!HU000007470T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 470
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 10222561 2002. 05. 17.
(73) Jogosult: Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, 64665 AlsbachHähnlein (DE)
DE
(72) Feltalálók: Bruns, Wilfried, 68647 Biblis (DE); Köhler, Gernot, 64665 Alsbach-Hähnlein (DE); De Groot, Herbert, 40591 Düsseldorf (DE); Rauen, Ursula, 45327 Essen (DE) (54)
HU 007 470 T2
A01N 1/02
(21) Magyar ügyszám: E 07 012466 (22) A bejelentés napja: 2003. 05. 14. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070012466 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1859679 A1 2007. 11. 28. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1859679 B1 2009. 10. 28.
(2006.01)
(74) Képviselõ: Kerény Judit, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Védõoldat ischaemiás károsodás megakadályozására
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 470 T2
A jelen találmány tárgya javított oldatösszetétel szervvédelemre, elõnyösen a szív, tüdõ, vese, máj, hasnyálmirigy és érrendszer megvédésére, adott esetben abból a célból, hogy véghez tudjunk vinni nem átvérzett ischaemiás szerven hosszan tartó mûtéteket, ugyanennek a szervnek a konzerválására a szállítási, illetve a tárolási idõ alatt más konzerválási eljárásokhoz viszonyítva csökkent szövetkárosodással járó transzplantációjához, vagy ischaemiás szervek reperfúziójához. A jelen találmány ehhez megfelelõ oldatokat bocsát rendelkezésre. Amikor 1955-ben Melrose bevezette a hiperkalémiás szívmegállást, a szívsebészek olyan helyzetbe kerültek, hogy képesek voltak vérmentes, nem verõ szíven komplex beavatkozásokat végrehajtani. Jóllehet, az akkori kardioplégiás oldatokkal csak legfeljebb 40 percig lehetett operálni, elõször váltak lehetségessé veleszületett szívfejlõdési rendellenességeknél operatív rekonstrukciók, valamint a szívbillentyû-protézis alkalmazása. A szívsebészetben mérföldkõként Banard alkalmazott 1967-ben elsõ alkalommal szívtranszplantációt. A további kutatás célja az volt, hogy az addig korlátozott mûtéti idõtartamot megfelelõ oldatokkal és megfelelõ alkalmazási eljárásokkal meg lehessen hosszabbítani. Már a 60¹as években Bretschneider munkacsoportjának sikerült jelentõsen meghosszabbítani az ischaemiaidõket a szívizomvédelem javítására szolgáló új koncepciókkal. Elõször nátriummegvonás révén lehetett elõidézni a szívmegállást, és például prokainnal, acetil-kolinnal és novokainnal megvédték a sejtmembránt, hogy egy sejten belüli ödéma keletkezését megelõzzék. A 12272 számú európai szabadalmi leírásban leírtak egy szívre, vesére és más szervekre szóló védõoldatot, amelyet egy hisztin+hisztidin-HCl alapú pufferrendszer jellemez, és amely ezenkívül nátrium¹, kálium- és magnéziumionokat, valamint egy poliolt vagy cukrot tartalmaz. Ezzel a védõoldattal 8¹szoros tolerálható ischaemiaidõt értek el a kezeletlen szívnél tapasztalt idõhöz képest. Ennek az oldatnak egy további javított változatát írták le az EP 0 054 635 számú európai szabadalmi leírásban, mely szerint a¹ketoglutarát hozzáadásával az aerob anyagcsere a szerv körülbelül 8–10 percig tartó perfúziója alatt a védõoldattal csökkenthetõ az ATP-veszteség a citrátciklus kedvezõ befolyásolása révén. A következõ években a klinikusok és fiziológusok figyelme az ischaemia befejezésének idõfázisára összpontosult, amely a hipotermiás és hipoxikus szerv felmelegedésével és vérrel történõ reperfúziójával végzõdik, és amelyben a szervek teljes mûködésüket visszanyerik. Az idevágó tanulmányok azt mutatják, hogy éppen az úgynevezett reperfúziós fázisban mennek végbe különbözõ patofiziológiás folyamatok, amelyeket a reperfúziókárosodás fogalmával (I–R-kár) lehet összefoglalni. Ennek során mindenekelõtt az endotélsejtek károsodnak, és ezt részben a gyulladásos folyamatok okaként, részben pedig következményeként lehet interpretálni, és amelynek patogenezisében a reakcióképes oxigénspeciesnek láthatólag
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
nagy jelentõsége van. Az utóbbi években ehhez még önálló károsodási faktorként jött hozzá a szervek védelmére alkalmazott hideg; a most alkalmazott konzerváló oldatok közül az ilyen károsodás ellen egyik sem nyújt védelmet. A WO 92/08453 A számú irat hidroxámsav védõhatását írja le, azonban pontos összetétel meghatározott ozmolaritással és pH¹értékekkel nincs leírva. A jelen találmány célja megakadályozni, illetve csökkenteni az ischaemia és a reperfúzió folyamán fellépõ patofiziológiás folyamatokat, amelyek a következõk: ischaemiás károsodás, hidegkárosodás (hidegindukált apoptózis), reperfúziós károsodás, gyulladásos folyamatok. Ehhez az 1. igénypontban egy szervvédõ oldat van megadva, amely teljesíti a megnevezett feladatot. A kardioplégia és a szervkonzerválás során a sejt- és szövetkárosodás ábrázolt mechanizmusai közül egy szervvédõ oldat összetételére vonatkozólag számos követelmény adódik. Ezen követelmények realizálásához találtunk anyagokat, amelyek újszerû, hatékony 1. igénypont szerinti szervvédõ oldatok koncepcióját teszik lehetõvé. Az oldat összetételét úgy választjuk meg, hogy minden fent említett károsodási komponens ellen hatékony védelmet nyújt. A mechanizmusorientált és nem toxikus komponensek által lényegesen csökkenthetõ a konzerválási károsodás. Az eddig alkalmazott konzerválóoldatok ismert toxicitását (véletlenszerû, illetve az anasztomózis idõ alatt bekövetkezõ) szervfelmelegedést elkerüljük. Ily módon javítható a megfelelõ szervszövet funkcionalitása és életképessége, megnõ az ischaemiás és hidegtárolási tolerancia, ezzel hosszabb szervkonzerválási idõk válnak lehetségessé. Ez hozzájárulhat a logisztikához is, abból a célból, hogy javíthassuk a transzplantációhoz a szervek hozzáférhetõségét. Elõnyösnek mutatkozik, ha hidroxámsavszármazékot alkalmazunk, amelynél a hidroxámsav nitrogénatomján lévõ hidrogénatom szubsztituálva van alkil¹, aril- vagy alkil-aril-csoporttal, amelyek 1–20 szénatomosak. Ajánlatos továbbá, ha a hidroxámsavszármazékban a hidroxámsav-szénatomon lévõ hidrogénatom 1–20 szénatomos alkil¹, aril- vagy alkil-aril-csoporttal szubsztituált, ahol ez a szubsztituens tartalmazhat heteroatomokat és/vagy hidroxi¹, amino¹, metoxicsoportokat is. Az is kedvezõ, ha a hidroxámsav nitrogénatomján lévõ szubsztituensek a hidroxám-szénatomján lévõ szubsztituenssel gyûrût zárnak be. A találmányhoz ajánlatos, ha egy vagy több alábbi vegyületet és/vagy sóját tartalmazza: acethidroxámsav, acet-N-metil-hidroxámsav, N-benzil-acethidroxámsav, hexánhidroxámsav, hexán-N-metil-hidroxámsav, benzhidroxámsav, N-metil-benzhidroxámsav;
1
HU 007 470 T2
szalicil-hidroxámsav, szalicil-N-metil-hidroxámsav, szalicil-N-benzil-hidroxámsav, 2-fenil-acethidroxámsav, 2-fenil-acet-N-metil-hidroxámsav, 3,4-dimetoxi-benzhidroxámsav, 3,4-dimetoxi-N-metil-benzhidroxámsav, 2,3-dimetoxi-N-metil-benzhidroxámsav, 2,4-dimetoxi-N-metil-benzhidroxámsav, 3,5-dimetoxi-N-metil-benzhidroxámsav, 2,4-dihidroxi-benzhidroxámsav, 2,3-dihidroxi-benzhidroxámsav, 3,4-dihidroxi-benzhidroxámsav, 3,4,5-trimetoxi-benzhidroxámsav, 3,4,5-trimetoxi-N-metil-benzhidroxámsav, 4-hidroxi-3-metoxi-benzhidroxámsav, 2-hidroxi-3-metoxi-benzhidroxámsav, 2-hidroxi-5-metoxi-benzhidroxámsav, 2-hidroxi-3-metil-izokarbosztiril, 4-klór-N-metil-benzhidroxámsav, 6-ciklohexil-1-hidroxi-4-metil-2(1H)-piridon. Adagolhatunk továbbá elõnyösen deferoxamint is, ahol ajánlatos, ha a deferoxamin koncentrációja maximum körülbelül 10 mmol/l. Az is ajánlatos, hogy ha 6¹hidroxi-2,5,7,8-tetrametilkromán-2-karbonsav-származékot vagy megfelelõ metil-észtert adagolunk. Pufferként célszerû az N¹acetil-hisztidin-alapú puffer, különösen N¹acilezett hisztidinalapú puffer, adott esetben megfelelõ szerves bázissal kombinálva, például N¹glicil-hisztidin/N¹glicil-hisztidin-hidroklorid vagy N¹acetil-hisztidin/lizin és/vagy arginin és/vagy kolin. Az oldat elõnyösen kationként lizint és/vagy lizinszármazékot, elõnyösen lizintartalmú dipeptideket, valamint adott esetben anionként aszpartátot tartalmaz. Célszerûen az oldatban a hidroxámsav és/vagy származékainak koncentrációja legfeljebb körülbelül 10 mmol/l. Az is elõnyös, ha az oldatban a trolox koncentrációja legfeljebb körülbelül 10 mmol/l. Elõnyös, ha az N¹acetil-hisztidin koncentrációja körülbelül 20 mmol/l–körülbelül 265 mmol/l. Ajánlatos továbbá, ha az oldatban a nátriumelektrolit célszerûen körülbelül 10 mmol/l–körülbelül 120 mmol/l koncentrációban van jelen. Egy másik változat szerint vagy kiegészítésképpen az oldat tartalmazhat káliumot, célszerûen körülbelül 5–körülbelül 25 mmol/l koncentrációban. A magnézium koncentrációja továbbá célszerûen körülbelül 3 mmol/l–körülbelül 27 mmol/l. Végül a kalcium elõnyösen körülbelül 0,0001 mmol/l–körülbelül 1,5 mmol/l szabad koncentrációban van jelen. Különösen ajánlatos a lizin és/vagy annak származékai, elõnyösen egy lizintartalmú dipeptid, célszerûen legfeljebb körülbelül 140 mmol/l koncentrációban. Elõnyös, ha az aszpartát az oldatban körülbelül legfeljebb 140 mmol/l koncentrációban van jelen. Amennyiben klorid van az oldatban, ajánlatos, hogy ha az aszpartát a kloridhoz képest feleslegben van jelen.
5
10
15
20
25
30
35
40
2
Bevált az is, hogy ha az oldat a¹ketoglutarátot tartalmaz célszerûen körülbelül 1–körülbelül 9 mmol/l koncentrációban. Az ozmolit koncentrációja elõnyösen legfeljebb körülbelül 140 mmol/l. Az egyik igénypont szerinti eljárás az oldat elõállítására úgy megy végbe, hogy víz feleslegben, célszerûen a szükséges vízmennyiség 90%-ában hozzáadjuk keverés közben az elektrolitokat, a puffert, majd a hidroxámsavat és/vagy származékait úgy, hogy a pH¹érték beállítódik, hozzáadjuk az ozmolitokat vagy ozmolitot, és az oldatot vízzel feltöltjük a kívánt térfogatra. A hidroxámsav és/vagy származékai kinyeréséhez célszerûen rövid szénláncú alkoholokat és/vagy DMF¹et és/vagy THF¹et használunk oldószerként. Különösen elõnyösnek bizonyul az eljárás, ha a szénsav-észterrel való reagáltatást báziskatalízis segítségével végezzük. A találmányt, különösen az 5. igénypont eljárást, alkalmazhatjuk szívinfarktus, szélütés utáni vagy balesetsebészeti beavatkozások utáni vagy extremitás reperfúzió utáni reperfúziós károsodások csökkentésére vagy elkerülésére. Az alkalmazás ajánlatos továbbá olyan betegségek gyógyításánál, amelyeknek elõidézõje hiperferémia (például Alzheimer-kór), továbbá gyökök, oxigéngyökök vagy hidrogén-peroxid által elõidézett sejtkárosodás. A vastól függõ hidegkárosodás, illetve a hideg által elõidézett sejthalál gátlására vaskelátorokat lehet használni. Az ilyen sejtkárosodások csökkentésére szolgáló vegyületekként nem alkalmas minden komplexképzõ. Így például az EDTA, mint ahogy a kusztodiolban lévõ hisztidin is kevésbé hatástalan, bár ezek a ligandumok is erõs vaskomplexeket képeznek. A ligandumnak a vasat inkább speciális módon kell megkötni, és a ligandumnak gyorsan és kielégítõ koncentrációban kell elérni az intracelluláris rekeszeket. Ki lehetett mutatni, hogy különös jelentõsége van az I¹es, illetve II¹es hidroxámsav szerkezeti elemének, amely háromszor található meg a deferoxaminban, mint a vas megfelelõ szerkezeti eleme, illetve liganduma,
45 I
II
ahol R1=1–20 szénatomos alkil¹, aril- vagy alkil-aril50 csoport, amelyek egyenesek vagy elágazóak lehetnek, és tartalmazhatnak heteroatomokat és/vagy további szubsztituenseket is, például hidroxil-amin- stb. csoportokat, és R2 jelentése hidrogénatom, és egyébként ugyanaz lehet, mint R1, és ahol R1 és R2 együtt gyûrût 55 képezhet, és/vagy további szubsztituenseket tartalmazhat, például 2¹hidroxi-piridin-N-oxid és származékai, amelyek csak az eset más tautomer szerkezetét képviselik, ahol R1 és R2 a konjugált kettõs kötésekkel együtt gyûrûbe lehet zárva. A deferoxaminhoz képest 60 kicsi és lipofil anyagokkal realizálható egy gyors intra3
1
HU 007 470 T2
celluláris hozzáférhetõség stratégiája, azaz egy erõs vaskelátor. Egyszerû hidroxámsavak is pozitív hatást mutatnak, azonban egy jó hatékonysághoz szükséges egy meghatározott hidrofília/lipofília arány. Ezenkívül ki lehetett mutatni, hogy a hidroxámsav nitrogénatomján alkilszubsztituált (R2=alkil) vegyületek a szubsztituálatlan vegyületekhez képest, ahol R2 hidrogénatom, általában hatékonyabbak. Amennyiben R2 erõsen elektronvonzó csoport, például – CO–R3 (ahol R3 ugyanaz, mint R1), ez hatástalanságot idéz elõ, bár ezek a vegyületek is még könnyen képeznek vaskomplexeket, például: N-hidroxi-szukcinimid, 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzo-triazin. Két példa szerinti anyag hatékonyságát az 1. és 2. ábra szemlélteti. A hidroxámsav és/vagy származékai találmány szerinti oldatokban lévõ célszerû koncentrációja legfeljebb mintegy 10 mmol/l. Az 1. ábra a máj endotéliumsejtek hidegen történõ károsodásának gátlását mutatja, amely károsodást szalicil-N-metil-hidroxámsavval idézzük elõ. Tenyésztett patkánymáj endotéliumsejteket 72 órán keresztül 4 °C¹on inkubálunk a University of Wisconsin-oldatban (UW) aerob körülmények között 1 mmol szalicil-N-metil-hidroxámsav jelenlétében és távollétében, és ezt követõen 3 óráig melegítjük újra (37 °C¹on) a sejttenyésztõ táptalajban. A sejtkárosodás paraméteréül a citoszol laktát-dehidrogenáz (LDH) felszabadulása szolgál. A 2. ábra hepatociták 3,4-dimetoxi-N-metilbenzhidroxámsavval elõidézett hidegen történõ károsodásának gátlását mutatja. Tenyésztett patkány hepatocitákat 24 órán keresztül 4 °C¹on aerob körülmények között 1 mmol 3,4-dimetoxi-N-metil-benzhidroxámsav jelenlétében és távollétében aerob körülmények között inkubálunk, és ezt követõen 3 óráig újra melegítjük 37 °C¹on a sejttenyészet táptalajban. A sejtkárosodás paraméteréül szolgál a citoszol laktát-dehidrogenáz (LDH) felszabadulása. A deferoxamin erõs vaskelátor, amely a vasat hatfogú ligandum formájában köti meg nem redoxaktív formában. Ezáltal optimális védelmet nyújt hosszabb hidegnek való kitettség esetén. A deferoxamin azonban viszonylag nagy hidrofil molekula, amelynek ezáltal korlátozott a membrán áthatolhatósága. Ezért a deferoxamin nem éri el kielégítõ koncentrációban és sebességgel az összes intracelluláris rekeszt ahhoz, hogy teljes védelmet nyújtson. Elõnyösen legfeljebb 10 mmol/l oldat koncentrációban lehet jelen az oldatban. További vegyületeket adhatunk hozzá, amelyeket célszerûen hozzáadunk a találmány szerinti szervvédõ oldathoz, ezek az 5. és 6. igénypontban vannak megadva. A találmány egy további kivitelezési formája szerint a találmány szerinti 6¹hidroxi-2,5,7,8-tetrametilkromán-2-karbonsav gyökfogó troloxot, illetve származékait adjuk hozzá ahhoz, hogy a hidegkárosodásnál és a reoxigénezési károsodásnál keletkezõ intracelluláris csoportokat felfogjuk. A találmány szerinti oldat-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
ban célszerûen a troloxszármazék koncentrációja legfeljebb mintegy 10 mmol/l. Valamennyi szervvédõ oldat rendelkezik pufferanyagokkal, amelyek az ischaemia folyamán az elkerülhetetlen acidózis ellen hatnak. A leggyakrabban használt szervetlen pufferrendszerek a foszfátok és hidrogén-karbonátok. A pufferkapacitás és pH¹stabilitás vonatkozásában abszolút jobbnak mutatkozott a Custodiol®-ban alkalmazott szerves pufferrendszer: hisztidin/hisztidin-HCl. Különösen elõnyösnek mutatkozik, ha a hisztidinszármazékokat, például N¹acetil-hisztidint használunk a hisztidin/hisztidin HCl helyett pufferrendszerként a fent megnevezett, de más ismert védõoldatokban is. A 3. ábra egy 2¹es faktorral javított N¹acetil-hisztidin pufferkapacitást mutat fiziológiai tartományban a hisztidin/hisztidin HCl-hez viszonyítva. A hisztidinszármazék alkalmazásával elkerülhetõ néhány nemkívánatos hisztidin-mellékhatás (toxicitás különösen a melegben, de a hidegben is néhány sejttípus esetében, például hepatocitáknál), anélkül, hogy befolyásolnánk a jó pufferkapacitást (4. ábra). A 3. ábra a hisztidin/hisztidin-HCl és az N¹acetilhisztidin semlegesítési görbéjét mutatja, amibõl adódnak a használható pufferkapacitások a fiziológiai pH¹érték tartományában, N¹acetil-hisztidin esetében mintegy 60% és a hisztidinnél körülbelül 30% az elhasznált bázis és anyag egymáshoz viszonyított arányára vonatkoztatva. A megnevezett pufferrendszer a találmány szerinti oldatban elõnyösen mintegy 20 mmol/l¹tõl mintegy 265 mmol/l¹ig koncentrációban van jelen. A 4. ábra példát mutat meleg körülmények között a hisztidintoxicitást mutatja, valamint mutatja ennek a toxicitásnak a hisztidinszármazékok általi csökkentését. Tenyésztett patkányhepatocitákat 5 órán keresztül 37 °C¹on aerob körülmények között 198 mmol L¹hisztidin, illetve 198 mmol N¹acetil-hisztidin jelenlétében és távollétében inkubálunk. Alapoldatként a Krebs–Henseleit-puffer (KH) szolgál, egy sejtkultúrákban gyakran alkalmazott fiziológiai sóoldat a hisztidinszármazékot tartalmazó oldatokban a nátrium-klorid-koncentrációt 99 mmol-lal csökkentjük, és a pH¹értéke IICI, illetve nátrium-hidroxid hozzáadásával 7,2¹re állítjuk. Ez a továbbfejlesztés a konzerválás után a sejtfunkciók még jobb megtartását teszi lehetõvé. Az egyik ilyen kation célszerûen a nátrium. Viszonylag alacsony nátriumkoncentrációk egyrészt elõnyösek a sejtmembránon az elektromechanikus szigeteléshez (szívmegállás), másrészt csökkentik a hipoxiindukált nátriumbeáramlás elkerülése vagy csökkentése alapján a hipoxiás, azaz oxigénhiányos károsodást. Emellett marad egy ozmotikus rezerv, azaz tartalék, a többi anyagra (például pufferanyagokhoz, lásd alább). Az oldat alacsonyabb nátriumkoncentrációjánál is gyorsan beáll a reperfúziós fázis homeosztázisa, azaz homeostatikus egyensúlya, mert a nátrium szövet közötti növekedése (140 mmol) gyorsan bekövetkezik. Ezáltal a találmány szerinti oldatban ajánlatos a körülbelül 10 mmol/l¹tõl mintegy 120 mmol/l nátriumkoncentráció.
1
HU 007 470 T2
Viszonylag alacsony, azonban a fiziológiás extracelluláris érték fölötti káliumkoncentráció alátámasztja a sejtmembrán elektromechanikus izolálását (szívmegállás), elkerüli azonban az erõsen hiperkalémiás oldatok hátrányait (az erõsen hiperkalémiás oldatok igen gyors szívmegállást indukálnak, azonban a reoxigénezési fázisban is felelõsek a ritmuszavarokért és adott esetben erõsebb reperfúziós károsodásokért; a reperfúziós fázisban a szövet közötti káliumkoncentráció beállítása idõben elhúzódik, miáltal megnõ ezen oldatoknál a szervek késleltetett kezdõ funkcióinak kvótája. Csak az enyhén hiperkalémiás oldatok rendelkeznek azzal az elõnnyel, hogy a reperfúzió elõtt nem szükséges az oldatot kimosni a transzplantálandó szervbõl (az oldatok tehát nem tudják kifejteni az ischaemiás idõ befejezéséig védõ tulajdonságaikat), és nagy szisztemikus toleranciával rendelkeznek. Ezért ajánlatos a találmány szerinti oldatban a körülbelül 5 mmol/l¹tõl mintegy 25 mmol/l¹ig terjedõ káliumkoncentráció. Egy lényegesen magasabb magnéziumkoncentrációra törekszünk (a szérum-norma értékén felül), mert a magnézium számos glikolitikus enzimrendszer társtényezõjeként védi az anaerob anyagcserét, és ezáltal hozzájárul a hideg ischaemia ideje alatt is az ATP-képzõdéshez. A magnézium ezenkívül hozzájárul még a plazmamembrán Na+–K+–ATPáz aktivitásának fenntartásához, és így az ionhomeosztázis változásai ellen hat. Mint fiziológiai Ca2+-antagonista, ezenkívül a magnézium még egy sejten belüli kalcium akkumuláció káros hatását is ellensúlyozza. A reperfúziós fázisban a magnéziumból egy nagy pool szükséges az aerob energia-anyagcsere stimulálására. A magnézium értágító tulajdonsága ezenkívül a reperfúziós károsodás összehúzó hatását is ellensúlyozza. Ezért ajánlatos, hogy a találmány szerinti oldatban a magnéziumkoncentráció mintegy 3–27 mmol/l legyen. Ischaemiás körülmények között és az ezzel kapcsolatos intracelluláris acidózis és a nátriumhomeosztázis zavara feltételei mellett fennáll egy citoszolikus kalciumnövekedés veszélye. Ez nemkívánatos aktivitásokat fokoz, így például stimulálja a proteázokat és foszfolipázokat, és a szívnél nagy ATP-fogyasztással járó hiperzsugorodással jár. A kalcium fiziológiai funkcióit az ischaemia alatt ez messzemenõkig elnyomja, és emiatt a citoplazmatikus koncentrációk tartományában az oldatban a kalciumkoncentrációkat ennek meg kell mozgatni. Ezért ajánlatos a találmány szerinti oldatban a körülbelül 0,0001 mmol/l–1,5 mmol/ szabad kalciumkoncentráció. A lizin és arginin bázikus aminosavak, illetve ezek származékai, mint glicines dipeptidek, (Lys-Gly, GlyLysm, illetve Arg-Gly, Gly-Arg) felhasználhatók a hiányzó bázis ekvivalensek fedezésére, minthogy a nátrium¹, kálium¹, magnézium- és kalciumkationok koncentrációja és aránya a már leírt tények alapján meg van határozva. A lizin és/vagy lizinszármazékok, illetve arginin és/vagy argininszármazékok koncentrációja a találmány szerinti oldatban legfeljebb mintegy 140 mmol/l lehet. A fiziológiás extracelluláris kloridaniont a fiziológiás értékekkel összehasonlítva lényegesen csökkentett
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
koncentrációban alkalmazzuk, hogy megakadályozzuk a hideg ischaemia alatt az ionhomeosztázis zavarait. Ez különösen egy hipoxiás indukált kation beáramlásra, például nátriumbeáramlásra érvényes. Az elektron semlegesség miatt ez a beáramlás az anionok párhuzamos beáramlásától, elõnyösen a klorid párhuzamos beáramlásától függ. Különbözõ szerzõk utalásai arra engednek következtetni, hogy a magas kloridkoncentrációk kedvezõen hatnak egy intracelluláris ödéma mértékére. A találmány szerinti oldatban ezért ajánlatos a kloridkoncentrációt a lehetõ legszélesebb értelemben a fiziológiai szint alatt tartani, maximum 90 mmol/l¹ig. A klorid mellett laktobionátot is adagolhatunk, mint impermeábilis aniont legfeljebb 140 mmol/l koncentrációban. A szervvédõ oldatokban alkalmazott anionkoncentrációk általában a kationok megválasztásából és a felhasznált szervetlen, illetve szerves pufferbõl adódnak. Az áthatolhatatlan anionok alkalmazása, például laktobionát alkalmazása, az intracelluláris ödéma keletkezése ellen hat. Egy kiemelkedõ alternatívát jelent az aszpartát, és az aszpartát alkalmazásával több cél érhetõ el: a) Sav ekvivalensként az aszpartát az elõnytelen kloridot helyettesíti. b) Az aszparaginsav aktívan támogatja a membránokon végbemenõ anyagcserét és meggyorsítja a homeosztázis újraelõállítását. c) Az aszpartát az a¹ketoglutaráttal kapcsolatban kedvezõen befolyásolja az aerob energia-anyagcserét a reperfúzió kritikus fázisában, illetve a szerv újraoxigénezési kritikus fázisban, és ezáltal a kezdeti funkciókat gyorsítja. Különösen a reoxigenezési fázisban szükséges (amikor a szerv egyre fokozódó felmelegedésével lényegesen megnõ az energiaigény) fokozni az energia elõállítást, mert egy ATP-hiány éppen ebben a melegedési fázisban befolyásolná lényegesen a szerv funkcionalitását és a reperfúziós kár mértékét növelné. Ajánlatos, hogy az aszpartátkoncentrátum a találmány szerinti oldatban legfeljebb 140 mmol/l legyen, az is célszerû, hogy a találmány szerinti oldatban az aszpartát a kloridhoz viszonyítva feleslegben legyen. A glicin aminosavat nagyobb millimoláris koncentrációban alkalmazzuk, minthogy a glicin ebben a koncentrációban a plazmamembrán stabilizálásával megakadályozza a hipoxiindukált nátriumbeáramlást (egy diffúzióorientált oxigén-anyagcsere elkerülése), és ehhez még gátolja makrofágok aktiválását. Ajánlatos a legfeljebb 30 mmol/l glicinkoncentráció a találmány szerinti oldatban. A hideg ischaemia alatt is nem jelentéktelen a szóban forgó szerv energiaszükséglete, miáltal támogatásként energia szolgáltató anyagokat vagy energiaanyagcsere fokozó anyagokat adunk az oldathoz. Eközben különbözõ koncepciókat követünk (lásd az aszpartátot is fent és az a¹ketoglutarátot az alábbiakban). Az egyik ilyen koncepció a glükóz hozzáadása. Az oldat egy fiziológiás glükóz koncentrációja a sejtek számára, amelyek összehasonlítva csekély gliko-
1
HU 007 470 T2
génkészletek alapján exogén glükóz ajánlatra vannak utalva, lehetõvé teszi például endotéliumsejtek számára, hogy az anaerob glikolízis révén az ischaemia alatt nyerjenek energiát. A glükózkoncentrációt azonban úgy választjuk meg, hogy elkerülhetõ legyen egy glükózfelesleg-felvétel más sejtek által, különösen hepatociták által (a korábbi extrém magas glükózkoncentrációjú konzerválóoldatoknál fellépõ probléma), így a találmány szerinti oldatok legfeljebb 10 mmol/l glükózt tartalmaznak, az aszpartáttal együtt az a¹ketoglutarát arra szolgál, hogy alátámassza a hipoxiás feltételek elõtt vagy alatt és/vagy után az anyagcserét. Célszerûen körülbelül 1–9 mmol/l koncentrációt választunk. Oly mértékben szükséges az ozmotikusan ható anyagok hozzáadása, ahogy az szükséges a kívánt körülbelül 300 mosm/l fiziológiai ozmotikus nyomás eléréséhez. Általában poliolokat és cukrokat (például mannitot, raffinózt, szacharózt) vagy nagy molekulasúlyú anyagokat (például HES és dextrán) alkalmazunk. Utóbbiak bizonyos szerveknél nem váltak be, mert befolyásolják a védelem minõségét, a HES-sel és dextránnal elõállított magas viszkozitás hátrányait. Viszkozitás 4 °C¹on: Custodiol® 1,8 cP; UW-oldat 4,8 cP. Ozmolitikumként a szerveknek megfelelõen mannitot, xilitet, szorbitot, szacharózt vagy raffinózt alkalmazhatunk. Az ozmolitkoncentráció célszerûen legfeljebb 140 mmol/l a találmány szerinti oldatban. Egy szövet közötti ödéma elkerülésére néhány szervben/szövetben egy kolloidozmotikus hatékony anyag hozzáadása elõnyös, ilyen például a dextrán40/dextrán¹70. Ez különös mértékben érvényes a tüdõ és hasnyálmirigy megvédésére. A sejtek és szövetek lefagyasztásához a továbbiakban elõnyös további krioprotektív anyagokat hozzáadni, például dimetil-szulfoxidot (DMSO). Az 5. ábra a hepatociták hidrogén-peroxid általi sejtkárosodását és különbözõ hidroxámsavakkal történõ megvédését mutatja, mégpedig a következõképpen: 1) görbe N4+20 mmol/l H2O2; 2) görbe N4+20 mmol/l H2O2+1 mmol/l 4¹klór-Nmetil-benzhidroxámsav; 3) görbe N4+20 mmol/l H2O2+mmol/l 2¹hidroxi-3metil-izokarboszteril; 4) görbe N4+20 mmol/l H 2O2+1 mmol/l 3,4,5trimetoxi-N-metil-benzhidroxámsav; 5) görbe N4+20 mmol/l H 2 O 2 +1 mmol/l 3,4dimetoxi-N-metil-hidroxámsav; ahol N4 a II. példa szerinti oldatot jelenti, azonban trolox és hidroxámsavszármazék nélkül. A 6. ábra a hepatociták hidegkárosodásának gátlását mutatja az új konzerváló oldat segítségével. Kultivált patkány hepatocitákat inkubálunk 24 órán keresztül 4 °C¹on egy találmány szerinti oldatban, amelyhez hozzáadunk pufferként N¹acetil-hisztidint és 1 mmol/l troloxot, és a hidroxámsav-származékhoz 0,5 mmol/l veratril-N-metil-hidroxámsavat, és összehasonlításképpen Krebs–Henseleit-puffer (KH) oldatot és inkubáljuk.
5
2
A hideg inkubálást aerob körülmények között hajtjuk végre; 24 óra múlva a sejteket egy reperfúzió stimulálására a sejtkultúra táptalajban 30 °C¹on újra felmelegítjük, egy sejtkárosodás indikátoraként szolgál a citoszolikus laktát-dehidrogenáz (azaz LDH felszabadulása).
Példák A következõkben olyan oldatok példáit adjuk meg, amelyek megfelelnek az itt igényelt oltalmi kör követel10 ményeinek. I. példa mmol/l
15
20
25
Na(+)
25
K(+)
15
Mg(++)
10
Ca(++) Cl(–)
25
Aszpartát(–)
33
Ac-N¹His
60
Ac-N¹His (–)
60
Lizin-H(+)
60
Glicin
10
Triptofán
30
35
0,1
2
Veratril-N-metil-hidroxámsav
2
Trolox
2
Ketoglutarát(–)
2
N-Metil-szalicil-hidroxámsav
2
pH
7,2
Ozmolalitás
310
II. példa mmol/l
40
45
50
55
60 6
Na(+)
15
K(+)
10
Mg(++)
8
Ca(++)
0,015
Cl(–)
0,03
Aszpartát(–)
38
Ac-N¹His
60
Ac-N¹His(–)
60
Lizin-H(+)
60
Glicin
10
Triptofán
2
2,3-Dimetoxi-N-metilbenzhidroxámsav
2
Trolox
2
Ketoglutarát(–)
3
N-Metil-szalicil-hidroxámsav
2
1
HU 007 470 T2
Táblázázat (folytatás)
2
V. példa mmol/l
Mannit pH Ozmolalitás
30
mmol/l
5
7,2 310
III. példa
10 mmol/l
Na(+)
15
K(+)
10
Mg(++)
16
Ca(++)
0,04
Cl(–)
0,03
Aszpartát(–)
54
Ac-N¹His
60
Ac-N¹His(–)
60
Lizin-H(+)
60
Glicin
6
Triptofán
2
2,3-Dimetoxi-benzhidroxámsav
1
Trolox-OCH3
2
Ketoglutarát(–)
3
2-Hidroxi-3-metil-izokarbosztriril
1
Mannit
20
pH Ozmolalitás
7,2 310
IV. példa mmol/l
Na(+)
15
K(+)
10
Mg(++)
8
Ca(++)
0,015
Cl(–)
0,03
Aszpartát(–)
31
Ac-N¹His
70
Ac-N¹His(–)
70
Lizin-H(+)
70
Glicin
8
Triptofán
2
2-Hidroxi-3-metil-izokarbosztriril
2
Ketoglutarát(–)
2
N-Metil-szalicil-hidroxámsav Mannit pH Ozmolalitás
15
2 20 7,2 310
20
Na(+)
16
K(+)
10
Mg(++)
8
Ca(++)
0,05
Cl(–)
0,1
Aszpartát
16
N-Ac-His
80
Hisztidin
88
L-Arginin
12
Glicin
20
L-Alanin
10
Triptofán
2
alfa-Ketoglutarát
3
Mannit
25
40
3,4-Dimetoxi-N-metil-hidroxámsav
2
pH
7,1
Ozmolalitás
307
Egy szervvédõ oldat, mégpedig pufferrendszer, 30 elektrolitok, védõhatású anyagok és ozmolitok funkcionális komponenseinek megfelelõen állítjuk elõ a találmány szerinti oldatot. Ehhez a szükséges víz mennyiség körülbelül 90%-ában feloldjuk a pufferanyagokat. Ezt követõen a kationok elektrolitként 35 szükséges semleges sóit, például nátrium¹, kálium¹, magnézium- és kalciumsóit a megadott fiziológiailag elfogadható koncentrációkban hozzáadjuk és keverés közben feloldjuk. A védõhatású anyagok további komponensei következnek, amelyeket az oldathoz adago40 lunk. Ezt követõen felülvizsgáljuk az oldat pH¹értékét, és adott esetben az 1. igénypontban megadott értékre állítjuk. Végül hozzáadjuk a megadott mennyiségû ozmolitokat, és az oldatot a kívánt térfogatra hígítjuk. A megfelelõ tartályokba történõ letöltés után az oldatot 45 sterilizáljuk. A ciklusos hidroxámsavak elõállítása például a 2¹hidroxi-piridin-N-oxidból levezethetõ vegyületek elõállítása például az Organic Synthesis Collektiv V. kötet 623. oldalán és a következõ oldalakon található. A hid50 roxámsavak karbonsavszármazékokból történõ elõállítási eljárása megtalálható a Houben–Weil, Methoden der organischen Chemie, 686. oldalán és a következõ oldalakon, melynek során oldószerként rövid szénláncú alkoholokat, DMF¹et, THF¹et használunk. A megfe55 lelõ karbonsav-észterrel történõ reakciót báziskatalizáltan hajthatjuk végre (NaOMe, K2CO3, CaO). Végül hivatkozunk a ciklusos hidroxámsavak elõállításánál a következõ irodalomra: A. Kleemann, J. Engel, Pharmazeutische Wirkstoffe, második kiadás, 1982, 206. olda60 lon és a következõ oldalakon. 7
1
HU 007 470 T2
A leírásban hivatkozott dokumentumok A leírásban a bejelentõ által hivatkozott dokumentumok kizárólag az olvasók informálását szolgálják, és nem képezik az európai szabadalmi dokumentum részét. Ezeket nagy gondossággal állítottuk össze; az EPA tartalmazhat azonban hibákat és hiányosságokat, amiért nem vállalunk felelõsséget. A leírásban hivatkozott szabadalmi dokumentumok – EP12272A – EP0054635A – WO9208453A
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Védõoldat perfúzió, mûtét, transzplantáció vagy kriokonzerválás és ezt követõ reperfúzió után szerveken vagy izolált sejtrendszereken vagy szövetrészeken bekövetkezõ ischaemiás károsodások elkerülésére, amely oldat tartalmaz alkáli- és adott esetben alkáliföldfém-ionokat, valamint egy vagy több hisztidinszár-
2
mazékon alapuló puffert és egy poliolt és/vagy cukrot, és ozmolaritása 290 mosm/l–350 mosm/l, valamint pH¹értéke 6,8–7,4, azzal jellemezve, hogy hisztidinszármazékként N¹acil-hisztidin/bázis-alapú puffert 5 használunk. 2. Az 1. igénypont szerinti oldat, ahol bázisként N¹glicil-hisztidin/N¹glicil-hisztidin-hidroklorid, N¹acetilhisztidin/bázis vagy N¹acetil-hisztidin/lizin és/vagy arginin- és/vagy hisztidinalapú puffert használunk. 3. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oldat, 10 amely lizint és/vagy lizinszármazékot, elõnyösen lizintartalmú dipeptideket tartalmaz. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oldat, amely aszpartátot tartalmaz. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oldat, 15 amelyben az N¹acetil-hisztidin koncentrációja 20 mmol/l–265 mmol/l. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti oldat, amelynek aszpartáttartalma legfeljebb 140 mmol/l. 7. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oldat, 20 amely hidroxámsavszármazékokat tartalmaz.
8
HU 007 470 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
9
HU 007 470 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
10
HU 007 470 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
11
HU 007 470 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
12
HU 007 470 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
13
HU 007 470 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
