TERÁPIAREZISZTENCIA FEHÉRJÉK MŐKÖDÉSÉNEK VIZSGÁLATA „FLOWCYTOMETRIA” ALKALMAZÁSÁVAL Szendi Eszter V. évfolyam
Témavezetı: Dr. Vajdovich Pé Péter TDK konferencia, 2008.11.26.
Terápiarezisztencia alapvetı sejtes védekezési mechanizmusok terápiarezisztencia: a sejtek legtöbbször a betegségek ellen használt terápiás készítményeket is idegen anyagként kezelik, azokat szervezetükbıl eltávolítják, csökkentve vagy akár kioltva ezzel a kezelés hatékonyságát kemoterápia! két forma: 1) eredendı 2) szerzett
egyik ilyen mechanizmus: membránpumpa-fehérjék (effluxpumpák)
Membránpuma-fehérjék Két család: major vault protein-ek (MVP-k) ATP binding casette transporters (ABC transzporterek)
ATP függı, primer aktív transzporterek
mőködésük: ATP-hidrolízis E-felszabadulás
citotoxikus anyagok kipumpálása
MDR1 - multidrug resistance-1
Pgp - permeability-glükoprotein ABCb alcsalád jelen vannak: bél, máj, vese hámsejtek; mellékvese, tüdı, placenta, csontvelı, perifériás vér sejtjei, vér-agy /vér-here gát szubsztrátjai: vinblasztin, vinkrisztin mitoxantron doxorubicin, daunorubicin etopozid, paclitaxel
MRP1 - multidrug resistance associated protein-1
ABCc alcsalád GSH dependensek, hiányában elvesztik funkciójukat jelen vannak: tüdı, vékonybél, izom, vér, máj sejtjeiben; gyulladásos folyamatok szabályozása szubsztrájai: ua.mint az MDR1 + metotrexát
Effluxpumpák azonosítása Calcein-próba: funkcionális teszt fluoreszcencia mérésen alapul eredmények kifejezése: multidrog rezisztencia aktivitási faktor (MAF) calcein-AM: nem-fluoreszkáló, lipofil vegyület IC észterázok
calcein: fluoreszkáló, hidrofil vegyület, MDR szubsztrát magas MDR szám/MAF
alacsony IC calcein szint alacsony IC fluoreszcencia és fordítva
Effluxpumpák gátlása cél: az MDR pumpát a megfelelı antagonistával gátolva a gyógyszer a célsejtben maradjon gátló vegyületek: verapamil – MDR-ek MK-571 – MRP1 mechanizmus: (ONT-093 blokkolón keresztül bemutatva)
„Flow” – Áramlás-citometria min alapul?: a sejtek fényszórási tulajdonságain mesterségesen elıidézett IC fluoreszcenciájuk mérésein képes több paraméter szimultán mérésére a sejteket egyesével, egymástól különállóan elemzi lamináris áramlás
a flowcytométer
High angle mőködése: detector
Cell két lézerfej
kék – 488nm (calcein) piros – 633nm (TP3)
négy fénydetektor- FL
FL1 – 520nm (calcein) FL4 – 660nm (TP3)
FSC; SSC Laser
Low angle detector
0°
a flowcytométer mőködése: két lézerfej
kék – 488nm (calcein) piros – 633nm (TP3)
négy fénydetektor- FL
FL1 – 520nm (calcein) FL4 – 660nm (TP3)
FSC; SSC
Célkitőzésünk eredeti célkitőzésünk: különbözı tumoros szövetekbıl nyert biopsziás mintákból szeparáljunk el daganatosan elfajult sejteket, melyekben ezt követıen vizsgálhassuk a memebrán-transzport fehérjék funkcióját a calcein-próba segítségével vérbıl szeparált egészséges lymphocyták kérdés: változott-e a beteg kutyák keringı mononukleáris sejtjeinek multidrog rezisztencia aktivitási faktor (MAF) értéke a kemoterápiás kezelés hatására a kontroll kutyák vérében keringı hasonló sejtek MAF értékeihez képest?
Anyag és módszer Vizsgált állatok: Szükséges oldatok: 9 kezelés alatt álló lymphomás Calcein -AM – oldat átlagéletkor: 8,27 év Verapamil – oldat (jelölés: V) 4 szuka, 5 kan. Mk-571 – oldat (jelölés: M) 6 egészséges Beagle HBSS – oldat (jelölés: H) átlagéletkora: 4,75 év To-Pro (TP3) – oldat
3 kan, 3 szuka.
Minta: alvadásban gátolt vénás vér
A minták elıkészítése: egészséges mononukleáris sejtek elkülönítése Ficollreagenssel az elkülönített sejtek felvétele HBSS-ben
Áramlás-citometriás mérés: FacsCalibur flowcytométer és Cellquest program minden mintából 5000 sejt „kapuzás”:
R1 : méret és granuláltság alapján különítettük el a szükséges sejteket (lymphocyták és monocyták)
R2 : azokat a sejteket szőrtük ki, melyeknél magas volt az 520 nm-es emittálás magas volt az IC calcein szintjük R3 : az élı sejteket válogattuk ki, melyeknél alacsony volt a 660 nm-es emittálás nem vették fel a TP3-at (ok: ép a sejtmembránjuk)
„kapuzás” R2
R1
R3
marad: mononukleáris,
magas IC calcein szintő, élı sejtek
Eredmé Eredmények IC calcein szintek: IC calcein szint = IC fluoreszcencia értékek IC calcein (VP) > IC calcein (MK) > IC calcein (HBSS) beteg IC calcein szint < a kontroll (p<0,05)
s
MAF értékek kiszámítása: MAF: IC flc.(gátolt) - IC flc.(gátlás nélküli) / IC flc.(gátolt)*100 beteg átlagos MAF (mrp1+mdr1) értékek > kontroll (p<0,01) beteg átlagos MAF (mrp1) értékek > kontroll (p<0,06) nincs szignifikáns különbség a kontroll-beteg átlag MAF(mdr1)
értékekben P<0,01
Következteté vetkeztetések a betegek esetében az effluxpumpa mechanizmus
fokozottabban mőködik, és/vagy az effluxpumpák száma (mennyisége) nıtt a kemotrápia hatására a kemoterápiás kezelés hatására az MRP1
aktivitása jelentısebb mértékben okozott effluxfunkció erısödést, míg az MDR1-é nem változott számottevıen
Köszö szönetnyilvá netnyilvánítás Témavezetımnek: Dr. Vajdovich Péternek Dr. Karászi Évának és Dr. Várady Györgynek (Országos Gyógyintézeti Központ
Haematológiai és Immunológiai Intézet) Dr. Szécsényi Dórának Belgyógyászati Tanszék és Klinikának Családomnak
Köszö szönöm a figyelmet!
