VyuÏití odpadních surovin k produkci obohacené kvasinkové biomasy

VYSOKÉ UâENÍ TECHNICKÉ V BRNù BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ FACULTY OF CHEMISTRY

VyuÏití odpadních surovin k produkci obohacené kvasinkové biomasy

Disertaãní práce

Autorka práce / Author

Brno 2011

Ing. Terezie Dvofiáková

(

2

)

Obsah 1. Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2. Teorie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1 Kvasinky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1.1 Základní charakteristika kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1.2 Kvasinka jako modelov˘ organismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.1.2.1 Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.1.3 BuÀka kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.3.1 Bunûãná stûna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.1.3.2 Jizvy po puãení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.1.3.3 Cytoplazmatická membrána . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.1.3.4 Cytoplazma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.1.3.5 Jádro a extrachromozomální ãásti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.1.3.6 Mitochondrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.3.7 Vakuoly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.4 Dezintegrace bunûk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.1.4.1 Mechanické metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.1.4.2 Fyzikální metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.1.4.3 Chemické metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.1.4.4 Enzymatické metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . .20 2.1.5 Kvasinky a prostfiedí . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.1.5.1 Vliv prostfiedí na kultivaci kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.1.5.2 Nutriãní poÏadavky a nutriãní stres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.1.6 Kultivace kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.1.7 RÛst kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.1.8 Metabolismus kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.1.8.1 Sekundární metabolity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.1.9 Mutageneze kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.1.9.1 Mutageny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.1.9.2 Mutace malého rozsahu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.1.9.3 Mutace velkého rozsahu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.1.9.4 Oprava po‰kozené DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.2 Karotenogenní kvasinky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4

Rod Rhodotorula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 Rod Sporobolomyces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Rod Cystofilobasidium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Rod Phaffia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.3 Karotenoidy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.3.1 Vlastnosti karotenoidÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.3.2 Biosyntéza karotenoidÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.3.2.1 Regulaãní enzymy biosyntézy karotenoidÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

(

3

)

2.4 Izolace a anal˘za vybran˘ch kvasinkov˘ch metabolitÛ . . . . . . . . . . . . . . 34 2.4.1 Karotenoidy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.4.2 Ergosterol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.4.3 Bioetanol a xylóza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.4.4 Kvasinková biomasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.4.5 Kvasinková DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.4.5.1 Izolace intaktní chromozomální DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.5 VyuÏití odpadních substrátÛ k produkci vybran˘ch kvasinkov˘ch metabolitÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3. Cíle disertaãní práce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4. Experimentální ãást . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.1 PouÏité mikroorganismy, chemikálie, pfiístroje a pomÛcky . . . . . . . . . . . 45 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5

Kvasinkové kmeny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Bakteriální kmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 PlísÀové kmeny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Chemikálie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Pfiístroje a pomÛcky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.2 Kultivace karotenogenních kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 4.2.1 SloÏení kultivaãních médií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 4.2.2 Podmínky kultivace a uchovávání kultur kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.2.3 Kultivace za pÛsobení stresov˘ch faktorÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.2.3.1 Kultivace za pÛsobení osmotického a oxidaãního stresu . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.2.3.2 Kultivace za pfiídavku iontÛ kovÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.2.3.3 Kultivace na rÛzn˘ch odpadních substrátech . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.2.3.4 Kultivace pfii vystavení kultury pÛsobení mutagenu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.3 Kultivace a uchovávání kompetentní Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . 52 4.3.1 SloÏení kultivaãních médií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.4 Kultivace a uchovávání Escherichia coli DH5α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.5 Anal˘zy provedené u karotenogenních kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.5.1 Mikroskopické pozorování morfologick˘ch zmûn bunûk kvasinek . . . . . . . . . . . . . 53 4.5.2 Vyhodnocení nárÛstu kultury, produkce biomasy a odbûr vzorkÛ . . . . . . . . . . . . . . 53 4.5.3 Extrakce karotenoidÛ a ergosterolu z bunûk kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 4.5.3.1 Identifikace a anal˘za karotenoidÛ a ergosterolu RP-HPLC/UV-VIS . . . . . . . . 54 4.5.4 Izolace a anal˘za chromozomální DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 4.5.4.1 Pfiíprava protoplastÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 4.5.4.2 Izolace intaktní chromozomální DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 4.5.4.3 Optimalizace PFGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 4.5.4.4 Barvení a vizualizace gelu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

(

4

)

4.6 Anal˘zy provedené u kompetentních bunûk S. cerevisiae a E. coli DH5α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 4.6.1 PCR amplifikace regionu DNA kódujícího cílov˘ gen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.6.2 Pfiíprava insertu k ligaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.6.2.1 Ligace plazmidu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.6.3 Amplifikace plazmidu v E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.6.3.1 Izolace plazmidu z transformovan˘ch bakterií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.6.4 Transformace kvasinky S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 4.6.4.1 Izolace plazmidu z transformované kvasinky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 4.6.5 Sekvenování vyizolovaného plazmidu z transformované kvasinky . . . . . . . . . . . . . 58 4.6.6 Stanovení enzymatické aktivity reduktázy xylózy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

5. V˘sledky a diskuze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 5.1 Základní charakteristika karotenogenních kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 5.1.1 RÛst karotenogeních kvasinek za optimálních podmínek kultivace . . . . . . . . . . . . . 61

5.2 Vliv environmentálních stresov˘ch faktorÛ na rÛst karotenogenních kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 5.2.1 Kultivace pfii pÛsobení osmotického stresu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 5.2.1.1 Vliv osmotického stresu na rÛst Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . 65 5.2.1.2 Vliv kombinovaného osmotického a oxidaãního stresu na rÛst Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 5.2.1.3 Vliv osmotického stresu na rÛst Rhodotorula aurantiaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 5.2.1.4 Vliv osmotického stresu na rÛst Sporobolomyces roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 5.2.1.5 Vliv osmotického stresu na rÛst Sporobolomyces shibatanus . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.2.2 Kultivace pfii pÛsobení oxidaãního stresu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 5.2.2.1 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . 70 5.2.2.2 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Rhodotorula aurantiaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 5.2.2.3 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Sporobolomyces roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 5.2.2.4 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Sporobolomyces shibatanus . . . . . . . . . . . . . . . . 73 5.2.3 Kultivace s pfiídavkem iontÛ kovÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 5.2.4 Kultivace karotenogenních kvasinek na rÛzn˘ch odpadních substrátech . . . . . . . . . 75 5.2.4.1 RÛst Cystofilobasidium capitatum kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 5.2.4.2 RÛst Rhodotorula aurantiaca kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech . 78 5.2.4.3 RÛst Rhodotorula glutinis a S. roseus kultivovan˘ch na rÛzn˘ch odpadních substrátech . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 5.2.5 Kultivace karotenogenních kvasinek v pfiítomnosti mutagenu . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5.3 Vliv environmentálních stresov˘ch faktorÛ na morfologii karotenogenních kvasinek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 5.3.1 Morfologie kvasinek C. capitatum kultivovan˘ch pfii pÛsobení osmotického a oxidaãního stresu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 5.3.2 Morfologie kvasinek kultivovan˘ch na odpadních substrátech . . . . . . . . . . . . . . . . 84 5.3.2.1 Morfologie Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 5.3.2.2 Morfologie Rhodotorula aurantiaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.3.2.3 Morfologie Sporobolomyces roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 5.3.3 Morfologie kvasinek vystaven˘ch pÛsobení mutagenu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.3.3.1 Morfologie Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.3.3.2 Morfologie kvasinek Rhodotorula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.3.3.3 Morfologie kvasinek Sporobolomyces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 (

5

)

5.4 Zbarvení kultur kvasinek kultivovan˘ch pfii pÛsobení environmentálních stresov˘ch faktorÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5.4.1 Zbarvení kultur kvasinek za pÛsobení osmotického stresu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.4.1.1 Zbarvení Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.4.1.2 Zbarvení Sporobolomyces roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.4.1.3 Zbarvení Sporobolomyces shibatanus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 5.4.2 Zbarvení kultur kvasinek za pÛsobení oxidaãního stresu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 5.4.2.1 Zbarvení Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 5.4.2.2 Zbarvení Sporobolomyces roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 5.4.2.3 Zbarvení Sporobolomyces shibatanus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 5.4.3 Zbarvení kultur kvasinek pfii kultivaci na rÛzn˘ch odpadních substrátech . . . . . . . . 93 5.4.3.1 Zbarvení kultur Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 5.4.3.2 Zbarvení kultur Rhodotorula aurantiaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 5.4.3.3 Zbarvení kultur Sporobolomyces roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 5.4.4 Zbarvení kultur kvasinek za pÛsobení mutagenu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 5.4.4.1 Zabarvení Cystofilobasidium capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 5.4.4.2 Zabarvení kvasinek Rhodotorula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 5.4.4.3 Zabarvení kvasinek Sporobolomyces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

5.5 Produkce karotenoidÛ kvasinkami pfii pÛsobení environmentálních stresov˘ch faktorÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 5.5.1 Produkce karotenoidÛ pfii osmotickém a oxidaãním stresu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 5.5.2 Produkce karotenoidÛ pfii pÛsobení iontÛ kovÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 5.5.3 Produkce karotenoidÛ na odpadních substrátech . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 5.5.3.1 Produkce karotenoidÛ u C. capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 5.5.3.2 Produkce karotenoidu u R. aurantiaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 5.5.3.3 Produkce karotenoidÛ u S. roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 5.5.4 Produkce karotenoidÛ za pÛsobení mutagenu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

5.6 Produkce ergosterolu kvasinkami pfii pÛsobení environmentálních stresov˘ch faktorÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 5.6.1 Produkce ergosterolu na rÛzn˘ch odpadních substrátech . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 5.6.1.1 Produkce ergosterolu u C. capitatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 5.6.1.2 Produkce ergosterolu u R. aurantiaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 5.6.1.3 Produkce ergosterolu u S. roseus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 5.6.2 Produkce ergosterolu pfii pÛsobení mutagenu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

5.7 Izolace a anal˘za chromozomální DNA karotenogenních kvasinek . . . . 124 5.7.1 Pfiíprava protoplastÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 5.7.2 PÛsobení dezintegrace na morfologii bunûk u tvorby protoplastÛ . . . . . . . . . . . . . 124 5.7.3 Optimalizace pulzní gelové elektroforézy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 5.7.3.1 Pulzní gelová elektroforéza karotenogenních kvasinek kultivovan˘ch za pÛsobení stresov˘ch faktorÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

5.8 Studium utilizace xylózy rekombinantní kvasinkou S. cerevisiae . . . . . 135 5.8.1 Izolace plazmidu z transformované kvasinky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 5.8.2 Sekvenování vyizolovaného plazmidu z transformované kvasinky . . . . . . . . . . . . 137 5.8.3 Stanovení enzymatické aktivity xylózareduktázy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

(

6

)

6. Závûry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Seznam pouÏité literatury . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 Seznam pouÏit˘ch zkratek a symbolÛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

(

7

)

(

8

)

Abstrakt Kvasinky jsou stejnû jako ostatní organismy neustále vystavovány vlivÛm okolního prostfiedí. Jejich pfieÏití závisí na dovednosti pfiizpÛsobit se environmentálním zmûnám vãetnû schopnosti vyuÏívat rÛzné alternativní zdroje Ïivin. V pfiedloÏené disertaãní práci byly karotenogenní kvasinky patfiící mezi rody Rhodotorula, Sporobolomyces a Cystofilobasidium testovány z hlediska vyuÏitelnosti vybran˘ch odpadních substrátÛ a rovnûÏ podrobeny soubûÏnû úãinkÛm nûkolika typÛ exogenního stresu a mutacím za úãelem zv˘‰ení produkce mikrobiální biomasy obohacené specifick˘mi metabolity. Jako alternativní nutriãní zdroje pocházející z odpadních substrátÛ ze zemûdûlské a hospodáfiské v˘roby byly testovány jableãné slupky, vláknina, kukufiiãné klíãky a dal‰í. Kvasinky byly dále vystaveny pÛsobení osmotického, oxidaãního a kombinovaného stresu (pfiídavky NaCl a H2O2 o rÛzn˘ch koncentracích do kultivaãních médií), dále iontÛ kovÛ selenu a chromu v koncentracích 0,01 mM, 0,1 mM a 1 mM. Testoval se také vliv mutagenu ethylesteru kyseliny metansulfonové. Pfii proveden˘ch experimentech se sledovala schopnost adaptace bunûk, morfologické zmûny, zabarvení médií produkovan˘mi pigmenty, tvorba nûkter˘ch v˘znamn˘ch kvasinkov˘ch metabolitÛ a zmûny ve fragmentaci chromozomální DNA. Za úãelem vyhodnocení potenciálních zmûn v kvasinkovém genomu po pÛsobení mutagenu a stresov˘ch faktorÛ se optimalizovaly metody izolace intaktní chromozomální DNA a následná anal˘za pulsní gelovou elektroforézou. MnoÏství produkovan˘ch metabolitÛ se analyzovalo zejména pomocí RP-HPLC s UV/VIS a MS detekcí. V práci bylo prokázáno, Ïe vût‰ina kmenÛ je schopna vyuÏívat studované odpadní substráty a produkovat na nich vybrané cílové metabolity. Biomasa se napfi. u R. aurantiaca na jableãné vlákninû pohybovala kolem 7 g/l a u C. capitatum pfii kultivaci na neupravené syrovátce dosahovala 9 g/l. Vyprodukované mnoÏství karotenoidÛ ãinilo u R. aurantiaca pfii kultivacích na p‰eniãné ka‰i a kukufiiãn˘ch klíãcích s enzymatickou hydrol˘zou F. solani 1,01 mg/g, u S. roseus na tûstovinách aÏ 4,3 mg/g. Hodnoty syntézy ergosterolu se u R. aurantiaca pohybovaly na jableãn˘ch slupkách kolem 4,8 mg/g, u S. roseus pfii kultivaci na tûstovinách s enzymatickou hydrol˘zou P. chrysosporium 8,9 mg/g. Nejvhodnûj‰ím substrátem pro produkci biomasy a indukci karotenoidÛ jsou odpady obsahující smûs jednodu‰‰ích a sloÏen˘ch sacharidÛ obohacená o pfiídavek dusíkat˘ch látek. Potenciální cytotoxick˘ úãinek stresov˘ch faktorÛ o nízk˘ch koncentracích nebyl prokázán. Genom karotenogenních kvasinek se podafiilo rozdûlit optimalizovanou metodou PFGE, karyotypy jednotliv˘ch zástupcÛ obsahují 11 a více chromosomÛ s viditeln˘mi odli‰nostmi mezi jednotliv˘mi druhy i rody. V rámci zahraniãní stáÏe se testovala schopnost rekombinantní kvasinky S. cerevisiae pfiemûÀovat xylózu na xylitol, ãímÏ by se dosáhlo zv˘‰ení produkce bioethanolu jakoÏto náhradního zdroje paliv. Ukázalo se, Ïe jak vyuÏitím ligninocelulózov˘ch materiálÛ k produkci biolihu, tak i rÛzn˘ch odpadních substrátÛ k mikrobiální syntéze karotenoidÛ by vedlo ke sníÏení prÛmyslov˘ch v˘robních nákladÛ na produkci kvasinkov˘ch metabolitÛ, jakoÏ i ke sníÏení negativní zátûÏe na Ïivotní prostfiedí.

Klíãová slova Kvasinky, karotenoidy, bioethanol, odpadní substráty, fyziologick˘ stres, mutageneze (

9

)

Abstract Yeasts are like other organisms constantly exposed to environmental influences. Their survival depends on the skills to adapt to environmental changes, including the ability to use various alternative sources of nutrients. In presented PhD thesis carotenogenic yeast belonging to the genera Rhodotorula, Sporobolomyces and Cystofilobasidium were tested for ability to use of selected waste substrates, and also subjected to several types of exogenous stress effects and mutations in order to increase the production of microbial biomass enriched with specific metabolites. As alternative nutrient sources derived from waste substrates from agricultural and farm production apple peel, pulp, corn germ and more were tested. Yeasts were also exposed to osmotic, oxidative and combined stress (benefits of various concentrations of NaCl and H2O2 to the culture media), followed by metal ions of selenium and chromium in concentrations of 0.01 mM, 0.1 mM and 1 mM. The effect of mutagen methanesulfonic acid ethyl ester was tested too. In all experiments the adaptivity of cells, morphological changes, color pigments produced by the media while some important fungal metabolites production and changes in chromosomal DNA fragmentation were analyzed. In order to evaluate potential changes in the yeast genome after treatment with mutagen and stress factors methods for isolation of intact chromosomal DNA and DNA analysis by pulsed field gel electrophoresis was optimized. The amount of produced metabolites was mainly analyzed by RP-HPLC with UV/VIS and MS detection. The work has been shown that most strains are able to use waste substrates and produced selected target metabolites. Biomass, for example, in R. aurantiaca on apple fiber was about 7 g/l and in C. capitatum cultivated on modified whey reached to 9 g/l. Amount of produced carotenoids by R. aurantiaca cultivated on wheat germ and maize after enzymatic hydrolysis by F. solani was ??1.01 mg/g and S. roseus on pasta 4.3 mg/g. The values of ergosterol synthesis in R. aurantiaca are on the apple shells around 4.8 mg/g, in S. roseus on pasta with the enzymatic hydrolysis of P. chrysosporium 8.9 mg/g. The best substrate for biomass production and induction of carotenoids are waste substartes containing a mixture of simple and complex carbohydrates enriched with the addition of nitrogen compounds. Potential cytotoxic effect of stress factors of low concentrations was demonstrated. Red yeast genome was able to distribute by optimized PFGE, the karyotype of tested yeasts contain 11 or more chromosomes with visible differences between yeast species and genera. During exchange internship the ability of recombinant yeast S. cerevisiae to convert xylose to xylitol, which would be achieved by increasing the production of bioethanol as alternative fuel sources was studied. It turned out that both ligninocellulose materials to bioethanol production, as well as various waste substrates for microbial synthesis of carotenoids would reduce costs for industrial production of yeast metabolites, as well as to reduce the negative burden on the environment.

Keywords Yeasts, carotenoids, bioethanol, waste substrates, physiological stress, mutagenezis

(

10

)

1. Úvod V‰echny Ïivé organismy na na‰í planetû se vyznaãují neustálou pfiemûnou látek. Ta jejich buÀkám zaji‰Èuje dostateãné mnoÏství energie a stavebního materiálu pro v‰echny Ïivotní projevy, jako je zachování bunûãné integrity, obnova vnitrobunûãn˘ch struktur, v˘mûna látek s prostfiedím, odezva na zásahy z vnûj‰ího prostfiedí a za vhodn˘ch podmínek také syntéza nové bunûãné hmoty, tj. rÛst a rozmnoÏování. Intenzita, se kterou budou v‰echny tyto pfiemûny látek neboli metabolismus probíhat, je dána vlivem vnûj‰ího prostfiedí na dan˘ organismus. Mikroorganismy jsou charakteristické velmi rychlou syntézou bunûãné hmoty. Tato biosyntetická aktivita je zpÛsobena mimo jiné jejich schopností pfiijímat Ïiviny cel˘m povrchem tûla. Vzhledem k vysokému obsahu ribosomÛ a ribonukleov˘ch kyselin v buÀkách mají také velice dobfie vyvinut˘ aparát syntézy proteinÛ. Mikroorganismy tedy dovedou bûhem velmi krátké doby pfiemûnit vhodn˘ substrát, napfi. i odpadní suroviny z prÛmyslov˘ch nebo hospodáfisk˘ch v˘rob, v bunûãnou hmotu bohatou na bílkoviny a vitamíny. Mikrobní biomasa jiÏ na‰la uplatnûní ve zdravotnictví, kosmetice, jako pfiísady do krmn˘ch smûsí nebo zdroje vitamínÛ – pfiedev‰ím skupiny B, provitamínu D (ergosterolu) a u nûkter˘ch kvasinkov˘ch rodÛ (Rhodotorula) také provitamínu A (β-karotenu). V‰estrann˘ zájem o pfiírodní antioxidanty v podobû karotenoidÛ vzrostl v dÛsledku jejich schopností redukovat mnoÏství voln˘ch radikálÛ, zmírÀovat pfiíznaky chronick˘ch onemocnûní, rÛzn˘ch druhÛ rakoviny a stárnutí. Nicménû pouÏití chemick˘ch syntetick˘ch metod pro pfiípravu karotenoidÛ jako potravináfisk˘ch pfiídavn˘ch látek bylo v posledních letech pfiísnû regulováno. Proto je nyní vûnována pozornost nalezení vhodné pfiírodní metody k jejich v˘robû, napfi. biotechnologicky pomocí mikroorganismÛ, kter˘mi bude moÏné pfiemûnit rÛzné substráty na karotenoidní pigmenty. Kvasinky schopné akumulovat karotenoidní pigmenty se vzhledem ke snadnému rÛstu i manipulaci v laboratorních podmínkách komerãnû vyuÏívají k produkci nejen jiÏ zmínûného β-karotenu, ale také astaxanthinu apod. Aby se získal Ïádan˘ produkt v co nejvût‰ím mnoÏství, je moÏné produkci karotenoidÛ cílenû ovlivÀovat pomocí genového inÏen˘rství, modifikací kultivaãních podmínek, zmûnami ve sloÏení Ïivného média nebo pÛsobením vhodn˘ch vnûj‰ích faktorÛ. Dal‰í moÏností vyuÏití mikrobiální produkce je fermentace rostlinné biomasy jakoÏto ekologicky ‰etrná alternativa fosilních paliv. Tato v˘roba se ov‰em stane ekonomicky pfiijatelnou teprve ve chvíli, kdy budou mikrobiální kmeny schopné zkvasit zcela v‰echny cukry i v takov˘ch komplexních matricích, jak˘mi jsou ligninocelulózové materiály. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae pouÏívaná k v˘robû etanolu sice akceptuje i vysoké koncentrace alkoholu v médiu, ale není schopná utilizovat arabinózu a xylózu. Tyto dva sacharidy se ov‰em v nûkter˘ch rostlinn˘ch materiálech nacházejí ve více neÏ 30% z celkového obsahu cukrÛ. Xylóza je také druh˘m nejhojnûji se vyskytujícím cukrem v pfiírodû. Najdeme ji i v rychle rostoucích rostlinách, zemûdûlsk˘ch odpadních materiálech a tvrd˘ch dfievech, které by se daly k v˘robû biolihu snadno pouÏít. Pokud bude kvasinka S. cerevisiae adaptována na pentózy, stane se mikrobiální produkce bioetanolu efektivní a sníÏí se i negativní dopad na Ïivotní prostfiedí pfii souãasném pouÏívání, pfiepravû a skladování fosilních paliv. (

11

)

PfiedloÏená práce se zab˘vá vyuÏitím nûkter˘ch typÛ odpadních substrátÛ k produkci vybran˘ch kvasinkov˘ch metabolitÛ, a to za pouÏití fyziologického a nutriãního stresu, mutací i genetick˘ch modifikací produkãních kmenÛ.

(

12

)

2. Teorie 2.1 Kvasinky Kvasinky svou rÛznorodostí a v‰estrannou vyuÏitelností nacházejí uplatnûní v mnoha oblastech vûdy, technologiích a medicínû. SlouÏí jako modelové eukaryotní organismy v molekulární biologii i genetice. Nûkteré druhy na‰ly uplatnûní pfii produkci potravin, nápojÛ i ve farmacii, zatímco u jin˘ch je jejich pfiítomnost spí‰e neÏádoucí, protoÏe vyvolávají kaÏení ãi rÛzná onemocnûní (Walker G. M. 1998). Vzhledem k jejich dlouholetému spojení s prÛmyslem jsou velmi dobfie prostudované jak po fyziologické, tak i po genetické stránce. Zájem o jejich studium v biotechnologiích vzrostl pfiedev‰ím díky snadné manipulaci, toleranci k ‰irokému rozsahu teplotního optima, koncentraci substrátÛ v médiu, pH, kyslíku i jejich Ïivotnímu cyklu (Kirsop B. E., Kurtzman C. P. 1988). Jsou to jednobunûãné eukaryotní organismy patfiící mezi vy‰‰í houby. ¤adí se mezi askomycety nebo basidiomycety, jenÏ se rozmnoÏují vegetativnû (nepohlavnû) puãením nebo dûlením, ale nûkteré druhy také pohlavnû pomocí spor (Vraná D. 1986). Kvasinky se vyuÏívají pfii prÛmyslové v˘robû alkoholick˘ch nápojÛ, pfii produkci biomasy nebo rÛzn˘ch metabolick˘ch produktÛ. Mezi poslednû jmenované patfií napfi. enzymy, vitamíny, karotenoidy, lipidy, ethanol a také slouãeniny syntetizované zavedením rekombinantní DNA do kvasinek (Kurtzman C. P., Fell J. W. 1998).

2.1.1 Základní charakteristika kvasinek PfiestoÏe nejsou kvasinky ve svém pfiirozeném prostfiedí natolik roz‰ífiené jako bakterie, mohou b˘t izolovány z pÛdy, vody i vzduchu. Jednotlivé kolonie lze nalézt na rostlinách, zvífiatech i hmyzu, kde se mohou vyskytovat jak v symbióze, tak i paraziticky. Bylo zji‰tûno, Ïe nûkteré druhy lze izolovat i z extrémního prostfiedí o vysoké koncentraci cukrÛ a solí, nízké teplotû, nebo nedostatku kyslíku (Schaechter M., Lederberg J. 2004). BuÀky rÛzn˘ch druhÛ kvasinek se li‰í svou velikostí, tvarem a barvou. Ov‰em tyto rozdíly se mohou objevit i ve stejné kultufie jednoho kmene. Nejãastûji jsou buÀky elipsoidní, kulovité, oválné, dlouze protáhlé nebo i trojúhelníkové, citronovité apod. ·ífika se pohybuje v rozmezí 1–10 µm, a délka kvasinek od pouh˘ch 2–3 µm aÏ po 20–50 µm. Tvar i velikost bunûk závisí na kultivaãních podmínkách a také na stáfií kultury (Walker G. M. 1998; ·ilhánková L. 1995). Kolonie mohou b˘t také rÛznû zbarvené, coÏ jednotlivé buÀky chrání pfied úãinky UV záfiení. Bylo dokonce zji‰tûno, Ïe mnoÏství vyprodukovan˘ch pigmentÛ vzrÛstá s vy‰‰í intenzitou záfiení, kterému jsou kvasinky vystaveny (Moliné M. a spol 2009; Leland S. J. 1999). Barevná ‰kála pigmentÛ je od bílé, pfies Ïlutou a rÛzné odstíny ãervené aÏ po ãernou (·ilhánková L. 1995). Nûkteré barevné druhy (napfi. Phaffia rhodozyma, Rhodotorula glutinis) se jiÏ dnes vyuÏívají v biotechnologii pfii produkci pigmentÛ astaxantinu a β-karotenu v pfiídavcích do krmn˘ch smûsí (Walker G. M. 1998).

(

13

)

2.1.2 Kvasinka jako modelov˘ organismus PouÏití kvasinek jakoÏto modelov˘ch eukaryotick˘ch organismÛ v sobû zahrnuje hned nûkolik v˘hod. Jedná se o jednobunûãné organismy, které na rozdíl od sloÏitûj‰ích eukaryot lze pûstovat pfii laboratorních podmínkách v pfiedem definovan˘ch médiích, coÏ umoÏÀuje úplnou kontrolu nad parametry prostfiedí. Snadná manipulace pfii práci s tûmito mikroorganismy pfiispûla k detailnímu prozkoumání metabolick˘ch drah a charakterizaci enzymÛ podílejících se na tûchto biochemick˘ch procesech. V cytologii pfiinesl v˘zkum kvasinek poznání o funkãnosti mechanismÛ mitózy a meiózy, biogeneze organel, ale i struktury a funkce cytoskeletu. Neménû dÛleÏité byly i v˘zkumy v oblasti struktury genomu a nukleov˘ch kyselin, funkce proteinÛ a sekrece, rekombinace, regulace bunûãného cyklu, fiízení genové exprese nebo pÛsobení stresov˘ch faktorÛ na buÀky kvasinek (Feldmann H. 2010). Vzhledem ke svému postavení nejvíce vyuÏívané a zároveÀ dobfie geneticky zmapované kvasinky pfiedstavuje Saccharomyces cerevisiae ideální eukaryotick˘ modelov˘ systém pro v˘zkum genetického základu mnoha bunûãn˘ch a fyziologick˘ch kontrolních mechanismÛ. Signální dráhy a reakce, které pÛsobí na rÛzné extracelulární podnûty (dostupnost Ïivin, zmûny Ïivotního prostfiedí) jsou dobfie prostudované a co je velmi dÛleÏité, tyto odezvy na podnûty prostfiedí mohou b˘t aplikovány i na vy‰‰í eukaryota (de Winde J. H. 2003).

2.1.2.1 Saccharomyces cerevisiae Kvasinky patfiící mezi rod Saccharomyces se vyznaãují schopností kvasit cukry. Nejznámûj‰í je kvasinka S. cerevisiae, která se pouÏívá v pekafiství a produkci alkoholu. S. cerevisiae je pravdûpodobnû nejlépe prostudovan˘m eukaryotick˘m organismem na molekulární a bunûãné úrovni. DNA této kvasinky obsahuje kolem 6000 genÛ. Genom byl rozlu‰tûn v roce 1997 a jednalo se o první eukaryotick˘ modelov˘ organismus, kter˘ byl zcela sekvenovan˘. Od té doby se pouÏívá pro lep‰í pochopení funkce bunûk nejen u zvífiat, ale i u lidí (Pommerville J. C. 2011). Kromû potravináfiského prÛmyslu (v˘roba vína, piva, droÏdí) nachází kvasinka S. cerevisiae uplatnûní i v produkci biolihu. JelikoÏ se vyznaãuje v˘born˘mi fermentaãními schopnostmi a nenároãnou manipulací v laboratofiích, vyuÏívá se jakoÏto nejprozkoumanûj‰í eukaryotick˘ systém k mikrobiální v˘robû ethanolu, kter˘ by mohl nahradit dnes pouÏívaná fosilní paliva. Vzhledem k tomu, Ïe se v rostlin˘ch matricích nachází i pentózy (xylóza, arabinóza), které bûÏnû S. cerevisiae nedovede utilizovat, je potfieba nejprve kvasinku geneticky upravit, napfi. zavedením genu umoÏÀujícího konverzi pentóz na etanol (Bengtsson O., Hahn-Hägerdal B., GorwaGrauslund M. F. 2009). Pokud by se takto transformované kvasinky vyuÏívaly pfii v˘robû biopaliv, zmírnilo by se riziko ekologického dopadu fosilních paliv na Ïivotní prostfiedí.

(

14

)

Obr. 1: Nátûr na Petriho misce kvasinky Saccharomyces cerevisiae

2.1.3 BuÀka kvasinek Kvasinky patfií mezi eukaryotní mikroorganismy, jejichÏ buÀky se skládají z bunûãné stûny, cytoplazmatické membrány, jádra, mitochondrií, vakuol, endoplazmatického retikula, Golgiho aparátu, jizev po puãení a mikroãástic (·ilhánková L. 1995). Pro následné prÛmyslové vyuÏití kvasinek je velmi dÛleÏité si uvûdomit a následnû i pochopit vztahy mezi funkcí a strukturou bunûãn˘ch organel a tím, jak jsou tyto ãásti organizovány na makromolekulární úrovni (Walker G. M. 1998). Mikroãástice

Ribozomy Mitochondrie Golgiho aparát

Vakuoly

Jádro Bunûãná stûna Endoplazmatické retikulum

Cytoplazma

Obr. 2: BuÀka kvasinky (zdroj http://www.biocourseware.com/iphone/cell/)

(

15

)

2.1.3.1 Bunûãná stûna BuÀky kvasinek se vyznaãují pomûrnû silnou stûnou (100-200 nm), která udává buÀce tvar a také ji chrání pfied mechanick˘m po‰kozením nebo osmotick˘m ‰okem. Hlavní strukturní sloÏkou jsou polysacharidy, které jsou zde zastoupeny aÏ z 90 % a to zejména glukany a manany, v malé mífie téÏ chitin (Walker G. M. 1998). Kromû polysacharidÛ se zde nacházejí také bílkoviny (6-10 %), lipidy a fosfolipidy (3-10 %) a fosforeãnany (·ilhánková L. 1995). Pfiesné chemické sloÏení bunûãn˘ch stûn kvasinek se li‰í v závislosti na druhu kvasinek, jejich stáfií a podmínkách rÛstu. Kvasinky patfiící mezi Saccharomyces mají bunûãné stûny sloÏeny pfiedev‰ím z β-glukanÛ a α-mananÛ. U pigmentotvorn˘ch ãerven˘ch kvasinek (Rhodotorula a Sporobolomyces) bylo sloÏení jejich bunûãn˘ch stûn dlouhou dobu neobjasnûné vzhledem k neznalosti lytického enzymu, kter˘ by byl schopn˘ atakovat silnou stûnu tûchto kvasinek (Arai M., Lee T. H., Murao S. 1978). Komerãnû dodávané lytické enzymy byly pro tyto kvasinky neselektivní (Enzyme Information 2007). Pozdûji byl prokázán jako hlavní sloÏka bunûãné stûny glukomanan (Arai M., Lee T. H., Murao S. 1978). U basidiomycet je také jednou ze sloÏek bunûãné stûny chitin, zatímco u askomycet se nachází pouze v jizvách po puãení. Kvasinky rodu Schizosaccharomyces chitin naopak neobsahují vÛbec, a tvofií α-glukan (Spencer J. F. T., Spencer D. M. 1997). Bunûãná stûna má nejen funkci ochranou, jak jiÏ bylo zmínûno, ale podílí se také na interakci bunûk a enzymatické aktivitû (Walker G. M. 1998). Má ãetné póry, kter˘mi mohou dovnitfi a ven z buÀky procházet rÛzné látky, kromû vysokomolekulárních napfi. polysacharidÛ a bílkovin (·ilhánková L. 1995).

– mannoprotein – β glukan – β glukan + chitin – mannoprotein – membrána

Obr. 3: Bunûãná stûna kvasinek (zdroj http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer /learning-center/lysing-enzymes.html)

2.1.3.2 Jizvy po puãení Na povrchu stûn bunûk se nacházejí tzv. jizvy po puãení, které jsou pozÛstatky dfiívûj‰ích spojení bunûk s buÀkou matefiskou. Oznaãují se také jako jizvy zrodu. Je zajímavé, Ïe kvasinky nepuãí v místech, kde jiÏ jednou puãely, proto lze podle mnoÏství tûchto jizev také urãit stáfií jednotliv˘ch kvasinek (·ilhánková L. 1995). (

16

)

2.1.3.3 Cytoplazmatická membrána Cytoplazmatická membrána kvasinek je silná jen 7,5-8 nm a skládá se z lipidÛ a proteinÛ. Je charakteristická vychlípeninami, které prostupují do cytoplazmy. JelikoÏ je propustná pouze pro velmi malé molekuly bez náboje, tvofií proto osmotické rozhraní mezi buÀkou kvasinky a vnûj‰ím prostfiedím. Dochází zde k transportu látek ven i dovnitfi buÀky (·ilhánková L. 1995).

2.1.3.4 Cytoplazma Cytoplazma je mírnû kyselé, tekuté prostfiedí buÀky s komponenty o nízké nebo stfiední molekulové hmotnosti, rozpu‰tûn˘mi proteiny, glykogenem a dal‰ími rozpustn˘mi makromolekulami. Jsou zde tedy jak mikroãástice, tak i agregáty makromolekul – ribosomy, proteosomy a ãásti lipidÛ (Walker G. M. 1998). Cytoplazma kvasinek obsahuje systém membrán tzv. endoplazmatické retikulum, kde se nachází jiÏ zmiÀované ribosomy a také kvasinkové enzymy glykolytické, komplex syntézy mastn˘ch kyselin a biosyntézy proteinÛ (Walker G. M. 1998; ·ilhánková L. 1995). Ribosomy: Nacházejí se v endoplazmatickém retikulu (ER) nebo v mitochondriích. Podle toho je tedy dûlíme na mitochondriální a asociované k ER. Skládají se z proteinov˘ch podjednotek, mohou b˘t buì samostatnû nebo spojené do agregátÛ tzv. polysomÛ. Dochází v nich k biosyntéze bílkovin (Walker G. M. 1998). âásti lipidÛ: Jsou zásobárnou lipidÛ pro biosyntézu membrán kvasinek. Nejãastûji se skládají z esterÛ sterolÛ, fosfolipidÛ a nenasycen˘ch voln˘ch mastn˘ch kyselin (Walker G. M. 1998). Proteosomy: Jsou podjednotkami komplexu proteáz, zapojují se do kontroly bunûãného cyklu, signální transdukce, rozmnoÏování a stresov˘ch reakcí (Walker G. M. 1998).

2.1.3.5 Jádro a extrachromozomální ãásti Jádro kvasinek se nachází pfiibliÏnû uprostfied buÀky a od cytoplazmy je oddûlené dvojitou jadernou membránou s póry (·ilhánková L. 1995). Je kulovité s prÛmûrem okolo 1,5 µm. Velikost a poãet pórÛ v membránû jádra závisí na podmínkách rÛstu a na fázi bunûãného cyklu. Na rozdíl od vût‰iny eukaryotick˘ch bunûk nedochází u membrány kvasinkov˘ch jader k rozpadu bûhem mitózy. V jádfie (tzv. nukleoplazmû) se nachází DNA, RNA, základní proteiny (protaminy a histony) a nehistonové proteiny. Kondenzovan˘m nukleoproteinov˘m materiálem je chromatin, coÏ je komplex dvou‰roubovice DNA a histonu. Hmota chromatinu tvofií jednotlivé chromozomy (Walker G. M. 1998). Poãet chromozomÛ v haploidním stavu se li‰í podle druhu kvasinek. (S. cerevisiae má napfi. 16 chromozomÛ) a jejich velikost se pohybuje od 0,2-6 Mb. Velikost kvasinkového genomu se pohybuje v rozmezí 10-15 Mb a kóduje kolem 5000-10 000 genÛ. Chromozomy kvasinek mohou b˘t analyzovány metodou pulzní gelové elektroforézy. Strukturální organizace chromozomÛ hraje dÛleÏitou roli pfii regulaci funkce genÛ (Walker G. M. 1998).

(

17

)

V buÀkách kvasinek se nacházejí i extrachromozomální ãásti napfi. nízkomolekulární kruhová DNA o délce 2 µm zvaná plazmid. V diploidním jádfie se vyskytuje v mnoha kopiích (aÏ 100) a vyuÏívá se v genovém inÏen˘rství pfii konstrukci klonovacího vektoru v technologiích rekombinantní DNA (Walker G. M. 1998). MPL proteiny Pfienos molekul pfies póry mRNA Heterochromatin Vfieténko Euchromatin

Jadern˘ obal Proteiny asociované v chromatinu Endoplazmatické retikulum

Komplex jadern˘ch pórÛ

Obr. 4: Jádro kvasinky (zdroj http://www.rockefeller.edu/labheads/rout/research_project_3.php)

2.1.3.6 Mitochondrie Mitochondrie kvasinek jsou bunûãné organely, jejichÏ velikost, tvar i poãet závisí na druhu ãi kmenu kvasinek, fázi bunûãného cyklu a podmínkách rÛstu. Mohou b˘t kulovité, válcovité, vláknité nebo laloãnaté o rozmûrech 0,3-1 µm x 3 µm. Obklopují je dvû membrány. Vnûj‰í bradaviãnatého tvaru a vnitfiní s ãetn˘mi hlubok˘mi vchlípeninami tzv. kristy. Velikost a poãet krist závisí na externích fyziologick˘ch faktorech, které mají vliv na rÛst kvasinek, napfi. parciální tlak kyslíku, koncentrace glukózy, pfiítomnost nefermentovateln˘ch substrátÛ (Walker G. M. 1998; ·ilhánková L. 1995). Mitochondrie se skládají z bílkovin, lipidÛ, fosfolipidÛ, RNA a malého mnoÏství DNA. Nachází se zde d˘chací enzymy a systém oxidaãní fosforylace. Probíhá zde také syntéza mitochondriálních bílkovin, z ãehoÏ plyne, Ïe zde jsou pfiítomny také tRNA, mRNA a ribozomy. Pfii kultivaci za aerobních podmínek je v kvasinkách pfiítomno nejvíce dobfie vyvinut˘ch mitochondrií, na druhou stranu pfii anaerobní kultivaci se mitochondrie zmen‰ují (·ilhánková L. 1995).

2.1.3.7 Vakuoly Vakuoly b˘vají nejãastûji kulovité útvary obklopené jednoduchou membránou. U novû puãících bunûk lze pozorovat vût‰í mnoÏství men‰ích vakuol, ke stáfií kvasinek se jejich poãet redukuje a zvût‰uje se jejich tvar, aÏ mohou obsahovat pouze jednu vakuolu, která vyplÀuje témûfi cel˘ obsah buÀky (·ilhánková L. 1995).

(

18

)

Probíhá zde nespecifická intracelulární proteol˘za katalyzovaná vakuolov˘mi endopeptidázami, aminopeptidázami a karboxypeptidázami. SlouÏí jako hlavní zásobárny aminokyselin, polyfosfátÛ a kationtÛ kovÛ (Walker G. M. 1998).

2.1.4 Dezintegrace bunûk Naru‰ení bunûãn˘ch stûn je klíãov˘m krokem v celé fiadû bioprocesÛ, kdy cílov˘ produkt není vyluãován buÀkami do prostfiedí. Bunûãné stûny kvasinek mají fiadu funkcí, udrÏují tvar bunûk, chrání je pfied fyzikálními stresy, hrají dÛleÏité role pfii stabilizacích vnitfiního osmotického prostfiedí a podílí se na fiízení prostupu makromolekul buÀkou. Naru‰ení bunûãn˘ch stûn patfií mezi metody zamûfiené k získání poÏadovan˘ch intracelulárních produktÛ. U eukaryot je bunûãná stûna strukturnû komplikovaná. Stûna kvasinek se skládá ze dvou hlavních vrstev. Vnûj‰í je silnû zesíÈována, tvofiena manany a proteiny, pod ní se nachází vrstva glukanÛ. Cytoplazmatická membrána pod bunûãnou stûnou je tvofiena fosfolipidovou dvojvrstvou (Kumar A., Awasthi A. 2009). Stûny kvasinek mohou b˘t naru‰eny mechanick˘mi (homogenizace, ml˘nky) nebo nemechanick˘mi (fyzikální, chemické a enzymatické) metodami (Middelberg A. P. J. 1995). V‰echny pouÏité metody musí splÀovat základní pravidlo, izolovan˘ intracelulární produkt nesmí b˘t pfii dezintegraci bunûãn˘ch stûn denaturován nebo hydrolyzován pfiítomn˘mi enzymy (Kumar A., Awasthi A. 2009). Metody dezintegrace bunûãn˘ch stûn mechanické nemechanické fyzikální chemické enzymatické ml˘nky osmotick˘ ‰ok antibiotika lytické enzymy homogenizéry termol˘za chelataãní ãinidla autol˘za mikrofluidizéry ultrazvuk detergenty rozpou‰tûdla hydroxidy Tab 1: Pfiehled metod dezintegrace bunûãn˘ch stûn mikroorganismÛ (Middelberg A. P. J. 1995)

2.1.4.1 Mechanické metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek VyuÏití mechanick˘ch metod k naru‰ení bunûãn˘ch stûn na‰lo uplatnûní v laboratofiích i v prÛmyslu. Intracelulární produkty jsou získávány z mikroorganismÛ mechanick˘m poru‰ením stûn a v‰echny vnitrobunûãné komponenty jsou uvolnûny do média. PoÏadovaná látka poté musí b˘t separována z komplexní smûsi proteinÛ, nukleov˘ch kyselin a fragmentÛ bunûãné stûny. Nejãastûji se vyuÏívají ml˘nky, homogenizátory (Kumar A., Awasthi A. 2009).

2.1.4.2 Fyzikální metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek Rozbíjení bunûk fyzikálními metodami je zpÛsobeno nepfiím˘m pÛsobením na struktury bunûãn˘ch stûn. Pfiíkladem jsou osmotick˘ ‰ok, dekomprese plynÛ a ultrazvuk. (

19

)

Ultrazvuk: Ultrazvukové rozbíjení bunûãn˘ch stûn zahrnuje kavitaci, mikroskopické bublinky nebo kavitaci generovanou tlakov˘mi vlnami. Tvofií se ultrazvukov˘mi vibracemi o vysok˘ch zvukov˘ch frekvencích kolem 20 kH/s. Snímaãe pfievádûjí vlny na mechanické oscilace pomocí titanové sondy ponofiené do koncentrovaného roztoku bunûk. Dochází k velkému v˘vinu tepla, které mÛÏe po‰kodit termolabilní proteiny a jiné bunûãné komponenty, proto je dÛleÏité suspenzi bûhem celého procesu chladit (Kumar A., Awasthi A. 2009). Nev˘hodami této metody jsou vysoká produkce tepla, které musí b˘t odvádûno; hluãnost (nûkteré systémy vyÏadují ochranné pomÛcky na u‰i a ultrazvukové skfiínû); tvorba voln˘ch radikálÛ, které mohou interagovat s ostatními molekulami vzorku (Microfluidics 2004).

2.1.4.3 Chemické metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek VyuÏitím chemick˘ch látek k dezintegraci bunûãn˘ch stûn dochází ke tvorbû kanálkÛ ve stûnách, kter˘mi mohou b˘t následnû extrahovány intracelulární látky. K tûmto úãelÛm lze pouÏít organická rozpou‰tûdla (toluen, éter, chloroform), antibiotika, povrchovû aktivní látky, detergenty (SDS, laurylsarkosin) a chelataãní ãinidla (Kumar A., Awasthi A. 2009). Detergenty: Tyto látky mají amfipatické vlastnosti, coÏ dovoluje jejich interakci jak s vodnou, taki tukovou fází vzorku. Detergenty rozpou‰tûjí lipidy bunûãn˘ch stûn za tvorby micel. Nejãastûji se pouÏívají detergenty SDS, laurylsarkosin. ZpÛsobují denaturaci proteinÛ a problémy pfii následn˘ch pfieãi‰Èovacích krocích (Panesar P. S., Marwaha S. S., Chopra H. K. 2010). Chelataãní ãinidla: PouÏití nejznámûj‰ího chelataãního ãinidla EDTA (ethylenamin kyseliny tetraoctové) pfii izolaci intracelulárních komponent nezávisí na teplotû experimentu, a jeho efektivita se odráÏí na pouÏitém pufru. Doporuãuje se pouÏívat v kombinaci s lytick˘mi enzymy nebo detergenty (Panesar P. S., Marwaha S. S., Chopra H. K. 2010).

2.1.4.4 Enzymatické metody dezintegrace bunûãné stûny kvasinek Existuje celá fiada enzymÛ, které se vyznaãují schopností hydrolyzovat vazby v bunûãn˘ch stûnách mikroorganismÛ. Jsou velmi selektivní, citlivé a efektivní, ale také nákladné (Kumar A., Awasthi A. 2009). Jedná se napfi. o glukanázy, mananázy, chitinázy a lytikázy. Naru‰ení stûn je zpÛsobeno pfiidáním tûchto lytick˘ch enzymÛ k suspenzi bunûk. Pfii dezintegraci bunûãn˘ch stûn kvasinek se nejãastûji vyuÏívá kombinace lytick˘ch enzymÛ spoleãnû s proteinázami pÛsobícími na membránové proteiny (Panesar P. S., Marwaha S. S., Chopra H. K. 2010). Zvolené enzymatické naru‰ení stûn kvasinek a následná izolace produktÛ závisí na druhu pouÏit˘ch mikroorganismÛ, podmínkách pouÏité dezintegrace a vlastnostech izolované látky (Kumar A., Awasthi A. 2009). Nev˘hodami u enzymatick˘ch dezintegrací jsou ne vÏdy zcela reprodukovatelné v˘sledky. Kromû potenciálních problémÛ s nestabilitou enzymÛ, závisí také citlivost bunûk k lytick˘m enzymÛm na stavu kultury. Kvasinky ve stacionární fázi mají tûÏce odstranitelné bunûãné stûny, zatímco v ãasné logaritmické fázi rÛstu jsou mnohem náchylnûj‰í k enzymatické l˘zi stûn. (

20

)

Je také dÛleÏité lytick˘ enzym následnû odstranit ze suspenze nebo alespoÀ inaktivovat (Microfluidics 2004).

2.1.5 Kvasinky a prostfiedí Kvasinky se nacházejí snad v celém pfiírodním ekosystému. V‰udypfiítomná kolonizace je zpÛsobena schopností úãinnû konkurovat jin˘m mikroorganismÛm, které tvofií danou komunitu (Avery S. N., Stratford M., van West P. 2008). ·iroké spektrum druhÛ lze nalézt v pÛdû, vzduchu, sladké i slané vodû, jsou bûÏn˘mi obyvateli rostlin, b˘vají spojovány se zvífiaty i lidmi (Rosa C. A., Péter G. 2006; Walker G. M. 1998). Dovedou soutûÏit se v‰emi ostatními mikroorganismy o dÛleÏité zdroje uvolÀováním extracelulárních enzymÛ do okolí. Jejich ãinnost je ovlivÀována pfievládajícími abiotick˘mi faktory, kter˘mi jsou teplota, dostupnost vody, plynu a rovnováha pH (Avery S. N., Stratford M., van West P. 2008). Podmínky, které panují v tûchto pfiírodních a umûl˘ch místech v˘skytu, urãují metabolickou aktivitu, rÛst a schopnost pfieÏití. Jin˘mi slovy, kvasinky se buì pfiizpÛsobí, nebo zemfiou (Rosa C. A., Péter G. 2006).

2.1.5.1 Vliv prostfiedí na kultivaci kvasinek Jednobunûãné organismy Ïijící volnû v pfiírodû jsou vystavovány zmûnám v prostfiedí, které omezují nebo ohroÏují pfieÏití buÀky. Tyto zmûny se oznaãují jako stresové faktory a mohou b˘t fyzikální, chemické nebo biologické povahy (Hohman S., Mager W. H. 2003; Rosa C. A., Péter G. 2006). Patfií mezi nû zmûny teplot, osmotického tlaku, pH a koncentrace iontÛ vody a rozpu‰tûn˘ch látek, vystavení extrémnímu tlaku, radiaci a toxick˘m látkám, a také oxidaãní a nutriãní stres (Rosa C. A., Péter G. 2006). V pfiírodû mohou b˘t kvasinky vystaveny rÛzn˘m typÛm stresÛ souãasnû nebo postupnû; napfi. oxidaãní stres spoleãnû s nutriãním hladovûním bûhem stacionární fáze rÛstu (Hohman S., Mager W. H. 2003). teplotní stres (heat shock) manozylované membránové proteiny

osmotick˘ stres oxidaãní stres /radiace /po‰kození DNA /v˘Ïiva /hladovûní-drogy /ionty/pH /kyseliny

Hsf

HOG dráha

stresová tolerance

HSE

Hsps

Msn2/4

STRE

Streps Hsp12 Ctt1 Ddr2 Tps2

PKA

metabolizmus glukózy

faktory transkripce, cykliny

Msn2/4 Msn2/4

cAMP

odolnost ke stresu Yap1

H+ -ATPasw

Proteiny teplotního Ub4 ‰oku: UBC Hsp82 Hsp70 Hsp60 Hsp26 Hsp90 Hsp104 M

G1

Cup1 S

oxidaãní stres

Tps2

Arrest in G2

G2 Hsp 30

TIP/TIR/PAU

zásoba (glykogen, trehalóza)

proteozom, programovaná proteol˘za

kontrola proteáz

zpracování RNA, syntéza ribosomÛ

tûÏké kovy

Obr 5: Vliv stresov˘ch faktorÛ na buÀku kvasinky (zdroj: http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol/13%20Signall ing%20and%20Regulatory%20Circuits%20in%20Yeast.pdf) (

21

)

Teplotní stres: Pokud na buÀky pÛsobí teploty vy‰‰í nebo naopak niωí neÏ je optimum pro rÛst, jedná se o teplotní stres. Rozmezí teplotního optima se pro rÛzné druhy kvasinek li‰í (Lepock J. R. a kol. 1997; Piper P. W. 1993). Dobfie prostudované jsou bunûãné reakce na v˘razné zv˘‰ení teplot v prostfiedí známé jako teplotní ‰ok (tzv. heat shock). Jedná se o metabolické reakce organismu, kdy také dochází k pozastavení rÛstu a ke globálním zmûnám v transkripci. Následná genová exprese vyvolaná teplotním ‰okem je pozoruhodnû konzistentní v celé evoluci a jejím primárním cílem je rychlá syntéza tzv. „heat shock“ proteinÛ (Trott A., Morano K. A. 2003). Teplota je jedním z nejdÛleÏitûj‰ích faktorÛ ovlivÀujících rÛst kvasinek. Mikroorganismy jsou charakteristické sv˘m teplotním minimem, optimem a maximem, pfii kterém jsou schopné rÛst. Podle optimálních teplot rÛstu se dûlí mezi psychrofilní, mezofilní a termofilní. Vût‰ina v prÛmyslu a laboratofiích pouÏívan˘ch kvasinek je mezofilní, coÏ znamená, Ïe nejlépe rostou mezi 20-30 °C (Walker G. M. 1998). Oxidaãní stres: V‰echny aerobní organismy jsou vystaveny oxidaãnímu stresu zpÛsobenému pfiítomností reaktivních forem kyslíku (ROS); H2O2, superoxidy, produkty peroxidace lipidÛ. ROS mohou zpÛsobit po‰kození bunûãn˘ch sloÏek – lipidÛ, DNA a proteinÛ. Proto si jednotlivé buÀky vyvinuly ochranné adaptivní reakce pÛsobící proti oxidaãním stresÛm, jenÏ mohou b˘t regulovány na úrovni transkripce (Jamieson D. J. 1998). Napfi. kvasinka Saccharomyces cerevisce se vyznaãuje fiadou detoxikaãních enzymÛ pÛsobících proti ROS. Jedná se o katalázy, cytochrom c-peroxidázu, glutationperoxidázu apod. (Demasi A. P. D. a kol. 2006). pH prostfiedí: pH ovlivÀuje mikrobiální rÛst a urãuje, jak˘ organismus v daném prostfiedí pfieÏije. Extracelulární pH je signálem pro mikrobiální chování vÛãi prostfiedí, zatímco intracelulární pH ovlivÀuje enzymovou aktivitu, reakãní rychlosti, stabilitu bílkovin a strukturu nukleov˘ch kyselin. Teoreticky lze fiíci, Ïe kaÏdá molekula buÀky je tzv. pH senzorem (S∏onczewski J. L. 2009). Vût‰ina kvasinek roste velmi dobfie v rozmezí pH 4,5-6,5. Vût‰ina druhÛ je schopna rÛst i v men‰ím rozsahu pH ve více kyselé nebo zásadité oblasti (Walker G. M. 1998). Osmotick˘ a soln˘ stres: Nejznámûj‰ím stresov˘m faktorem kvasinek je zmûna osmotického tlaku. Pokud jsou buÀky vystaveny osmotickému ‰oku, pfiichází o bunûãnou vodu pasivní difúzí (Häussinger D., Sies H. 2007). PÛsobením hyperosmotického stresu dojde ke ztrátû turgoru a objemu buÀky. Nastanou zmûny v genové expresi a, pozastaví se rÛst, a to aÏ do ukonãení celkové fyziologické adaptace na nastalé zmûny (Klipp E. a kol. 2005). BuÀky kvasinek si vyvinuly obranné mechanismy zabraÀující tûmto ztrátám. Jedná se o rÛzné typy dlouhodobé transkripãní a translaãní genové regulace a také o krátkodobé adaptace spojené s akumulací glycerolu (Häussinger D., Sies H. 2007). Vystavení bunûk kvasinek solnému stresu vede jednak k osmotickému stresu a také ke vzniku specifické kationové toxicity. RÛzné ionty napfi. Na+ a Li+ jsou vÛãi buÀkám toxické vzhledem k jejich schopnostem inhibovat specifické metabolické dráhy (Posas F. a kol. 2000). V laboratorních podmínkách b˘vá osmotick˘ stres nejãastûji vyvoláván pfiídavkem NaCl do kultivaãního média. Kromû osmotického stresu je vyvolán také soln˘ stres jiÏ zmínûnou toxicitou Na+ iontÛ (Hohmann S., Mager W. H. 2003, Hohmann S. 2002). (

22

)

2.1.5.2 Nutriãní poÏadavky a nutriãní stres Kvasinky vyÏadují pro zachování Ïivotních funkcí a rÛstu zdroje uhlíku, dusíku, minerálních solí, urãit˘ch vitamínÛ a rÛstov˘ch faktorÛ (Rosa C. A., Péter G. 2006). Pochopení, jak˘m zpÛsobem je uskuteãnûn pfienos vody, esenciálních organick˘ch a anorganick˘ch Ïivin z kultivaãního prostfiedí do bunûk kvasinek pfies bunûãnou stûnu a membránu, je klíãem k interakci kvasinek a jejich komunikaci s prostfiedím. To v‰e lze vyuÏít pro úspû‰nou kultivaci nejen v laboratorních podmínkách, ale také pfii prÛmyslové fermentaci (Walker G. M. 1998). Jedním z nejdÛleÏitûj‰ích ekologick˘ch faktorÛ pro urãení specifiãnosti v˘skytu kvasinek jsou rozdíly ve schopnostech vyuÏít rÛzné druhy Ïivin (Rosa C. A., Péter G. 2006). NejvyuÏívanûj‰ím zdrojem uhlíku a energie jsou uhlovodíky, a to hlavnû cukry (hexózy a oligosacharidy). Glukóza a ostatní jednoduché cukry (maltóza, laktóza, sacharóza aj.) mohou b˘t vyuÏívány fermentaãnû a oxidaãnû. Ostatní zdroje uhlíku (alkoholy, organické kyseliny) mohou b˘t metabolizovány pouze aerobní respirací (Rosa C. A., Péter G. 2006; Walker G. M. 1998). Pfiedpokládá se, Ïe asi polovina doposud znám˘ch druhÛ kvasinek nemá dostateãnou schopnost fermentace a vyuÏívá tedy v˘hradnû aerobní metabolismus. Ov‰em ani fermentaãní druhy kvasinek nemohou neustále pfieÏívat pouze v nepfiítomnosti kyslíku, neboÈ nûkteré souãásti membránov˘ch lipidÛ mohou b˘t syntetizovány pouze aerobnû (Rosa C. A., Péter G. 2006). V‰echny typy bunûk, dokonce i jednotlivé buÀky ve vícebunûãn˘ch organismech, se vyznaãují schopností reagovat na zmûny ve svém prostfiedí. To ov‰em vyÏaduje komplexní snímání a pfienos signálÛ k pfiizpÛsobení bunûãného rÛstu, úpravy genové exprese, metabolick˘ch aktivit a dal‰ích vlastností bunûk. V‰echny vlivy prostfiedí, které ohrozí pfieÏití bunûk, nebo alespoÀ zabrání optimálním podmínkám jejich existence, se oznaãují jako bunûãn˘ stres (Hohman S., Mager W. H. 2003). Mikroorganismy mají schopnost rozvíjet se i ve zdánlivû pustém a nepfiíznivém prostfiedí za tzv. nutriãních stresov˘ch podmínek. Tûmi mohou b˘t omezení Ïivin a hladovûní (Hohman S., Mager W. H. 2003). Vzhledem k tomu, Ïe se kvasinky vyznaãují schopností vyuÏívat ‰irokou ‰kálu substrátÛ jako zdroje Ïivin, lze nedostupnost jednoho druhu Ïivin vykompenzovat vyuÏitím jiného. Reakce na nedostatek nutriãních zásob b˘vá ãasto doprovázena metabolick˘m pfiechodem od bohat‰ích k chud‰ím zdrojÛm Ïivin. K tomuto procesu hladovûní musí b˘t aktivovány specifické signální metabolické dráhy (Hohman S., Mager W. H. 2003; Gash A. P., Werner-Washburne M. 2002).

2.1.6 Kultivace kvasinek JelikoÏ patfií kvasinky mezi fakultativní mikroorganismy, mohou rÛst jak za aerobních tak i za anaerobních podmínek, pokud mají dostateãnou zásobu metabolizovateln˘ch substrátÛ. Kultivaãní média se pfiipravují kapalná nebo pevná s pfiídavkem agaru (Kirsop B. E., Kurtzman C. P. 1988). Bliωí zkoumání morfologie, fyziologie a genetiky mikroorganismÛ bylo umoÏnûno vyvinutím rÛzn˘ch kultivaãních technik vyuÏiteln˘ch v laboratorních podmínkách (Talaro K. P. 2007). Pro úspû‰nou kultivaci musí b˘t mikroorganismy v médiích o obsahu v‰ech potfiebn˘ch Ïivin (Walker G. M. 1998; Talaro K. P. 2007). Mikroorganismy se sv˘mi nutriãními poÏadavky li‰í, a to od jednoduch˘ch anorganick˘ch aÏ po komplexní anorganické i organické slouãeniny. (

23

)

Pfii kultivacích je nyní pouÏíváno více neÏ 500 druhÛ rÛzn˘ch médií. Je také dÛleÏité dodrÏovat striktní sterilní podmínky, aby se zabránilo neÏádoucím kontaminacím (Walker G. M. 1998; Talaro K. P. 2007). Kultury mezofilních basidiomycet, mezi které patfií i karotenogenní kvasinky, se nejãastûji inkubují pfii teplotách mezi 20-25 °C. Zdrojem uhlíku a energie b˘vá nejãastûji glukóza. Ty druhy kvasinek, které dovedou utilizovat i jiné zdroje uhlíku (alkany, rozvûtvené alkany, aromatické a cyklické alkany), jsou dÛleÏité pro odbourávání tûchto látek v pfiírodû, kde by jinak zatûÏovaly Ïivotní prostfiedí. VyuÏívají se v bioremediaci, biokatal˘ze nebo v technologiích ãi‰tûní odpadních vod (Satyanarayana T., Kunze G. 2009).

2.1.7 RÛst kvasinek RÛst kvasinek závisí na zisku Ïivin, jejich následném vstfiebání a integraci funkãních komponent v buÀce za úãelem zv˘‰ení bunûãné hmotnosti a poãtu jedincÛ (Walker G. M. 1998). Jakmile mají mikroorganismy v prostfiedí k dispozici potfiebné Ïiviny, stávají se metabolicky aktivními a zaãínají rÛst. BuÀky syntetizují nové komponenty, ãímÏ se zvût‰ují a zároveÀ dochází k nárÛstu populace (Talaro K. P. 2007). Ke grafickému znázornûní poãtu Ïivotaschopn˘ch jedincÛ v závislosti na ãase slouÏí tzv. rÛstová kfiivka (·ilhánková L. 2002), která je charakteristická nûkolika fázemi rÛstu (Walker G. M. 1998). První fáze je pfiípravná tzv. lag fáze s nulovou rÛstovou rychlostí. Zahrnuje ãas potfiebn˘ pro inokulum k pfiizpÛsobení se na nové fyzikální a chemické podmínky v prostfiedí (Walker G. M.). BuÀky se nerozmnoÏují, pouze zvût‰ují svÛj objem a dochází k aktivaci a syntéze enzymÛ potfiebn˘ch k rÛstu (·ilhánková L. 2002, Walker G. M. 1998). Lag fáze nastává pfii vystavení inokula zmûnám ve v˘Ïivû nebo fyzikálních podmínkách rÛstu (Walker G. M. 1998). Doba trvání závisí na druzích mikroorganismÛ, fyziologickém stavu bunûk, velikosti inokula a na sloÏení nového rÛstového prostfiedí (·ilhánková L. 2002). Jakmile jsou kvasinky schopné aktivního bunûãného dûlení, pfiecházejí do fáze urychleného rÛstu následovaného fází exponenciální. V exponenciální fázi se buÀky vyznaãují konstantní generaãní dobou a maximální rÛstovou rychlostí (Walker G. M. 1998). Délka exponenciální fáze závisí na rychlosti vyãerpání esenciálních prvkÛ, akumulaci rÛstov˘ch inhibitorÛ a nadmûrné flokulaci bunûk (Walker G. M. 1998). Po fázi exponenciální je rychlost rÛstu nov˘ch bunûk postupnû zpomalována dokud nedosáhne nuly a systém následnû pfiejde do stacionární fáze s konstantní akumulací kvasinkové biomasy. BuÀky jsou po tento ãas schopné i dlouhodobû pfieÏít bez pfiísunu Ïivin. Pfiechod kvasinek do stacionární fáze rÛstu, kromû limitace Ïivinami, mohou urychlit i nûkteré dal‰í fyziologické pfiíãiny. Patfií sem napfi. toxické metabolity, nízké pH, promûnlivost v pfiítomném mnoÏství kyslíku nebo vysoká teplota (Walker G. M. 1998).

(

24

)

4

5

ln x

6 3

1 2 τ Obr. 6: RÛstová kfiivka (Walker G. M. 1998) Poslední fáze je charakteristická odumíráním bunûk v dÛsledku vyãerpání Ïivin a nahromadûním odpadních látek (Talaro K. P. 2007). V závislosti na druhu mikroorganismÛ mÛÏe trvat t˘dny nebo i mûsíce (·ilhánková L. 2002).

2.1.8 Metabolismus kvasinek V kaÏdém Ïivém organismu dochází enzymaticky fiízen˘mi chemick˘mi reakcemi k syntéze (anabolismus) a rozkladu (katabolismus) látek. Cukry, aminokyseliny, nukleotidy a polymery z nich odvozené jsou syntetizované a vyuÏívané podobn˘mi cestami. Jedná se o základní, tzv. primární metabolismus. Slouãeniny zde vznikající jsou nezbytné pro pfieÏití a dobré fungování organismu a oznaãují se primárními metabolity (Mann J. 2005). Tvofií se bûhem aktivního rÛstu (logaritmická fáze) mikroorganismÛ (Balachandar D., Vendan R. T. 2007).

2.1.8.1 Sekundární metabolity Látky s ãasto odli‰n˘mi strukturami neÏ primární metabolity, pfiestoÏe jsou z nich vyrobeny, nejsou pro rÛst kultury nezbytné. Naz˘vají se sekundárními metabolity a jejich funkcí je nejãastûji zaji‰tûní pfieÏití organismÛ v pfiírodû (Chadwick D. J., Whelan J. 1992). Sekundární metabolity se tvofií ke konci aktivního rÛstu nebo na zaãátku stacionární fáze. Zmûnami v kultivaãních podmínkách a ve vlastnostech pouÏit˘ch mikrobiálních kmenÛ lze dosáhnout nadprodukce sekundárních metabolitÛ, zatímco nadprodukce primárních metabolitÛ je obtíÏná (Balachandar D., Vendan R. T. 2007). Oba typy metabolismÛ jsou navzájem propojeny, neboÈ nûkteré produkty primárního metabolismu slouÏí za substráty v sekundárních metabolick˘ch drahách (Mann J. 2005). Systém rychlé a vãasné produkce sekundárních metabolitÛ by dokonce mohl b˘t jedním ze zpÛsobÛ, kter˘m kvasinky mohou zachovávat konkurenãní v˘hodu (Avery S. N., Stratford M., Van West P. 2008). Mikrobiální sekundární metabolity zahrnují antibiotika, pigmenty (karotenoidy), toxiny, inhibitory enzymÛ aj. Jejich syntéza je regulována rÛstovou rychlostí, Ïivinami, indukcí a inaktivací enzymÛ. Samotné syntézy b˘vají ãasto kódovány geny v chromozomální DNA a zfiídka také plastidovou DNA (Chadwick D. J., Whelan J. 1992). (

25

)

hmotnost bunûk (mg/ml)

30

rÛst

A-faktor

20

sekundární metabolismus

10

10

produkce A-faktor (ng/ml)

první log-fáze druhá log-fáze 20

0 0

24

48

72

doba kultivace (h) Obr. 7: Produkce sekundárních metabolitÛ bûhem rÛstu mikroorganismÛ (zdroj http://www.bioscience.org/2002/v7/d/horinouc/fulltext.asp?bframe=figures.htm&doi=yes)

2.1.9 Mutageneze kvasinek Základním principem mutace u mikroorganismÛ je dostateãnû dlouh˘ kontakt s mutagenem. Nejlep‰í metodou zavádûní mutací do genomu je pouÏít mutageny charakteristické vysokou frekvencí mutací a nízkou úmrtností organismu, kter˘ je tûmto mutacím vystaven˘ (Xiao W. 2006). Kvasinky disponují ideálními vlastnostmi ke studiu mutageneze. Unicelulární buÀky rychle rostou v koloniích o velké geneticky homogenní populaci, coÏ je nezbytné pro studium genetick˘ch zmûn a anal˘zu indukovan˘ch mutantÛ. V˘hodou je moÏnosti aplikace v˘sledkÛ získan˘ch u genetick˘ch experimentÛ s kvasinkami na vy‰‰í organismy, coÏ je moÏné porovnávat díky podobné organizaci eukaryotick˘ch bunûk. Jedním z hlavních cílÛ v˘zkumu mutací je pochopení zmûn u molekul DNA, které jsou základem dûdiãn˘ch zmûn fenotypu (Prescott D. M. 1975). Mutace mikrobiálních kmenÛ mohou vézt ke zlep‰ení nûkter˘ch vlastností pfii souãasném oslabení jin˘ch. Jejich prostfiednictvím mÛÏe dojít ke zmûnám v genetické konstituci. Jde o zmûny trvalé a pfienosné do dal‰ích generací. Mutace jsou obvykle zpÛsobené chybami pfii kopírování genetického materiálu bûhem bunûãného dûlení (Soni S. K. 2007) a pfii vystavení bunûk fyzikálním, chemick˘m (Evans I. H. 1996) nebo biologick˘m (Soni S. K. 2007) faktorÛm. Nejfrekventovanûj‰ími mutacemi in vivo jsou substituce, posuny, delece nebo pfiestavba v párech bazí (Xiao W. 2006). Pokud se nejedná o mutace dominantní, není lehké je v mikrobiálních kulturách detekovat vzhledem k pfiítomnosti i nezmutovan˘ch alel. Mutace jsou povaÏovány za hnací sílu evoluce, kdy ty ménû pfiíznivé nebo ‰kodlivé jsou odstranûny od genetického fondu pfiirozen˘m v˘bûrem, zatímco ty pfiíznivé mají tendenci se hromadit. Neutrální mutace nemají Ïádn˘ vliv na pfieÏití organismÛ v pfiírodû, mohou se pouze hromadit bûhem evoluãního v˘voje (Soni S. K. 2007). (

26

)

2.1.9.1 Mutageny Volba správného mutagenu závisí na pouÏitém kmenu kvasinek a druhu mutací, které mají zpÛsobovat. DNA mutace b˘vají zpÛsobené faktory fyzikálními – UV záfiení, ionizaãní záfiení, RTG záfiení a chemick˘mi – alkylaãní ãinidla, analogy bází, deaminaãní ãinidla (Evans I. H. 1996). NejpouÏívanûj‰ími alkylaãními ãinidly jsou N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanin (MNNG), methylester kyseliny methansulfonové (MMS) a ethylester kyseliny methansulfonové (EMS) (Xiao W. 2006). Alkylaãní ãinidla jsou elektrofilní slouãeniny, které reagují s makromolekulami pomocí donorov˘ch alkylaãních skupin. Navazují se na báze nukleofilní substitucí SN1 a SN2 pfies vazebná místa kyslíku nebo dusíku genomové DNA. Mohou vézt k naru‰ení ‰roubovice DNA, brání replikaci a transkripci, ãasto zpÛsobují zaãlenûní chybného páru bází. EMS reaguje s molekulou DNA pfiedev‰ím prostfiednictvím SN2 reakcí, coÏ vede primárnû k substitucím u párÛ bází (Xiao W. 2006). EMS navazuje na báze u DNA ethylové skupiny, ãímÏ se mohou zmûnit párovací vlastnosti jednotliv˘ch bází nebo deformovat molekula DNA (Hartl D. L., Jones E. W. 2009). Pfiednostnû dochází k alkylaci guaninu, coÏ zpÛsobí jeho navázání na thymin místo cytosinu a pfii replikaci dojde k zámûnû jednotliv˘ch párÛ bází v sekvenci molekuly DNA (Upadhyaya N. M. 2007). Pfiemûny v jednotliv˘ch párech bází mohou vyvolat zmûny u alel a fenotypu, jejichÏ identifikace v DNA vyÏaduje zdlouhav˘ proces mapování (Sensen Ch. W. 2002).

2.1.9.2 Mutace malého rozsahu Mutace malého rozsahu se t˘kají jednoho nebo nûkolika nukleotidÛ. Mohou b˘t bodové nebo zpÛsobit posun ãtecího rámce vlákna DNA. Bodové mutace jsou ãasto zpÛsobeny chemikáliemi nebo pfii chybné replikaci DNA, dochází zde k v˘mûnû jednoho nukleotidu za jin˘. Nejãastûji dochází k v˘mûnû purin-purin nebo pyrimidin-pyrimidin (A↔G, C↔T), ménû ãasto dochází k v˘mûnám purin-pyrimidin (C/T↔A/G). Bodové mutace mohou b˘t vratné v pfiípadû, kdy jiná bodová mutace zpÛsobí v˘mûnu nukleotidu do pÛvodního stavu; nebo pokud doplÀující mutace zapfiíãiní získání pÛvodní funkce genu (Soni S. K. 2007). Bodové mutace mohou b˘t tiché (nedojde ke zmûnû aminokyseliny), dávající smysl (zaãlenûní jiné aminokyseliny) nebo nesmyslné (dojde ke zkrácení proteinu). Pfii mutacích v posunu ãtecího rámce dochází k inserci nebo deleci jednoho ãi více nukleotidÛ nejãastûji bûhem replikace (Soni S. K. 2007).

2.1.9.3 Mutace velkého rozsahu Pfii mutacích velkého rozsahu dochází ke zmûnám ve struktufie chromosomÛ, které zahrnují amplifikaci nebo duplikaci genÛ, deleci vût‰ích úsekÛ chromosomÛ, chromosomální translokace, intersticiální deleci ãásti DNA z jednoho chromosomu, pfiepnutí orientace chromosomu, ztrátu jedné z alel delecí nebo rekombinancí (Soni S. K. 2007). Zmûny v genomu mohou b˘t vyvolané faktory Ïivotního prostfiedí (UV záfiení, jaderné záfiení, chemikálie), coÏ mÛÏe vyústit aÏ v po‰kození DNA na úrovni fiízení genové exprese nebo v pofiadí genÛ, takÏe bûÏné pohlavní rozmnoÏování jiÏ nebude moÏné (Soni S. K. 2007). (

27

)

2.1.9.4 Oprava po‰kozené DNA Aãkoliv je DNA pfiirozenû rezistentní vÛãi promûnám prostfiedí a jeví se jako stabilní, na primární úrovni podléhá neustál˘m zmûnám nejãastûji v dÛsledku chyb pfii replikaci, rekombinaci a opravám (Friedberg E. C., Walker G. C., Siede W. 1995). I pfii pÛsobení mutagenÛ na buÀky kvasinek mÛÏe dojít k opravám na úrovni DNA, coÏ mÛÏe vést k tomu, Ïe se pfiedpokládaná mutace ani neprojeví. Tento paradox je zpÛsoben tím, Ïe opravn˘ aparát DNA je nouzovû vyvolan˘m mechanismem. Ten se vyvinul na odstanûní mutací, které by mohly zpÛsobit smrt buÀky. Napfi. pfii vystavení kvasinek pÛsobení UV záfiení dojde sice ke tvorbû thymidinového dimeru, coÏ povede k zastavení replikace. Pfii následné opravû DNA bude dimer odstanûn fotoreakcí za pÛsobení enzymÛ vyuÏívajících viditelnou oblast svûtla a replikace bude opût spu‰tûna (Soni S. K. 2007). Pfii vystavení kvasinek rodu Saccharomyces pÛsobení alkylaãního ãinidla EMS, do‰lo u bunûk k extracelulárnímu respiraãnímu deficientu. V˘sledky proveden˘ch experimentÛ poukazují na rÛzné uspofiádání kvasinkové DNA v jádfie a mitochondriích, coÏ pravdûpodobnû naznaãuje moÏn˘ vliv opravy mechanizmÛ pfii indukci mutace zpÛsobující d˘chací deficit (Sereih N. A. A. a kol. 2011).

2.2 Karotenogenní kvasinky Eukaryotní kvasinky schopné produkovat Ïluté aÏ ãervené pigmenty patfií mezi basidiomycety. Odhaduje se, Ïe dodnes bylo popsáno pouze 1 % zástupcÛ tohoto typu, a to jak pigmentotvorn˘ch tak nepigmentotvorn˘ch (Weber R. W. S., Anke H., Davoli P. 2007). Znám˘mi producenty karotenoidÛ jsou kvasinky rodÛ Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Cystofilobasidium a Phaffia. Hlavními produkovan˘mi pigmenty jsou β-karoten, γ-karoten, torulen, torularhodin a astaxanthin (Dufossé L. 2006).

2.2.1 Rod Rhodotorula Kvasinky rodu Rhodotorula zahrnují nûkolik druhÛ. Jsou to Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, Rhodotorula mucilaginosa nebo R.aurantiaca (de Hoog G. S. a kol. 2001). Kvasinky jsou velmi roz‰ífiené v pfiírodû a syntetizují nejen β-karoten, ale také torularhodin kter˘ je produkován po vystavení kvasinek oxidaãním stresÛm (Sakaki H. a kol. 2000). RozmnoÏují se vegetativnû. Tvofií oranÏové, ãervené, Ïluté nebo bledé kolonie. BuÀky jsou kulaté, elipsoidní, mohou b˘t prodlouÏené a puãí na pólech. Nemají fermentaãní vlastnosti (Kurtzman C. P., Fell J. W. 1998). Kvasinka Rhodotorula glutinis je schopná rÛst na rÛzn˘ch odpadních substrátech pocházejících ze zemûdûlsk˘ch v˘rob (syrovátka, cukrová tfitina, fiepná melasa, hroznov˘ mo‰t apod), coÏ je potenciálnû vyuÏitelné v prÛmyslu pro produkci karotenoidÛ (Malisorn C., Suntornsuk W. 2008). Nûkteré druhy rhodotorul dovedou degradovat rÛzné organické slouãeniny a mohou tedy najít uplatnûní v bioremediaci (Satyanarayana T., Kunze G. 2009).

(

28

)

Obr. 8: Nátûr na Petriho misce kvasinky Rhodotorula

2.2.2 Rod Sporobolomyces Rod Sporobolomyces zahrnuje kolem 20 druhÛ kvasinek, z nichÏ nejznámûj‰ími jsou Sporobolomyces roseus, Sporobolomyces salmonicolor a Sporobolomyces shibatanus (de Hoog G. S. a kol. 2001). RozmnoÏují se vegetativnû, tvofií rÛÏové, oranÏové, ãervené, naÏloutlé nebo bledé kolonie. BuÀky jsou kulaté, elipsoidní nebo cylindrické a obvykle puãí na pólech. Nemá fermentaãní vlastnosti (Kurtzman C. P., Fell J. W. 1998). Sporobolomyces roseus produkuje β-karoten, torulen a torularhodin (Davoli P., Weber R. W. S. 2002). Zv˘‰ená produkce torularhodinu byla pozorována pfii vystavení této kvasinky stresov˘m faktorÛm, a lze tedy pfiedpokládat, Ïe tímto smûrem by se mohla ubírat biosyntéza jednotliv˘ch karotenoidÛ (Davoli P. a kol. 2004). Sporobolomyces salmonicolor tvofií lososovû rÛÏové kolonie li‰ící se od kvasinek Rhodotorula spp. produkcí balistokonidií na velk˘ch sterigmatech, které byly identifikovány jako pfiíãiny infekcí u pacientÛ s AIDS (Satyanarayana T., Kunze G. 2009).

Obr. 9: Nátûr na Petriho misce kvasinky Sporobolomyces

(

29

)

2.2.3 Rod Cystofilobasidium Zafiazení heterobasidiomycet produkujících teliospóry do speciálního kvasinkového rodu Cystofilobasidium, místo dfiíve pouÏívané tfiídy Rhodosporidium, bylo provedeno vzhledem k nûkter˘m jejich odli‰nostem. Zástupci Cystofilobasidium se vyznaãují tvorbou filobazídií, coÏ jsou holobazídia s úzkou centrální oblastí a zvût‰en˘m vrcholem. zatímco u rodu Rhodosporidium jsou bazídia trubkovitû pfiíãná. V souãasné dobû rod Cystofilobasidium zahrnuje ãtyfii kvasinkové druhy, tfii jsou oranÏovû zabarvené (C. bisporidi, C. capitatum, C. informominiatum) a jeden krémov˘ (C. ferigula). C. capitatum byl oznaãen za synonymum pro C. lari-marini (Sampaio J. P., Gadanho M., Bauer R. 2001). V‰echny tyto ãtyfii druhy obsahují xylózu v bunûãné stûnû, dovedou utilizovat glukuronát a produkují ‰krobu podobné látky, u C. lari-marini byly pozorovány fermentaãní schopnosti (Fell W. J., Roeijmans H., Boekhout T. 1999).

Obr. 10: Nátûr na Petriho misce kvasinky Cystofilobasidium

2.2.4 Rod Phaffia âervená kvasinka Phaffia rhodozyma je hlavním producentem astaxanthinu (Andrewes A. G. a kol. 1976), kter˘ se akumuluje v kapiãkách lipidÛ cytoplazmatické membrány (Johnson E. A., An G. H. 1991) a slouÏí jako ochrana proti reaktivním kyslíkov˘m radikálÛm, které mohou vyvolat po‰kození DNA a oxidaci proteinÛ (Schroeder W. A., Johnson E. A. 1993). RozmnoÏuje se vegetativnû a tvofií oranÏové kolonie. BuÀky jsou elipsoidní (Kurtzman C. P., Fell J. W. 1998). DokáÏe rÛst na rÛzn˘ch zdrojích uhlíku napfi. glukóza, maltóza, sacharóza, xylóza, laktóza.(Johnson E. A., An G. H. 1991). Byly provedeny také experimenty s kultivací na médiích obsahujících rostlinné nebo ovocné ‰Èávy (Okagbue R. N., Lewis M. J. 1984; Meyer P. S., du Preez J. C. 1994), vedlej‰í produkty po mletí kukufiice (Hayman G. T. a kol. 1995) nebo kyselé hydrolyzáty ligninocelulózov˘ch materiálÛ (Martin A. M. a kol. 1992).

(

30

)

Obr. 11: Nátûr na Petriho misce kvasinky Phaffia

2.3 Karotenoidy Karotenoidy jsou ze v‰ech pigmentÛ v pfiírodû tûmi nejroz‰ífienûj‰ími a nejzajímavûj‰ími (Britton, G., Liaaen-Jensen, S., Pfander, H. 1998), vyskytují se ve Ïluté, oranÏové a ãervené barvû (Aksu, Z., Eren, A. T. 2007). Jsou produkovány fiadou bakterií, kvasinek, vláknit˘mi houbami, fiasami, rostlinami a vy‰‰ími organismy (Buzzini P. a kol. 2005). JiÏ v roce 1831 Wackenroder izoloval karoteny z mrkve (Daucus carota), ãímÏ si tyto slouãeniny vyslouÏily své jméno. O ‰est let pozdûji, roku 1837, Berzelius pojmenoval Ïlut˘ pigment podzimního listí jako xantofyl. Tyto dva velké objevy byly poãátkem v˘zkumu karotenoidÛ (Britton, G., Liaaen-Jensen, S., Pfander, H. 1998). Jsou to vysoce hydrofobní slouãeniny a proto se nacházejí zejména ve spojení s lipidy nebo hydrofobními strukturami – membránami (Britton G. A kol. 2008). Kromû toho, Ïe se jedná o metabolické prekurzory vitamínÛ a hormonÛ, plní karotenoidy rÛzné biologické a fyziologické funkce v Ïiv˘ch organismech (ochrana pfied svûtlem a oxidaãními ãinidly, fotosyntéza.). Byly prokázány jejich antioxidaãní vlastnosti a pozitivní úãinky v prevenci proti nûkter˘m formám rakoviny (Buzzini P. a kol. 2005). V souãasné dobû roste zájem o mikrobiální produkci karotenoidÛ, a to i pfies dostupnost tûchto pigmentÛ v pfiírodních rostlinn˘ch zdrojích. Mikroorganismy jsou schopné vyprodukovat nûkolik typÛ karotenoidních barviv jako odezvu na podnûty z prostfiedí. Mikrobiální produkce je také ve srovnání s chemickou syntézou nebo extrakcí z pfiírodních zdrojÛ v˘hodnûj‰í vzhledem k sezónní a zemûpisné dostupnosti (âertík M. a kol. 2009).

(

31

)

CH 3 CH 3

CH 3

CH 3

H 3C

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3

Obr. 12: β-karoten

2.3.1 Vlastnosti karotenoidÛ Karotenoidy jsou tetraterpeny skládající se z nenasycen˘ch izoprenov˘ch derivátÛ (Aksu Z., Eren A. T. 2007). Mohou b˘t lineární, nebo na jednom i obou koncích molekuly cyklické (Hirschberg J. 1999). Absorpãní vlastnosti karotenoidÛ a jejich zbarvení jsou dány fietûzcem konjugovan˘ch dvojn˘ch vazeb v molekule (Britton G. 1995). I kdyÏ se intenzita absorpãního maxima a vlnová délka mohou u rÛzn˘ch druhÛ karotenoidÛ li‰it, celkové UV spektrum b˘vá obvykle zachováno a je snadno rozpoznatelné, coÏ umoÏÀuje snadnou identifikaci tûchto pigmentÛ (Davoli P., Weber R. W. S. 2002). Vzhledem k vût‰ímu poãtu dvojn˘ch vazeb v molekule, podléhají karotenoidy snadno oxidaci. Musí b˘t proto bûhem manipulace chránûny pfied svûtlem, teplem, kyslíkem a kyselinami, aby nedo‰lo k jejich degradaci (Britton G. 1995).

2.3.2 Biosyntéza karotenoidÛ Doposud bylo identifikováno více neÏ 600 druhÛ karotenoidÛ, ale pouze nûkteré z nich jsou vyuÏívány prÛmyslovû (Verdoes J. C. a kol. 2003). Jsou to napfi. lykopen, β-karoten, astaxanthin, které na‰ly uplatnûní ve farmacii, kosmetice, jako potravináfiská barviva a pfiídavky do krmn˘ch smûsí (Johnson E. A., Schroeder W. A. 1996). Obrovské mnoÏství derivátÛ karotenoidÛ v pfiírodû je dáno biosyntetickou dráhou, která byla prokázána u vy‰‰ích rostlin, fias, nûkter˘ch bakterií a kvasinek (Kaiser P. a kol. 2007). Biosyntéza vychází z centrální isoprenoidové dráhy, která také slouÏí pro syntézu terpenÛ, skvalenÛ a fytolÛ (Hirschberg J. 1999). Poãínaje jednoduch˘mi slouãeninami acetyl-CoA, glyceraldehyd-3-fosfátem a pyruvátem, které vznikají centrálními metabolick˘mi dráhami, je klíãov˘m meziproduktem isopentenyldifosfát (IPP). Ten je poté bakteriemi, houbami, rostlinami a zvífiaty pfieveden na rÛzné pfiírodní produkty (âertík M. a kol. 2009). U kvasinek biosyntéza karotenoidÛ probíhá pfies metabolickou dráhu mevalonátu. Prvním dÛleÏit˘m krokem je konverze acetyl-CoA na 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) za katal˘zy HMG-CoA syntázy (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009). HMG-CoA je poté redukován na kyselinu mevalonovou. Redukce HMG-CoA na mevalonát je stûÏejním a regulaãním krokem pfii syntéze sterolÛ (Metzler D. E., Metzler C. M. 2003). Pfied samotnou syntézou polyprenylÛ je nutné, aby jedna molekula isopentenyldifosfátu byla izomerizována na dimethylallyldifosfát. Kondenzací jedné molekuly dimethylallyldifosfátu (DMADP) a tfií molekul isopentenyldifosfátu (IDP) vznikne diterpen geranylgeranyl difosfát (GGDP), kter˘ tvofií polovinu v‰ech (

32

)

karotenoidÛ C40. Kondenzací hlava-hlava dvou molekul GGDP vzniká první bezbarv˘ karotenoid fytoen. Následn˘mi desaturaãními reakcemi dochází ke zvy‰ování poãtu konjugovan˘ch dvojn˘ch vazeb a produkci neurosporenu nebo lykopenu. Dal‰ími desaturaãními reakcemi vznikají ostatní karotenoidy buìto acyklické nebo cyklické. Syntéza cyklick˘ch karotenoidÛ mÛÏe probíhat na jednom nebo obou koncích molekuly lykopenu nebo neurosporenu (Schmidt-Dannert C. 2000).

crtE crtB

crtE, GGDP syntáza crtB, Fytoen syntáza

Fytoen crtl

crtl, Fytoen desaturáza crtY, Lykopen cykláza

Fytofluen crtl

ζ -karoten

crtY

crtl

Neurosporen

crtY

Dihydro- β -zeakaroten

Tetrahydro-β -karoten

β -Zeakaroten

Dihydro- β -karoten

crtl

Lykopen

crtY

l14

3,4-Dodehydrolykopen l14

β,ψ -karoten

Y2

3,4,3’,4’-Tetradehydrolykopen

β,β -karoten

Torulen Cyklické xantofyly

Acyklické xantofyly

Obr. 13: Biosyntéza karotenoidÛ (zdroj http://www.nature.com/nature/journal/v409/n6817/fig_tab/409253a0_ F3.html)

2.3.2.1 Regulaãní enzymy biosyntézy karotenoidÛ V souãasnosti je známo více neÏ 150 crt genÛ kódujících asi 24 enzymÛ karotenoidní dráhy. Geny byly izolovány z bakterií, rostlin, fias a hub (Hirschberg J. a kol. 1997). Tyto geny lze vyuÏít k produkci karotenoidÛ pomocí rekombinantních mikroorganismÛ. Kompletní biosyntetické dráhy karotenoidÛ byly charakterizovány u bakterií Rhodobacter a Erwinia, ve kter˘ch jsou crt geny pfiítomny ve formû klastrÛ (âertík M. a kol. 2009). Syntéza fytoenu je zakódována v úzce asociovan˘ch bakteriálních crtB a eukaryotních psy genech. Základním kofaktorem je ATP v kombinaci s Mn2+ nebo Mg2+ ionty. Inhibice syntézy fytoenu je zpÛsobena napfi. ionty fosfátu (âertík M. a kol. 2009). Lykopen-β-cykláza, katalyzující tvorbu β-kruhu, byla naklonována z bakterií a rostlin (Schmidt-Dannert C. 2000). Zaãlenûním crt genÛ do nov˘ch biosyntetick˘ch drah lze roz‰ífiit ‰kálu strukturálnû rÛznorod˘ch karotenoidÛ získan˘ch pomocí rekombinantních mikroorganismÛ. Pfiedpokladem k tûmto syntézám je kooperace crt genÛ z rÛzn˘ch druhÛ s heterogenním hostitelem (Schmidt-Dannert (

33

)

C. 2000). Mezi jiÏ charakterizované geny, které jsou zapojené do biosyntézy karotenoidÛ u mikroorganismÛ patfií crt geny A, B, C, D, E, F a I (u fototrofních bakterií Rhodobacter capsulatus) a crt geny D, I, B a C (u Rhodobacter aphaeroides) podílející se na pfiemûnû neurosporenu na rÛzné typy acyklick˘ch xantofylÛ (Britton G. a kol. 1998). Nyní se nabízí pomocí genového inÏen˘rství moÏnosti syntéz strukturálnû rÛznorod˘ch karotenoidÛ ve velkém mnoÏství pro vyuÏití v lékafiství a farmacii (Schmidt-Dannert C. 2000).

2.4 Izolace a anal˘za vybran˘ch kvasinkov˘ch metabolitÛ MoÏnosti stanovení intracelulárních metabolitÛ t˘kajících se konkrétních slouãenin nebo metabolick˘ch meziproduktÛ byly jiÏ dfiíve publikovány pro kvasinky, bakterie a rostliny (Bhattacharya M. a kol. 1995). S postupn˘m rozvojem oblastí v˘zkumu metabolického inÏen˘rství a metabolické anal˘zy se zaãaly vyvíjet dal‰í techniky, které umoÏÀují studium a porovnávání jednotliv˘ch metabolick˘ch profilÛ. Poté, co jsou metabolity izolovány, mohou b˘t vyuÏity rÛzné analytické techniky pro jejich kvalitativní a kvantitativní stanovení (Castrillo J. I. a kol. 2003).

2.4.1 Karotenoidy VzrÛstající zájem o karotenoidy jakoÏto prekurzory vitamínu A vedly ke zdokonalování technik vhodn˘ch k jejich identifikaci a kvantifikaci (Careri M. a kol. 1999). Anal˘za pigmentÛ je moÏná po úspû‰né izolaci z bunûk, které jsou nejprve naru‰eny acetonem. Dále následuje zm˘delnûní, extrakce ethyletherem a vakuové odpafiení etherov˘ch frakcí (Dvofiáková T. 2008). Vysokoúãinná kapalinová chromatografie (HPLC) je upfiednostÀovanou metodou k separaci, identifikaci a kvantifikaci karotenoidÛ v biologick˘ch vzorcích. JelikoÏ se karotenoidy v biologick˘ch matricích nachází ve formû sloÏit˘ch smûsí, nelze metodu HPLC vyuÏít k identifikaci zaloÏené pouze na mûfiení retenãních ãasÛ a fixnû dan˘ch vlnov˘ch délek (van Breemen R. B. 1995) z dÛvodu spektrálních interferencí jednotliv˘ch strukturálnû podobn˘ch komponent (Careri M. a kol. 1999). VyuÏití HPLC s detekcí fotodiodového pole (PDA) a moÏností kontinuálního záznamu spektrálních dat bûhem celé anal˘zy se jeví jako vhodná metoda v˘zkumu karotenoidÛ. VyÏaduje ov‰em po celou dobu mûfiení kompletní chromatografické rozli‰ení jednotliv˘ch sloÏek analytu s moÏností pozorování a porovnávání spektrofotometrick˘ch údajÛ UV/VIS spekter a retenãních ãasÛ s jednotliv˘mi standardy (van Breemen R. B. 1995). Hmotnostní spektrometrie (MS) a tandemové anal˘zy spojené s hmotnostní spektrometrií (napfi. HPLC-UV/VIS-MS), které poskytují charakteristiky fragmentÛ molekul na základû jejich molekulové hmotnosti, umoÏÀují identifikovat jednotlivé izomery karotenoidÛ (van Breemen R. B. 1995; Careri M. a kol. 1999).

(

34

)

Obr. 14a: Aparatura HPLC

2.4.2 Ergosterol Lipidy pfiítomné v plazmatick˘ch membránách eukaryotick˘ch bunûk jsou nezbytné pro organizaci a funkci membrán. Zatímco cholesterol je hlavním sterolem plazmatick˘ch membrán vy‰‰ích eukaryot (napfi. savci), u niωích eukaryot (kvasinky, houby, protozoa aj.) je to ergosterol (Arora A. a kol. 2004). Steroly jsou produktem komplexní biosyntetické dráhy s více neÏ 20 rozdíln˘mi reakcemi. Sterolovû-specifická ãást zaãíná kondenzací farnesylpyrofosfátu za tvorby skvalenu; u kvasinek syntéza konãí ergosterolem (Eisenkolb M. a kol. 2002). JelikoÏ je ergosterol spoleãnû s karotenoidy souãástí lipidické frakce bunûk, je pro nûj moÏné vyuÏít stejné postupy extrakce, jako jiÏ byly popsány u karotenoidÛ (Iwaki T. a kol. 2008). Pro separaci a detekci ergosterolu lze pouÏít tandemovou techniku GC-MS (plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií) s kvadrupólov˘m hmotnostním analyzátorem (AlcazarFuoli L. a kol. 2008). Dal‰í vyuÏitelnou metodou je HPLC s reverzní fází (RP-HPLC), pfiiãemÏ detekce ergosterolu je velmi jednoduchá, jelikoÏ je jedním z mála polynenasycen˘ch sterolÛ absorbujících pfii 280 nm (Gessner M. O., Chauvet E. 1993).

2.4.3 Bioetanol a xylóza Xylóza je hned po glukóze druh˘m nejhojnûji se vyskytujícím fermentovateln˘m cukrem v ligninocelulózov˘ch matricíh. Geneticky upravená kvasinka S. cerevisiae je schopna konverze pentóz na bioetanol. Koncentrace etanolu a xylózy je moÏné následnû stanovit vysokoúãinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s iontovû-v˘mûnnou kolonou, UV a refraktometrickou detekcí; mobilní fáze 5 mM H2SO4, 45 °C, s prÛtokem 0,6 ml.min–1 (Bengtsson O., HahnHägerdal B., Gorwa-Grauslund M. F. 2009). Evaporaci produkovaného etanolu je moÏné urãit experimentálnû pfii kontinuální fermentaci. Rychlost evaporace a anal˘za pomocí HPLC zahrnuje celkovou produkci bioetanolu (Bettiga M., Hahn-Hägerdal B., Gorwa-Grauslund M. F. 2008). (

35

)

Schopnost kvasinky S. cerevisiae uklizovat xylózu lze provûfiit sekvenováním vyizolovan˘ch plazmidÛ z tûchto transformantÛ a promûfiením enzymatické aktivity reduktáz xylózy spektrometricky pfii 340 nm (Bengtsson O., Hahn-Hägerdal B., Gorwa-Grauslund M. F. 2009).

2.4.4 Kvasinková biomasa Metody zab˘vající se stanovením poãtu bunûk nebo koncentrací bunûk ve vzorku jsou dÛleÏité pro dané experimenty a mikrobiologickou charakteristiku. Klasické metody vychází ze sledování poãtu nebo hmotnosti bunûk. Pomocí fyzikálních a biochemick˘ch technik byla vyvinuta spousta pfiím˘ch i nepfiím˘ch metod pro tyto anal˘zy (Talaro K. P. 2007). Tradiãní pfiímé stanovení biomasy vyuÏívá sledování hmotnosti su‰iny napfi. za pomoci diferenãního váÏení pfied a po vysu‰ení vzorku. Dále lze pro laboratorní nebo prÛmyslové stanovení biomasy pouÏít nepfiímé metody jako je odstfieìování, turbidimetrie, filtrace apod. Pro porovnávání rÛzn˘ch anal˘z mezi sebou je dobré uvádût obsahy bunûãn˘ch komponent ve vztahu k suché hmotnosti (Kocková-Kratochvílová A. 1990).

2.4.5 Kvasinková DNA Karotenoidní kvasinky patfií do tfiídy Basidiomycetes (Weber R. W. S., Anke H., Davoli P. 2007). K jejich identifikaci se vyuÏívají morfologické vlastnosti, sloÏení bunûãné stûny a anal˘za DNA (Fell J. W. a kol. 2000). Jednotlivé druhy jsou obvykle rozdûlovány podle fyziologick˘ch vlastností (vyuÏití zdrojÛ uhlíku a dusíku) a zkoumáním rozdílÛ v DNA mezi blízce pfiíbuzn˘mi druhy. Tato identifikace mÛÏe b˘t velmi pomalá, sloÏitá i cenovû nároãná. V˘sledné poznatky ve fyziologii i morfologii mohou prokazovat znaãnou variabilitu uvnitfi i mezi jednotliv˘mi druhy. K pfiekonání tûchto problémÛ je identifikace kvasinek zamûfiena na molekulární metody napfi. PCR, PFGE (Fell J. W. a kol. 2000).

2.4.5.1 Izolace intaktní chromozomální DNA Metody molekulární biologie a genetiky lze vyuÏít k zodpovûzení mnoha otázek z oblastí biotechnologie a systematiky mikroorganismÛ. DÛleÏit˘mi nástroji tûchto technik je enzymatická l˘za bunûãn˘ch stûn, coÏ je nesmírnû dÛleÏité v fiadû experimentÛ s transformacemi a tvorbou protoplastÛ. Kvasinkové protoplasty lze úãinnû izolovat komerãnû dostupn˘mi enzymatick˘mi preparáty (Kaul W., Rossow U., Emeis C. Ch. 1993). Ov‰em pro nûkteré kvasinky (napfi. karotenogenní) nemohou b˘t tyto komerãnû dodávané lytické enzymy pro nespecifiãnost pouÏity (Kaul W., Rossow U., Emeis C. Ch. 1993; Enzyme Information 2007) a izolace DNA pfies tvorbu protoplastÛ je také ãasovû znaãnû nároãná (Piper P. 1996). Pfiíprava genomové DNA je obecnû provádûna v roztoku. BuÀky jsou nejprve enzymaticky pfievedeny na sferoplasty nebo protoplasty, naãeÏ je provedena l˘za bunûk pomocí detergentu spoleãnû s chelataãním ãinidlem (EDTA). V˘sledkem je komplexní smûs DNA, RNA a proteinÛ. Proteiny a RNA jsou odstranûny proteinázami a RNA-ázami. Zbytky proteinÛ mohou b˘t pozdûji odstranûny fenolovou extrakcí nebo gelovou chromatografií. Roztok obsahující DNA je zkoncentrován a precipitován pfiídavkem etanolu (Suwanto A. 1994). (

36

)

Pfii anal˘ze kvasinkového genomu pomocí PFGE je velmi dÛleÏité získat intaktní DNA. Izolaãní metody v roztoku, které byly popsány v˘‰e, zpÛsobují naru‰ení DNA na men‰í fragmenty kolem 700 kb. Rozbití molekuly je zpÛsobeno mechanick˘mi silami pfii práci s DNA ve formû roztoku. JelikoÏ je kvasinková DNA vût‰í neÏ 1000 kb, je velmi dÛleÏité vyvarovat se pfii izolacích mechanického po‰kození (Smith C. L., Condemine G. 1990). Je vhodné pfievést kvasinkovou DNA do agarózov˘ch bloãkÛ, které chromosomy uchrání pfied mechanick˘m po‰kozením bûhem izolaãních procesÛ (Cifuentes V. a kol. 1997).

Obr. 14b: Aparatura PFGE

L˘za bunûãn˘ch stûn karotenogenních kvasinek Karotenogenní kvasinky se vyznaãují silnou bunûãnou stûnou (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009), která obsahuje glukomanany (Arai M., Lee T. H., Murao S. 1978). Aãkoliv se k naru‰ení bunûãné stûny tûchto kvasinek vyuÏívá napfi. komerãnû dostupná lytikáza, obsahující β-1,3glukan hydrolázu, nedojde vzhledem k nespecifiãnosti tohoto enzymu k dokonalému rozru‰ení bunûãn˘ch stûn. Vhodnou metodou se jeví izolace enzymÛ z kultury Penicillium lilacinum, které se vyznaãují schopnostmi tvofiit z více neÏ 90 % protoplasty u karotenogenních kvasinek, coÏ by mohlo pfiispût ke snaωí izolaci intaktní kvasinkové DNA (Venkateswaran G. 1997).

Pulzní gelová elektroforéza Poãet i velikost jednotliv˘ch chromozomÛ se mezi jednotliv˘mi druhy kvasinek li‰í, ãehoÏ lze vyuÏít u anal˘zy genomu. ProtoÏe jsou tyto chromozomy pfiíli‰ velké pro bûÏné elektroforetické metody, je nutné vyuÏití pulzní gelové elektroforézy (PFGE). Pomocí PFGE-Chef (pulzní gelová elektroforéza s homogenním obrysovû upnut˘m elektrick˘m polem) se nabízí moÏnost diferenciace kvasinkov˘ch kmenÛ rozdûlením chromozomÛ podle velikosti v agarózovém gelu. Touto metodou lze potenciálnû odhalit mutace kvasinek, nicménû mutace musí b˘t vût‰ího rozsahu pro dosaÏení v˘raznûj‰ích zmûn chromozomÛ (Goineau S. 2010). (

37

)

Pomocí pulzní gelové elektroforézy (PFGE) lze dosáhnout efektivního rozli‰ení neporu‰en˘ch velk˘ch chromozomÛ molekuly DNA. Získáme pfiímé informace o organizaci genomu mnoha niωích eukaryot; rozli‰í se polymorfismus chromozomÛ u kvasinek s podobn˘mi fyziologick˘mi vlastnostmi (Cifuentes V. a kol. 1997). Lze ‰tûpit molekuly DNA na fragmenty dlouhé od nûkolika kilopárÛ bází (kb) aÏ po více neÏ 10 megapárÛ bází (Mb) za pouÏití dvou nebo i více elektrick˘ch polí, která se stfiídají v rÛzn˘ch úhlech v pfiesnû definovan˘ch ãasov˘ch intervalech (Burmeister M., Ulanovsky L. 1992; Bílková K., Králová B. 1997). Tím se usnadní anal˘za jak jednoduch˘ch, tak i komplexních genomÛ.

2.5 VyuÏití odpadních substrátÛ k produkci vybran˘ch kvasinkov˘ch metabolitÛ Karotenogenní kvasinky mohou rÛst v ‰irokém spektru pH (2,5-9,5) a pfii teplotách 5-26 °C (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009; Libkind D. a kol. 2008; Latha B. V. a kol. 2005). Pokud budou vystavené stresov˘m podmínkám, zaãnou obvykle akumulovat více pigmentÛ. Znalost molekulárních mechanizmÛ stimulace produkce karotenoidÛ mÛÏe vést ke zlep‰ení biotechnologick˘ch procesÛ (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009; Halienova A. a kol. 2007). Kvasinkové druhy Rhodotorula a Phaffia by mohly b˘t komerãnû vyuÏitelné pro potravináfiství v syntéze pfiírodních karotenoidÛ (β-karoten, torulen, torularhodin a astaxantin), pfiesto je limitujícím faktorem vysoká cena produkce (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009). Zavedení prÛmyslové v˘roby β-karotenu mikrobiálnû bude realizovatelné teprve v pfiípadû minimalizace v˘robních nákladÛ. Toho lze dosáhnout mj. vyuÏitím odpadních surovin z prÛmyslov˘ch v˘rob jakoÏto zdrojÛ nutriãních látek (Bhosale P., Gadre R. V. 2001) a zv˘‰ením mnoÏství vyprodukovan˘ch pigmentÛ optimalizací kultivaãních podmínek (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009).

kontrola

bramborov˘ extrakt

lyofilizovaná syrovátka

syrovátka

Obr. 15: Zabarvení kvasinky Rhodotorula glutinis kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech Pfiedmûtem intenzivního studia se v souãasné dobû stává úãinnost pfiemûny zdroje uhlíku na karotenoidní pigmenty spoleãnû s optimalizací rÛstového média pro kultivaci kvasinek. Jako substráty mohou slouÏit pentózy a hexózy, ale i disacharidy, glycerol, etanol, metanol, n-alkany (âertík M. a kol. 2009) aj. JiÏ byly publikovány v˘sledky mikrobiální produkce karotenoidÛ na médiích z odpadÛ zemûdûlsk˘ch v˘rob obsahujících syrovátku (âarnecká M. 2009; Frengova G. a kol. 1994), melasu z cukrové tfitiny (Bhosale P., Gadre R. V. 2001), sojov˘ olej (Mant-

(

38

)

zouridou F. a kol. 2006), glycerol z bionafty (Saenge Ch. a kol. 2010), kukufiiãn˘ sirup (Buzzini P. 2001) apod. Hlavními karotenoidními pigmenty produkovan˘mi kvasinkami jsou β-karoten, astaxanthin, torulen a torularhodin. MnoÏství vyprodukovaného pigmentu závisí na rozdílnosti v druzích kvasinek, ale mÛÏe se také li‰it u kvasinek stejného druhu v závislosti na kultivaãních podmínkách (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009). Akumulace karotenoidních pigmentÛ u vût‰iny kvasinek zaãíná v pozdní logaritmické fázi a pokraãuje ve fázi stacionární (Moliné M. a spol 2009). Kvasinky jsou schopné syntetizovat karotenoidy bûhem kultivace na syntetick˘ch médiích i pfiírodních substrátech s dostateãn˘m zdrojem uhlíku. Pfiehled vyuÏiteln˘ch zdrojÛ substrátÛ je uveden v tabulce 2 a 3. Alternativní metodou pfii utilizaci nûkter˘ch pfiírodních substrátÛ v produkci karotenoidÛ kvasinkov˘mi druhy Rhodotorula jsou smûsné kultivaãní techniky. Roz‰ífien˘m pfiírodním substrátem je mléãná syrovátka, obsahující laktózu, která je zdrojem uhlíku. Syntéza karotenoidÛ pomocí laktáza-negativních kvasinek (R. glutnis, R. mucilaginosa) na syrovátce lze uskuteãnit pomocí enzymatické hydrol˘zy laktózy na snáze asimilovatelné zdroje uhlíku (glukóza a galaktóza); buì spoleãnou kultivací s laktáza-pozitivními kvasinkami (Kluyveromyces lactis) producenty β-galaktooxidázy (Frengova G. a kol. 2004), nebo s s homofermentativními bakteriemi mléãného kva‰ení, popfi. startovacími jogurtov˘mi kulturami, které jsou rovnûÏ schopny laktózu transformovat na uhlíkové zdroje (glukóza, galaktóza, kyselina mléãná) snáze vyuÏitelné kvasinkami (Frengova G. a kol. 1994; Simova E. D. a kol. 2004).

Syntetická média vhodná ke kultivaci karotenogenních kvasinek zdroj uhlíku glukóza xylóza celobióza sacharóza glycerol sorbitol

odkaz Ni H. a kol. 2007; Perrier V. a kol. 1995 Parajo J. C. a kol. 1998 Sun N. a kol. 2004 Polulyakh O. V. a kol. 1991; Wang S. L. a kol. 2001 Kusdiyantini E. a kol. 1998 Sun N. a kol. 2004

Tabulka 2: Pfiehled vyuÏiteln˘ch syntetick˘ch substrátÛ vhodn˘ch ke kultivaci karotenogenních kvasinek

(

39

)

Pfiírodní substráty vhodné ke kultivaci karotenogenních kvasinek zdroj uhlíku ‰Èáva z hroznÛ hroznov˘ mo‰t ananasová ‰Èáva jableãné ‰lupky/duÏnina/vláknina ra‰elinov˘ extrakt a hydrolyzát slan˘ nálev z fiedkve odpady po hydrol˘ze hofiãice enzymatické hydrolyzáty dfieva hemicelulózové hydrolyzáty eukalyptového dfieva hydrolyzovaná fazolová mouãka ‰Èáva z cukrové tfitiny melasa fiepná a z cukrové tfitiny kukufiiãn˘ sirup kukufiiãn˘ hydrolyzát mléãná syrovátka

odkaz Longo E. a kol. 1992; Meyer P., Du Preez J. 1994 Buzzini P., Martin A. 1999; Buzzini P. 2000 Jirasripongpun K. a kol. 2008 Petrik S. a kol. 2010 Vazquez M., Martin A. M. 1998 Malisorn C., Suntornsuk W. 2008 Tinoi J. a kol. 2006 Parajo J. C. a kol. 1997 Parajo J. C. a kol. 1998a; Cruz J. M., Parajo J. C. 1998 Tinoi J. a kol. 2005 Fontana J. D. a kol. 1996; Moriel D. G. A kol. 2005 Bhosale P., Gadre R. V. 2001; Aksu Z., Eren A. T. 2005 Buzzini P. 2001; Libkind D., van Brook M. 2006 Kesava S. S. a kol 1998 âarnecká M. 2009; Frengova G. a kol. 1994

Tabulka 3: Pfiehled vyuÏiteln˘ch pfiírodních zdrojÛ uhlíku vhodn˘ch ke kultivaci karotenogenních kvasinek Vedlej‰í produkty a meziprodukty ze zemûdûlsk˘ch a prÛmyslov˘ch v˘rob ãasto zatûÏují Ïivotní prostfiedí. VyuÏitím levn˘ch zdrojÛ uhlíku v mikrobiálních fermentacích lze tyto zátûÏe úspû‰nû limitovat (Buzzini P., Martini A. 1999). Do dne‰ního dne byly provedeny rÛzné experimenty s kultivací kvasinek na rÛzn˘ch odpadních substrátech slouÏících jako nutriãní zdroj pro kvasinky pro produkci karotenoidních pigmentÛ (Bhosale P., Gadre R. V. 2001). Pfiehled vyprodukovaného mnoÏství karotenoidÛ kvasinkami kultivovan˘mi na vybran˘ch odpadních substrátech je uveden v Tabulce 4.

(

40

)

Produkce karotenoidÛ na rÛzn˘ch odpadních substrátech druh kvasinky

zdroj uhlíku

karotenoidy:

odkaz

(mg/g cdw) / (mg/l kultury)

R. glutinis DBVPG 3853 R. glutinis DBVPG 3853 R. glutinis mutant 32 R. glutinis mutant 32 R. mucilaginosa NRRL-2502 R. mucilaginosa NRRL-2502 Phaffia rhodozyma NRRL Y-17268 Xanthophyllomyces dendrorhous mutant GM 807 R. glutinis TISTR Sporobolomyces roseus Rhodotorula rubra Rhodotorula glutini Rhodotorula glutinis Rhodotorula glutinis Rhodotorula glutinis R. glutinis DBVPG 3853

hroznov˘ mo‰t sojová mouka glukóza hydrolyzovaná melasa fiepná melasa syrovátka xylóza 10% ananasov˘ dÏus

0,9154 / 5,95 0,8833 / 4,24 1,8 / 22 1,7 / 18 21,20 / 89 29,2 / 70 neuvedeno / 5,8 0,493 / neuvedeno

Buzzini P., Martini A. 1999 Buzzini P., Martini A. 1999 Bhosale P., Gadre R. V. 2001 Bhosale P., Gadre R. V. 2001 Aksu Z., Eren A. T. 2005 Aksu Z., Eren A. T. 2005 Parajo J. C. a kol. 1998 Jirasripongpun K. a kol. 2008

hydrolyzovaná fazolová mouãka syrovátka bramborov˘ extrakt stûstoviny po enzymatické hydrol˘ze jableãné slupky lyofilizovaná syrovátka bramborov˘ extrakt kukufiiãn˘ sirup

0,345 / 3, 48

Tinoi J. a kol. 2005

2,5 / 11,47 0,42 / 3,17 3,6 / 40,10

âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009

1,15 / 1,32 8,20 / 66,32 2,19 / 12,08 0,54 / 8,20

âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 Buzzini P. 2001

Tabulka 4: Pfiehled vyprodukovaného mnoÏství karotenoidÛ kvasinkami kultivovan˘mi na rÛzn˘ch odpadních substrátech Zlep‰ením vlastností kvasinkov˘ch kmenÛ a optimalizací nadprodukce metabolitÛ v kombinaci s levn˘mi zdroji uhlíku bude moÏné zdokonalit biosyntézu karotenoidÛ, která se poté stane úãinnûj‰í a úspornûj‰í. Zemûdûlské a prÛmyslové meziprodukty a odpadní látky obsahují dostateãné mnoÏství cukrÛ, které mohou b˘t v˘hodnû pfiemûnûné na chemické slouãeniny vhodné k aplikaci v potravináfiském a farmaceutickém prÛmyslu prostfiednictvím mikrobiální biotechnologie (Frengova G. I., Beshkova D. M. 2009), ãímÏ se také sníÏí zátûÏ na Ïivotní prostfiedí.

(

41

)

(

42

)

3. Cíle disertaãní práce Cílem disertaãní práce bude studium vyuÏiteln˘ch zdrojÛ substrátÛ k produkci obohacené kvasinkové biomasy. Odpadní suroviny budou pocházet pfiedev‰ím z potravináfisk˘ch v˘rob. V rámci disertaãní práce budou fie‰eny následující dílãí cíle: • Kultivace karotenogenních kvasinek na vybran˘ch odpadních substrátech • Sledování tvorby metabolitÛ kvasinkami (karotenoidy, ergosterol aj.) vãetnû optimalizace extrakce a stanovení vybran˘ch kvasinkov˘ch metabolitÛ • Testování kombinací nutriãních faktorÛ a rÛstov˘ch podmínek • Vliv exogenních fyzikálních a chemick˘ch stresÛ na produkci biomasy a vybran˘ch metabolitÛ • Sledování zmûn DNA a metabolického profilu u dan˘ch kvasinkov˘ch kmenÛ • Pfiíprava mutantních kmenÛ schopn˘ch vyuÏít alternativní zdroje Ïivin k nadprodukci vybran˘ch metabolitÛ • Optimalizace separaãních a analytick˘ch technik k izolaci a charakterizaci kvasinkového metabolomu • Srovnávací anal˘za vybran˘ch kmenÛ prÛmyslov˘ch kvasinek kultivovan˘ch za rÛzn˘ch podmínek

(

43

)

(

44

)

4. Experimentální ãást 4.1 PouÏité mikroorganismy, chemikálie, pfiístroje a pomÛcky 4.1.1 Kvasinkové kmeny Pro kultivaãní experimenty bylo vybráno 6 karotenogenních kmenÛ kvasinek pocházejících ze sbírky kvasinkov˘ch kultur CCY (Culture Collection of Yeasts), Chemick˘ ústav AV, Bratislava, Slovensko. Jednalo se o kmeny Cystofilobasidium capitatum CCY 10-1-1, Rhodotorula aurantiaca CCY 20-9-7, Rhodotorula glutinis CCY 20-2-33, Rhodotorula mucilaginosa CCY 20-7-31, Sporobolomyces roseus CCY 19-6-4 a Sporobolomyces shibatanus CCY 19-20-3; srovnávací kmen Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 z âeské sbírky mikroorganismÛ, Ústavu experimentální biologie PfiF MU Brno, âR; a kompetentní kmen Saccharomyces cerevisiae TMB 3043 + XR (obsahující plazmid RedM1 s aktivitou xylózareduktázy) pocházející z Ústavu aplikované mikrobiologie, Lund, ·védsko.

4.1.2 Bakteriální kmen Pro bakteriální transformaãní experimenty byl vybrán kompetentní kmen Escherichia coli DH5α (Life Technologies, USA).

4.1.3 PlísÀové kmeny Extracelulární enzymy k hydrol˘ze odpadních substrátÛ byly pfiipraveny z plísní Alternaria alternata CCM 8332, Aureobasidium pollulans CCM F-148, Fusarium solani CCM F-552 a Phanerochaete chrysosporium CCM 8074 získan˘ch z âeské sbírky mikroorganismÛ, Ústavu experimentální biologie PfiF MU Brno, âR.

4.1.4 Chemikálie V‰echny pouÏité chemikálie byly vesmûs ãistoty p.a. a byly získány od bûÏn˘ch distributorÛ. Chemikálie pro kultivaci kvasinek Karotenogenní kvasinky a S. cerevisiae CCM 8191 byly kultivovány aerobnû na glukózov˘ch médiích. Pfii kultivacích na pevn˘ch mediích byl pfiidán prá‰kov˘ agar (Himedia, Indie). Pro navození environmentálních stresÛ byla média obohacena: osmotick˘ a oxidaãní stres: NaCl (Fluka, Nûmecko), H2O2 (Lachema, âR); stres s ionty kovÛ: Na2SeO3 (Sigma-Aldrich, Nûmecko), CrCl3 (Fluka, Nûmecko); nutriãní stres: média obohacena syrovátkou (Pribina a.s., âR), jableãnou vlákninou (Provita, âR), vajeãn˘mi tûstovinami (Idal, SK), p‰eniãnou instantní celozrnnou ka‰í Otesánek (Poex, âR), kukufiiãn˘mi klíãky (Unibal, âR) a jablky a hru‰kami z hyper-

(

45

)

marketÛ (âR); kultivace za pÛsobení mutagenu: ethylester kyseliny metansulfonové (EMS; Sigma-Aldrich, Nûmecko). Kompetentní kvasinky S. cerevisiae byly kultivovány aerobnû na médiích obsahujících YNB (Difco Laboratories-Becton, Dickinson and Co., USA), hydrogenftalát draseln˘ (Merck, Darmstadt, Nûmecko), xylózu (Acros Organics, Belgie). Pevná média obsahovala prá‰kov˘ agar (Merck, Nûmecko). Chemikálie pro kultivaci E. coli Bakterie E. coli DH5α byla kultivována na LB médiu (Shelton Scientific, USA), pevná média obsahovala prá‰kov˘ agar (Merck, Nûmecko). Chemikálie pro izolaci a anal˘zu chromozomální DNA Pfii izolaci kvasinkové chromozomální DNA byly pouÏity chelaton 3 (EDTA) p. a. (Lachema, âR), Tris(hydroxymetyl)aminometan (Tris) p. a. (Serva, Nûmecko), dodecylsulfát sodn˘ (SDS) p. a. (Serva, Nûmecko), proteináza K (Serva, Nûmecko), lytikáza (Sigma-Aldrich, Nûmecko), low melting point agaróza (Serva, Nûmecko), β-merkaptoetanol (Serva, Nûmecko), N-lauroyl sarkosin (Sigma-Aldrich, Nûmecko), sorbitol (Sigma-Aldrich, Nûmecko), agaróza prémium (Serva, Nûmecko), ethidium bromid (Serva, Nûmecko), sklenûné kuliãky (Sigma-Aldrich, Nûmecko), mofisk˘ písek, aceton (Lachema, âR), Ultra clean microbial DNA isolation kit (MO BioLabs, USA), Yeast chromosome PFG marker, kter˘ obsahuje chromosomy izolované ze S. cerevisiae kmene YPH80 v rozmezí 225-1900 kb (BioLabs, USA). Chemikálie pro extrakci a anal˘zu karotenoidÛ a ergosterolu Extrakce a anal˘za karotenoidních pigmentÛ a ergosterolu byla provedena pomocí acetonu p. a. (Lachema, âR), hydroxidu draselného p. a. (Lachema, âR), diethyléteru p. a. (Lachema, âR), ethanolu pro UV-VIS (Lachema, âR) a methanolu pro HPLC (Sigma-Aldrich, Nûmecko). Chemikálie pro izolaci plazmidÛ a restrikãní anal˘zu Pfii izolacích plazmidÛ obsahujících gen reduktázy xylózy byl pouÏit sorbitol (Sigma-Aldrich, Nûmecko), chlorid vápenat˘ (Sigma-Aldrich, Nûmecko), QIAquick gel extraction kit (Qiagen, Nûmecko), GeneJet™ Plasmid miniprep kit (Fermentas, Nûmecko), Fast digest buffer (Fermentas, Nûmecko), Fast digest PST1 (Fermentas, Nûmecko), Fast digest SAL1 (Fermentas, Nûmecko), pGEM-T Easy vector system (Promega, USA), Buffer T4 DNA ligase (Fermentas, Nûmecko), T4 DNA ligase (Fermentas, Nûmecko), BAM HI buffer (Fermentas, Nûmecko), SpeI (Fermentas, Nûmecko), a SalI (Fermentas, Nûmecko) Chemikálie pro transformace kvasinek a bakterií Transformace bakterií a kvasinek se uskuteãnily s vyuÏitím YNB média (Difco Laboratories-Becton, Dickinson and Co., USA), octanu litného (Sigma-Aldrich, Nûmecko), kyseliny octo(

46

)

vé (Sigma-Aldrich, Nûmecko), polyetylenglykolu (Serva, Nûmecko), sledí DNA (Invitrogen, USA), LB média (Shelton Scientific, USA), Piperazin-N,NAPPOS-bis(2-ethansulfonové kyseliny) – PIPES (Sigma-Aldrich, Nûmecko), chloridu manganatého (Sigma-Aldrich, Nûmecko), chloridu vápenatého (Sigma-Aldrich, Nûmecko), chloridu draselného (Sigma-Aldrich, Nûmecko), a ampicilinu (Sigma-Aldrich, Nûmecko). Chemikálie pro stanovení enzymové aktivity a koncentrace proteinÛ Pfii stanoveních aktivity enzymÛ schopn˘ch ‰tûpit xylózu na xylitol byly pouÏívány NADH (Sigma-Aldrich, Nûmecko), NADPH (Sigma-Aldrich, Nûmecko), xylóza (Acros Organics, Geel, Belgie), triethanolamin (TRA) (Sigma-Aldrich, Nûmecko), a Y-per yeast extraction protein reagent (Pierce biotechnology, USA). Pomocí Coomassie Protein Assay Reagent (Pierce Biotechnology) a standardu albuminu (Bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, Nûmecko) se stanovovala koncentrace proteinÛ u kompetentních kvasinek Saccharomyces cerevisiae s plazmidem RedM1 s aktivitou reduktázy xylózy. Chemikálie pro PCR a pfieãi‰tûní vzorkÛ PCR a následné pfieãi‰tûní vzorkÛ bylo provedeno pomocí E.Z.N.A.™ Cycle-pure kit (Omega Bio-Tek, USA), High fidelity PCR buffer (Fermentas, Nûmecko), High fidelity PCR enzyme mix (Fermentas, Nûmecko), Primer XR18 Forward/Reward (Eurofins MWG Operon, Nûmecko), a PCR Nucleotide mix dNTPs (Fermentas, Nûmecko).

4.1.5 Pfiístroje a pomÛcky Pfii fie‰ení experimentální ãásti dizertaãní práce bylo pouÏito následujících pfiístrojÛ a laboratorních pomÛcek: • kultivace mikroorganismÛ: analytické váhy (Boeco, Nûmecko), laboratorní váhy, autokláv, tfiepaãka Yellow line (Nûmecko) a tfiepaãka (Boule Medical AB, ·védsko), inkubátor (INR-200 Shake incubator, Anglie), laminární box Aura mini (BioAir Instruments, USA), inkubátor (Labquip, Indie), „Lab Roller“ (Labquip, Indie), spektrofotometr VIS Helios ä (Unicam, USA), spektrofotometr Hitachi U-1800 (Hitachi Ltd., Japonsko), mikroskop LII00A (Intraco Micro, Nûmecko), GKB Color digital CCD kamera (Taiwan), software Lucia Image active 5.0 (Laboratory imaging s r. o., âR). • PCR, izolace a anal˘za DNA: Centrifugy Sigma a C28 (Laborzentrifugen, Nûmecko), mikrocentrifuga Mikro 200 (Hettich Zentrifugen, Nûmecko), vyhfiívaná vodní lázeÀ (Julabo Labortechnic GmbH, Nûmecko), vortex TK 3s (Kartell, Itálie), tfiepaãka (Heidolph Promax 1020, Nûmecko), ultrazvuk PS 02000 „Ultrasonic Compact Cleaner“ (Powersonic, Slovensko), sestava pro horizontální elektroforézu (Bio Rad, USA), elektroforetick˘ zdroj SH 300 (Shelton scientific, USA), PCR aparatura (Eppendorf), PFGE sestava obsahující Gene Navigator, GN Controller a programovateln˘ zdroj (Pharmacia Biotech, ·védsko), software Scionimage (Ultra Viewer, USA), software Quantity One (Bio Rad, Anglie). • Izolace a anal˘za karotenoidÛ a ergosterolu: filtry 0,45 µm pro HPLC PRE-CUT (All(

47

)

tech, Anglie), vakuová odparka RV 06 (IKA, Nûmecko), vodní lázeÀ EL-20 (Merci a.s., âR), sestava pro HPLC/UV-VIS (ECOM spol. s r.o., âR) s programátorem gradientu GR5, vysokotlak˘m ãerpadlem P4020, dávkovacím ventilem C, termostatem kolony LCO101, UV-VIS detektorem LCD2084; kolona Kinetex 4,6x150nm; 100 A, C18, 2,6 µm (Phenomenex, USA), software Clarity-chromatography Data Apex 2006. • stanovení enzymatické aktivity: spektrofotometr U-2000 (Hitachi, Japonsko), spektrofotometr Hitachi U-1800 (Hitachi, Japonsko), stolní centrifuga Z160M (Hermle Labortechnik, Nûmecko), software Swftool-Reaction Kinetics, Openoffice 3.3.0 a MatLab R2006.

4.2 Kultivace karotenogenních kvasinek V‰echny karotenogenní kvasinky (viz kapitola 4.1.1) byly kultivovány na stejn˘ch médiích s glukózou a/nebo jin˘m zdrojem C a N obsaÏen˘ch v odpadních substrátech z potravináfiství nebo zemûdûlsk˘ch v˘rob. Pro v‰echny experimenty se soubûÏnû provádûla kontrolní kultivace na glukózovém médiu.

4.2.1 SloÏení kultivaãních médií V proveden˘ch experimentech karotenogenní kvasinky rostly na jednoduch˘ch inokulaãních a následnû produkãních glukózov˘ch médiích. SloÏení tûchto médií uvádí tabulky 5 a 6. Sterilace médií probíhala v autoklávu se sacharidovou sloÏkou oddûlenou od zbytku média, aby se zabránilo karamelizaci. Po ochlazení se obû ãásti sterilnû smíchaly. SloÏka glukóza kvasniãn˘ autolyzát (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4

(g/l odstáté vody) 40 7 5 5 0,34

Tab. 5: SloÏení inokulaãních médií

SloÏka glukóza (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4

(g/l odstáté vody) 40 5 5 0,34

Tab. 6: SloÏení produkãního média

(

48

)

4.2.2 Podmínky kultivace a uchovávání kultur kvasinek KaÏd˘ kmen kvasinek pouÏit˘ pro experimentální práci (viz kapitola 4.1.1) rostl za optimálních podmínek pfies dvoustupÀovou inokulaci. Kultivace probíhala aerobnû pfii 28 °C za stálého osvûtlení na laboratorních tfiepaãkách pfii 90 rpm. V‰echny kmeny byly sterilnû zaoãkovány do inokulaãního média 1 (INO 1), po 24 hodinách sterilnû pfieneseny do inokulaãního média 2 (INO 2) v pomûru 1:5. Po dal‰ích 24 hodinách byly opût sterilnû pfieneseny do produkãního média (Prod) se zachováním pomûru 1:5. Kultivace v produkãních médiích probíhaly po dobu 48 hodin pro anal˘zu DNA nebo 80 hodin pro anal˘zu karotenoidÛ a ergosterolu. SloÏení médií je uvedeno v tabulkách 5 a 6.

4.2.3 Kultivace za pÛsobení stresov˘ch faktorÛ Na základû proveden˘ch experimentÛ z pfiede‰l˘ch prací (âarnecká M. 2006 a 2009) byly vybrány osmotick˘ stres, oxidaãní stres, nutriãní stres a doplnûny pfiídavky iontÛ kovÛ do média a mutace, které vedly k indukci produkce karotenogenních metabolitÛ. Sledovaly se také potenciální zmûny v kvasinkovém genomu.

4.2.3.1 Kultivace za pÛsobení osmotického a oxidaãního stresu Pfii cíleném ovlivÀování produkce karotenoidÛ za pomocí stresov˘ch faktorÛ byl vybrán u kvasinky C. capitatum osmotick˘ a oxidaãní stres nebo jejich vzájemná kombinace. Osmotick˘ stres byl navozen pfiídavkem 2% a 5% NaCl, peroxidov˘ stres pfiídavkem 2 mM nebo 5 mM H2O2 do produkãních médií, nebo do INO II a souãasnû i do produkãních médií. U karotenogenních kvasinek C. capitatum, R. aurantiaca, S. roseus a S. shibatanus byla stanovena téÏ rÛstová kfiivka pfii pÛsobení osmotického a oxidaãního stresu. Osmotick˘ stres byl indukován pfiídavkem NaCl do produkãního média o koncentracích 2 %, 5 % a 9 %, oxidaãní stres byl indukován pfiídavkem H2O2 do produkãního média o koncentracích 2 mM, 5 mM a 100 mM. V urãit˘ch ãasov˘ch intervalech bylo odebíráno 100 µl bunûãné suspenze a mûfien zákal turbidimetricky pfii 630 nm oproti destilované vodû. KaÏdé mûfiení probûhlo 2x paralelnû a v˘sledné hodnoty byly prÛmûrovány. Ze získan˘ch hodnot byla sestavena rÛstová charakteristika a sestrojeny grafy nárÛstu dan˘ch kultur v programu Excel. SoubûÏnû byly kvasinky C. capitatum a S. roseus kultivovány za pÛsobení negativních stresov˘ch podmínek (9% NaCl a 100 mM H2O2 v produkãních médiích) po dobu 48 hodin, poté byla z tûchto kvasinek vyizolována DNA a provedena PFGE-Chef, aby se ovûfiilo, zda do‰lo ke zmûnû genomu pfii pÛsobení koncentrovan˘ch stresov˘ch faktorÛ na kultury kvasinek.

4.2.3.2 Kultivace za pfiídavku iontÛ kovÛ Vystavení kultury kovov˘m iontÛm ve formû Na2SeO3 o koncentracích 0,01 mM; 0,1 mM a 1 mM bylo realizováno ihned po inokulaci do produkãních médií anebo ve 30. hodinû této kultivace, a to u kvasinky C. capitatum. Pfii experimentech s ionty chromu ve formû CrCl3 byl experiment rozdûlen na 2 ãásti. V první se chrom pfiidal ihned po inokulaci do produkãního média, (

49

)

nebo po uplynutí 30 hodin od inokulace do produkãního média. Ve druhé fázi experimentu se chrom pfiidal jiÏ do inokulaãního média 2 (INO II) o koncentraci 0,1 mM a zároveÀ i do produkãního média ihned po inokulaci nebo po 30 hodinách rÛstu kultury.

4.2.3.3 Kultivace na rÛzn˘ch odpadních substrátech V‰echny testované karotenogenní kvasinky byly kultivovány za optimálních podmínek na glukózovém médiu (kontrolní kultivace) a také v médiích s alternativními zdroji C a N pro navození nutriãního stresu. V tûchto pfiípadech byly ãásteãnû nebo zcela nahrazeny glukóza a kvasniãn˘ autolyzát. Za zdroje C a N se pouÏívaly rÛzné odpadní substráty pocházející ze zemûdûlsk˘ch v˘rob nebo z potravináfiství. Tyto náhradní Ïiviny se pfiidávaly do INO II nebo produkãního média, popfiípadû do obou z nich. Experimenty byly rozdûleny na tfii ãásti. V 1. ãásti se vyuÏívaly ovocné odpadní substráty (jableãná vláknina, jableãné a hru‰kové slupky). Ve druhé ãásti experimentu se pouÏívaly ‰krobnaté odpadní substráty (p‰eniãná ka‰e a kukufiiãné klíãky), syrovátka upravená a neupravená. V poslední ãásti experimentu se vyuÏily hydrolyzované kukufiiãné klíãky, p‰eniãná ka‰e, jableãná vláknina, tûstoviny. ·krobnaté substráty z 3. ãásti experimentu byly nejprve podrobeny enzymatické hydrol˘ze extracelulárními enzymy izolovan˘mi z plísÀov˘ch kultur. Syrovátka se pouÏívala v neupravené nebo upravené formû, coÏ vyÏadovalo nejprve lyofilizaci a odstranûní bílkovin úpravou pH pomocí H2SO4 na 4,6 a 20 minutov˘m povafiením. VysráÏené bílkoviny se poté odstfiedily pfii 5000 rpm/10 minut. SloÏka glukóza (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 kvasniãn˘ autolyzát

(g/l odstáté vody) 40 5 5 0,34 7

Tab 7: sloÏení inokulaãního média 1 (INO I)

Série experimentÛ 1.B 2. (g/l odstáté vody) 40 40 5 5 5 5 0,34 0,34 – 7 7 –

1.A SloÏka glukóza (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 kvasniãn˘ autolyzát jableãná vláknina

40 5 5 0,34 7 –

Tab 8: sloÏení inokulaãního média 2 (INO II)

(

50

)

3. 40 5 5 0,34 7 –

1. série

kontrola A

sloÏka (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 glukóza glukóza + jableãná vláknina jableãné slupky hru‰kové slupky

jableãná vláknina A B (g/l odstáté vody) 4 4 0,34 – – 15+15 15+15 – – – –

B 4 4 0,34

30 – – –

30 – – –

jableãné slupky A B

hru‰kové slupky

4 4 0,34

4 4 0,34 – – – 30

– – 30 –

– – 30 –

Tab 9: sloÏení produkãního média (Prod) v 1. ãásti experimentu

2. série SloÏka (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 glukóza tûstoviny

(g/l odstáté vody) 4 4 0,34 30 30

SloÏka kukufiiãné klíãky p‰eniãná ka‰e upravená syrovátka neupravená syrovátka

(g/l odstáté vody) 30 30 30 30

Tab 10: sloÏení produkãního média (Prod) ve 2. ãásti experimentu

3. série sloÏka (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 glukóza jableãná vláknina jableãná vláknina + E1 jableãná vláknina + E2 jableãná vláknina + E3 jableãná vláknina +E4 tûstoviny tûstoviny + E1 tûstoviny + E2

(g/l odstáté vody) 4 4 0,34 30 30 30 30 30 30 30 30 30

sloÏka tûstoviny + E3 tûstoviny + E4 p‰eniãná ka‰e p‰eniãná ka‰e + E1 p‰eniãná ka‰e + E2 p‰eniãná ka‰e + E3 p‰eniãná ka‰e + E4 kukufiiãné klíãky kukufiiãné klíãky + E1 kukufiiãné klíãky + E2 kukufiiãné klíãky + E3 kukufiiãné klíãky + E4

(g/l odstáté vody) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Tab 11: sloÏení produkãního média (Prod) ve 3. ãásti experimentu E1-E4 jsou vyizolované enzymové preparáty z extracelulárních enzymÛ následujících plísní: 1. Alternaria alternata CCM 8326 2. Fusarium solani CCM F-552 3. Aureobasidiu pollulans CCM F-148 4. Phanerochaete chrysosporium CCM 8074

(

51

)

4.2.3.4 Kultivace pfii vystavení kultury pÛsobení mutagenu U testovan˘ch kvasinek (viz kapitola 4.1.1) se také sledoval vliv pfiídavku alkylaãního ãinidla ethylesteru kyseliny methansulfonové (EMS) na produkci kvasinkov˘ch metabolitÛ a potenciální zmûny v DNA v dÛsledku vznikl˘ch mutací. EMS se pfiidával do produkãních glukózov˘ch médií. Podle jiÏ proveden˘ch experimentÛ byla zvolena koncentrace EMS v mnoÏství 10 mg/l (âarnecká M. 2006) pro anal˘zu metabolitÛ a izolaci DNA a 20 mg/l pro anal˘zu DNA. SoubûÏnû byla provedena kontrolní kultivace v‰ech kvasinek za optimálních podmínek. Kultivace probíhala 48 hod (izolace intaktní DNA) a 80 hod (anal˘za kvasinkov˘ch metabolitÛ).

4.3 Kultivace a uchovávání kompetentní Saccharomyces cerevisiae Kultivace kvasinek Saccharomyces cerevisiae obsahujících plazmid RedM1 nebo RedM2 probíhala za stálého tfiepání 160 rpm a pfii konstantní teplotû 30 °C. Oba kmeny byly nejprve zaoãkovány do inokulaãního média a po 24 hodinách kultivace centrifugovány 5 minut/4000 rpm. BuÀky byly následnû rozsuspendovány v 1 ml produkãního média a pfieneseny do zb˘vajícího mnoÏství produkãního média, ve kterém byly kultivovány. Kultivace byla ukonãena, jakmile se absorbance pfii 620 nm pohybovala v rozmezí 0,7-1. Zásobní kultury byly uchovávány na Petriho miskách s YNB médiem (6,7 g/l) obohacen˘ch xylózou (30 g/l) a agarem (15 g/l) pfii 4 °C.

4.3.1 SloÏení kultivaãních médií Kompetentní kvasinky Saccharomyces cerevisiae byly kultivovány na tekut˘ch YNB (Yeast Nitrogen Base) médiích 6,2 g/l obohacen˘ch glukózou 20 g/l (inokulaãní médium) nebo xylózou 40 g/l (produkãní médium); pufrováno 0,5 M hydrogenftalátem draseln˘m a doplnûno na poÏadovan˘ objem destilovanou vodou. Sterilace média probíhala v autoklávu oddûlenû od cukerné sloÏky, aby se zabránilo karamelizaci. Glukóza nebo xylóza byly pfiidány následnû k hotovému médiu pfii zachování sterilních podmínek.

α 4.4 Kultivace a uchovávání Escherichia coli DH5α Bakterie Escherichia coli DH5α se pro izolaci plazmidÛ kultivovaly na kapaln˘ch LB médiích (sloÏení uvádí tabulka 12) obohacen˘ch ampicilinem (1 ml/l). Kultivace probíhaly za stálého tfiepání na pohybliv˘ch deskách v termostatu pfii 37 °C pfies noc. Po transformaci byly kultivovány v LB médiu na Petriho miskách obsahujícím ampicilin a agar pfii 37 °C , poté uchovávány pfii 4 °C. SloÏení LB média Trypton Yeast extract NaCl 1M NaOH

10 g/l 5 g/l 5 g/l 1 ml

Tab. 12: sloÏení LB média

(

52

)

4.5 Anal˘zy provedené u karotenogenních kvasinek U v‰ech testovan˘ch kvasinek (viz kapitola 4. 1. 1) se sledovaly a vyhodnocovaly tyto parametry: mikroskopické pozorování morfologick˘ch zmûn, nárÛst kultury bûhem kultivace, produkce vybran˘ch metabolitÛ a biomasy, anal˘za chromozomální DNA a zmûny v genomu kvasinek po vystavení kultur stresov˘m podmínkám vyvolan˘ch nutriãním stresem nebo pÛsobením mutagenu.

4.5.1 Mikroskopické pozorování morfologick˘ch zmûn bunûk kvasinek Kapka suspenze bunûãn˘ch kultur se po pfiípadném nafiedûní pomocí kapátka pfienesla na podloÏní sklíãko a pfiikryla krycím sklíãkem. Zmûny v morfologii a pfiípadné neÏádoucí kontaminace byly sledovány pod svûteln˘m mikroskopem pfii zvût‰ení 640x. Jednotlivá pozorování mohla b˘t dokumentována uloÏením v poãítaãi, kter˘ byl napojen˘ na mikroskop, s vyuÏitím software Lucia Image active 5.0 (Laboratory Imaging s r. o., âR).

4.5.2 Vyhodnocení nárÛstu kultury, produkce biomasy a odbûr vzorkÛ K vyhodnocení nárÛstu kultur a produkce biomasy kvasinek bylo vyuÏito turbidimetrické mûfiení zákalu spektrofotometrem pfii vlnové délce 630 nm proti destilované vodû. Turbidita byla pfiepoãtena na hmotnost su‰iny (CDW) odeãtením z následujících regresních rovnic sestrojen˘ch experimentálnû pro jednotlivé analyzované kmeny (závislost gravimetricky stanovené su‰iny a optické hustoty bunûk): • Cystofilobasidium capitatum: OD630 = 1.966xCDW (g/l) • Rhodotorula aurantiaca: OD630 = 0.205 x CDW (g/l) – 0.018 • Rhodotorula glutinis: OD630 = 0.195 x CDW (g/l) – 0.023 • Rhodotorula mucilaginosa: OD630 = 0.230xCDW (g/l) • Sporobolomyces roseus: OD630 = 0.242xCDW (g/l) – 0.049 • Sporobolomyces shibatanus: OD630 = 0.205xCDW (g/l) – 0.018 JestliÏe média obsahovala pfiídavek odpadního substrátu, pouÏívalo se jako blank toto médium bez zaoãkovan˘ch kvasinek, ãímÏ se sníÏily nepfiesnosti v mûfiení. Stanovení nárÛstu kvasinek spektrofotometricky postupnû u v‰ech vzorkÛ se provádûlo pfii ukonãení kultivace v 48. hodinû (anal˘za genomu) nebo 80. hodinû (anal˘za metabolitÛ). V‰echna mûfiení se provedla 2x a vyhodnocena byla prÛmûrná hodnota. U v‰ech kvasinek (viz kapitola 4. 1. 1) se sledoval nárÛst biomasy. Po ukonãení kultivace se jednotlivé kultury postupnû centrifugovaly po dobu 10 minut a 5000 rpm za pokojové teploty. BuÀky byly poté promyty vodou, opût centrifugovány a nakonec se rozsuspendovaly ve fyziologickém roztoku. Takto byly uchovány pfii –20 °C k následnému pouÏití.

(

53

)

4.5.3 Extrakce karotenoidÛ a ergosterolu z bunûk kvasinek Pfii izolaci karotenoidÛ a ergosterolu, které jsou souãástí bunûãné stûny kvasinek, lze vyuÏít nûkolikastupÀovou extrakci se zm˘delnûním a oba metabolity vyizolovat souãasnû. Pro izolaci byly pouÏity vzorky z produkãních médií o obsahu 50 ml nebo 100 ml kultury. BuÀky se nejprve centrifugovaly 10 minut pfii 5000 rpm k odstranûní fyziologického roztoku, ve kterém byly uchovávány. Následnû se dezintegrovaly ve tfiecí misce s 50 ml acetonu a zm˘delÀovaly 30 minut/90 °C na vodní lázni v 10 % ethanolickém roztoku KOH. Po ochlazení se karotenoidy extrahovaly 3x postupn˘m pfiidáváním 50 ml diethyletheru. Spojené etherové vrstvy se odpafiily na vakuové odparce.

4.5.3.1 Identifikace a anal˘za karotenoidÛ a ergosterolu RP-HPLC/UV-VIS Extrakty se po odpafiení na vakuové odparce rozpustily v etanolu pro HPLC, pfiefiltrovaly pfies jednorázové filtry a pfievedly se do mikrocentrifugaãních zkumavek. Pfied samotnou anal˘zou se krátce centrifugovaly pfii 5000 rpm, aby nedo‰lo k zanesení dávkovacích kohoutÛ pfiípadn˘mi neãistotami. Separace probíhala izokraticky s pouÏitím sestavy HPLC (ECOM spol. s r. o.) viz kapitola 4.1.5 pfii 45 °C. Mobilní fází byl metanol pro HPLC (karotenoidy i ergosterol) s prÛtokem 1,0 ml/min, fotometrická detekce pfii 450 nm (karotenoidy) nebo 285 nm (ergosterol). K vyhodnocení dat slouÏil software Clarity (DataApex, âR). Dále se stanovoval obsah v‰ech karotenoidÛ ve vzorku. K celkov˘m hodnotám produkce karotenogenních pigmentÛ v˘znamnû pfiispívá kromû β-karotenu také torulen a torularhodin. Tyto látky ov‰em není lehké pfiesnû kvantifikovat vzhledem k nedostupnosti standardÛ. Pro odhad produkce celkov˘ch karotenoidÛ byla s ohledem na podobnost struktur pouÏita kalibraãní kfiivka β-karotenu a byly zde zahrnuty i deriváty torularhodinu (Márová I. et al., 2010).

4.5.4 Izolace a anal˘za chromozomální DNA V prÛbûhu optimalizace vhodné metody izolace chromozomální DNA byly vyzkou‰eny rÛzné techniky dezintegrace bunûãné stûny kvasinek s vyuÏitím lytick˘ch enzymÛ, lytick˘ch pufrÛ, ultrazvuku, detergentu SDS, sklenûn˘ch kuliãek a mofiského písku s acetonem, nejãastûji vzájemnû zkombinované. Vliv pouÏit˘ch postupÛ na bunûãnou stûnu byl pozorován pod mikroskopem a data byla analyzována a ukládána pomocí software Lucia Image active 5.0 (Laboratory Imaging s r. o., âR).

4.5.4.1 Pfiíprava protoplastÛ JelikoÏ komerãnû dodávan˘ lytick˘ enzym lytikáza (kapitola 2.4.5.1) není dostateãnû úãin˘ pfii rozbíjení bunûãné stûny karotenogenních kvasinek (Enzyme Information 2007), byly v rámci optimalizace pfiípravy kvasinkov˘ch chromozomÛ pro pulzní gelovou elektroforézu vyzkou‰eny rÛzné metody slouÏící k naru‰ení bunûãn˘ch stûn karotenogenních kvasinek. Rozbíjení bunûk ultrazvukem: BuÀky kvasinky Rhodotorula mucilaginosa z 48. hodiny kultivace byly zcentrifugovány 10 minut/5000 rpm, rozsuspendovány v etanolu, rozbíjeny (

54

)

pomocí ultrazvuku a následnû pozorovány pod mikroskopem. Podmínky experimentu: 50% v˘kon; 4 minuty; 1,5 sec/1 sec; sonda MS73. Rozbíjení bunûk ultrazvukem se smûsí enzymÛ: V následující ãásti experimentu byly tytéÏ buÀky zcentrifugovány a rozsuspendovány v 50 mM vychlazené EDTA, inkubovány 1 hod/37 °C se smûsí enzymÛ (lytikáza, proteináza K), vortexovány 5 minut, rozbíjeny pomocí ultrazvuku a následnû pozorovány pod mikroskopem. Podmínky experimentu: 50% v˘kon; 4 minuty; 1,5 sec/1 sec; sonda MS73. Rozbíjení bunûk enzymaticky s prodlouÏenou dobou inkubace: K buÀkám z pfiede‰lého experimentu kvasinky Rhodotorula mucilaginosa se pfiidal enzym lytikáza 13 mg/500 µl. Poté probíhala inkubace pfii 37 °C, v ãase t=1 hodina, t=4 hodiny byly vortexovány 5 minut a mikroskopovány. Dále rozbíjeny pomocí ultrazvuku a následnû pozorovány pod mikroskopem. Podmínky experimentu: 50% v˘kon; 4 minuty; 1,5 sec/1 sec; sonda MS73. U následujících dvou experimentÛ byly z dÛvodÛ nedostateãného mnoÏství bunûk R. mucilaginosa a pfiedpokládané znaãné podobnosti sloÏení bunûãné stûny kvasinek rodu Rhodotorula pouÏity R. glutinis a R. aurantiaca. Rozbíjení bunûk lytick˘m pufrem a enzymem: Kvasinka Rhodotorula glutinis byla centrifugována 10 minut/5000 rpm, rozsuspendována v lytickém pufru (1,2 M sorbitol, 50 mM citronan sodn˘, 50 mM fosforeãnan sodn˘, 50 mM EDTA, 1% β-merkaptoetanol) s pfiídavkem lytikázy (Burmeister M, Ulanovsky L. 1992). Po dvouhodinové inkubaci pfii 37 °C byla pozorována pod mikroskopem. Rozbíjení bunûk enzymov˘m koktejlem, SDS a sklenûn˘mi kuliãkami: BuÀky Rhodotorula aurantiaca se centrifugovaly a rozsuspendovaly v 50 mM EDTA s enzymovou smûsí (lytikáza 10 mg/ml, Proteináza K 2 mg/ml), 10% SDS a pfiídavkem sklenûn˘ch kuliãek pro snaωí homogenizaci. Pfiipraven˘ vzorek byl 5 minut vortexován, po 2 hodinách na vodní lázni mikroskopován. Rozbíjení bunûk homogenizací mofisk˘m pískem a acetonem: BuÀky kvasinek R. mucilaginosa, R. aurantiaca, R. glutinis a S. roseus se homogenizovaly po dobu 5 minut ve tfiecí misce po rozpu‰tûní v acetonu s pfiídavkem mofiského písku. Homogenizát se odlil do zkumavky a po usazení mofiského písku byly buÀky odpipetovány do ãisté zkumavky a pozorovány pod mikroskopem.

4.5.4.2 Izolace intaktní chromozomální DNA Izolace intaktní chromozomální DNA byla provedena podle prací (Cifuentes V. a kol 1997, Deak T. a kol 2000) a provedeno porovnání, která z metod bude pro karotenoidní kvasinky v˘hodnûj‰í. Po ukonãení kultivace byly buÀky karotenogenních kvasinek (viz kapitola 4.1.1) centrifugovány a promyty: a) v 50 mM EDTA o pH 7,5 a suspendovány v roztoku enzymu lytikáza pro rozbití bunûãn˘ch stûn kvasinek v koncentraci 4 mg enzymu/1x109 bunûk; suspenze byla smíchána s roztokem „Low melting point“ agarózy na v˘slednou 1% koncentraci ve 125 mM EDTA o pH 7,5; pfiedehfiáté na 42 °C. Následovala inkubace 30 minut/37 °C a distribuce do forem, (

55

)

ve kter˘ch jednotlivé bloãky ztuhnu pfii 4 °C. Agarózové bloãky byly inkubovány pfies noc v LET pufru (500 mM EDTA, 7,5% β-merkaptoetanol, 10 mM TRIS, pH 7,5) (Cifuentes V. a kol. 1997), nebo b) v LET pufru a distribuovány do bloãkÛ o koncentraci 6x108 bunûk; inkubace pfii 37 °C v LET pufru (500 mM EDTA, 7,5% β-merkaptoetanol, 10 mM TRIS, pH 7,5) s 25 mg/ml lytikázy (Deak T. a kol 2000). Dále následuje 24h inkubace v NDS pufru (500 mM EDTA, 1% lauroyl sarkosin, 10 mM Tris, pH 7,5) s enzymem Proteináza K (2 mg/ml), opût v NDS pufru a nakonec jsou promyty v 50 mM EDTA o pH 7,5 a v tomto roztoku jsou uchovány pfii 4 °C k pouÏití.

4.5.4.3 Optimalizace PFGE Srovnávací chromozomální DNA z modelové kvasinky S. cerevisiae pfiipravená v rámci experimentální ãásti pfiede‰lé dizertaãní práce (âarnecká M. 2010), DNA izolovaná z karotenogenních kvasinek z 50. hodiny kultivace a pro porovnání také z 80. hodiny kultivace byly separovány pulzní gelovou elektroforézou s homogenním elektrick˘m polem (CHEF-PFGE) pfii 10 °C. V rámci optimalizace metody se vyzkou‰ely rÛzné elektroforetické podmínky (koncentrace agarózového gelu 0,8-1,2%; 0,05 a 0,08 M TBE; napûtí 108 V, 135 V a 162 V; pulzní ãas od 20 s do 500 s k nalezení nejvhodnûj‰ího zpÛsobu separace kvasinkové DNA. Yeast chromosome PFG marker (16 chromozomÛ z S. cerevisiae YPH80; velikost 225-1900 kb) slouÏil za standard k urãení velikosti separovan˘ch chromozomÛ.

4.5.4.4 Barvení a vizualizace gelu Po skonãení elektroforetického dûlení kvasinkov˘ch chromozomÛ se gel barvil ve vodném roztoku ethidium bromidu (1 µg/ml) na tfiepaãce pfii 30 rpm/1 hodina, odbarvoval v destilované vodû 30 minut pfii 30 rpm. K vizualizaci byla pouÏita UV lampa a poãítaãov˘ software ScionImage.

4.6 Anal˘zy provedené u kompetentních bunûk S. cerevisiae α a E. coli DH5α V rámci experimentÛ, které se uskuteãnily ve spolupráci s Technickou univerzitou v Lundu bûhem zahraniãní stáÏe, byla provedena PCR amplifikace ãásti DNA nesoucí gen xylózareduktázy, bakteriální transformace E. coli DH5α, vyizolován bakteriální plazmid, provûfiení úspû‰nosti v izolaci plazmidu a jeho následného zavedení transformací do kvasinky S. cerevisiae, sekvenování plazmidÛ a promûfiena enzymatická aktivita xylózareduktázy.

(

56

)

4.6.1 PCR amplifikace regionu DNA kódujícího cílov˘ gen Pro amplifikaci úseku DNA zodpovûdného pro redukci xylózy na xylitol byla provedena PCR. Pro jednu PCR reakci se pfiipravila do PCR mikrozkumavek 5.5x PCR smûs skládající se z: Dream Taq DNA polymerázy, 2 mM dNTPs, PCR pufru, primerÛ F/R (Eurofins MWG Operon), templátové DNA a destilované vody do celkového objemu 50 µl. PCR mikrozkumavky se vloÏily do PCR aparatury a PCR bûÏela za následujících podmínek: 5 minut 94 °C; 30 cyklÛ s 94 °C/30 s, 50 °C/30 s, 72 °C/1 min; 72 °C/7 min. PCR produkty (lineární DNA) byly poté smíchány dohromady a pfieãi‰tûny E.Z.N.A.™ Cycle-pure kitem. 8 µl PCR produktu s 3 µl DNA „Loading buffer“ a 5 µl 1 kb DNA ladder jako standardu byly podrobeny horizontální elektroforéze v 1% agarózovém gelu (30 min/100 V).

4.6.2 Pfiíprava insertu k ligaci Pfieãi‰tûná DNA po PCR (insert) a DNA p425GPD byly na‰tûpeny restrikãními enzymy 1 a 2 (SPE I a Sal I); spoleãnû s pufrem Bam HI a destilovanou vodou do koneãného objemu 30 µl inkubovány 30 minut/37 °C. Po inkubaci byla provedena elektroforéza v 1% agarózovém gelu (20 µl vzorku + 5 µl loading pufru). Fragment odpovídající Ïádanému inzertu byl vyfiíznut z gelu a pfieãi‰tûn QIAQuick Gel Extraction kitem.

4.6.2.1 Ligace plazmidu Plazmidová ãást DNA pfiipravená v pfiede‰lém kroku byla podrobena ligaci s vektorem pGEMT-Easy (Promega, USA), ligázou T4 DNA, pufrem T4 DNA ligázy a destilovanou vodou do koneãného objemu 15 µl; 1 hod/ 22 °C na vodní lázni.

4.6.3 Amplifikace plazmidu v E. coli PomnoÏení smûsi po ligaci se provedlo bakteriální transformací kompetentní E. coli DH5α. 150 µl kompetentních bunûk se smíchalo s 10 µl ligovaného plazmidu a inkubováno 30 minut na ledu. Vzorek byl vystaven teplotnímu ‰oku (heat-shock) 1 min/42 °C a vrácen na 5 minut do ledové láznû. K transformované smûsi se sterilnû pfiidal 1 ml LB média a nechalo se inkubovat 1 hod/37 °C. Zcentrifugované buÀky (5 min/5000 rpm) byly rozsuspendovány v malém mnoÏství zbylého média a naoãkovány na Petriho misky s LB médiem + ampicilinem. Inkubace probíhala v termostatu pfii 37 °C pfies noc.

4.6.3.1 Izolace plazmidu z transformovan˘ch bakterií Bakteriální kolonie, které narostly na Petriho miskách po transformaci, byly zaoãkovány do kapalného LB média + amp a kultivovány pfies noc. Bakteriální plazmid byl izolován s Gene Jet™ Plasmid Miniprep Kit a pouÏit na transformaci kvasinek.

(

57

)

4.6.4 Transformace kvasinky S. cerevisiae Bakteriální plazmid vyizolovan˘ Gene Jet™ Plasmid Miniprep Kit se na‰tûpil s BamHI (1 hodina/37 °C) a slouÏil k transformaci kvasinky S. cerevisiae. Transformace probíhala litium-acetátovou metodou. Pfiíprava kompetentních bunûk: BuÀky S. cerevisiae byly kultivovány v YPD médiu pfies noc (OD620 = 0,7-1), centrifugovány (5 minut/4000 rpm/4 °C) a rozsuspendovány v 10 ml vychlazené sterilní destilované vody. BuÀky opût centrifugovány a rozsuspendovány v 1 ml ledové sterilní destilované vodû a pfievedeny do 1,5 ml mikrocentrifugaãních zkumavek a centrifugovány (1 minuta/5000 rpm). Poté se buÀky smíchaly s ãerstvû pfiipraven˘m a vychlazen˘m roztokem TE/LiOAc (150 µl 10*TE, 150 µl 10*LiOAc) a centrifugovaly (1 minuta/5000 rpm) a opût rozsuspendovaly s 200 µl TE/LiOAc. Transformace: 50 µl kompetentních bunûk S. cerevisiae se opatrnû smíchalo s 10 µl bakteriálního plazmidu a 5 µl sledí DNA (negativní kontrola neobsahovala bakteriální plazmid). Ihned bylo pfiidáno 300 µl ãerstvû pfiipraveného 40% PEG (800 µl 50% PEG, 100 µl 10*LiOAc, 100 µl 10*TE). Inkubace probíhala na pohyblivé desce 30 minut/30 °C a poté následoval teplotní ‰ok (heatshock) 15 minut/42 °C na vodní lázni. Transformované buÀky byly centrifugovány (1 minuta/5000 rpm), rozsuspendovány v 1 ml YPD média, inkubovány 2 hodiny/30 °C, 45 minut/led a zcentrifugovány (1 minuta/5000 rpm). BuÀky se 3x promyly sterilní destilovanou vodou a zaoãkovaly na YNB médium obsahujícím xylózu.

4.6.4.1 Izolace plazmidu z transformované kvasinky Bunûãné kultury transformované kvasinky byly po úspû‰né kultivaci na xylózou obohaceném YNB médiu centrifugovány (5 minut/4000 rpm), rozsuspendovány ve vodû, opût centrifugovány a rozsuspendovány v 1 ml protoplastickém roztoku (1,2 M sorbitol, 100 mM Tris, 10 mM CaCl2, 4 U/ml zymolyáza, 0,5% β-merkaptoetanol) a pfievedeny do mikrocentrifugaãních zkumavek. Následovala inkubace 30 minut/30 °C na pohyblivé desce. Plazmid se vyizoloval pomocí Plazmid mini prep kitu (Fermentas), restrikãnû na‰tûpil s BamHI (1 hodina/37 °C) a byla provedena kontrolní elektroforéza (0,8% agarózov˘ gel, 30 minut/100 V).

4.6.5 Sekvenování vyizolovaného plazmidu z transformované kvasinky Úspû‰nû vyizolované vzorky plazmidÛ z transformované kvasinky, které by mûly nést gen xylózareduktázy, byly zaslány na sekvenování u BM Labbet AB (Furulund, ·védsko).

(

58

)

4.6.6 Stanovení enzymatické aktivity reduktázy xylózy Transformované kvasinky nesoucí gen xylózareduktázy byly pro zji‰tûní enzymatické aktivity kultivovány na YNB médiu obsahujícím glukózu do exponenciální fáze. BuÀky se promyly sterilní vodou, zváÏily a rozsuspendovaly v proteinovém extrakãním roztoku Y-PER (Pierce, USA). Pro stanovení obsahu proteinÛ se pouÏil Coomassie Protein Assay Reagent (Pierce, USA). Aktivita NAD(P)H-dependentní xylózareduktázy se stanovila pomocí Ultrospec 2100 spektrometru (Amersham Biosciences, ·védsko) pfii OD340/30 °C v pufru TRA (100 mM, pH 7). Reakce byla nastartována pfiídavkem xylózy. Metoda byla optimalizována pro rÛzné koncentrace kofaktorÛ NAD(P)H ( 0,025 mM - 0,2 mM) a substrátu xylózy (0,1 M - 0,7 M). V˘sledky byly zpracovány v programu Openoffice 3.3.0 a MatLabu R2006 s vyuÏitím rovnice (1), která popisuje závislost poãáteãní rychlosti na koncentraci substrátÛ dvousubstrátové reakce, kde Vmax je maximální rychlost, [A] a [B] jsou koncentrace NAD(P)H a xylózy, respective KmA a KmB jsou Michaelisovy konstanty pro NAD(P)H a xylózu, KiA je pfiíslu‰ná disociaãní konstanta NAD(P)H. V = Vmax [A] [B]/(KiA KmB + KmB[A] + KmA[B]+ [A] [B])

(

59

)

(1)

(

60

)

5. V˘sledky a diskuze 5.1 Základní charakteristika karotenogenních kvasinek K úspû‰nému provedení experimentÛ zamûfien˘ch na nadprodukci cílovách analyzovan˘ch metabolitÛ a sledování zmûn ve fyziologii a morfologii karotenogenních kvasinek bylo nejprve nezbytné seznámit se s obecnou charakteristikou tûchto mikroorganismÛ pfii kultivacích za optimálních podmínek. Za optimální podmínky byly na základû pfiedchozích proveden˘ch experimentÛ (Dvofiáková T. 2008, âarnecká M. 2009) zvoleny: aerobní kultivace pfii 28 °C na glukózovém médiu s odstátou vodou za stálého osvûtlení a tfiepání pfii 90 rpm. Analyzované kvasinky vyrostly bûhem 5 aÏ 7 dnÛ a jejich rÛstová kfiivka vykazovala dvoustupÀov˘ nárÛst biomasy s prodlouÏenou stacionární fází (grafy 1-4). RÛstová charakteristika kvasinek R. glutinis a R. mucilaginosa, vykazující dvoustupÀov˘ nárÛst a prodlouÏenou stacionární fázi, byla provedena v pfiedcházející disertaãní práci (âarnecká M. 2009), a proto se experimenty se sledováním rÛstové charakteristiky zamûfiily na zb˘vající karotenogenní kvasinky.

5.1.1 RÛst karotenogeních kvasinek za optimálních podmínek kultivace

Cystofilobasidium capitatum:

Obr. 16: Mikroskopick˘ snímek (640x) a nátûr na Petriho misce C. capitatum

Graf 1: RÛstová kfiivka C. capitatum (

61

)

Rhodotorula aurantiaca:

Obr. 17: Mikroskopick˘ snímek (640x) a nátûr na Petriho misce – R. aurantiaca

Graf 2: RÛstová kfiivka R. aurantiaca Sporobolomyces roseus:

Obr. 18: Mikroskopick˘ snímek (640x) a nátûr na Petriho misce S. roseus

(

62

)

Graf 3: RÛstová kfiivka S. roseus Sporobolomyces shibatanus:

Obr. 19: Mikroskopick˘ snímek (640x) a nátûr na Petriho misce S. shibatanus

Graf 4: RÛstová kfiivka S. shibatanus Karotenoidní kvasinky se vyznaãují produkcí pigmentÛ Ïluté, oranÏové a ãervené barvy. BuÀky jsou kruhového aÏ protáhlého tvaru, jak lze vidût na obrázcích 16-19. Porovnáním rÛstov˘ch kfiivek podle grafÛ 1-4 si lze v‰imnout, Ïe v‰echny sledované kvasinky se vyznaãovaly dvou-

(

63

)

stupÀov˘m rÛstem a prodlouÏenou stacionární fází. Produkce biomasy dosahovala za dan˘ch kultivaãních podmínek kolem 5-9 g/l. První maxima se objevila u v‰ech sledovan˘ch kmenÛ kolem 50. hodiny kultivace. Druhé maximum bylo u kvasinek Sporobolomyces roseus a Sporobolomyces shibatanus u 80. hodiny a u kvasinek Rhodotorula aurantiaca a Cystofilobasidium capitatum kolem 100. hodiny kultivace. Podle v˘sledkÛ âarnecká M. 2009 je moÏné porovnat rÛstové vlastnosti karotenogenních kvasinek i s R. glutinis a R. mucilaginosa, které také dosahovaly dvou maxim bûhem kultivace, a to v 80. h a kolem 100 h kultivace. Vzhledem k tomu, Ïe rÛstová maxima jsou spojována s produkcí karotenoidÛ (viz kapitola 5.3.3.), byla pro následující experimenty, zamûfien˘mi na produkci kvasinkov˘ch metabolitÛ, zvolena 80. hodina kultivace, kdy se je‰tû dalo vylouãit potenciální rÛstové inhibice zpÛsobené nahromadûním toxick˘ch látek, stresu nebo nedostatku Ïivin. Del‰í doby kultivace mohu b˘t také problematické vzhledem k rostoucímu mnoÏství mrtv˘ch bunûk v médiu a vy‰‰ím produkãním nákladÛm. Pro izolaci a anal˘zu kvasinkové DNA byla vybrána 48. hodina kultivace, zasahující do exponenciální fáze rÛstu kvasinek. Pro porovnání byla intaktní DNA izolována i z 80. hodiny kultivace, a to a jak z ãerstv˘ch, tak i mrazen˘ch bunûk (viz kapitola 5.7.3).

5.2 Vliv environmentálních stresov˘ch faktorÛ na rÛst karotenogenních kvasinek Bunûãné organismy vyÏadují pro optimální rÛst specifické vnitfiní podmínky. K jejich udrÏení si organismy vyvinuly nesãetné strategie, které jim napomáhají adaptovat se a úspû‰nû pfiekonávat variabilní a ãasto i drsné podmínky vnûj‰ího prostfiedí. Kvasinky se musí pfiizpÛsobovat a odolávat v˘kyvÛm v mnoÏství a dostupnosti Ïivin, teplotû, kyselosti, osmotickému prostfiedí, pfiítomnosti ‰kodliv˘ch látek, záfiení apod. Z environmentálních stresov˘ch faktorÛ pÛsobících na buÀky kvasinek byly pro provedené experimenty vybrány osmotick˘ a oxidaãní stres nebo jejich vzájemná kombinace, obohacení kultivaãních médií ionty kovÛ selenu a chromu, kultivace na rÛzn˘ch odpadních substrátech k navození nutriãního stresu a sledování vlivu mutagenu na vybrané karotenogenní kvasinky. Se v‰emi uveden˘mi faktory se kvasinky mohou setkat i ve svém pfiirozeném prostfiedí a v zájmu pfieÏití aktivují pfiíslu‰né adaptaãní mechanismy. Pfii sledování vztahÛ mezi mûnícím se Ïivotním prostfiedím a funkãní genomikou je nutné provést kvantitativní rozbor fenotypov˘ch odpovûdí na jednotlivé stresové faktory. Pokud budou kvasinky pod vlivem stresov˘ch faktorÛ, dojde k fenotypové profilaci a budeme schopni rozpoznat jejich odezvu na zmûny prostfiedí. Cytotoxicitu lze charakterizovat urãením mnoÏství Ïivotaschopn˘ch bunûk a jejich nárÛstu, kter˘ bude záviset na síle pÛsobícího negativního faktoru Ïivotního prostfiedí. BuÀky kvasinek vystavené jednotliv˘m stresÛm se musí nejprve adaptovat zmûnám prostfiedí, coÏ bude vyÏadovat urãit˘ ãas, neÏ se zaãnou rychleji mnoÏit a rÛst v porovnání s optimálními podmínkami kultivace. Pfii pfiekroãení urãité koncentrace toxick˘ch látek zaãnou stresové faktory na kvasinky pÛsobit negativnû a dojde k apoptóze a/nebo nekróze (viz kapitoly 2.1.5, 2.1.5.1 a 2.1.5.2; Rosa C. A., Péter G. 2006).

(

64

)

5.2.1 Kultivace pfii pÛsobení osmotického stresu V závislosti na experimentech s R. glutinis proveden˘ch v pfiede‰lé práci (âarnecká M. 2009) byly karotenogenní kvasinky C. capitatum, R. aurantiaca, S. roseus a S. shibatanus vystaveny pÛsobení osmotického stresu indukovanému pfiídavkem NaCl o koncentracích 2%, 5% a 9% do produkãního média. Niωí koncentrace solí slouÏily ke sledování, zda dojde ke stimulaci rÛstu kvasinek a 9% NaCl byla vybrána jako negativní stresov˘ faktor (Ribeiro G. F., Corte-Real M., Johansson B. 2006). Kvasinka C. capitatum byla soubûÏnû kultivována za pÛsobení kombinovaného osmotického a oxidaãního stresu, kter˘ byl indukován pfiídavkem NaCl o koncentracích 2% a 5%, nebo pfiídavkem H2O2 o koncentracích 2 mM a 5 mM do inokulaãního média 2 (INO II), a/nebo do produkãního média.

5.2.1.1 Vliv osmotického stresu na rÛst Cystofilobasidium capitatum oznaãení kontrola 2% NaCl 5% NaCl 9% NaCl

0 0,58 0,56 0,46 0,48

4 0,74 0,97 0,76 0,61

8 1,22 1,20 0,81 0,84

24 1,63 1,42 0,94 0,89

Doba kultivace (hod) 28 32 35 48 52 56 2,57 2,77 3,54 4,73 4,98 4,09 1,70 1,78 2,26 3,26 3,66 3,31 1,09 1,27 1,58 2,01 2,24 2,80 0,97 1,07 1,32 1,70 1,98 2,03

59 4,43 3,51 3,05 2,14

74 5,09 3,61 3,05 2,57

78 5,34 4,25 3,54 2,49

81 5,77 4,35 3,69 2,82

98 6,59 4,58 3,89 2,54

103 6,71 4,76 4,02 2,59

127 5,90 2,47 2,26 1,86

Tab. 13: RÛst kultury C. capitatum pfii pÛsobení osmotického stresu

Graf 5: RÛst C. capitatum pfii pÛsobení osmotického stresu Z grafu 5 lze vyãíst nutnou del‰í dobu adaptace kvasinky na stresové podnûty vyvolané pfiídavky rÛzn˘ch koncentrací NaCl do kultivaãních médií. Pfiídavek soli sice zpÛsobuje pokles produkce biomasy, ale tento pokles není pfii niωí koncentraci NaCl pfiíli‰ v˘razn˘, v 80. hodinû klesla produkce biomasy v pfiítomnosti 2% NaCl o 25%, v pfiítomnosti 5% NaCl o 36% a aÏ v pfiítomnosti 9% NaCl poklesla produkce biomasy pfiibliÏnû na polovinu. Kvasinka je tedy schopna pomûrnû dobfie odolávat zv˘‰ené koncentraci solí, pokud jde o rÛstové vlastnosti. (

65

)

5.2.1.2 Vliv kombinovaného osmotického a oxidaãního stresu na rÛst Cystofilobasidium capitatum Kombinovan˘ stres vyvolan˘ postupnou aplikací stresového faktoru – nejprve o niωí koncentraci v inokulaãním médiu a poté o vy‰‰í koncentraci v produkãním médiu lze u nûkter˘ch kvasinek s v˘hodou vyuÏít k dosaÏení naprodukce metabolitÛ, ponûvadÏ kvasinky se mohou nejprve adaptovat na stres a poté sná‰ejí i vy‰‰í dávky stresového faktoru. Navíc byla u kvasinek popsána tzv. zkfiíÏená stresová odezva, kdy aplikace jednoho stresového faktoru umoÏní lep‰í odolnost vÛãi jinému stresovému faktoru o vy‰‰í koncentraci (Walker G. M. 1998). Kvasika C. capitatum byla podrobena nûkolika typÛm kombinovaného stresu. Oznaãení pro Inokulaãní médium II je v grafu oddûleno pomlãkou od oznaãení pro Produkãní médium: K (kontrola); 2% NaCl a 5%NaCl (soln˘ stres pfii tûchto koncentracích) 2 mM H2O2 a 5 mM H2O2 (peroxidov˘ stres pfii tûchto koncentracích).

Graf 6: RÛst C. capitatum pfii pÛsobení osmotického, oxidaãního a kombinovaného stresu (80. h kultivace)

(

66

)

V experimentu s kombinovan˘m pÛsobením osmotického a oxidaãního stresu na kvasinku C. capitatum (graf 6) si lze opût pov‰imnout poklesu rÛstu v pfiítomnosti vy‰‰ích koncentrací stresov˘ch faktorÛ. Nejvy‰‰ích rozdílÛ mezi nárÛstem kontrolní kultivace a za stresov˘ch podmínek je pfii pouÏití kombinovaného stresu vyvolaného pfiídavkem 5% NaCl do inokulaãního média 2 (INO II) v kombinaci jak s osmotick˘m tak i oxidaãním stresem v produkãních médiích a pfiídavkem 5 mM H2O2 do INO II a 2% NaCl v produkãním médiu. Naopak oxidaãní stres pÛsobí u nûkter˘ch kultivací mírnû stimulaãnû a bylo dosaÏeno i o nûco vy‰‰í produkce biomasy neÏ u kontrolní kultivace. Nejvy‰‰í produkce biomasy byla dosaÏena v pfiítomnosti 5 mM peroxidu v produkãním médiu (6,71 g/l). Je moÏné, Ïe lep‰í rÛstové vlastnosti jsou zpÛsobeny pfiítomností vy‰‰í koncentrací kyslíku pocházejícího z ãásteãného rozkladu peroxidu vodíku, coÏ stimuluje rÛst biomasy striktnû aerobních karotenogenních kvasinek. Pfiídavek soli vedl u kombinovan˘ch stresÛ k v˘raznûj‰ímu poklesu biomasy.

5.2.1.3 Vliv osmotického stresu na rÛst Rhodotorula aurantiaca Doba kultivace (hod) oznaãení 0 4 8 24 28 32 35 48 52 56 60 72 80 96 104 kontrola 0,60 1,27 2,06 3,12 3,78 4,15 4,31 4,64 4,89 4,40 3,93 4,90 5,28 5,71 5,99 2% NaCl 0,34 0,94 1,54 2,55 3,01 3,32 3,50 3,84 3,81 3,90 3,08 2,89 3,39 4,48 4,62 5% NaCl 0,26 0,50 0,67 1,15 1,03 1,26 1,06 1,60 1,70 1,78 1,80 1,93 1,56 1,50 1,33

108 5,64 4,15 1,31

Tab 14: RÛst kultury R. aurantiaca vystavené pÛsobení osmotického stresu

Graf 7: RÛst R. aurantiaca pfii pÛsobení osmotického stresu Kvasinka R. aurantiaca (graf 7) u osmotického stresu vykazovala podobné chování jako C. capitatum. I zde niωí koncentrace stresového faktoru v˘raznûj‰ím zpÛsobem neovlivnila rÛst a produkci metabolitÛ. V 80. h kultivace byl nárÛst biomasy pfii pouÏití 2% NaCl sníÏen o 36%,

(

67

)

u 5% NaCl je tento pokles jiÏ 70%. Pokud se jedná o rÛstové vlastnosti, nedovede R. aurantiaca v porovnání s C. capitatum sná‰et vy‰‰í koncentrace solí.

5.2.1.4 Vliv osmotického stresu na rÛst Sporobolomyces roseus oznaãení kontrola 2% NaCl 5% NaCl 9% NaCl

0 0,66 0,60 0,55 0,49

4 0,88 0,72 0,60 0,51

8 1,30 0,76 0,62 0,49

24 2,43 1,81 1,44 0,66

Doba kultivace (hod) 28 32 35 48 52 56 2,87 4,21 5,00 6,48 6,26 6,15 2,08 2,25 2,70 3,26 2,25 1,75 1,61 1,73 2,10 2,45 1,98 1,40 0,88 0,88 1,21 1,63 1,57 1,59

59 6,77 1,71 1,44 1,30

74 7,64 2,12 1,86 1,48

78 7,89 2,39 2,00 1,92

81 8,05 2,62 2,14 1,81

98 4,25 1,46 1,13 1,03

103 4,15 1,42 1,17 0,97

127 3,92 1,36 1,21 1,07

Tab 15: RÛst kultury S. roseus vystavené pÛsobení osmotického stresu

Graf 8: RÛst S. roseus pfii pÛsobení osmotického stresu Ze v‰ech ãtyfi sledovan˘ch kvasinek vykazovala S. roseus nejvy‰‰í rozdíly mezi kontrolní kultivací a kultivacemi v pfiítomnosti osmotického stresového faktoru (graf 8). Je zde patrná del‰í doba adaptace na stres a sníÏen˘ aÏ potlaãen˘ rÛst. Kvasinky kmene Sporobolomyces roseus sná‰ejí pfiítomnost NaCl v médiu podstatnû hÛfie neÏ pfiedchozí studované kmeny; pokles produkce biomasy byl v pfiípadû pfiídavku 2% NaCl na cca 30 % pÛvodní hodnoty, pfiiãemÏ dal‰í zvy‰ování koncentrace soli jiÏ nemûlo na pokles tvorby biomasy v˘znamnûj‰í vliv. Lze oãekávat, Ïe pouÏití NaCl stresu jako indukãního faktoru pro produkci jak˘chkoli metabolitÛ bude v˘znamnû souviset se zmûnami produkce biomasy.

(

68

)

5.2.1.5 Vliv osmotického stresu na rÛst Sporobolomyces shibatanus oznaãení kontrola 2% NaCl 5% NaCl 9% NaCl

0 0,38 0,43 0,38 0,33

4 0,65 0,62 0,36 0,33

8 0,84 0,65 0,55 0,38

24 2,14 1,04 0,65 0,58

Doba kultivace (hod) 28 32 35 48 52 56 3,26 3,53 4,16 4,99 4,62 2,75 1,38 1,55 2,75 3,55 2,45 2,31 0,82 1,28 1,84 2,53 1,65 1,31 0,80 0,89 1,19 1,31 0,87 0,67

59 2,38 2,19 1,14 0,70

74 2,72 2,36 1,26 0,77

78 3,04 2,55 1,75 0,72

81 3,40 2,97 1,94 0,92

98 2,67 2,04 1,75 0,94

103 2,62 2,01 1,55 0,82

127 2,58 1,87 1,43 0,65

Tab 16: RÛst kultury S. shibatanus vystavené pÛsobení osmotického stresu

Graf 9: RÛst S. shibatanus pfii pÛsobení osmotického stresu Na rozdíl od S.roseus vykazuje kvasinka S.shibatanus (graf 9) podstatnû vy‰‰í odolnost vÛãi pfiítomnosti soli v médiu; v produkãní fázi (80. h) je biomasa v pfiítomnosti 2% NaCl prakticky beze zmûn a aÏ se zvy‰ující se koncentrací dochází k poklesu rÛstu. U 5% NaCl byl rÛst sníÏen o 43 %, u 9% NaCl o 66 %. Pfii celkovém posouzení vlivu osmotického stresu na karotenogenní kvasinky lze dojít k závûru, Ïe u C. capitatum a S. shibatanus nedochází k v˘raznému poklesu nárÛstu kultury pfii pÛsobení niωích koncentrací soli. K poklesu rÛstu dojde aÏ pfii pÛsobení 9% NaCl u C. capitatum o 50 %, u S. shibatanus o 70 %. Niωí koncentrace NaCl tyto kvasinky sná‰í velmi dobfie a není tedy negativnû ovlivnûna produkce biomasy, ãehoÏ by se dalo vyuÏít pfii prÛmyslov˘ch kultivacích obohacené biomasy. Vy‰‰ího specifického rÛstu pfii vystavení NaCl bylo dosaÏeno i u R. mucilaginosa (Hernández-Saavedra N., Ochoa J. L., Vazquez-Dulhalt R. 1995). Na druhou stranu u kvasinek R. aurantiaca a S. roseus je moÏné zaznamenat niωí sná‰enlivost vÛãi koncentracím soli v médiu, nejv˘raznûji tomu bylo u kvasinky S. roseus, kdy i 2% NaCl v produkãní fázi (80. h) vyvolalo témûfi 70% pokles v produkci biomasy. Kvasinka R. glutinis se vyznaãovala podobn˘mi rÛstov˘mi vlastnostmi jako R. aurantiaca, niωí koncentrace soli v médiu zpÛsobily 40-70% pokles rÛstu a tedy niωí adaptaãní schopnosti (âarnecká M. 2009). (

69

)

5.2.2 Kultivace pfii pÛsobení oxidaãního stresu Karotenogenní kvasinky C. capitatum, R. aurantiaca, S. roseus a S. shibatanus byly vystaveny pÛsobení oxidaãního stresu indukovaného pfiídavkem H2O2 o koncentracích 2 mM, 5 mM v produkãním médiu, a jako negativní stresov˘ faktor slouÏila koncentrace 100 mM. Kvasinka C. capitatum byla soubûÏnû kultivována za pÛsobení kombinovaného osmotického a oxidaãního stresu, kter˘ byl indukován pfiídavkem NaCl o koncentracích 2% a 5%, nebo pfiídavkem H2O2 o koncentracích 2 mM a 5 mM do inokulaãního média 2 (INO II), a/nebo do produkãního média. V˘sledky z tohoto experimentu jsou shrnuty v kapitole 5.2.1.2.

5.2.2.1 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Cystofilobasidium capitatum oznaãení 0 kontrola 0,58 2 mM H2O2 0,56 5 mM H2O2 0,46 100 mM -“- 0,48

4 0,74 0,97 0,76 0,61

8 1,22 1,20 0,81 0,84

24 1,63 1,42 0,94 0,89

Doba kultivace (hod) 28 32 35 48 52 56 2,57 2,77 3,54 4,73 4,98 4,09 1,70 1,78 2,26 3,26 3,66 3,31 1,09 1,27 1,58 2,01 2,24 2,80 0,97 1,07 1,32 1,70 1,98 2,03

59 4,43 3,51 3,05 2,14

74 5,09 3,61 3,05 2,57

78 5,34 4,25 3,54 2,49

81 5,77 4,35 3,69 2,82

98 6,59 4,58 3,89 2,54

103 6,71 4,76 4,02 2,59

127 5,90 2,47 2,26 1,86

Tab 17: RÛst kultury C. capitatum vystavené pÛsobení oxidaãního stresu

Graf 10: RÛst C. capitatum pfii pÛsobení oxidaãního stresu Podobnû jako u osmotického stresu (graf 5) je i oxidaãní stres (graf 10), vyvolan˘ pfiídavkem H2O2 do kultivaãních médií, charakteristick˘ nev˘razn˘m, maximálnû 35% poklesem rÛstu pfii niωích koncentrací H2O2 a niωí rÛstovou schopností kvasinky pfii vy‰‰í koncentraci H2O2 o 50%. VyuÏití tûchto kvasinek pfii kultivacích za oxidaãního stresu nebude z prÛmyslového hlediska vzhledem k pomûrnû nízké produkci biomasy pfiíli‰ nadûjné. (

70

)

5.2.2.2 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Rhodotorula aurantiaca

oznaãení 0 4 8 24 kontrola 0,60 1,27 2,06 3,12 2 mM H2O2 0,34 0,94 1,54 2,55 5 mM H2O2 0,26 0,50 0,67 1,15

Doba kultivace (hod) 28 32 36 48 52 56 60 72 80 96 104 108 3,78 4,15 4,31 4,64 4,89 4,40 3,93 4,90 5,28 5,71 5,99 5,64 3,01 3,32 3,50 3,84 3,81 3,90 3,08 2,89 3,39 4,48 4,62 4,15 1,03 1,26 1,06 1,60 1,70 1,78 1,80 1,93 1,56 1,50 1,33 1,31

Tab 18: RÛst kultury R. aurantiaca vystavené pÛsobení oxidaãního stresu

Graf 11: RÛst R. aurantiaca pfii pÛsobení oxidaãního stresu U kvasinky R. aurantiaca (graf 11) nebyl zaznamenán tak strm˘ pokles v rÛstu jako u ostatních kvasinek v pfiítomnosti peroxidu v médiu. U 5 mM H2O2 je sice vidût del‰í adaptace pfied zapoãetím rÛstu, nicménû se nezdá, Ïe by i tato vy‰‰í koncentrace pÛsobila na kvasinku toxicky. Produkce biomasy je i po vystavení kvasinky oxidaãnímu stresu beze zmûn. Je zde je‰tû více neÏ u C. capitatum (graf 10) vidût pozitivní vliv peroxidu vodíku na aerobní kvasinky, kdy pfiítomnost vy‰‰í koncentrace kyslíku v médiu pocházejícího z rozkladu H2O2 vede ke stimulaci rÛstu.

(

71

)

5.2.2.3 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Sporobolomyces roseus oznaãení 0 kontrola 0,66 2 mM H2O2 0,60 5 mM H2O2 0,55 100 mM -“- 0,49

4 0,88 0,72 0,60 0,51

8 1,30 0,76 0,62 0,49

24 2,43 1,81 1,44 0,66

Doba kultivace (hod) 28 32 35 48 52 56 2,87 4,21 5,00 6,48 6,26 6,15 2,08 2,25 2,70 3,26 2,25 1,75 1,61 1,73 2,10 2,45 1,98 1,40 0,88 0,88 1,21 1,63 1,57 1,59

59 6,77 1,71 1,44 1,30

74 7,64 2,12 1,86 1,48

77 7,89 2,39 2,00 1,92

78 8,05 2,62 2,14 1,81

81 4,25 1,46 1,13 1,03

103 4,15 1,42 1,17 0,97

127 3,92 1,36 1,21 1,07

Tab 19: RÛst kultury S. roseus vystavené pÛsobení oxidaãního stresu

Graf 12: RÛst S. roseus pfii pÛsobení oxidaãního stresu S. roseus se vyznaãoval jak v pfiípadû osmotického stresu (graf 8), tak i v oxidaãním stresu (graf 12) velmi nízkou schopností adaptace. JiÏ nízká koncentrace stresov˘ch faktorÛ mûla za následek cytotoxicitu. V produkãní fázi rÛstu jiÏ 2 mM H2O2 zpÛsobil témûfi 68% pokles tvorby biomasy a také vy‰í koncentrace peroxidu jiÏ nepÛsobily dal‰í v˘razné zmûny. Kmen reaguje na peroxid podobnû jako na sÛl, coÏ mÛÏe souviset s omezen˘mi adaptaãními schopnostmi, ty mohou b˘t podmínûny charakterem pfiirozeného nalezi‰tû – lesní pÛda, odkud byl pfiírodní kmen získán.

(

72

)

5.2.2.4 Vliv oxidaãního stresu na rÛst Sporobolomyces shibatanus oznaãení 0 kontrola 0,38 2 mM H2O2 0,43 5 mM H2O2 0,38 100 mM -“- 0,33

4 0,65 0,62 0,36 0,33

8 0,84 0,65 0,55 0,38

24 2,14 1,04 0,65 0,58

Doba kultivace (hod) 28 32 35 48 52 56 3,26 3,53 4,16 4,99 4,62 2,75 1,38 1,55 2,75 3,55 2,45 2,31 0,82 1,28 1,84 2,53 1,65 1,31 0,80 0,89 1,19 1,31 0,87 0,67

59 2,38 2,19 1,14 0,70

74 2,72 2,36 1,26 0,77

77 3,04 2,55 1,75 0,72

78 3,40 2,97 1,94 0,92

81 2,67 2,04 1,75 0,94

103 2,62 2,01 1,55 0,82

127 2,58 1,87 1,43 0,65

Tab 20: RÛst kultury S. shibatanus vystavené pÛsobení oxidaãního stresu

Graf 13: RÛst S. shibatanus pfii pÛsobení oxidaãního stresu U kvasinky S. shibatanus kultivované za oxidaãního stresu (graf 13) do‰lo s pouÏitím 5 mM a vy‰‰í koncentrace H2O2 k v˘raznému prodlouÏení adaptaãní fáze. Z pfiedloÏen˘ch v˘sledkÛ je patrné, Ïe nízké koncentrace oxidaãních i osmotick˘ch stresÛ nemají zásadní vliv na samotn˘ rÛst kvasinek. U v‰ech sledovan˘ch karotenogenních kvasinek kromû S. roseus se mÛÏeme setkat s dobr˘mi rÛstov˘mi vlastnostmi a produkcí biomasy v pfiítomnosti i vy‰‰ích koncentrací peroxidu vodíku v médiu, kdy uvolÀující se kyslík zfiejmû pÛsobí na rÛst aerobních karotenogenních kvasinek stimulaãnû. R. aurantiaca se vyznaãovala nezmûnûn˘mi rÛstov˘mi vlastnosmi i v pfiítomnosti vy‰‰ích koncentrací H2O2, stejn˘ch v˘sledkÛ bylo dosaÏeno i u kvasinek R. glutinis (âarnecká M. 2009) a R. mucilaginosa (Moore M. M., Bredveld M. W., Autor A. P. 1989). Ov‰em kultivaãní experimenty na tfiepaãkách mají niωí míru reprodukovatelnosti, dochází zajisté ke zmûnám prostfiedí bûhem kultivace a odbûru vzorkÛ. Reprodukovatelnost experimentu by se mohla nav˘‰it sledováním a mûfiením mikrokultur, kde by se snadnûji zachovaly jednotlivé rÛstové podmínky, pfiípadnû fiízenou kultivací ve fermentoru (Buzzini P. 2001).

(

73

)

5.2.3 Kultivace s pfiídavkem iontÛ kovÛ Vliv kovÛ byl studován podrobnûji pouze u kvasinky C. Capitatum, a to zejména za úãelem otestování potenciálních pozitivních produkãních vlastností kmene. Provedení experimentu je podrobnû popsáno v kapitole 4.2.3.2. Oznaãení pro Inokulaãní médium II je v grafu oddûleno pomlãkou od oznaãení pro Produkãní médium.

Graf 14: RÛst C. capitatum za vystavení kultury iontÛm kovÛ V kultivacích s pfiídavky iontÛ kovÛ si lze v grafu 14 pov‰imnout sníÏeného nárÛstu kvasinky C. capitatum v pfiítomnosti 1 mM selenu. Je zajímavé, Ïe tato koncentrace mûla negativní vliv na rÛst v obou pfiípadech experimentu. Pravdûpodobnû jiÏ tato vysoká koncentrace selenu pÛsobí na kvasinku toxicky. Pokud byl selen v 1 mM koncentraci pfiidán ihned po inokulaci do produkãního média, byla rÛstová schopnost sníÏena témûfi 3x v porovnání s kontrolní kultivací. (

74

)

Pfiídavek chromu v testovan˘ch koncentracích nemûl v˘znamn˘ vliv na rÛst kultury, coÏ by bylo vyuÏitelné pfii pfiípadné sorpci nebo transportu kovu do bunûk.

5.2.4 Kultivace karotenogenních kvasinek na rÛzn˘ch odpadních substrátech RÛst kvasinek je závisl˘ na zvolen˘ch kultivaãních podmínkách (pH, teplota, aerace, Ïiviny.). Porovnání rÛstu jednotliv˘ch kmenÛ kvasinek na rÛzn˘ch zdrojích uhlíku a dusíku je moÏné pouze v pfiípadû dodrÏení stejn˘ch podmínek kultivace. Pro experimenty byly za optimální podmínky kultivace zvoleny na základû pfiede‰l˘ch zku‰eností s karotenogenními kvasinkami (Dvofiáková T. 2008, âarnecká M. 2009) teplota 28 °C, stálá aerace, osvûtlení a tfiepání 90 rpm. NárÛst biomasy byl sledován v médiích obsahujících za zdroj uhlíku glukózu (40g/l) a kvasniãn˘ autolyzát (7g/l) jako zdroj dusíku. Tato kultivace byla oznaãena za kontrolní a porovnávala se s produkcí biomasy kvasinek kultivovan˘mi na rÛzn˘ch odpadních substrátech (jableãná vláknina, jableãné a hru‰kové slupky, upravená a neupravená syrovátka, tûstoviny, kukufiiãné klíãky, p‰eniãná ka‰e). Kontrolní kultivace byla zafiazena ke kaÏdé sérii kultivaãních experimentÛ za úãelem monitoringu variability rÛstu kultury a zejména za úãelem srovnání vyuÏitelnosti dalného odpadního substrátu.

5.2.4.1 RÛst Cystofilobasidium capitatum kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech Provedené experimenty s vyuÏitím rÛzn˘ch zdrojÛ odpadních substrátÛ jakoÏto zdroje uhlíku a dusíku pro kvasinku C. capitatum, jsou shrnuty v grafech 15-17.

Graf 15: NárÛst kvasinky C. capitatum kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech v 1. ãásti experimentu

(

75

)

Graf 16: NárÛst kvasinky C. capitatum kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech ve 2. ãásti experimentu

(

76

)

Graf 17: NárÛst kvasinky C. capitatum kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech ve 3. ãásti experimentu Z v˘sledkÛ obsaÏen˘ch v grafech 15-17 je patrné, Ïe ovocné i ‰krobnaté odpadní substráty jsou vhodné ke kultivaci kvasinky C. capitatum. Ovocné ov‰em pouze v pfiípadû pfiítomnosti glukózy v médiu. Pokud probíhala kultivace pouze na samotn˘ch ovocn˘ch substrátech (hru‰kové slupky), do‰lo k v˘raznému aÏ témûfi trojnásobnému poklesu nárÛstu kvasinkové biomasy v porovnání s pfiíslu‰nou kontrolní kultivací. U vyuÏití ‰krobnat˘ch substrátÛ do‰lo po enzymatické hydrol˘ze k mírnému poklesu rÛstu kvasinky, coÏ bylo nejvíce patrné ( 2x niωí oproti kontrole) u enzymatického preparátu ã. 2 (F. solani) v kombinaci s kultivací na vlákninû. Obecnû lze konstatovat, Ïe kvasinka C. capitatum je schopna vyuÏívat prakticky v‰echny testované odpadní substráty, lep‰ích v˘sledkÛ bylo dosaÏeno na substrátech obsahujících dodateãné zdroje dusíku (tûstoviny, syrovátka) a na jableãné vlákninû.

(

77

)

5.2.4.2 RÛst Rhodotorula aurantiaca kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech

Graf 18: NárÛst kvasinky R. aurantiaca kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech v 1. ãásti experimentu

Graf 19: NárÛst kvasinky R. aurantiaca kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech ve 2. ãásti experimentu (

78

)

Graf 20: NárÛst kvasinky R. aurantiaca kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech ve 3. ãásti experimentu V˘sledky nárÛstu kvasinky jsou shrnuty v grafech 18-20. Pfii kultivacích R. aurantiaca na ovocn˘ch odpadních substrátech bylo dosaÏeno opût dobr˘ch rÛstov˘ch vlastností v pfiípadû pfiítomnosti glukózy v médiu. Kultivace na jableãné vlákninû s nebo bez pfiedchozí enzymatické hydrol˘zy kromû pouÏití 4. enzymového preparátu, vykazovala rovnûÏ dobré produkãní vlastnosti. Naopak pouÏití ‰krobnat˘ch odpadních substrátÛ se pfii kultivaci R. aurantiaca nejeví jako vhodné. NárÛst biomasy je zde oproti kontrolní kultivaci pomûrnû nízk˘. I po pfiedchozí enzymatické hydrol˘ze nebylo dosaÏeno efektivního nárÛstu, a to zejména u kultivace na kukufiiãn˘ch klíãcích a p‰eniãné ka‰i, kdy pouÏité enzymy nedokázaly fiádnû roz‰tûpit substrát a do‰lo tedy jen k ãásteãnému rÛstu kvasinky.

(

79

)

5.2.4.3 RÛst Rhodotorula glutinis a S. roseus kultivovan˘ch na rÛzn˘ch odpadních substrátech Na základû jiÏ proveden˘ch experimentÛ s kultivacemi na rÛzn˘ch odpadních substrátech v pfiede‰lé práci (âarnecká M. 2009), byly pro kvasinky R. glutinis a S. roseus vybrány kultivace na tûch odpadních substrátech, které nebyly v pfiedchozí práci provedeny a poslouÏily k porovnání dosaÏen˘ch v˘sledkÛ s ostatními zde testovan˘mi karotenogenními kvasinkami.

Graf 21: NárÛst kvasinky R. glutinis kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech ve 3. ãásti experimentu

(

80

)

Graf 22: NárÛst kvasinky S. roseus kultivované na rÛzn˘ch odpadních substrátech v 1. a 3. ãásti experimentu U kvasinek R. glutinis a S. roseus (graf 21 a 22) nebyly zaznamenány v˘razné poklesy v nárÛstu kultur kultivovan˘ch jak na ‰krobnat˘ch substrátech bez pfiede‰lé enzymatické hydrol˘zy pomocí extracelulárních enzymÛ vyizolovan˘ch z plísní, tak i po hydrol˘ze vzhledem ke kontrolním kultivacím. U kvasinky S. roseus byl pouze mírn˘ pokles rÛstu u ovocn˘ch substrátÛ. Obecnû lze fiíci, Ïe v‰echny zde testované kvasinky se vyznaãovaly dobr˘mi rÛstov˘mi vlastnostmi pfii kultivacích na rÛzn˘ch odpadních substrátech, které se jeví jako potenciálnû moÏné pfii pouÏití v prÛmyslové praxi. U C. capitatum by se jednalo o média hlavnû s dodateãn˘mi dusíkat˘mi zdroji (syrovátka a tûstoviny), pro R. aurantiaca by byla vhodná zejména jableãná vláknina, kvasinky R. glutinis a S. roseus by mohly b˘t v prÛmyslové praxi kultivovány prakticky na v‰ech zde testovan˘ch substrátech.

(

81

)

5.2.5 Kultivace karotenogenních kvasinek v pfiítomnosti mutagenu Kultivace v pfiítomnosti EMS byly realizovány podle postupu uvedeného v kapitole 4.2.3.4. Kvasinky vystavené pÛsobení mutagenu se vyznaãovaly pfii kultivacích v kapalném médiu s EMS zfieteln˘m poklesem intenzity zabarvení i zmûnami v morfologii (viz kapitoly 5.3.3 a 5.4.4). Ov‰em pfii následném naoãkování v‰ech kmenÛ v 80. h kultivace na Petriho misky za úãelem vizuální selekce jednotliv˘ch kolonií, do‰lo pfii rÛstu na glukózovém médiu s pfiidan˘m agarem ke klasickému oranÏovému zbarvení vût‰iny kolonií kvasinek. Vizuální v˘bûr mutantÛ byl tedy znaãnû obtíÏn˘, vzhledem k tomu, Ïe pfii porovnání kvasinek po pÛsobení EMS a kontrolních vzorkÛ nebylo moÏné zfietelnû rozeznat barevné zmûny jednotliv˘ch kolonií.

Graf 23: RÛst karotenogeních kvasinek kultivovan˘ch za pÛsobení mutagenu Podle grafu 23 lze vzájemnû porovnat vliv pÛsobení mutagenu ethylesteru kyseliny metansulfonové (EMS) pfiidané do produkãních médií o koncentraci 10 mg/l. Sledované karotenogenní kvasinky vykazovaly rozdílné chování u jednotliv˘ch selektovan˘ch mutantÛ. Zatímco rÛst u vybraného mutantu R. mucilaginosa nebyl nijak pozmûnûn pfiídavkem mutagenu, selektované mutanty C. capitatum a R. aurantiaca se vyznaãovaly mírn˘m poklesem v rÛstu. U mutantu C. capitatum byl rÛst niωí témûfi 1,5x oproti kontrolní kultivaci. Naopak u mutantÛ kvasinek R. glutinis a S. shibatanus mûlo vystavení kultur úãinkÛm EMS spí‰e stimulující efekt na rÛst. Produkce biomasy mutantu R. glutinis byla 1,5x vy‰‰í neÏ u kontroly. Mutageneze je jednou z nejpouÏívanûj‰ích metod k pfiípravû kmenÛ s nov˘mi ãi pozmûnûn˘mi vlastnostmi. Náhodná metageneze a následná selekce mutantÛ podle fenotypu je v‰ak velmi zdlouhavá a pracná a v rámci pfiedloÏené práce nebylo z ãasov˘ch dÛvodÛ moÏné provést dal‰í rozsáhlé experimenty. (

82

)

5.3 Vliv environmentálních stresov˘ch faktorÛ na morfologii karotenogenních kvasinek Pozorování zmûn v morfologii mikroorganismÛ pod mikroskopem je jednou z moÏností rychlého odhalení viditeln˘ch zmûn pfiizpÛsobení se organismÛ na pÛsobení Ïivotního prostfiedí. Lze se velmi rychle dovûdût o zpÛsobech, jak˘mi kvasinky reagují na rÛzné stresové situace a odhalit neÏádoucí pfiítomné kontaminace. Dal‰ím indikátorem adaptace na zmûny prostfiedí, kter˘ je také velmi snadno pozorovateln˘, jsou barevné odli‰nosti mezi jednotliv˘mi kulturami kvasinek kultivovan˘mi za optimálních podmínek nebo pfii vystavení pÛsobení stresov˘ch faktorÛ (viz kapitola 5.4).

5.3.1 Morfologie kvasinek C. capitatum kultivovan˘ch pfii pÛsobení osmotického a oxidaãního stresu Na následujících snímcích jsou zobrazeny mikroskopické záznamy (640 x) morfologick˘ch zmûn kvasinky C. capitatum kultivované za pÛsobení osmotického, oxidaãního nebo kombinovaného stresu.

Obr. 20: Produkãní média zleva: kontrola, 2% NaCl, 2 mM H2O2, 5% NaCl, 5 mM H2O2

Obr. 21: INO II s 2% NaCl a Prod zleva: kontrola, 2% NaCl, 2 mM H2O2, 5% NaCl, 5 mM H2O2

(

83

)

Obr. 22: INO II s 5% NaCl a prod zleva: kontrola, 2% NaCl, 2 mM H2O2, 5% NaCl, 5 mM H2O2

Obr. 23: INO II s 2 mM H2O2 a Prod zleva: kontrola, 2% NaCl, 2 mM H2O2, 5% NaCl, 5 mM H2O2

Obr 24: INO II s 5mM H2O2 a Prod zleva: kontrola, 2% NaCl, 2 mM H2O2, 5% NaCl, 5 mM H2O2 Na obr. 20-24 si mÛÏeme pov‰imnout silnûj‰ích bunûãn˘ch stûn u kvasinek kultivovan˘ch za pfiítomnosti osmotického, oxidaãního a kombinovaného stresu. Tento efekt je pravdûpodobnû zpÛsoben nahromadûním karotenoidních pigmentÛ, které vznikají jako odezva na stres a ukládají se ve stûnách. Pfiítomnost dûlících se bunûk také ukazuje na stále fungující metabolismus i v pfiítomnosti stresov˘ch faktorÛ. PÛsobení H2O2 na kvasinky mûlo za následek vût‰í po‰kození bunûk oproti stresu osmotickému, obzvlá‰È pfii kombinovaném oxidaãním stresu.

5.3.2 Morfologie kvasinek kultivovan˘ch na odpadních substrátech Na obr 25-36 jsou zobrazeny mikroskopické snímky (640x) jednotliv˘ch karotenogenních kvasinek kultivovan˘ch na rÛzn˘ch odpadních substrátech.

(

84

)

5.3.2.1 Morfologie Cystofilobasidium capitatum

Obr. 25: Mikroskopické snímky C. capitatum na médiích zleva: kontrola, jableãné slupky, hru‰kové slupky

Obr. 26: Mikroskopické snímky C. capitatum na médiích zleva: tûstoviny, tûstoviny + E1, tûstoviny + E2, tûstoviny + E3, tûstoviny + E4

Obr. 27: Mikroskopické snímky C. capitatum na médiích zleva: p‰eniãná ka‰e, p‰eniãná ka‰e + E1, p‰eniãná ka‰e + E2, p‰eniãná ka‰e + E3, p‰eniãná ka‰e + E4

Obr. 28: Mikroskopické snímky C. capitatum na médiích zleva: vláknina, vláknina + E1, vláknina + E2, vláknina + E3, vláknina + E4 Mikroskopické snímky 25-28 zachycují kvasinku C. capitatum kultivovanou na rÛzn˘ch odpadních substrátech. Je moÏné si zde pov‰imnout silnûj‰ích bunûãn˘ch stûn pfii vystavení nutriãním stresÛm oproti kontrolní kultivaci, coÏ bude pravdûpodobnû zpÛsobeno ukládáním stre(

85

)

sov˘ch metabolitÛ (karotenoidÛ) ve stûnách bunûk, jako to bylo u osmotick˘ch a oxidaãních stresov˘ch experimentÛ (kapitola 5.3.1.). Pfii vyuÏití ‰krobnat˘ch substrátÛ a vlákniny, aÈ jiÏ s pfiede‰lou úpravou s plísÀov˘mi preparáty nebo i bez nich, do‰lo k mírnému protaÏení bunûk oproti buÀkám kulat˘m pozorovan˘m pfii kontrolních kultivacích. Kvasinky se na pfiedloÏen˘ch snímcích dûlí, coÏ také poukazuje na funkãní metabolickou aktivitu.

5.3.2.2 Morfologie Rhodotorula aurantiaca

Obr. 29: Mikroskopické snímky R. aurantiaca na médiích zleva: kontrola, jableãné slupky, hru‰kové slupky

Obr. 30: Mikroskopické snímky R. aurantiaca na médiích zleva: tûstoviny, tûstoviny + E1, tûstoviny + E3, tûstoviny + E4

Obr 31: Mikroskopické snímky R. aurantiaca na médiích zleva: p‰eniãná ka‰e, p‰eniãná ka‰e + E1, p‰eniãná ka‰e + E3, p‰eniãná ka‰e + E4

(

86

)

Obr. 32: Mikroskopické snímky R. aurantiaca na médiích zleva: vláknina, vláknina + E1, vláknina + E3, vláknina + E4 Na snímcích 29-32 u kvasinky R. aurantiaca kultivované na odpadních substrátech nedo‰lo k v˘razn˘m zmûnám v morfologii. Pouze pfii vyuÏití hru‰kov˘ch slupek se jednotlivé buÀky oproti ostatním kultivacím mírnû protáhly a nebyly jiÏ kulaté. I zde si mÛÏeme pov‰imnout dûlících se kvasinek.

5.3.2.3 Morfologie Sporobolomyces roseus

Obr. 33: Mikroskopické snímky S. roseus na médiích zleva: kontrola, hru‰kové slupky

Obr. 34: Mikroskopické snímky S. roseus na médiích zleva: tûstoviny, tûstoviny + E1, tûstoviny + E3, tûstoviny + E4

(

87

)

Obr 35: Mikroskopické snímky S. roseus na médiích zleva: p‰eniãná ka‰e, p‰eniãná ka‰e + E1, p‰eniãná ka‰e + E3, p‰eniãná ka‰e + E4

Obr. 36: Mikroskopické snímky S. roseus na médiích zleva: vláknina, vláknina + E1, vláknina + E3, vláknina + E4 Morfologie kvasinky S. roseus (obr. 33-36) pfii kultivacích na odpadních substrátech vykazuje tvorbu shlukÛ u kultivace na p‰eniãné ka‰i a vlákninû. Nejvíce patrné jsou shluky u p‰eniãné ka‰e hydrolyzované plísÀov˘m preparátem 2 pocházejícm z F. solani a na vlákninû upravené enzymov˘m preparátem 4 pocházejícím z P. chrysosporium. U této kvasinky do‰lo k nejvíce patrnému po‰kození bunûk pfii kultivacích na odpadních substrátech, coÏ mÛÏe b˘t zpÛsobeno hor‰í adaptací této kvasinky ke stresov˘m podnûtÛm. Nicménû rÛstové vlastnosti nebyly nijak ovlivnûny, jak jsme se mohli pfiesvûdãit v kapitole 5.2.4.3.

5.3.3 Morfologie kvasinek vystaven˘ch pÛsobení mutagenu Mikroskopické snímky na obr. 37-39 zachycují zmûny v morfologii karotenogenních kvasinek kultivovan˘ch na kontrolním glukózovém médiu a u selektovan˘ch mutantÛ po vystavení úãinkÛm mutagenu ethylesteru kyseliny metansulfonové (EMS) v koncentraci 10 mg/l po dobu 80 hodin.

(

88

)

5.3.3.1 Morfologie Cystofilobasidium capitatum

Obr. 37: C. capitatum pfii kultivaci na glukózovém médiu a v pfiítomnosti 10 mg/L EMS

5.3.3.2 Morfologie kvasinek Rhodotorula

Obr. 38: Morfologie kvasinek Rhodotorula pfii kultivaci na glukózovém médiu a v pfiítomnosti 10 mg/L EMS

(

89

)

5.3.3.3 Morfologie kvasinek Sporobolomyces

Obr. 39: Morfologie kvasinek Sporobolomyces pfii kultivaci na glukózovém médiu a v pfiítomnosti 10 mg/L EMS Na obrázcích 37-39 si mÛÏeme pov‰imnout jednotliv˘ch zmûn v morfologii selektovan˘ch kvasinek vystaven˘ch úãinkÛm mutagenu EMS pfii kultivacích v kapaln˘ch médiích do 80. h. V‰echna média s pfiidan˘m mutagenem byla o nûco svûtlej‰í neÏ tomu bylo u kontrol (viz kapitola 5.4.4). U v‰ech experimentÛ s kultivacemi za pÛsobení EMS do‰lo ke znaãnému po‰kození bunûk. Intracelulární ãásti kvasinek byly po úãinku mutagenu uvolnûny do média a do‰lo k deformacím samotn˘ch bunûk. Je vidût, Ïe pouÏit˘ mutagen mûl na morfologii kvasinek destrukãní vliv. V˘sev kultury vystavené mutagenu na Petfiino misky s Ïivn˘m agarem umoÏnil selekci jednotliv˘ch kolonií podle fenotypu, pfiiãemÏ blo moÏné selektovat jak v˘raznû zbarvené, tak i zcela bezbarvé kolonie. Tyto buÀky byly dále pasáÏovány, kultivovány a analyzovány z hlediska vybran˘ch metabolick˘ch aspektÛ.

5.4 Zbarvení kultur kvasinek kultivovan˘ch pfii pÛsobení environmentálních stresov˘ch faktorÛ âervené kvasinky se vyznaãují schopností produkce karotenogenních pigmentÛ Ïluté, oranÏové aÏ ãervené barvy. Typ karotenoidu, koncentrace i mnoÏství jsou závislé na jednotliv˘ch kvasinkov˘ch druzích a podmínkách, za jak˘ch jsou vedeny jednotlivé kultivace. Barevné zmûny médií karotenogenních kvasinek oproti kontrolním vzorkÛm mohou b˘t velmi snadno vizuálnû zkoumány a zaznamenávány (viz následující kapitoly 5.4.1. – 5. 4. 4.).

(

90

)

5.4.1 Zbarvení kultur kvasinek za pÛsobení osmotického stresu 5.4.1.1 Zbarvení Cystofilobasidium capitatum

Obr 40: médium obsahuje zleva: kontrola, 2% NaCl, 5% NaCl, 9% NaCl Pfii kultivacích C. capitatum s rÛzn˘mi koncentracemi NaCl nevykazovala kultura kromû pouÏití nejvy‰‰í 9% NaCl Ïádné vût‰í barevné zmûny oproti kontrolnímu vzorku. Vysoká koncentrace soli v médiu mûla za následek nejen zpomalen˘ rÛst (viz kapitola 5.2.1.1.), ale i pravdûpodobnû sníÏenou tvorbu karotenoidÛ, coÏ mohlo b˘t zpÛsobeno negativním vlivem stresov˘ch podmínek na jednotlivé buÀky.

5.4.1.2 Zbarvení Sporobolomyces roseus

Obr 41: médium obsahuje zleva: kontrola, 2% NaCl, 5% NaCl, 9% NaCl Také u kvasinky S. roseus mÛÏeme pozorovat stejn˘ vliv vysoké koncentrace soli v médiu, coÏ vedlo je‰tû k vût‰ím barevn˘m rozdílÛm oproti kontrolnímu vzorku neÏ v pfiede‰lém experimentu s C. capitatum (5.4.1.1.). Barva média S. roseus v pfiítomnosti 9% NaCl byla témûfi bílá.

(

91

)

5.4.1.3 Zbarvení Sporobolomyces shibatanus

Obr 42: médium obsahuje zleva: kontrola, 2% NaCl, 5% NaCl, 9% NaCl Kultivace S. shibatanus za pÛsobení osmotického stresu mûla za následek postupnou zmûnu zabarvení médií, kdy zvy‰ující se koncentrace NaCl mûla zpÛsobila úbytek v zabarvení média. V˘sledky vizuálního pozorování odpovídají rÛstové charakteristice této kvasinky, jejíÏ v˘sledky jsou shrnuty v kapitole 5.2.1.5.

5.4.2 Zbarvení kultur kvasinek za pÛsobení oxidaãního stresu 5.4.2.1 Zbarvení Cystofilobasidium capitatum

Obr 43: médium obsahuje zleva: K, 2 mM H2O2, 5 mM H2O2, 100 mM H2O2 Vystavení C. capitatum oxidaãním stresÛm nemûlo zásadní vliv na zmûny zabarvení médií, která jsou v‰echna oranÏová.

5.4.2.2 Zbarvení Sporobolomyces roseus

Obr 44: médium obsahuje zleva: K, 2 mM H2O2, 5 mM H2O2, 100 mM H2O2 Také u kvasinky S. roseus nedo‰lo k pfiíli‰n˘m barevn˘m zmûnám pfii vystavení kultur kvasinek oxidaãním stresÛm. Pouze 100 mM H2O2 zpÛsobil bled‰í zbarvení oproti ostatním médiím.

(

92

)

5.4.2.3 Zbarvení Sporobolomyces shibatanus

Obr 45: médium obsahuje zleva: K, 2 mM H2O2, 5 mM H2O2, 100 mM H2O2 U S. shibatanus pfii oxidaãním stresu mÛÏeme vidût stejn˘ efekt pÛsobení zvy‰ující se koncentrace stresového faktoru na sniÏující se oranÏovou barvu média, jako tomu bylo u osmotického stresu, vyvolaném pfiídavky NaCl (kapitola 5.4.1.3.).

5.4.3 Zbarvení kultur kvasinek pfii kultivaci na rÛzn˘ch odpadních substrátech Odpadní látky pocházející ze zemûdûlství nebo prÛmyslu zpÛsobují zátûÏ na Ïivotní prostfiedí. Jejich pouÏití jako substrátÛ ke kultivacím kvasinek by mohlo znaãnû sníÏit jak v˘robní náklady pfii mikrobiálních v˘robách, tak i pfii samotn˘ch kultivacích. Navíc tyto odpadní látky obsahují znaãné mnoÏství Ïivin vhodn˘ch k utilizaci kvasinkami. Pfii pfiedloÏen˘ch experimentech se zkoumala vhodnost pouÏití vybran˘ch odpadních látek (ovocné, ‰krobnaté) k mikrobiálním kultivacím a produkci obohacené kvasinkové biomasy. Testované kvasinky patfiily mezi rody Cystofilobasidium, Rhodotorula a Sporobolomyces. Zkoumal se také vliv enzymatické pfiedchozí hydrol˘zy ‰krobnat˘ch odpadních látek pomocí ãtyfi druhÛ plísÀov˘ch extracelulárních enzymÛ pocházejících z plísÀov˘ch kultur Alternaria alternata CCM 8326, Fusarium solani CCM F-552, Aureobasidiu pollulans CCM F-148 a Phanerochaete chrysosporium CCM 8074 (viz kapitola 4.2.3.3.).

5.4.3.1 Zbarvení kultur Cystofilobasidium capitatum

Obr 46: médium obsahuje zleva: kontrola, jableãné slupky, hru‰kové slupky

Obr 47: médium obsahuje zleva: tûstoviny, tûstoviny + E1, tûstoviny + E2, tûstoviny + E3, tûstoviny + E4 (

93

)

Obr 48: médium obsahuje zleva: p‰eniãná ka‰e, p‰eniãná ka‰e + E1, p‰eniãná ka‰e + E2, p‰eniãná ka‰e + E3, p‰eniãná ka‰e + E4

Obr 49: médium obsahuje zleva: vláknina, vláknina + E1, vláknina + E2, vláknina + E3, vláknina + E4 U kvasinky C. capitatum nedo‰lo k v˘raznám vizuálním zmûnám pfii kultivacích na ovocn˘ch odpadních substrátech v porovnání s kontrolním médiem (Obr. 46). Naopak pfii kultivacích s ostatními odpadními látkami (Obr. 47, 48) a pfii enzymatick˘ch hydrol˘zách pomocí plísÀov˘ch preparátÛ si lze pov‰imnout jiÏ zfietelnûj‰ích barevn˘ch zmûn oproti kontrolní kultivaci. Tûstoviny a kukufiiãné klíãky mûly za následek bled‰í odstíny médií. Oproti tomu vláknina zabarvila média do temnû hnûdé barvy, coÏ znemoÏnilo vizuálnû identifikovat pfiítomné oranÏové karotenoidy.

5.4.3.2 Zbarvení kultur Rhodotorula aurantiaca

Obr 50: médium obsahuje zleva: kontrola, jableãné slupky, hru‰kové slupky

Obr 51: médium obsahuje zleva: tûstoviny, tûstoviny + E1, tûstoviny + E3, tûstoviny + E4

(

94

)

Obr 52: médium obsahuje zleva: p‰eniãná ka‰e, p‰eniãná ka‰e + E1, p‰eniãná ka‰e + E3, p‰eniãná ka‰e + E4

Obr 53: médium obsahuje zleva: vláknina, vláknina + E1, vláknina + E3, vláknina + E4 Také u R. aurantiaca nedo‰lo pfii kultivacích na jableãn˘ch a hru‰kov˘ch slupkách ke zmûnám v barvû médií oproti kontrole. Kultivace na tûstovinách, kde se vyuÏilo enzymatick˘ch hydrol˘z, vedly k zesvûtlení médií na lehce rÛÏovou barvu. U p‰eniãné ka‰e je tato nízká produkce pigmentÛ patrná jak bez enzymatické hydrol˘zy, tak i s ní. Média s vlákninou podobnû jako u C. capitatum znemoÏnila vizuální identifikaci karotenoidÛ, protoÏe byla také hnûdû zakalená.

5.4.3.3 Zbarvení kultur Sporobolomyces roseus

Obr 54: médium obsahuje zleva: kontrola, jableãné slupky, hru‰kové slupky

Obr 55: médium obsahuje zleva: tûstoviny, tûstoviny + E1, tûstoviny + E3, tûstoviny + E4

(

95

)

Obr 56: médium obsahuje zleva: p‰eniãná ka‰e, p‰eniãná ka‰e + E1, p‰eniãná ka‰e + E3, p‰eniãná ka‰e + E4

Obr 57: médium obsahuje zleva: vláknina, vláknina + E1, vláknina + E3, vláknina + E4 Kvasinka S. roseus kultivovaná na ovocn˘ch substrátech a p‰eniãné ka‰i s nebo bez enzymatické hydrol˘zy nepÛsobila velk˘mi rozdíly v barevnosti jednotliv˘ch médií. Pfii kultivaci na tûstovinách po enzymatické hydrol˘ze pomocí plísÀov˘ch enzymÛ pocházejících z A. alternata mÛÏeme vidût sytû rÛÏov˘ odstín kultury. Vláknina opût zabarvila média do hnûdého odstínu.

5.4.4 Zbarvení kultur kvasinek za pÛsobení mutagenu V této ãásti experimentu byl zkoumán úãinek pÛsobení mutagenu ethylesteru kyseliny metansulfonové (EMS) na barevné zmûny kultur kvasinek bûhem kultivaãního procesu. Mutagen byl pfiidán do médií o koncentraci 10 mg/l a kvasinky mu byly vystaveny po dobu 80 hodin. Následnû byly kvasinky po pÛsobení EMS i z kontrolních médií naoãkovány na Petriho misky a postupn˘m fiedûním se docílilo nárÛstu jednotliv˘ch kolonií. Z kaÏdého kvasinkového kmene byla zaoãkována jedna selektovaná kolonie opût do kapalného média, pfies dvoustupÀovou inokulaci a kultivace probûhla po dobu 48 h (anal˘za DNA) a 80 h (izolace a anal˘za metabolitÛ). Vzhledem k tomu, Ïe po naoãkování kvasinek vystaven˘ch EMS z kapaln˘ch médií, které byly prokazatelnû svûtlej‰ích odstínÛ oproti kontolám, nebyly rozeznatelné zásadní vizuální zmûny kolonií, byly kvasinky po mutagenezi z Petriho misek pro dal‰í experimenty vybrány náhodnû.

(

96

)

5.4.4.1 Zabarvení Cystofilobasidium capitatum

Obr 58: zmûna ve zbarvení média (nahofie) bez mutagenu (vlevo) a s mutagenem (vpravo) a jednotlivé kultury na Petriho miskách (dole) bez mutagenu (vlevo) a s mutagenem (vpravo) Kultivace C. capitatum s EMS v kapalném médiu vedla k témûfi bílému zabarvení (obr 58 nahofie), coÏ ov‰em nemûlo vliv na sníÏenou produkci β-karotenu (viz kapitola 5.5.4.). Oproti tomu jednotlivû narostlé kolonie nevykazují zfietelnû viditelné barevné zmûny jak po mutagenezi tak v kontrolním vzorku.

(

97

)

5.4.4.2 Zabarvení kvasinek Rhodotorula

Obr 59: zmûna ve zbarvení média bez mutagenu (nahofie) a s mutagenem (dole) u jednotliv˘ch kvasinek zleva: R. aurantiaca, R. glutinis, R. mucilaginosa

Obr 60: zmûna ve zbarvení kolonií kvasinek na Petriho miskách bez mutagenu (nahofie) a s mutagenem (dole) u jednotliv˘ch kvasinek zleva: R. aurantiaca, R. glutinis, R. mucilaginosa U kvasinek patfiícím mezi Rhodotorula lze vidût po expozici mutagenu (Obr 59) rÛzná zabarvení médií od témûfi bílé (R. mucilaginosa) po lehce oranÏovou (R. glutinis). U kvasinek R. aurantiaca a R. mucilaginosa vedl tento barevn˘ úbytek také ke sníÏené tvorbû karotenoidÛ (viz kapi(

98

)

tola 5.5.4.). Po naoãkování na Petriho misky (obr. 60) nevykazují kvasinky opût barevné rozdíly v kontrolním vzorku nebo s EMS.

5.4.4.3 Zabarvení kvasinek Sporobolomyces

Obr 61: zmûna ve zbarvení média bez mutagenu (nahofie) a s mutagenem (dole) u jednotliv˘ch kvasinek zleva: S. roseu, S. shibatanus

Obr 62: zmûna ve zbarvení kolonií na Petriho misckách bez mutagenu (vlevo) a s mutagenem (vpravo) u S. shibatanus Také u kvasinek patfiících mezi Sporobolomyces (obr. 60) jsou média s EMS témûfi bílá, takÏe vizuální kontrolou nemohla b˘t prokázána pfiítomnost karotenoidních pigmentÛ. Kolonie S. shibatanus jsou po vystavení EMS svûtlej‰í v porovnání s kontrolou (obr. 62), coÏ se také pro(

99

)

jevilo niωí produkcí karotenogenních pigmentÛ na rozdíl od ostatních kvasinek (viz kapitola 5.5.4).

5.5 Produkce karotenoidÛ kvasinkami pfii pÛsobení environmentálních stresov˘ch faktorÛ Identifikace a kvantifikace pigmentÛ obsaÏen˘ch ve vzorku vyÏaduje jejich úplné chromatografické rozli‰ení. V pfiípadû karotenoidÛ nastávají jisté problémy, jelikoÏ se ve vzorcích vyskytují ve formû smûsí, fiada z nich má podobnou strukturu nebo jsou izomery, coÏ znesnadÀuje identifikaci. NejvyuÏívanûj‰í metodou k anal˘ze karotenoidÛ je vysokoúãiná kapalinová chromatografie (HPLC) s reverzní fází. Abychom získali v˘sledky co s nejvût‰í pfiesností, je nutné separaãní podmínky optimalizovat a poté je striktnû dodrÏovat. Separace karotenoidÛ z ãerven˘ch kvasinek byla v na‰ich experimentech provedena s vyuÏitím kolony Kinetex C18 s reverzní fází. VyuÏíval se metanol jako mobilní fáze s prÛtokem 1,1 ml/min a UV/VIS detekce pro karotenoidy 450 nm a pro ergosterol 285 nm (viz kapitola 4.5.3.1). Majoritním pigmentem byl identifikovan˘ β-karoten, kter˘ se stanovoval z kultur kultivovan˘ch 80 hodin (viz kapitola 5.1.1., van Breemen R. B. 1995). Extrakty z kvasinkov˘ch bunûk kromû β-karotenu obsahovaly je‰tû lykopen, kter˘ je pfiím˘m prekurzorem v biosyntéze β-karotenu a více typÛ oxidovan˘ch karotenoidÛ, zejména torulen, torularhodin a jejich deriváty. Mikrobiální produkce β-karotenu by mohla b˘t prÛmyslovû jednodu‰‰í a ekonomiãtûj‰í v pfiípadû vyuÏití rÛzn˘ch odpadních substrátÛ ze zemûdûlsk˘ch a hospodáfisk˘ch v˘rob. Produkãní náklady se tímto sníÏí na minimum. V experimentálních kultivacích byla proto testována moÏnost mikrobiální produkce obohacené biomasy nejen za stresov˘ch podmínek vyvolan˘ch osmotick˘m, oxidaãním stresem, pfii expozici mutagenu a pfiídavky iontÛ kovÛ, ale také pfii kultivacích na rÛzn˘ch odpadních substrátech. K tûmto úãelÛm se pouÏívaly kvasinky Cystofilobasidium, Rhodotorula a Sporobolomyces. Odpadní substráty byly ovocné, ‰krobnaté a ‰krobnaté podrobené enzymatické hydrol˘ze pomocí extracelulárních plísÀov˘ch enzymÛ (viz kapitola 4.2.3.3).

5.5.1 Produkce karotenoidÛ pfii osmotickém a oxidaãním stresu Oznaãení pro Inokulaãní médium II je v grafu oddûleno pomlãkou od oznaãení pro Produkãní médium (Prod): K (kontrola); 2% NaCl a 5% NaCl (soln˘ stres pfii tûchto koncentracích) 2 mM H2O2 a 5 mM H2O2 (peroxidov˘ stres pfii tûchto koncentracích). Pro získání komplexních informací o karotenogenní kvasince C. capitatum a jejího chování pfii rÛzn˘ch stresov˘ch experimentech, byly vybrány kultivace za pÛsobení oxidaãního, osmotického a kombinovaného stresu a dále kultivace pfii pÛsobení iontÛ kovÛ.

(

100

)

Graf 24: Produkce β-karotenu C. capitatum pfii osmotickém, oxidaãním a kombinovaném stresu Kvasinky C. capitatum vystavené pÛsobení osmotického a oxidaãního stresu produkovaly za v‰ech testovan˘ch podmínek vy‰‰í mnoÏství karotenoidÛ ve srovnání s kontrolou. Produkce β–karotenu byla nejvy‰‰í v podmínkách kombinovaného stresu. Nejvy‰‰ích v˘tûÏkÛ se dosáhlo pfii pÛsobení 5% NaCl v INO II v kombinaci s ostatními stresov˘mi faktory, pfii kombinaci 5% NaCl v INO II a souãasnû 5% NaCl v Prod vedlo více neÏ ke ãtyfinásobnému zv˘‰ení tvorby β-karotenu oproti kontrolní kultivaci. Také kombinovan˘ stres s 2% NaCl v INO II a ostatních stresov˘ch faktorÛ v Prod vedlo ke zv˘‰ené tvorbû β-karotenu (aÏ 3x) ve srovnání s kontrolní kultivací. V porovnání s produkcí biomasy (viz kapitola 5.2.1.2), kdy oxidaãní stres zpÛsobil znaãn˘ nárÛst kvasinky a naopak osmotick˘ stres o vy‰‰ích koncentrací zpÛsobil nízkou produkci bio(

101

)

masy, je zajímavé si pov‰imnout opaãného vlivu tûchto stresov˘ch faktorÛ na produkci obohacené biomasy. 5% koncentrace NaCl v médiu zpÛsobila nejvy‰‰í produkci β-karotenu (0,8 mg/g), coÏ by mohlo souviset se stresovou odezvou projevující se hromadûním karotenÛ ve stûnách buÀky kvasinek.

Graf 25: Produkce celkov˘ch karotenoidÛ C. capitatum pfii osmotickém, oxidaãním a kombinovaném stresu Stejn˘ch v˘sledkÛ jako tomu bylo u pfiedchozího experimentu (graf 24) se dosáhlo pfii stanovení celkov˘ch karotenoidÛ (graf 25) u kvasinky C. capitatum (stanovení celkov˘ch karote(

102

)

noidÛ viz kapitola 4.5.3.1) kultivované za osmotick˘ch a oxidaãních stresÛ. Opût je zde zv˘‰en˘ nárÛst karotenoidÛ oproti kontrolnímu vzorku pfii kombinovan˘ch stresov˘ch experimentech, kdy bylo do INO II pfiidáno 5% NaCl a v Prod se vyskytovaly ostatní stresové faktory. 4x vy‰‰í produkce karotenoidÛ bylo dosaÏeno ve vzorku s 5% NaCl v INO II a 5% NaCl v Prod, a více neÏ 3,5x více celkov˘ch karotenoidÛ v kombinovaném stresu s 5% NaCl v INO II a 5 mM H2O2 v Prod. Pfiítomnost 5% NaCl v médiu mûla opût negativní vliv na produkci biomasy (viz kapitola 5.2.1.2), ale vedla k indukci produkce karotenoidÛ (6,6 mg/g). Kromû jiÏ zmínûného β-karotenu by se dala kultivace C. capitatum prÛmyslovû vyuÏít k tvorbû kvasinkové biomasy obohacené o dal‰í karotenogenní pigmenty, kter˘mi jsou torulen a torularhodin. Z v˘sledkÛ proveden˘ch s kombinova˘mi stresov˘mi faktory by byly pro produkci pigmentÛ vhodné kultivace za osmotického stresu – obzvlá‰È pfii vy‰‰ích koncentracích NaCl, kdy dochází u poÏadovan˘ch metabolitÛ k indukci produkce pigmentÛ a dále pfii pouÏití vy‰‰í koncentrace NaCl v kombinaci s H2O2.

5.5.2 Produkce karotenoidÛ pfii pÛsobení iontÛ kovÛ V˘sledky experimentu s kultivací kvasinky C. capitatum vystavené úãinkÛm iontÛ kovÛ selenu a chromu o rÛzn˘ch koncentracích, jsou uvedeny v grafech 26 a 27.

(

103

)

Graf 26: Produkce β-karotenu C. capitatum pfii pÛsobení iontÛ kovÛ U grafÛ 26 a 27 je oznaãení pro Inokulaãní médium 2 (INO II) oddûleno pomlãkou od oznaãení pro Produkãní médium (Prod) a oba grafy pfiedstavují karotenoidové produkce kvasinky C. capitatum pfii kultivacích v médiích s pfiídavky iontÛ chromu a selenu v rÛzn˘ch koncentracích, které se pfiidávaly do médií ihned po inokulaci nebo po 30 hodinách kultivace (viz kapitola 4.2.3.2).

(

104

)

Graf 27: Produkce celkov˘ch karotenoidÛ C. capitatum pfii pÛsobení iontÛ kovÛ V experimentech zamûfien˘ch na vyhodnocení produkce pigmentÛ u karotenogenní kvasinky C. capitatum kultivované s ionty kovÛ (grafy 26 a 27) je moÏné si pov‰imnout, Ïe pfiídavek chromu mûl za následek mírnû zv˘‰enou produkci karotenoidÛ (max. 2x více oproti kontrole), v nûkter˘ch podmínkách jeho pfiítomnost v médiu pÛsobila nepfiíznivû na tvorbu pigmentÛ. Pokud byl chrom pfiidán v koncentraci 0,1 mM jiÏ do INO II, do‰lo ke sníÏení produkce β-karotenu aÏ 220x oproti kontrolní kultivaci. Chrom pfiidan˘ ve 30. hodinû kultivace také v koncentraci 0,1 mM zpÛsobil 4x niωí produkci β-karotenu. Pfiídavky Cr o vy‰‰í koncentraci nemûly na produkci pigmentÛ tak negativní vliv jako Cr o nízké koncentraci, produkce je tu víceménû srovnatelná s kontrolní kultivací. (

105

)

Obohacení médií selenem v nejvy‰‰í koncentraci 1 mM v Prod ihned po inokulaci vedlo ke sníÏení tvorby β-karotenu 14x oproti kontrole a pfiidání stejné koncentrace selenu aÏ po 30 hodinách kultivace sníÏilo tvorbu β-karotenu 6x. Naopak pfiídavek selenu v koncentracích niωích ve 30. hodinû kultivace vedlo k nav˘‰ení produkce β-karotenu u 0,01 mM selenu 1,5x a u 0,1 mM selenu aÏ 3x v porovnání s kontrolní kultivací. Stejné v˘sledky je moÏné vidût v produkcích celkov˘ch karotenoidÛ. Je zajímavé si pov‰imnout, Ïe aãkoliv v˘sledky u pfiedchozího experimentu se soln˘m a peroxidov˘m stresem (viz kapitola 5.5.1) poukazovaly na zcela opaãné pÛsobení tûchto stresÛ v produkci biomasy a karotenoidÛ, neplatí tyto závûry pro biogenní prvky selen a chrom. Zdá se, Ïe vy‰‰í koncentrace selenu mûly stejn˘ toxick˘ efekt jak na rÛst kvasinky (kapitola 5.2.3), tak i na produkci pigmentÛ. Pfii kultivacích s 5 mM Cr do‰lo k indukci karotenoidÛ i biomasy, stejn˘ch stimulaãních efektÛ jak pfii tvorbû biomasy tak i karotenoidÛ se docílilo také pfii vyuÏití niωích koncentrací selenu. Pfii prÛmyslov˘ch kultivacích s biogenními prvky by mohla b˘t kvasinka C. capitatum vystavena úãinkÛm chromu, zejména v koncentraci 5 mM, kdy dle na‰ich v˘sledkÛ do‰lo k nejlep‰í stimulaci jak rÛstu tak i tvorby karotenogenních pigmentÛ.

5.5.3 Produkce karotenoidÛ na odpadních substrátech PouÏití odpadních látek ze zemûdûlsk˘ch a hospodáfisk˘ch v˘rob za substráty ke kultivacím mikroorganismÛ a v˘robû obohacené kvasinkové biomasy mÛÏe podstatnû sníÏit negativní dopad na Ïivotní prostfiedí. V následujícíh kapitolách jsou shrnuty v˘sledky kultivaãních experimentÛ zamûfiené na produkci β-karotenu kvasinkami za vyuÏití ovocn˘ch odpadních látek, tûstovin a rÛzn˘ch ‰krobnat˘ch substrátÛ podroben˘ch pfiedem enzymatické hydrol˘ze ke snaz‰ímu vyuÏití kvasinkami. Podrobné pfiípravy kultivaãních médií pro tfii druhy experimentÛ jsou popsány v kapitole 4.2.3.3.

5.5.3.1 Produkce karotenoidÛ u C. capitatum V následujících grafech 28-30 jsou uvedeny v˘sledky kultivací C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech.

(

106

)

Graf 28: Produkce β-karotenu C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech 1. ãást experimentu Pfii vyuÏití ovocn˘ch odpadních substrátÛ k produkci obohacené biomasy mûl v˘znamn˘ vliv pouÏit˘ zdroj dusíku. Pokud byla kvasinka C. capitatum kultivovaná na jableãn˘ch slupkách s kvasniãn˘m autolyzátem jako zdrojem dusíku v INO II, produkce β-karotenu (graf 28) byla 6x vy‰‰í neÏ u kontrolní kultivace. Naopak pfii kultivacích s alternativním zdrojem dusíku v INO II (za zdroj dusíku neslouÏil kvasniãn˘ autolyzát, ale vláknina), do‰lo ke sníÏení produkce β–karotenu více neÏ 4,5x v porovnání s kontrolní kultivací. VyuÏití jableãné vlákniny jako zdroje Ïivin se v obou typech experimentu projevilo za nevhodné, jelikoÏ mnoÏství β-karotenu se oproti kontrole sníÏilo aÏ 6x (experiment A), pfiípadnû 2x (experiment B).

Graf 29: Produkce β-karotenu C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech 2. ãást experimentu (

107

)

V porovnání s niωím nárÛstem biomasy (viz kapitola 5.2.4.1) na jableãn˘ch slupkách, do‰lo u tohoto odpadního substrátu ke zv˘‰ené tvorbû β-karotenu (0,8 mg/g), a naopak u vy‰‰í produkce biomasy na jableãné vlákninû si lze pov‰imnout velmi nízké produkce β-karotenu. V grafu 29 mÛÏeme vidût v˘sledky v produkci β-karotenu u kvasinky C. capitatum ve druhé ãásti experimentu. Za zcela nevhodnou se projevila kultivace na p‰eniãné ka‰i, kdy byl zaznamenán pokles v produkci sledovaného pigmentu 2,5x oproti kontolnímu vzorku. SníÏená produkce β-karotenu byla pravdûpodobnû zpÛsobena vyuÏitím substrátu s vy‰‰ím obsahem ‰krobu, kter˘ není kvasinkami dobfie vyuÏiteln˘. Také u druhého typu experimentu s odpadními substráty si mÛÏeme v‰imnout vzájemn˘ch vztahÛ s nízkou produkcí biomasy (kapitola 5.2.4.1) na tûstovinách, coÏ naopak stimulovalo produkci β-karotenu, kter˘ se ukládá v buÀkách jako odezva na stresové podmínky, v tomto pfiípadû vyvolané nutriãním stresem. V následující ãásti experimentu (graf 30) byly provedeny experimenty se stejn˘mi komplexními substráty rozloÏen˘mi alespoÀ ãásteãnû extracelulárními enzymy plísní.

Graf 30: Produkce β-karotenu C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech 3. ãást experimentu PouÏití vlákniny a tûstovin dokonce i po enzymatické hydrol˘ze (graf 30) nebylo pro produkci pigmentÛ vhodné. V˘tûÏky byly spí‰e sníÏeny v porovnání s kontrolní kultivací. Naopak p‰eniãná ka‰e po enzymatické hydrol˘ze plísÀov˘mi preparáty 2 a 3 (viz 4.2.3.3.) byla snáze

(

108

)

utilizovatelná kvasinkami a tvorba pigmentÛ byla nav˘‰ena oproti kontrolní kultivaci 2,6x (preparát z F. solani) a 4,6x (preparát z A. pollulans). Ve srovnání s tvorbou biomasy (viz kapitola 5.2.4.1), kdy do‰lo k nízké produkci pfii kultivacích s p‰eniãnou ka‰í s nebo i bez enzymatick˘ch hydrol˘z pomocí plísÀov˘ch preparátÛ, do‰lo pfii kultivacích na tûchto odpadních substrátech k indukci β-karotenu. U ostatních odpadních substrátÛ, tûstovin a vlákniny, byl sice zaznamenán niωí nárÛst biomasy, ov‰em produkce β-karotenu zde v porovnání s kontrolou vy‰‰í nebyla.

5.5.3.2 Produkce karotenoidu u R. aurantiaca V grafech 31-33 jsou shrnuty v˘sledky kultivací R. aurantiaca na odpadních substrátech.

Graf 31: Produkce β-karotenu R. aurantiaca na rÛzn˘ch odpadních substrátech 1. ãást experimentu VyuÏití jableãné vlákniny kvasinkou R. aurantiaca pfii kultivaci s náhradním zdrojem dusíku vedlo ke 1,5x sníÏené produkci β-karotenu ve srovnání s kontrolou. Jableãné a hru‰kové slupky v médiu mûly za následek 1,5 násobn˘ pokles β-karotenu oproti kontrole, aãkoliv buÀky byly kultivované v pfiítomnosti komplexního zdroje dusíku.

(

109

)

Porovnání produkce biomasy (viz kapitola 5.2.4.2) a β-karotenu poukazuje na podobné v˘sledky, kdy vyuÏití jableãn˘ch a hru‰kov˘ch slupek nevedlo jak k v˘znamné tvorbû biomasy, tak ani karotenu. Kvasinka naopak dobfie rostla pfii kultivacích s jableãnou vlákninou a glukózou, kdy byla také zaznamenána nejvy‰‰í produkce β-karotenu (0,68 mg/g).

Graf 32: Produkce β-karotenu R. aurantiaca na rÛzn˘ch odpadních substrátech 2. ãást experimentu Ve druhé ãásti experimentu (graf 32) pfii kultivaci kvasinky R. aurantiaca na rÛzn˘ch odpadních substrátech se ukázalo, Ïe kvasinka není schopna utilizovat komplexní ‰krobnaté substráty, je v‰ak schopna vyuÏívat substráty ãásteãnû rozloÏené enzymatickou hydrol˘zou (graf 33). Také kultivace na neupravené syrovátce (viz kapitola 4.2.3.3.) mûla za následek produkci βkarotenu 7x niωí oproti kontrole. Naopak upravená (tj. lyofilizovaná a deproteinovaná) syrovátka vedla k produkci β-karotenu 3,5x vy‰‰í v porovnání s kontrolní kultivací. Také v této ãásti experimentu je dosaÏeno podobn˘ch v˘sledkÛ v porovnání s nárÛstem biomasy (viz kapitola 5.2.4.2) a tvorbou β-karotenu, kdy se pro kultivace nehodily substráty s tûstovinami a p‰eniãnou ka‰í.

(

110

)

Graf 33: Produkce β-karotenu R. aurantiaca na rÛzn˘ch odpadních substrátech 3. ãást experimentu Pfii 3. ãásti experimentu u kvasinky R. aurantiaca kultivace na jableãné vlákninû a tûstovinách nevedla k úspû‰né produkci β-karotenu oproti kontrolnímu vzorku. S vyuÏitím extracelulárních enzymatick˘ch plísÀov˘ch preparátÛ u vlákniny do‰lo u tûchto substrátÛ aÏ k 8,6x niωí (u preparátu F. solani) a 21x niωí produkci β-karotenu (u preparátu A. alternata) oproti kontrole. Pfii kultivacích na tûstovinách vedla enzymatická hydrol˘za s preparátem pocházejícím z P. chrysosporium k 18x niωí produkci β-karotenu oproti kontrole. Naopak kultivace na kukufiiãn˘ch klíãcích a p‰eniãné ka‰i s vyuÏitím enzymatick˘ch preparátÛ od F. solani vedla ke dvojnásobné produkci β-karotenu ve srovnání s kontrolním vzorkem. Pfii porovnání produkce biomasy (viz kapitola 5.2.4.2) u kultivací na p‰eniãné ka‰i s enzymatickou hydrol˘zou E2, do‰lo k nízkému nárÛstu kvasinky, zatímco produkce β-karotenu zde

(

111

)

byla nejvy‰‰í. Stejn˘ch v˘sledkÛ bylo dosaÏeno také s kultivací na kukufiiãn˘ch klíãcích s enzymov˘m preparátem E2. V obou pfiípadech se produkce β-karotenu pohybovala kolem 1 mg/g.

5.5.3.3 Produkce karotenoidÛ u S. roseus V grafu 34 jsou shrnuty v˘sledky produkce β-karotenu u kvasinky S. roseus.

Graf 34: Produkce β-karotenu S. roseus na rÛzn˘ch odpadních substrátech 1. a 3. ãást experimentu Neobvykle vysoká produkce β-karotenu byla dosaÏena u kvasinky S. roseus (graf 34) pfii kultivacích na rÛzn˘ch odpadních substrátech. V‰echny vyzkou‰ené substráty v experimentech s touto kvasinkou se prokázaly b˘t vhodné pfii kultivacích k zisku obohacené kvasinkové biomasy o karotenogenní pigmenty. Ov‰em pfii produkci biomasy tato kvasinka dosahovala nejniωích hodnot ze v‰ech sledovan˘ch kasinek, coÏ limituje její pfiípadné prÛmyslové vyuÏití.

(

112

)

Pouze pfii kultivaci na p‰eniãné ka‰i enzymovû hydrolyzované preparátem E1 (A. alternata) do‰lo k produkci β-karotenu cca 4x niωí neÏ u kontroly. U ostatních pouÏit˘ch substrátÛ nedo‰lo k v˘razn˘m zmûnám v produkci analyzovaného pigmentu v porovnání s kontrolním vzorkem. Pfii kultivacích na tûstovinách s enzymatickou hydrol˘zou P. chrysosporium se dosáhlo dokonce dvojnásobné produkce β-karotenu. V porovnání dosaÏen˘ch v˘sledkÛ v této práci (Márová I. et al., 2011) s jiÏ publikovan˘mi daty kultivací na rÛzn˘ch odpadních substrátech je moÏné si pov‰imnout zejména u kvasinky S. roseus velmi dobrou produkci β-karotenu (4,3 mg/g) na tûstovinách s nebo bez pfiede‰lé enzymatické hydrol˘zy. Lze tedy pfiedpokládat pouÏitelnost tûchto odpadních substrátÛ ke kultivacím v prÛmyslov˘ch v˘robách za úãelem produkce kvasinkové obohacené biomasy. V porovnání s kvasinkami Rhodotorula, na‰e experimenty s R. aurantiaca a kultivacemi na kukufiiãn˘ch klíãcích s enzymatickou hydrol˘zou poukazují také na vhodnosti tohoto substrátu pfii tvorbû β–karotenu. Jednotlivé produkce jsou zde srovnatelné, u S. roseus dokonce vy‰‰í v porovnání s pfiede‰l˘mi pracemi (viz tabulka 21). Tyto v˘sledky dokazují vhodnost pouÏit˘ch odpadních substrátÛ pro vyuÏití v prÛmyslové praxi. Produkce karotenoidÛ na rÛzn˘ch odpadních substrátech druh kvasinky zdroj uhlíku karotenoidy: (mg/g cdw) / (mg/l kultury) R. aurantiaca CCY 20-9-7 upravená syrovátka 0,997 / 6,945 R. aurantiaca CCY 20-9-7 kukufiiãné klíãky po enzymatické hydrol˘ze 1,07 / 7,9462 S. roseus CCY 19-6-4 tûstoviny 4,33 / 18,931 S. roseus CCY 19-6-4 tûstoviny po enz. hydrol˘ze 4,32 / 18,931 R. glutinis DBVPG 3853 hroznov˘ mo‰t 0,9154 / 5,95 R. glutinis DBVPG 3853 sojová mouka 0,8833 / 4,24 R. glutinis mutant 32 glukóza 1,8 / 22 R. glutinis mutant 32 hydrolyzovaná melasa 1,7 / 18 R. mucilaginosa NRRL-2502 fiepná melasa 21,20 / 89 R. mucilaginosa NRRL-2502 syrovátka 29,2 / 70 Phaffia rhodozyma NRRL Y-17268 xylóza neuvedeno / 5,8 Xanthophyllomyces dendrorhous 10% ananasov˘ dÏus 0,493 / neuvedeno mutant GM 807 R. glutinis TISTR hydrolyz. fazolová mouãka 0,345 / 3, 48 S. roseus syrovátka 2,5 / 11,47 R. mucilaginosa bramborov˘ extrakt 0,42 / 3,17 R. glutinis tûstoviny po enz. hydrol˘ze 3,6 / 40,10 R. glutinis jableãné slupky 1,15 / 1,32 R. glutinis lyofilizovaná syrovátka 8,20 / 66,32 R. glutinis bramborov˘ extrakt 2,19 / 12,08 R. glutinis DBVPG 3853 kukufiiãn˘ sirup 0,54 / 8,20 D. castellii DBVPG 3503

odkaz tato práce tato práce tato práce tato práce Buzzini P., Martini A. 1999 Buzzini P., Martini A. 1999 Bhosale P., Gadre R. V. 2001 Bhosale P., Gadre R. V. 2001 Aksu Z., Eren A. T. 2005 Aksu Z., Eren A. T. 2005 Parajo J. C. a kol. 1998 Jirasripongpun K. a kol. 2008 Tinoi J. a kol. 2005 âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 âarnecká M. 2009 Buzzini P. 2001

Tab. 21: Porovnání produkce karotenoidÛ jednotliv˘mi kvasinkov˘mi kmeny na rÛzn˘ch odpadních substrátech

(

113

)

5.5.4 Produkce karotenoidÛ za pÛsobení mutagenu Kultivace s expozicí karotenogenních kvasinek mutagenu je popsána v kapitole 4.2.3.4. V následujících grafech 35 a 36 jsou shrnuty v˘sledky tohoto experimentu u selektovan˘ch mutantÛ vyhodnocující produkci β-karotenu a celkov˘ch karotenoidÛ. U kaÏdé testované kvasinky byla vybrána vÏdy jedna kolonie, u které se pfiedpokládala indukce produkce karotenoidÛ dle vizuálního hodnocení a ta byla zaoãkována do kapalného média. Kultivace probûhla pfies dvoustupÀovou inokulaci po dobu 80 h.

Graf 35: Porovnání rodukce β-karotenu kvasinkami pfii expozici mutagenu Podobnû jako tomu bylo u sledování vlivu pfiítomnosti mutagenu na rÛst karotenogenních kvasinek (kapitola 5.2.5.), tak i u produkce β-karotenu (graf 35) se jednotlivé selektované kvasinkové druhy li‰í v porovnání s kontrolními kultivacemi. Zmûny v produkci β-karotenu mohou souviset s pfiím˘m ovlivnûním úseku DNA kvasinek zodpovûdného za tvorbu karotenoidÛ po expozici kvasinek pÛsobení EMS. Vy‰‰í produkce β-karotenu byla zaznamenána u selektovan˘ch mutantÛ R. glutinis a C. capitatum.

(

114

)

Graf 36: Porovnání produkce celkov˘ch karotenoidÛ kvasinkami pfii expozici mutagenu V porovnání celkové produkce karotenoidÛ (graf 36) jsou opût velké rozdíly mezi jednotliv˘mi kmeny testovan˘ch kvasinek izolovan˘ch po náhodné selekci. Je zde patrná vy‰‰í produkce celkov˘ch karotenoidÛ u mutantÛ kvasinek R. glutinis a R. mucilaginosa (dfiíve R. rubra). Mírnû vy‰‰í produkce celkov˘ch karotenoidÛ je také u selektovaného mutantu C. capitatum v porovnání s kontrolou. Naopak pfii produkci biomasy v porovnání s tvorbou karotenoidÛ bylo u selektovaného mutantu C. capitatum dosaÏeno niωích hodnot neÏ u kontroly. U kvasinky R. glutinis je u selektovaného mutantu vy‰‰í produkce biomasy i karotenoidÛ. Jak jiÏ bylo zmínûno, mutageneze je proces umoÏÀující v˘voj a selekci nov˘ch kmenÛ, vzhledem k rozsahu práce v‰ak jiÏ dal‰í experimenty nemohly b˘t zafiazeny.

5.6 Produkce ergosterolu kvasinkami pfii pÛsobení environmentálních stresov˘ch faktorÛ Dal‰ím sledovan˘m metabolitem karotenogenních kvasinek byl ergosterol, vyuÏiteln˘ jako provitamin D. Jeho tvorba byla cílenû ovlivÀována rÛzn˘mi environmentálními stresov˘mi faktory. Následující kapitoly 5.6.1. a 5.6.2. shrnují v˘sledky tûchto experimentÛ.

(

115

)

5.6.1 Produkce ergosterolu na rÛzn˘ch odpadních substrátech 5.6.1.1 Produkce ergosterolu u C. capitatum V grafu 37 jsou shrnuty v˘sledky produkce ergosterolu u C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech.

Graf 37: Produkce ergosterolu C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech 1. ãást experimentu Produkce ergosterolu u C. capitatum (graf 37) v první ãásti experimentu byla zv˘‰ená pfii kultivaci na slupkách z hru‰ek, kdy naopak tato kvasinka vykazovala sníÏené rÛstové vlastnosti (viz kapitola 5.2.4.1). Pfii pouÏití jableãn˘ch slupek v kombinaci s alternativním dusíkat˘m zdrojem (jableãná vláknina), do‰lo ke sníÏení ergosterolu o 2,5 násobek v porovnání s kontrolní kultivací. VyuÏití hru‰kov˘ch slupek jakoÏto substrátu ke kultivacím C. capitatum za úãelem podukce obohacené kvasinkové biomasy by mohlo vést k prÛmyslovému vyuÏití. Byla zde sice zaznamenána niωí tvorba biomasy, ov‰em na druhou stranu se tato odpadní látka osvûdãila pfii produkci β-karotenu i ergosterolu.

(

116

)

Graf 38: Produkce ergosterolu C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech 2. ãást experimentu Ve druhé ãásti experimentu (graf 38) dosáhla produkce ergosterolu maxima pfii kultivaci na tûstovinách (aÏ 2x více), zatímco na tomto substrátu byl vysledován sníÏen˘ rÛst s tvorbou biomasy. Ostatní pouÏité odpadní substráty v tomto experimentu vykazovaly sníÏené hodnoty vyprodukovaného ergosterolu oproti kontrole. Také ve druhé ãásti experimentu u kultivací C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech se tûstoviny ukázaly b˘t potenciálnû vhodn˘m odpadním substrátem ke kultivacím. Dochází zde sice k niωím rÛstov˘m vlastnostem, ov‰em vy‰‰í produkci β-karotenu a ergosterolu.

(

117

)

Graf 39: Produkce ergosterolu C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech 3. ãást experimentu V poslední ãásti experimentu (graf 39) s kultivacemi C. capitatum na rÛzn˘ch odpadních substrátech, do‰lo ke sníÏené tvorbû ergosterolu pfii vyuÏití vlákniny, aÈ se jednalo o vlákninu ãistou nebo pfiedem enzymaticky upravenou rÛzn˘mi extracelulárními enzymy plísní. Nejvy‰‰ího nárÛstu ergosterolu je moÏné si pov‰imnout u p‰eniãné ka‰e s enzymatickou hydrol˘zou pomocí A. pollulans (aÏ 2x více v porovnání s kontrolou). V poslední ãásti experimentu se za vhodn˘ substrát k prÛmyslové produkci metabolitÛ jeví p‰eniãná ka‰e zejména po enzymatické hydrol˘ze preparátem E3, kdy do‰lo k indukci β-karotenu i ergosterolu. Je zde ov‰em zaznamenán niωí nárÛst biomasy.

5.6.1.2 Produkce ergosterolu u R. aurantiaca Graf 40 uvádí v˘sledky v produkci ergosterolu u kvasinky R. aurantiaca pfii kultivacích na odpadních substrátech.

(

118

)

Graf 40: Produkce ergosterolu R. aurantiaca na rÛzn˘ch odpadních substrátech 1. ãást experimentu U kvasinky R. aurantiaca bylo v první ãásti experimentu (graf 40) dosaÏeno nejvy‰‰ích produkcí ergosterolu na médiích s jableãn˘mi slupkami (1,3x více oproti kontrole) a jableãnou vlákninou pfii kultivacích s alternativním zdrojem dusíku v INO II ve formû vlákniny. Pfii kultivacích na jableãné vlákninû s alternativním zdrojem dusíku bylo dosaÏeno nejen vysové produkce biomasy (viz kapitola 5.2.4.2), tak i β-karotenu a ergosterolu. Tento substrát se tedy dá povaÏovat za vhodn˘ k prÛmyslové produkci obohacené kvasinkové biomasy.

Graf 41: Produkce ergosterolu R. aurantiaca na rÛzn˘ch odpadních substrátech 2. ãást experimentu (

119

)

Graf 41 shrnuje v˘sledky druhého experimentu s kvasinkou R. aurantiaca pfii kultivacích na odpadních substrátech. Nejvíce bylo vyprodukováno ergosterolu na médiu s p‰eniãnou ka‰í. Jednalo se skoro o dvojnásobek oproti kontrolnímu vzorku. V‰echna pouÏitá média byla charakteristická tím, Ïe pfii kultivaci kmene R.aurantiaca do‰lo k vy‰‰í tvorbû ergosterolu ve srovnání s kontrolní kultivací. Ve druhé ãásti experimentu lze povaÏovat za v˘hodn˘ substrát k produkci obohacené kvasinkové biomasy u R. aurantiaca upravenou syrovátku. Kvasinka na ni dosahovala nejen vy‰‰í produkce biomasy (viz kapitola 5.2.4.2), ale i β-karotenu a ergosterolu.

Graf 42: Produkce ergosterolu R. aurantiaca na rÛzn˘ch odpadních substrátech 3. ãást experimentu Zatímco u tfietí ãásti experimentu s kvasinkou R. aurantiaca do‰lo ke sníÏenému rÛstu na médiích s p‰eniãnou ka‰í a kukufiiãn˘mi klíãky (viz kapitola 5.2.4.2), byla velmi nízká produk(

120

)

ce ergosterolu (graf 42) u kultivací s tûstovinami, a to bez nebo s enzymatickou hydrol˘zou. Jednalo se o více neÏ sedminásobn˘ pokles. Naopak tvorba ergosterolu na p‰eniãné ka‰i s E1 (A. alternata) je skoro trojnásobná oproti kontrole. V poslední ãásti experimentu bylo zji‰tûno, Ïe pfii kultivacích na p‰eniãné ka‰i, a to zejména s enzymatickou hydrol˘zou E2, do‰lo sice k niωímu nárÛstu kvasinky (viz kapitola 5.2.4.2), ov‰em produkce metabolitÛ β-karotenu a ergosterolu je zde vy‰‰í oproti kontrole.

5.6.1.3 Produkce ergosterolu u S. roseus Graf 43 shrnuje v˘sledky pfii kultivacích kvasinky S. roseus na rÛzn˘ch odpadních substrátech.

Graf 43: Produkce ergosterolu S. roseus na rÛzn˘ch odpadních substrátech 1. a 3. ãást experimentu V posledním experimentu pfii kultivacích na odpadních substrátech s kvasinkou S. roseus (graf 43) byla zaznamenána velmi nízká (3x) tvorba ergosterolu na p‰eniãné ka‰i s E1 (A. alternata) oproti kontrole. Naopak kultivace na tûstovinách s E4 (P. chrysosporium) zv˘‰ila tvorbu ergosterolu dvakrát v porovnání s kontrolou. Vût‰í mnoÏství ergosterolu bylo i v kultivaci na hru‰kov˘ch slupkách s kvasniãn˘m autolyzátem v INO II jako zdroji dusíku (2x). (

121

)

Zatímco u produkce biomasy nebyly zaznamenány v˘razné rozdíly v produkci pfii kultivaci na rÛzn˘ch odpadních substrátech (viz kapitola 5.2.4.3), produkce β-karotenu a ergosterolu je vy‰‰í u tûstovin s enzymatickou hydrol˘zou E4 a p‰eniãné ka‰e s enzymatickou hydrol˘zou E3. Pfii porovnání produkce ergosterolu a obohacené kvasinkové biomasy jsme do‰li k závûru, Ïe u C. capitatum se nejv˘hodnûji jeví pouÏití kultivace na jableãn˘ch slupkách a p‰eniãné ka‰i po enzymatické hydrol˘ze E3. R. aurantiaca by mohla b˘t prÛmyslovû pouÏitelná k produkci obohacené kvasinkové biomasy o β-karoten a ergosterol pfii kultivacích na kukufiiãn˘ch klíãcích a p‰eniãné ka‰i s hydrol˘zou E2. Kvasinka S. roseus se vyznaãovala nejvy‰‰ími produkcemi ergosterolu a β-karotenu ze v‰ech kvasinek, na druhou stranu byla charakteristická nízkou produkcí biomasy. I pfies nízk˘ nárÛst této kvasinky by bylo v budoucnu moÏné prÛmyslové vyuÏití produkce obohacené biomasy pfii kultivacích na odpadních substrátech zejména na tûstovinách a p‰eniãné ka‰i s enzymatick˘mi hydrol˘zami. Je zajímavé, Ïe produkce ergosterolu u studovan˘ch kvasinek vût‰inou podléhala podobn˘m zmûn˘m jako produkce karotenoidÛ; podmínky vedoucí ke zv˘‰ení produkce pigmentÛ obvykle vyvolaly i zv˘‰ení produkce ergosterolu. Tato skuteãnost svûdãí o soubûÏné shodné regulaci obou vûtví izoprenoidní dráhy (tj. steroidní a karotenoidní) u karotenogenních kvasinek, coÏ mÛÏe b˘t s v˘hodou vyuÏito pfii prÛmyslové produkci obohacené kvasinkové biomasy.

5.6.2 Produkce ergosterolu pfii pÛsobení mutagenu V následujícím grafu 44 jsou uvedeny v˘sledky v produkci ergosterolu u selektovan˘ch kvasinek po úãincích EMS.

(

122

)

Graf 44: Porovnání produkce ergosterolu kvasinkami pfii pÛsobení EMS Z grafu 44 je zfiejmá nepatrnû zv˘‰ená produkce ergosterolu u selektovan˘ch mutantÛ R. glutinis, u kter˘ch byla zaznamenána vy‰‰í tvorba β-karotenu a biomasy. Mutanty C. capitatum byly charakteristické vy‰‰í produkcí karotenoidÛ, ale zato niωí produkcí biomasy a ergosterolu. Slektované mutanty R. mucilaginosa byly charakteristické niωí produkcí ergosterolu, ale na druhou stranu nejvy‰‰í produkcí celkov˘ch karotenoidÛ (témûfi 4 mg/g). Z dosaÏen˘ch v˘sledkÛ lze vysledovat spí‰e indukci β-karotenu a celkov˘ch karotenoidÛ u selektovan˘ch mutantÛ po vystavení úãinkÛm mutagenu EMS v koncentraci 10 mg/l, neÏ vy‰‰í produkci ergosterolu a nárÛst biomasy. Pouze u kvasinky S. shibatanus nejsou znaãnû viditelné rozdíly u selektovan˘ch mutantÛ jak v tvorbû biomasy, tak i pigmentÛ a ergosterolu v porovnání s kontrolou. Zda bude jednou moÏné pouÏít tyto mutanty v prÛmyslu ke tvorbû obohacené biomasy závisí na dal‰ích experimentech, jejichÏ provedení je nutné. Bylo by dobré optimalizovat vizuální selekci mutantÛ, která byla pfii proveden˘ch experimentech znaãnû obtíÏná, jelikoÏ po naoãkování kvasinek s EMS v médiu, do‰lo na Petriho miskách k nastolení optimálních podmínek rÛstu a mutované kvasinky nevykazovaly dobfie postfiehnuteln˘ch barevn˘ch rozdílÛ v jednotliv˘ch kolonií ve srovnání s kontrolními kultivacemi. Nemohlo tedy b˘t zaruãeno, zda do‰lo k zaãlenûní pÛsobení mutagenu do DNA kvasinek pfii v˘bûru kolonií k následn˘m experimentÛm.

(

123

)

V budoucnu by také bylo dobré zamûfiit se na experimenty t˘kající se kultivací mutantÛ na rÛzn˘ch druzích odpadních substrátÛ. Kombinace pÛsobení mutagenu s nutriãním stresem vyvolan˘m alternativním pfiísunem uhlíku a dusíku karotenogenním kvasinkám z odpadních látek by mohlo vést k nadprodukci karotenoidÛ a lipidÛ a souãasnû by se mohly sníÏit produkãní náklady. Tato karotenoidy obohacená biomasa by poté mohla slouÏit za zdroj karotenoidních pigmentÛ nebo jako krmivo s biologicky cenn˘mi komponentami.

5.7 Izolace a anal˘za chromozomální DNA karotenogenních kvasinek Tato ãást práce byla zamûfiena na molekulární identifikaci a charakterizaci karotenogenních kvasinek podle jejich pfiíslu‰nosti k jednotliv˘m rodÛm a druhÛm. K tomuto úãelu byla v práci vyuÏita karyotypizace, která umoÏÀuje anal˘zu chromozmální DNA vãetnû sledování jejích zmûn. Aby ov‰em byla dosaÏena úspû‰ná anal˘za kvasinkového genomu, je velmi dÛleÏité získat neporu‰enou chromozomální DNA. K tomuto úãelu bylo vyvinuto hned nûkolik izolaãních postupÛ. V této práci se vyzkou‰ely dvû metody izolace kvasinkové DNA ve formû agarózov˘ch bloãkÛ. Byla také vyzkou‰ena metoda pfiípravy protoplastÛ karotenogenních kvasinek, coÏ by usnadnilo izolaci intaktní DNA (Piper P. 1996). Karotenogenní kvasinky jsou ov‰em charakteristické velice silnou bunûãnou stûnou (viz kapitoly 2.1.3.1 a 2.1.4, Kaul W., Rossow U., Emeis C. Ch. 1993), kterou není lehké dezintegrovat, aniÏ by se po‰kodila samotná chromozomální DNA.

5.7.1 Pfiíprava protoplastÛ U pfiípravy protoplastÛ je velmi dÛleÏité rozru‰ení bunûãné stûny kvasinek. V˘sledky rÛzn˘ch technik dezintegrace jsou shrnuty v následující kapitole 5.7.2. pfiesn˘ postup experimentu je popsán v kapitole 4.5.4.1.

5.7.2 PÛsobení dezintegrace na morfologii bunûk u tvorby protoplastÛ K pfiípravû protoplastÛ pomocí ultrazvuku a enzymÛ se vyuÏily buÀky kvasinek Rhodotorula, pfii testování úãinku homogenizátoru na bunûãné stûny karotenogenních kvasinek s kombinací acetonu a sklenûn˘ch kuliãek popfiípadû mofiského písku, byly jiÏ pouÏity i ostatní kvasinkové druhy Sporobolomyces a Cystofilobasidium. V˘sledky experimentÛ jsou uvedeny na následujícíh obrázcích 63-71.

(

124

)

Obr 63: Vliv ultrazvuku na dezintegraci Rhodotorula mucilaginosa (640x) Z obrázku 63 je vidût nedostateãnost v pouÏití ultrazvuku na rozbíjení bunûãné stûny kvasinek. Na mikroskopickém snímku jsou buÀky R. mucilaginosa zcela nepo‰kozené.

Obr 64: PÛsobení enzymÛ v kombinaci s ultrazvukem na Rhodotorula mucilaginosa (640x) Také pfii pÛsobení enzymÛ lytikáza a proteináza K (1 hodina) v kombinaci s následn˘m rozbíjením bunûk ultrazvukem nedo‰lo k v˘raznému po‰kození kvasinky (obr 64).

Obr 65: Zleva: Inkubace s lytikázou 1 hodina; Inkubace s lytikázou 4 hodiny Rhodotorula mucilaginosa (640x)

(

125

)

Obr 66: Homogenizace ultrazvukem Rhodotorula mucilaginosa (640x) Obrázky 65 a 66 zachycují kvasinku R. mucilaginosa po inkubaci s enzymem lytikáza po dobu 1 hodiny a 4 hodin s následnou homogenizací ultrazvukem. Jak je vidût z pfiiloÏen˘ch snímkÛ, ani prodlouÏená inkubaãní doma s lytick˘m enzymem a následnou homogenizací nevedla ke kvalitnímu rozru‰ení bunûãné stûny kvasinky. Neúspûch experimentu je pravdûpodobnû spojen s nízkou aktivitou nebo omezenou substrátovou specifitou lytického enzymu ke stûnám karotenogenních kvasinek.

Obr 67: PÛsobení lytického pufru, lytikázy a 2 hodin inkubace na kvasinku R. glutinis (640x) Velmi silná bunûãná stûna karotenogenní kvasinky R. glutinis odolala i kombinacím lytického pufru, lytikázy a prodlouÏené inkubaãní dobû (Obr 67). Také u kavsinky R. aurantiaca nedo‰lo k rozbití bunûãné stûny pfii pouÏití enzymové smûsi hydroláz a detergentu SDS ve spojení se sklenûn˘mi kuliãkami (Obr 68).

(

126

)

Obr 68: Vliv enzymové smûsi, detergentu SDS a sklenûn˘ch kuliãek u R. aurantiacana na bunûãnou stûnu (640x)

Obr 69: Rozbíjení bunûk ve tfiecí misce s acetonem a mofisk˘m pískem. Zleva: R. glutinis, R. aurantiaca (640x)

Obr 70: Rozbíjení bunûk ve tfiecí misce s acetonem a mofisk˘m pískem. Zleva: R. mucilaginosa, C. capitatum (640x)

Obr 71: Rozbíjení bunûk ve tfiecí misce s acetonem a mofisk˘m pískem. Zleva: S. shibatanus, S. roseus (640x) (

127

)

Na obrázcácích 69-71 je jiÏ vidût rozru‰ení siln˘ch bunûãn˘ch stûn zkouman˘ch karotenogenních kvasinek. Dezintegrace pomocí homogenizátoru s acetonem a mofisk˘m pískem sice dokázala rozbít bunûãné stûny, ov‰em do‰lo k velkému po‰kození intracelulárních ãástí kvasinek, coÏ znemoÏnilo izolaci intaktní chromozomální DNA. Na základû získan˘ch v˘sledkÛ byla pro elektroforetickou anal˘zu kvasinkového genomu tedy pouÏita izolace intaktní DNA ve formû agarózov˘ch bloãkÛ, které jednotlivé chromosomy chrání pfied po‰kozením bûhem izolaãních postupÛ, zejména pfii pipetování a vortexování. PfiestoÏe postup izolace DNA ve formû agarózov˘ch bloãkÛ je podstatnû nároãnûj‰í, izolace s vyuÏitím nûkteré z dezintegraãních technik nebyla v pfiípadû karotenogenních kvasinek pouÏitelná, ponûvadÏ nebylo moÏné souãasnû dosáhnout uspokojivé míry dezintegrace bunûk a získat kvalitní preparát intaktní chromozomální DNA.

5.7.3 Optimalizace pulzní gelové elektroforézy Pfii izolacích intaktní chromozomální DNA pomocí agarózov˘ch bloãkÛ dochází k ochranû intracelulárních ãístí bunûk, ãímÏ se také zv˘‰í ‰ance na vyizolování nepo‰kozené DNA. Nicménû i tento postup bylo nutné optimalizovat s ohledem na sloÏení povrchov˘ch vrstev bunûk karotenogenních kvasinek. Pfii optimalizacích izolace byly vyzkou‰eny dvû metody, jejichÏ v˘sledky jsou shrnuty v kapitole 5.7.3 a 5.7.3.1. Pfiesn˘ postup izolace kvasinkové DNA je uveden v kapitole 4.5.4.2. Za standard chromozomální DNA slouÏil komerãnû dodávan˘ Yeast Chromosome Marker (YCM) kvasinky S. cerevisiae kmene YPH80 s velikostními markery pro pulsní gelovou elektroforézu 225-1900 kb (BioLabs, USA). U optimalizace metody byly vyzkou‰eny dva postupy izolace intaktní DNA (postup viz kapitola 4.5.4.2.), ãerstvé i mrazené buÀky karotenoidních kvasinek, pocházejících z 48. nebo 80. hodiny kultivace, rÛzné koncentrace gelu, pufru a rozdílné podmínky anal˘zy. V˘sledky jsou uvedeny na obrázcích 72-80.

Obr 72: Optimalizace PFGE; podmínky: 1% gel; 0,08M TBE; 162V; 70s/15h, 120s/11h; 1. Yeast Chromosome Standard, 2. C. capitatum 10-1-1, 3. S. roseus, 4. S. salmonicolor, 5. S. shibatanus, 6. R. aurantiaca, 7. R. mucilaginosa, 8. P. rhodozyma

Cílem optimalizace experimentu s PFGE anal˘zou bylo finálnû získat optimální karyotypy v‰ech testovan˘ch karotenogenních kvasinek. Experiment, jehoÏ v˘sledky jsou vidût na snímku 72, probíhal za podmínek doporuãen˘ch v˘robcem kvasinkového standardu (6V/cm; 70s/15h, (

128

)

120s/11h; 1% gel). Nicménû standard se nerozdûlil zcela na v‰ech 16 chromosomÛ, ale pouze na 14 do velikosti 1120 kb, coÏ je zároveÀ i velikost nejvût‰ího viditelného chromosomu u zde pouÏit˘ch kvasinek. Karotenogenní kvasinky se rozdûlily pouze na 4 frakce o velikostech cca 610 kb, 645 kb, 785 kb a 1120 kb. Zvolená doba pulsní gelové elektroforézy nebyla k rozdûlení celkové DNA ãerven˘ch kvasinek dostaãující. Nejsou zde ani zfietelnû patrné rozdíly mezi jednotliv˘mi druhy. V˘sledek S. roseus navíc vypovídá, Ïe jeho DNA byla bûhem izolace degradovaná.

Obr 73: Optimalizace PFGE; podmínky: 1,2% gel; 0,05M TBE; 162V; 10s/2hod, 40 s/3 hod, 65 s/5 h, 95 s/6 hod, 120 s/8 hod; 1. Yeast Chromosome Standard, 2. C. capitatum 10-1-1, 3. R. glutinis, 4. R. mucilaginosa, 5. S. shibatanus, 6. P. rhodozyma, 7. S roseus

Anal˘za chromozomální DNA ze snímku 73 byla zamûfiena na rozdûlení nejmen‰ích chromozomálních fragmentÛ karotenogenních kvasinek. Tomu byly pfiizpÛsobeny i podmínky experimentu s velmi nízk˘mi pulsními ãasy (od 10 s do 120 s). Je vidût, Ïe ani velmi nízké pulzní ãasy nedovolily rozdûlit DNA na men‰í fragment neÏ je 610 kb (jako u pfiedchozího snímku 72). Nicménû R. mucilaginosa byla rozdûlena na 5 zfietelnû viditeln˘ch fragmentÛ (610, 785, 815, 945 a 1100 kb), C. capitatum (610, 815, 945 a 1100 kb) a S. roseus (610, 645, 945 a 1100 kb) na 4. Mezi jednotliv˘mi druhy kvasinek jsou vidût mírné rozdíly mezi velikostmi jednotliv˘ch frakcí DNA. Ostatní vzorky jsou buì degradované nebo nezfietelnû rozli‰itelné.

(

129

)

Obr 74: Optimalizace PFGE; podmínky: 1,1% gel; 0,08M TBE; 108-162V; 150s/15hod, 200s/20hd, 250s/20hod, 300s/20hod, 500s/20hod; 1. Yeast Chromosome Standard, 2+3. R. glutinis, 4+5. R mucilaginosa, 6. S. roseus, 7. S. shibatanus, 8. S. salmonicolor, 9. C. capitatum 10-1-1, 10. C. capitatum 10-1-2.

Elektroforegram na snímku 74 shrnuje anal˘zu chromozomální DNA testovan˘ch kvasinek pfii dlouhém bûhu separace (95 hod) zamûfieném na anal˘zu velk˘ch fragmentÛ. Napûtí bylo voleno s ohledem na dobu anal˘zy a pulsních ãasÛ v hodnotách 108V, 135V a 162V. Zvolené separaãní podmínky sice nebyly pfiíli‰ vhodné pro anal˘zu standardu S. cerevisiae, ale na druhou stranu bylo dosaÏeno kvalitního rozdûlení a vzájemné odli‰ení kvasinkov˘ch chromosomÛ na cca 15 fragmentÛ. Lze si pov‰imnout odli‰ností mezi kvasinkami rÛzného druhu rodu Rhodotorula. Vzorky patfiící kvasince R. glutinis (2, 3) vykazují znaãné odli‰nosti od chromosomov˘ch fragmentÛ u vzorkÛ R. mucilaginosa (4, 5). R. mucilaginosa byla separována do 15 dobfie viditeln˘ch fragmentÛ: 2 velikostní fragmenty kolem 610 kb, poté na 680 kb, 745 kb, 945 kb, na 7 fragmentÛ o velikosti mezi 1120-1640 kb, 1640 kb a 1900 kb. Naproti tomu kvasinka R. glutinis se podafiila rozdûlit na hÛfie zfieteln˘ch cca 12 fragmentÛ., kdy nejmen‰í zaãíná velikostí nad 610 kb, následují dva chromosomy kolem 680 kb, poté mezi 915-945 kb a asi 5 chromosomÛ o velikostech mezi 1100-1640 kb. Následuje jeden chromosom nad 1640 kb, kter˘ u R. mucilaginosa chybí. Posledním viditeln˘m chromosomem je poté velikostní fragment 1900 kb. U kvasinek Sporobolomyces (6, 7) jsou také dobfie viditelné jednotlivé rozdíly v separovan˘ch chromosomech. Kvasinka S. roseus se rozdûlila na cca 11 velikostních ãástí (680 kb, 745-815 kb, 2 fragmenty mezi 945-1120 kb, cca 3 fragmenty 1120-1640, 1640 kb, 1 fragment pod 1900 kb a poslední o velikosti 1900 kb). Kmen S. salmonicolor je rozdûlena do cca 15 fragmentÛ (610 kb, 680 kb, 745-815 kb, 4x 815-1100 kb, 1640 kb, bad 1640 kb a poslední také 1900 kb). Poslední vzorky kvasinek Cystofilobasidium nejsou dostateãnû rozli‰itelné, proto byla jejich anal˘za provedena opakovanû.

(

130

)

Obr 75: Optimalizace PFGE; podmínky: 1,2 % gel; 0,08M TBE; 162V; 70s/15h, 120s/15h; 1. Yeasts Chromosome Standard, 2. C. capitatum 10-1-1, 3. C. capitatum 10-1-2

Pfii zvolen˘ch podmínkách anal˘zy kvasinkové DNA z obrázku 75 je patrné celkové rozdûlení standardu S. cerevisce na v‰ech 16 chromosomÛ ve velikostech 225-1900 kb deklarovan˘ch v˘robcem. U karotenoidních kvasinek C. capitatum 10-1-1 a 10-1-2 nedo‰lo k dobrému rozli‰ení separovan˘ch chromosomÛ, coÏ poukazuje pravdûpodobnû na velmi nízkou koncentraci DNA v analyzovaném vzorku. Nicménû i tak lze, aã neostfie, rozeznat asi 11 jednotliv˘ch fragmentÛ.

Obr 76: Optimalizace PFGE; 1% gel; 162V, 0,08M TBE; 30s/6hod, 80s/8hod, 120s/10hod; 1. Yeast Chromosome Standard, 2. R. glutinis (A), 3. R. glutinis (B), 4. R. aurantiaca (A), 5. R. aurantiaca (B), 6. S. roseus (A), 7. S. roseus (B), 8. C.capitatum (A), 9. C. capitatum (B), 10. R. glutinis na syrovátce (B), 11. R. glutinis na bramborov˘ch slupkách (B).

Byly testovány dvû metody izolace intaktní DNA. Vzorky s oznaãením A jsou izolované podle Deak T. a kol. 2000, vzorky B dle Cifuentes V. a kol. 1997. Pfiesn˘ popis je v kapitole 4.5.4.2. (

131

)

U elektroforetické anal˘zy, jejíÏ záznam je na snímku 76, ne‰lo o dÛkladnou separaci kvasinkov˘ch chromosomÛ. Testovaly se dvû metody izolace intaktní DNA a jejich vliv na obsaÏené mnoÏství DNA ve vzorku. JelikoÏ vzorky izolované postupem podle Deak T. a kol. 2000 vykazovaly lep‰ích v˘sledkÛ, pouÏíval se tento postup izolace kvasinkové DNA i v dal‰ích experimentech zejména u stresovan˘ch vzorkÛ, kdy se pfiedpokládalo niωí zastoupení bunûk nebo bunûk s po‰kozenou DNA.

Obr 77: Optimalizace PFGE; 1% gel; 0,08 M TBE; 108-135-162 V; 150 s/15 hod, 200 s/20 hod, 250 s/20 hod, 300 s/20 hod; 1. Yeast Chromosome Standard, 2. R. glutinis mraÏené buÀky, 3. R. aurantiaca mraÏené buÀky, 4. C. capitatum mraÏené buÀky, 5. R. aurantiaca 48. h kultivace ãerstvé buÀky, 6. R. glutinis 48. h kultivace ãerstvé buÀky, 7. C. capitatum 48. h kultivace ãerstvé buÀky, 8. S. roseus 48. h kultivace ãerstvé buÀky, 9. R. mucilaginosa 48. h kultivace ãerstvé buÀky, 10. S. shibatanus 48. h kultivace ãerstvé buÀky, 11. R. glutinis syrovátka, 12. R. glutinis bramborové slupky

U experimentu, jehoÏ záznam je na obrázku 77, se testoval vliv pouÏití ãerstv˘ch bunûk kvasinek nebo naopak mrazen˘ch k izolaci intaktní chromozomální DNA v agarózov˘ch bloãcích a následnou anal˘zu. Ukázalo se, Ïe vyuÏití ãerstv˘ch bunûk z exponenciální fáze rÛstu (48 h) vykazuje mnohem lep‰ích v˘sledkÛ. Proto se pro experimenty pouÏívaly vÏdy ãerstvû nakultivované kvasinky a izolace probíhala postupem podle Deak T. a kol. 2000 (viz kapitola 4.5.4.2.). R. aurantiaca se rozdûlila cca na 9 fragmentÛ (610 kb, 745-815 kb, 1120 kb, 4x mezi 1120-1640 kb, 1640 kb a poslední 1900 kb); R. glutinis na cca 13 úsekÛ (555 kb, 610 kb, 680 kb, 745 kb, 915 kb, 1120 kb, cca 5x 1120-1640 kb, 1640 kb, 1900 kb); C. capitatum cca 13 fragmentÛ (555 kb, 610 kb, 680 kb, 815 kb, 945 kb, 5x 1120-1640 kb, 1640 kb, 2x kolem 1900 kb); S. roseus asi na 5 frakcí (680 kb, 745-815 kb, 1120 kb, asi dva ve velikostech 1640-1900 kb); R. mucilaginosa na cca 11 fragmentÛ (610 kb, 680 kb, 915-945 kb, cca 5 v rozmezí 1120-1640 kb, 1640 kb, 2 kolem 1900 kb); S. shibatanus ‰patnû viditeln˘ch cca 8 frakcí (610 kb, 745-815 kb, cca 4 mezi 1120-1640 kb, 1900 kb).

(

132

)

Obr 78: Optimalizace PFGE; 1% gel; 0,08M TBE; 108-135-162V; 150s/15h, 200s/20h, 250s/20h, 300s/20h, 500s/10h; 1. Yeast Chromosome Standard, 2. R. glutinis 80h kultivace, 3. R. glutinis 48h kultivace, 4. S. roseus 48h kultivace, 5. S. roseus 80h kultivace, 6. S. shibatanus 80h kultivace, 7. S. shibatanus 48h kultivace

U posledního experimentu zaznamenaného na obrázku 78 si mÛÏeme pov‰imnout jednotliv˘ch rozdílÛ mezi kvasinkami Rhodotorula a Sporobolomyces, dokonce i mezi S. roseus a S. shibatanus. Opakovanû bylo prokázáno, Ïe 48. hodina, tedy fáze exponenciálního rÛstu kvasinek, vyhovuje více k izolaci DNA neÏ 80. hodina ze stacionární fáze rÛstu. U R. glutinis je dobfie vidût 13 jednotliv˘ch frakcí (555 kb, 610 kb, 680 kb, 785 kb, 945 kb, cca 7 mezi 1120-1640 kb, 1640 kb, 1900 kb); u S. roseus hÛfie viditeln˘ch 6 fragmentÛ (680 kb, 815 kb, 1x nad 1120 kb, 1640 kb, a dva chromosomy kolem 1900 kb), coÏ je zpÛsobeno pravdûpodobnû nízkou koncentrací DNA a u S. shibatanus cca 14 frakcí zãásti v jinch pozicích neÏ u S.roseus (555 kb, 610 kb, 680 kb, 745 kb, 785 kb, 815 kb, 915 kb, 5 chromosomÛ mezi 1120-1640 kb, 1640 kb, 1900 kb). PFGE je technika slouÏící k separaci velk˘ch fragmentÛ DNA a cel˘ch kvasinkov˘ch chromosomÛ, které není moÏné rozli‰it pomocí bûÏn˘ch elektroforetick˘ch technik. Pfii izolaãních postupech jsou kvasinkové chromosomy imobilizované v agarózov˘ch bloãcích, coÏ zajistí jejich neporu‰ení a nedojde k fragmentaci mechanick˘mi procesy bûhem pipetování. Po následné anal˘ze kvasinkového genomu pomocí PFGE, slouÏí chromosomov˘ profil a karyotyp kvasinek k identifikaci, obzvlá‰È v pfiípadû, jedná-li se o druhy, které vykazují jen malé nebo prakticky Ïádné variace mezi jednotliv˘mi rody. MÛÏeme tedy jednotlivé kvasinky identifikovat na základû jejich druhové a rodové pfiíbuznosti.

(

133

)

5.7.3.1 Pulzní gelová elektroforéza karotenogenních kvasinek kultivovan˘ch za pÛsobení stresov˘ch faktorÛ Karotengenní kvasinky, které byly vystaveny negativním stresov˘m faktorÛm pfii osmotickém (9% NaCl) a oxidaãním (100 mM H2O2) stresu a pfii mutacích (20 mg/l EMS), byly testovány, jestli se zde vyskytly odchylky v chromozomální DNA oproti buÀkám u nestresovan˘ch kultur. V˘sledky experimentÛ jsou shrnuty na snímcích 79-80.

Obr 79a: PFGE kvasinek po pÛsobení mutagenu; podmínky: 1% gel; 0,08M TBE; 162V: 100s/8h, 150s/10h; 135V: 200s/15h; 108V: 300s/15h. 1. Yeast Chromosome Standard, 2 a 3. R. glutinis kontrola , 4 a 5. R. glutinis s mutagenem, 6. R. mucilaginosa kontrola, 7 a 8. R. mucilaginosa s mutagenem, 9 a 10. S. shibatanus kontrola, 11 a 12. S. shibatanus s mutagenem.

Obr 79b: PFGE kvasinek po pÛsobení mutagenu; podmínky: 1% gel; 0,08M TBE; 162V: 100s/8h, 150s/10h; 135V: 200s/15h; 108V: 300s/15h; 1. Yeast chromosome standard, 2 a 3. C. capitatum kontrola, 4 a 5. C. capitatum s mutagenem

Pfii bliωím prozkoumání snímkÛ 79a a 79b dojdeme k závûru, Ïe vystavení karotenogenních kvasinek pÛsobení mutagenu o vy‰‰ích koncentracích (20 mg/l), nevedlo ke zmûnám v chromozomální DNA, které by mohly b˘t detekovány pomocí pulsní gelové elektroforézy. Aãkoliv do‰lo u takto kultivovan˘ch kvasinek jiÏ pfii niωí koncentraci mutagenu k razantním rozdílÛm v rÛstu (viz kapitola 5.2), morfologii (viz kapitola 5.3), ve zbarbení médií (viz kapitola 5.4) a produkci metabolitÛ (viz kapitola 5.5 a 5.6), integrita chromozomální DNA podle PFGE zÛstala neporu‰ená. Metody, kter˘mi by bylo moÏné detekovat vzniklé mutace v kvasinkovém genomu, by mûly b˘t rychlé, standardizovatelné, vysoce citlivé a reprodukovatelné. Vhodn˘mi technikami vyuÏiteln˘mi pro vyhodnocení mutací mohou b˘t napfi. denaturaãní gradientová gelová elektroforéza (DGGE) nebo anal˘za heteroduplexu. Pomocí tûchto technik jsou mutace detekovány elektroforetickou separací. Dále je moÏné vyuÏití sledování polymorfismÛ v délkách restrikãních fragmentÛ nebo detekování genomov˘ch mutací pomocí enzymatick˘ch reakcí. Rychlé a jed-

(

134

)

nuduché fie‰ení anal˘z bodov˘ch mutací se také nabízí pomocí PCR s rychl˘m cyklem (Rapidcycle PCR) s fluorescencí genotypu (Loeffler J. a kol. 2000).

Obr 80: PFGE kvasinek po pÛsobení osmotického a oxidaãního stresu; podmínky: 1% gel; 0,08M TBE; 162V: 100s/8h, 150s/10h; 135V: 200s/15h; 108V: 300s/15h; 1. Yeast Chromosome Standard, 2 a 3. S. roseus kontrola, 4 a 5. S. roseus 9% NaCl, 6 a 7. S. roseus 100 mM H2O2, 8. C. capitatum kontrola, 9 a 10. C. capitatum 9% NaCl, 11 a 12. C. capitatum 100 mM H2O2

U posledního experimentu (snímek 80), kdy byly karotenogenní kvasinky kultivovány v pfiítomnosti 9% NaCl (vysok˘ osmotick˘ stres) a 100 mM H2O2 (vysok˘ oxidaãní stres) nejsou viditelné rozdíly mezi stresovanou kulturou a kulturou kontrolní. Pulsní gelová elektroforéza sama o sobû pravdûpodobnû není schopná rozli‰it potenciální rozdíly v jednotliv˘ch chromosomálních fragmentech zkouman˘ch kvasinek, aãkoliv podobnû jako u pfiedchozího experimentu, i zde byly zaznamenané diference v rÛstu (kapitola 5.2.), morfologii (kapitola 5.3), zabarvení (kapitola 5.4), a produkci metabolitÛ (kapitoly 5.5 a 5.6) mezi stresovan˘mi kvasinkami a kontrolními.

5.8 Studium utilizace xylózy rekombinantní kvasinkou S. cerevisiae Tato ãást disertaãní práce byla zpracována v rámci zahraniãního pobytu Erasmus na Technické univerzitû v Lundu, ·védsko. Experimenty zde povedené se t˘kaly transformací kvasinky S. cerevisiae, která by se poté mohla vyuÏívat k rÛstu na pentózov˘ch substrátech (xylóza, arabinóza) a tvorbû bioetanolu. Takto geneticky pozmûnûná S. cerevisiae mÛÏe vyuÏívat xylózu a pfiemûÀovat ji metabolick˘mi pentózov˘mi dráhami na xylitol. Právû tato schopnost pfiemûny xylózy na xylitol se testovala a dokazovala nám úspû‰né zavedení genu reduktázy xylózy do kvasinky.

(

135

)

Gen nesoucí úsek DNA zodpovûdného za produkci enzymu katalyzujícího redukci xylózy na xylitol byl amplifikován v bakteriálním kmenu E. coli DH5α a poté pfienesen transformaãní reakcí do bunûk S. cerevisiae (pfiesn˘ popis experimentÛ v kapitolách 4.6.3 a 4.6.4).

Obr. 81: Amplifikace genu xylózareduktázy. Elektroforéza v 1% agarózovém gelu (20 µl vzorku + 5 µl loading pufru); standard 1kb DNA ladder

5.8.1 Izolace plazmidu z transformované kvasinky Z bunûãn˘ch kultur transformovan˘ch kvasinek se vyizoloval plazmid nesoucí gen xylózareduktázy a restrikãnû se na‰tûpil. V˘sledek experimentu je na snímcích 82 aÏ 84. Vzorky obsahující zkouman˘ plazmid byly poslány na sekvenování do BM Labbet AB (Furulund, ·védsko)

Obr 82: Restrikãní ‰tûpení vyizolovaného plazmidu z transformovan˘ch kvasinek (vzorky ã. 8, 9 poslány na sekvenování), standard 1kb DNA ladder

(

136

)

Obr 83: Restrikãní ‰tûpení vyizolobaného plazmidu z transformovan˘ch kvasinek (vzorek ã. 5 poslán na sekvenování), standard 1kb DNA ladder

Obr 84: Restrikãní ‰tûpení vyizolobaného plazmidu z transformovan˘ch kvasinek (vzorky ã. 2, 6 a 7 poslány na sekvenování), standard 1kb DNA ladder

5.8.2 Sekvenování vyizolovaného plazmidu z transformované kvasinky Úspû‰nû vyizolované vzorky plazmidÛ z transformované kvasinky, u kter˘ch se pfiedpokládalo, Ïe ponesou gen xylózareduktázy, byly zaslány na sekvenování u BM Labbet AB (Furulund, ·védsko). V˘sledné sekvence se následnû porovnaly s databází NCBI (National Center for Biotechnology Information) dostupné na http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

(

137

)

>Screen 9A1F_GPDf – 9 .. 959 of sequence hypotetick˘ protein 9A1 (Anaeromyxobacter 90%) CTTACTTCTTAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAGAACTT AGTTTCGACGGATTCTAGAACTAGTGGATCCTCTCGCCCGGTGGTATTGGTGTTGTGTTTTTTGC CCACAAGGGAACGGCCGCCTGGGAGACTCAACTTCAAGCAATGATCGACGCCGGCTGGATCATCG TCGGTTCGTGGCCGCTTGCTACGGAGAGGGAGGGTCGGCTTAGGGCCATGGATTCGGCCGTGCTG GCGTCTTCGATTCAGCTCGTGTGTCGACCGAGGGAAACGGCCGACGGCACACTGCGTGACAGCGC CGGTGACTGGCGAGAAGTCCTGCAACAGTTGCCTCGACGTATTCACGAATGGATGCCACGGCTAG CGAAGGAAGGCGTTGTTGGGGCGGACGCGATATTTGCTTGCTTAGGTCCTGCGCTTGAACTCTTC TCCCGTCACTCTCGTGTGGAGCGCGCGAATGGCGATCGCGTGACCCTTCGCGAGTATCTGGAACA GGTCTGGGCGGCGGTGTCACGGGAGGCCTTGTCGATGATCTTCTCGGACCCGGACACGGCAGGCC TTGATGAAGACGCACGCGTCACGGCTATCTGGCTCTGGACGATTGCGGCACCAACCGGAGACTCT CAAGACCTGGCAGCCGAAGATGCATCAGATGATCAAGACATTAGGACGTCATCCAAGGCAGGCAG TGGCTATTCGCTTGAATTCGATGCCGCTCGAAAGATTGCCCAAGGGCTCGGTGCCCAGCTTGAGG CGATGCAGCACGTCATCGAAGTCAAAGGCGACACCGCGCGCCTGCTTCTTGTGGCAGAGCGGACG AAATACCTATTTGGCGGCCCCGACGGTGCGCCGACGCAAAAGCAGAGGTCCAAAAAGAAGCCTCA GAGGGGGCTCTTTGAGGAGCTGGAAGAAGTGGCTGAACAACAAGC

>Screen 9A2F_GPDf — 12.. 954 of sequence hypotetick˘ protein 9A2 (Anaeromyxobacter 90%) ACTTCTTAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAGAACTTAGT TTCGACGGATTCTAGAACTAGTGGATCCTCTCGCCCGGTGGTATTGGTGTTGTGTTTTTTGCCCA CAAGGGAACGGCCGCCTGGGAGACTCAACTTCAAGCAATGATCGACGCCGGCTGGATCATCGTCG GTTCGTGGCCGCTTGCTACGGAGAGGGAGGGTCGGCTTAGGGCCATGGATTCGGCCGTGCTGGCG TCTTCGATTCAGCTCGTGTGTCGACCGAGGGAAACGGCCGACGGCACACTGCGTGACAGCGCCGG TGACTGGCGAGAAGTCCTGCAACAGTTGCCTCGACGTATTCACGAATGGATGCCACGGCTAGCGA AGGAAGGCGTTGTTGGGGCGGACGCGATATTTGCTTGCTTAGGTCCTGCGCTTGAACTCTTCTCC CGTCACTCTCGTGTGGAGCGCGCGAATGGCGATCGCGTGACCCTTCGCGAGTATCTGGAACAGGT CTGGGCGGCGGTGTCACGGGAGGCCTTGTCGATGATCTTCTCGGACCCGGACACGGCAGGCCTTG ATGAAGACGCACGCGTCACGGCTATCTGGCTCTGGACGATTGCGGCACCAACCGGAGACTCTCAA GACCTGGCAGCCGAAGATGCATCAGATGATCAAGACATTAGGACGTCATCCAAGGCAGGCAGTGG CTATTCGCTTGAATTCGATGCCGCTCGAAAGATTGCCCAAGGGCTCGGTGCCCAGCTTGAGGCGA TGCAGCACGTCATCGAAGTCAAAGGCGACACCGCGCGCCTGCTTCTTGTGGCAGAGCGGACGAAA TACCTATTTGGCGGCCCCGACGGTGCGCCGACGCAAAAGCAGAGGTCCAAAAAGAAGCCTCAGAG GGGGCTCTTTGAGGAGCTGGAAGAAGTGGCTGAACAC Z v˘sledkÛ sekvenování vypl˘vá, Ïe ve vzorcích 8 a 9 (viz obr 82) byl nalezen hypotetick˘ protein s 90% podobností s Anaeromyxobacter sp., nebyla ov‰em prokázána sekvenãní podobnost s geny pro XR, proto se v dal‰í kapitole 5.8.3 studovala úspû‰nost transformace na úrovni fenotypu. (

138

)

5.8.3 Stanovení enzymatické aktivity xylózareduktázy Jestli transformované kvasinky S. cerevisiae skuteãnû obsahovaly gen zodpovûdn˘ za schopnost utilizace pentóz, bylo sledováno i na úrovní fenotypu, a to promûfiením enzymatické kinetiky, tedy rychlosti reakce, s jakou transformovaná kvasinka dovede redukovat pfiítomnou xylózu na xylitol. Aktivita NAD(P)H-dependentní xylózareduktázy se stanovila pomocí Ultrospec 2100 spektrometru (Amersham Biosciences, ·védsko) pfii OD340/30 °C v pufru TRA. Metoda byla optimalizována pro rÛzné koncentrace kofaktoru NAD(P)H (0,025 mM - 0,2 mM) a substrátu (xylóza) (0,1 M – 0,7 M). V˘sledky se zpracovaly v programu Openoffice 3.3.0 s vyuÏitím Lineweaverova-Burkova grafu závislosti 1/vi na 1/[S], vyuÏívaného ke stanovení Km, Vmax. Pfiehledn˘ popis provedeného experimentu je v kapitole 4.6.6.

Graf 45: Stanovení koncentrace proteinÛ ve vzorku kompetentní S. cerevisiae

A (595 nm) bunûãn˘ extrakt 0,656 0,656

A (595 nm) protein 8,648 8,561

Tab 22: Obsah proteinÛ v bunûãném extraktu po transformaci S. cerevisiae Graf 45 a tabulka 22 udávají v˘sledky ve stanovení koncentrace proteinÛ ve vzorku rekombinaãní S. cerevisiae. Koncentrace proteinÛ byla stanovena na 0,1712 mg/ml, dále byla promûfiena reakãní kinetika. V˘sledky jsou uvedeny v tabulce 23.

(

139

)

kofaktor NADPH/NADH

Enzymatická aktivita transformované S. cerevisiae Vmax (U/mg proteinu) KmA (µm) KmB (µm) 2,8 / 1,24 28 / 17 90 / 70

KiA (µm) 40 / 23

Tab 23: Stanovení Km a Vmax pro transformovanou S. cerevisiae (Runquist D., Hahn-Hägerdal B., Bettiga M, 2010) Z vy‰‰ích hodnot Km pro kofaktor NADPH oproti NADH lze usuzovat na niωí afinitu xylózareduktázy k NADPH. Enzym více upfiednostÀuje reakce s kofaktorem NADH, coÏ také odpovídá mnohem vy‰‰í hladinû intracelulárního NADH neÏ NADPH. Z pfiedloÏen˘ch v˘sledkÛ (tabulka 23) je dále patrné, Ïe námi transformovaná kvasinka S. cerevisiae obsahovala gen pro enzym, kter˘ je zodpovûdn˘ za redukci xylózy, tzv. xylózareduktázu (XR). XR je jedním z enzymÛ pocházejících z Pichia stipitis a vyuÏívan˘ch v rekombinantních S. cerevisiae k utilizaci xylózy. Zkouman˘ gen byl úspû‰nû integrován v chromosomech a vykazoval stabilní genovou expresi. S. cerevisiae tedy vykazovala schopnost utilizace xylózy, která je jedním z nejhojnûji se vyskytujících sacharidÛ v pfiírodû, hlavnû v ligninocelulózov˘ch matricích. Vzhledem k tomu, Ïe se S. cerevisiae s v˘born˘mi fermentaãními vlastnostmi vyuÏívá k v˘robû etanolu, je schopnost utilizovat xylózu dal‰í v˘zvou ve vyuÏití rÛzn˘ch odpadních substrátÛ z ligninocelulózov˘ch matric k v˘robû biolihu.

(

140

)

6. Závûry • Tato práce byla zamûfiena na moÏnosti cíleného ovlivnûní mikrobiální produkce biomasy obohacené vybran˘mi metabolity, zejména karotenoidy (u ãerven˘ch kvasinek) a bioetanolu (u rekombinantní S. cerevisiae). U karotenogenních kvasinek patfiících do druhÛ Rhodotorula, Sporobolomyces a Cystofilobasidium se testovala moÏnost vlivu rÛzn˘ch stresov˘ch faktorÛ na produkce biomasy, jiÏ zmínûn˘ch karotenoidÛ a také ergosterolu. • Jednotlivé kvasinky byly vystaveny osmotickému, oxidaãnímu stresu i jejich vzájemné kombinaci, dále se sledovalo pÛsobení pfiítomn˘ch iontÛ kovÛ v kultivaãních médiích (chromu a selenu). Kvasinky byly vystaveny nutriãnímu stresu zámûnou bûÏn˘ch uhlíkat˘ch a dusíkat˘ch zdrojÛ (glukóza a kvasniãn˘ autolyzát) za rÛzné odpadní substráty ze zemûdûlsk˘ch a hospodáfisk˘ch v˘rob (jableãná vláknina, jableãné slupky, hru‰kové slupky, tûstoviny, kukufiiãné klíãky, p‰eniãná ka‰e nebo syrovátka). Suroviny obsahující velké mnoÏstv˘ch komplexních sacharidÛ byly podrobeny hydrol˘ze s vyuÏitím smûsn˘ch extracelulárních plísÀov˘ch enzymÛ. Kvasinky byly také vystaveny náhodné mutagenezi s vyuÏitím esteru kyseliny metansulfonové a zkoumalo se, jestli se zmûní jejich schopnost syntetizovat Ïádané metabolity. • V první fázi práce byly sledovány morfologické zmûny (mikroskopie), barevné odli‰nosti u jednotliv˘ch kultur kvasinek kultivovan˘ch za optimálních podmínek a za pÛsobení stresÛ. Prvním v˘znamn˘m parametrem bylo stanovení mnoÏství vyprodukované biomasy ve v‰ech testovan˘ch podmínkách (gravimetrie, nefelometrie). Dále byly sledovány zmûny produkce metabolitÛ izoprenoidní dráhy – karotenoidÛ a ergosterolu (HPLC). V neposlední fiadû se zkoumal vliv nûkter˘ch pouÏit˘ch environmentálních stresÛ na zmûny v genomu testovan˘ch kvasinek (PFGE). U rekombinantního kmene S. cerevisiae se sledovaly kinetické parametry xylózareduktázy. Izolované plazmidy, u kter˘ch se pfiedpokládala pfiítomnost genu kódujícího xylózareduktázu (PCR), se podrobily sekvenování. • Po expozici karotenogenních kvasinek osmotickému stresu o rÛzn˘ch koncentracích NaCl v médiu nedo‰lo u kvasinek C. capitatum a S. shibatanus k v˘raznému poklesu v rÛstov˘ch vlastnostech pfii niωích koncentracích NaCl. RÛst byl sníÏen aÏ v pfiítomnosti 9% NaCl, a to u C. capitatum o 50 % a u S. shibatanus o 70 %. Nízké koncentrace soli tyto kvasinky sná‰í velmi dobfie, ãehoÏ by se dalo vyuÏít i pfii prÛmyslov˘ch kultivacích. U R. aurantiaca a S. roseus byla zaznamenána hor‰í sná‰enlivost k pfiítomnosti NaCl v médiu. Nejv˘raznûj‰í efekt se projevil u S. roseus, kdy i 2% pfiídavek NaCl zpÛsobil témûfi 70% pokles v nárÛstu kultury. Pfii posuzování barevn˘ch zmûn médií pfii kultivacích za osmotického stresu do‰lo pfii pÛsobení 9% NaCl u v‰ech sledovan˘ch kvasinek k vysokému úbytku zbarvení média z oranÏové aÏ témûfi na bílou barvu, coÏ odpovídá negativnímu úãinku stresového faktoru na jednotlivé buÀky. • PÛsobení oxidaãního stresu pomocí H2O2 zpÛsobilo u v‰ech testovan˘ch kvasinek kromû S. roseus podporu rÛstu i tvorby biomasy. Zv˘‰ená tvorba biomasy se projevovala dokonce i v pfiítomnosti vy‰‰ích koncentrací H2O2, kdy pravdûpodobnû O2 pocházející z roz(

141

)

kladu H2O2 stimuloval aerobní karotenogenní kvasinky v rÛstu. Na druhou stranu u kvasinky S. roseus byla zaznamenána velmi nízká schopnost adaptace, kdy i nízké koncentrace H2O2 pÛsobily toxicky a 2 mM H2O2 v produkãní fázi vyvolal 70% pokles tvorby biomasy. Tento kmen reagoval na soln˘ i peroxidov˘ stres podobnû, coÏ pravdûpodobnû souvisí s nízk˘mi adaptaãními vlastnostmi kvasinky a mohlo by souviset s charakterem pfiirozené lokality (lesní pÛda), odkud byl pÛvodní kmen získán. Pfii sledování barevn˘ch zmûn médií u oxidaãního stresu nedo‰lo u C. capitatum k v˘razn˘m zmûnám, u ostatních sledovan˘ch kvasinek zpÛsobily vy‰‰í koncentrace H202 svûtlej‰í odstín média. • Experimenty s kombinovan˘mi stresov˘mi faktory (NaCl a H2O2) vedly u C. capitatum k poklesu rÛstu pfii pouÏití 5% NaCl v INO II v kombinacích s osmotick˘mi i oxidaãními stresy rÛzn˘ch koncentrací v produkãních médiích. Naopak oxidaãní stres pÛsobil mírnû stimulaãnû, nejvy‰‰í produkce biomasy byla dosaÏena s 5 mM H2O2 v produkãním médiu (6,71 g/l). I zde pÛsobil uvolnûn˘ kyslík z H2O2 na rÛst stimulaãnû. Vystavení kvasinky C. capitatum pÛsobení osmotického, oxidaãního nebo kombinovaného stresu mûlo za následek i zesílení povrchov˘ch struktur bunûk. Tento efekt byl zpÛsoben pravdûpodobnû nahromadûn˘mi karotenogenními pigmenty, které vznikají jako odezva na stresové faktory. H2O2 zpÛsobil mnohem vût‰í po‰kození bunûk neÏ sÛl. • Kvasinka C. capitatum vykazovala pfii v‰ech testovan˘ch podmínkách osmotického i oxidaãního stresu vy‰‰í produkci karotenoidÛ v porovnání s kontrolní kultivací. Nejvíce β-karotenu bylo vyprodukováno pfii pÛsobení kombinovaného stresu s 5% NaCl v INO II a souãasnû i v produkãním médiu. Oproti nárÛstu biomasy pfii produkci pigmentÛ nepÛsobil H2O2 stimulaãnû, a naopak NaCl v médiu sice znamenala pomalej‰í rÛst, ale zato do‰lo k vy‰‰í produkci pigmentÛ, které se nahromadily v bunûãn˘ch stûnách jakoÏto odezva na soln˘ stres. Kromû produkce biomasy by mohla b˘t kvasinka C. capitatum pouÏita k prÛmyslové produkci karotenogenních pigmentÛ nejen β-karotenu, ale i torulenu a torularhodinu. K v˘robám by byly vhodné zejména kultivace za pÛsobení kombinovan˘ch stresÛ s vy‰‰ími koncentracemi NaCl, kdy dochází k indukci poÏadovan˘ch metabolitÛ. • Kvasinka C. capitatum v experimentech s biogenními prvky selenem a chromem vykazovala v pfiítomnosti 1 mM Se nízk˘ nárÛst. Vy‰‰í koncentrace selenu mûly negativní vliv i na produkci pigmentÛ. Vysoké koncentrace selenu zfiejmû pÛsobí na kvasinku toxicky. Pfiídavek chromu v testovan˘ch koncentracích nemûl vliv na rÛst, ãehoÏ by bylo moÏné vyuÏít pfii pfiípadné sorpci nebo transportu kovu do bunûk. K indukci pigmentÛ do‰lo u experimentÛ s 5 mM Cr a niωími koncentracemi Se, kdy do‰lo také ke stimulaci v rÛstu. • VyuÏití odpadních substrátÛ ke kultivacím vedlo k dobr˘m rÛstov˘m vlastnostem u v‰ech sledovan˘ch kvasinkov˘ch kmenÛ. U C. capitatum do‰lo ke stimulaci rÛstu na médiích s dodateãn˘mi zdroji dusíku (tûstoviny a syrovátka) a na jableãné vlákninû. Kvasinka R. aurantiaca dobfie rostla na jableãné vlákninû a R. glutinis spoleãnû s S. roseus by mohly b˘t prÛmyslovû kultivovány prakticky na v‰ech zde testovan˘ch substrátech. • Kultivace na rÛzn˘ch odpadních substrátech vedly k nûkter˘m morfologick˘m zmûnám kvasinek. U C. capitatum se vyskytly silnûj‰í bunûãné povrchové struktury a protaÏení bunûk pfii pouÏití ‰krobnat˘ch substrátÛ. R. aurantiaca mûla také protáhlej‰í buÀky, a to (

142

)

pfii kultivacích na hru‰kov˘ch slupkách. Kvasinka S. roseus tvofiila shluky na p‰eniãné ka‰i. U této kvasinky bylo zaznamenáno nejvût‰í po‰kození bunûk, coÏ mohlo b˘t vyvoláno hor‰ími adaptaãními vlastnostmi. Sledované kmeny vykazovaly, rovnûÏ jisté rozdíly zbarvení, u C. capitatum byly pozorovány svûtlej‰í odstíny média u kultivací na tûstovinách. V‰echny posuzované kvasinky byly charakteristické hnûd˘m zabarvením médií pfii kultivacích na vlákninû. • Produkce karotenoidÛ byla pfii kultivacích na rÛzn˘ch odpadních substrátech u kvasinky C. capitatum zv˘‰ena 6x pfii pouÏití jableãné vlákniny a kvasniãného autolyzátu jako zdroje N. Dále do‰lo k indukci β-karotenu a ergosterolu pfii kultivacích na p‰eniãné ka‰i s enzymatickou hydrol˘zou plísÀov˘mi preparáty 3 a 4, kde ov‰em do‰lo k poklesu v tvorbû biomasy. Kvasinka R. aurantiaca se vyznaãovala dobr˘mi rÛstov˘mi vlastnostmi na jableãné vlákninû, kde do‰lo i k indukci β-karotenu (0,68 mg/g) a ergosterolu. Kvasinka je schopná utilizovat ‰krobnaté substráty aÏ po ãásteãné enzymatické hydrol˘ze. P‰eniãná ka‰e s plísÀov˘m preparátem E2 mûla za následek sice niωí produkci biomasy, ale vy‰‰í produkci β-karotenu (1 mg/g). Nejvíce ergosterolu bylo vyprodukováno na médiích obsahujícíh p‰eniãnou ka‰i. Neobvykle vysoká produkce β-karotenu (4,3 mg/g) a ergosterolu byla u kvasinky S. roseus, a to na v‰ech testovan˘ch odpadních substrátech. Na druhou stranu se ov‰em S. roseus vyznaãoval nejniωí produkcí biomasy ze v‰ech karotenogenních kvasinek v proveden˘ch experimentech, coÏ limituje její potenciální vyuÏití pfii prÛmyslové produkci obohacené biomasy. • V porovnání v˘sledkÛ prezentovan˘ch experimentÛ s jiÏ publikovan˘mi daty od jin˘ch vûdeck˘ch t˘mÛ lze usuzovat, Ïe perspektivní vyuÏití by mohla mít kromû kvasinky R.glutinis CCY 20-2-26 (prokázáno v pfiedchozích pracích) také kvasinka Cystofilobasidium capitatum CCY 10-11-1. Oba kmeny se vyznaãují pomûrnû stabilním rÛstem, relativnû vysokou produkcí biomasy (cca 10 g/l za optimálních podmínek) a schopností adaptovat se na stresové podmínky a alternativní nutriãní zdroje bez v˘razné ztráty produkce biomasy a s indukovanou produkcí prÛmyslov˘ch metabolitÛ. Lze tedy usuzovat o moÏnosti vyuÏití tûchto kmenÛ k zavedení produkce obohacené kvasinkové biomasy do prÛmyslového mûfiítka. • Vystavení karotenogenních kvasinek pÛsobení náhodné mutageneze vlivem chemického mutagenu ethylesteru kyseliny methansulfonové o koncentraci 10 mg/l zpÛsobilo odli‰né chování u v‰ech testovan˘ch kvasinek. Selekce mutantÛ nevedla k získání kmenÛ s v˘znamnû odli‰n˘mi vlastnostmi vhodn˘ch k dal‰ímu vyuÏití. Je tfieba provést sérii následn˘ch experimentÛ vãetnû testování rÛstu a produkãních vlastností selektovan˘ch mutantÛ na odpadních substrátech, kdy by mohlo dojít k nadprodukci karotenoidÛ a lipidÛ a souãasnû ke sníÏení produkãních nákladÛ. • DÛleÏit˘m znakem u sledování toxicity environmentálních stresÛ je fragmentace chromozomální DNA. Pulsní gelová elektroforéza intaktní kvasinkové chromozomální DNA bunûk, které byly vystaveny rÛzn˘m stresov˘m faktorÛm, by mohla prokázat rÛzné druhy po‰kození struktury a integrity DNA. Studium karyotypu kvasinek je ov‰em do jisté míry limitováno izolací nepo‰kozené DNA. V pfiedloÏené práci byly testovány rÛzné metody za úãelem dezintegrace atypické a mimofiádnû rigidní bunûãné stûny karotenogenních (

143

)

kvasinek. Postupy s pomocí ultrazvuku, lytick˘ch enzymÛ, detergentÛ, vortexu nebo zv˘‰ené doby inkubace s chemick˘mi ãinidly nevedly ke kvalitní a kvantitativní formaci protoplastÛ. AÏ pouÏití mechanické dezintegrace spoleãnû s acetonem a mofisk˘m pískem vedlo k rozbití bunûãné stûny, ov‰em do‰lo souãasnû k nevratnému po‰kození intracelulárních komponent a nebylo moÏné vyizolovat intaktní chromozomální DNA. K izolaci kvsinkové chromozomální DNA se tedy vyuÏila metoda izolace v agarózov˘ch bloãcích, které nohou molekulu DNA dostateãnû ochránit pfied po‰kozením. • Pfiímé rozsuspendování bunûk v lytickém pufru s enzymem lytikázou a detergenty a následná inkubace pfies noc se jevila jako optimální metoda pro izolaci intaktní chromozomální DNA. Vyextrahovaná DNA byla poté analyzovaná metodou pulsní gelové elektroforézy. Za optimální podmínky byly stanoveny: 1% gel, 0,08 M TBE pufr, pro niωí pulsní ãasy 162 V. Napûtí se se zvy‰ujícími pulsními ãasy sniÏovalo pfies 135 V na 108 V. Pro komplexní charakterizaci geonomu karotenogeních kvasinek byla zvolena jako optimální doba anal˘zy aÏ 95 hodin, pro porovnání potenciálních zmûn v karyotypu po expozici stresov˘m faktorÛm postaãila doba anal˘zy kolem 48 hodin. • Nejmen‰í chromosomy karotenogenních kvasinek byly u S. salmonicolor, R. glutinis a C. capitatum charakterizovány velikostí 555 kb, zatímco R. aurantiaca, R. mucilaginosa a S. shibatanus obsahovaly nejmen‰í zji‰tûn˘ fragment o velikosti 610 kb a S. roseus o velikosti 680 kb. V‰echny kvasinky obsahovaly nejvût‰í zji‰tûn˘ chromosom velikosti 1900 kb. U nûkter˘ch byl chromosomov˘ fragment této velikosti rozdûlen na dvû ãásti. Kvasinku C. capitatum se podafiilo separovat na 13 jednotliv˘ch frakcí, u R. aurantiaca bylo prokázko 9 frakcí, u R. glutinis 13 frakcí, kmeny R. mucilaginosa a S. salmonicolor obsahovaly aÏ 15 frakcí, S. roseus 11 a S. shibatanus 8 frakcí. I pfies detailní optimalizaci a anal˘zu nemusí b˘t zji‰tûn˘ poãet frakcí koneãn˘. • Pfii pÛsobení vy‰‰ích koncentrací osmotického (9% NaCl) a oxidaãního (100 mM H2O2) stresu, ani pfii expozici kvasinek pÛsobení mutagenu o koncentraci 20 mg/l, nebyly zaznamenány viditelné rozdíly v PFGE profilech jednotliv˘ch chromosomÛ u analyzovan˘ch kmenÛ. Z tûchto v˘sledkÛ lze orientaãnû usuzovat, Ïe efekt pouÏit˘ch koncentrací stresov˘ch faktorÛ na testované kvasinky nebyl toxick˘. Detailní vliv mutací by bylo nutné sledovat pomocí jin˘ch technik, napfi. DGGE. • Provedené experimenty s rekombinantní kvasinkou S. cerevisiae prokázaly schopnost transformované kvasinky utilizovat xylózu, coÏ bylo zpÛsobeno pfiítomností vneseného genu xylózareduktázy (XR) z P.stipitis. Získané v˘sledky otevírají moÏnosti ve vyuÏívání ligninocelulózov˘ch materiálÛ k produkci bioethanolu jakoÏto alternativního zdroje energie ze sniÏující se zásoby dnes hojnû pouÏívan˘ch fosilních paliv. Produkce obohacené kvasinkové biomasy s pouÏitím rÛzn˘ch odpadních substrátÛ pocházejících ze zemûdûlsk˘ch v˘rob, hospodáfiství nebo prÛmyslu sníÏí nejen ekonomické aspekty v˘roby, ale také rizika zátûÏe Ïivotního prostfiedí.

(

144

)

Seznam pouÏité literatury AKSU, Z., EREN, A. T. Carotenoids production by the yeast Rhodotorula mucilaginosa: use of agricultural waste substrates as a carbon source. Process Biochem., 2005, vol. 40, p. 29852991. ISSN: 1359-5113. AKSU, Z., EREN, A. T. Production of carotenoids by the isolated yeast of Rhodotorula glutinis. Biochemical Engineering Journal, 2007, vol. 35, p. 107-113. ISSN: 1369-703X. ALCAZAR-FUOLI, L., MELLADO, E., GARCIA-EFFRON, G., LOPEZ, J. F., GRIMALT, J. O., CUENCA-ESTRELLA, J. M., RODRIGUEZ-TUDELA, J. L. Ergosterol biosynthesis pathway in Aspergillus fumigatus. Steroids, 2008, vol. 73, p. 339-343. ISSN: 0039128X. ARAI, M., LEE, T. H., MURAO, S. Substrate specifity of the Penicillium lilacinum enzyme lytic to the cell wall of Rhodotorula glutinis and the structure of the Rhodotorula cell wall glucomannan. Curr. Microbiol., 1978, vol. 1, p. 185-188. ISSN: 0343-8651. ARORA, A., RAGHURAMAN, H., CHATTOPADHYAY, A. Influence of cholesterol and ergosterol on membrane dynamics: a fluorescence approach. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, vol. 318, p. 920-926. ISSN: 0006-291X. AVERY, S. N., STRATFORD, M., VAN WEST, P. (ed.). Stress in yeasts and filamentous fungi. 1st ed. 2008. ISBN 978-0-12-374184-4. BALACHANDAR, D., VENDAN, R. T. Introductory microbiology. 2007. ISBN 978-81-8942278-3. BALACHANDAR, D., VENDAN, R. T. Introductory microbiology. 2007. ISBN 978-81-89422-78-3. BARON, J. A., et al.:Carotenoids (IARC handbooks of cancer prevention; 2): International Agency for Research on Cancer World Health Organization. Edited by 1998. ISBN 92832-3002-7. BENGTSSON, O., HAHN-HÄGERDAL, B., GORWA-GRAUSLUND, M. F. Xylose reductase from Pichia stipitis with altered coenzyme preference improves ethanolic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae. Bitechnology of Biofuels, 2009, vol. 2, no. 9. BETTIGA, M., HAHN-HÄGERDAL, B., GORWA-GRAUSLUND, M. F. Comparing the xylose reductase/xylitol dehydrogenase and xylose isomerase pathways in arabinose and xylose fermenting Saccharomyces cerevisiae strains. Bitechnology of Biofuels, 2008, vol. 1, no. 16. BHATTACHARYA, M., FUHRMAN, L., INGRAM, A., NICKERSN, K. W., CONWAY, T. Single-run separation and detection of multiple metabolic intermediates by anion-exchange high-performance liquid chromatography and application to cell pool extracts prepared from Escherichia coli. Anal. Biochem., 1995, vol. 232, p. 98-106. ISSN: 1995-9954. BHOSALE, P., GADRE, R. V. BBETA-carotene production in sugarcane molasses by a Rhodotorula glutinis mutant. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2001, vol. 26, p. 327-332. ISSN: 1365-2672. (

145

)

BÍLKOVÁ, K., KRÁLOVÁ, B. Izolace biomakromolekul. 1st ed. Praha: Vysoká ‰kola chemicko-technologická,Fakulta potravináfiské a biochemické technologie, 1997. BRITTON, G. Carotenoids, Spectroscopy. Vol. 1B. Basel: Birkhäuser Verlag, 1995. UV/Visible spectroscopy, p. 13-62. ISBN 3-764-32909-2. BRITTON, G., LIAAEN-JENSEN, S., PFANDER, H. (ed.). Carotenoids Volume 3: Biosynthesis and Metabolism. 1998. ISBN 3-764-35829-7. BRITTON, G., LIAAEN-JENSEN, S., PFANDER, H. (ed.). Carotenoids Volume 4: Natural Function. 2008. ISBN 3-7643-7498-3. BURMEISTER, M., ULANOVSKY, L. (ed.). Pulsed-field gel electrophoresis: protocols, methods and theories. 1992. ISBN 0-89603-229-9. BUZZINI, P. An optimization study of carotenoid production by Rhodotorula glutinis DBVPG 3853 from substrates containing concentrated rectified grape must as the sole carbohydrate source. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2000, vol. 24, p. 41-45. ISSN: 1367-5435. BUZZINI, P. Batch and fed-batch carotenoid production by Rhodotorula glutinis-Debaryomyces castellii co-cultures in corn syrup. Journal of Applied Microbiology, 2001, vol. 90, p. 843-847. ISSN: 1365-2672. BUZZINI, P., MARTIN, A. Production of carotenoids by strains of Rhodotorula glutinis cultured in raw materials of agro-industrial origin. Bioresour. Technol., 1999, vol. 71, no. 1, p. 41-44. ISSN: 0960-8524. BUZZINI, P., MARTINI, A., GAETANI, M., TURCHETTI, B., PAGNONI, U. M., DAVOLI, P. Optimization of carotenoid production by Rhodotorula graminis DBVPG 7021 as a function of trace element concentration by means of response surface analysis. Enzyme Microb. Technol., 2005, vol. 36, p. 687-692. surface analysis. Enzyme Microb. Technol., 2005, vol. 36, p. 687-692. CARERI, M., ELVIRI, L., MANGIA, A. Liquid chromatography-electrospray mass spectrometry of BBETA-carotene and xanthophylls: Validation of the analytical method. J. Chromatogr., A, 1999, vol. 854, p. 233-244. ISSN: 0021-9673. CASTRILLO, J. I., HAYES, A., MOHAMMED, S., GASKELL, S. J., OLIVER, S. G. An optimized protocol for metabolome analysis in yeast using direct infusion electrospray mass spectrometry. Phytochemistry, 2003, vol. 62, no. 6, p. 929-937. ISSN: 0031-9422. CIFUENTES, V. a kol. Genetics and electrophoretic karyotyping of wild-type and astaxanthin mutant strains of Phaffia rhodozyma. Antonie van Leeuwenhoek, 1997, vol. 72, p. 111117. ISSN: 0003-6072. CRUZ, J. M., PARAJO, J. C. Improved astaxanthin production by Xanthophyllomyces dendrorhous growing on enzymatic wood hydrolysates containing glucose and cellobiose. Food Chem., 1998, vol. 63, p. 479-484. ISSN: 0308-8146. âARNECKÁ, M. Název: Diplomová práce. Brno: VUT, Fakulta chemická, 2006. âARNECKÁ, M. Molecular study of intracellular changes as response of microorganisms to environment: Dizertaãní práce. Brno: VUT, Fakulta chemická, 2009.

(

146

)

âERTÍK, M., MÁROVÁ, I., HANUSOVÁ, V., RAPTA, P., BREIEROVÁ, E. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2009. 25, Biotechnological Production and Properties of Carotenoid Pigments, p. 355-375. ISBN: 978-1-4200-7703-2. DEAK, T. a kol. Molecular characterization of Yarrowia lipolitica and Candida zeylanoides isolated from Poultry. Appl. Environ Microbiol, 2000, vol. 66, no. 10, p. 4340-4344. ISSN: 0099-2240. DEMASI, A. P. D., PEREIRA, G. A. G., NETTO, L. E. S. Yeast oxidative stress response: Influences of cytosolic thioredoxin peroxidase I and of the mitochondrial functional state. FEBS Journal, 2006, vol. 273, p. 805-816. ISSN:1742-4658. DAVOLI, P., MIERAU, V., WEBER, R. W. S. Carotenoids and Fatty Acids in Red Yeasts Sporobolomyces roseus and Rhodotorula glutinis. Applied Biochemistry and Microbiology, 2004, vol. 40, no. 4, p. 392-397. ISSN:0003-6838. DAVOLI, P., WEBER, R. W. S. Carotenoid pigments from the red mirror yeast, Sporobolomyces roseus. Mycologist, 2002, vol. 16, no. 3, p. 102-108. ISSN:0269-915X. DE HOOG, G. S., GUARRO, J., GENE, J., FIGUERAS, M. J. Atlas of Clinical Fungi. 2nd ed. 2001. ISBN 9-070-35143-9. DE WINDE, J. H. (ed.). Functional genetics of industrial yeasts. 2003. ISBN 3-540-02489-1. DUFOSSÉ, L. Microbial Production of Food Grade Pigments. Food Technol. Biotechnol, 2006, vol. 44, no. 3, p. 313-321. ISSN:1330-9862. DVO¤ÁKOVÁ, T. Sledování metabolick˘ch zmûn karotenogenních kvasinek v závislosti na podmínkách kultivace: Diplomová práce. Brno: VUT, Fakulta chemická, 2008. EISENKOLB, M., ZENZMAIER, Ch., LEITNER, E., SCHNEITER, R. A Specific Structural Requirement for Ergosterol in Long-chain Fatty Acid Synthesis Mutants Important for Maintaining Raft Domains in Yeast. Mol. Biol. Cell, 2002, vol. 13, no. 12, p. 4414-4428. ISSN:0202-0116. Enzymatic method, 2004. Choosing The Best Cell Disruption Method for Research and Pharmaceutical Production. http://www.mixerequipment.com/f_mic/cell_disruption/cell_disrupti on.html#enzymaticanchor (accessed July 11, 6). EVANS, I. H. Yeast protocols: Methods in cell and molecular biology. 1996. ISBN 0-89603319-8. FELDMANN, H. Yeast: Molecular and cell biology. 2010. ISBN 978-3-527-32609-9. FELL, J. W., BOEKHOUT, T., FONSECA, A., SCORZETTI, G., STATZELL-TALLMAN, A. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, vol. 50, p. 1351-1371. ISSN: 1084-3082. FELL, W. J., ROEIJMANS, H., BOEKHOUT, T. Cystofilobasidiales, a new order of basidiomycetous yeasts. Int. J. Syst. Bacteriol., 1999, vol. 49, no. 3, p. 907-913. ISSN 0020-7713

(

147

)

FONTANA, J. D., CZECZUGA, B., BONFIM, T. M. B., CHOCIAI, M. B., OLIVEIRA, B. H., GUIMARAES, M. F., BARON, M. Bioproduction of carotenoids:next term: The comparative use of raw sugarcane juice and depolymerized bagasse by Phaffia rhodozyma. Bioresour. Technol., 1996, vol. 58, no. 2, p. 121-125. ISSN: 0960-8524. FRENGOVA, G. I., BESHKOVA, D. M. Carotenoids from Rhodotorula and Phaffia: yeasts of biotechnological importance. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2009, vol. 36, no. 2, p. 163-180. ISSN: 1898-2370. FRENGOVA, G., SIMOVA, E., BESHKOVA, D. Use of whey ultraWltrate as a substrate for production of carotenoids by the yeast Rhodotorula rubra. Appl. Biochem. Biotechnol., 2004, vol. 112, p. 133-141. ISSN: 0273-2289. FRENGOVA, G., SIMOVA, E., PAVLOVA, K., BESHKOVA, D., GRIGOROVA, D. Formation of carotenoids by Rhodotorula glutinis in whey ultrafiltrate. Biotechnol. Bioeng., 1994, vol. 44, p. 888-894. ISSN: 0006-3592. FRIEDBERG, E. C., WALKER, G. C., SIEDE, W. (ed.). DNA repair and mutagenesis. 1995. ISBN 1-55581-088-8. GASH, A. P., WERNER-WASHBURNE, M. The genomics of yeast responses to environmental stress and starvation. Functional & Integrative Genomics, 2002, vol. 2, no. 4-5, p. 181192. ISSN: 1438-793X. GESSNER, M. O., CHAUVET, E. Ergosterol-to-Biomass Conversion Factors for Aquatic Hyphomycetes. Appl. Environ. Microbiol., 1993, vol. 59, no. 2, p. 502-507. ISSN: 1098-5336. Goineau, S.: Yeasts services; PFGE (CHEF), 2010. Siebel Institute Yeast & Microbiology Services. http://www.siebelinstitute.com/services/yeast.html (accessed Sept 30, 2010). HALIENOVÁ, A., MÁROVÁ, I., âARNECKÁ, M., KONEâNÁ, H., HANUSOVÁ, V., HEZINOVÁ, V. Proteome and metabolome changes in red yeasts grown under exogenous stress. J. Biotechnol., 2007, vol. 131, no. 1, p. s202-s202. ISSN: 0168-1656. HARTL, D. L., JONES, E. W. (ed.). Genetics: analysis of genes and genomes. 7th ed. 2009. ISBN 978-0-7637-5868-4. HAYMAN, G. T., MANNARELI, B. M., LEATHERS, T. Production of carotenoids by Phaffia rhodozyma grown on media composed of corn wet-milling co-products. J. Ind. Microbiol., 1995, vol. 14, p. 389-395. ISSN: 0169-4146. HÄUSSINGER, D., SIES, H. (ed.). Methods in ENZYMOLOGY: Volume 428/Osmosensing and osmosignaling. California: Academic Press, 2007. ISBN 978-0-12-373921-6. HERNÁNDEZ-SAAVEDRA, N. Y., OCHOA, J. L., VAZQUEZ- DULHALT, R. Osmotic adjustment in marine yeast. J. Plamkton Res., 1995, vol. 17, no. 1, p. 59-69. HIRSCHBERG, J. Production of high-value compounds: carotenoids and vitamin E. Current Opinion in Biotechnology, 1999, vol. 10, no. 2, p. 186-191. ISSN 0958-1669. HIRSCHBERG, J., COHEN, M., HARKER, M., LOTAN, T., MANN, V., PECKER, I. Molecular genetics of the carotenoid biosynthesis pathway in plants and algae. Pure Appl. Chem., 1997, vol. 69, no. 10, p. 2151-2158. ISSN: 6910-2151.

(

148

)

HOHMANN, S. Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, vol. 66, no. 2, p. 300-372. ISSN: 1098-5557. HOHMAN, S., MAGER, W. H. (ed.). Yeast stress responses. Springer, 2003. ISBN 3-540-439269. CHADWICK, D., WHELAN, J. (ed.). Secondary metabolites: Their function and evolution. 1992. ISBN 0-471-93447-X. IWAKI, T., et al. Multiple functions of ergosterol in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Gen. Microbiol., 2008, vol. 154, no. 3, p. 830-841. ISSN: 1350-0872. JAMIESON, D. J. Oxidative stress responses of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 1998, vol. 14, no. 16, p. 1511-1527. ISSN: 1097-0061. JIRASRIPONGPUN, K., PEWLONG, W., KITRAKSA, P., KRUDNGERN, C. Carotenoid production by Xanthophyllomyces dendrorhous: use of pineapple juice as a production medium. Lett. Appl. Microbiol., 2008, vol. 47, p. 112-116. ISSN: 0266-8254. JOHNSON, E. A., AN, G. H. Astaxanthin from microbial sources. Crit. Rev. Biotechnol., 1991, vol. 11, p. 297-326. ISSN: 0904-0622. JOHNSON, E. A., SCHROEDER, W. A. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Vol. 53. Berlin, Germany: Springer-Verlag, 1996. Microbial carotenoids, p. 119-178. ISSN: 0724-6145. KAISER, P., SURMANN, P., VALLENTIN, G., FUHRMANN, H. A small-scale method for quantitation of carotenoids in bacteria and yeasts. J. Microbiol. Methods, 2007, vol. 70, p. 142-149. ISSN: 0167-7012. KAUL, W., ROSSOW, U., EMEIS, C. Screening for microorganisms with cell wall lytic activity to produce protoplast-forming enzymes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, vol. 39, p. 574-576. ISSN: 0020-5054. KESAVA, S. S., AN, G. H., KIM, C. H., RHEE, S. K., CHOI, E. S. An industrial medium for improved production of carotenoids from a mutant strain of Phaffia rhodozyma. Bioprocess Biosyst. Eng., 1998, vol. 19, p. 165-170. ISSN: 0178-515x. KLIPP, E., NORDLANDER, B., KRÜGER, R., GENNEMARK, P., HOHMANN, S. Integrative model of the response of yeast to osmotic shock. Nature biotechnology, 2005, vol. 23, no. 8, p. 975-982. ISSN: 1087-0156. KIRSOP, B. E., KURTZMAN, C. P. (ed.). Yeasts - (Living resources for biotechnology). Cambridge University press, 1988. ISBN 0-521-35227-4. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, A. Yeasts and yeast-like Organisms. VCH Verlagsgesellschaft mbH Weinheim, 1990. ISBN 3-527-26162-1. KUMAR, A., AWASTHI, A. Bioseparation engineering. 2009. ISBN 978-93-80026-08-4. KURTZMAN, C. P., FELL, J. W. (ed.). The yeasts: a taxonomic study. Elsevier Science B. V., 1998. ISBN 0-444-81312-8.

(

149

)

KUSDIYANTINI, E., GAUDIN, P., GOMA, G., BLANC, P. J. Growth kinetics and astaxanthin production of Phaffia rhodozyma on glycerol as a carbon source during batch fermentation. Biotechnol. Lett., 1998, vol. 20, p. 929-934. LATHA, B. V., JEEVARATNAM, H., MURALI, S., MANJA, K. S. Influence of growth factors on carotenoid pigmentation of Rhodotorula glutinis DFR-PDY from natural source. Indian Journal of Biotechnology, 2005, vol. 4, p. 353-357. ISSN:0972-5849. Leland, S. J. Massive carotenoid accumulation in Dunaliella bardawil induced by ultraviolet-A radiation. J. Photochem. Photobiol., B 1999, 48 (1), 68-74. ISSN: 1011-1344. LEPOCK, J. R., BITTAR, E. E., WILLIS, J. S.: Protein Denaturation During Heat Shock. Advances in Molecular and Cell Biology, 1997, vol. 19, p. 223-259. ISBN 0-7623-0142-2. LIBKIND, D., GADANHO, M., VAN BROOCK, M., SAMPAIO, J. P. Studies on the heterogeneity of the carotenogenic yeast Rhodotorula mucilaginosa from Patagonia, Argentina. natural source. J. Basic Microbiol., 2008, vol. 48, no. 2, p. 93-98. ISSN: 0233-111X. LIBKIND, D., VAN BROOK, M. Biomass and carotenoid pigment production by Patagonian native yeasts. World J. Microbiol. Biotechnol., 2006, vol. 22, p. 687-692. ISSN: 09593993. LOEFFLER, J., et al. Rapid Detection of Point Mutations by Fluorescence Resonance Energy Transfer and Probe Melting Curves in Candida Species. Clin. Chem., 2000, vol. 46, p. 631635. ISSN: 0066-4804. LONGO, F., SIERO, C., VELAZQUEZ, J. B., CALO, P., CANSADO, J., VILLA, T. G. Astaxanthin production from Phaffia rhodozyma. Biotechnol. Forum Eur., 1992, vol. 9, p. 565567. MALISORN, C., SUNTORNSUK, W. Optimization of BBETA-carotene production by Rhodotorula glutinis DM28 in fermented radish brine. Bioresour. Technol., 2008, vol. 99, no. 7, p. 2281-2287. ISSN: 0960-8524. MANN, J. Secondary metabolism. 2nd ed. 2005. ISBN 0-19-855529-6. MANTZOURIDOU, F., TSIMIDOU, M. Z., ROUKAS, T. Performance of Crude Olive Pomace Oil and Soybean Oil during Carotenoid Production by Blakeslea trispora in Submerged Fermentation. J. Agric. Food Chem., 2006, vol. 54, p. 2575-2581. ISSN: 0021-8561. Márová I., âarnecká M., Halienová A., Koãí R., Breierov E.: Production of carotenoid/ergosterol-supplemented biomass by red yeast Rhodotorula glutinis grown under external stress. Food Technology and Biotechnology, 48(1), 2010, p.56-61. ISSN 1330-9862 . Márová I., âarnecká M., Halienová A., Dvofiáková T., Hroniková A.: Use of several waste substrates for carotenoid-rich yeast biomass production. Journal of Environmental Management. Accepted 8.6.2011, DOI 10.1016/j.jenvman.2011.06.018. MARTIN, A. M., ACHEAMPONG, E., PATEL, T. R., CHORNET, E. Study of growth parameters for Phaffia rhodozyma cultivated in peat hydrolysates. Appl. Biochem. Biotechnol., 1992, vol. 37, p. 235-241. ISSN: 1559-0291. McKINNEY, R. E. Environmental pollution control microbiology. 2005. ISBN 0-203-02569-5.

(

150

)

METZLER, D. E., METZLER, C. M. (ed.). Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells. 2nd ed. 2003. ISBN: 0-12-492541-3. MEYER, P. S., DU PREEZ, J. C. Astaxanthin production by a Phaffia rhodozyma mutant on grape juice. World J. Microbiol. Biotechnol., 1994, vol. 10, p. 178-183. ISSN: 1573-0972. Microfluidics, 2004. Choosing The Best Cell Disruption Method for Research and Pharmaceutical Production. http://www.mixerequipment.com/f_mic/cell_disruption/cell_disrupti on.html#enzymaticanchor (accessed July 11, 6). MIDDELBERG, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol. Adv., 1995, vol. 13, no. 3, p. 491-551. ISSN: 0734-9750. Moliné, M.; Libkind, D.; Diéguez, M. C.; Brook van, M. Photoprotective role of carotenoids in yeasts: Response to UV-B of pigmented and naturally-occurring albino strains. J. Photochem. Photobiol., B 2009, 95 (3), 156-161. ISSN: 1011-1344. MOORE, M. M., BREEDVELD, M. W., AUTOR, A. P. The role of carotenoids in preventing oxidative damage in the pigmented yeast, Rhodotorula mucilaginosa. Arch. Biochem. Biophys., 1989, vol. 270, no. 2, p. 419-431. ISSN: 0003-9861. MORIEL, D. G., CHOCIAI, M. B., MACHADO, I. M. P., FONTANA, J. D., BONFIM, T. M. B. Effect of feeding methods on the astaxanthin production by Phaffia rhofozyma in fedbatch process. Braz. Arch. Biol. Technol., 2005, vol. 48, p. 397-401. ISSN: 1516-8913. NI, H., CHEN, Q., RUAN, H., YANG, Y., LI, L., WU, G., HU, Y., HE, G. Studies on optimalization of nitrogen sources for astaxantin production by Phaffia rhodozyma. J. Zhejiang Univ. Sci. B., 2007, vol. 8, p. 365-370. ISSN: 1862-1783. OKAGBUE, R. N., LEWIS, M. J. Mixed culture of Bacillus circulans WL-12 and Phaffia rhodozyma on different carbon sources: Yeast-wall lytic enzyme production and extractability of astaxanthin. Biotechnol. Lett., 1983, vol. 5, no. 11, p. 731-736. ISSN: 1573-6776. PARAJO, J. C., SANTOS, V., VAZGUEZ, M. Optimization of carotenoid production by Phaffia rhodozyma cells grown on xylose. Process Biochem., 1998, vol. 33, no. 2, p. 181-187. ISSN: 1359-5113. PARAJO, J. C., SANTOS, V., VAZGUEZ, M. Production of carotenoids by Phaffia rhodozyma growing on media made from hemicellulosic hydrolysates of eukalyptus globulus wood. Biotechnol. Bioeng., 1998a, vol. 59, p. 501-506. ISSN: 1097-0290. PARAJO, J. C., SANTOS, V., VAZQUEZ, M., CRUZ, J. M. Production of carotenoidsnext term by Xanthophyllomyces dendrorhous growing on enzymatic hydrolysates of prehydrolysed wood. Food Chem., 1997, vol. 60, no. 3, p. 347-355. ISSN: 0308-8146. PANESAR, P. S., MARWAHA, S. S., CHOPRA, H. K. (ed.). Enzymes in food processing: Fundamental and potential applications. 2010. ISBN 978-93-80026-33-6. PERRIER, V., DEBREUCQ, E., GALZY, P. Fatty acid and carotenoid composition of Rhodotorula strains. Arch. Mikrobiol., 1995, vol. 164, p. 173-179. ISSN: 0302-8933. PETRIK, S., HÁRONÍKOVÁ, A., DVO¤ÁKOVÁ, T., MÁROVÁ, I. Analysis of carotenoids producted by several red yeast strains using different types of waste substrates. Chemické Listy, 2010, vol. 104, p. 576. ISSN: 1213-7103. (

151

)

PIPER, P. Yeast protocols: Methods in molecular biology. 1996. 53, Isolation of yeast DNA, p. 103-107. ISBN: 0-89603-319-8. PIPER, P. W.: Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev., 1993, vol. 11, no. 4, p. 339-355. ISSN: 0168-6445. POLULYAKH, O. V., PODOPRIGOVA, O. I., ELISEEV, S. A., ERSHOV, Y. V., BYKHOVSKY, V. Y., DMITROVSKI, A. A. Biosynthesis of torulene and torularhodin in the yeast Phaffia rhodozyma. Prikl. Biokhim. Mikrobiol., 1991, vol. 27, p. 541-545. POMMERVILLE, J. C. Alcamo’s fundamentals of microbiology. 9th ed. 2011. ISBN 978-07637-6258-2. POSAS, F., CHAMBERS, J. R., HEYMAN, J. A., HOEFFLER, J. P., DE NADAL, E., ARINO, J. The transcriptional response of yeast to saline stress. The Journal of Biological Chemistry, 2000, vol. 275, no. 23, p. 17249-17255. ISSN: 0021-9258. PRESCOTT, D. M. (ed.). Methods in cell biology. Volume XII: Yeast cells.. 1975. ISBN 0-12564112-5. RIBEIRO, G. F., CORTE-REAL M., JOHANSSON B. Characterization of DNA damage in yeast apoptosis induced by hydrogen peroxide, acetic acid and hyperosmotic shock. Molecular Biology of the Cell, 2006, vol. 17, no. 10, p. 4584-4591. ISSN: 1939-4586. ROSA, C. A., PÉTER, G. (ed.). Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts (The Yeasts Handbook). Springer, 2006. ISBN 3-540-26100-1. RUNQUIST, D., HAHN-HÄGERDAL, B., BETTIGA, M. Increased Ethanol Productivity in Xylose-Utilizing Saccharomyces cerevisiae via a Randomly Mutagenized Xylose Reductase. Appl. Environ. Microbiol., 2010, vol. 76, no. 23, p. 7796-7802. ISSN: 0099-2240. SAENGE, Ch., CHEIRSIP, B., SUKSAROGE, T. T., BOURTOOM, T. Potential use of oleaginousred yeast Rhodotorula glutinis for the bioconversion of crude glycerol from biodiesel plant to lipids and carotenoids. Process Biochem., 2010, vol. xxx, p. xxx-xxx. ISSN:1359-5113. SAKAKI, H., NAKANISHI, T., SATONAKA, K., MIKI, W., FUJITA, T., KOMEMUSHI, S. Properties of a High-Torularhodin-Producing Mutant of Rhodotorula glutinis Cultivated under Oxidative Stress. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000, vol. 89, no. 2, p. 203-205. ISSN: 1389-1723. SAMPAIO, J. P., GADANHO, M., BAUER, R. Taxonomic studies on the genus Cystofilobasidium: description of Cystofilobasidium ferigula sp. nov. and clarification of the status of Cystofilobasidium lari-marini. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2001, vol. 51, p. 221-229. ISSN: 1348-3412. SATYANARAYANA, G., KUNZE, G. Yeast biotechnology: Diversity and applications. 2009. ISBN 978-1-4020-8291-7. SENSEN, Ch. W. (ed.). Essential of genomics and bioinformatics. 2002. ISBN 3-527-30541-6.

(

152

)

SEREIH, N. A. A., et al. Genetic and biochemical characterization of some food-borne properties of Saccharomyces ceregvisiae modified strains. International Journal of Academic Research, 2011, vol. 3, no. 1, p. 533-540. ISSN: 2075-4124. SCHAECHTER, M., LEDERBERG, J. (ed.). The desk encyclopedia of microbiology. Elsevier Academic Press, 2004. ISBN 0-12-621361-5. SCHMIDT-DANNERT, C. Engineering novel carotenoids in microorganisms. Current Opinion in Biotechnology, 2000, vol. 11, p. 255-261. ISSN: 0958-1669. SCHROEDER, W. A., JOHNSON, E. A. Antioxidant role of carotenoids in Phaffia Rhodozyma. J. Gen. Microbiol., 1993, vol. 139, p. 907-912. ISSN: 0022-1287. SIMOVA, E. D., FRENGOVA, G. I., BESHKOVA, D. M. Synthesis of carotenoids by Rhodotorula rubra GED8 co-cultivated with yogurt starter cultures in whey ultrafiltrate. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2004, vol. 31, p. 115-121. ISSN: 1367-5435. SLONCZEWSKI, J. L. Encyclopedia of Microbiology. Oxford: Academic Press, 2009. Physiology, Stress responses: pH, p. 477-484. ISBN: 0-12-621361-5. SMITH, C. L., CONDEMINE, G. New approaches for physical mapping of small genomes. J. Bacteriol., 1990, vol. 172, no. 3, p. 1167-1172. ISSN: 0021-9193. SONI, S. K. (ed.). Microbes: A source of energy for 21st century. 2007. ISBN 81-89422-14-6. SPENCER, J. F. T., SPENCER, D. M. (ed.). Yeasts in natural and artificial habitats. 1997. ISBN 3-540-56820-4. SUN, N., LEE, S., SONG, K. B. Characterization of a carotenoid-hyperproducing yeast mutant isolated by low-dose gamma irradiation. Process Biochem., 2004, vol. 94, p. 263-267. ISSN: 0168-1605. SUWANTO, A. Pulsed-field gel electrophoresis: A revolution in microbial genetics. Asia Pacific Journal of Molecular biology and biotechnology, 1994, vol. 2, no. 2, p. 78-85. ISSN: 0128-7451. TALARO, K. P. Foundations in Microbiology: Basic Principles. 6.th ed. 2007. ISBN 10-007126232-3. TINOI, J., RAKARIYATHAM, N., DEMING, R. L. Simplex optimization of karotenoid production by Rhodotorula glutinis using hydrolyzed mung bean waste flour as substrate. Process Biochemistry, 2005, vol. 40, no. 7, p. 2551-2557. ISSN: 0032-9592. TINOI, J., RAKARIYATHAM, N., DEMING, R. L. Utilization of mustard waste isolated for improved production of astaxanthin by Xanthophyllomyces dendrohous. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2006, vol. 33, p. 309-314. ISSN: 1367-5435. TROTT, A., MORANO, K. A. The yeast response to heat shock. Topics in Current Genetics, 2003, vol. 1, p. 71-119. ISSN: 1610-2096. UPADHYAYA, N. M. (ed.). Rice functional genomics: Challenges, progres and prospects. 2007. ISBN 978-0-387-48903-2. VAN BREEMEN, R. B. Electrospray Liquid Chromatography-Mass Spectrometry of Carotenoids. Anal. Chem., 1995, vol. 67, no. 13, p. 2004-2009. ISSN: 0003-2700. (

153

)

VAZQUEZ, M., MARTIN, A. M. Mathematical model for Phaffia rhodozyma growth using peat hydrolysates as substrate. J. Sci. Food Agric., 1998, vol. 76, p. 481-487. ISSN: 1097-0010. VENKATESWARAN, G. Lipid modification in Rhodotorula Gracilis: biochemical and genetic studies: Teze. Indie: University of Mysore, 1997. VERDOES, J. C., SANDMANN, G., VISSER, H., DIAZ, M., VAN MOSSEL, M., VAN OOYEN, A. J. J. Metabolic Engineering of the Carotenoid Biosynthetic Pathway in the Yeast Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). Appl. Environ. Microbiol., 2003, vol. 69, no. 7, p. 3728-3738. ISSN: 0099-2240. VRANÁ, D. (ed.). Kvasinky ve v˘zkumu a praxi. 1.st ed. Praha: Academia, 1986. ISBN 21-02386. WALKER, G. M., Yeasts physiology and biotechnology. Wiley J. & Sons Ltd., 1998. ISBN 0471- 96447-6. WANG, S. L., ZHANG, X., ZHANG, H., LIN, K. Effects of some additives on the growth and carotenoids content of Rhodotorula. Food Sci. Technol., 2001, vol. 2, p. 20-21. ISSN: 1005-9989. XIAO, W. Yeast protocols. 2006. ISBN 1-59259-958-3.

(

154

)

Seznam pouÏit˘ch zkratek a symbolÛ A

adenin

C

cytosin nebo uhlík

C40

40 atomÛ uhlíku

CDW

hmotnost bunûk v suchém stavu

DGGE

denaturaãní gelová gradientová elektroforéza

DMADP

dimethylallyl difosfát

DNA

deoxyribonukleová kyselina

E1

enzymatick˘ extrakt z A. alternata

E2

enzymatick˘ extrakt z F. solani

E3

enzymatick˘ extrakt z A. pollulans

E4

enzymatick˘ extrakt z P. chrysosporium

EDTA

chelaton 3, kyselina ethylendiamintetraoctová

EMS

ethylester kyseliny methansulfonové

ER

endoplazmatické retikulum

G

guanin

GC-MS

plynová chromatografie s hmotnostní detekcí

GGDP

geranylgeranyl difosfát

HMG-CoA

3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA

HPLC

vysokoúãinná kapalinová chromatografie

IDP

isopentenyl difosfát

INO I

inokulaãní médium 1

INO II

inokulaãní médium 2

K

kontrola, kontrolní kultivace

kb

kilopáry bází

kH

kiloHerz

Ki

inhibiãní konstanta enzymatické reakce

Km

Michaelsova konstanta enzymatické reakce

KOH

hydroxid draseln˘

LB

Luria Bertani médium

LiOAc

octan lithn˘

LET

pufr o sloÏení EDTA, TRIS a BBETA-merkaptoethanol

Mb

megapáry bází (

155

)

MMS

methylester kyseliny methansulfonové

MNNG

N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanin

MS

hmotnostní spektrometrie

N

dusík

NADH

nikotinamid adenin dinukleotid

NADPH

nikotinamid adenin dinukleotid fosfát

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NDS

pufr o sloÏení EDTA, TRIS a lauryl sarkosin

PCR

polymerázová fietûzová reakce

PDA

detekce pomocí fotodiodového pole

PFGE

pulzní gelová elektroforéza

PFGE-Chef

pulzní gelová elektroforéza s homogenním obrysovû upnut˘m elektrick˘m polem

PIPES

piperazin-1,2-bis[2-ethansulfonová kyselina]

Prod

produkãní médium

RNA

ribonukleová kyselina

ROS

reaktivní formy kyslíku

RTG

rentgenovo záfiení

SDS

dodecylsulfát sodn˘

T

thimin

TBE

pufr o sloÏení TRIS, kyselina boritá a EDTA

TE/LiOAc

pufr o sloÏení TRIS a LiOAc

TRA

triethanolamin

TRIS

Tris(hydroxymetyl)aminometan

UV/VIS

ultrafialová a viditelná oblast spektra

Vmax

maximální rychlost enzymové reakce

YNB

„yeast nitrogen base“ médium

XR

xylózareduktáza

(

156

)