Zadání bakalářské práce

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-BAK0427/2009 Akademický rok: 2011/2012 Ústav chemie potravin a biotechnologií Lucie Kostková Chemie a technologie potravin (B2901) Potravinářská chemie (2901R021) Ing. Libor Babák, Ph.D. Ing. Petra Šupinová

Název bakalářské práce: Probiotika a probiotické mikroorganismy

Zadání bakalářské práce: 1) Probiotika - obecná charakterizace a význam 2) Probiotické produkty 3) Probiotické mikroorganismy

Termín odevzdání bakalářské práce: 4.1.2012 Bakalářská práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.

----------------------Lucie Kostková Student(ka)

V Brně, dne 1.12.2009

----------------------Ing. Libor Babák, Ph.D. Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Probiotika a jejich pozitivní vliv na lidské zdraví jsou v souþasnosti þasto diskutované téma. PĜesto je informovanost veĜejnosti o jejich pĜíznivých úþincích nedostateþná, stejnČ tak jejich využívání v praxi. Práce shrnuje souþasné vČdecké poznatky o úþincích probiotik na lidský organismus. První kapitola se zabývá vymezením pojmu probiotika, jejich historií, významem, vlastnostmi, úþinky na lidské zdraví a riziky spojenými s užíváním probiotik. Druhá kapitola obsahuje popis probiotických produktĤ, jejich formy a potraviny obsahující probiotika. V kapitole þíslo tĜi se Ĝeší probiotické mikroorganismy, jejich hlavní charakteristiky a pĜíklady komerþních startovacích kultur. PĜedposlední kapitola obsahuje informace o životaschopnosti probiotických mikroorganismĤ. A kapitola poslední zkoumá metody zaþlenČní probiotik do výrobku.

ABSTRACT Probiotics and their positive influence on human health are presently very discussed theme. Nevertheless is informedness of public about probiotics benign influence insufficient, as well as their practical usage. This thesis summarizes present scientific knowledge about probiotic effects on human organismus. Fisrt chapter deals with determination of concept probiotics, their history, meaning, qualities, effects on human health and hazard connected with probiotic usage. Second chapter includes description of probiotic products, their forms and foodstuff containing probiotics. Chapter three discuss probiotic microorganisms, their main characteristics and examples of commercial starting cultures. Fourth chapter takes in informations about viability of probiotic microorganisms. And last chapter researches methods of integration of probiotics into products.

KLÍýOVÁ SLOVA probiotika, probiotické produkty, probiotické mikroorganismy

KEYWORDS probiotics, probiotic products, probiotic microorganisms

1

KOSTKOVÁ, L. Probiotika a probiotické mikroorganismy. Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, fakulta chemická, 2011. 39 s. Vedoucí bakaláĜské práce Ing. Libor Babák, Ph.D.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakaláĜskou práci vypracovala samostatnČ a že všechny použité literární zdroje jsem správnČ a úplnČ citovala. BakaláĜská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v BrnČ a mĤže být využita ke komerþním úþelĤm jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a dČkana FCH VUT. ................................................ podpis studenta

2

OBSAH ÚVOD………………………………………………………………………………………….......4 1. Probiotika……………………………………………………………………………………5 1.1 Historie probiotik……...…....…………………………….....……………………5 1.2 Definice probiotik….………………………………………………………………6 1.3 Význam probiotik…………………………………………………………………7 1.4 Vlastnosti a podmínky pĤsobení probiotik…………………………..……...…9 1.5 Úþinky probiotik na lidské zdraví………………………………………...……10 1.5.1 Imunitní systém…………………………………………………………10 1.5.2 Infekce vyvolaná Helicobacter pylori……....…...……………………13 1.5.3 Idiopatické stĜevní zánČty………………………………………….….14 1.5.4 PrĤjmová onemocnČní………………………...………………………16 1.5.5 Prevence nádorových onemocnČní………………………...………..16 1.5.6 Akutní pankreatitida…………..………...……………………….…….18 1.5.7 OnemocnČní jater……………………………………………...………18 1.5.8 Hladina cholesterolu v krvi….…………………………….…………..18 1.6 Rizika spojená s podáváním probiotik……...………..……………...……….20 2. Probiotické produkty……………………………………………………………………..21 2.1 Formy probiotik na trhu ………….…………………………………....……….21 2.2 Potraviny obsahující probiotika….………………………………….…………21 2.2.1 Kysané mléþné výrobky a nápoje……………………………….……21 2.2.2 Sýry………………………………………...……………………..……..23 2.2.3 Tvrdé salámy…………………..………...……………………………..24 2.2.4 Zmrzlina a mražené dezerty………...…...……………………..…….25 2.2.5 Probiotika - doplĖky stravy………..………...…………………..…….25 3. Probiotické mikroorganismy………………………..…………………….…………….26 3.1 Hlavní charakteristiky…………………………….....…………………...…….26 3.2. PĜíklady komerþních smČsí startovacích kultur……….........……………....26 4. Životaschopnost probiotických mikroorganismĤ….…….……...……………...…..29 4.1 Vlastnosti fermentaþních médií …………..………….……....………………29 4.2 Vliv kyslíku na životaschopnost bunČk……..….………………….…………30 5. Metody zaþlenČní probiotik do výrobku……….….....………………..….....………..31 5.1 VýbČr bakteriální kultury………….....……………………………..………….31 5.2 Typy obalĤ………………………………………………………………...……..31 5.3 Velikost inokula………………………………………………………………….31 5.4 DvoustupĖová fermentace………………………………….…………………32 5.5 Technika mikroenkapsulace…....………………………………..…………….32 5.6 DoplnČní mléka živinami….…….......…………………………...……………32 5.7 Použití antioxidantĤ…….…………....…………………….…………………..33 5.8 PĜídavek cysteinu…………..………..………………...………………………33 5.9 Rozlišení živých a neživých bunČk a stanovení jejich poþtu ….....…..……34 VÝSLEDKY A DISKUZE……….……………………………………………………….….35 ZÁVċR………………………………….……………………………………………….…...36 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJģ……….……………………….……….……………….37

3

ÚVOD Probiotické potraviny, vþetnČ mléþných výrobkĤ, hrají významnou roli v lidské výživČ. DĜíve byly definovány jako „potraviny obsahující živé mikroorganismy, které aktivnČ zlepšují zdraví a udržují v rovnováze mikroflóru stĜeva“. V souþasné dobČ jsou vymezeny jako „produkty, které obsahují mikrobiální buĖky, nebo jejich þásti, a mají blahodárný vliv na zdraví hostitele“. PĜi výrobČ se osvČdþily zejména bakterie rodu Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus. V dnešní dobČ se výraznČ zvýšil poþet mikrobiálních druhĤ, které jsou obsaženy v probiotických mléþných produktech (napĜ. pasterované mléko, zmrzlina, kysané mléko, sýry). Potraviny jsou hlavním zdrojem pĜíjmu probiotik a mezi fermentovanými mléþnými produkty zĤstává nejvýznamnČjším výrobkem jogurt. CelosvČtovČ je prodáváno více než 100 rĤzných probiotických výrobkĤ a spotĜeba potravin obsahujících Lactobacillus acidophilus a bifidobakterie je pozornČ sledována. K zajištČní zlepšení zdraví je podstatné, aby potraviny vyhovovaly nárokĤm minimální koncentrace probiotik 106 cfu ml-1 nebo g-1 i na konci doby spotĜeby. Na životnost probiotických kultur ve fermentovaném mléce pĤsobí Ĝada faktorĤ, zejména pak výsledná kyselost produktu, dostupnost živin, rozpustnost a možnost permeace kyslíku pĜes obal výrobku. Stabilita probiotických kultur ve výrobcích je dĤležitým problémem, na který je zamČĜena hlavní pozornost.

4

1

PROBIOTIKA

V ýeské republice je používání probiotik vymezeno Vyhláškou þ. 446/2004 Sb.1, která stanovuje požadavky na doplĖky stravy a na obohacování potravin potravními doplĖky. Množství a druh mikroorganismĤ obsažených v mléþných výrobcích vymezuje Vyhláška þ. 77/2003 Sb.2

1.1

Historie probiotik

O pozitivním pĤsobení zakysaných mléþných výrobkĤ píše už Bible, resp. její Starý zákon v knize Genesis 18.8, kdy je dlouhovČkost Abraháma pĜisuzována vlivu kyselého mléka a výrobkĤ z nČho. Je nutné si uvČdomit, že úvaha o pozitivním pĤsobení stĜevní mikroflóry na lidské zdraví mohla následovat až poté, co byla poznána existence mikroorganismĤ a jejich úloha v patogenezi rĤzných chorob a dČjĤ (napĜíklad kysnutí vína apod.). PĜestože je za „otce“ mikrobiologie považován Antonie van Leeuwenhoek (1632–1723), který poprvé pod mikroskopem vidČl bakterie, rozvoj mikrobiologie nastal až mnohem pozdČji, v 19. a 20. století. Za skuteþného zakladatele bakteriologie a mikrobiologie jsou považováni Louis Pasteur a Robert Koch. Robert Koch (1843–1910) nalezl pĤvodce antraxu, cholery a tuberkulózy. Louis Pasteur (1822–1895) vyvrátil teorii abiogeneze, a za pĤvodce kysání potravin, ale i nČkterých nemocí oznaþil mikroorganismy. Na základČ výzkumĤ tČchto dvou prĤkopníkĤ bakteriologie postavil pozdČji Joseph Lister (1827–1912) teorii asepse, antisepse a aseptické operace. Louis Pasteur zjistil pĜíþinu kvašení, dále inicioval a konkrétnČ rozvinul tvorbu a aplikaci vakcín (napĜíklad proti vzteklinČ). V roce 1887 byl založen PasteurĤv institut, který se stal na konci 19. a na zaþátku 20. století nejdĤležitČjším místem, kde se koncentrovali odborníci oboru mikrobiologie. Pracovali zde mimo jiné napĜíklad Emile Roux, Alexandre Yersin, Albert Calmette, Camille Guérin, ale také Ilja Iljiþ Meþnikov a další. Od roku 1908 získali vČdci Pasteurova institutu celkem osm Nobelových cen. Ilja Iljiþ Meþnikov (1845–1916) na podkladČ svých výzkumĤ zjistil, že BulhaĜi a obyvatelé ruských stepí žijící déle konzumují jogurt a zakysané mléþné výrobky. Vyslovil teorii autointoxikace bakteriemi ze stĜeva, které je tĜeba utlumit podáním jiných bakterií (bakterií mléþného kvašení). Za tyto práce získal v roce 1908 Nobelovu cenu. Jeho „bulharský bacil“ byl pozdČji urþen jako Lactobacillus delbrueckii, ssp. bulgaricus. V roce 1920 dokázal L. F. Rettger, že tato bakterie neosidluje lidské stĜevo a þásteþnČ tím Meþnikovovy teorie oslabil. V PasteurovČ institutu byla pozdČji popsána bakterie vyskytující se ve stĜevČ u kojených dČtí, kterou Henry Tissier oznaþil jako Bacillus bifidus communis, pozdČji byla pĜejmenována na bifidobacterium a byl dokázán vliv na prevenci prĤjmĤ u dČtských pacientĤ. Je nutné uvČdomit si, že teorie probiózy, tedy ovlivnČní – potlaþení – mikroba jiným mikrobem souvisela s pomČrnČ nízkou úþinností antimikrobiálních postupĤ þi látek, které byly do praxe zavedeny mnohem pozdČji (Alexander Flemming získal v roce1928 Nobelovu cenu za objev antibakteriálního úþinku plísnČ Penicillium notatum). Tato teorie byla na konci 19. století tak silná, že na disertaþní práci Ernesta Duchesnea „Užití Penicillium glaucum v léþbČ infekce“ nebyl v roce 1897 brán zĜetel. Termín probiotikum byl do praxe zaveden mnohem pozdČji, v roce 1953 ho poprvé použil Kollath jako opak antibiotika. Probiotikum bylo tehdy definováno jako faktor pocházející z mikrobĤ, který stimuluje rĤst jiných bakterií. Dnešní definice probiotika pochází z roku 1989, kdy Roy Fuller definoval 5

probiotikum jako živý mikrobiální potravinový doplnČk, který pozitivnČ ovlivĖuje hostitele zlepšením jeho stĜevní mikrobiální bilance. 3

1.2

Definice probiotik

Definice probiotik se stále vyvíjí. V souþasné dobČ jsou probiotika definována jako živé mikroorganizmy, které mají pĜíznivý úþinek na mikroflóru þlovČka þi zvíĜete (Ĝíkáme, že mají probiotické vlastnosti). Tento pĜíznivý úþinek probiotik je podmínČn požitím dostateþného množství živých bakterií. Prvními probiotickými výrobky v EvropČ byly kysané mléþné výrobky, nyní jsou však v této skupinČ zahrnuty i další druhy potravin, napĜ. další mléþné produkty, masné výrobky, nápoje a kvašené výrobky obecnČ. Bylo navrženo pĜes dvacet kritérií, která by mČla charakterizovat kmeny mikroorganizmĤ s probiotickými vlastnostmi. 4 Zde jsou nejdĤležitČjší z nich: musí být zdravotnČ nezávadné (napĜ. lidského pĤvodu) nesmí být patogenní musí být natolik rezistentní, aby se „nepoškodily“ v prĤbČhu technologického zpracování a nemČly by ovlivĖovat organoleptické vlastnosti probiotické potraviny neniþí se v kyselém prostĜedí a v pĜítomnosti žluþi (nesmí být bČhem prĤchodu zažívacím traktem zniþeny nebo oslabeny) neniþí se bČhem výrobního procesu a zĤstávají životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny pĜichycují se na epiteliální buĖky ve stĜevech a jsou schopny dalšího rĤstu je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav Všechny známé bakterie s probiotickým úþinkem patĜí do skupiny bakterií mléþného kvašení, která zahrnuje druhy Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Bifidobacterium a Enterococcus. Z vyjmenovaných mikroorganizmĤ jsou jako probiotika, která lze pĜidávat do potravin, komerþnČ dostupné pouze nČkteré kmeny Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus, lze však využívat i další druhy napĜ. Lactococcus, Pediococcus aj. Probiotické organizmy se musí do stĜev (pĜedevším do tlustého stĜeva) dostat pĜi každém požití v dostateþném množství (jako minimální množství se udává 108/ ml), aby byly schopny významnČ ovlivnit složení stĜevní mikroflóry. Další dČlení mikroorganismĤ považované za probiotické je následovné ( podle bezpeþnosti užití jednotlivých druhĤ v rámci jednoho kmene ) : 1. Bakterie mléþného kvašení, které patĜí do skupiny grampozitivních bakterií. ěadí se sem bakteriální druhy, které jsou obecnČ považovány za bezpeþné a jejich aplikace nepĜináší pro þlovČka žádné nebezpeþí. Do této skupiny patĜí bakterie rodu Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus a Streptococcus. 2. Probiotické mikroorganizmy, které pĜedstavují nepatogenní izoláty. ěadí se sem mikrobiální rody, které zahrnují i potenciálnČ patogenní kmeny. Do této skupiny patĜí Escherichia coli, Clostridium butyricum nebo kvasinka Saccharomyces boulardii.5

6

Obrázek þ. 1: Saccharomyces bourlardii6

1.3

Význam probiotik

V poslední dobČ stále více roste zájem o potravináĜské výrobky a lékárenské produkty, které obsahují probiotika. Pravidelná konzumace napĜ. probiotických mléþných výrobkĤ pomáhá zlepšovat zažívací potíže a zažívání celkovČ reguluje. PrávČ pozitivní vliv probiotik na stĜevní mikroflóru má velký význam pĜi udržení celkového zdraví þlovČka. Náš organismus je v souþasnosti stále více zatČžován nepĜíznivými vlivy okolního prostĜedí. Zdá se, že probiotika, resp. mléþné výrobky obsahující probiotickou kulturu, mohou organismu pomoci se s tČmito vlivy vypoĜádat. Probiotika jsou proto pĜedmČtem souþasného zájmu Ĝady studií. V lidské spoleþnosti stále pĜibývá alergických onemocnČní i celkových poruch imunity. A právČ v této oblasti mohou mít probiotika svĤj zvláštní význam. 7 „StĜevní mikroflóra v lidském tČle je mnohem dĤležitČjší, než se lidé i lékaĜi domnívají. V budoucnu je pravdČpodobné, že se podaĜí ovlivnČním stĜevní mikroflóry probiotiky nahradit v mnohých pĜípadech léþbu chemickými látkami,“ Ĝíká o roli probiotik doc. MUDr. Pavel Kohout, Ph.D. z 2. interní kliniky Fakultní Thomayerovy nemocnice v Praze. Probiotika jsou jedno þi víceþetnou kulturou mikroorganismĤ, jež pĜi osídlení trávicího traktu mĤže pĜíznivČ ovlivĖovat zdravotní stav þlovČka. NČkteré úþinky probiotik se mohou uplatnit již pĜi krátkodobČjším podávání. Lidské tČlo mĤže díky nim lépe využít vitamíny, vápník nebo laktózu, které pĜijímá v mléce. Probiotika také pomáhají snížit riziko infekce trávicího traktu a mohou pĜíznivČ ovlivĖovat i celkový imunitní systém organismu. 7

Aby mohl být výrobek oznaþen jako probiotický, musí obsahovat dostatek specifických živých probiotických mikroorganismĤ, které až do konce doby trvanlivosti tohoto výrobku prospČšnČ pĤsobí na zdraví þlovČka. Probiotika prospívají svému hostiteli prostĜednictvím rĤzných mechanismĤ svého pĤsobení, které jsou v souþasné dobČ studovány. Pomáhají tlumit rĤst patogenních bakterií, neutralizují toxické látky a pĜispívají do urþité míry k pĜirozeným obranným mechanismĤm lidského tČla. ÚþinnČ také pĜispívají k procesu trávení tím, že þiní nČkteré složky potravy snáze stravitelnými. NapĜíklad betagalaktosidáza, která je produkována nČkterými probiotiky, usnadĖuje trávení laktózy. NČkterá probiotika rovnČž stimulují aktivitu nČkterých enzymĤ bunČk epitelu tenkého stĜeva, jako jsou napĜíklad laktázy, invertázy nebo maltázy. Použití probiotik ve výživČ otevírá další perspektivní oblast podpory zdraví lidské populace, vyžaduje si však peþlivý výbČr nejúþinnČjších bakteriálních kmenĤ. K získání znalostí o úþincích tČchto potenciálních probiotik na lidský organismus a tím zajištČní optimálního využití specifických vlastností každého jejich kmene jsou nutné studie in vitro a in vivo. 8

-

-

-

-

-

ObecnČ prospČšné úþinky: Pomoc pĜi metabolismu bílkovin a vitaminĤ – napĜ. díky enzymu fosfatáza, zlepšují vstĜebávání bílkovin z mateĜského mléka, také nČkteré kmeny bifidobakterií produkují vitaminy, jako napĜíklad vitamin B1, vitamin B2, vitamin B12, vitamin C, vitamin PP a kyselinu listovou. Tvorba tČchto vitaminĤ mĤže zlepšit nutriþní vlastnosti fermentovaných mléþných výrobkĤ. Antibakteriální aktivita – prokázal se antibakteriální úþinek proti nČkterým organismĤm, mezi které patĜí E. Coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Candida albicans. Tento antibakteriální úþinek je þásteþnČ zpĤsoben tvorbou organických kyselin (mléþné a octové kyseliny) a þásteþnČ výsledkem pĤsobení bakteriocinĤ (antibiotik produkovaných bakteriemi) a peroxidĤ. Kyselina mléþná a octová snižují pH stĜevního obsahu a tím bojují proti rĤstu mikroorganismĤ. Stimulace imunity - Stimulace bunČþné imunity byla již do znaþné míry prokázána in vitro, ovšem pozitivní výsledky zaznamenané in vivo nejsou zatím ještČ dostateþnČ poþetné na to, aby byly zcela pĜesvČdþivé. Celá Ĝada studií in vivo provedených u zvíĜat a u lidí však naznaþuje, že požívání bifidobakterií zlepšuje nespecifické obranné mechanismy proti infekci. Snížení rizika rakoviny tlustého stĜeva - Mnoho studií se v nedávných letech zamČĜilo na možnou úlohu probiotik pĜi prevenci rakoviny tlustého stĜeva. NČkteré z nich prokázaly snížení rychlosti rĤstu urþitých experimentálních pĜípadĤ rakoviny u zvíĜat. PĜi podání lidem prokázaly schopnost blokovat aktivitu nČkterých enzymĤ, které napomáhají pĜi pĜemČnČ prokarcinogenĤ na karcinogeny, jako jsou nitrosaminy a sekundární aminy. Mechanismus pĤsobení probiotik a jejich dlouhodobé úþinky v této oblasti nebyly ještČ plnČ vyjasnČny – jsou pĜedmČtem þetných studií. PĤsobení na stĜevní pasáž - produkování organických kyselin a snížení pH stĜevního obsahu pĜispívá, kromČ jiného, ke zrychlení stĜevní pasáže. Existuje souvislost mezi zrychlením peristaltiky tlustého stĜeva a zvýšeným poþtem bifidobakterií pĜítomných ve stolici.

Zdá se, že probiotika, a obzvláštČ nČkteré bifidobakterie, hrají významnou roli ve stĜevním ekosystému; avšak ne všechna probiotika mají stejnou úþinnost. Jejich úþinnost závisí na výbČru vhodného kmene bifidobakterií, pĜiþemž každý kmen má specifické úþinky. 9

8

1.4

Vlastnosti a podmínky pĤsobení probiotik

Probiotické bakterie pĜijaté potravou nebo doplĖky stravy nekolonizují lidské stĜevo natrvalo. Aby alespoĖ po dobu, kdy jsou v tČle po jejich pĜíjmu obsaženy, mČly svĤj efekt, je nutné, aby splĖovaly Ĝadu dĤležitých podmínek. Jednou z podmínek fungování probiotických kultur jako zdraví protektivních bakterií je jejich dostateþná koncentrace v daném výrobku. Ta je podle platných norem stanovena na hodnotu vyšší nebo rovnu 106 KTJ/g v tenkém stĜevČ a 108 KTJ/g ve stĜevČ tlustém, jako optimální množství v potravinách a výrobcích se ale uvádí 1010 KTJ/g. Tyto hodnoty se uvádí i pĜesto, že se jedná jen o odhady, protože ani nelze pĜesnČ stanovit pĜesný poþet bakterií, které GIT projdou a do cílových orgánĤ se dostanou. Uvedených hodnot musí výrobek, pokud má být oznaþovaný jako „probiotický“ nebo „s obsahem probiotik“, dosahovat i v den konþící trvanlivosti. PĜi výraznČ nižším poþtu by bakterie nemČly ve stĜevČ požadovaný úþinek. Dalším požadavkem a vlastností probiotik je jejich odolnost vĤþi žaludeþním kyselinám ( pH 1-2, obsahují sekrety obsahující prekursory proteolytických enzymĤ a HCl ), žluþovým kyselinám (lehce alkalické) a pankreatickým šĢávám ( výraznČ alkalické, pH 7,1-8,3 ). Tím, že jsou vĤþi tČmto podmínkám odolné, dorazí do tlustého stĜeva nepoškozené a kolonizují snadnČji stĜevní sliznici, þímž zamezují pĜítomnosti a adhezi enteropatogenních a enterotoxigenních bakterií. Mezi ty Ĝadíme napĜíklad druhy Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis, Clostridium perfringens a další. Tyto druhy mohou pĜi vyšším výskytu zpĤsobovat infekce, prĤjmová onemocnČní, bolesti bĜicha, bolesti hlavy, teploty a další zdravotní potíže.

Obrázek þ. 2: Yersinia pseudotuberculosis10 Další podmínkou je odolnost vĤþi výrobnímu procesu potraviny a také to, že musí bakterie zĤstat životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny. 11 9

Shrnutí charakteristických vlastností: jsou lidského pĤvodu nejsou patogenní neniþí se v kyselém prostĜedí a v pĜítomnosti žluþi neniþí se bČhem výrobního procesu a zĤstávají životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav

1.5

Úþinky probiotik na lidské zdraví

Normální a zdraví prospČšné funkce mĤže zajišĢovat pouze vyvážená mikroflóra, která obsahuje dostateþné množství probiotických kultur. Její složení se bČhem života mČní, liší se v jednotlivých þástech GIT a závisí na dalších faktorech, jako je farmakoterapie, životní styl, výživa, psychický stav a další. PĜesto se dají vČdecky prokázané pĜíznivé úþinky probiotik na lidské zdraví shrnout do nČkolika bodĤ. V dĤsledku životního stylu zahrnujícího pohybovou aktivitu, stravování, farmakologickou terapii, expozici toxickým látkám a další faktory, dochází neustále k obmČnČ složení GIT mikroflóry. Probiotika se v tomto smČru podílejí na kompenzaci tČchto výkyvĤ, uvádí mikroflóru trávicího traktu do fyziologické rovnováhy nebo ve prospČch nepatogenních mikroorganismĤ. Pozitivní vliv probiotik se také uvádí v souvislosti s následujícími onemocnČními, poruchami a schopnostmi: imunomodulaþní úþinky, léþba idiopatických stĜevních zánČtĤ, infekce žaludku zpĤsobená Helicobacter pylori, prĤjmová onemocnČní, akutní pankreatitida. Probiotika se jeví jako vhodná terapie po léþbČ antibiotiky. Lidské stĜevo je po jejich léþbČ velmi oslabeno a mikroflóra výraznČ redukována. PĜedpokládá se i posilující úþinek po léþbČ imunosupresivy a cytostatiky. V obou pĜípadech je typický þastý výskyt prĤjmĤ. Probiotika aplikovaná po tČchto terapiích mohou pomoci obnovit zdravý pomČr mikrobiálních kmenĤ, potlaþit patogenní mikroflóru a redukovat frekvenci stolic. Je prokázáno, že jsou probiotika schopna zlepšit stav pacientĤ, kteĜí trpí alergiemi, þasto se v této souvislosti uvádí atopický ekzém, laktózová intolerance, astmatická rýma a další. Uvažuje se i o možném vlivu probiotických bakterií na vstĜebávání minerálĤ, zejména pak vápníku. V této souvislosti pak i o prevenci osteoporózy u postmenopauzálních žen. Bakterie stĜevní mikroflóry, jíž jsou probiotika souþástí produkují vitaminy Ĝady B a vitamin K. ProbiotikĤm jsou pĜisuzovány další pĜíznivé funkce a vlivy na lidský organismus a jeho onemocnČní. Ne všechny tyto vlivy však byly dostateþnČ zkoumány, aby pĜinesly ovČĜené a klinicky významné výsledky. Mluví se o pĤsobení probiotik na snižování hladiny cholesterolu, pozitivního vlivu na náladu a poznávací schopnosti, potenciální roli v terapii hypertenze, pĜi léþbČ jaterních onemocnČní a jako o prevenci pĜi peritonitidách. 12 1.5.1 Imunitní systém V odborné literatuĜe je pĜedevším sledován vliv probiotik na imunitní systém þlovČka. DĤvod je jasný, protože právČ imunitní systém je alfou a omegou všech onemocnČní, poruch a zdravotních potíží v lidském organismu. Pokud tedy mají probiotika pozitivní vliv na imunitní systém, je logické, že ovlivĖují jednotlivé buĖky, tkánČ, orgány a soustavy. Imunitní systém je souhrn mechanismĤ zajištujících integritu organismu rozeznáváním a likvidací cizích þi vlastních, ale potenciálnČ škodlivých struktur. Vlastní pojem imunita je tedy definován jako schopnost organismu bránit se škodlivému vlivu infekþních þinitelĤ a tím udržovat integritu tČla. 10

Imunitní systém je tvoĜen souborem bunČk, molekul a humorálních makromolekul, které jsou schopné vzájemnČ komunikovat pĜi rozlišování pozmČnČných nebo cizích bunČk þi tkání a odstraĖovat je. Rozlišujeme dva typy imunitních mechanismĤ, a to specifické imunitní mechanismy (uplatĖují se okamžitČ po pĤsobení cizorodých látek nezávisle na pĜedchozím setkání s nimi) a nespecifické imunitní mechanismy (vyvíjejí se teprve po setkání s danou látkou, pĤsobí až po urþité dobČ a jsou zamČĜeny jen proti látce, která je vyvolala). 13

Obrázek þ. 3: Lidský T- lymfocyt14



Probiotické bakterie mají prokázaný vliv na imunitní systém þlovČka v mnoha smČrech, daly by se shrnout takto:  stimulace mechanismĤ pĜirozené imunity, tvorby sekreþního IgA a místní imunitní reakce, orální tolerance na potravinové antigeny, rezistence na spontánní nádory, udržování fyziologické rovnováhy mezi Th1- a Th2- lymfocyty  snížení neregulovaného (poškozujícího) zánČtu v lidském tČle  normalizace dysfunkce stĜevní sliznice Výsledky nČkterých studií prokázaly, že probiotické kultury mají schopnost udržovat pomČr Th1 a Th2 lymfocytĤ, tedy i regulovat pĜípadné nadmČrné zastoupení Th2, který je mediátorem alergických reakcí. Další neopomenutelnou podstatou prospČšné funkce probiotické stĜevní mikroflóry je její bezprostĜední kontakt s místním imunitním systémem, který tvoĜí lymfoidní tkáĖ sdruženou se stĜevem – GALT. StĜevní mikroflóra, a tím spíše probiotické kultury, jsou neodluþitelnČ spojeny s GALT a stĜevním epitelem a vzájemné se neustále ovlivĖují. Pokud dojde 11

k narušení jedné z tČchto složek, mĤže být dĤsledkem nerovnováha, snazší napadení organismu patogeny nebo podmínČnými patogeny a nedostateþná imunologická tolerance k potravinovým alergenĤm. Porucha právČ této tolerance mĤže vést k pĜecitlivČlosti projevující se alergickými chorobami, jako jsou potravinové alergie, atopický ekzém, alergická rýma, prĤduškové astma a další. NejþastČjšími pĜíþinami narušení zmínČných tĜí složek jsou patogenní mikroorganismy, toxiny, antibiotika, cytostatická a imunosupresivní léþba a stresové situace. Hlavní funkce GALT spoþívá v tom, že produkuje sekreþní protilátky, které jsou schopny neutralizovat toxiny a viry, brání adhezi bakterií na sliznice a tím brání vzniku a rozvoji infekþního procesu. Podle dalších výzkumĤ zpĤsobují probiotika také aktivaci makrofágĤ a zvyšují tak hladinu imunoglobinu IgG2. Tím zvyšují i odolnost proti veškerým infekcím, zejména pak proti tČm, které zpĤsobují zažívací potíže. Z epidemiologických údajĤ je zĜetelné, že v lidské populaci výraznČ pĜibývá onemocnČní, které mají charakteristiky alergií zprostĜedkovaných protilátkami IgE. PĜibývá ale i orgánovČ zamČĜených imunopatologií, mezi které Ĝadíme napĜíklad diabetes mellitus I. typu. Aþ nČkteĜí vČdci považují význam probiotik za pĜecenČný, mohlo by podávání probiotických mikroorganizmĤ pozitivnČ ovlivnit nežádoucí trend vzrĤstajícího poþtu imunopatologických nemocí v populaci. 15 Atopický ekzém - ovlivnČní prĤbČhu a léþby atopických ekzémĤ je dalším z vlivĤ, které se v souvislosti s probiotiky dlouhodobČ zkoumají. PĜedmČtem tČchto výzkumĤ je jejich vliv na redukci symptomĤ a léþba atopického ekzému a citlivost na potravinové alergeny, zejména na kravské mléko. PĜedpokládaným mechanismem úþinku je ovlivnČní prostupnosti stĜevní stČny pro alergeny, zmírnČní lokálních imunitních odpovČdí organismu na alergeny, redukce fekálnČ-orálních infekcí a ovlivnČní složení stĜevní mikroflóry. Pacienti s atopickým ekzémem mají v trávicím traktu ménČ gram-pozitivních aerobních kmenĤ a celkovČ je jejich mikroflóra hodnocena jako chudší. I mikroflóra u zdravých novorozencĤ a batolat se liší od té u dČtí s atopickým ekzémem. Je prokázáno, že probiotika mají na vyvážení a regulaci mikroflóry GIT pozitivní vliv. U lidí trpících tímto onemocnČním je typický zvýšený poþet bakterií kmenu Bakteroides a naopak snížený poþet bifidobakterií. PrávČ podávání bifidobakterií vede ke snížení patogenní Escherichia coli a Bacteroides sp., což by mohlo vést ke snížení alergické reakce. Velká þást studií testovala pozitivní vliv probiotik na atopický ekzém u dČtí. StejnČ jako u jiných onemocnČní, i v tomto pĜípadČ existují studie, které pozitivní vliv probiotik na prevenci, prĤbČh nebo léþbu atopického ekzému potvrzují, tak i studie, jejichž výsledky nejsou jednoznaþné, pĜíznivé úþinky pĜímo nepotvrzují nebo je dokonce vyvracejí. Studie s použitím Lactobacillus fermentum na dČtech od pĤl do 1,5 roku vČku, kdy byla probiotika podávána dvakrát dennČ po dobu 4 mČsícĤ, prokázala zlepšení stĜednČ tČžké a tČžké dermatitidy u tČchto dČtí. Jiná studie sledovala úþinky u dČtí ve vČku 1-13 let prokázala zvýšenou hladinu IgE, ústup rozsahu ekzému, trávicích potíží, zlepšení bariérové funkce a snížení eozinofiního kationického proteinu, který bývá u ekzémĤ zvýšený. Studie K. Laitinena a kol. sledovala dČti, které mČly alergie v rodinné anamnéze. VČdci zjistili, že perinatální podávání probiotik v kombinaci s látkami jako jsou retinol, vápník a zinek, je bezpeþné a snižuje riziko výskytu atopického ekzému. Výzkum E. Isolauriho aj., který byl provádČn na 27 dČtech po dobu dvou mČsícĤ prokázal na skupinČ léþené probiotiky zlepšení stavu atopického ekzému oproti skupinČ dostávající placebo. Pozitivní úþinky byly prokázány jak u skupiny dČtí suplementovaných Lacobacillus rhamnosus, tak Bifidobacterium lactis. I další studie potvrzují pĜíznivý efekt bakterií Lactobacillus rhamnosus a Bifidobacterium lactis Bb-12 na léþbu atopického ekzému. Prokázala se také poloviþní incidence atopického ekzému u matek, kterým byly v prĤbČhu tČhotenství podávány formuly s tČmito kmeny. 12

Na stranČ druhé vČdecký tým pod vedením M. Viljanena v Helsinkách provedl výzkum na 230 dČtech a pĜinesl výsledky, které klinicky významnou úlohu probiotik na atopický ekzém nepotvrzují, aþkoli je pĜedpokládal. Prokázal se pouze efekt Lactobacillus rhamnosus na jeden typ atopického ekzému, skupina dČtí suplementovaných smČsí probiotických kmenĤ ale žádné prĤkazné výsledky nepĜinesla. I pozitivní výsledek Lactobacillus rhamnosus byl pozorován až 4 týdny po skonþení studie, ne ihned, tak jak se oþekávalo. Na základČ tČchto výsledkĤ vČdci pĜedpokládají, že lepší efekt by mohla mít smČs hned nČkolika kmenĤ laktobacilĤ. 16 Laktózová intolerance - mléþné výrobky obsahující probiotika je vhodné podávat u pacientĤ trpících laktózovou intolerancí, protože rozkládají z mléþného cukru laktózu pomocí ȕ galaktosidázy a mléþné výrobky tak mají snížený obsah laktózy na 20 % až 40 % pĤvodního množství. Vhodnou indikací preparátĤ s probiotiky se dá dosáhnout jak snížení klinických pĜíznakĤ laktózové intolerance, tak zvýšení tolerance mléþných výrobkĤ. Objevují se také práce, které využívají této vlastnosti laktobacilĤ pĜi pĜípravČ nízkolaktózových nebo bezlaktózových výrobkĤ. 17 1.5.2

Infekce vyvolaná Helicobacter pylori

Podle výsledkĤ odborných studií probiotika ovlivĖují rĤst a výskyt bakterie Helicobacter pylori v lidském GIT. PĜisuzuje se jim hned nČkolik mechanizmĤ úþinku. Tím nejjednodušším a nejjasnČjším úþinkem proti Helicobarter pylori je obecná vlastnost probiotik, že obsazují vazebná místa na sliznici. V žaludku (stejnČ jako ve stĜevČ) tak dochází ke kompetitivní inhibici, tzn., že Helicobacter pylori už nemá takovou možnost se na sliznici vázat, protože jsou receptory obsazené probiotickými bakteriemi. Probiotika také podporují tvorbu mucinu, alkalického hlenu, který chrání sliznici žaludku pĜed poškozením. Tím brání patogenním bakteriím, tedy i Helicobactru pylori, k jejich adhezi k žaludeþní sliznici. V dĤsledku infekce Helicobacter pylori v žaludku þlovČka dochází k zánČtlivé odezvČ organismu. Ta je typická zvýšenou hladinou zánČtlivých mediátorĤ. Probiotickým kulturám se pĜisuzuje schopnost mČnit imunologickou odezvu organismu, a to tím, že snižují produkci mediátorĤ zánČtu, a také stimulují tvorbu IgA, která má na sliznici žaludku stabilizující úþinek. Prokázalo se, že probiotika posilují antimikrobiální látky v žaludku þlovČka, které zamezují adhezi Helicobacter pylori k žaludeþní sliznici. Dokonce také nČkteré druhy laktobacilĤ samy produkují antimikrobiální substance, které zamezují množení a snižují životaschopnost Helicobactera pylori. Tato schopnost tvorby antimikrobiálních látek byla zjištČna u druhĤ Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei a Lactobacillus lactis. Studie a výzkumy se provádČly s rĤznými druhy probiotických kultur, mezi druhy s nejlepšími výsledky terapii infekce Helicobacter pylori patĜí Lactobacillus acidophillus La5 a Bifidobacterium lactis Bb12. StejnČ jako u ostatních druhĤ, i u tČchto záleží na jejich koncentraci v médiu. Podle jedné ze studií in vitro, byl prokazatelný rozdíl mezi vlivem pĜi obsahu 0,125 ml a 0,25 ml v podávaném médiu. Oborníci zaþali pracovat na studiích, které zkoumají vliv probiotik pĜi léþbČ nálezu Helicobactera pylori antibiotiky. PĜedpokládali, že by probiotika mohla podpoĜit úþinek antibiotik, výsledky studií však nejsou jednoznaþné. TĜi ze sedmi studií prokázaly, že probiotika podporují úþinek antibiotik, zbývající þtyĜi studie tento efekt neprokázaly. VČdci tedy považují za nutné a žádoucí provést další, hlubší a rozsáhlejší výzkumy, které by tuto souvislost potvrdily nebo vyvrátily. 18

13

1.5.3 Idiopatické stĜevní zánČty Etiologie idiopatických stĜevních zánČtĤ je neznámá, možnými pĜíþinami jejich vzniku mohou být zmČny ve složení stĜevní mikroflóry nebo zmČnČná reakce organismu na mikrobiální flóru ve stĜevní sliznici. Idiopatické stĜevní zánČty jsou charakterizovány zánČtlivými zmČnami sliznice a stČny stĜeva, þasto s rodinným výskytem. ěadí se mezi nČ Cronova choroba a ulcerózní kolitida. V etiopatogenezi idiopatických stĜevních zánČtĤ hraje dĤležitou roli rovnováha mezi protizánČtlivými faktory (jako napĜíklad bakterie ve sliznici stĜeva, bakteriální, potravinové antigeny, atd.) a protizánČtlivými faktory (napĜ. slizniþní bariéra, hlen, atd.). Tyto faktory jsou také ovlivĖovány genetickými pĜedpoklady a vlivy zevního prostĜedí a životního stylu. Vzhledem k tomu, že probiotika mohou nČkteré tyto faktory ovlivnit, teoreticky se jejich indikace jeví jako prospČšná. Probiotika mají potenciál být pĜínosné v léþbČ ISZ hned z nČkolika dĤvodĤ. Jednak jsou schopny potlaþit nebo snížit kolonizaci stĜevní sliznice patogenními bakteriemi, dále je také prokázána jejich schopnost redukovat expresi zánČtlivých cytokinĤ. ProbiotikĤm se také pĜisuzuje schopnost zvyšovat proliferaci epiteliálních bunČk stĜeva. Vliv suplementace probiotiky se zkoumala i pĜi léþbČ ISZ antibiotiky. Optimální terapie ISZ vyžaduje odstranČní prozánČtlivých faktorĤ, dominantních mikrobiálních antigenĤ a blokádu odpovČdí slizniþního imunitního systému na tyto podnČty. Z tohoto pohledu terapie antibiotiky a probiotiky pĤsobí komplementárnČ. Antibiotika eliminují agresivní mikrobiální kmeny a lkprobiotika mají pĜíznivý vliv na obnovení porušené rovnováhy jednotlivých složek GIT. Tyto všechny funkce naznaþují, že probiotika mají v léþbČ ISZ své místo. PĜesto existují názory, které tuto jejich funkci zpochybĖují. G.W.Tannock ve svých studiích uvádí, že považuje za nepravdČpodobné, aby probiotické kmeny prokazatelnČ mČnily podmínky ve stĜevČ, když tvoĜí jen asi 1 % z bakteriální masy. Podle nČj i jiných vČdcĤ sice nČkteré studie pĜíznivý vliv pĜi léþbČ ISZ prokazují, nČkteré z nich ale vykazují uspokojivé výsledky jen po krátkou dobu, ne dlouhodobČ, nebo nejsou statisticky významné. V jedné ze studií byla probiotika podávána pacientĤm s idiopatickými stĜevními zánČty ve fázi udržovací terapie. Kontrolní skupina probiotika nedostávala a následnČ byly porovnány délky doby remise u obou skupin. Výsledky jasnČ prokázaly, že by probiotika mohla být jednou z dalších plnohodnotných možností udržovací léþby pacientĤ s idiopatickými stĜevními zánČty. U pacientĤ s Cronovou chorobou byla v kontrolní skupinČ prĤmČrná doba udržení remise 7 mČsícĤ, zatímco u pacientĤ, kde byla podávána probiotika, trvalo udržení remise 14 mČsícĤ. U pacientĤ s ulcerózní kolitidou došlo u tČch, kterým byla probiotika podávána, bČhem následujících 24 mČsícĤ k relapsu pouze u jedné osoby. U pacientĤ, kterým podávána nebyla, udržení remise trvalo prĤmČrnČ 19 mČsícĤ. NČkteĜí autoĜi uvádí, že laktobacily a bifidobakterie ve vČtším množství už bývají indikovány, a to právČ v terapii ulcerozní kolitidy, kdy pacient netoleruje aminosalicyláty. Podle této práce mají produkty probiotické mikroflóry - volné mastné kyseliny s krátkým ĜetČzcem, prokazatelný léþebný efekt u ulcerózní kolitidy. ObecnČ se podle tohoto zdroje terapie probiotiky u idiopatických stĜevních zánČtĤ nedá oznaþit za nevhodnou. KomplexnČ vzato, probiotika by mČla mít svými obecnými vlastnostmi a schopnostmi pĜíznivý vliv na léþbu ISZ a velké množství studií tuto jejich schopnost potvrdila. Na druhé stranČ existují i studie, které jejich jednoznaþné pĜíznivé pĤsobení na ISZ neprokázaly. Otázkou je, zda jde o rozdíly výsledkĤ v dĤsledku použití rĤzných bakteriálních kmenĤ, v dĤvČryhodnosti zdrojĤ, zkoumaných populaþních skupin nebo jiných faktorĤ. Všichni autoĜi a odborníci se však shodují v jednom – tato oblast pĤsobení je, aþkoli se jí v souþasné dobČ

14

vČnuje více pozornosti, stále málo probádaná a definitivní výsledky pĜinesou až další studie a výzkumy. 19 Cronova choroba - zánČtlivé onemocnČní Cronova choroba je spuštČna abnormální aktivací slizniþních T-lymfocytĤ, které pĤsobí proti stĜevním bakteriím. AutoĜi studie o bakterii Lactococcus lactis K. Robinson a L.M. Chamberlain zjistili, že tato bakterie spolu s Lactobacillus casei má pozitivní vliv na zánČtem postiženou tkáĖ a zároveĖ redukuje množství T-lymfocytĤ na slizniþní vrstvČ stĜeva. Jiné zdroje zase tvrdí, že u Cronovy choroby na rozdíl od ulcerózní kolitidy nejsou výsledky terapie probiotiky zcela jednoznaþné. Studie s terapií mesalazinu a Saccharomyces boulardii pĜitom prokázala snížení relapsĤ u sledovaných pacientĤ témČĜ o polovinu. I studie, kde byl podáván samotný kmen Saccharomyces boulardii pĜinesly výsledky, které potvrzují pĜíznivý efekt tohoto kmenu na poþet replapsĤ u nemocných. PĜi podávání Escherichia coli Nissle pacientĤm s Cronovou chorobou bylo prokázáno kromČ snížení relapsĤ také nižší výskyt zažívacích potíží a zlepšení celkového dobrého pocitu pacientĤ. U další studie, ve které se probíhala léþba s podáním Escherichia coli Nissle resp. Lactobacillus rhamnosus ale snížení relapsĤ neprokázala.

Obrázek þ. 4: Escherichia coli Nissle20 Pokud by se shrnuly výsledky zatím dostupných studií, dalo by se Ĝíci, co už bylo výše zmínČno. ProbiotikĤm se nedá v terapii ISZ upĜít jejich blahodárný efekt snižující relaps nemoci, avšak nakolik je toto zlepšení dlouhodobé, trvalé a klinicky významné je stále otázkou. Výsledky studií se v mnoha informacích a výsledcích shodují, ne ovšem ve všech. PotĜeba dalších výzkumĤ k objasnČní vlivu probiotik na léþbu ISZ je tedy nutná a žádoucí. 21 Ulcerózní kolitida - pĜedbČžné zkušenosti jednoho italského týmu odborníkĤ ukázaly efektivitu terapie probiotiky na ulcerózní kolitidu. AutoĜi dlouhodobČ vČnují pozornost skupinČ rĤzných probiotik, které podávají pacientĤm. Jde o smČs pĜipravenou ze kmenĤ laktobacilĤ 15

(L. casei, L. acidophilus, L. plantarum, L. delbrueckii ssp. bulgaricus), 3 kmenĤ bifidobakterií (B. longum, B. breve, B. infantis) a kmene Streptococcus thermophilus. Takto sestavený, vysoce koncentrovaný preparát obsahuje 500 bilionĤ/g živých bakterií. Zatímco byl prokázán pĜíznivý vliv na prĤbČh a délku remise u ulcerózní kolitidy, u Cronovy choroby se tato probiotika neosvČdþila. 22 1.5.4 PrĤjmová onemocnČní Probiotika mají osvČdþený vliv pĜi napadení nebo pĜemnožení zažívacího traktu patogenních bakterií, vþetnČ bakterií Clostridium perfringens a Clostridium difficiale. PrĤjmy jsou jednak zpĤsobeny pĜítomností tohoto patogenu, ale také antibiotické léþby, která bývá v tČchto pĜípadech pĜedepisována. V obou pĜípadech se probiotika, hlavnČ kmeny Saccharomyces boulardi a Lactobacillus rhmanosus, osvČdþily jako vhodná terapie. Probiotické kmeny se také jeví jako potenciální prevence nosokomiálních prĤjmĤ, tj. prĤjmĤ získaných bČhem pobytu v nemocnici nebo jiném zdravotnickém zaĜízení. Studie provádČné na dČtech jednak kmen Lactobacillus rhamnosus, a také smČsí kmenĤ Bifidobacetrium bifidum a Streptococcus termophilus, však klinicky významné zlepšení, které by podnČcovalo k použití probiotik jako rutinní preventivní léþby, se neprokázalo. Existují vČdecké studie, které potvrzují možnost využití probiotik i jako prevenci proti cestovatelskému prĤjmu. NejþastČji studie uvádí pĜíznivý vliv kmenĤ Lactobacillus GG a Lactobacillus acidophilus LA5 a Bifidobacterium lactis Bb-12. Jiné výzkumy vykazují výsledky, které nejsou klinicky významné, avšak celkovČ pĜevažuje poþet studií, které preventivní úþinek probiotik u cestovatelského prĤjmu potvrzují. V souvislosti s rotavirovými prĤjmy bývá nejþastČji pĜedmČtem studií pĤsobení rodu Lactobacillus, a to zejména Lactobacillus rhamnosus a Lactobacillus reuteri, jejichž pĜíznivý vliv je prokázán. Další druhy, jako jsou Lactobacillus casei ssp. rhamnosus a Lactobacillus delbrueckii, jsou teprve ve fázi výzkumĤ. Mechanismem úþinku Lactobacillus rhamnosus je jeho zesílení odpovČdi stĜeva na rotavirus. Dalším jevem souvisejícím s probiotiky, který se podílí na terapeutickém úþinku je stabilizace stĜevní mikroflóry a snížení stĜevní permeability. Podle výsledkĤ studií mají dČti, které užívají probiotika vČtší nadČji, že toto prĤjmové onemocnČní u nich bude trvat kratší dobu než týden. VČtšinou se jedná o zkrácení prĤjmĤ o jeden den. PrĤjmy patĜí rovnČž k jednomu za nejþastČjších nežádoucích úþinkĤ antibiotik. Vyskytují se asi u 20 – 40 % pacientĤ léþených antibiotiky. Pokud jsou probiotické kultury podávány bČhem terapie, dosahuje úþinek probiotik výrazných výsledkĤ. Výskyt prĤjmových onemocnČní klesá až na jednu tĜetinu a v pĜípadČ, že už pacient prĤjmy trpí, snižují probiotika jak jeho délku, tak intenzitu. DĤvodem k použití probiotika pĜi a po terapii antibiotiky vychází z pĜedpokladu, že antibiotická léþba naruší vyváženost stĜevní mikroflóry, v dĤsledku þehož vznikají u pacientĤ prĤjmy. NČkolik studií prokázalo, že souþasná léþba probiotiky tuto posunutou rovnováhu navrací zpČt a pĤsobí tak proti preventivČ proti prĤjmĤm. Tento úþinek byl prokázán jak u dospČlých, tak u dČtí. 23 1.5.5 Prevence nádorových onemocnČní Preventivní úþinek probiotik u vzniku nádorových onemocnČní byl prokázán mnoha studiemi, které pĜímo potvrdily, že probiotika brání vzniku a rĤstu prekancerózních lézí a nádorĤ. Probiotika nebo jimi produkované rozpustné látky mohou podle vČdcĤ pĜímo reagovat s nádorovými buĖkami v kultuĜe a inhibovat jejich rĤst. PĜímé antiproliferativní pĤsobení na nádorové buĖky prokázala mléka fermentovaná kmeny Bifidobacterium infantis, 16

Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus paracasei.

Obrázek þ. 5: Bifidobacterium infantis 24 PrávČ studie, které byly provádČny na zvíĜatech, kterým byla podávána smČs probiotik (Bifidobacterium ssp., Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus) a prebiotik (laktulóza, inulin, FOS) zjistily vČtší efekt obou tČchto složek podávaných dohromady, než když byly podávány a testovány oddČlenČ. VČtšina poznatkĤ a studií ,týkající se protinádorového pĤsobení probiotik souvisí s þinností bakterií, protože nČkteré jejich metabolity mĤžou být karcinogenní nebo genotoxické. Jedním z nejþastČji uvádČným dĤvodem antikarcinogenního pĤsobení probiotik je jejich schopnost tvorby SCFA. Probiotika rozkládají ve stĜevČ zbytky nestrávených sacharidĤ za vzniku mastných kyselin s krátkým ĜetČzcem. Ty potom slouží jednak jako výživa pro kolonocyty, ale také jako substrát pro rĤst stĜevní mikroflóry. Dalším efektem SCFA ve stĜevČ je snížení pH, které dosahuje až hodnoty 4. Nízké pH ve stĜevČ je nepĜíznivé pro rĤst a množení patogenních bakterií osidlujících stĜevo a vede tak k inhibici jejich rĤstu. Dalšími mechanismy pĤsobení probiotik v prevenci karcinogeneze je úprava metabolických aktivit stĜevní mikroflóry, zvyšování imunity hostitele a vazba a degradace potenciálních karcinogenĤ a hlavnČ úprava stĜevní mikroflóry, která je schopná vytváĜet nČkteré karcinogeny a promotory. NČkteré studie prokázaly snížení výskytu karcinomu u žen, které dlouhodobČ konzumovaly jogurty a jiné zakysané mléþné výrobky. Jiné studie zkoumající totéž ale tento efekt nepotvrdily. AĢ už je výsledek jakýkoli, v souvislosti s mléþnými výrobky se hovoĜí o dvou podstatných aspektech karcinogeneze. Jedním z nich je vysoký pĜíjem tuku ve stravČ, jako jeden z hlavních rizikových faktorĤ pro vznik kolorektálního karcinomu. VČdci, kteĜí jsou vĤþi konzumaci jogurtĤ jako preventivní terapii proti karcinogenezi skeptiþtí, uvádČjí, že právČ zvýšená konzumace mléþných výrobkĤ mĤže mít za dĤsledek zvýšený pĜíjem tukĤ a tím 17

i naopak potenciální vyšší riziko vzniku nádorĤ. Druhým aspektem je podíl vápníku na pĜípadné antikarcinogenní aktivitČ mléþných výrobkĤ. Podstatné je, že aþ u rĤzných kmenĤ, podmínek a výzkumných týmĤ nejsou výsledky stejné, jistý antikarcinogenní úþinek byl pozorován. 25 1.5.6 Akutní pankreatitida Akutní pankteratitida je primárnČ neinfekþní zánČtlivé onemocnČní slinivky bĜišní. NejþastČjší komplikací pĜi onemocnČní akutní pankreatitidou je infekce, která mĤže vést v závislosti na svém rozsahu až k úmrtí pacienta. PrávČ podávání probiotik jako prevence infekcí je v poslední dobČ þasto diskutovanou otázkou. Výsledky prvních studií vycházejí pozitivnČ ve prospČch probiotik. Byl pozorován pĜíznivý efekt pĜi podávání Lactobacillus sp. spoleþnČ s enterální výživou. Poškození stĜevního epitelu podle nČkterých studií pĜedchází probiotika tím, že se podílí na rozkladu SCFA na butyrát, který má schopnost zabraĖovat dalšímu poškození epitelu a podporuje jeho reparaci. Léþba ale nebyla oznaþena za úspČšnou kvĤli problematickému dopravení butyrátu do stĜeva. V nČkterých pĜípadech byl podávaný butyrát ve formČ klystýru úspČšný v redukci poškození sliznice stĜeva pĜi ulcerózní kolitidČ. Na druhé stranČ tato terapie nemusí být efektivní, protože butyrátový roztok podávaný ve formČ klystýru také nedokáže úplnČ efektivnČ dosáhnout na tato místa. Studie M. Muftuoglu a kol. na laboratorních krysách, kterým byly podávány probiotika (Streptococcus termophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis) jako souþást enterální výživy ukázala, že v porovnání se skupinou, která byla krmena pouze enterální výživou (bez probiotických kultur), má signifikantní pozitivní vliv na funkci pankreatu. U skupiny krys pĜijímajících probiotika byl potvrzen nižší výskyt fibróz, edémĤ, nekróz a dalších poškození nebo látek jej zpĤsobující. PĜesto ale autoĜi této studie nemohou považovat výsledky za statisticky prĤkazné.26 1.5.7 OnemocnČní jater U pacientĤ trpících jaterní cirhózou bývá v 50 až 70 % pĜípadĤ zaznamenán vysoký obsah gramnegativních mikroorganismĤ v tenkém stĜevČ. To bývá zpĤsobeno dlouhodobým terapeutickým snižováním tvorby kyseliny chlorovodíkové, která by za normálních okolností množení a životaschopnost patogenĤ potlaþovala. Tento nárĤst patogenních mikroorganismĤ a nedostatek probiotických kultur vede k vyšší prostupnosti stĜeva jak pro patogeny, tak pro toxiny a další látky, což zhoršuje stav pacientĤ s jaterní cirhózou a jinými zánČtlivými onemocnČními. Terapie probiotiky v tomto pĜípadČ zamezuje nárĤstu nežádoucí mikroflóry obsahující ureázu a produkující amoniak. Dalším mechanizmem pĤsobení, který zlepšuje stav tČchto pacientĤ je fakt, že probiotika štČpí nevstĜebatelné cukry a tím pĤsobí projímavČ. PrávČ prĤjmy se tČlo zbavuje nejenom mikrobĤ obsahujících ureázu, ale i kmenĤ obsahujících deaminázy, þímž dochází ke snížení obsahu toxických produktĤ ve stĜevČ. 27 1.5.8 Hladina cholesterolu v krvi Vysoká hladina cholesterolu v krvi patĜí k þastému zdravotnímu problému populace na celém svČtČ. V poslední dobČ se v souvislosti s probiotiky þasto hovoĜí o jejich potenciálním vlivu na snižování cholesterolu v krvi, a tím i o jejich preventivním úþinku na aterosklerózu a ischemické choroby. VČdecké názory a poznatky se však v tomto smČru rozcházejí.

18

Obrázek þ.6: Cholesterol28 VČdecké práce, které obhajují úþinek na snížení hladiny cholesterolu v krvi, popisují nČkolik mechanismĤ, jimiž probiotika vyluþují cholesterol z tČla. Prvním z nich je in vitro prokázaná schopnost laktobacilĤ a bifidobakterií asimilovat cholesterol z média, dalším pĜedpokládaným mechanismem je navázání cholesterolu na povrch probiotických bakterií a jejich vylouþení z tČla. NČkteré studie zjistily vztah mezi hladinou cholesterolu a octovou a propionovou kyselinou. Zatímco octová kyselina (resp. acetát) je prekurzorem syntézy cholesterolu, propionová kyselina (resp. propionát) snižuje, jak produkci glukózy, tak koncentraci cholesterolu v krvi. Z tohoto hlediska mají probiotika potenciální schopnost hladinu cholesterolu ovlivĖovat, protože fermentací ve stĜevČ vznikají právČ tyto kyseliny. PĜíznivý vliv na hladinu cholesterolu vykazují výsledky studií, které byly provádČny jak na zvíĜatech, tak na zdravých lidech. Studie potvrdily snížení krevních lipidĤ pĜi suplementaci dobrovolníkĤ výrobky s obsahem Lactobacillus gasseri a také Bifidobacetrium longum. Výzkum na myších, které už trpČly hypercholeterolémií ukázal, že po podání Lactobacillus reuteri se jejich stav celkovČ zlepšil a hladiny cholesterolu i triacylglyceridĤ klesly o 22 % a 33 %. PĜes všechny tyto studie, které úþinnost probiotik na snižování hladiny cholesterolu potvrzují, je mnoho vČdcĤ opaþného názoru. Studie, ve kterých byly dobrovolníkĤm podávány párky s obsahem Lactobacillus paracasei napĜíklad hladinu cholesterolu neovlivnily. StejnČ tak výzkum, ve kterém podávali 55 zdravým jedincĤm probiotické kmeny Lactobacillus acidophillus DDS-1 a Bifidobacterium longum UABL-14 ve formČ kapslí (aby zabránila pĜípadnému zvýšení krevních lipidĤ zvýšeným pĜíjmem mléþných výrobkĤ, které by dobrovolníci konzumovali nad rámec stravy) žádný efekt na hladinu krevních lipidĤ neprokázal. VČdci se zabývali dokonce i tím, zda negativní výsledky nemohli být zpĤsobeny dávkováním v prĤbČhu dne. NepodaĜilo se jim však prokázat snížení hladiny cholesterolu ani pĜi podávání jeden dávky dennČ, ani pĜi prĤbČžném pĜíjmu probiotik. 29 19

1.6

Rizika spojená s podáváním probiotik

Aby mohl být bakteriální kmen považován za probiotický, musí splĖovat mimo jiné podmínky hlavnČ to, že prokazatelnČ nesmí vykazovat patogenitu nebo toxicitu vĤþi lidskému organismu. Proto i jejich rizika jsou velmi nízká a nežádoucí úþinky vzácné. V ojedinČlých pĜípadech pacienti léþení probiotiky uvádČjí vČtší plynatost a stĜevní motilitu. Naprosto výjimeþnČ jsou probiotika spojována se vznikem a výskytem infekþních onemocnČní stĜev. Tyto nežádoucí úþinky jsou však sledovány jen u pacientĤ, kteĜí trpČli závažným onemocnČním, které mČlo za následek znaþné oslabení imunitního systému. V ostatních pĜípadech jsou probiotika dobĜe snášena u všech vČkových skupin, doporuþují se i jako suplementace v tČhotenství. Pokud se v souvislosti s probiotiky vyskytují nČjaké nedostatky nebo rizika, pak jsou to vČtšinou problémy spojené se samotnými výrobky obsahujícími probiotika. K nejþastČjším problémĤm patĜí fakt, že výrobky neobsahují deklarovaný poþet probiotických kmenĤ nebo uvádČné kmeny. To je ale vČcí výrobce, jeho pĜístupu k výrobČ nebo klamavé reklamy. Zdravotní rizika mĤže pĜinést i výrobek, který neodpovídá hygienickým normám, má prošlou dobu expirace, je nevhodnČ skladován atp., avšak ani toto není problém probiotických bakterií, ale výrobku, výrobce nebo uživatele. V roce 2002 vydala pracovní skupina expertĤ FAO/WHO doporuþení, aby byly probiotické kmeny charakterizovány tČmito testy: - urþení rezistence k antibiotikĤm - hodnocení nČkterých metabolických aktivit - hodnocení vedlejších úþinkĤ bČhem klinických zkoušek - test na produkci toxinĤ, pokud kmen patĜí k druhu, u nČhož se produkce toxinĤ (vĤþi savcĤm) vyskytuje - test na hemolytickou aktivitu, pokud kmen patĜí k druhu, u nČhož se tato aktivita vyskytuje - hodnocení absence infektivity u imunokompromitovaných zvíĜat V roce 2003 vydala pracovní skupina expertĤ VČdeckého výboru pro potraviny, VČdeckého výboru pro výživu zvíĜat a VČdeckého výboru pro rostliny návrh obecnČ použitelného pĜístupu k hodnocení bezpeþnosti mikroorganizmĤ používaných v potravinách a krmivech a pĜi výrobČ potravin a krmiv. V rámci Evropské unie pĜes všechna tato doporuþení doposud neexistuje legislativní pĜedpis, který by upravoval uvádČní potravin s cílenČ pĜidanými mikroorganismy na trh. Ve vČtšinČ evropských zemí jsou stanovena pouze obecná tvrzení o potravinách s obsahem probiotických kultur. Skupina expertĤ FAO/WHO doporuþila výrobcĤm, aby na obalech potravin vyznaþila informace o rodu, druhu a kmenu probiotického mikroorganismu, minimální množství živých bunČk k datu expirace a správné podmínky uchování a další informace. Vzhledem k tomu, že tyto údaje nejsou vymahatelné, výrobci se jimi ve vČtšinČ pĜípadĤ neĜídí. 30

20

2

PROBIOTICKÉ PRODUKTY

V obchodní síti celého svČta je k dostání široké spektrum mléþných výrobkĤ. Typickým pĜíkladem je pasterované mléko, zmrzlina, kysané mléko, sýry a dČtská výživa. Celková spotĜeba všech typĤ fermentovaných výrobkĤ neustále stoupá, za což pravdČpodobnČ odpovídají jejich nutriþní a zdravotní vlastnosti.

2.1

Formy probiotik na trhu

Probiotika mĤžeme na trhu najít v rĤzných formách. Z tohoto hlediska mĤžeme rozlišovat probiotika alimentární, farmaceutická a medicínská. Alimentární probiotika Potraviny obsahující probiotické kultury, tedy fermentované mléþné výrobky (kefír, kyška, podmáslí, acidofilní mléko, jogurtové nápoje, jogurty), nČkteré tvarohy, kysané zelí a jinou kysanou zeleninu, tvrdé sýry a šlechtČné tvrdé salámy. Farmaceutická probiotika Probiotika používaná jako potravinové doplĖky ve formČ kapslí, tablet a prášku. Složení tČchto preparátĤ je rĤzné, záleží na výrobci a na tom, komu je výrobek urþen. Tyto výrobky obsahují vČtšinou tĜi až devČt druhĤ probiotických kultur. Jednou z výhod takto podávaných probiotik je nezávislost na manipulaci s výrobkem, jako je tomu u probiotik obsažených v potravinách. Medicínská probiotika NapĜíklad Ĝada Symbioflor, speciální vakcíny a další preparáty indikované lékaĜem. 31

2.2

Potraviny obsahující probiotika

K nejbČžnČjším zdrojĤm probiotik patĜí zejména kysané (fermentované) mléþné výrobky. Mezi potraviny s nezanedbatelným obsahem probiotických kultur ale také Ĝadíme vysokodohĜívané tvrdé sýry, mléþným kysáním konzervovanou zeleninu (kysané zelí, rychlokvašené okurky) a šĢávu z kysaného zelí. Opomíjeným, ale také dĤležitým zdrojem jsou ušlechtilé suché salámy. Naopak ménČ výhodné z hlediska obsahu probiotických kultur jsou termizované dezerty a tavené sýry. PĜi výbČru potravin s probiotickými kulturami je dobré se o potravinČ informovat. Je totiž nutné, aby potravina obsahovala dostateþné množství probiotických kultur. NČkteré potraviny obsahují minimální, zákonem stanovený poþet probiotik, jiné obsahují nČkolikanásobnČ více tČchto mikroorganismĤ. Takové potraviny mívají obvykle kratší dobu trvanlivosti a je potĜeba uchovávat je v chladu. 32 2.2.1 Kysané mléþné výrobky a nápoje Mezi zakysané mléþné výrobky s obsahem bakterií mléþného kvašení Ĝadíme jogurt, jogurtové mléko, acidofilní mléko, kefír, kefírové mléko, kysané mléko nebo smetanový zákys, kysanou nebo zakysanou smetanu, kysaný mléþný výrobek s bifido kulturou a kysané podmáslí. PĜi výrobČ zakysaných mléþných výrobkĤ jsou v souþasnosti þisté mlékaĜské kultury. NejþastČji se z Ĝad probiotik používají a uvádí bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus. 21

V souþasné dobČ patĜí k probiotickým výrobkĤm témČĜ všechny zakysané mléþné výrobky tekuté a jogurtového typu, které obsahují pĜedevším bifidobakterie nebo laktobacily. ýím dál více mlékárenských firem rozšiĜuje svĤj sortiment výrobkĤ právČ o zakysané mléþné nápoje, jako jsou kyška, kefírové mléko apod. Klasickým pĜíkladem kysaného mléþného výrobku je jogurt. Vyrábí se buć jako klasický jogurt, míchaný jogurt nebo jako nápoj. Tyto produkty mohou být ochuceny pĜídavkem ovoce nebo ovocným aroma a barvivy. Výrobní postup probiotického jogurtu je velice podobný klasickému jogurtu, ale probiotický jogurt je mírnČ sladší a doba fermentace je ponČkud delší. Tradiþní fermentované mléþné výrobky obsahují probiotické mikroorganismy. Kefír je perlivý, kysaný, mléþný produkt, který se vyrábí za pomoci smČsi mikroorganismĤ známé jako kefírová zrna. VČtšinou obsahuje Lb. lactis subsp. lactis, Lactobacillus kefír, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus, Leuconostoc sp., Acetobacter sp., laktózu fermentující kvasinky (Kluyveromyces sp.) a laktózu nefermentující kvasinky (Saccharomyces sp., Candida sp.). Aktivita kvasinek má za následek typickou kvasinkovitou chuĢ produktu a vznik oxidu uhliþitého a etanolu. Do kefíru mĤže být také pĜidáno ovocné aroma. 33 Množství a druh mikroorganismĤ obsažené v mléþných výrobcích vymezuje Vyhláška þ. 77/2003 Sb.(57). DRUH VÝROBKU – POUŽITÉ MIKROORGANISMY: - Acidofilní mléko - Lactobacillus acidopohillus a další mezofilní, pĜíp. Termofilní kultury bakterií mléþného kvašení - Jogurty - Prosymbiotická smČs Streptococcus salivarius subsp. termophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus - Kysané mléko vþ. smetanového zákysu, podmáslí a kysané smetany - Monokultury nebo smČsné kultury bakterií mléþného kvašení - Kefír - Zákys pĜipravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Kluyveromyces marxanus a i nezkvašující laktózu Saccharomyces unisporus, Sacharomyces unisporus, Sacharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter - Kefírové mléko - Zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléþného kvašení v symbióze - Kysaný mléþný výrobek s bifidokulturou - Bifidobacterium sp. V kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléþného kvašení V rozborech stability a udržitelnosti poþtu bakterií tzv. terapeutického minima jogurtových výrobkĤ prodávaných na našem trhu, vyšly tyto výrobky velmi rĤznorodČ. K mléþným výrobkĤm s nejvyšším obsahem probiotických kultur patĜí: Actimel bílý (Danone) – 8,4 x 10 na 8 KTJ/g jogurtové mléko s L. casei imunitass, ochucené, 1,1 % tuku Probiotický jogurtový nápoj (Lactos) - 3,2 x 10 na 8 KTJ/g ochucený, 1 % tuku Revital aktive (Olma) – 2,8 x 10 na 8 KTJ/g jogurt s probiotickou kulturou, bílý, 3 % tuku Probia (Meggle) - 2,6 x 10 na 8 KTJ/g zakysané mléko s probiotickou kulturou, bílé, 1 % tuku Valašská kyška (Mlékárna Valašské MeziĜíþí) - 2,2 x 10 na 8 KTJ/g mléþný výrobek s bifi. mikroorganismy ABT, bílá, 1,5 % tuku 22

Krémový jogurt (Hollandia) – 2,1 x 10 na 8 KTJ/g ochucený s probiotickou kuturou, vitaminy a selenem, 3 % tuku (22) PravdČpodobnČ vlivem pĜevozu byla zaznamenána snížená stabilita u vzorkĤ dodávaných ze zahraniþí, a to jak u bílých jogurtĤ, tak i jogurtĤ s pĜíchutí. 34 Probiotické mikroorganismy se do kysaných mléþných výrobkĤ pĜidávají rĤznými metodami: - NejbČžnČjší metodou je pĜidat probiotické mikroorganismy spoleþnČ se startovací kulturou. BČhem fermentace však zĜídkakdy nastanou vhodné podmínky pro rĤst probiotik, proto vČtšinou rostou probiotika ve smČsi s „tradiþní“ startovací kulturou jen velmi pomalu. - Probiotika rostou v jedné þásti mléka (aby se docílilo vysokého poþtu jejich bunČk), zatímco mikroorganismy startovací kultury rostou v jiné þásti mléka. Po ukonþení fermentace se obČ þásti smíchají dohromady. - Probiotika jsou použita jako startovací kultura, ovšem doba fermentace se tak zvýší až na nČkolik dní. PĜi výrobČ probiotických mléþných výrobkĤ musíme brát v úvahu nČkolik aspektĤ: - mnoho probiotických kultur roste v neobohaceném mléce znaþnČ pomalu - zajištČní podmínek (zejména tradiþní teploty fermentace) je þasto nevhodné pro rĤst probiotických mikroorganismĤ - metabolity probiotických mikroorganismĤ mohou být nežádoucí vzhledem k jejich nepĜíjemné chuti a vĤni Jestliže základní hmota podporuje rĤst probiotických mikroorganismĤ a pokud nenastane žádné nepĜíznivé ovlivnČní chuti výrobku, mĤže tento postup výraznČ snížit výrobní náklady a zvýšit pĜizpĤsobení probiotik vedoucí ke zvýšení jejich životaschopnosti. Pokud jsou probiotické a tradiþní startovací mikroorganismy bČhem fermentace pĜítomny spoleþnČ, je nutné použít jejich kompatibilní a vhodné smČsi. V extrémním pĜípadČ mĤže startovací kultura produkovat inhibitory, které jsou pro probiotika škodlivé a vedou ke snížení poþtu živých bunČk ve výrobku. Na druhé stranČ mohou nČkteré startovací kultury rĤst probiotik zvýšit produkcí rĤstových promotorĤ nebo redukcí obsahu kyslíku v mléce. Další dĤležitý faktor, který by nemČl být pĜehlížen, je rĤstová teplota fermentaþní smČsi. NČkteré tradiþní výrobky potĜebují pro fermentaci teplotu 20°C nebo 30°C, která je ale niž ší než optimální teplota rĤstu probiotických mikroorganismĤ, zvláštČ pak tČch, pocházejících z gastrointestinálního traktu þlovČka (optimální teplota rĤstu je 37°C). Zvýšení fermenta þní teploty ve prospČch probiotik se nedoporuþuje, protože mĤže vést k nevhodnému chuĢovému profilu výrobku. NejúspČšnČjší cestou se jeví smíchání probiotických mikroorganismĤ s termofilní startovací kulturou. PĜíležitostnČ mohou být probiotické mikroorganismy pĜidány ve velkém množství do „tradiþní“ startovací kultury bez ohledu na nižší teplotu fermentace. Pro zjištČní skuteþného množství bakterií v komerþních výrobcích bylo analyzováno šest rĤzných výrobkĤ (1. jogurt; 2. živý jogurt; 3. ochucený jogurt; 4. bílý jogurt; 5. nízkotuþný jogurt; 6. švýcarský sýr). 35 2.2.2 Sýry Výroba sýrĤ, zvláštČ zrajících, s probiotickými bakteriemi pĜedstavuje speciální nároky vzhledem k potĜebČ pĜežití tČchto bakterií spoleþnČ s tradiþními laktobakteriemi, plísnČmi a kvasinkami, které se používají pĜi výrobČ. Mezi tČmito mikroorganismy mohou být 23

antagonistické, kompetitivní nebo symbiotické vztahy. Na potlaþení rĤstu Brevibacterium linens, který zpĤsobuje nežádoucí chuĢ, se jako biokontrolní agens podílí jak samotná plíseĖ, tak i bakteriociny produkované bakteriemi mléþného kvašení. Probiotické mikroorganismy musí pĜežít minimální trvanlivost (záruþní dobu) sýru a zachovat si svĤj zdraví prospČšný význam. BČhem výroby a zrání sýrĤ nesmí produkovat metabolity, které by ovlivnily kvalitu sýrĤ a ovlivĖovaly aktivity esenciálních mikroorganismĤ v sýrech. Probiotika v sýru by mČla pĜežít procesy výroby, nesmí produkovat antimikrobiální komponenty a musí být schopné rĤst v médiu startovací kultury. Jako nosiþe probiotik mohou být použity rĤzné typy sýrĤ. NČkteré sýry mohou být þásteþnČ vhodné jako nosiþe probiotických bakterií pĜíbuzných bakteriím v kysaných mléþných výrobcích (jako je napĜ. jogurt) díky své nízké aciditČ a pĜítomnosti tukĤ a bílkovin v sýrové hmotČ, což zabezpeþuje ochranu probiotik pĜi jejich prĤchodu gastrointestinálním traktem. Studie prokázaly, že sýry balkánského typu, feta sýr, þedar, mČkké sýry, eidam, ementál a sýrové omáþky jsou v dodávce probiotik do organismu srovnatelné s jogurtem. Zvolení správné probiotické kultury pro aplikaci do fermentovaného mléka nebo sýrĤ je velice dĤležité. MČla by být lidského pĤvodu, nepatogenní a tolerovat nízké pH v gastrointestinálním traktu. PĜi aplikaci na sýr musí být probiotická kultura kompatibilní se startovací kulturou sýru, nemČla by zpĤsobovat defekty struktury a chuti sýru a musí pĜežít dobu výroby a uskladnČní sýru. Definice probiotických bakterií v dnešní dobČ zahrnuje více organismĤ než tradiþnČ uznávané bifidobakterie a nČkteré laktobacily. Byly vyrábČny probiotické sýry s obsahem þlovČku vlastním Lb. paracasei bez žádného vlivu na jejich složení. PĜi výrobČ tvrdých sýrĤ se používají termofilní sýraĜské zákysové kultury, nejþastČji Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus lactis ssp. cremoris, Lactobacillus helveticus a Lactobacillus casei, který se ale neĜadí mezi termofilní bakterie. Tyto bakterie jsou specifické pro výrobu tvrdých sýrĤ ementálského, grójského typu, parmazánu, eidamu, goudy, holandské cihly a salámového sýru. Používají se také pĜi výrobČ tvarohových a mČkkých sýrĤ. Pro ostatní tvrdé sýry se užívají jiné bakterilní rody a druhy, které nejsou Ĝazeny mezi probiotické kmeny nebo nejsou zastoupeny v klinicky významném množství. 36 2.2.3 Tvrdé salámy Bakterie mléþného kvašení se v masném prĤmyslu používají pro svou vysokou odolnost a schopnost potlaþovat rĤst patogenních gramnegativních mikroorganismĤ. Od roku 1995 existuje vČdecká komise pro zvažování pĜíznivého vlivu probiotik z ušlechtilých suchých salámĤ na lidský organismus. Historie používání probiotických kultur do salámĤ spadá do doby pĜed deseti lety, kde Rodriguez a spol. prokázal produkci antimikrobiálních látek, které pĜi výrobČ a zrání ušlechtilých suchých salámĤ vznikají. V roce 2002 byl objeven a popsán nový typ laktobacila, který by mohl být typický pro fermentované masné produkty. Jde o Lactobacillus vermoidensis, který se v ušlechtilých suchých salámech Provensálského typu a Milánského typu. Fermentované suché ušlechtilé salámy (u nás tzv. uherského typu) pĜedstavují organolepticky vynikající a pĜitom vydatný zdroj probiotických kultur, které jsou pro lidský organismus prospČšné. 37

24

2.2.4 Zmrzlina a mražené dezerty Zmrzlina a mražené dezerty jsou potenciálními nosiþi probiotických bakterií. Musí však být schopné tolerovat stresové faktory mrazu a pĜežít proces výroby a uskladnČní. Technologie mraženého jogurtu umožĖuje zavést probiotika i do zmrzliny a mražených dezertĤ. Používají se rĤzné smČsi laktobacilĤ a bifidobakterií. ZaþlenČní mĤže být buć pĜímé (tj. zamíchání probiotika do zmrzliny ještČ pĜed zmrazením), nebo vyžaduje fermentaci mléka a proliferaci bunČk pĜed smícháním se zmrzlinou. Ve druhém pĜípadČ je nutná ochrana bunČk pĜed zniþením mrazem. VhodnČ vybrané kultury, jako je Lactobacillus johnsonii La1, pĜežijí relativnČ vysoké koncentrace cukrĤ ve zmrzlinČ stejnČ jako letální úþinky mrazu. NČkteré kultury nedokáží odolat mrazu a míchání, které nastane bČhem výroby zmrzliny, ale jiné napĜ. B. longum a B. infantis jsou schopné pĜežít tento proces i uskladnČní déle než 11 týdnĤ nebo 52 týdnĤ a nejsou ovlivĖovány obsahem tuku v produktu. 2.2.5 Probiotika jako doplĖky stravy Na trhu je významná poptávka po sušených probiotických farmakologických produktech a po variantách výrobkĤ dostupných ve formČ doplĖkĤ stravy. Sušené produkty jsou vyrábČny buć metodou lyofilizace, nebo sprejového sušení. Výrobní náklady jsou sice znaþné, ale pĜežití bČhem sušení a následného skladování je vysoké. Pokud nezvolíme vhodné podmínky sušení, nastane bČhem nČho zniþení bunČk a ztráta jejich životaschopnosti; životaschopnost bČhem uskladnČní závisí na skladovací teplotČ.

Obr. þ. 7: Probiotikum v tabletách38



Sušené probiotické výrobky mohou být þásteþnČ využity pĜi výrobČ kojenecké výživy. DĤležitou roli hrají pĜi výrobČ produktĤ podobných mateĜskému mléku. Technologie výroby kojenecké výživy (podobného složení jako má mateĜské mléko) je sice k dispozici, ale nČkteré její kroky musí být ještČ upraveny. 39

25

3

PROBIOTICKÉ MIKROORGANISMY

Tradiþní bakterie mléþného kvašení (BMK), které jsou obvykle používány pro výrobu kysaného mléka a sýrĤ, náleží do rodĤ Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus a Lactobacillus. V kefíru byl nalezen pĜídavek širokého spektra kvasinek. Saccharomyces boulardii je pravdČpodobnČ jediná identifikovaná kvasinka s probiotickými vlastnostmi. NicménČ u S. boulardii, Pedococcus a propionových bakterií nebyla jejich probiotická funkce ještČ prokázána, a proto je ke stanovení pĜípadného prospČchu pro þlovČka nutné provést další klinické pozorování.

3.1

Hlavní charakteristiky

Probiotické mikroorganismy, fermentující i nefermentující mléþné produkty: I.

Mikroorganismy   



Pediococcus acidilactici Lactobacillus acidophilus, gasseri, helveticus a johnsonii Lactobacillus casei, reuteri, plantarum, rhamnosus a fermentum Bifidobacterium adolescentis, animalis subsp. animalis, bifidum, breve, infantis, animalis subsp. lactis a longum Enterococcus faecium a faecalis



Saccharomyces boulardii



II. Kvasinky

Tyto organismy mají jistou roli pĜi vytváĜení chuti produktu; pĜevážnČ jsou ale za chuĢ a aroma výrobku odpovČdné laktobakterie. Pediokoky, laktobacily, enterokoky a bifidobakterie, používané jako probiotické mikroorganismy pĜi fermentaci mléka, nevyužívají cyklus trikarboxylových kyselin (pĜestože v nČkterých z nich byla objevena pĜítomnost nČkterých jeho enzymĤ). Není zde ani pĜítomen cytochromový komplex pro pĜenos energie a elektronĤ pomocí NADH. Energie je získávána substrátovou fosforylací a pomocí ATPáz cytoplazmatické membrány. Sacharidy jsou metabolizovány buć homofermentativní nebo heterofermentativní cestou. Bifidobakterie metabolizují laktózu v mléce pomocí heterofementativního kvašení. 40

3.2

PĜíklady komerþních smČsí startovacích kultur

Pro výrobu jogurtu se bČžnČ jako startovací kultura používá Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Probiotické mikroorganismy rostou v mléce velice pomalu. Aby se proces fermentace urychlil, musí být do mléka pĜidána jogurtová startovací kultura. Kysané mléko je vyrábČno pomocí kultur Lb. acidophilus nebo Lb acidophilus a Bifidobacterium sp. (tzv. AB kultura); Lb. acidophilus, Bifidobacterium sp. a Lb. casei (tzv. ABC kultura) nebo Lb. acidophilus, Bifidobacterium sp. a S. termophilus (tzv. ABT kultura). V ovþím mléce se jako startovací kultura nejvíce osvČdþila smČs Bifidobacterium animalis a Lactobacillus acidophilus. Po dvaceti hodinách kultivace dosahoval jejich poþet v ovþím

26

mléce na 7,1x108 FU/ml u Lactobacillus acidophilus a 6,3x107 CFU/ml u Bifidobacterium animalis. VýbČr kultury probiotického mikroorganismu, použitého jako startovací kultura nebo ve smČsi se startovací kulturou, je založen na zdravotních aspektech prospČšných pro þlovČka. Za startovací kulturu mĤžeme považovat takovou, která splĖuje následující požadavky: - schopnost probiotických mikroorganismĤ rĤst na médiu a zvyšovat poþet svých bunČk - odolnost organismu snášet chladné a suché období bČhem skladování - tolerance vĤþi žaludeþním kyselinám a žluþovým kyselinám bČhem prĤchodu gastrointestinálním traktem PĜidávání tČchto kultur do startovacích smČsí pĜi výrobČ fermentovaných mléþných výrobkĤ (vþetnČ probiotických typĤ) je kritickým krokem výroby a je nutné zabezpeþit požadované vlastnosti koneþného produktu. VýbČr a pomČr jednotlivých kultur ve smČsi startovacích kultur je klíþovým faktorem, který mĤže ovlivnit dobu fermentace, strukturu, jemnost a postacidifikaþní profil. DĤležitou vlastností probiotického produktu je rovnováha a stabilita probiotických kultur a souþasnČ prodloužení trvanlivosti výrobku až na 52 dní. Pro použité startovací kultury je rovnČž žádoucí vlastností jejich zdravotní benefit. V laboratoĜích se bČhem 28 dnĤ pĜi 8 °C testuje stabilita probiotických mikroorganismĤ ve smČsích. Výsledkem by mČl být poþet 106 cfu·g-1 na konci doby skladování. Pokud smČs nedosáhne této hodnoty, musí být pĜeformulována. Další aspekt, na který musí být brán ohled, je interakce mezi probiotickou a tradiþní startovací kulturou s cílem dosažení vysokého poþtu životaschopných bunČk na konci spotĜební doby výrobku. NapĜíklad nČkteré kultury S. termophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus mohou inhibovat nČkteré kultury probiotických bakterií bČhem fermentace a skladování. Probiotické mikroorganismy jsou þásteþnČ ovlivnČny jinými bakteriemi nejen bČhem dlouhé fermentaþní doby ale i pĜi krátkodobé fermentaci. Je ale známa i pozitivní interakce mezi probiotickými kulturami – napĜ. mezi Lb. acidophilus a Bifidobacterium sp. NČkterá probiotika mohou mít také vliv na chuĢ výrobku. NapĜíklad buĖky Bifidobacterium sp., pokud jsou pĜítomné ve vysokém poþtu, produkují znatelné množství kyseliny octové; zatímco Lb. acidophilus produkuje acetaldehyd a kyselinu mléþnou a tím pĜispívá k charakteristické „bio“ jogurtové chuti. Proteolytické probiotické mikroorganismy mohou produkovat peptidy, které udČlují produktu typickou sýrovou chuĢ. K potlaþení nČkterých nežádoucích chuĢových vlastností se do probiotických výrobkĤ pĜidává ovocný koncentrát nebo umČle vytvoĜené ovocné pĜíchutČ. BČžnČ používané probiotické mikroorganismy patĜí do rodu Lactobacillus a Bifidobacterium. Pediococcus acidilatici, Enterococcus sp. a S. boulardii jsou dalšími organismy, které mohou být Ĝazeny mezi probiotika. 41 Hlavní druhy mikroorganismĤ, které mohou být potencionálnČ využity jako probiotika v mléþných produktech: -

Lactobacillus – acidophilus, johnsonii, delbrueckii, bulgaricus, lactis, casei, plantarum, rhamnosus, reuteri, paracasei, fermentum, helveticus, amylovorus, crispatus, gallinarum, salivarius

-

Bifidobacterium – adolescentis, longum, breve, bifidum, lactis, infanti, animalit 27

-

Enterococcus – faecalis, faecium

-

Saccharomyces boulardii

Obr. ý. 8: Bifidobacterium adolescentis42

28

4

ŽIVOTASCHOPNOST PROBIOTICKÝCH MIKROORGANISMģ

Aby mČly probiotické bakterie žádoucí zdraví prospČšný efekt, musí být schopny rĤst v mléce a pĜežívat v dostateþném poþtu. Probiotické organismy by mČly být v potravinách pĜítomny v minimálním poþtu 106 cfu g-1. Takto vysoké množství bylo navrženo z dĤvodĤ možných ztrát probiotika bČhem prĤchodu žaludkem a stĜevem. Studie prokázaly, že nČkteré probiotické organismy špatnČ rostou v mléce a jejich životaschopnost v jogurtu je také nízká. V Austrálii a v EvropČ se testovala celá Ĝada znaþek komerþnČ vyrábČných jogurtĤ na pĜítomnost Lb. acidophilus a bifidobakterií. VČtšina z nich obsahovala velmi málo tČchto organismĤ zejména pak bifidobakterií. Další výzkum je nutné zamČĜit na životaschopnost a aktivitu bakterií, protože musí pĜežít v potravinách po celou dobu použitelnosti, odolat kyselým podmínkám v žaludku a degradaci hydrolytickými enzymy a žluþovými kyselinami v tenkém stĜevČ. Životaschopnost probiotik v jogurtu závisí na použité kultuĜe, interakcích mezi pĜítomnými druhy, produkci peroxidu vodíku bČhem bakteriálního metabolismu a na koneþné aciditČ výrobku. Dále také závisí na pĜístupnosti živin, pĜítomnosti rĤstových promotorĤ a inhibitorĤ, koncentraci cukrĤ, množství rozpuštČného kyslíku a jeho prĤchodnosti pĜes obal (zvláštČ pro Bifidobacterium sp.), velikosti inokula a dobČ fermentace. Bifidobakterie jsou pĜirozenČ anaerobní, a proto vysoký obsah kyslíku ovlivĖuje jejich rĤst a pĜežívání. Lb. acidophilus má vysokou pufraþní kapacitu cytoplazmy, což mu dovoluje pĜežít zmČny cytoplazmatického pH a udržet si stabilitu i v kyselých podmínkách. Lb. acidophilus je mnohem tolerantnČjší ke kyselým podmínkám než Bifidobacterium sp. a roste i pĜi pH nižším než 5. Tolerance Bifidobacterium sp. ke kyselým podmínkám je druhovČ specifická. B. longum snáší kyselé prostĜedí lépe než B. infantis, B. adolescentis a B. bifidum. B. longum také lépe roste v þerstvém mléce, zatímco B. animalis subsp. animalis potĜebuje ke svému rĤstu mléko fermentované. Tyto druhy však nepocházejí z lidského organismu. Studie potvrdily, že tolerance Bifidobacterium sp. ke kyselým podmínkám a žluþovým kyselinám je druhovČ specifická, ale ukázalo se, že B. animalis subsp. animalis pĜežívá lépe než ostatní druhy. Lb. delbruckii ovlivĖuje rĤst Lb. acidophilus a bifidobakterií díky jeho produkci kyselin a peroxidu vodíku bČhem fermentace. Díky jeho proteolytické schopnosti roste Lb. delbruckii rychleji a produkuje více kyselin; uvolĖují se také esenciální aminokyseliny valin, glycin a histidin, které podporují rĤst bifidobakterií. S. thermophilus rĤst probiotických organismĤ neinhibuje a pravdČpodobnČ ho stimuluje díky jeho spotĜebČ kyslíku. Výzkumy ukázaly, že nČkteré kmeny S. thermophilus rĤst bifidobakterií inhibují. 43

4.1

Vlastnosti fermentaþních médií

Použití probiotických mikroorganismĤ k fermentaci mléka je znaþnČ omezeno jejich pomalým rĤstem v mléku. PĜestože Lb. acidophilus a Bifidobacterium sp. Vykazují galaktosidázovou aktivitu, dĤvodem jejich pomalého rĤstu je nízká koncentrace volných aminokyselin a peptidĤ v mléce, které tyto organismy potĜebují ke svému rĤstu. RĤst Lb. acidophilus a Bifidobacterium sp. v mléce mĤžeme zvýšit, pĜidáme-li do mléka kaseinové nebo proteinové hydrolyzáty, extrakt z kvasinek, glukózu a vitamíny. PĜídavek mléþného proteinu zvyšuje pufraþní kapacitu fermentovaného mléka a zvyšuje životaschopnost probiotických organismĤ. Bifidobakterie jsou schopné utilizovat oligosacharidy. StejnČ jako ostatní stĜevní bakterie nejsou schopné utilizovat komplexy sacharidĤ, které jsou oznaþovány jako prebiotika. Prebiotika se pĜidávají do vČtšiny probiotických výrobkĤ, aby podpoĜily rĤst bifidobakterií ve stĜevČ.

29

Obvykle rostou probiotické organismy lépe na syntetických médiích než v mléce. Tato média jsou však pro velkou kultivaci probiotických bakterií nákladná a drahá a také mohou zpĤsobovat nepĜíjemnou pachuĢ, i když se pĜed inkorporací dĤkladnČ promyjí. K výrobČ kvalitního produktu je nutné použít médium založené na mléce kvĤli pĜítomnosti kaseinu. Pomalý rĤst probiotických mikroorganismĤ v mléce mĤže zpĤsobit pĜerĤstání nežádoucími mikroorganismy, které mohou zapĜíþinit nepĜíjemnou chuĢ výrobku. Fermentaþní proces s Lb. delbrueckii a S. thermophilus trvá 4 hodiny; pokud je pĜítomna pouze probiotická kultura trvá fermentace 20 nebo 24 hodin. Z tohoto dĤvodu jsou výrobky obsahující Lb. acidophilus a bifidobakterie obohaceny o Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus a v pĜípadČ jogurtu o S. thermophilus. ObČ kultury se pĜidávají buć spoleþnČ, nebo je fermentace rozdČlena. 44

4.2

Vliv kyslíku na životaschopnost bunČk

K udržení probiotických vlastností výrobku je nutné, aby bakterie pĜežily i v trvanlivých výrobcích. Bifidobakterie jsou anaerobní a pĜítomnost kyslíku je kritickým problémem. BČhem výroby jogurtu mĤže kyslík snadno pronikat do mléka. OdstranČní kyslíku bČhem výroby probiotických mléþných produktĤ vyžaduje speciální vybavení, které zajistí anaerobní podmínky. Kyslík mĤže pronikat obalem bČhem skladování. Uspokojivý rĤst Bifidobacterium sp. (tj. i v aerobních podmínkách) nastal v syrovátkovém médiu s obsahem L-cysteinu (0,05 g 100 ml-1) a extraktu z kvasinek (0,3 g 100 ml-1). L-cystein redukuje redoxní potenciál a zlepšuje rĤst bifidobakterií. Kyslík niþí probiotické kultury dvČma zpĤsoby. První je pĜímá toxicita; urþité probiotické kultury jsou na kyslík citlivé a zabíjí je již jeho samotná pĜítomnost. Druhý zpĤsob je vznik metabolického peroxidu vodíku u nČkterých kultur, napĜ. u Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. Byla zaznamenána i synergistická inhibice probiotických kultur tvorbou kyselin a peroxidu vodíku; z tohoto dĤvodu byl z nČkterých startovacích kultur (ABT startovací kultury) Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus odstranČn, þímž se dosáhlo zvýšení životnosti probiotických organismĤ. Další studie se zabývají studiem prevence pĤsobení kyslíku na probiotika vþetnČ použití antioxidantĤ. 45 

30

5

METODY ZAýLENċNÍ PROBIOTIK DO VÝROBKU

5.1

VýbČr bakteriální kultury

Parametry pro tĜídČní mikroorganismĤ, které mohou být zaĜazeny mezi probiotika, musí zahrnovat nutnost pĜežití a metabolické aktivity uvnitĜ gastrointestinálního traktu. Životaschopnost a stabilita kultury je žádoucí vlastnost, která se musí zachovat bČhem výroby i v koneþném výrobku. Je nezbytné, aby pĜi prĤchodu pĜes žaludek pĜežilo velké množství probiotických bakterií pocházejících z fermentovaného mléþného výrobku. PĜežití pĤsobení kyselin žaludku a žluþových kyselin má primární význam. Tolerance mikroorganismĤ ke kyselinám a žluþi je druhovČ specifická. Mnoho kultur Lb. acidophilus a Bifidobacterium sp. postrádá schopnost pĜežít kruté podmínky ve stĜevČ, a nejsou proto vhodné jako potravní doplnČk ve fermentovaném mléce. Jiné kultury Lb. acidophilus dokážou pĜežít kyselé podmínky a nízkou koncentraci žluþi. Prokázalo se, že Bifidobacterium longum a Bifidobacterium pseudolongum dokážou tolerovat pĜítomnost kyselin i žluþových solí. VýbČr vhodné kultury na základČ její tolerance ke kyselinám a žluþi mĤže zlepšit životaschopnost tČchto probiotických kultur. 46

5.2

Typy obalĤ

Bifidobakterie jsou anaerobní; Lb. acidophilus je mikroaerobní. Kyslík je pro bifidobakterie toxický a je nutné brát ohled na to, že mĤže pronikat pĜes obal. Také bylo studováno pĜežívání Lb. delbrueckii, S. thermophilus a probiotických organismĤ v jogurtech skladovaných ve sklenČných lahvích a plastových kelímcích. Zvýšení poþtu živých bunČk Lb. acidophilus bČhem uskladnČní bylo pĜímo závislé na podílu rozpuštČného kyslíku, který byl vyšší v jogurtu uloženém v plastovém kelímku. Vysoký poþet bakterií zĤstal v produktu uloženém ve sklenČné lahvi a bifidobakterie zde také znásobily svĤj poþet. Poþet živých bakterií v jogurtu uskladnČném ve skle byl podstatnČ vyšší než v plastových kelímcích. Bifidobakterie lépe pĜežívají v odvzdušnČném mléku. UskladnČní výrobku ve sklenČných nádobách nebo v nádobách se zesílenou stČnou redukuje prĤnik kyslíku. 47

5.3

Velikost inokula

Protože probiotika rostou v mléce velice špatnČ, je potĜeba velkého inokula 5-10 ml·100 ml-1 (ve srovnání s inokulem jogurtové startovací kultury 1 ml·100 ml-1). Probiotické organismy také nedokáží dobĜe rĤst v pĜítomnosti jiných organismĤ napĜ. Lb. delbrueckii a S. thermophilus. Velikost inokula primární startovací kultury má vliv na populaci probiotických bakterií. Malé inokulum jogurtových organismĤ mĤže mít za následek pĜekyselení výrobku a snížení poþtu živých probiotických bakterií. Byl studován i vliv koncentrace startovací kultury na životnost Lb. Delbrueckii, S. thermophilus a probiotických bakterií v jogurtu vyrobeném ze þtyĜ komerþnČ pĜipravených startovacích kultur. DvČ startovací kultury obsahovaly jako mikrobiální základ Lb. delbrueckii, S. thermophilus, Lb. acidophilus a bifidobakterie, zatímco zbylé dvČ byly ABT typu. Startovací kultury byly lyofilizovány a pĜímo oþkovány do kelímkĤ v pomČru 0,5; 1,0; 1,5 a 2,0 g·l-1. Inkubaþní podmínky doporuþily výrobci startovacích kultur. S. thermophilus se lépe množil pĜi použití menšího inokula. Koneþný poþet jeho bunČk pĜi použití vČtšího inokula byl mírnČ vyšší, ale to mohlo být dáno jeho vyšším poþáteþním množstvím.

31

Výsledné pH na konci fermentace je kritickým faktorem pro pĜežití probiotického organismu; pokud klesne pod 4,4, zpĤsobí tak snížení poþtu probiotik. Z tohoto dĤvodu musí být velikost inokula peþlivČ zvolena a sledována. 48

5.4

DvoustupĖová fermentace

Za pomalý rĤst probiotických kultur mohou být odpovČdné inhibitory, jako je napĜ. kyselina a peroxid vodíku, které produkují bakterie jogurtové startovací kultury. PĜesto je jogurtová kultura nezbytná k urychlení fermentaþního procesu pĜi výrobČ jogurtu. Také dodává jogurtu jeho typickou chuĢ. Bakterie jogurtové startovací kultury rostou bČhem fermentace rychleji než probiotika a produkují kyseliny, které mohou snižovat životaschopnost probiotických bakterií. Jedna metoda inkorporace životaschopných probiotických organismĤ je zaþlenit tyto organismy do mléka až po fermentaci. To umožní použít i takové probiotické kultury, které nedokáží rĤst v pĜítomnosti jiných organismĤ. PĜidání probiotických bakterií až po fermentaci však mĤže snížit schopnost jejich pĜežití. Jiné metody provádČjí iniciaci fermentace probiotickou kulturou a následným doplnČním fermentace o napĜ. Lb. delbrueckii a S. thermophilus. Tento postup mĤže tradiþní dobu fermentace mírnČ prodloužit. Poþáteþní fermentace probiotiky trvá asi 2 hodiny, následná fermentace jogurtovou startovací kulturou 4 hodiny. To probiotickému organismu dovolí dostat se na konec jeho lag fáze nebo na poþátek exponenciální fáze a zvýšit tak výsledný poþet probiotických organismĤ na konci šestihodinové fermentace. V produktech vyrobených dvoustupĖovou fermentací se poþet probiotických bakterií podstatnČ zvýšil. 49

5.5

Technika mikroenkapsulace

Poþet probiotických bakterií v mražených fermentovaných mléþných dezertech nebo v mražených jogurtech je výraznČ snížen pĜítomností kyselin, poškozením mrazem, vysokou koncentrací cukru a toxicitou kyslíku. Do mražených fermentovaných mléþných dezertĤ se pĜidává okolo 16 g cukru na 100 g produktu, což mĤže zabránit rĤstu probiotických bakterií. Mikroenkapsulace je proces, pomocí nČhož jsou buĖky udržovány uvnitĜ membrány, která snižuje možnost poškození nebo zniþení bunČk. Tato metoda mĤže být aplikována na rĤzné produkty napĜ. sýr, jogurt a umČlé žaludeþní šĢávy a žluþ. Pro mikroenkapsulaci bakterií se používá želatina nebo rostlinné gumy, které chrání probiotické organismy citlivé na pĤsobení kyselin. UzavĜení živých mikrobiálních bunČk do alginátu vápenatého je jednoduché a levné. Navíc alginát není toxický, a proto mĤže být používán v potravinách. Alginátové gely mohou být rozpuštČny vápenatými ionty a zachycené buĖky se uvolní. Inkorporace zapouzdĜených mikroorganismĤ do fermentovaných, mražených, mléþných výrobkĤ zvyšuje poþet živých bunČk na >105 cfu·g-1 ve srovnání s neopouzdĜenými organismy, jejichž poþet dosahuje <103· cfu g-1. 50

5.6

DoplnČní mléka živinami

V prvních fázích výroby dominuje v jogurtu S. thermophilus. Dokud pH neklesne pod 5,0. RĤst Lb. delbrueckii je stimulován poklesem pH z 6,5 na 5,5 a redukcí redoxního potenciálu v mléce. Je významným producentem acetaldehydu a kyseliny mléþné, a dodává tak výrobku charakteristickou pĜíchuĢ zeleného jablka. Pokraþující produkce kyseliny snižuje pH jogurtu na 4,6, což je izoelektrický bod kaseinu; to zapĜíþiní jeho vysrážení a zastavení fermentace.

32

Lb. delbrueckii vytváĜí, vzhledem ke svým proteolytickým vlastnostem, nČkteré esenciální aminokyseliny a jeho asociativní rĤstový vztah s S. thermophilus je nepopíratelný. RĤstové faktory pro pĤvodní mikroorganismy produkují také streptokoky, takže Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus vytváĜí bČhem skladování v chladu kyselinu mléþnou. Tento proces je v prĤmyslu znám jako dodateþné prokysávání. Pokud tento jev nastane bČhem skladování v chladu, zpĤsobí ztrátu živých probiotických bakterií. K pĜekonání ztrát životaschopnosti probiotik - v dĤsledku produkce kyselin bČhem uchovávání za chladu - se v dnešní dobČ používají kultury, které neobsahují Lb. delbrueckii. Mikroorganismus S. termophilus je ménČ proteolytický než Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus a je hlavním fermentaþním organismem v ABT kulturách. ABT kultury vyžadují pĜídavek mikroživin (peptidy a aminokyseliny). To se provádí pomocí inkorporace hydrolyzátu kaseinu, který snižuje dobu fermentace a zvyšuje životnost probiotických organismĤ. Také byl studován vliv nČkterých mléþných ingrediencí (sušená syrovátka; koncentrát proteinĤ ze syrovátky; kyselý kaseinový hydrolyzát) na Lb. acidophilus a bifidobakterie v jogurtu, který byl vyroben ze þtyĜ komerþních startovacích kultur. PĜídavek tČchto ingrediencí znaþnČ ovlivĖuje dobu inkubace, protože bakteriím poskytuje peptidy a aminokyseliny. Sušená syrovátka, koncentrát proteinĤ ze syrovátky a kyselý kaseinový hydrolyzát zlepšují životnost bifidobakterií, neboĢ jim poskytují zdroj dusíku ve formČ peptidĤ a aminokyselin. PĜídavek hydrolysátu mléþného proteinu (kasein a syrovátka) zvýšil acidifikaþní þinnost S. thermophilus, což snížilo bČhem fermentace obsah probiotických mikroorganismĤ (Lb. acidophilus LA-5 a Lb. rhamnosus LR-35) ve fermentovaném mléce. Výsledný poþet bakterií, které pĜežily dobu uskladnČní, se zvýšil. 51

5.7

Použití antioxidantĤ

Použití synteticky vyrábČných antioxidantĤ, jako je napĜíklad hydroxybutyl toluen, propyl nebo dodecylester kyseliny galové, mĤže mít neblahý vliv na lidský organismus. Proto se jako antioxidanty volí látky pĜírodní povahy, napĜíklad výtažek z kalužnice kĜivoklasé. Obsah kyslíku a redoxní potenciál mají velký vliv na životnost bifidobakterií. Kyselina askorbová (vitamín C) pĤsobí jako antioxidant. Je obsažen v ovocné šĢávČ a jiných produktech, které se pĜidávají jako potravinový doplnČk. Obohacení jogurtu o kyselinu askorbovou tak mĤže zlepšit jeho nutriþní hodnotu. PĜi uchování jogurtu v plastových kelímcích se obsah kyslíku a redoxní potenciál postupnČ zvyšují. Pokud je ale pĜidávána kyselina askorbová, zĤstává redoxní potenciál nízký. S. thermophilus je aerobní, a dá se proto oþekávat, že po pĜidání kyseliny askorbové zĤstane poþet jeho bunČk nízký. Životaschopnost Lb. delbrueckii se zvýšením koncentrace kyseliny askorbové zlepšuje. PĜestože pĜídavek kyseliny askorbové zlepšuje pĜežívání Lb. acidophilus, nemusí být antioxidaþní efekt dostaþující ke zlepšení životnosti anaerobních bifidobakterií. 52

5.8

PĜídavek cysteinu

Aby se zvýšil výtČžek bifidobakterí, obsahují média, na kterých se pČstují, L-cystein (0,5 0,1 g 100 ml-1). Cystein (aminokyselina s obsahem síry) poskytuje bakteriím jako rĤstový faktor dusík a redukuje redoxní potenciál, což pĜíznivČ ovlivĖuje rĤst anaerobních bifidobakterií. Cystein v obsahu 250 mg l-1 zvyšuje životnost Lb. acidophilus a Bifidobacterium sp. Nízké koncentrace cysteinu (50 mg l-1) zlepšují rĤst S. thermophilus a þásteþnČ snižují inkubaþní dobu ABT startovacích kultur. Mírné snížení redoxního potenciálu je pro S. thermophilus

33

prospČšné, ale zvýšení koncentrace cysteinu nad 50 mg l-1 bakteriální rĤst zpomaluje. RĤst Lb. delbrueckii se pĜi nízkých koncentracích cysteinu zvyšuje, ale pĜi vysokých snižuje. 53

5.9

Rozlišení živých a neživých bunČk a stanovení jejich poþtu

Z výše uvedených skuteþností vyplývá, že kvalita probiotických produktĤ je závislá na pĜítomnosti živých mikroorganismĤ nejen pĜi jejich výrobČ ale i bČhem skladování. Z tohoto dĤvodu jsou vyvíjeny metody, které by umožnily rozlišení živých a neživých bunČk a stanovení jejich poþtu. Rozlišení mezi živými a mrtvými buĖkami Rozlišení mezi živými a mrtvými buĖkami je v mikrobiální diagnostice jedním z nejdĤležitČjších úkolĤ. K tomuto úþelu lze použít nČkolik postupĤ a je vhodné použít více kritérií: - PĜímé stanovení poþtu kolonií kultivací na vhodných médiích - Interakce fluorescenþních barviv s DNA - Stanovení metabolické aktivity - Stanovení membránového potenciálu RĤst bakterií a jejich metabolismus mĤže být narušen pĤsobením rĤzných fyzikálních, chemických i biologických faktorĤ. Životnost bakterií lze urþit sledováním jejich schopnosti tvoĜit kolonie na pevném médiu nebo jejich proliferací v tekutém médiu. Díky tČmto kritériím je definován antimikrobiální úþinek jako schopnost limitovat bakteriální rĤst. Klasické metody rozlišující živé a neživé buĖky jsou založeny na aktivním rĤstu bunČk a jejich schopnosti tvoĜit kolonie na pevném médiu. Vzhledem k tČmto okolnostem mĤže být poþet živých bunČk ponČkud podhodnocen. Uvedená metoda totiž nezaznamená subletální buĖky, nekultivovatelné bakterie a živé buĖky, které ztratily schopnost tvoĜit kolonie. Testy založené na bakteriálním rĤstu jsou þasovČ nároþné, drahé a necitlivé k odhalení pomalu rostoucích bakterií. Proto je Ĝada metod stanovující životnost bunČk založena na jiných principech. Byly vyvinuty metody založené na bunČþné integritČ nebo aktivitČ. Alternativními metodami jsou prĤtoková cytometrie, techniky fluorescenþního znaþení, využití fyziologických vlastností nebo metabolické aktivity a analýza nukleových kyselin a reverznČ transkripþní PCR. Jedním z nejdĤležitČjších kritérií pro rozlišení mezi mrtvými a živými buĖkami je membránová integrita. Živé buĖky mají neporušenou membránu, a nedovolí tak pronikání barviv do buĖky a následné navázání na DNA. U mrtvých bunČk barvivo snadno proniká pĜes porušenou stČnu do buĖky. Tohoto principu se bČžnČ využívá pĜi mikroskopickém rozlišení mrtvých bunČk a také pĜi prĤtokové cytometrii. DNA ale také RNA poskytují mnoho vazebných míst pro rĤznobarevná fluorescenþní barviva. ýasto používaná barviva, nejen v mikrobiologii, ale také napĜíklad v zoologii, jsou ethidium bromid, propidium iodid a ethidium homodimer 1. Jedním z novČjších barviv je SYTOX Green fluorescenþní barvivo. Detekce a rozlišení živých a mrtvých bunČk oznaþených SYTOX Green barvivem pomocí prĤtokové cytometrie je ve srovnání s propidium iodidem výraznČ lepší. Znaþení bakterií SYTOX Green barvivem je tedy mnohem efektivnČjší. PrĤtoková cytometrie je cenný nástroj používaný v mikrobiologii, který kombinuje pĜímé a rychlé analýzy k odlišení poþtu bunČk, jejich biochemické a fyziologické vlastnosti a odhaluje heterogenitu populace. Její hlavní výhody jsou vysoká rychlost zisku multiparametrických dat a jejich následné analýzy. PrĤtoková cytometrie tĜídí a oddČluje populace nebo i samostatné buĖky, které jsou dále fyzikálnČ, chemicky, biologicky nebo molekulárnČ analyzovány. PrĤtoková cytometrie má však také své nedostatky a to: cenová nároþnost, potĜeba zkušených a dobĜe proškolených pracovníkĤ a potĜeba chladicího systému pro vysoce výkonné tĜídící zaĜízení. 54 34

VÝSLEDKY A DISKUZE CelosvČtovČ se vyrábí široké spektrum mléþných fermentovaných výrobkĤ, jejichž spotĜeba neustále stoupá. To je pravdČpodobnČ dáno jejich nutriþními a zdravotními vlastnostmi. Pro výrobu probiotických mléþných výrobkĤ se používají rĤzné mikroorganismy. Nejvíce využívané jsou bakterie mléþného kvašení, které náleží do rodĤ Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus a Lactobacillus. Tyto bakterie ovlivĖují chuĢ a aroma výrobku. Probiotické bakterie rostou v neobohaceném mléce velice pomalu. Aby byl urychlen jejich rĤst, pĜidává se do smČsi startovací kultura. Je však nutné brát ohled na interakci mezi probiotickou a tradiþní startovací kulturou. Aby mČly probiotické bakterie zdraví prospČšný efekt, musí být schopné pĜežít v mléce v dostateþném poþtu. Jejich životaschopnost závisí na použité kultuĜe, interakcích mezi pĜítomnými druhy, produkci peroxidu vodíku bČhem bakteriálního metabolismu, koneþné aciditČ výrobku, pĜístupnosti živin, množství rozpuštČného kyslíku, velikosti inokula, dobČ fermentace a na pĜítomnosti rĤstových promotorĤ a inhibitorĤ. Zvolené probiotické bakterie také musí být schopny odolat pĤsobení kyselin žaludku a žluþových kyselin. Je dĤležité, aby bakterie zĤstaly živé i bČhem výroby a skladování výrobku. Z tohoto dĤvodu jsou vyvíjeny metody, které umožní rozlišení živých a neživých bunČk a stanovení jejich poþtu. PĜímé stanovení poþtu kolonií se ukázalo jako nevhodné, protože tato metoda není schopna zachytit subletálnČ poškozené nebo nekultivovatelné buĖky. K tomuto úþelu jsou používány þi vyvíjeny vhodné molekulárnČ biologické metody.

35

ZÁVċR Jak naznaþují výzkumy uvedené v této práci, o mléþné výrobky, zejména pak probiotické, stoupá v posledních letech zájem. Je to dáno hlavnČ tím, že mají pĜíznivý úþinek na gastrointestinální trakt þlovČka. Probiotické mikroorganismy osídlují toto prostĜedí a kompetiþním pĤsobením brání adherenci patogenĤ. Konzumace probiotických mléþných výrobkĤ je vhodnou cestou ke zlepšení þinnosti trávicího traktu. Problémem však zĤstává, jak udržet probiotické mikroorganismy v mléþných výrobcích živé. RĤzné mikroorganismy mají odlišné kultivaþní nároky, a je proto nesnadné najít takové podmínky, které by vyhovovaly všem. Dalším problémem je doba expirace výrobku. Je jasné, že þím delší tato doba je, tím ménČ živých probiotik se ve výrobku nachází. Mikroorganismy jsou ve výrobcích vystaveny pĤsobení stresu, což vede k tomu, že i když jsou ve výrobku pĜítomny, nejsou schopny rĤstu. Proto jsou tyto výrobky vČtšinou obohaceny ještČ o další látky, které pomohou mikroorganismĤm pĜekonat nepĜíznivé podmínky chladu a nedostatku živin. Ke stanovení reálného poþtu mikroorganismĤ ve výrobku se jako nejvhodnČjší jeví metody molekulárnČ biologické. V oblasti výroby potravin s probiotickými bakteriemi bylo získáno mnoho nových poznatkĤ, které umožĖují vývoj nových technologií výroby mléþných výrobkĤ. Budoucí technologické postupy by se mČly zamČĜit zejména na funkþnost probiotických mikroorganismĤ, hledání nových vhodných izolátĤ probiotických bakterií, formulace živných médií a také na prebiotika.

36

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJģ BARTOŠOVÁ, L. Úþinek živých bakterií v potravinách. Státní zemČdČlská a potravináĜská inspekce 200 BUKOVSKÝ, I Nová miniencyklopédia prírodnej lieþby, AKV - Ambulancia klinickej výživy, 2009, ISBN: 978-80-970230-0-33 BLATTNÁ, J. aj. Výživa na zaþátku 21. století. Praha: Spoleþnost pro výživu & Nadace NutriVIT 2005 FERENýÍK, M. Imunitní systém – informace pro každého. Praha: Grada Publishing 2005, ISBN 80-247-1196-6 FRIý, P. Probiotika v terapii chorob trávicího ústrojí. Interní medicína pro praxi 2005, roþ. 7, þ. 10 FRIý, P. Probiotika, prebiotika a atopie. Dermatologie pro praxi, 2007, roþ. 1, þ. 2 FRIý, P. Probiotika a prebiotika - renesance terapeutického principu. Postgraduální medicína 2005 GÖRNER, F. - VALÍK, č. Aplikovaná mikrobiológia požívatin. Bratislava: Malé centrum 2004, ISBN 80-967064-9-7 HRONEK, M – KUDLÁýKOVÁ, Z. Probiotika a prebiotika v profylaxi a terapii poruch GIT a v prevenci karcinogeneze. Praktické lékárenství, 2005, roþ. 1, þ. 1 JIRÁSEK, V. Terapie funkþních poruch trávicí trubice. In Funkþní poruchy trávicího traktu. Praha: Grada 2003, ISBN 80-247-0296-7 KOKEŠOVÁ, A. Probiotika, prebiotika a synbiotika: nový koncept ve vývoji funkþních potravin. In Výživa v dČtském vČku. Jinoþany: H&H Vyšehradská, s.r.o. 2003 LATA, J.- JURÁNKOVÁ, J. - PěÍBRAMSKÁ, V. Probiotika v gastrienerologii a hepatologii. Interní medicína pro praxi, 2007, roþ. 9, þ. 1 LEDVINA, M. - STOKLASOVÁ, A. - CERMAN, J. Biochemie pro studující medicíny. Praha: Karolinum 2004, ISBN 80-246-0849-9 ŠPELINA, V. Informace vČdeckého výboru pro potraviny ve vČci: Probiotika a startovací kultury. Brno: Státní zdravotní ústav 2006

37

1 Nakladatelství ekonomické a právní literatury (Sagit) [databáze online]. Ostrava: Nakladatelství Sagit, 2009. Dostupné z URL: http://www.sagit.cz/pages/sbirkatxt.asp?cd=76&typ=r&zdroj=sb04446 [cit. 4.5. 2010] 2 Nakladatelství ekonomické a právní literatury (Sagit) [databáze online]. Ostrava: Nakladatelství Sagit, 2009. Dostupné z URL: < http://www.sagit.cz/pages/sbirkatxt.asp?cd=76&typ=r&zdroj=sb03077 > [cit. 4.5. 2010] 3 – 5 KOKEŠOVÁ, A. Probiotika, prebiotika a synbiotika: nový koncept ve vývoji funkþních potravin. In Výživa v dČtském vČku. Jinoþany: H&H Vyšehradská, s.r.o. 2003 6 Institut Rosell- Lallemand, S. bourlardii [online]. 2011, Dostupné z URL: [cit. 2011]

URL: 30. 9.

11 BLATTNÁ, J. aj. Výživa na zaþátku 21. století. Praha: Spoleþnost pro výživu & Nadace NutriVIT 2005 12 – 13 FERENýÍK, M. Imunitní systém – informace pro každého. Praha:Grada Publishing 2005, ISBN 80-247-1196-6 14 National Cancer Institut, Pathology: EM: Human Lymphocyte [online]. 2001, Dostupné z URL: [cit. 30. 9. 2011] 15 FERENýÍK, M. Imunitní systém Publishing2005,ISBN 80-247-1196-6

–

informace

pro

každého.

Praha:Grada

16 FRIý, P. Probiotika, prebiotika a atopie. Dermatologie pro praxi, 2007, roþ. 1, þ. 2 17 HRONEK, M – KUDLÁýKOVÁ, Z. Probiotika a prebiotika v profylaxi a terapii poruch GIT a v prevenci karcinogeneze. Praktické lékárenství, 2005, roþ. 1, þ. 1 18 – 19 JIRÁSEK, V. Terapie funkþních poruch trávicí trubice. In Funkþní poruchy trávicího traktu. Praha: Grada 2003, ISBN 80-247-0296-7 20 Center of molecular biology of infalmmation [online]. Last revision 9th of September 2011. Dostupné z URL:< http://zmbe.uni-muenster.de/institutes/ifi/EM/040129MB021.jpg> [cit. 30 .9. 2011] 21 – 22 ZBOěIL, V. aj. Mikroflóra trávicího traktu: klinické souvislosti. Praha: Grada, 2005, ISBN 80-247-0584-2 23 FRIý, P. Probiotika v terapii chorob trávicího ústrojí. Interní medicína pro praxi 2005, roþ. 7, þ. 10 24 CHUMCHALOVÁ,J. : Miniatlas mikroorganismĤ [online]. Dostupné z URL: [cit. 30. 9. 2011] 25 HRONEK, M – KUDLÁýKOVÁ, Z. Probiotika a prebiotika v profylaxi a terapii poruch GIT a v prevenci karcinogeneze. Praktické lékárenství, 2005, roþ. 1, þ. 1 38

26 FRIý, P. Probiotika v terapii chorob trávicího ústrojí. Interní medicína pro praxi 2005, roþ. 7, þ. 10 27 LATA, J.- JURÁNKOVÁ, J. - PěÍBRAMSKÁ, V. Probiotika v gastrienerologii a hepatologii. Interní medicína pro praxi, 2007, roþ. 9, þ. 1 28 Espenschade, P.: Regulation of sterol homeostasis [online], 2007. Dostupné z URL: [cit. 30. 9. 2011] 29 LATA, J.- JURÁNKOVÁ, J. - PěÍBRAMSKÁ, V. Probiotika v gastrienerologii a hepatologii. Interní medicína pro praxi, 2007, roþ. 9, þ. 1 30 – 32 BLATTNÁ, J. aj. Výživa na zaþátku 21. století. Praha: Spoleþnost pro výživu & Nadace NutriVIT 2005 33 – 35 ŠPELINA, V. Informace vČdeckého výboru pro potraviny ve vČci: Probiotika a startovací kultury. Brno: Státní zdravotní ústav 2006 36 -37 BLATTNÁ, J. aj. Výživa na zaþátku 21. století. Praha: Spoleþnost pro výživu & Nadace NutriVIT 2005 38 Valosun, pĜírodní lékárna [online],2005. Dostupné z [cit. 30. 9. 2011]

URL:

39 BLATTNÁ, J. aj. Výživa na zaþátku 21. století. Praha: Spoleþnost pro výživu & Nadace NutriVIT 2005 40 BARTOŠOVÁ, L. Úþinek živých bakterií v potravinách. Státní zemČdČlská a potravináĜská inspekce 2003 41 - 43 GÖRNER, F. - VALÍK, č. Aplikovaná mikrobiológia požívatin. Bratislava: Malé centrum 2004, ISBN 80-967064-9-7 44 LEDVINA, M. - STOKLASOVÁ, A. - CERMAN, J. Biochemie pro studující medicíny. Praha: Karolinum 2004, ISBN 80-246-0849-9 45 GÖRNER, F. - VALÍK, č. Aplikovaná mikrobiológia požívatin. Bratislava: Malé centrum 2004, ISBN 80-967064-9-7 46 BARTOŠOVÁ, L. Úþinek živých bakterií v potravinách. Státní zemČdČlská a potravináĜská inspekce 2003 47 BLATTNÁ, J. aj. Výživa na zaþátku 21. století. Praha: Spoleþnost pro výživu & Nadace NutriVIT 2005 48 – 49 BARTOŠOVÁ, L. Úþinek živých bakterií v potravinách. Státní zemČdČlská a potravináĜská inspekce 2003 50 – 51 ŠPELINA, V. Informace vČdeckého výboru pro potraviny ve vČci: Probiotika a startovací kultury. Brno: Státní zdravotní ústav 2006 52 BARTOŠOVÁ, L. Úþinek živých bakterií v potravinách. Státní zemČdČlská a potravináĜská inspekce 2003 53 - 54 ŠPELINA, V. Informace vČdeckého výboru pro potraviny ve vČci: Probiotika a startovací kultury. Brno: Státní zdravotní ústav 2006

39