
� 0 � .. �
�;
%Total
100.00
1 25 42.&9
G2·M
<...>
%Gated
M5 M1
� c:>
FL2""'r .. . Sample 10: P21
Total Events: 20000
X Parameter. Fl2·A FL2-Area (Linear) Marker
AU
Events 20000
M1 Go-G1 G2-M
5.03
8367
-46.84
5353
26.77
731
M5
100.00
100.00
1006
3607
$-phase
% Total
%Gat ed
5.03
-46.84
18.04
18.04
26.77
3.65
3.65
Mean
27 0.14
36.04
139.66
Median
222.00 0.00
4.66
201.00
288.03
11.n
289.00
384.01
421
556.93
8 .... � .. � ....
4 1 .64
201.57
c:>
j;
cv
25.72
386.00 502.00
M5 Mt
C>
0
•
FL2....ree. .. Sample 10: P22
Total Events: 20000
X Parameter : FL2-A FL2-Area (Linear)
Mat1<er All M1 GQ.G1
$-phase
G2-M
M5
Eventa 20000 1250
%Gat ed
% Total
100.00
100.00
6.26
6.25
9153
45.77
45.77
5070
20.27
25.35
2027
4054
531
2.66
25.35
2.66
Mean
259.14
39.67
1G4.90
288.36 3n.36 585.88
cv
4 2.51
129.85
5.53 11.66
Median
221 .00 8.00
193.00
288.00
3.57
3n.oo
23.79
556.00
34
Lampiran 4 Hasil analisis flowsitometri apoptosis sel T47D dengan menggunakan pewamaan annexin V-PI pada kelompok ekstrak gembili 40 J,tg/ml
File; A42.013
File: A�1.01 1
Patient 10: 1207.11
File: A43.010
Patient 10: 1207.11
Patient 10: 1207.11
Gated E-: 20000
Gated Events: 20000 TetaI Events: 20000
Tctal E-: 20000
Quad %Gated %Total
Quad % Gated % T ot al
Quad % G a ed t
ToCal E-: 20000 UL
10.40
UR
10.40
33.35
33.35
LL
�.85
�.65
10.40
10.<40
LR
Ut.
7.51
UR
28.95
LR
12.07
LL
51.47
7.51
28.95 51 A7
12.07
Gated E-.enta: 20000
UL
UR LL
LR
7.37
18,6�
87.55
8.39
% Tolal
7.37
16.6S
87.55
8.39
"
35
5 Hasil analisis
Lampiran
menggunakan pewamaan annexin
flowsitometri
apoptosis
sel
T47D
dengan
V-PI pada kelompok ekstrak gembili 20 �g/ml
ANNEXIN V FITC
File: A23.021
File: A21.012
File: A22.020
Patient iD: 1207.1 1
Patient ID: 1207.11
Patlent iD: 1207.11
Gated Events: 20000
Gated Events: 20000
Total Events: 20000
Total Events: 20000
Quad %Gated % Tota l UL
0.87
0.97
UR
7.36
7.36
88.31
88.31
5.36
5.36
Ll
LR
Quad % Geted % Total UL
1.36
1.36
UR
12.41
12.41
LL
81.48
81.48
LR
4.75
4.75
Gated Events: 20000 Total Events: 20000
Quad % Gatad % Total Ul
1.29
1.29
UR
12.00
12.00
ll
82.03
82.03
4.68
4.68
LR
,.
36
Lampiran 6 Hasil analisis flowsitometri apoptosis sel T47D menggunakan pewamaan annexin V-PI pada kelompok kontrol sel
AK.014
v
�
...
(')
(')
N - o ... _
"' - o
�
AK2.01�
2
v
dengan
AK3.016
2
<">
2
2
"' - c ... _
... _
0
�
0
2
File: AK.014
Patient tO: 1207.11 Gated Events: 20000
File: AK2.015
PaHent 10: 1207.11 Gatad Events: 20000
Tctal Events: 20000
T ct al Events: 20000
e< % Tol3 Quae % Gat
Quad % G a ted 'lit Teta
Ul
0.30
0.30
UL
0.21
0.21
UR
3.n
3.n
UR
4.17
4.17
LL
91.5�
91.5e
LL
91.28
91.26
LR
4.36
4.36
LR
4.38
4.38
Ale: AK3.o16
Patient 10: 1207.11
Gated Eventa: 20000
Total Eventa: 20000 Quad % Ga lee % Tcta UL
0.35
UR
9.91
9.91
LL
60.7e
ao.1e
LR
8.96
8.96
0.35
,.
37
Lampiran 7 Hasil analisis flowsitometri apoptosis sel T47D menggunakan pewarnaan annexin V-PI pada kelompok doxorubicin
dengan
File: OOX 10 T470.001 PaiJent 10: 1212.11
Gated Ewnts: 20000 Total Ewnts: 20000 Quad %Ga t ed % Total UL
UR
61.09 20.28
61. 09 20.28
LL
7.04
7.04
lR
11.58
11.58
..
38
8. Data absorbasi pada kultur sel T47D setelah pemberian ekstrak etanol gembili selama 24 jam.
Lampiran
Rata-rata
% hidup
0,250
0,224
9,432082
0,194
0,196
0,192
6,243773
0,350
0,348
0,386
0,361
23,14846
125
0,430
0,473
0,496
0,466
33,6101
62,5
0,640
0,619
0,628
0,629
49,81734
31,25
0,770
0,780
0,770
0,773
64,19794
15,63
0,779
0,821
0,771
0,790
65,89173
7,81
0,850
0,854
0,716
0,807
67,5191
3,91
0,986
0,962
0,831
0,926
79,44205
1,95
1,012
1,037
1,025
1,025
89,23946
Kontrol sel
1,097
1,203
1,098
1,133
Kontrol media
0,126
0,129
1,132
0,129
1
2
1000
0,202
0,219
500
0,185
250
Dosis (t!UmL)
3
39
Lampiran 9. Data absorbasi sel vero setelah pemberian ekstrak etanol gembili selama 24 jam
Dosis (&!VmL)
1
2
3
Rata-rata
% hidup
1000
0,155
0,146
0,142
0,147667
8,266129
500
0,11
0,104
0,107
0,107
0,0672043
250
0,122
0,126
0,137
0,128333
4,3682796
125
0,227
0,277
0,302
0,268667
32,66129
62,5
0,477
0,547
0,57
0,531333
85,61828
31,25
0,826
0,842
0,863
0,843667
148,58871
15,625
0,877
0,9
0,942
0,906333
161,22312
7,8125
0,787
0,79
0,882
0,819667
143,75
3,90625
0,853
0,866
0,859
0,859333
151,74731
1,953
0,864
0,864
0,909
0,879
Kontrol sel
0,709
0,709
0,39
0,602
Kontrol media
0,11
0,105
0,105
0,106
155,71237
•
40
Lampiran 10. Data absorbansi sel T47D setelah pemberian doxorubicin selama 24jam % hidup
Dosis (�mL)
1
2
3
Rata-rata
100
0,1225
0,1395
0,149
0,137
44,02314
so
0,1255
0,138
0,1495
0,137666667
44,23736
25
0,1245
0,146
0,1585
0,143
45,95116
12,5
0,1335
0,1435
0,1885
0,155166667
49,86075
6,25
0,1445
0,163
0,2
0,169166667
54,35947
3,75
0,1485
0,1585
0,167
0,158
50,77121
•
Kontrol sel Kontrof media
"
41
Lampiran 11. Cara kerja uji sitotoksik a. Panen sel - Kondisi sel pada flash diamati dibawah mikrosk�p inverted, jika sudah konfluent �80% maka, sel siap untuk dipanen
-
Media kultur pada flask dibuang
Sel yang berada didasar flash dicuci dengan PBS 2x dengan volume Y2 volume awal media pada flask Sel pada dasar flask dibuang dan diberi 200J.1L tripsin-EDTA dan diinkubasi pada kondisi standar selama ±3 menit Sebanyak 4 ml media kultur (MK) ditambahkan pada flask tersebut untuk menginaktivasi tripsin-EDTA Setelah itu sel disemprot perlahan dan ditampung ke konikal dan dihitung j umlah selnya Jika sel terlalu banyak maka, dapat dilakukan pengenceran dengan menambahkan MK sesuai dengan kebutuhan sel sebaliknya, jika sel kurang dari kebutuhan maka, dapat sel dapat dipadatkan dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit. Sel ditanam pada mikroplate 96 sebanyak 100 JlL/swnuran dengan kapadatan sel untuk masing-masing sumuran 10,000 sel /mL sedangkan, kontrol media tidak diisikan sel. Selanjutnya diinkubasi pada inkubator C02 5%, 37°C selama 24 jam b. Pemberian senyawa uji Senyawa uji dipersipakan sesuai dengan dosis yang akan diuji •
Ekstrak etanol gembili Nt N2
=
=
41 9,7 Jlg/mL; Vt 1000 Jlg/mL; V2
=
=
?
1000 JlL
Pengenceran: Nt X Vt
= N2 x V2
419,7 J.lg/mL x ?
=
1000 Jlg/mL x 1000 JlL
Vt = 2,3 JlL 42
Jadi, diambil 2,3 JlL
dari konsentrasi
awal
997,7 J.1L MK sehingga diperoleh 1000
(N 1) dan ditambahkan
J.1L ekstrak etanol gembili
konsentrasi 1000 Jlg/mL. Konsentrasi berikutnya dilakukan pengenceran sebanyak
1 :2
sampai 9 seri konsentrasi •
Doxorubicin N1 = 2000Jlg/mL; V1 = ? N2 = l OOJ.1g/mL; V2
=
1000J.1L
Pengenceran:
N1 x V1
= N2 x V2
20001lg/mL x ?
= 1 OOilg/mL x 1000!-!L
VI = 50J.1L Jadi, diambil 50 IlL dari konsentrasi awal (N1) dan ditambahkan 950 IlL MK sehingga diperoleh 1000 IlL doxorubicin konsentrasi 100 llg/mL. Konsentrasi
berikutnya
dilakukan
pengenceran
sebanyak
1 :2
sampai 6 seri konsentrasi Setelah 24 jam, mikroplate berisi sel dikeluarkan dari inkubator C02 5%, ° 37 C -
Media
kultur pada masing-masing sumuran di mikroplate dibuang dan
d.icuci PBS 2x masing-masing dengan volume 50 IlL Sebanyak 100 J.1L larutan uji dimasukkan ke masing-masing sumuran (triplo) sesuai dengan seri konsentrasinya sedangkan, untuk kontrol sel dan kontrol media hanya diisi 100 J.1L media kultur Setelah selesai, mikroplate diinkubasi
pada
° incubator C02 5%, 37 C
selama 24 jam. c.
Pengujian MTT -
Mikroplate dikeluarkan dari C02 5%, 3�C setelah 24 jam
-
Media kultur pada masing-masing sumuran di mikroplate dibuang dan dicuci PBS 2x masing-masing dengan volume 50 J.1L
43
-
Ditambahkan
100 �L MTT ( 10% pada MK) pada masing masing sumuran
dan diinkubasi kembaJi selama 4 jam pada kondisi standar Setelah
4 jam, pembentukan garam formazan diama�
lalu, ditambahkan
100 �L SDS 10% untuk melarutkan garam formazannya -
Mikroplate dibungkus almunium foil
dan dibiarkan disuhu ruang selama
24 jam. -
Setelah 24 jam, mikroplate dibaca pada elisa reader panjang gelombang
595nm.
..
44
Lampiran
12. Cara keija uji apotosis metode double staning dan flowsitometri
annexin V/PI
)- METODE DOUBLE STANING a. Panen dan penanaman (plating) sel 1 -
Kondisi sel pada flash diamati dibawah mikroskop inverted, jika sudah konfluent -80% maka, sel siap untuk dipanen
-
Media kultur pada flask dibuang Sel yang berada didasar flash dicuci dengan PBS 2x dengan voJume
Y2
volume awal media pada flask Sel pada dasar flask dibuang
dan diberi 200flL tripsin-EDTA dan diinkubasi
pada kondisi standar selama ±3 menit Sebanyak 4 ml media kultur (MK) ditambahkan pada flask tersebut untuk menginaktivasi tripsin-EDTA Setelah itu sel disemprot perlahan dan ditampung ke konikal
dan dihitung
jumlah selnya
Jika sel terlalu banyak maka, dapat dilakukan pengenceran dengan menambahkan MK sesuai dengan kebutuhan sel sebaliknya, jika sel kurang dari kebutuhan maka, dapat sel dapat dipadatkan dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit. Sel ditanam pada
cover
slip
yang telah diletakkan di dasar mikroplate
6.
Masing-masing sumuran ditanam sel sebanyak 1 00,000 sel /mL Selanjutnya diinkubasi pada inkubator C02 b. •
5%, 37°C selama 24 jam
Pemberian senyawa uji Setelah 24 jam, mikroplate berisi sel dikeluarkan dari inkubator C02
5%, 3'f>C Media kultur pada masing-masing sumuran di mikroplate dibuang dan dicuci PBS
2x masing-masing dengan volume 50 flL
Sebanyak 100 flL larutan uji dimasukkan ke masing-masing sumuran (triplo) sesuai dengan
seri konsentrasinya (ekstrak etanol 40 flg/mL
dan 20 flg/mL) sedangkan pada kontrol hanya diisi oleh media kultur sebanyak 1 mL. Adapun peta plate sebagai berikut: 45
Mikroplate I
Mikroplate 2
1-a
1-b
1-c
3-a
3-b
3-c
2-a
2-b
2-c
4-a
4-b
4-c
Keterangan: 1-a; 1-b; 1-c : Kelompok kontro] triplo (a,b,c) 2-a� 2-b; 3-c : Kelompok ekstrak etanol gembili 40�g/mL triplo (a,b,c) 3-a; 3-b; 3-c : Kelompok ekstrak etanol gembili 20�g/mL triplo (a,b,c) Setelah selesai, milcroplate diinkubasi pada incubator C02 5%, 37°C selama 24 jam. c. Pewarnaan -
Media pada masing-masing sumuran dibuang
-
Dicuci PBS 2x dengan volume pada masing-masing sumuran sebanyak 500 J.LL Cover slip diambil dan ditempatkan pada obyek glass dan diberikan 10 �L Acridine orange-ethidium bromide mix reaction
d. Pembacaan
Sel yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop flourecense perbesaran 400x dan difoto dengan menggunakan kamera canon lexus 12 mega pixel. -
Dari basil foto tersebut, sel yang apoptosis dibedakan dengan sel yang hidup berdasarkan kriteria sel yang mengalarni apoptosis.
�
METODE FLOWSITOMETRJ
Sel yang konfluent -80% dipanen dengan menggunakan tripsin-EDTA •
Selanjutnya jumlah sel dihitung dengan mengunakan hemositometer dibawah mikroskop cahaya. Setelah dihitung, sel ditempatkan pada 2 buah mikroplate (12 sumuran) dimana masing-masing well (sumuran) diisi dengan sel T47D kepadatan 5x106/mL (triplo) -
Mikroplate ditempatkan pada kondisi standar inkubasi
inkubator c� 5%, suhu 3 �c selama 24 jam.
kultur
pada
46
-
Setelah 24 jam mikroplate dikeluarkan ekstrak etanol gembili 40 flg/mL,
dan diberikan perlakuan (kontrol,
dan 20 f.tg/mL, dengan kondisi!peta plate
sebagai berikut: o
Mikroplate I
1-a
1-b
2-a
2-b
Mikroplate 2
1-c
3-a
3-b
3-c
2-c
4-a
4-b
4-c
Keterangan: 1-a; 1-b; 1-c : Kelompok kontrol triplo (a,b,c) 2-a; 2-b; 3-c : Kelompok ekstrak etanol gembili 40j.tg/mL triplo (a,b,c) 3-a; 3-b; 3-c : Kelompok ekstrak etanol gembili 20flglmL triplo (a,b,c) -
Kemudian diinkubasi kembali pada kondisi standar selama 24 jam Setelah 24 jam sel, media pada masing-masing sumuran ditampung dalam konikal yang berbeda (konikal 1 sampai konikal 12).
-
Sel yang ebrada pada dasar sumuran ditripsinasi dengan 150 flL tripsin EDTA dan dimasukkan kedalam inkubator selama ± 2 menit. Satu mililiter media kultur ditambahkan pada masing-masing S1Ulluran untuk mengaktivasi tripsin-EDTA, kemudian disempotkan perlahan untuk melepaskan sel pada dasar sumuran
-
Setelah lepas sel ditampung pada konikal untuk masing-masing sumuran digunakan konikal yang berbeda (konikal l sampai konika1 12).
-
Lalu dicuci PBS sebanyak 2 kali tanpa membuang sisa PBS, Sisa PBS buangan ditampung pada masing-masing konikal (konikal 1
sampai
konikal 12) •
-
Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 rnenit, selanjutnya supematan dibuang dan ditambahkan 500 flL PBS dingin pada konikal 1 sampai konikal 12 lalu, dipindahkan pada tube 1,5 mL yang berbeda untuk tiap tiap konikal (tube 1 sampai 12). Pelabelan disesuaikan dengan kode pada rnikroplate
-
Dihitung jumlah sel pada masing-masing tube
-
Tube disentrifugasi kembali selama 2 menit dengan kecepatan 2000 rpm.
47
Supematan dibuang
dan pelet diresuspensi dengan 100 � annexin V/PI
mix reaction yang mengandung buffer, annexin V,
dan PI dengan
perbandingan konsentrasi: 2 �L PI + 2 �L annexin V + 100 �L buffer Suspensi sel dan annexin V/PI mix reaction dibaca pada
FACS
calibur
Becton Dickinson. Penentuan prosentase sel dalam keadaan hidup,
apoptosis, late apoptosis,
early
dan nekrosis digunakan program cell quest.
48
Lampiran 13. Cara keija uji aktivitas proliferasi dengan flowsitometri pewarna PI
1 . Sel yang konfluent -80% dipanen dengan menggunakan tripsin-EDTA 2. Selanjutnya jumlah sel dihitung dengan mengunakan hemositometer dibawah mikroskop cahaya. 3. Setelah dihitung, sel ditempatkan pada 2 buah mikroplate (12 sumuran) dimana masing-masing well (sumuran) diisi dengan sel T47D kepadatan 6 5x10 /mL (triplo) 4. Mikroplate ditempatkan pada kondisi standar inkubasi
kultur
pada
inkubator C02 5%, suhu 3jlc selama 24 jam. 5. Setelah 24 jam mikroplate dikeluarkan dan diberikan perlakuan (kontrol, ekstrak etanol gembili 40 1-!g/mL, dan 20 1-!g/mL, dengan kondisi/peta plate sebagai berikut: Mikroplate I
Mikroplate 2
1-a
1-b
1-c
3-a
3-b
3-c
2-a
2-b
2-c
4-a
4-b
4-c
Keterangan: 1 -a; 1-b; 1-c : Kelompok kontrol triplo (a,b,c) 2-a; 2-b; 3-c : Kelompok ekstrak etanol gembili 40!-!g/mL triplo (a,b,c) 3-a; 3-b; 3-c : Kelompok ekstrak etanol gembili 20J!g/mL triplo (a,b,c) 6. Kemudian diinkubasi kembali pada kondisi standar selama 24 jam 7.
Setelah 24 jam sel, media pada masing-masing sumuran ditampung dalam konikal yang berbeda (konikal l sampai konikal 12).
•
8. Sel yang ebrada pada dasar sumuran ditripsinasi dengan 150 IlL tripsin EDTA dan dimasukkan kedalam inkubator selama ± 2 menit. 9. Satu mililiter media kultur ditambahkan pada masing-masing sumuran untuk mengaktivasi tripsin-EDTA, kemudian disempotkan perlahan untuk melepaskan sel pada dasar sumuran 10. setelah lepas sel ditampung pada konikal untuk masing-masing sumuran digunakan konikal yang berbeda (konikal l sampai konikal 12).
49
1 1 . Lalu dicuci PBS sebanyak 2 kali tanpa membuang sisa PBS, Sisa PBS buangan ditampung pada masing-masing konikal (konikal
1
sampai
konikal 12) 12. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit, selanjutnya supematan dibuang
dan ditambahkan 500 �L PBS dingin pada
konikal 1 sampai konikal 12 lalu, dipindahkan pada tube 1,5 mL yang berbeda untuk tiap tiap konikal (tube 1 sampai 12). Pelabelan disesuaikan dengan kode pada mikroplate 13. Dihitungjumlah sel pada masing-masing tube 14. Tube disentrifugasi kembali selama 2 menit dengan kecepatan 2000 rpm. 1 5 . Supematan dibuang
dan pelet diresuspensi dengan PI mix reaction (sudah
mengandung RNAase) dengan perbandingan konsentrasi 1 juta 16. Suspensi sel
1 : 1 artinya
seUmL : 1 ml PI mix reaction
dan PI mix reaction dibaca pada FACS calibur Becton
Dickinson. Untuk menentukan prosentase set pada masing-masing fase siklus sel digunakan program cell quest.
•
50
Lampiran 14. Biodata peneliti utama Nama Soemarno Tempat lahir Semarang
Tanggal lahir 12 Juni 1973
Gelar Dokter, magister sains, spesialis patologi anatomi Kelamin Pria
Jabatan GoIongan Asisten ahli ITI B Bagian!Divisi Patologi Anatomi Institusi asal Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung Telepon Faksimile (024) 6583584 __(024) 6594366 Alarnat Korespondeni Pos n. Mulawarrnan Selatan no.20 Semarang Alarnat E-mail Telepon Rurnah Telepon Genggam (HP) 024-76481283 081 1272687 Kuallfikast Akademtk Tahun 2003 Tahun 2010
Institusi Universitas Islam Sultan Agung Institusi Universitas Diponegoro
Gelar Dokter umum Gelar Magister sains
Tahun 2010
Institusi Universitas Diponegoro
Gelar Spesialis Patologi Anatomi
Publikasi Ilmiah •
Pengaruh Pemberian ekstrak sarang semut terhadap aktivitas proliferasi dan indeks apoptosis adenocarsinoma payudara mencit C3H. Majalah Patologi Indonesia -
Rhabdomiosarcoma pada ginjal. Jurnal Sains Medika. Vol.l, No.2 Juli Desember 2009
51
Lampiran 15. Biodata peneliti pertama Nama Dina Fatmawati
Gelar Sarjana Sains
Tempat lahir Surabaya Jabatan Asisten Ahli
Tanggal lahir 5 Mei 1983
Bagian/Divisi Biologi Kedokteran Institusi asal Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan
Kelarnin Wanita
GoIongan IliA
Agung
Telepon
Faksimile
(024) 6583584
(024) 6594366
Alamat Korespondeni Pos Jl. Raya Kaligawe KM.4 PO.BOX
1235 Semarang 50 1 12
Alamat E-mail diena home(aNahoo.co.id Telepon Rumah
Telepon Genggam (HP)
08157752883
024-7002 173 2 Kualifikasi Akademik Tahun
2000 -2005 Tahun 20 10- sekarang
Gelar Sarjana Sains
Institusi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Dippnegoro Institusi Program studi Ilmu Kedokteran dasar dan Biomedis Minat Kedokteran Molekuler Program PascasarjanaUniversitas Gadjah Mada
4. Publikasi Ilmiah -
Efek Pemberian Serbuk Pasak bumi (Eurycoma longifolia) Terhadap Motilitas dan Abnormalitas Spermatozoa Mencit. Jumal Sains Medika
•
Vol.l, No.2, Juli-Desember 2009 -
Apoptosis Inducing Effect of Ethanolic Extraxt of Gembili (D.esculanta)
th International
on T47D Breast Cancer Cell Line. Oral Presentation. 5
Conference Molecular Biology Eijkman 2011 -
Uji sitotoksik senyawa alkaloid mahkota dewa
(Phaleria macrocarpa)
pada kultur sel T47D. Prociding Nasional Seminar Herbal for Cancer.
2011 52
