Vliv suplementace n-3 polynenasycenými mastnými kyselinami na složení kondenzátu vydechovaného vzduchu u nemocných s cystickou fibrózou

216 Stud. Pneumol. Phthiseol., 69, 20 09, č. 6, s. 216–220

Vliv suplementace n-3 polynenasycenými mastnými kyselinami na složení kondenzátu vydechovaného vzduchu u nemocných s cystickou fibrózou L. Fila1, J. Brázová2, J. Musil1 1

Pneumologická klinika, 2. LF UK a FN Motol, 2Ústav imunologie, 2. LF UK a FN Motol

SUMMARY Effect of supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids on exhaled breath condensate composition in patients with cystic fibrosis Bronchopulmonary disease in cystic fibrosis (CF) is coupled with neutrophilic inflammation. Leukotriene (LT) B4 is an important chemoattractant for neutrophilic leukocytes. Supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) leads to synthesis of biologically less active LTB5. The aim of this study was to compare inflammatory markers (pH and LTB4) in exhaled breath condensate (EBC) in stable CF and healthy controls, to evaluate their relation to lung function, nutritional status and systemic inflammatory markers, and also to assess the effect of supplementation with n-3 PUFA. Twelve stable CF patients (5 males) with a mean age of 25.6 years had higher concentrations of EBC LTB4 (174.6 vs. 82.6 pg/ml; p = 0.011) and insignificantly lower values of EBC pH (5.95 vs. 6.13) when compared with healthy controls (n = 12; 4 males; mean age 27.3 years). In CF patients, EBC LTB4 concentration correlated with serum C-reactive protein concentration (r = 0.629; p = 0.028) and EBC pH value correlated with the body mass index (r = 0.639; p = 0.025) and blood neutrophil granulocytes count (r = –0.686; p = 0.014). After six weeks of n-3 PUFA supplementation (doses corresponding to 1.3 % of calorie intake), nine CF patients had higher EBC pH values (6.08 vs. 6.32; p = 0.042) and insignificantly lower EBC LTB4 concentration (173.0 vs. 120.5 pg/ml). We conclude that CF patients have more pronounced inflammatory parameters in EBC when compared with healthy controls. EBC inflammatory parameters correlated with systemic inflammatory markers. After n-3 PUFA treatment, EBC LTB4 concentration tended to be lower and EBC was significantly less acid, which may reflect less intense neutrophilic inflammation. Keywords: cystic fibrosis, exhaled breath condensate, leukotriene B4, n-3 polyunsaturated fatty acids SOUHRN Bronchopulmonální onemocnění cystické fibrózy (CF) je spojeno s neutrofilním zánětem. Leukotrien (LT) B4 je důležitým chemotaktickým faktorem neutrofilních leukocytů (NF). Podání n-3 polynenasycených mastných kyselin (PUFA) vede k syntéze biologicky méně aktivního LTB5. Cílem práce bylo porovnat zánětlivé parametry (pH a LTB4) kondenzátu vydechovaného vzduchu (KVV) u stabilní CF a zdravých kontrol, zhodnotit jejich vztah k plicním funkcím, stavu výživy a systémovým zánětlivým parametrům a dále zhodnotit vliv suplementace n-3 PUFA. 12 nemocných se stabilní CF (5 mužů) v průměrném věku 25,6 roku mělo ve srovnání se zdravými dobrovolníky (n = 12; 4 muži; průměrný věk 27,3 roku) vyšší koncentraci LTB4 v KVV (174,6 vs. 82,6 pg/ml; p = 0,011) a nesignifikantně nižší pH KVV (5,95 vs. 6,13). U nemocných s CF korelovala koncentrace LTB4 v KVV s koncentrací C-reaktivního proteinu v séru (r = 0,629; p = 0,028) a hodnota pH v KVV s hodnotou body mass indexu (r = 0,639; p = 0,025) a počtem neutrofilních granulocytů v krvi (r = –0,686; p = 0,014). Po šesti týdnech suplementace n-3 PUFA v dávce odpovídající 1,3 % kalorického příjmu došlo u nemocných s CF (n = 9) k vzestupu hodnoty pH KVV (6,08 vs. 6,32; p = 0,042) a nesignifikantnímu poklesu koncentrace LTB4 v KVV (173,0 vs. 120,5 pg/ml). Uzavíráme, že nemocní s CF měli více vyjádřené zánětlivé parametry v KVV oproti zdravým kontrolám. Zánětlivé parametry v KVV korelovaly se systémovými zánětlivými markery. Suplementace n-3 PUFA má tendenci snižovat koncentraci LTB4 v KVV a signifikantně snižuje pH KVV, což může odrážet zmírnění neutrofilního zánětu dýchacích cest u nemocných s CF. Klíčová slova: cystická fibróza, kondenzát vydechovaného vzduchu, leukotrien B4, n-3 polynenasycené mastné kyseliny

ÚVOD Bronchopulmonální onemocnění u cystické fibrózy (CF) je spojené s poruchou mukociliární clearance, chronickou bakteriální kolonizací a zánětlivým postižením dýchacích cest. Dominujícím buněčným typem v tomto zánětu jsou neutrofilní granulocyty (NF). Důsledkem těchto procesů je

rozvoj bronchiektázií, obstrukční ventilační poruchy a respirační insuficience [3]. Jedním z možných způsobů hodnocení mediátorů neutrofilního zánětu dýchacích cest u CF je jejich vyšetření v kondenzátu vydechovaného vzduchu (KVV) [2]. Důležitým chemotaktickým mediátorem NF je leukotrien (LT) B4 [8]. Recentní práce prokazují možnost ovlivnění koncentrací LTB4 v krevním sé-

217 ru za pomoci suplementace n-3 polynenasycených mastných kyselin (n-3 PUFA) vzhledem k tomu, že jde o prekurzory biologicky méně aktivního LTB5 [4]. Prekurzorem LTB4 je především kyselina arachidonová (ARA), jíž je u nemocných s CF relativní nadbytek oproti hlavním n-3 PUFA, tedy kyselině eikosapentaenové (EPA) a dokosahexaenové (DHA) [14]. Existují práce, které prokazují příznivý efekt suplementace EPA a DHA jak u myšího modelu CF (pokles počtu NF v tekutině získané bronchoalveolární laváží po inhalační expozici lipopolysacharidu Pseudomonas aeruginosa), tak u nemocných s CF (pokles koncentrace sérového imunoglobulinu G a spotřeby antibiotik pro léčbu plicních exacerbací) [10,13]. Z těchto důvodů jsme v prezentované práci hodnotili vliv suplementace n-3 PUFA na některé parametry KVV u nemocných s CF, a to na pH a koncentraci LTB4. Hodnoceny byly rovněž změny plicních funkcí, stavu výživy a systémových zánětlivých parametrů a jejich korelace s těmito zánětlivými parametry KVV u nemocných s CF.

rometru MasterLab, Jaeger, SRN), dále odběr krve na vyšetření zánětlivých parametrů a odběr kondenzátu vydechovaného vzduchu (KVV) za použití kondenzátoru ECoScreen (Jaeger, SRN). Zaznamenány byly hodnoty body mass indexu (BMI), usilovně vydechnutého objemu za první sekundu (FEV1), koncentrace sérového C-reaktivního proteinu (CRP) a počtu NF v periferní krvi. V KVV byla bezprostředně po odběru bez využití deaerace změřena hodnota pH přístrojem Titan se sondou CupFet (Sentron, Nizozemí) a vzorky byly zamraženy (při teplotě –80 °C) až do vyšetření koncentrace LTB4 metodou ELISA (R&D Systems, USA). Vyšetřené parametry byly zaznamenány jako aritmetický, resp. geometrický (u log-normálního rozdělení) průměr a 95% interval spolehlivosti (95% CI). Statistické vyhodnocení bylo provedeno Studentovým t-testem a Pearsonovým korelačním koeficientem (u dat s log-normálním rozdělením byly testy aplikovány na log-transformovaná data) za pomoci statistického software Statistica 8 Cz (StatSoft ČR, s. r. o.). Za signifikantní byly považovány p-hodnoty < 0,05. Kontrolní soubor tvořilo 12 dobrovolníků bez anamnézy chronického plicního onemocnění či nikotinizmu.

VÝSLEDKY

MATERIÁL A METODIKA Do studie byli zařazeni dospělí nemocní s CF (homozygoti F508del) ve stabilní fázi onemocnění, u kterých byl zaznamenán věk, pohlaví a kolonizace dýchacích cest. Těmto pacientům byl po dobu 6 týdnů podáván preparát n-3 PUFA v dávce odpovídající 1,3 % kalkulovaného energetického příjmu [10]. Energetický příjem byl kalkulován s ohledem na věk, pohlaví a faktory aktivity a katabolizmu 42–50 kcal/kg/d. Odpovídající množství preparátu n-3 PUFA (s obsahem 225 mg EPA a 170 mg DHA v jedné kapsli [16]) pak činilo 61–72 mg/kg/d, tj. 0,152–0,18 kapsle/kg/d. Při zahájení a ukončení studie bylo provedeno vyšetření stavu výživy, stavu plicních funkcí (za použití spi-

Do studie bylo zařazeno 12 nemocných s CF. Jejich demografické, klinické a laboratorní nálezy včetně srovnání s kontrolním souborem jsou uvedeny v tab. 1. Koncentrace LTB4 v KVV byla u nemocných s CF signifikantně vyšší, u pH KVV byly zjištěny nesignifikantně nižší hodnoty. Korelace hodnot zánětlivých parametrů v KVV se stavem výživy, stavem plicních funkcí a systémovými zánětlivými parametry jsou uvedeny v tab. 2. Hodnoty pH KVV pozitivně korelovaly se stavem výživy a negativně s počtem NF v periferní krvi, koncentrace LTB4 v KVV pak pozitivně korelovala

Tabulka 1: Demografické, klinické a laboratorní parametry nemocných s CF a kontrolního souboru Parametr

Nemocní s CF

Počet (muži/ženy) Věk (roky) pH KVV LTB4 v KVV (pg/ml)

Kontrolní soubor

12 (5/7)

12 (4/8)

25,6 (23,3–28,1)

27,3 (24,9–29,8)

p-hodnota§

ns

5,95 (5,68–6,22)

6,13 (5,96–6,30)

ns

174,6 (104,5–291,7)

82,6 (61,4–111,2)

p = 0,011

Kolonizace dýchacích cest • Pseudomonas aeruginosa

2

• Burkholderia cenocepacia

8

†

• nekolonizovaní

2

FEV1 (% nál. hodn.)

52,4 (39,1–70,3)

BMI /kg/m2)

21,1 (19,4–22,8)

NF (počet/μl)

7,8 (5,5–10,1)

CRP (mg/l) §

5,6 (3,0–8,2)

t-test; † bez kolonizace Pseudomonas aeruginosa a Burkholderia cenocepacia; věk nemocných, koncentrace LTB4 v KVV a hodnota FEV1 jsou uvedeny jako geometrické průměry (95% CI), v ostatních případech jde o aritmetické průměry (95% CI); zkratky viz text

218 s koncentrací CRP v séru. Další signifikantní korelace prokázány nebyly. Studii dokončilo 9 nemocných s CF. Porovnání jejich klinických a laboratorních parametrů před a po suplementaci n-3 PUFA uvádí tab. 3. Došlo k signifikantnímu vzestupu hodnot pH KVV a nesignifikantnímu poklesu koncentrace LTB4 v KVV (přestože se jednalo o pokles o 30,3 %). Ostatní parametry nebyly signifikantně ovlivněny.

DISKUZE Dostupné publikace prokazují korelace koncentrací LTB4 a počtu NF v materiálech z dolních dýchacích cest (KVV, indukované sputum, bronchoalveolární laváž) a rovněž korelaci těchto parametrů s tíží bronchopulmonálního onemocnění nejen u CF [5,20], ale i u dalších chronických respiračních onemocnění [11,15]. Otázka ovlivnění produkce LTB4 pomocí suplementace prekurzoru biologicky méně aktivního LTB5 je u pacientů s CF aktuální i z toho důvodu, že u tohoto onemocnění je prokazován deficit esenciálních mastných kyselin (kyseliny linolové a α-linolenové; α-linolenová kyselina je prekurzorem EPA a DHA), a to bez závislosti na malabsorpci tuků. V tkáních, kde je exprimován transmembránový regulátor vodivosti (CFTR), je u nemocných s CF v buněčných membránách zvýšený poměr kyseliny arachidonové (ARA) k DHA [14]. Zvýšený poměr ARA/DHA je

u nemocných s CF prokazatelný i v krevním séru, kde je rovněž zvýšený poměr Meadovy kyseliny (MA) k ARA (index deficience esenciálních mastných kyselin). Tyto změny jsou výraznější u nemocných s těžkými mutacemi CFTR (I.–III. třída mutací) a u nemocných s hepatopatií vázanou na CF [21]. S plazmatickou koncentrací ARA koreluje klinické (Shwachmanovo) skóre nemocných s CF [6]. S indexy ARA/DHA a MA/ARA dokonce negativně koreluje frakční koncentrace vydechovaného oxidu dusnatého (FeNO) [18]. FeNO je u CF snížená, což má pravděpodobně řadu důsledků pro rozvoj plicního onemocnění, neboť NO má účinky bronchodilatační a antimikrobiální, a navíc stimuluje mukociliární clearance [9]. Patofyziologie cystické fibrózy je tak podstatně komplikovanější a je třeba brát v úvahu i porušený metabolizmus NO a mastných kyselin. Novější práce na myším modelu CF prokazují oproti původním Freedmanovým nálezům [13] pouze zmírnění zánětlivé infiltrace periportálních polí jater [1]. Změny v oblasti plic, pankreatu a tenkého střeva prokazatelné nebyly. Suplementace DHA u myšího modelu CF s infekcí mukoidní Pseudomonas aeruginosa rovněž nevedla ke zlepšení přežití [23]. Suplementace n-3 PUFA u nemocných s CF po dobu 6 měsíců vedla ke snížení poměru LTB4/LTB5 v membránách NF, a podporovala tak

Tabulka 2: Korelace zánětlivých parametrů KVV se stavem plicních funkcí, stavem výživy a systémovými zánětlivými parametry u nemocných s CF pH KVV Parametr

LTB4 v KVV

Korelační koeficient

p-hodnota

Korelační koeficient

p-hodnota

0,04

ns

–0,218

ns

FEV1 BMI

0,639

0,025

NF

–0,686

0,014

–0,45 0,475

ns

ns

CRP

–0,227

ns

0,629

0,028

Zkratky viz text

Tabulka 3: Změny klinických a laboratorních parametrů před a po suplementaci n-3 PUFA Parametr

Před suplementací

pH KVV

6,08

(5,77–6,38)

Po suplementaci 6,32

(6,18–6,46)

p-hodnota§ 0,042

LTB4 v KVV (pg/ml)

173,0

(96,8–308,3)

120,5

(81,1–178,6)

ns

FEV1 (% nál. hodn.)

49,8

(36,1–68,5)

48,2

(34,6–67,1)

ns

2

BMI (kg/m )

21,4

(19,3–23,5)

21,4

(19,3–23,5)

ns

NF (počet/μl)

7,3

(4,5–10,2)

7,0

(5,0–9,1)

ns

CRP (mg/l)

5,8

(2,8–8,9)

6,0

(1,6–10,3)

ns

§

t-test; koncentrace LTB4 v KVV a hodnota FEV1 jsou uvedeny jako geometrické průměry (95% CI), v ostatních případech jde o aritmetické průměry (95% CI); zkratky viz text

219 možnost produkce chemotakticky méně aktivních působků [19]. Stejně tak 12 měsíců trvající studie se suplemetací DHA vedla k méně prozánětlivému profilu mastných kyselin sérových fosfolipidů [22]. Tyto změny však nebyly provázeny klinickým zlepšením nemocných. Studie Jumpsena [17] využívala, obdobně jako práce námi prezentovaná, šestitýdenní podávání DHA v dávce 70 mg/kg/d. Tato suplementace vedla ke zvýšení obsahu DHA ve fosfolipidech séra, membrán erytrocytů a vzorků střevní sliznice. Stejně jako v naší studii však nebyly prokazatelné změny plicních funkcí. Nicméně prokázaný vzestup pH KVV může odrážet zmírnění neutrofilního zánětu dýchacích cest. Obdobný nález jsme u nemocných s CF zachytili rovněž v případě léčby inhalačními kortikosteroidy [12]. Lze tedy říci, že ačkoli se daří korigovat laboratorní odchylky v metabolizmu mastných kyselin, není dosud prokazatelná klinická odpověď v oblasti bronchopulmonálního postižení u CF. Jedním z možných vysvětlení je vliv dalších chemotaktických mediátorů, především interleukinu 8 [7], jehož produkce suplementací n-3 PUFA nejspíše ovlivněna není. Námi prezentovaná práce je bohužel limitována malým souborem vyšetřených pacientů s CF. Jsme si vědomi toho, že k ověření platnosti zjištěných výsledků je zapotřebí dalšího výzkumu na větších souborech nemocných.

ZÁVĚR Prezentovaná práce prokazuje výraznější zánětlivé parametry v KVV u nemocných s CF oproti zdravým kontrolám a jejich korelaci se systémovými zánětlivými markery. Suplementace n-3 PUFA má tendenci snižovat koncentraci LTB4 v KVV a signifikantně snižuje pH KVV, což může odrážet zmírnění neutrofilního zánětu dýchacích cest u nemocných s CF.

SEZNAM ZKRATEK ARA BMI CF CFTR CRP DHA EPA FeNO

– – – – – – – –

FEV1

–

KVV LT MA NF

– – – –

kyselina arachidonová (20:4 n-6), body mass index, cystická fibróza, transmembránový regulátor vodivosti, C-reaktivní protein, kyselina dokosahexaenová (22:6 n-3), kyselina eikosapentaenová (20:5 n-3), frakční koncentrace vydechovaného oxidu dusnatého, usilovně vydechnutý objem za první sekundu, kondenzát vydechovaného vzduchu, leukotrien, Meadova kyselina (20:3 n-9), neutrofilní granulocyty.

LITERATURA 1. Beharry S, Ackerley C, Corey M, Kent G, Heng YM et al. Long-term docosahexaenoic acid therapy in a congenic murine model of cystic fibrosis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007; 292:G839–848. 2. Bodini A, D'Orazio C, Peroni D, Corradi M, Folesani G et al. Biomarkers of neutrophilic inflammation in exhaled air of cystic fibrosis children with bacterial airway infections. Pediatr Pulmonol 2005; 40:494–499. 3. Boucher RC. New concepts of the pathogenesis of cystic fibrosis lung disease. Eur Respir J 2004; 23:146–158. 4. Calder PC. Polyunsaturated fatty acids, inflammation, and immunity. Lipids 2001; 36:1007–1024. 5. Carpagnano GE, Barnes PJ, Geddes DM, Hodson ME, Kharitonov SA. Increased leukotriene B4 and interleukin6 in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167:1109–1112. 6. Colombo C, Bennato V, Costantini D, Valmarana L, Dacco V et al. Dietary and circulating polyunsaturated fatty acids in cystic fibrosis: are they related to clinical outcomes? J Pediatr Gastroenterol Nutr 2006; 43:660–665. 7. Courtney JM, Ennis M, Elborn JS. Cytokines and inflammatory mediators in cystic fibrosis. J Cyst Fibros 2004; 3:223–231. 8. Crooks SW, Stockley RA. Leukotriene B4. Int J Biochem Cell Biol 1998; 30:173–178. 9. de Winter-de Groot KM, van der Ent CK. Nitric oxide in cystic fibrosis. J Cyst Fibros 2005; 4 Suppl 2: 25–29. 10. De Vizia B, Raia V, Spano C, Pavlidis C, Coruzzo A, Alessio M. Effect of an 8-month treatment with omega-3 fatty acids (eicosapentaenoic and docosahexaenoic) in patients with cystic fibrosis. J Parenter Enteral Nutr 2003; 27:52–57. 11. Ding YL, Yao WZ, Zheng J, Zhu YL, Liu Z. [Changes of leukotriene B4 in chronic obstructive pulmonary disease and effects of theophylline on leukotriene B4.] Beijing Da Xue Xue Bao. 2005; 37:393–397. Abstract. 12. Fila L, Musil J, Valentová Bartáková L, Chládek J. Vliv terapie inhalačními kortikosteroidy na složení kondenzátu vydechovaného vzduchu u nemocných s cystickou fibrózou. Stud Pneumol Phthiseol 2008; 68:6–9. 13. Freedman SD, Weinstein D, Blanco PG, Martinez-Clark P, Urman S, Zaman M, Morrow JD, Alvarez JG. Characterization of LPS-induced lung inflammation in cftr-/- mice and the effect of docosahexaenoic acid. J Appl Physiol 2002; 92:2169–2176. 14. Freedman SD, Blanco PG, Zaman MM, Shea JC, Ollero M et al. Association of cystic fibrosis with abnormalities in fatty acid metabolism. N Engl J Med 2004; 350:560–569. 15. Gabrijelcic J, Acuna A, Profita M, Paterno A, Chung KF, Vignola AM, Rodriguez-Roisin R. Neutrophil airway influx by platelet-activating factor in asthma: role of adhesion molecules and LTB4 expression. Eur Respir J 2003; 22:290–297. 16. http://www.maxicor.cz 17. Jumpsen JA, Brown NE, Thomson AB, Paul Man SF, Goh YK, Ma D, Clandinin MT. Fatty acids in blood and intestine following docosahexaenoic acid supplementation in adults with cystic fibrosis. J Cyst Fibros 2006; 5:77–84. 18. Keen C, Olin AC, Edentoft A, Gronowitz E, Strandvik B. Airway nitric oxide in patients with cystic fibrosis is associated with pancreatic function, Pseudomonas infection, and polyunsaturated fatty acids. Chest 2007; 131:1857– 1864. 19. Panchaud A, Sauty A, Kernen Y, Decosterd LA, Buclin T et al. Biological effects of a dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids supplementation in cystic fibrosis patients: a randomized, crossover placebo-controlled trial. Clin Nutr 2006; 25:418–427.

220 20. Sagel SD, Sontag MK, Wagener JS, Kapsner RK, Osberg I, Accurso FJ. Induced sputum inflammatory measures correlate with lung function in children with cystic fibrosis. J Pediatr 2002; 141:811–817. 21. Van Biervliet S, Vanbillemont G, Van Biervliet JP, Declercq D, Robberecht E, Christophe A. Relation between fatty acid composition and clinical status or genotype in cystic fibrosis patients. Ann Nutr Metab 2007; 51:541–549. 22. Van Biervliet S, Devos M, Delhaye T, Van Biervliet JP, Robberecht E, Christophe A. Oral DHA supplementation in DeltaF508 homozygous cystic fibrosis patients. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2008; 78:109– 115. 23. Van Heeckeren AM, Schluchter M, Xue L, Alvarez J, Freedman S, St George J, Davis PB. Nutritional effects on

host response to lung infections with mucoid Pseudomonas aeruginosa in mice. Infect Immun 2004; 72:1479– 1486.

Práce byla podpořena grantem IGA 8458-5 a interním grantem FN Motol č. 9755/2006. Došlo: 10. 3. 2009

Adresa: MUDr. Libor Fila Pneumologická klinika, 2. LF UK a FN Motol V Úvalu 84, 150 06 Praha 5 Česká republika e-mail: [email protected]