Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala 0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mM), 1 ml enzymového preparátu (konc. bílkovin 1,5 mg/ml) a 2 ml pufru (100 mM Tris, pH 7,5). Reakce probíhala při teplotě 37 °C a byl sledován přírůstek absorbance při 340 nm. Po 5 minutách vzrostla absorbance z 0,2 na 1,45. Vypočítejte celkovou a specifickou aktivitu malátdehydrogenasy v enzymovém preparátu. (ε=6220 l/mol/ cm). Měření absorbance probíhalo v jednocentimetrové kyvetě a všechny substráty byly v reakční směsi v nadbytku.
Sledování průběhu separace Metoda
Koncentrace bílkovin [mg/ml]
Objem
Celková aktivita [U]
buněčný extrakt
258,1
20
4000
(NH4)2SO4
118,1
9
4053
HIC
57,5
6
3565
GPC
19,3
2
2565
[ml]
Metoda
Koncentrace bílkovin [mg/ml]
Objem [ml]
Celková aktivita [U]
buněčný extrakt
258,1
20
4000
(NH4)2SO4
118,1
HIC GPC
Specifická aktivita [U/mg]
Stupeň přečištění
[%] -
0,77
57,5 19,3
9 6 2
Výtěžek
100
4053 3,81
4,9
101
10,33
13,3
89
66,45
85,8
64
3565 2565
Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mM maltosy a 0,5 ml 50 mM Tris pufru pH 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 °C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na2CO3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 °C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm3.cm-1.mol-1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?
Afinitní chromatografie
Princip afinitní chromatografie 1. afinitní chromatografie protein
afinitní ligand
+ Matrix
Spacer arm
2. Imunoafinitní chromatografie Proteinový epitop
ligand protilátka
+ Matrix
Spacer arm
Příklady afinitních interakcí enzym
analog substrátu, inhibitor, kofaktor
protilátka
antigen,virus, buňka
lektin
polysacharid, glykoprotein, buněčný povrch, receptor
nukleová kys.
komplementární sekvence, histony, DNA/RNA polymerasy, DNA/RNA vázající proteiny
hormon, vitamin
receptor, přenašeče
Stacionární fáze •nejčastěji agarosa (Sepharosa) •ligand kovalentně navázaný přes –OH skupinu cukerné jednotky nosiče •velké póry umožňující průnik velkých molekul •co nejnižší nespecifické adsorbce •ligandy: •specifické •reversibilní vazba •schopnost navázat na nosič bez ovlivnění vazby •vazba na protein nesmí být ani slabá ani silná
Ligand x raménko •ligand Mr<1000 – raménko
•krátké raménko – látka se na ligand špatně váže
•dlouhé raménko – možná nespecifická vazba – snížení selektivity
•velká hustota ligandů - sterická nepřístupnost přebytečných ligandů
Vhodné vazebné a eluční podmínky ideální podmínky
vazba mezi ligandem a purifikovanou molekulou
KD =
[L].[P] [LP]
vazba KD 10-6 - 10-4 M eluce KD 10-1 - 10-2 M
KD > 10-4 ~ slabá interakce
KD < 10-6 ~ silná interakce
obtížná eluce
Možnosti eluce Metoda 1 změna pH nebo iontové síly Metoda 2 Extremní pH nebo vysoká koncentrace močoviny nebo guanidin hydrochloridu Metoda 3 a 4 přídavek kompetičního činidla
Gradientová x skoková eluce
pomalá vazba
pomalá desorpce
Typy afinitních ligandů Ligandy používané pro mono-specifickou afinitní chromatografii
Látky používané pro připojování ligandů aktivátor N-hydroxysukcinimid (NHS) CNBr Karbodiimid Epoxid …
skupina ligandu -NH2 -NH2 -NH2, -COOH -SH, -NH2, -OH
N-hydroxysukcinimid (NHS-Sepharosa)
> 30 mg / 1 ml nosiče
•připojení přes amino skupinu (často protilátka nebo antigen) •první výběr při přípravě imunospecifického média
CNBr (CNBr aktivovaná Sepharosa) •alternativa k NHS aktivované Sepharose •vazba přes primární aminoskupinu nebo přes jinou nukleofilní skupinu •vhodná pro větší ligandy •proteiny, peptidy, aminokyseliny, nukleové kyseliny
N, N'-disubstituovaný karbondiimid EAH Sepharosa + ligand-COOH
ECH Sepharosa + ligand-NH2
•malé ligandy
Epoxid (Epoxy-aktivovaná Sepharosa 6B)
•ligandy obsahující –OH, -NH2, -SH •malé ligandy – cholin, ethanolamin a cukry
Aktivovaná thiolová skupina 1– 2 tvorba disulfidů (reversbilní-DTT) 3– kovalentní chromatografie 4– reakce s těžkými kovy a jejich deriváty např. p-chloromercuribenzoate → mraptidy 5- reakce s alkylovými nebo arylovými halogenidy → thioleterové deriváty 6- reakce s látkami obsahujícími C=O, C=C a N=N
Ligandy používané pro skupinově-specifickou afinitní chromatografii skupinově specifický ligand
specifita
Protein A
Fc region IgG
Protein G
Fc region IgG
Lektiny
glukopyranosylové a mannopyranosylové skupiny
Cibacron Blue
široká skupina enzymů, NAD+ dependentní enzymy, sérový albumin
Procion Red
NADP+
Lysin
plasminogen, rRNA
Arginin
serinové proteasy
Benzamidin
serinové proteasy
Kalmodulin
proteiny regulované kalmodulinem
Heparin
kolagulační faktory, lipoproteiny, lipasy, hormony, steroidní receptory, nukleové kyseliny vázající enzymy
Streptavidin
Biotin a biotinylované látky
Oligo (dT, dA, ...)
mRNA, nukleasy
Kovové ionty
proteiny a peptidy obsahující dostupný His
Protein A a Protein G protein A – Staphylococcus aureus protein G – Streptococcus purifikace: monoklonální protilátky IgG polyklonální protilátky IgG imunokomplexy
Heparin A hexuronová kyselina - D-glukuronová kyselina nebo L-iduronová kyselina (C-5 epimer) B D-glukosamin R1 = -H nebo -SO3 R2 = -SO3 nebo -COCH3.
• DNA vázající proteiny – iniciační a elongační faktory, restrikční endonukleasy, DNA ligasa, DNA and RNA polymerasa • inhibitory serinových proteas - antithrombin III • Enzymy – lipoprotein lipasy, koagulační enzymy, superoxid dismutasa • růstové faktory • extracelulární matrixové proteiny • hormonální receptory - androgenní receptory • Lipoproteiny
Streptavidin •streptavidin - molekula isolovaná z Streptomyces avidinii •biotinylované protilátky – purifikace antigenů
5‘-AMP-Sepharosa •ATP-dependentní kinasy
2'5‘-ADP-Sepharosa •NADP+-dependentní dehydrogenasy silně interagují s 2'5‘-ADP
Cibacron™ Blue F3G-A (Blue Sepharosa)
•Cibacron Blue F3G-A ~ „analog“ NAD+ ⇒ enzymy vyžadující kofaktory obsahující adenyl - kinasy, dehydrogenasy •vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)
Procion™ Red (Red Sepharosa)
•enzymy vyžadující kofaktor NADP+ •vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)
Konkavalin A •lektin z Canavalia ensiformis (jack bean) •tetramerní metalloprotein •větvené mannosidy, cukry s terminální mannosou nebo glukosou (αMan > αGlc > GlcNAc) • purifikace glykoproteinů, polysacharidů a glykolipidů • detekce změn ve složení látek obsahujících cukry • isolace povrchových buněčných glykoproteinů
„Lentil“ lektin •lektin z Lens culinaris (čočka) •větvené mannosidy obsahující fukosu α−1,6 vázanou na N-acetylglukosamin •membranové glykoproteiny, povrchové buněčné antigeny, virální glykoproteiny
Pšeničný lektin •ze semen Triticum vulgare (pšenice) •homodimerní neglykosylovaný protein •vazba - N-acetylglukosaminových zbytků, chitobiosového jádra N-oligosacharidů, N-acetylneuraminové kyseliny
Kalmodulin •vysoce konservovaný regulační protein eukaryotních buněk •účastní se mnoha buněčných procesů – metabolismus glykogenu, přenos nervových impulsů, regulace, kontrola poměru NAD+/NADP+ •purifikace kalmodulin vázajících proteinů - ATPasy, adenylát cyklasy, protein kinasy, fosfodiesterasy, neurotransmitery
Aktivovaný thiol
•Thiol-obsahující látky • ~ kovalentní chromatografie
Produkce rekombinantních proteinů proteiny vyrobené genovými modifikacemi, při nichž do genomu producenta (obvykle bakterie nebo kvasinky) byl uměle začleněn gen kódující požadovanou bílkovinu z jiného organismu kultivační podmínky bakteriální kmen expresní systém
produkce rozpustného proteinu nebo nerozpustný protein
M
B
cyt
IB
Rekombinantní fůzní proteiny fůzní kotva
imobilizovaný ligand
podmínky vazby
podmínky eluce
Glutathion Stransferasa GST
redukovaný glutathion
Neutrální pH, nedenaturující prostředí, glutathion musí být redukovaný a GST musí být aktivní
volný redukovaný glutathion
Histidinová kotva His-tag
Chelatovaný nikl nebo kobalt
Neutrální pH bez redukčních a oxidačních látek
>200 mM Imidazol, nízké pH, silné chelatační činidlo
Maltose Binding Protein MBP
Amylosa
Neutrální pH, nedenaturující prostředí; přídavek NaCl k snížení nespecifické sorbce
maltosa
Protein A
IgG
Neutrální pH, nedenaturující prostředí
změna pH, iontové síly
Green Fluorescent Protein GFP
Anti-GFP antibody
Neutrální pH, nedenaturující prostředí
nízké pH, iontová síla
GST fůzní protein
glutathion S-transferasa
glutathion
SDS elektroforesa
Pharmacia
Histidinová kotva R HN O N O HC C N 2+ NH H2 Ni O N HC C H2 N O NH
O H 2 C N CH CH2 O O O
stacionární fáze: •NiNTA Agarosa •His Bind •HiTrap Chelating
H N
OH O
NiNTA Agarosa
„In-fusion“ ligace
MBP (maltosu vázající protein)
GFP (zelený fluorescenční protein) HO
Tyr 66 Ser 65 HO
CH2
O
N H
O N H
NH
Gly 67
O O2 HO
N HO
N
O
N H O
Jak vysvětlit tvorbu inkluzních tělísek v bakteriích?
„overexprese“ proteinu
chaperon
příčiny: poměr protein : chaperon velké množství částečně sbaleného proteinu
„misfolded“ špatně sbalený
agregát
nativní protein
Inkluzní tělíska u eukaryot
Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000
Dva modely tvorby inkluzních tělísek
Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000
Výhody a nevýhody inkluzních tělísek (IB) výhody
nevýhody
Vysoká produkce
Obtížná renaturace, optimální postup nelze předpovědět
IB mohou být isolovány ve vysoké čistotě (40 - 90 %)
Produkce nemůže být sledována testováním aktivity
Proteiny v IB jsou chráněny před proteasami
Hlavní kontaminací jsou oligomery a špatně sbalené nebo štěpené formy proteinu, které je problém odstranit
Možnost produkce toxických proteinů
Izolace inklusních tělísek resuspendace buněčné pelety v pufru s inhibitorem proteas, DTT (5mM) a lysozymem přidat detergent (Triton X-100, DOC) + sonikace přidat DNasu I centrifugace 30 000 x g 30 min 4°C opláchnout peletu pufrem s detergentem rozpustit peletu (inkluzní tělíska) v pufru s 6M guanidin-HCl a 25 mM DTT centrifugace 100 000 x g 10 min – důležitý krok změřit koncentraci proteinů v supernatant
Solubilizace inkluzních tělísek pufr + denaturační činidlo - 4-6 M guanidin/HCl nebo 8M močovina (! při 4°C krystalizuje)
IB
supen.
peleta
buňky
Alternativa: alkalické pH, detergenty např. N-laurylsarkosin, SDS (0,3 - 5%)
Purifikace denaturovaných proteinů renaturace → purifikace za nativních podmínek purifikace za denaturujících podmínek → renaturace
kompatibilita denaturujících podmínek s chromatografiemi
Renaturace
hlavní parametry renaturace proteinů
renaturační pufr:
typ pufru redoxní systém u proteinů s disulfidovými můstky pH aditiva
podmínky:
teplota koncentrace proteinu koncentrace aditiva koncentrace redoxního činidla
renaturační techniky:
ředění dialysa/ultrafiltrace gelová chromatografie na koloně
neexistuje univerzální postup!!! Refolding database
Redoxní systém pro proteiny s disulfidovými můstky je potřeba optimální koncentrace oxidačního i redukčního činidla, pro umožnění vytvoření správných disulfidových vazeb • glutathion (GSH/GSSH) - 5-15 mol/l, molární poměr red : ox ~ od 1:1 do 10:1 •
cystein / cystin
•
cysteamin / cystamin
pH reakce > 9 (pKa Cys v denaturovaném proteinu je 8,7)
Typ a koncentrace aditiva
Renaturační kity
Renaturační techniky Renaturační technika
Výhody / nevýhody
Dialýza
Časová náročnost Velké objemy pufru
Ředění
Jednoduchá technika Záleží na rychlosti ředění Až stonásobně zředěný protein
Gelová chromatografie
Sepadace agregátů od renaturovaného proteinu Lze použít vysoké koncentrace proteinu Agregáty může být obtížné vymýt z kolony Pouze malý objem nanášeného vzorku
Renaturace na koloně
Jednoduché a rychlé Libovolný objem vzorku
Renaturace na koloně
GSH/GSSG
GSH/GSSG
Koncentrace proteinu
výtěžek renaturace klesá s vyšší počáteční koncentrací proteinu 10 - 50 µg/ml
Analýza renaturovaného proteinu • SDS-PAGE analýza rozpustné a nerozpustné složky • testování aktivity • ELISA ne WB • cirkulární dichroismus nebo infračervená spektroskopie • DLS
Jak zlepšit rozpustnost rekombinantního proteinu??? • snížit rychlost exprese • snížení teploty kultivace • použití low-copy plasmidu • použití slabšího promotoru • snížení koncentrace induktoru • změna kultivačního média • přídavek prostetické skupiny nebo kofaktoru • přídavek pufru – kontrola pH • přídavek 1 % glukosy – represe indukce lac promotoru laktosou z media (LB,…) • přídavek polyolů (sorbitol) nebo sacharosy – zvýšení osmotického tlaku – akumulace osmoprotektantů v buňce • exprese s chaperony a/nebo enzymy pomáhajícími správně sbalit protein • GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE, ClpB • peptidyl prolyl cis/trans isomerasa (PPI's), disulfidoxidoreduktasa (DsbA), disulfidisomerasa (DsbC) • cílení do periplasmatického prostoru • přídavek leader sekvence (pelB , ompT) • disulfidoxidoreduktasa (DsbA), disulfidisomerasa (DsbC) • použití speciálních kmenů E.coli • AD494 - mutace thioredoxinreduktasy (trxB) • Origami - mutace thioredoxinreduktasy (trxB) + glutathionreduktasy (gor) • fúzní proteiny http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_expression/ecoli/improving_protein_solubility/
použití afinitní chromatografie Mono-specifická AC jednokroková purifikace enzymů, receptorů, protilátek ~ s využitím specifických ligandů
Skupinově-specifická AC jednokroková purifikace proteinů obsahujících obecnější vazebné místo jako jsou některé skupiny protilátek, glykoproteiny, NADP-dependentní proteiny, ...
Fůzní proteiny AC jednokroková purifikace afinitní část je k proteinu připojena pomocí genového inženýrství
Experiment .
Mono-specifická AC
Skupinově-specifická AC
Fůzní proteiny AC
stacionární fáze
vysoce poresní, dobře přístupné jak pro ligand, tak i pro protein
média jsou komerčně dostupná
média jsou komerčně dostupná
kolona
krátké silné
krátké silné
krátké silné
ligandy
některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky
některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky
některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky opakované použití pouze pro stejný protein, riziko kontaminace
průtok
vazba a desorbce závisí na průtoku
vazba a desorbce závisí na průtoku
vazba a desorbce závisí na průtoku
objem vzorku
nesmí být překročena kapacita kolony pokud je velké KD neměl by být vzorek moc naředěn
nesmí být překročena kapacita kolony
nesmí být překročena kapacita kolony
