Vérkészítmény Tesztelése Tenyésztőmédiumkiegészítőként
KÉSZÍTETTE:
Babos Kitti Biomérnök szakos hallgató
TÉMAVEZETŐ: Vácz Gabriella
Budapest, 2014
Vérkészítmény Tesztelése Tenyésztőmédium-kiegészítőként
Az őssejtekkel kapcsolatos kutatások napjainkban nagyon népszerűek, hiszen ezen sejtek felfedezésével és vizsgálatukkal lehetőség nyílt a regenerációs gyógyítás magasabb szintre emelésére. Az alkalmazásuk és működésük azonban továbbra is kérdőjelekkel teli. Az egyik vitatott terület a sejtek tenyésztésével van összefüggésben. A felnőtt sejteket felhasználó őssejtterápiák lényege ugyanis az, hogy az emberi szervezetben kis számban előforduló őssejteket speciális in vitro körülmények között feldúsítják és ezt a megnövelt, gyógyításra már elegendő mennyiséget jutatják el a probléma helyére. Ehhez a lépéshez olyan tenyésztőmédiumra
van
szükség,
ami
tartalmazza
a
sejtek
növekedéséhez
és
differenciálódásához fontos anyagokat. Az egyik tápoldat-komponens az FBS (fetal bovine serum), azaz magzati szarvasmarha szérum, aminek az alkalmazása erősen vitatott. Az egyik komoly problémát a tudományos oldal jelenti, vagyis az, hogy az állati eredetű vér fertőzött lehet, így az alkalmazása komoly elővigyázatosságot igényel, ami a termék költségeit is megnöveli. Másfelől a szérum gyűjtése során rengeteg borjúmagzatot kell leölni, ami jelentősen megkérdőjelezi a módszer etikusságát. A TDK dolgozatom témája egy megfelelőbb kiegészítő találása az FBS helyett, amely ezeket a problémákat kiküszöböli. A vizsgált anyag egy emberi vérkészítmény, az SPRF (serumderived from platelet-rich fibrin), vagyis trombocitában gazdag fibrinből származtatott szérum volt. Ehhez nincs szükség állatok feláldozására és mivel a dúsításhoz szükséges mennyiség a beteg saját véréből elkészíthető, így az átfertőzéseket is megelőzi. A kísérletsorozat során fiatal, illetve idős donoroktól származó őssejteket kezeltem fiatal donor SPRF-ét, idős donor SPRF-ét, illetve FBS-t tartalmazó tápoldatokkal és vizsgáltam, hogy a három csoport körül melyik hozza a legnagyobb sejtnövekményt. A kapott eredmények arra engedtek következtetni, hogy a humán készítmény felülmúlhatja az állatit és így új távlatokat nyithat az őssejtterápiák felépítéséhez.
Testing a Blood Fraction as a Cell Culture Medium Supplement
Stem cell based researches are very popular nowadays, because discovering and studying these cells made the chance to take regenerative healing to a higher level. However, their application and mechanisms are questionable so far. One of the most controversial areas is cell growing. The purpose of stem cell therapies, which use adult cells, is to enrich them to an increased number under in vitro conditions, because in the human body these cells are very rare. So then, this raised quantity is taken to the problematic part of the organism. For this step, we need a special culture media, which contains the important factors for cell growing and differentiation. One medium supplement is the FBS (fetal bovine serum), but the use of it is debated. Some problems are scientific, which means that the using of the product needs very serious providence, because it is inhuman. These methods make the FBS expensive. On the other hand, collecting the serum needs a lot of bovine sacrifices, which makes questions about the ethical part of this process. My study is about searching for another supplement instead of the FBS, which does not have the previously mentioned problems. The examined material was a human blood fraction named SPRF (serum-derived from platelet-rich fibrin). For this product we do not need to slaughter animals and there is no threat of contamination, because it can be acquired from the blood of the patients. In the experiments I used mediums with SPRF from an old donor, SPRF from a young donor and FBS as a media supplement to treat old and young mesenchymal stem cell lines. The following step was to test which one of these three groups had the greatest increase in the number of cells. The results showed that the human blood fraction can surpass the animal, and because of this, it can open up new perspectives for the construction of therapies utilizing stem cells.
Tartalomjegyzék
1. Bevezetés ................................................................................................................................ 1 2. Irodalom ................................................................................................................................. 3 2.1. Őssejtterápiák ...................................................................................................................... 3 2.1.1. Az őssejtek típusai ............................................................................................................ 3 2.1.1.1. Mezenchimális őssejtek................................................................................................. 5 2.1.2. Terápia mezenchimális őssejtekkel: múlt, jelen és jövő .................................................. 6 2.2. Az őssejtek tápanyagigénye ................................................................................................ 8 2.2.1. Problémák az FBS használatával ................................................................................... 11 2.2.1.1. Humán alternatívák ..................................................................................................... 13 2.2.1.2. Szérum-mentes médiumok .......................................................................................... 15 3. Kísérletek és módszerek ....................................................................................................... 16 3.1. Ötlet a kísérletek megvalósítására ..................................................................................... 16 3.2. Sejtkultúra fenntartása ....................................................................................................... 17 3.2.1. Őssejtek általános ellátása .............................................................................................. 17 3.2.1.1. Őssejt médium készítése, sejtek táplálása ................................................................... 18 3.2.1.2. Passzálás ...................................................................................................................... 19 3.2. Vérkészítmény tesztelése idős és fiatal donorból származő őssejtvonalakon ................... 20 3.2.1. Tenyésztőmédiumok elkészítése .................................................................................... 21 3.2.2. Sejtek számlálása és tálcára tétele .................................................................................. 22 3.2.3. Az életképesség mérése .................................................................................................. 25 4. Eredmények és értékelésük .................................................................................................. 27 4.1. A médiumok hatása fiatal donorból izolált sejtekre .......................................................... 27
4.2. A médiumok hatása idős donorból izolált sejtekre ........................................................... 28 4.3. Az eredmények értékelése ................................................................................................. 29 5. A folytatás ............................................................................................................................ 30 6. Összefoglalás ........................................................................................................................ 31 7. Függelék ............................................................................................................................... 32 7.1. Fiatal őssejtek mérési eredményei ..................................................................................... 32 7.1.1. Kontroll médiumban ...................................................................................................... 32 7.1.2. Fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiumban ................................................................ 34 7.1.3. Idős donor SPRF-ét tartalmazó médiumban .................................................................. 36 7.2. Idős őssejtek eredményei .................................................................................................. 38 7.2.1. Kontroll médiumban ...................................................................................................... 38 7.2.2. Fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiumban ................................................................ 39 7.2.3. Idős donor SPRF-ét tartalmazó médiumban .................................................................. 40 7.3. Eredmények összefoglalása ............................................................................................... 42 8. Irodalomjegyzék ................................................................................................................... 43
Rövidítésjegyzék
ESC
Embrionális őssejt
Embryonic stem cell
NESC
Nem embrionális őssejt
Non-embryonic stem cell
MSC
Mezenchimális őssejt
Mesenchymal stem cell
BMSC
Csontvelő eredetű őssejt
Bone marrow-derived stem cell
HBMSC
Humán csontvelő eredetű őssejt
Human bone marrow-derived stem cell
FBS
Magzati szarvasmarha szérum
Fetal bovine serum
PRF
Trombocitában gazdag fibrin
Platelet-rich fibrin
SPRF
Trombocitában gazdag fibrinből származtatott szérum
Serum-derived from platelet-rich fibrin
HPL
Humán trombocita lizátum
Human platelet lysate
1. Bevezetés Az őssejtek és a velük kapcsolatos terápiák napjaink orvostudományi kutatásainak egyik fontos területét alkotják. Ezt a tényt az indokolja, hogy a különböző típusú őssejtek képesek más és más sejtvonalbeli sejtekké differenciálódni, így a regenerációs medicina fel tudja őket használni a beteg, illetve sérült szövetek újjáépítéséhez, korrekciójához1. Használatuk azonban a sorozatos kísérletek ellenére is kérdésekkel teli, a tenyésztésüktől kezdve egészen a hatásmechanizmusukig léteznek eddig megmagyarázatlan és kérdéses jelenségek. Az egyik problémát a sejtek számának feldúsítása jelenti. Az általunk vizsgált úgynevezett MSC-k (mesenchymal stem cells), vagyis mezenchimális őssejtek a szervezetben nagyon kis mennyiségben fordulnak elő, ezért a terápiás célú alkalmazásuk során fontos, hogy egy megfelelő sejtszámot dúsítsunk fel belőlük in vitro körülmények között és ezt a megnövelt mennyiséget juttassuk el a probléma helyére2. Más módszereken alapuló technikák is igénylik ezt a lépést. A problémát tulajdonképpen az jelenti, hogy az őssejtek számára biztosítani kell a megfelelő összetételű tápközeget. Ma ez úgy történik, hogy a létfontosságú komponenseket tartalmazó, úgynevezett alapmédiumot ki kell egészíteni FBS-el (fetal bovine serum) és sokszor egy antibiotikum-keverékkel. A gondot okozó anyag tulajdonképpen az FBS, ami, mint a neve is mutatja, magzati állapotú borjú vérszérumát jelenti. Ennek a használata felvet ugyanis különböző problémákat3. Egyrészről az állati eredet miatt jelent gyenge láncszemet, mert ennek okán betegségek forrása lehet. Hogy ezt elkerüljék, a levett vérkészítmény nagyon gondos ellenőrzésen esik át, ami a termék költségeit jelentősen megemeli és továbbra sem jelent százszázalékos biztonságot. Másrészről az őssejtes kutatások népszerűsége miatt hatalmas mennyiségekre van szükség belőle, ami rengeteg borjú lemészárolását jelenti. Mivel ezek a problémák nem elhanyagolhatóak, már régóta próbálkoznak különböző kiegészítőkkel, amik helyettesíteni tudnák az FBS-t. A legjobb természetesen a szérummentes kultúra megteremtése lenne, mellőzve minden állati eredetű összetevőt, de sajnos a tudomány jelenleg állása szerint az eddig létrehozott készítmények hatása még bizonytalan. Ezeknél egyelőre jobbnak tűnnek a humán véralapú termékek4. A munkám során az SPRF (serum-derived
from
platelet-rich
fibrin)
elnevezésű
trombocitában
gazdag
fibrinkészítménnyel kísérleteztem, melynek már több publikációban is bemutatott, jótékony hatása ismeretes az őssejtekre5, azonban médium-kiegészítőként még nem foglalkoztak vele.
1
Az előnye abban is rejlik, hogy ezzel az eljárással akár a beteg saját véréből megteremthetőek lennének a dúsítás feltételei, így állati áldozatot nem igényelne továbbiakban a művelet és jelentősebb kontaminációs kockázatot sem jelent. A kísérletsorozatom célja tehát az volt, hogy különböző életkorú emberekből származó sejteket kezeljek SPRF-el és FBS-el kiegészített alapmédiumokkal, majd vizsgáljam, hogy az emberi vérkészítmény hatása összemérhető-e az állatival.
2
2. Irodalom 2.1. Őssejtterápiák A regenerációs gyógyítás napjainkban egy igen gyorsan fejlődő irányzatát jelenti a kutatásoknak. Ennek az alapja az, hogy az emberi test rendelkezik egy belső, regenerációra és javításra specializálódott rendszerrel az őssejteken keresztül, amelyek szinte az összes szövetben megtalálhatóak6. Ezen sejtek tanulmányozásának megkezdése Becker nevéhez fűződik. A kísérleteiben csontvelő eredetű sejteket fecskendezett sugárkezelt egerekbe, majd arra a megfigyelésre jutott, hogy a kezelt állatok lépében csomók keletkeztek, melyek száma arányos volt a beadott sejtek számával7. A további tanulmányozások az őssejtek két alapvető tulajdonságára hívták fel a kutatók figyelmét: önmegújulásra képesek, valamint megfelelő körülmények között különböző sejtvonalakba tudnak differenciálódni. Ezek a felfedezések tették lehetővé a szövetépítés fogalmának megteremtését. Az 1970-es években W. T. Green arra a konklúzióra jutott, hogy a biológiai tudományok segítségével lehetséges regenerálni és létrehozni új szöveteket úgy, hogy az életképes sejtekből mérnökölt állványzatokat hozunk létre8. 1993-ban Langer és Vacanti kijelentették, hogy a szövetépítés egy komplex terület, ami alkalmazza a mérnökség alapjait, hogy olyan biológiai helyettesítőket alkosson, amelyek visszaadják, fenntartják vagy javítják a szövet funkcióit 9. Látszik tehát, hogy a fogalom ugyan finomodott az évek során, de a lényege megmaradt és ezt ismerték fel tulajdonképpen az őssejteket felhasználó terápiák.
2.1.1. Az őssejtek típusai Az őssejtek két típusát különböztethetjük meg:
embrionális őssejtek (ESCs) o az első emberi ESC vonalat 1988-ban állapították meg10 o totipotens tulajdonságúak: mindhárom embrionális csíralemez sejtjeivé tudnak differenciálódni 3
o a hólyagcsíra belső sejtcsomójából származnak: ICM (inner cell mass)
beágyazódás után embriogenezis történik, amely során az ICM két különböző sejtlemezzé alakul:
hipoblaszt
epiblaszt o ez
alakul
tovább
a
három
csíralemezzé,
amelyekből képződnek a test különböző szövetei o totipotens tulajdonságuk hatalmas lehetőséget rejt, de az alkalmazás etikai kérdéseket vet fel:
embrió morális állapota
élet szentsége
Nem-embrionális őssejtek (NESCs) o hierarchiában alacsonyabb szinten állnak, mint az embrionális őssejtek
totipotens aktivitásukat ugyanis elvesztették11
nem tudnak mindhárom csíralemez sejtjeivé alakulni o más
szóval
multipotens
differenciálódási
aktivitással rendelkeznek o izolálási területüket tekintve nagyon sokfélék:
amnion folyadék12
köldökzsinór szövet13
zsírszövet14
központi idegrendszer15
csontvelő16
retina17
bőr18
o tárgyalásuknál a csontvelőből származó sejtekre szeretnék kitérni, mivel munkám során ezekkel foglalkoztam
csontvelő eredetű őssejtek (BMSCs)
potenciál, hogy kötőszövetté differenciálódjanak19
első
izolációjuk
úgy
történt,
hogy
csontvelőt
inkubáltattak műanyag edényben, majd négy óra után a nem letapadt sejteket eltávolították
4
o az
edény
mikroszkópos
vizsgálata
során
heterogén sejtpopulációkat és adherens sejteket figyeltek meg20
egy részük képes létrehozni a mezenchimát, vagyis azokat a szöveteket, amelyek az embrió mezodermájából keletkeznek: mezenchimális őssejtek (MSCs)16
2.1.1.1. Mezenchimális őssejtek A kísérleteket MSC sejttípussal végeztem a kutatás során. Ezt indokolta ezen sejtek sokszínűsége és a kutatócsoport profilja, vagyis az ortopédiai alkalmazások lehetősége. A sejtek legfőbb izolálási területeit, valamint a belőlük differenciáltatható sejtvonalakat az alábbi ábrával szeretném bemutatni1:
1. ábra Régóta megállapított tény, hogy a sorozatos megújulások a csontváz összes szövetét jellemzik. Ez tehát azt jelenti, hogy a végső állapotba került sejtek (pl. oszteoblasztok) elpusztulnak és helyükbe újonnan differenciálódottak lépnek. Ez az utánpótlás az MSC-kel
5
valósul meg, amelyek in vivo funkciója a megújítás, és pontosan ezt a tulajdonságot használja ki a terápiás alkalmazás is. Mivel a számuk igen kicsi: 100 000-500 000 sejtmagvas csontvelői sejtre körülbelül 1 darab mezenchimális jut, ezért fel kell őket dúsítani a hatékony terápiás mennyiséghez21.
2.1.2. Terápia mezenchimális őssejtekkel: múlt, jelen és jövő Az MSC-k első klinikai használata 1995-ben történt, amikor tanulmányt írtak abból, hogy 23 betegből kitenyésztettek egy adott mennyiséget és azt intravénásan visszaadagolták. A kísérlet konklúziója a következő: sikerült a sejteket in vitro dúsítani, valamint nem tapasztaltak toxikus hatást. 2013-ig összesen 338 klinikai kipróbálást írtak le22. Már a sejtekkel való korai kísérletek szakaszában rájöttek arra, hogy a tenyésztett sejtek gazdasejtbe juttatásához szükséges valamilyen hordozó, amely lokalizálja őket az érintett területhez. Kezdetben rágcsáló és kutya preklinikai modelleket állítottak fel, hogy tanulmányozzák a sejtek masszív csontjavításban való részvételét23. A kísérlet úgy nézett ki, hogy csontvelőből izolált MSC-ket növesztettek in vitro körülmények között, megfelelő tenyészőmédium segítségével, inkubátorban (37°C, 5%-os CO2 koncentráció), majd a kitenyésztett sejteket áthelyezték fibronektinnel bevont pórusos kálcium-foszfát kerámiára. Azért erre az anyagra esett a választás, mert előzőekben már felfedezett oszteokonduktív tulajdonságokkal rendelkezik és indukálja az MSC-k útját az oszteogenezis irányába24. Azt tapasztalták, hogy az MSC-k csontot képeztek a pórusokban, ennek mértéke pedig nagyobb és gyorsabb volt, mint amikor egyszerűen csak csontvelővel dolgoztak. Az így kapott őssejtes hordozót műtét útján juttatták a kísérleti állat sérült testrészébe és azt tapasztalták, hogy az beépült és javította a további gyógyulási folyamatokat. Napjainkban a terápiák fejlődése három különböző irányvonalat alakított ki:
1.) Sejtcserés terápiák o genetikai betegségeknél o mutáns sejtek cseréje allogén (nem saját) donor sejtekre
6
2.) MSC-k, mint növekedési faktorok/citokinek pumpái o szívinfarktus és stroke modellben25-26 o az 1. ábra szerint nem tudnak szív miocitákká vagy neurális elemekké alakulni
mégis javítást érnek el, de hogyan?
szekretálnak
molekulákat,
javítómechanizmusokat
és
amelyek
stimulálják
gátolják
a
a
degeneratív
jelenségeket
3.) Szövetépítési stratégiák o MSC-k egyesítése egy 3 dimenziós állványban, ezzel helyettesítve in vivo a sérült, javítandó szövetek 3 dimenziós darabjait o például porcjavítás esetén
szükség van egy fibronektin bevonatú szivacsra, melyet hialuronsavból készítenek szállító
támasztott elvárások: o elősegíti és erősíti a sejttapadást o pórusos, így a differenciált sejtek képesek bőséges és specializált extracelluláris mátrixot kialakítani benne o engedi a bioaktív molekulák hozzáférését a sejtekhez o tökéletesen beépül az új szövetbe vagy lassan felszívódik
a folyamat lépései 21:
2. ábra 7
az MSC-ket izoláció után feldúsítját Petri csészékben, majd hozzáadják a fibronektinnel bevont szállítót, hagyják a sejteket rátapadni, végül beültetik a sérülés helyére
A jövőbeli tervek természetesen arra vonatkoznak, hogy pontosan kiderítsük ezen sejtek működési mechanizmusait. Nem teljesen tisztázott például még az a terület sem, hogy melyek azok az anyagok, növekedési faktorok, amelyek kellenek ahhoz, hogy biztosítani lehessek a maximálisan hatásos és specifikus differenciálódást. További kérdés ezeknek a szükséges koncentrációja. A mechanizmus vizsgálatára kialakulóban lévő folyamat az úgynevezett sejtfestés27. Ennek az elve az, hogy egy fúziós proteint használnak festékként, amely hozzá tud kötődni és így megjelölni a protein A vagy G elnevezésű fehérjét, ami nem kovalensen a sejtmembránhoz van horgonyozva a palmitinsav által. Ez a napjainkban fejlődő, sejteket megcélzó (ún. cell-targeting) stratégiák alapja, amit MSC-kre is ki lehet terjeszteni.
2.2. Az őssejtek tápanyagigénye Mint ahogy azt az előző fejezetekben is leszögeztem, az MSC-k mennyisége az emberi szervezetben olyan kevés, hogy a terápiás alkalmazáshoz mindenképpen szükséges feldúsítani őket in vitro körülmények között. Most arra szeretnék kitérni, hogy pontosan hogyan is történik ez a folyamat. Az őssejtek izolációja során a forrást (például csontvelőt) az emberi szervezetből való elkülönítése után egy speciális tenyésztő edénybe helyezik, és növesztő médiumot tesznek rá, amely tartalmazza a sejtek növekedéséhez és differenciálódásához szükséges anyagokat. Hogy megteremtsék a megfelelő körülményeket, amelyek a sejteket eredendően körülveszik, inkubátorban tárolják őket. Ez 37°C-os hőmérsékletet és 5%-os CO2 koncentrációt jelent. A sejtek néhány nap után letapadnak az edény (általában Petri-csésze) aljára. Ez mikroszkópos vizsgálattal nyomon követhető folyamat. A tenyésztőmédium összetétele sejttípusonként eltér, nincsen olyan univerzális közeg, amely minden
őssejtnek
megfelelő
lenne.
A
következőben
szeretném
felsorolni,
általánosságban milyen anyagokra van szükség a növesztési folyamat során4:
8
hogy
Aminosavak o az úgynevezett alapmédium tartalmazza, mivel minden őssejt igényli őket
Szénhidrátok o alapmédiumban o energiaforrás o általában glükóz
Hormonok o fiziológiásan a vérkeringésben
szérum tartalmazza őket
Növekedési faktorok o szérumban o sejt proliferációjának segítése és specifikus sejtfunkciók stimulálása o a legtöbb sejttípus-specifikus
Proteáz inhibitorok o szérumban o tripszinációs folyamat inhibíciója védő hatás
Nyíróerő kivédők o szérumban o turbulencia és perfúzió okozta stressz ellen
Proteinek o szérumban o alacsony molekulatömegű komponensek szállítása, adhézió könnyítése
Vitaminok o alapmédiumban o szerep a növekedésben és a proliferációban
Glutamin o alapmédiumban o proteinek és ribonukleotidok szintézisének prekurzora
9
o légzési üzemanyag
Nyomelemek o alapmédiumban
Lipidek o néhány az alapmédiumban o szérumban is (szérum albumin szállítja őket) o energiatárolás, membránstruktúra kialakítása, transzpont- és jelölő rendszerek
Antibiotikumok o fertőzések elkerülése érdekében o sokszor negatív befolyás
Ezek alapján a tenyésztőmédium a következő összetevőkből áll: 1
3. ábra F
Mint a fentiekből látható, a tenyésztőmédium szérum komponense rengeteg fontos anyagot tartalmaz a sejtek számára.
1
Forrás: http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/
10
Funkciói összefoglalva28:
biztosítania kell o hormonális
faktorokat,
amik
stimulálják
a
sejtnövekedést
és
proliferációt, valamint előremozdítják a differenciálódást o transzport proteineket, amelyek szállítják a hormonokat, ásványokat és lipideket o lehorgonyzó és kiterjesztő faktorokat o stabilizáló és detoxikáló faktorokat
pH biztosítás, proteáz inhíbiálás
A tenyésztőmédium fejlesztése során az FBS, vagyis a magzati szarvasmarha szérum vált a legígéretesebb kiegészítővé, így jó eredményei alapján ez terjedt el legszélesebb körben. Használata azonban ellentmondásos.
2.2.1. Problémák az FBS használatával A problémákat kétféle módon lehet megközelíteni. Egyrészről beszélhetünk tudományos oldalról, ami az FBS állati eredetéből fakad. Ebből kiindulva ugyanis az összetétele erősen variábilis, sokszor magas az endotoxin-tartalma, immunválaszt válthat ki, máig nem azonosított komponenseket tartalmaz28 és könnyen mikrobiológiai fertőzések forrása lehet. Utóbbi miatt az összegyűjtött szérum komoly ellenőrzési procedúrán megy keresztül, ami a végtermék árát jelentősen megnöveli. A másik problémát az etikusság kérdése jelenti. Mivel az FBS a legelterjedtebb kiegészítő az in vitro eukarióta kultúrák körében, ezért nagy mennyiségekben kell előállítani. Ez a szám évi körülbelül 500 000 liter, amihez több mint egy millió borjút kell leölni3. Ez rengeteg állati áldozatot jelent és a mennyiség az in vitro módszerek (mint klónozás, genetikai módosítások) alkalmazásának fejlődése miatt növekedni fog az elkövetkező években. Fontos tehát a magzati borjú jóléte a vérvétel során, hiszen felmerül a fötális tudatosság kérdése29.
11
A magzati vér gyűjtése különböző hús-előállítási folyamatok során történik, miután a méhet eltávolították a kizsigerelés fázisában a leölt tehénből. A készítés további lépéseit az alábbi ábra mutatja30:
4. ábra
A fötális tudatosság lehetőségéről a vélemények megosztottak. Ha az állatnak már kialakult a tudata (agyi érettség), akkor az azt jelenti, hogy érez fájdalmat, képes szenvedni. Kísérletes módon sikerült kimutatni, hogy a magzat reagál a fájdalmas stimulációkra a vemhesség késői stádiumában31. Mivel a vérvétel is ebbe az időszakba esik (nagyobb magzattöbb vér) ezért különböző előírások születtek arra, hogy megelőzzék az állatok szenvedését. Mindemellett a biomedicinában kedvelt módszer az állatok lecserélése, érvényesül a 3R (replace, reduce, refine) elve, vagyis a lecserélés, csökkentés és javítás32. Ezért 2003-ban szerveztek egy konferenciát, annak megvitatására, hogyan lehetne csökkenteni az FBS használatát és korlátozni-, vagy megszüntetni az élő, még meg nem született borjúk szenvedését28. 2009-ben Dániában ültek össze újra, ahol bemutatták, hogy lehetséges lehet állati termékek nélkül sejteket növeszteni. A kísérleteknek két irányvonala ismert:
Emberi helyettesítők keresése
Szérum-mentes kultúrák kifejlesztése
12
2.2.1.1. Humán alternatívák Az emberi vérből készült helyettesítők sok problémát ki tudnának küszöbölni, de néhány kellemetlenség továbbra is fennáll az alkalmazásukkor.
Előnyök: o
nincs állati eredetű vírusveszély
o
akár a beteg saját véréből is elő lehet állítani a szükséges mennyiséget
nincs immunológiai probléma, megbetegítés veszélye
o több kipróbált készítmény hatása összemérhető-, vagy akár jobb is volt, mint az FBS-é
Hátrányok: o
továbbra sem precízen definiált összetevők
o
immunreakció ritkán, de előfordulhat
o
humán betegségeket hordozhat
Az emberi alternatívák magas trombocita-tartalommal rendelkező vérkészítmények. Ezt azért érdemes kiemelni, mert régóta ismert tény, hogy a trombociták, vagy más néven vérlemezkék nagyon jó növekedési faktor-források. Ezt a trombocita gélek klinikai tanulmányokban való vizsgálata során állapították meg, amikor is azt tapasztalták, hogy csökkentik a műtétekkel járó duzzadást és fájdalmat33, gyorsítják a lágyszövet helyreállítását34 és növelik a csontsejtek regenerációját35. Ennek a magyarázata az, hogy a vérlemezkék szekretálnak egyfelől kemotaxisért és az extracelluláris mátrix alakulásáért felelős faktorokat, mint a PDGF (platelet-derived growth factor) és TGFβ-1 (transforming growth factor β-1)36. A faktorok másik csoportja a hemosztázist, proliferációt és a sebgyógyulás újraalakulásos fázisát segíti elő: FGF (fibroblast growth factor)37, IGF (insulin-like growth factor)38, EGF (epidermal growth factor)39 és VEGF (vascular endothelial growth factor)40. A fent említett tulajdonságokból következtethetünk arra, hogy az emberi vérkészítmények alkalmasak lehetnek az FBS helyettesítésére. A továbbiakban kettő alternatívát szeretnék kiemeltem tárgyalni. A hPL-el, vagyis a humán trombocita lizátummal 2005-ben foglalkoztak először és különböző kísérletekben nagyon hatásosnak bizonyult. Ennek hátterében az előbb felsorolt,
13
trombociták által szekretált citokinek, növekedési faktorok állnak. Ezt a készítményt PRP-ből, vagyis trombocita-gazdag vérplazmából állítják elő, a következő lépésekben30:
5. ábra
A másik készítmény a PRF (platelet-rich fibrin), vagyis trombocitában gazdag fibrin, amely nevéből az látszik, hogy itt a vérlemezkék kedvező tulajdonsága mellett a fibrin is jelen van, ami nem más, mint a fibrinogén aktivált alakja41. Utóbbi egy oldható molekula, amely állandóan jelent van mind a vérplazmában, mind a trombociták α-granuláiban. Szerepe a vérlemezke-aggregáció a hemosztázis alatt, amikor is oldhatatlan fibrinné alakul. A PRF tulajdonképpen egy természetes fibrin mátrix, első fejlesztése Franciaországban történt, szájsebészeti alkalmazásban42. Sok kísérlet történt az őssejtekkel való kapcsolatának kiderítésére is és azt tapasztalták, hogy elősegítette azok proliferációját és migrációját 43. A fibrin továbbá az angiogenezis, vagyis az új vérerek alakulásának természetes támogatója, valamint elősegíti a sebgyógyulást az epithel sejtek és a fibroblasztok mechanizmusának vezérlése által44. Összefoglalva tehát rengeteg előnyös tulajdonsággal rendelkezik és az előállítása is igen egyszerű45:
14
6. ábra
A PRF izolációnál a vért alvadásgátlót nem tartalmazó vérvételi csőbe kell levenni, majd megfelelő időtartamú és fordulatszámú centrifugálás után azt tapasztaljuk, hogy a vér 3 különböző frakcióra válik szét: egy alsó, vörösvérsejteket tartalmazó (RBC, red blood cell)-; egy felső, trombocitában szegény plazmát tartalmazó (PPP, platelet-poor plasma)- és a közöttük elhelyezkedő, kocsonyás részre, ami nem más, mint a PRF. Mint az felső ábra jobb oldali képe is mutatja, ez csipesszel megfogható és kihúzható a csőből, ami megkönnyíti az izolálását. Médium-kiegészítőként még nem tesztelték ugyan a kocsonyás állaga miatt, de mivel az előbb említett, előnyös tulajdonságokkal rendelkezik, ezért a kipróbálása mindenképpen indokolt. Jelen dolgozatom célja a kinyomkodása utána kapott ún. SPRF (serum from platelet-rich fibrin) vizsgálata, mint támogató-komponens.
2.2.1.2. Szérum-mentes médiumok
Természetesen a legjobb megoldást az a tenyésztőmédium jelentené, amely nem tartalmaz semmilyen emberi, vagy állati eredetű összetevőt, de ennek a kifejlesztése még nem teljesen megoldott. Néhány cég ugyan már árul használatra kész termékeket, de ezek továbbra is tartalmaznak állati eredetű fehérjéket. Ha ezektől is meg tudnánk szabadítani a médiumot, akkor beszélhetnénk kémiailag definiált szérum-mentes médiumról46. Ennek a megvalósítása érdekében rekombináns technológiával hoznák létre a kívánt növekedési faktorokat, de ez az eljárás igen drága. Az új terméknek a következő kritériumoknak kell továbbá megfelelni:
könnyen elérhető
standardizált összetevők
tripszin-kompatibilitás
regisztrált összetevők
Vannak továbbá köztes technikák is, amelyek a sejttenyésztés elején még teljesen mértékben FBS-es médiumot használnak, majd szépen fokozatosan, mintegy hozzászoktatják a sejteket a szérum-mentes tápoldathoz4. Az eddig piacra hozott médiumoknak létezik egy adatbázisa is, ahol körülbelül 450 különböző termék
található,
ám
a
hatásosságukról
rendelkezésünkre47.
15
egyelőre
szűkös
információk
állnak
3. Kísérletek és módszerek
3.1. Ötlet a kísérletek megvalósítására A kísérleteink célja az volt, hogy egy olyan vérkészítményt teszteljünk médiumkiegészítőként, amivel az irodalmak ilyen megközelítésben még nem foglalkoztak. Ez nem volt más, mint az SPRF vagyis trombocitában gazdag fibrinből nyert szérum, ami a kutatócsoport saját fejlesztése. A készítmény tulajdonképpen a PRF származéka, ugyanis az előállításából kapott zselés állagú enyvet egy tálcában kinyomkodjuk és így folyékony halmazállapotú termékhez jutunk, amely megkönnyíti a vele kapcsolatos további munkákat. Ez teszi lehetővé azt is, hogy kiegészítsük vele a sejttenyésztő-médiumot. Mint ahogy arra az irodalmi áttekintésben is kitértem, a PRF-nek bizonyítottan nagyon előnyös tulajdonságai ismeretesek az őssejtek feldúsítására, így ezek alapján az SPRF nagyon jó anyagnak tűnik. A kiindulási gondolat az volt, hogy a vérkészítmények azért alkalmasak megfelelő támogató anyagnak, mert akár a beteg saját véréből is elkészíthetőek, így nem igényelnek sem állati áldozatot, sem pedig drága technológiákat. Ez viszont felveti azt a kérdést, hogy a donor kora nem befolyásolja-e egyrészt az őssejtjei, másrészt a vérszérumának lehetőségeit a hatékony gyógyításra. A humán trombocita lizátum kapcsán leírtak ugyanis egy olyan megfigyelést, hogy ennek a stimulációs hatása az MSC-kre korfüggő, ám a pontos mechanizmus még nem teljesen tisztázott48. Másrészről arról sem szabad megfeledkezni, hogy az idő előrehaladtával mind az MSC-k száma, mind pedig az aktivitásuk csökkenni kezd49. Hogy ezt a két hatást vizsgálni tudjuk fiatal és idősebb donoroktól is tenyésztettünk őssejteket és mindkét korcsoportú sejteket kezeltünk idős és fiatal donortól származó SPRF-et tartalmazó médiumokkal. Azért, hogy ezek hatása összemérhető lehessen az FBS-ével, mindkét sejttípushoz tartozott egy-egy kontroll (FBS-t tartalmazó) médiumot kapó kategória is. Mindkét támogatóanyagot 10%-os koncentrációban alkalmaztuk. A mérések úgy zajlottak, hogy a két csoport sejtjeit 24-lyukú tálcákon, hét napig növesztettem az adott médiumokban és mindegyik nap mértem a sejtek életképességét MTT esszé segítségével. Az adatokat végül összesítettem és kiértékeltem.
16
3.2. Sejtkultúra fenntartása A munkám során HBMSC-kel, azaz humán származású, csontvelő-eredetű mezenchimális őssejtekkel foglalkoztam. A sejtekkel kapcsolatos tevékenységek fontos alapköve a steril körülmények biztosítása, hiszen a levegőben szennyeződések és spórák találhatóak, melyek negatívan befolyásolhatják a sejtek életét és így a kísérletek kimenetelét.
3.2.1. Őssejtek általános ellátása Az őssejteket ideális összetételű őssejtmédiumot tartalmazó Petri csészékben inkubáltattam a növesztési folyamat során. Az inkubáció 37°C-on, 5%-os CO2 koncentráció mellett történt. Az MSC-ket mikroszkóp alatt vizsgálva nyúlványosan letapadt sejteket figyelhetünk meg, melyek a csésze alján egy monolayert alkotnak50:
7. ábra
A sejtekkel kapcsolatosan 3 rutinművelet különböztethető meg51.
Etetés o őssejtek friss médiummal való ellátása
17
o a sejtek növekedése során a tápközegből a szükséges faktorok elfogynak, így ezeket pótolni kell
Szétosztás o más néven passzálás o akkor végezzük, amikor a sejtek száma a kultúrában túlnövi a csésze kapacitását
Fagyasztás o sejtekkel való munka ideiglenes felfüggesztése
A feladataim során az első két műveletet láttam el.
3.2.1.1. Őssejt médium készítése, sejtek táplálása Az etetésnél az első feladat a megfelelő őssejt médium elkészítése volt. Az ehhez szükséges anyagok:
1 db 500 ml DMEM (with 1 g/l glucose, with L-glutamine) médium o 1g/l glükóz tartalommal o alapmédium, amelyet még ki kell egészíteni további szükséges anyagokkal
50 ml FBS (Fetal Bovine Serum) o fontos növekedési faktorokat tartalmaz o 10%-os koncentrációban tartalmazza a tenyésztőmédium
5 ml PEST (Penicillin-Streptomycin) o antibiotikumkeverék
Penicillin: 100 U/ml
Streptomycin: 100 µg/ml
o 1%-os koncentrációban tartalmazza a tenyésztőmédium A hőérzékeny összetevők miatt a médiumot +4°C-on, a szérumot és az antibiotikum keveréket pedig -20°C-on tároljuk. Az elkészítés menete a következő: az összetevőket felmelegítettem vízfürdőben, az alapmédium felbontása után abból 50 ml-t kipipettáztam, majd helyette 50 ml FBS-t és 5 ml PEST-t tettem bele. Az így elkészült őssejt médiumot az előbb leírtak alapján, előzetes feliratozás után a +4°C-os hűtőszekrénybe raktam.
18
A sejtek etetése előtt fontos, hogy a médiumot vízfürdőben felmelegítsük 37°C-ra, hiszen ez a sejtek számára ideális hőfok, ennél alacsonyabb hőmérsékletű anyaggal sokkolnánk őket, ami negatívan befolyásolná a növekedésüket. A sejtek táplálása heti háromszor történik. Az elhasznált médiumot biológiai fülke alatt kell kicserélni, ami egy olyan berendezés, amely a bejáratánál laminárisan felfelé levegőt áramoltat, ezzel elválasztja egymástól a fülke belső terét a környezettől és így segíti a kontamináció-mentes munkát. A sejteken lévő elhasznált oldatot pipettor segítségével távolítottam el és szintén ezzel helyeztem rájuk 8-10 ml friss médiumot.
3.2.1.2. Passzálás A passzálás lényege az, hogy ha a sejtek benövik a csésze alját, akkor szét kell őket oszlatni több másik csészébe, különben egy idő után a túl nagy szám miatt pusztulni kezdenek, vagy nem kedvező sejtvonalakba differenciálódnak. A folyamat első lépésében fülke alatt eltávolítottam a sejtekről a médiumot és mostam őket kétszer 5 ml PBS-el (phosphate buffered saline), ami egy fiziológiás oldat. Mivel a HBMSC-k a csésze aljára vannak letapadva, ezért a következő lépésben fel kell őket szedni onnan, ami egy tripszin nevű fehérjebontó enzim segítségével történik. Ez a sejtek letapadó nyúlványait kezdi el emészteni, ennek következtében pedig a HBMSC-k oldatba kerülnek. A PBS eltávolítása után tehát 1 ml, 10%-os töménységű tripszint pipettáztam az adott csészébe, amit ezután inkubátorba helyeztem azért, mert az enzim működésének ideális hőmérséklete 37°C. Az edényt ezután 2 percenként mikroszkóp alatt vizsgálva figyeltem a sejteket. Körülbelül 4-5 perc után azt tapasztaltam, hogy a sejtek túlnyomó többsége felgömbölyödve úszik az enzimes oldatban, tehát a folyamat leállítható. Ez 6 ml őssejt médiummal, mint szubsztrát-felesleggel történik. A leállítást követően a csésze tartalmát centrifugacsőbe pipettáztam és centrifugáltam 6 percig 1400 rpm fordulatszámon. Ezután a csőből leöntöttem a felülúszót és a letapadt sejthalmazt kiegészítettem 1 ml-re őssejt médiummal, majd szuszpendáltam az oldatot. Közben 2-3 Petri csészét előkészítettem (feliratozás, 10 ml őssejt médiummal való feltöltés) és a cső tartalmát eloszlatva megfelelő részletekbe, a sejtes oldatot beléjük pipettáztam. Ezután a csészéket az inkubátorba helyeztem és az etetésüket a fentebb ismertetett módon végeztem.
19
3.2. Vérkészítmény tesztelése idős és fiatal donorból származő őssejtvonalakon A fenti pontokban említett tevékenységek tehát az őssejtek általános ellátásával kapcsolatosak. Ezeket a műveleteket végeztem a dúsítási folyamat közben is. A sejteket a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikától kaptuk, csontvelő formájában. Ezt közvetlenül a műtét után a laborba vittük és ott Petri csészékbe helyeztük, majd őssejt-médiumban inkubáltattuk. Kétnaponta ezeket is etetni, valamint mosni kellett, egészen addig, amíg a csésze alját szépen be nem nőtték a sejtek. Hogy a sejtszám biztosan elegendő legyen, ezért passzáltam mind az idős, mind a fiatal donortól származó sejtvonalat. Az egyszerűség kedvéért innentől szeretnék úgy hivatkozni rájuk, hogy idős, illetve fiatal őssejtek, habár ez az elnevezés így pontatlan, de a használat szempontjából praktikus. A kísérleteket végül P2-es fiatal, valamint P3-as idős sejtekkel végeztem el. Hat darab 24-lyukú tálcára volt szükségem, hiszen kétféle őssejtünk van (idős-fiatal), melyeket három-három különböző médiummal kezeltem, összefoglalva tehát:
Kontroll médiumos kezelés
3 db fiatal sejtes tálca
Fiatal SPRF-es kezelés
Idős SPRF-es kezelés
6 db 24-lyukú tálca Kontroll médiumos kezelés
3 db idős sejtes tálca
Fiatal SPRF-es kezelés
Idős SPRF-es kezelés 8. ábra
A kísérletek eredetileg úgy zajlottak volna, hogy 10.000 sejtet teszek mindegyik használni kívánt lyukba és egy napig hagyom a sejteket letapadni. Másnap, a kísérleti időben vett 1. napon mindegyik tálcáról megmértem volna 3 darab lyukat, amelyek az MTT esszé hatására
20
elvesztik az életképességüket, így ezekkel többet nem kell foglalkozni. A mérések mindennap, médiumcserék pedig minden másnap történtek volna, tehát a 2. napon van esszé és csere is, a többi napon pedig ennek megfelelően. A könnyebb vizualizáció kedvéért egy időskálán is bemutatom az elképzelést:
9. ábra
Ezen a protokollon végül sejthiány miatt változtatni kellett egy kicsit.
3.2.1. Tenyésztőmédiumok elkészítése Az elkészítéshez először ki kellett számolni, hogy mekkora térfogatú médiumokra van szükség készítményenként. A számolást a fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiummal szeretném bemutatni, a másik vérkészítményből ugyanennyire volt szükség. Két olyan 24-lyukú tálcánk volt, amelyikhez fiatal donortól származó SPRF-es médiumot kell adni: egy fiatal őssejtes és egy idős őssejtes csoport. Hét napi mérésünk van, 3 lyuk/mérési alkalom felbontásban, és egy lyukba 1 ml médium kerül, tehát csak a feltöltésre kell 2x7x3 ml, azaz 42 ml. Nem szabad megfeledkezni továbbá a médimcserékről sem, amelyek kétnaponta történnek. Mivel a már lemért lyukakban a sejteket az életképességet mérő eljárás elpusztítja, azokkal már nem kell számolni, így az első cserénél (2. nap) 2x15 ml kell, a 4. napon 2x9 ml, az 6. egyben utolsó cserés napon már csak 2x3 ml. Ez összesen 52 ml. Összefoglalva: 2(tálca) x 7(mérési nap) x 3(lyuk/mérés)ml + 54 ml (médiumcsere) = 96 ml tenyésztőmédium
21
Mivel úgy gondoltuk, hogy inkább ráhagyással, de természetesen az arányok megtartásával fogunk dolgozni (10% szérum, 1% antibiotikum), ezért a végső tenyésztőmédium-összetétel a következőképpen alakult:
100 ml alapmédium
11,1 ml SPRF
1,11 ml PEST
A vérkészítmények elkészítésének első lépése véradó donorok keresése volt. A kritériumunk az volt, hogy az idős donor legyen 60 év feletti, a fiatal pedig 25 alatti, egészséges ember. Miután találtunk megfelelő jelentkezőket, behívtuk őket vérvételre. Általánosságban az igaz, hogy 1 fiolányi (6ml) vérből körülbelül 1 ml SPRF nyerhető, ezért mindkét donorunktól 1111 fiola vért vettünk le alvadásgátlót nem tartalmazó csövekbe és ezeket gyorsan (hogy ne induljon meg az alvadás) lecentrifugáltam 5 percig 3000 rpm fordulaton. Miután ez megtörtént, a keletkezett fibrin csomót kihúztam mindegyik csőből és attól függően, hogy az idős, vagy a fiatal donor véréből készült, két külön csészébe tettem, majd kinyomkodtam a tartalmukat. Ezután feliratoztam két darab zárható, 0.5 literes üvegedényt, majd mindkettőbe belepipettáztam 100-100 ml alapmédiumot és a megfelelő SPRF-ből 11,1-11,1 ml-t, végül pedig az antibiotikumot. Kontroll médiumot külön nem készítettünk, hiszen ez megegyezik az általános sejttenyésztő médiummal, ami mindig rendelkezésünkre állt a sejtek táplálása miatt. A két edényt a használatuk után mindig hűtőszekrénybe tettem +4°C-ra, ahol a legjobb az eltarthatóságuk.
3.2.2. Sejtek számlálása és tálcára tétele A következő művelet a sejtek tálcára való kitétele volt. Mint azt illusztráltam is, sejtvonalanként 3-3 tálcát használtam. Az elgondolás az volt, hogy a legmegfelelőbb sejtszám 10.000 sejt/lyuk lesz, arra alapozva, hogy ez a szám nem fogja még teljesen benőni a rendelkezésre álló terek a 7. napra, ezért elviekben azt fogjuk tapasztalni, hogy a sejtszám szép fokozatosan, de reményeink szerint médiumoktól eltérő mértékben nő.
22
A következő kérdés tehát az, hogy hány darab sejtre van szükségünk sejtvonalanként. 3-3 csészére tesszük ki a sejteket, csészénként 21 lyukat használva (7 mérés x 3 lyuk/mérés), tehát típusonként 3x21x10.000 sejtre van szükségünk, ami 630.000 sejt/vonal. A sejtszám meghatározása tulajdonképpen a passzálás egy későbbi lépésében történik, amikor a lecentrifugált sejtes oldat felülúszóját leöntve a letapadt sejtcsomót ki kell egészíteni 1 ml-re őssejt médiummal. A számlálást Bürker kamrával végeztem, ami a számlálókamrák csoportjába tartozik. Ezek tulajdonképpen különlegesen kiképzett tárgylemezek. Az általunk használt egy vastag üveglemezből és egy vékonyabb fedőlemezből állt, amelyeket egymásra helyezve, a közöttük lévő rés pontosan 0,1 mm vastagságú. Az üveglemezen ismert távolságú beosztások találhatóak, így ezek ismeretében kiszámolhatóvá válik az adott térfogategységben lévő sejtek száma. A műveletet úgy végeztem el, hogy a sejteket tartalmazó oldatból kipipettáztam 10 μl-t egy eppendorf csőbe, majd kiegészítettem 10 μl tripán-kék festékkel, melynek segítségével a sejtek
a
mikroszkóp alatt
jól
láthatóvá
válnak.
Az
így kapott
keveréket
jól
összeszuszpendáltam és 10 μl-t egyenletesen a fedőlemez alá fecskendeztem. A festék rögtön megfesti a sejteket, így a mikroszkópos vizsgálat azonnal kezdhető. A nagyított kamrára nézve négyzetes hálózatot figyelhetünk meg. A feladat az, hogy két egymás követő sorba és további egy négyzetben megszámoljuk a sejteket. Ezt a műveletet a tárgylemez másik két helyén is elvégezzük. Az így kapott három számnak vesszük az átlagát, és ha ezt a számot a hígítás és a kamraparaméterek függvényében megszorozzuk 20 000-el, akkor megkapjuk, hogy mennyi sejtünk van az elkészített 1 ml oldatban és így kiszámolhatóvá válik, hogy az általunk szükséges mennyiség mekkora térfogatban van jelen.
23
A fiatal sejteket felszedve és megszámolva már egy Petri csészében megvolt az elegendő mennyiség, szám szerint 640.000 sejt. Ez volt benne 1000 µl sejtszuszpenzióban, tehát egyszerű aránypárral számolva azt kaptam, hogy a kívánt 10.000 sejt 15,6 µl oldatban lesz jelen. Ennek megfelelően a 3x21 lyukat feltöltöttem 1-1 ml fiatal SPRF-et tartalmazó médiummal és ebbe pipettáztam bele lyukanként 15,6 µl-t a sejtoldatos centrifugacsőből. A fiatal sejteket tartalmazó 3 csoport tehát a következőképpen nézett ki:
Fiatal donortól származó MSC-k Fiatal SPRF-es médium
Öreg SPRF-es médium
1. nap
1. nap
1. nap
2. nap
2. nap
2. Nap
1. nap
1. nap
1. nap
2. nap
2. nap
2. Nap
3. nap
3. nap
3.nap
4. nap
4. nap
4. Nap
3. nap
3. nap
3.nap
4. nap
4. nap
4. Nap
5. nap
5. nap
5. nap
6. nap
6. nap
6. Nap
5. nap
5. nap
5. nap
6. nap
6. nap
6. Nap
7. nap
7. nap
7. nap
7. nap
7. nap
7. nap
Kontroll médium 1. nap
1. nap
1. nap
2. nap
2. nap
2. Nap
3. nap
3. nap
3.nap
4. nap
4. nap
4. Nap
5. nap
5. nap
5. nap
6. nap
6. nap
6. Nap
7. nap
7. nap
7. nap
10. ábra
24
Az idős sejteknél sajnos nem tapasztaltam ilyen nagy mennyiségeket, ami valószínűleg azzal magyarázható, hogy korral ezek aktivitása és proliferációs képessége csökkent. Az összes Petri csészét felhasználva is csak 260.000 sejtet kaptam, ezért itt módosítani kellett a kísérleti protokollon. Úgy gondoltuk, hogy csak 2 lyukat vizsgálunk egy tálcáról mérésenként és ezeket nem naponta, hanem csak minden másnap mérjük. Tehát ebből végső soron az jött ki, hogy egy tálcán csak 8 lyukat használtunk. Habár ez rontotta a mérésünk megbízhatóságát, ennek ellenére úgy gondoltuk, hogy valamennyi használható információval így is gazdagabbak leszünk a kísérlet során. Így tehát a tálcák elrendezése a következő:
Idős donortól származó MSC-k Fiatal SPRF-es médium 1. nap
1. nap
7. nap
7. nap
3. nap
3. nap
Öreg SPRF-es médium
5. nap
5. nap
1. nap
1. nap
7. nap
7. nap
3. nap
3. nap
5. nap
5. nap
Kontroll médium 1. nap
1. nap
7. nap
7. nap
3. nap
3. nap
5. nap
5. nap
11. ábra
3.2.3. Az életképesség mérése Az MTT esszé egy olyan elemzési forma, amely jelen kísérletben arra szolgált, hogy a különböző médiumokkal kezelt sejtcsoportokban megadja az élő sejtek mennyiségét. A mérés egy tetrazónium són, pontosabban a halványsárga 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromidon alapszik, amit szubsztrátként az élő sejtek mitokondriális enzimei át tudnak 25
alakítani sötétkék formazánná52. Mivel ez kristály állapotú, ezért oldatba kell vinni, amihez izopropanolt használnak53. A keletkezett formazán mennyisége pedig széles határok között egyenesen arányos az élő sejtszámmal. Ez az elemzés az életképesség mellett alkalmas a proliferáció és az aktiváció mérésére is54. Az MTT oldatot előzetesen készítjük el úgy, hogy a koncentrációja 5 mg/ml legyen. Az MTT sót tartalmazó üvegcséből tehát analitikai mérlegen kimértem 0,05 g-ot és ehhez a mennyiséghez 10 ml PBS-t pipettáztam. Az oldatot vortex segítségével homogenizáltam, majd 1-1 ml-es részletekben pipettáztam szét eppendorf csövekbe, melyeket ezután a -20°Cos mélyhűtőbe helyeztem. A kísérlet során az elemzési lépés úgy történt, hogy az adott mérési napokon elkészítettem az esszéhez szükséges oldatot aszerint, hogy az MTT: őssejt médium aránynak 1: 9-nek kell lennie. Például a 3. mérési napon, amikor mértem 3 fiatal őssejtes tálcáról 3-3 lyukat és 3 idős őssejtesről 2-2-t, összesen 3x3+3x2 ml, azaz 15 ml MTT esszére volt szükségem. Az aránynak megfelelően 1500 µl MTT oldatot pipettáztam 13 500 µl őssejt-médiumban. Ehhez kontrollmédiumot használtam, nem foglalkoztam azzal, hogy a megfelelő SPRF-et tartalmazó legyen, mert úgy gondoltam, hogy ez plusz információt nem adna a kísérlethez és így kevesebb vért is elegendő volt venni a donoroktól. A mérni kívánt lyukakból ezután eltávolítottam a médiumokat, majd a helyükbe 1-1 ml MTT esszét tettem. Mivel az enzimes reakció 37°C-on valósul meg és a tálca többi részén még érzékeny, növeszteni kívánt sejtek vannak, amelyek nem bírják a tartós szobahőmérsékletet, ezért a tálcákat 1 órára inkubátorba helyeztem. Az 1 óra letelte után az oldatot kipipettáztam a lyukakból és helyette 1-1 ml izopropanolt helyeztem beléjük, majd további egy óráig inkubáltattam őket. Ezután spektrofotométer segítségével mértem az egyes lyukak abszorbanciáját 2 hullámhosszon: 570 és 690 nm-en. Utóbbin azért, hogy a háttér zavarásából adódó hiba kiküszöbölődjön.
26
4. Eredmények és értékelésük A sejtéletképesség méréséből származó eredményeket a kísérlet lezajlása után összegyűjtöttük és kiértékeltük a GraphPad nevű program segítségével. Az eredményeket a következő, kapott ábrákon szeretném bemutatni.
abszorbancia
4.1. A médiumok hatása fiatal donorból izolált sejtekre
Eredmények elemzése a fiatal sejtes csoportoknál:
Sejtszám növekedés helyett az életképesség csökkenést tapasztaltuk
Ennek ellenére a fiatal SPRF szinte végig felülmúlta a többit
Az idős donor SPRF-ével kiegészített médium általánosságban szintén jobbnak bizonyult a kontroll médiuménál o Ahol nem teljesített jobban, ott is összemérhető volt a hatása az FBS-tartalmú médiummal
27
Az előző három pontbeli megfigyelésnek ellentmond a 6. nap, amikor a kontroll médiumban mértük a legjobb életképességet és meglepő módon a fiatal SPRF-ben a legrosszabbat
4.2. A médiumok hatása idős donorból izolált sejtekre
Eredmények elemzése az idős sejtes csoporoknál:
Itt szintén folyamatos sejtszám-csökkenést tapasztaltam
A fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médium mind a négy mérési napon jobb eredményt hozott a másik kettőnél
Az idős SPRF az esetek felében nyújtott rosszabb teljesítményt a kontrollnál, de ezeknél sem igazán számottevő mértékben
28
4.3. Az eredmények értékelése Természetesen az, hogy mindkét csoportnál fokozatos sejtpusztulást figyeltünk meg, nem jó. Ennek sokféle oka lehet. Az egyik felmerülő gondolat az, hogy nem volt megfelelő a kiinduláshoz használt sejtszám (10.000 sejt/lyuk), ezért a sejtek tulajdonképpen már az első napon telenőtték a csésze alját és ezután helyhiány miatt pusztulni kezdtek. Másrészről az is előfordulhat, hogy kontamináció lépett fel az inkubátorban, ami megfertőzte a vizsgált sejteket is. Sajnos ebben az időszakban többször tapasztaltunk hasonlókat egyéb sejttenyészetekben is. A harmadik lehetséges magyarázat az, hogy az MTT esszé hatására kezdtek el pusztulni a sejtek, esetleg az egy órás izopropanolos inkubálás során az elpárolgó propanol beleoldódott a mérésre még nem került lyukakba. Mindenesetre az mindenképpen pozitív eredmény, hogy a kontroll médiumnál is tapasztaltam az életképesség-csökkenést, ráadásul általában jóval nagyobb mértékben, mint az SPRF-et tartalmazó médiumoknál. Mint az várható volt, a legjobb teljesítményt a fiatal donorból származó SPRF-et tartalmzó médium produkálta mindkét sejtcsoportnál. Tehát beigazolódni látszik az a lehetőség, hogy a vérben a különböző növekedési faktorok és más őssejteket segítő molekulák száma, illetve aktivitása a korral valamilyen mértékben csökkent. Az látszik továbbá az eredményekből, hogy a két őssejtcsoport életképessége egészen más értékekről indult. Míg a fiatal sejteknél a maximális abszorbancia mindössze 0.065 volt, addig az öregnél körülbelül 0.125. A kísérlet tehát nem igazolta azt, hogy az idősebb emberekből származó őssejtek proliferációja rosszabb lenne a fiatalokénál, sőt, ezzel ellentétes hatást mutatott.
29
5. A folytatás
Mivel a kísérleti eredményeink folyamatos sejtszámcsökkenést mutattak be növekedés helyett, ezért ezt a méréssorozatot mindenképpen meg kell ismételni. A kapott adatok azonban azt mutatják, hogy ez nagyon jó kiindulási pont lehet egy új tenyésztőközeg fejlesztéséhez, hiszen az SPRF-es médiumok többségben felülmúlták a kontrollt és a legrosszabb esetben is ahhoz nagyon közeli értéket mutattak. Amit el kell végezni egy következő sorozat előtt, az egy arra irányuló kontrollkísérlet, hogy pontosan mennyi sejtre van szükség egy lyukban, mert a használt mennyiség (10.000 sejt) felvetett kérdéseket a kimenettel kapcsolatban. Érdemes lenne tehát egy olyan kísérletet csinálni, amelyben különböző mennyiségű sejteket teszünk ki 1-1 tálcára és rájuk a megszokott tenyésztőmédiumot téve vizsgáljuk egy hétig minden nap a sejtek mennyiségét. Az is könnyen előfordulhat, hogy nem is szükséges ilyen hosszú időtartamig vizsgálni a sejtek alakulását, hiszen a rendelkezésükre álló felület olyan kicsi, hogy még nagyon kevés sejt is gyorsan benövi. Ha ennél az ideális-sejtszám meghatározó kísérletnél is azt tapasztaljuk, hogy az összes tálcában csökken az idő függvényében a sejtek száma, akkor az azt jelenti, hogy az életképesség meghatározására használt MTT elemzési eljárás károsan befolyásolja a mérés alá még nem vetett sejtek életét. Ezt úgy tudjuk majd kiküszöbölni, ha a különböző mérési csoportokat különböző tálcákon kezeljük. Habár ez feleslegesen sok eszközt jelent (hiszen így egy 24-lyukú tálcáról csak 3 lyukat használunk ki), de teljesen megóvja a többi sejtet a módszer negatív befolyásolásától.
30
6. Összefoglalás
A TDK dolgozatom célja az volt, hogy keressek egy megfelelő alternatívát napjaink legelterjedtebb őssejtmédium-kiegészítője, az FBS helyett. Erre azért van szükség, mert a használatát a tudomány erősen vitatja. Egyrészt az állati eredetéből adódóan potenciális fertőzések forrása lehet, valamint mivel az összetétele változékony, így a kísérletek kimenetelét is különféleképpen befolyásolhatja. A másik problémacsoport szintén a származásából ered, méghozzá azért, mert az előállítása rengeteg állat életébe kerül. Az általam vizsgált anyag egy emberi vérkészítmény, az SPRF volt. Erre azért esett a választás, mert a géles formáját, a PRF-et már nagyon sok tanulmány bemutatta, mint potenciális forrás az őssejtek növekedéséhez, osztódásához. A másik nagyon pozitív érv mellette az, hogy őssejterápiáknál a beteg saját véréből elő lehetne állítani egy megfelelő közeget, hogy az előzetesen kinyert sejtmennyiséget feldúsítsuk a terápiás mennyiségre, ami ezután visszaültethető lenne. A kísérletsorozat úgy zajlott, hogy idős és fiatal donortól is tenyésztettem sejteket, majd mindkét sejttípust kezeltem 3-3 különböző tenyésztőmédiummal: idős embertől származó SPRF-et, fiatal emberből származó SPRF-et és FBS-t, mint kiegészítőt tartalmazóval. Ezt az magyarázza, hogy megfigyelések alapján az idősebb vonalból származó őssejtek vesztenek a proliferációjuk sebességéből és ez a vér növekedési faktor mennyiségére is igaz lehet. Így hát az előbb leírt hat csoportot egy hétig növesztettem a megfelelő médiumban és mindennap mértem a sejtéletképességüket MTT esszé segítségével. Az eredmények bizakodásra adnak okot, ám nem tökéletesek. A fiatal donor véréből készült SPRF mindegyik csoportban általánosan a legjobb eredményt produkálta és az idős donoré is elérte, vagy sokszor meg is haladta az FBS-sel kapott értékeket. A következő lépés az alkalmazandó sejtmennyiség pontos kikísérletezése kontroll médiumban, majd ezután a kapott értékkel a kísérletsorozat megismétlése.
31
7. Függelék 7.1. Fiatal őssejtek mérési eredményei 7.1.1. Kontroll médiumban 1
2
3
4
5
6
A
0,089
0,125
0,086
0,612
0,593
0,592
570
B C D
0,665
0,62
0,61
0,535
0,613
0,604
570
0,652
0,592
0,617
0,611
0,592
0,614
570
0,578
0,612
0,536
0,046
0,048
0,048
570
1
2
3
4
5
6
A
0,065
0,088
0,059
0,038
0,04
0,039
690
B C D
0,041
0,042
0,041
0,039
0,038
0,037
690
0,042
0,041
0,042
0,043
0,041
0,041
690
0,041
0,041
0,039
0,045
0,046
0,046
690
1
2
3
4
5
6
A
0,042
0,056
0,046
0,088
0,068
0,066
570
B C D
0,672
0,599
0,598
0,538
0,602
0,574
570
0,686
0,617
0,633
0,616
0,586
0,599
570
0,598
0,638
0,547
0,047
0,049
0,049
570
1
2
3
4
5
6
A
0,036
0,046
0,04
0,064
0,051
0,049
690
B C D
0,043
0,042
0,042
0,04
0,038
0,037
690
0,044
0,043
0,044
0,044
0,044
0,043
690
0,042
0,042
0,04
0,045
0,046
0,046
690
1
2
3
4
5
6
A
0,053
0,064
0,052
0,052
0,051
0,052
570
B
0,049
0,047
0,05
0,593
0,605
0,604
570
C D
0,571
0,624
0,604
0,602
0,544
0,677
570
0,628
0,575
0,581
0,048
0,049
0,049
570
1
2
3
4
5
6
A
0,043
0,055
0,043
0,045
0,045
0,046
690
B
0,042
0,04
0,043
0,042
0,038
0,037
690
C D
0,04
0,042
0,043
0,047
0,043
0,041
690
0,043
0,042
0,042
0,046
0,046
0,046
690
1. nap
2. nap
3. nap
32
1
2
3
4
5
6
A
0,06
0,061
0,053
0,053
0,052
0,054
570
B
0,045
0,045
0,05
0,059
0,053
0,058
570
C D
0,599
0,648
0,626
0,621
0,569
0,647
570
0,671
0,616
0,628
0,048
0,049
0,049
570
1
2
3
4
5
6
A
0,047
0,055
0,044
0,046
0,046
0,047
690
B
0,044
0,042
0,047
0,044
0,039
0,043
690
C D
0,043
0,042
0,043
0,045
0,044
0,047
690
0,043
0,043
0,042
0,046
0,046
0,046
690
1
2
3
4
5
6
A B
0,097
0,067
0,062
0,063
0,058
0,06
570
0,05
0,047
0,05
0,06
0,048
0,049
570
C
0,075
0,056
0,118
0,604
0,617
0,628
570
D
0,608
0,575
0,582
0,045
0,047
0,047
570
1
2
3
4
5
6
A B
0,078
0,058
0,05
0,053
0,05
0,052
690
0,047
0,043
0,047
0,05
0,044
0,045
690
C
0,066
0,045
0,094
0,046
0,044
0,043
690
D
0,042
0,042
0,041
0,045
0,046
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A B
0,107
0,078
0,056
0,053
0,053
0,057
570
0,052
0,05
0,05
0,063
0,049
0,055
570
C
0,057
0,053
0,082
0,1
0,068
0,067
570
D
0,762
0,727
0,761
0,046
0,047
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A B
0,089
0,071
0,045
0,046
0,047
0,05
690
0,048
0,045
0,047
0,052
0,044
0,05
690
C
0,046
0,041
0,063
0,065
0,05
0,051
690
D
0,062
0,063
0,06
0,044
0,045
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A B C
0,062
0,062
0,058
0,053
0,054
0,053
570
0,053
0,048
0,05
0,063
0,05
0,05
570
0,055
0,054
0,086
0,052
0,047
0,051
570
D
0,078
0,067
0,064
0,045
0,047
0,047
570
4. nap
5. nap
6. nap
7. nap
33
1
2
3
4
5
6
A B C
0,054
0,056
0,048
0,047
0,047
0,047
690
0,05
0,044
0,047
0,052
0,045
0,046
690
0,044
0,045
0,069
0,047
0,043
0,047
690
D
0,057
0,053
0,056
0,044
0,045
0,045
690
7.1.2. Fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiumban 1
2
3
4
5
6
A
0,184
0,181
0,108
0,934
1,164
1,378
570
B C D
0,773
0,663
0,789
0,962
1,086
1,304
570
0,688
0,678
0,809
0,909
0,905
1,404
570
0,661
0,7
0,905
0,048
0,05
0,05
570
1
2
3
4
5
6
A
0,118
0,109
0,055
0,266
0,381
0,511
690
B C D
0,09
0,105
0,157
0,265
0,342
0,501
690
0,092
0,107
0,156
0,236
0,193
0,56
690
0,091
0,106
0,213
0,044
0,047
0,046
690
1
2
3
4
5
6
A
0,146
0,083
0,059
0,08
0,098
0,078
570
B C D
0,918
0,633
0,841
0,882
0,957
1,417
570
0,876
0,859
0,846
0,876
1,416
1,216
570
0,888
0,853
0,937
0,048
0,05
0,05
570
1
2
3
4
5
6
A
0,119
0,067
0,051
0,055
0,064
0,053
690
B C D
0,169
0,051
0,18
0,212
0,254
0,518
690
0,216
0,219
0,17
0,202
0,471
0,409
690
0,219
0,191
0,222
0,044
0,047
0,046
690
1
2
3
4
5
6
A
0,112
0,122
0,062
0,057
0,062
0,062
570
B
0,078
0,079
0,086
0,793
0,818
0,888
570
C D
0,755
0,754
0,79
0,786
0,775
0,975
570
0,748
0,763
0,756
0,048
0,049
0,05
570
1
2
3
4
5
6
A
0,093
0,106
0,053
0,05
0,056
0,053
690
B
0,046
0,044
0,057
0,158
0,182
0,178
690
C D
0,108
0,118
0,122
0,191
0,161
0,255
690
0,134
0,116
0,163
0,044
0,046
0,048
690
1. nap
2. nap
3. nap
34
1
2
3
4
5
6
A
0,134
0,124
0,06
0,055
0,06
0,058
570
B
0,068
0,064
0,105
0,062
0,083
0,069
570
C D
1,223
1,16
1,055
1,261
1,404
1,704
570
1,225
1,185
1,283
0,048
0,063
0,052
570
1
2
3
4
5
6
A
0,123
0,112
0,053
0,049
0,054
0,05
690
B
0,062
0,058
0,097
0,047
0,06
0,046
690
C D
0,436
0,403
0,293
0,455
0,56
0,724
690
0,394
0,409
0,459
0,045
0,06
0,049
690
1
2
3
4
5
6
A B
0,109
0,144
0,077
0,057
0,068
0,06
570
0,067
0,062
0,104
0,055
0,063
0,073
570
C
0,091
0,108
0,082
1,045
1,054
1,092
570
D
0,845
0,926
1,08
0,046
0,051
0,049
570
1
2
3
4
5
6
A B
0,088
0,124
0,066
0,051
0,061
0,052
690
0,062
0,056
0,096
0,05
0,054
0,063
690
C
0,057
0,069
0,058
0,3
0,31
0,32
690
D
0,181
0,2
0,373
0,044
0,05
0,048
690
1
2
3
4
5
6
A B
0,14
0,147
0,077
0,055
0,062
0,061
570
0,068
0,062
0,101
0,058
0,067
0,067
570
C
0,05
0,051
0,054
0,08
0,059
0,071
570
D
0,867
0,922
0,728
0,046
0,051
0,049
570
1
2
3
4
5
6
A B
0,123
0,128
0,067
0,05
0,056
0,055
690
0,062
0,056
0,093
0,051
0,056
0,059
690
C
0,043
0,043
0,048
0,066
0,048
0,055
690
D
0,102
0,121
0,089
0,043
0,049
0,047
690
1
2
3
4
5
6
A B C
0,108
0,141
0,063
0,052
0,062
0,056
570
0,065
0,061
0,101
0,054
0,061
0,075
570
0,068
0,062
0,074
0,056
0,046
0,064
570
D
0,061
0,071
0,064
0,046
0,051
0,05
570
4. nap
5. nap
6. nap
7. nap
35
1
2
3
4
5
6
A B C
0,089
0,124
0,055
0,048
0,056
0,051
690
0,06
0,056
0,094
0,049
0,053
0,066
690
0,061
0,053
0,065
0,053
0,043
0,059
690
D
0,046
0,047
0,048
0,043
0,049
0,049
690
7.1.3. Idős donor SPRF-ét tartalmazó médiumban 1
2
3
4
5
6
A
0,108
0,08
0,168
0,686
0,655
0,725
570
B C D
0,661
0,604
0,677
0,575
0,671
0,63
570
0,762
0,624
0,641
0,679
0,662
0,655
570
0,68
0,684
0,553
0,046
0,047
0,049
570
1
2
3
4
5
6
A
0,085
0,053
0,097
0,058
0,067
0,051
690
B C D
0,05
0,055
0,051
0,059
0,054
0,068
690
0,06
0,06
0,066
0,058
0,058
0,077
690
0,068
0,062
0,055
0,045
0,045
0,046
690
1
2
3
4
5
6
A
0,054
0,054
0,055
0,062
0,075
0,073
570
B C D
0,694
0,612
0,718
0,641
0,725
0,712
570
0,831
0,714
0,718
0,737
0,714
0,742
570
0,757
0,806
0,621
0,045
0,049
0,05
570
1
2
3
4
5
6
A
0,043
0,047
0,043
0,054
0,051
0,051
690
B C D
0,048
0,051
0,065
0,092
0,078
0,13
690
0,067
0,101
0,106
0,083
0,109
0,151
690
0,108
0,125
0,086
0,043
0,045
0,047
690
1
2
3
4
5
6
A
0,073
0,054
0,056
0,048
0,053
0,051
570
B
0,066
0,054
0,058
0,675
0,63
0,714
570
C D
0,678
0,642
0,681
0,647
0,693
0,751
570
0,666
0,718
0,588
0,046
0,05
0,05
570
1
2
3
4
5
6
A
0,057
0,045
0,043
0,042
0,046
0,043
690
B
0,046
0,042
0,042
0,058
0,055
0,06
690
C D
0,053
0,051
0,058
0,064
0,114
0,084
690
0,053
0,055
0,063
0,044
0,046
0,048
690
1. nap
2. nap
3. nap
36
1
2
3
4
5
6
A
0,088
0,067
0,064
0,051
0,054
0,052
570
B
0,05
0,062
0,05
0,068
0,06
0,059
570
C D
0,733
0,672
0,698
0,699
0,798
0,827
570
0,778
0,789
0,699
0,047
0,05
0,05
570
1
2
3
4
5
6
A
0,071
0,055
0,05
0,044
0,046
0,045
690
B
0,045
0,057
0,046
0,049
0,042
0,042
690
C D
0,066
0,058
0,061
0,094
0,176
0,157
690
0,105
0,075
0,113
0,044
0,046
0,047
690
1
2
3
4
5
6
A B
0,063
0,06
0,068
0,058
0,058
0,063
570
0,054
0,066
0,051
0,063
0,063
0,062
570
C
0,107
0,075
0,084
0,731
0,705
0,74
570
D
0,677
0,709
0,655
0,044
0,05
0,048
570
1
2
3
4
5
6
A B
0,052
0,05
0,054
0,049
0,051
0,055
690
0,048
0,059
0,047
0,056
0,055
0,056
690
C
0,093
0,07
0,064
0,109
0,069
0,099
690
D
0,067
0,072
0,068
0,043
0,046
0,046
690
1
2
3
4
5
6
A B
0,075
0,068
0,074
0,056
0,056
0,055
570
0,047
0,059
0,051
0,05
0,073
0,06
570
C
0,062
0,065
0,06
0,118
0,067
0,065
570
D
0,78
0,888
0,793
0,045
0,052
0,047
570
1
2
3
4
5
6
A B
0,064
0,057
0,059
0,047
0,048
0,048
690
0,043
0,053
0,046
0,039
0,062
0,053
690
C
0,052
0,051
0,049
0,095
0,051
0,052
690
D
0,122
0,14
0,113
0,043
0,047
0,045
690
4. nap
5. nap
6. nap
37
1
2
3
4
5
6
A B C
0,054
0,049
0,051
0,05
0,051
0,059
570
0,048
0,061
0,051
0,071
0,06
0,058
570
0,065
0,062
0,067
0,051
0,047
0,054
570
D
0,079
0,09
0,054
0,045
0,051
0,047
570
1
2
3
4
5
6
A B C
0,048
0,044
0,042
0,043
0,044
0,052
690
0,044
0,055
0,047
0,058
0,053
0,053
690
0,054
0,049
0,047
0,045
0,043
0,047
690
D
0,061
0,072
0,046
0,044
0,046
0,046
690
7. nap
7.2. Idős őssejtek eredményei 7.2.1. Kontroll médiumban 1
2
3
4
5
6
A
0,199
0,101
0,602
0,582
0,61
0,62
570
B C D
0,569
0,601
0,046
0,047
0,045
0,045
570
0,051
0,045
0,047
0,047
0,045
0,045
570
0,046
0,046
0,045
0,045
0,047
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A
0,125
0,059
0,05
0,046
0,052
0,047
690
B C D
0,038
0,04
0,043
0,044
0,043
0,042
690
0,05
0,043
0,045
0,045
0,043
0,043
690
0,044
0,044
0,043
0,043
0,045
0,044
690
1
2
3
4
5
6
A
0,068
0,055
0,086
0,138
0,579
0,571
570
B C D
0,588
0,588
0,046
0,047
0,046
0,045
570
0,049
0,045
0,047
0,047
0,045
0,045
570
0,046
0,046
0,045
0,045
0,047
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A
0,057
0,047
0,054
0,111
0,043
0,043
690
B C D
0,039
0,039
0,043
0,044
0,042
0,042
690
0,048
0,043
0,045
0,045
0,044
0,043
690
0,044
0,044
0,043
0,043
0,045
0,044
690
1. nap
3. nap
38
1
2
3
4
5
6
A
0,068
0,058
0,058
0,07
0,093
0,082
570
B C D
0,598
0,585
0,046
0,047
0,046
0,045
570
0,046
0,045
0,047
0,047
0,046
0,045
570
0,046
0,046
0,045
0,045
0,047
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A
0,059
0,049
0,049
0,058
0,057
0,053
690
B C D
0,04
0,042
0,044
0,045
0,043
0,043
690
0,045
0,043
0,045
0,045
0,044
0,043
690
0,044
0,044
0,044
0,043
0,045
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A
0,068
0,057
0,055
0,064
0,087
0,07
570
B
0,079
0,108
0,046
0,047
0,046
0,045
570
C D
0,046
0,045
0,047
0,047
0,045
0,045
570
0,046
0,046
0,045
0,045
0,047
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A
0,059
0,048
0,047
0,054
0,07
0,057
690
B
0,055
0,083
0,043
0,044
0,043
0,042
690
C D
0,045
0,043
0,045
0,045
0,044
0,043
690
0,044
0,044
0,043
0,043
0,045
0,044
690
5. nap
7. nap
7.2.2. Fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiumban 1
2
3
4
5
6
A
0,275
0,162
0,875
0,953
1,122
1,37
570
B C D
0,549
0,665
0,047
0,047
0,046
0,045
570
0,044
0,045
0,047
0,048
0,046
0,049
570
0,046
0,046
0,045
0,045
0,047
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A
0,113
0,077
0,228
0,234
0,339
0,489
690
B C D
0,111
0,128
0,045
0,045
0,043
0,043
690
0,044
0,043
0,044
0,046
0,043
0,047
690
0,045
0,044
0,043
0,043
0,045
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A
0,057
0,052
0,161
0,303
1,331
1,482
570
B C D
0,918
0,908
0,047
0,047
0,05
0,045
570
0,044
0,045
0,047
0,048
0,046
0,049
570
0,046
0,046
0,044
0,045
0,046
0,046
570
1. nap
3. nap
39
1
2
3
4
5
6
A
0,052
0,043
0,104
0,131
0,489
0,581
690
B C D
0,197
0,224
0,045
0,045
0,046
0,043
690
0,044
0,043
0,045
0,046
0,043
0,047
690
0,045
0,044
0,043
0,044
0,045
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A
0,106
0,063
0,178
0,232
0,144
0,175
570
B C D
0,865
1,082
0,069
0,048
0,048
0,051
570
0,045
0,047
0,047
0,048
0,046
0,049
570
0,046
0,047
0,045
0,063
0,047
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A
0,078
0,052
0,161
0,207
0,077
0,104
690
B C D
0,164
0,327
0,063
0,045
0,044
0,047
690
0,044
0,045
0,045
0,046
0,043
0,047
690
0,045
0,044
0,043
0,06
0,045
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A
0,087
0,059
0,173
0,214
0,132
0,145
570
B
0,075
0,08
0,065
0,048
0,048
0,048
570
C D
0,045
0,045
0,047
0,049
0,047
0,046
570
0,046
0,047
0,045
0,055
0,048
0,046
570
1
2
3
4
5
6
A
0,069
0,05
0,157
0,191
0,116
0,119
690
B
0,053
0,05
0,059
0,045
0,044
0,045
690
C D
0,044
0,043
0,045
0,047
0,044
0,044
690
0,044
0,044
0,044
0,052
0,046
0,044
690
5. nap
7. nap
7.2.3. Idős donor SPRF-ét tartalmazó médiumban 1
2
3
4
5
6
A
0,115
0,109
0,762
0,7
0,762
0,795
570
B C D
0,704
0,731
0,045
0,047
0,05
0,044
570
0,044
0,046
0,047
0,046
0,046
0,044
570
0,046
0,046
0,046
0,046
0,046
0,046
570
1. nap
40
1
2
3
4
5
6
A
0,067
0,072
0,101
0,099
0,128
0,147
690
B C D
0,084
0,109
0,043
0,045
0,049
0,044
690
0,044
0,043
0,045
0,045
0,043
0,043
690
0,044
0,045
0,043
0,043
0,045
0,044
690
1
2
3
4
5
6
A
0,054
0,052
0,077
0,105
0,725
0,7
570
B C D
0,671
0,585
0,045
0,047
0,048
0,045
570
0,045
0,046
0,047
0,046
0,046
0,044
570
0,047
0,046
0,049
0,048
0,05
0,047
570
1
2
3
4
5
6
A
0,046
0,046
0,05
0,055
0,097
0,111
690
B C D
0,053
0,053
0,043
0,045
0,046
0,044
690
0,044
0,043
0,045
0,044
0,043
0,043
690
0,045
0,044
0,045
0,045
0,048
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A
0,049
0,049
0,062
0,066
0,087
0,098
570
B C D
0,673
0,618
0,045
0,046
0,048
0,045
570
0,045
0,046
0,048
0,046
0,046
0,045
570
0,047
0,046
0,048
0,048
0,05
0,047
570
1
2
3
4
5
6
A
0,043
0,044
0,057
0,06
0,049
0,049
690
B C D
0,064
0,067
0,043
0,045
0,047
0,044
690
0,045
0,043
0,046
0,044
0,043
0,043
690
0,044
0,044
0,044
0,045
0,048
0,045
690
1
2
3
4
5
6
A
0,054
0,054
0,059
0,064
0,067
0,081
570
B
0,067
0,06
0,045
0,047
0,048
0,045
570
C D
0,045
0,046
0,048
0,046
0,048
0,046
570
0,046
0,046
0,048
0,048
0,047
0,047
570
1
2
3
4
5
6
A
0,047
0,047
0,055
0,058
0,057
0,068
690
B
0,05
0,047
0,043
0,045
0,046
0,044
690
C D
0,044
0,043
0,046
0,044
0,044
0,044
690
0,044
0,044
0,044
0,044
0,046
0,045
690
3. nap
5. nap
7. nap
41
7.3. Eredmények összefoglalása Fiatal sejtek összefoglalt eredményei Fiatal sejt-Kontroll médium
Fiatal sejt-Idős médium
Fiatal sejt-Fiatal médium
1. nap
0,0293
0,0403
0,0637
2. nap
0,0193
0,0180
0,0280
3. nap
0,0070
0,0160
0,0320
4. nap
0,0147
0,0180
0,0203
5. nap
0,0147
0,0130
0,0323
6. nap
0,0230
0,0173
0,0137
7. nap
0,0143
0,0147
0,0183
1. táblázat
Idős sejtek összefoglalt eredményei Idős sejt-Kontroll médium
Idős sejt-Idős médium
Idős sejt-Fiatal médium
1. nap
0,0580
0,0425
0,1235
3. nap
0,0295
0,0385
0,1145
5. nap
0,0325
0,0435
0,0690
7. nap
0,0245
0,0150
0,0260
2. táblázat
42
8. Irodalomjegyzék
1
Bajada, S., Mazakova, I., Richardson, J. B., and Ashammakhi, N. (2008). Updates on stem cellsand their applications in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2, 169-183.
2
Ranieri Cancedda, R., Dozin, B., Giannoni, P., and Quarto, R. (2003). Tissue engineeing and cell therapy of cartilage and bone. Matrix Biology, 22, 81-91.
3
Jochems, C. E., van der Valk, J. B., Stafleu, F. R, and Baumans, V. (2002). The use of fetal bovine serum: ethical or scientific problem? Alternernatives to Laboratory Animals, 30, 219-227.
4
T., Noraberg, J., Price, A., Scarino, M. L., and Gstraunthaler, G. (2010). Optimization of chemically defined cell culture media – Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicology in Vitro, 24, 1053-1063.
5
Chen Yao Su, Ya Po Kuo, Yu Hong Tseng, Ching-Hua Su, and Burnouf, T. (2009). In vitro release of growth factors from platelet-rich fibrin (PRF): a proporsal to optimize the clinical applications of PRF. OOOOE, 108(1), 56-61.
6
Daar, A. S., and Greenwood, H. L. (2007). A proposed definition of regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 1, 179–184.
7
Becker, A. J., McCulloch, E. A., and Till, J. E. (1963). Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature, 197, 452–454.
8
Green, W. T. Jr. (1977). Articular cartilage repair. Behavior of rabbit chondrocytes during tissue culture and subsequent allografting. Clinical Orthopaedicsand Related Research, 124, 237–250.
9
Langer, R., and Vacanti, J. P. (1993). Tissue engineering. Science, 260(5110), 920–926.
10
11
Thompson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., and Shapiro, S. S. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 282, 1145–1147. Lee, E. H., and Hui, J. H. P. (2006). The potential of stem cells in orthopaedic surgery. Journal of Bone and Joint Surgery, 88(7), 841–853.
43
12
De Coppi, P., Bartsch, G. Jr, and Siddiqui, M. M. (2007). Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nature Biotechnology, 25(1), 100–106.
13
Wang, H. S., Hung, S. C., and Peng, S. T. (2004). Mesenchymal stem cells in the Wharton’s jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 22(7), 1330–1337.
14
Zuk, P. A., Zhu, M., and Mizuno, H. (2001). Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Journal of Tissue Engeering, 7, 211–228.
15
Gage, F. H. (2000). Mammalian neural stem cells. Science, 287(5457), 1433–1438.
16
Caplan, A. I. (1991). Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research, 9(5), 641–650.
17
Tropepe, V., Coles, B. L., and Chiasson, B. J. (2000). Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science, 287(5460), 2032–2036.
18
McKenzie, I. A., Biernaskie, J., and Toma, J. G. (2006). Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. Journal of Neuroscience, 26(24), 6651–6660.
19
Owen, M. (1988). Marrow stromal stem cells. Journal of Cell Science- Suppllement, 10, 63–76.
20
Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., and Petrakova, K. V. (1966). Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Journal of Embryology and Experimental Morphology, 16(3), 381–390.
21
Caplan, A. I. (2005). Mesenchymal Stem Cells: Cell-Based Reconstructive Therapy in Orthopedics. Tissue Engineering, 11(7), 1198-1211.
22
Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., and Caplan, A. I. (1995). Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant, 16, 557-564.
23
Awad, H., Huibregste, B., and Caplan, A.I. (1999). Autologous mesenchymal stem cellmediated repair of tendon. Tissue Engeering, 5, 267-277.
44
24
Ohgushi, H., and Caplan, A.I. (1999). Stem cell technology and bioceramics: From cell to gene engineering. Jornal of Biomedical Material Research, 48, 913-923.
25
Askari, A.T., and Penn, M.S. (2003). Cell therapy for the treatment of ischemic heart disease: Approaching a new frontier. In: Topal, E.J., ed. Textbook of Interventional Cardiology. Philadelphia, 1053–1061.
26
Chen, J., Zhang, Z.G., and Chopp, M. (2003). Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circulation Research, 92, 692-
27
Dennis, J.E., Cohen, N., Caplan, A.I., and Goldberg, V.M (2004). Targeted delivery of progenitor cells for cartilage repair. Journal of Orthopaedics Research, 22, 735-
28
van der Valk, J., Mellor, D., Brands, R., Fischer, R., Gruber, F., and Gstraunthaler, G. (2004). The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicology In Vitro, 18, 1-12.
29
Hodgson, J. (1995). To treat or not to treat: that is the question for serum. Biotechnology, 13, 333-338.
30
Hemed, H., Giebel, B., and Wagner, W. (2014). Evaluation of human platelet lysate versus fetal bovine serum for culture of mesenchymal stromal cells. Cytotherapy, 16, 170-180.
31
Mellor, D.J., and Gregory, N.G. (2003). Responsiveness, behavioural arousal and awareness in fetal and newborn lambs: experimental, practical and therapeutic implications. New Zealand Veterinary Journal, 51, 2–13.
32
Balls, M., Goldberg, A.M., Fentem, J.H., Broadhead, C.L., Burch, R.L., Festing, M.F., Frazier, J.M., Hendriksen, C.F., Jennings, M., van der Kamp, M.D., Morton, D.B., Rowan, A.N., Russell, C., Russell, W.M., Spielmann, H., Stephens, M.L., Stokes, W.S., Straughan, D.W., Yager, J.D., Zurlo, J., and van Zutphen, B.F. (1995). The three Rs: the way forward. The report and recommendations of ECVAM Workshop 11. Alternatives To Laboratory Animals, 23, 838–866.
33
Everts, P.A. (2007). Autologous platelet gel and fibrin sealant enhance the efficacy of total knee arthroplasty: improved range of motion, decreased length of stay and a 45
reduced incidence of arthrofibrosis. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy, 15, 888–894. 34
Lindeboom, J.A. (2007). Influence of the application of plateletenriched plasma in oral mucosal wound healing. Clinical Oral Implants Reserach, 18, 133–139.
35
Thor, A. (2007). Early bone formation in human bone grafts treated with platelet-rich plasma: preliminary histomorphometric results. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 36, 1164–1171.
36
Sampson, S., Gerhardt, M., and Mandelbaum, B. (2008). Platelet rich plasma injection grafts for musculoskeletal injuries: a review. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine, 1, 165-174.
37
Ponte, A. L., Marais, E., Gallay, N., Langonné, A., Delorme, B., and Hérault, O. (2007) The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells, 25, 1737-1745.
38
Li, Y., Yu, X., Lin, S., Li, X., Zhang, S., and Song, Y. H. (2007) Insulin-like growth factor 1 enhances the migratory capacity of mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 356, 780-784.
39
Savage, C. R., Cohen, S. (1973). Proliferation of corneal epithelium induced by epidermal growth factor. Experimental Eye Research, 15, 361-366.
40
Connolly, D. T., Heuvelman, D. M., Nelson, R., Olander, J. V., Eppley, B. L., and Delfino, J. J. (1989) Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. Journal of Clinical Investigation, 84, 1470-1478.
41
Mosesson, M. W., Siebenlist, K. R., and Meh, D. A. (2001). The structure and biological features of fibrinogen and fibrin. Annals of the New York Academy of Sciences, 936, 11–30.
42
Choukroun, J., Adda, F., Schoeffler, C., and Vervelle, A. (2000). Une opportunite en paro-implantologie: le PRF. Implantodontie, 42, 55-62.
43
Bensaid, W., Triffitt, J. T., Blanchat, C., Oudina, K., Sedel, L., and Petite, H. (2003). A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials, 24, 2497–2502.
46
44
Dvorak, H. F., Harvey, V. S., Estrella, P., Brown, L. F., McDonagh, J., and Dvorak, A. M. (1987). Fibrin containing gels induce angiogenesis. Implications for tumor stroma generation and wound healing. Laboratory Investigation, 57, 673-686.
45
Ehrenfest, D. M. D., Rasmusson, L., and Albrektsson, T. (2009). Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and plateletrich fibrin (L-PRF). Trends in Biotechnology, 27(3), 158-167.
46
Even, M. S., Sandusky, C. B., and Barnard, N. D. (2006). Serum-free hybridoma culture: ethical, scientific and safety considerations. Trends of Biotechnology, 24, 105108.
47
Cressey, D. (2009). Neuroscientists claim growing pains. Nature, 459, 19.
48
Lohmann, M., Walenda, G., Hemeda, H., Joussen, S., Drescher, W., and Jockenhoevel, S. (2012). Donor age of human platelet lysate affects proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One, 7, 37839.
49
D'Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., and Howard, G. A. (1999). AgeRelated Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. Journal of Bone and Mineral Research, 14, 1115-1122.
50
Salazar, K. D, Lankford, S. M., and Brody, A. R. (2009). Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF-β1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology, 5(297), 1002-1011.
51
Barker, K. (1998). At the bench: A laboratory navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
52
Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of lmmunological Methods, 65, 55-63
53
Gerlier, D., and Thomasset, N. (1986). Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Journal of Immunological Methods, 94, 57-63.
54
P.R. Twentyman, P. R., Luscombe, M. (1987). A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. British Jornal of Cancer, 56, 279-285.
47
48
