⎯⎯⎯ Tudományos Diákköri Dolgozat ⎯⎯⎯
VÉGH ÁDÁM
Útban a Pseudomonas aeruginosa gyógyszerpumpájának megértéséhez
Prof. Dr. Perczel András ELTE TTK Szerves Kémiai Tanszék Dr. Henrietta Venter Univesity of Cambridge Department of Pharmacology
⎯⎯⎯ Eötvös Loránd Tudományegyetem ⎯⎯⎯ ⎯⎯ Természettudományi Kar ⎯⎯ ⎯ Budapest, 2009 ⎯
1
Tartalomjegyzék Bevezetés .................................................................................................................................................................1 MexAB-OprM rendszer összetevőinek struktúrája ............................................................................................3 MexA ..............................................................................................................................................................3 MexB...............................................................................................................................................................3 OprM...............................................................................................................................................................4 Gyógyszerkilökés mechanizmusa..........................................................................................................................6 A projekt célja ........................................................................................................................................................7 Anyagok és eljárások .............................................................................................................................................8 Baktérium sejtek, plazmidok és növesztési körülmények ...............................................................................8 1. PCR ...........................................................................................................................................................10 2. Plazmid készítés ........................................................................................................................................11 3. Agaróz gél-elektroforézis ..........................................................................................................................11 4. DNS transzformáció..................................................................................................................................11 5. Glicerin törzs (stock) készítése..................................................................................................................12 6.Fehérje expresszálása és ISOV gyártás ......................................................................................................12 7.Fehérje-koncentráció meghatározás ...........................................................................................................13 8.Fehérje tisztítás...........................................................................................................................................13 9.SDS PAGE.................................................................................................................................................14 10. Élősejt-mérgezéses vizsgálat (Cytotoxicity Assay).................................................................................14 Eredmények..........................................................................................................................................................15 Konklúzió..............................................................................................................................................................19 Köszönetnyilvánítás .............................................................................................................................................20 Függelék ................................................................................................................................................................21 OprM mutánsok aminosav szekvenciája ...........................................................................................................27 Referenciák...........................................................................................................................................................28 Megjegyzések........................................................................................................................................................29
2
Bevezetés Az antibiotikumok korának hajnalán egy ismert állatorvos, James Herriot úgy írta le a penicillin hatását egy beteg birkán, hogy „A csoda a szemünk láttára zajlik le”. Sajnálatos módon azonban mára már jelentősen kezdenek szűkülni az antibiotikumok használatának lehetőségei, mivel azok a sejtek, amik ellen a gyógyászatban alkalmazták, sajnos többnyire rezisztenssé váltak az alkalmazott antibiotikumokra. Az egyik ilyen baktérium a Gram negatív aerób Pseudomonas aeruginosa [1]. A krónikusan, Pseudomonas aeruginosa által fertőzött rángógörcsben szenvedő betegek legnagyobb halálozási rátáját ez a baktérium okozza [2]. A krónikus betegeknél a tüdő mélyebb járataiban is megjelenő kiterjedt, nyálkás baktériumtelepek lényegében kiirthatatlanok, mivel antibiotikum rezisztensek. A Pseudomonas aeruginosa rengeteg fertőzést okoz a legyengült immunrendszerrel rendelkezők esetében, mint pl. a HIV- és rákbetegeknél, és a súlyos égést szenvedőknél. Az utóbbi két esetben sajnálatosan fatális módon 50% körüli a fertőzés valószínűsége. A baktérium mérgező fehérjéket termel, ami károsítja a szöveteket, és gyengíti a páciens immunrendszerét. Így például a szembe kerülve vakságot okoz [3]. Az antibiotikum rezisztenciáért két fő ok a felelős: a sejtmembrán nehéz átjárhatósága, és egy úgynevezett „gyógyszerpumpa” (drugpump) [4]. Továbbá a Pseudomonas aeruginosa könnyen szerez rezisztenciát akár mutációval a kromoszómálisan kódolt génjeiben. Így ez jelentősen megnehezíti a fertőzések hatásmechanizmusának vizsgálatát főként azért, mert egyetlen gyógyszerre való rezisztencia keresztrezisztenciával több gyógyszerrel szemben is ellenállóvá teszi a sejtet [3]. A pumpa játssza a legfőbb szerepet, hiszen hiába tennénk átjárhatóbbá a sejtfalat ha a pumpa minden gyógyszert kipumpál a sejtből, a gyógyszer semmit gyógyító hatást nem fog tudni kifejteni. Néhány pumpa csak a specifikus gyógyszereket, gyógyszercsoportokat ismeri fel, míg a gyógyszerrezisztenciáért felelős pumpák képesek felismerni a gyógyszerek széles skáláját és eltávolítani azokat a sejtből. Így képesek lecsökkenteni a sejten belüli gyógyszerkoncentrációt a toxikus szint alá, és így bármiféle gyógyszeres kezelés hatástalanná válik. A Gram negatív baktériumokban, mint az Escherichia coli és a Pseudomonas aeruginosa a gyógyszerrezisztenciát energia ellátású makromolekuláris pumpák segítik elő [5]. Ezek a rendszerek a következő részekből állnak: egy belső membrán komponensből, ami a rezisztencia nodulációs sejtszakasz (RND - Resistance-Nodulation-cell Division) a másodfajú transzporterek szupercsaládjából, egy csatornaképző külső membrán faktor (OMF - Outer3
Membrane Factor) és egy peripla beli fúziós membránfehérje (MFP - Membrane Fusion Protein). Ezzel meg is teremti a közvetlen kapcsolatot a külső térrel a két membránon át. A Pseudomonas aeruginosa-ban több háromkomponensű szerkezetet azonosítottak. A legjobban karakterizált és a gyógyszerrezisztenciáért legjobban felelős a sejtmembránokon áttörő MexAB-OprM rendszer [1.Ábra].
1.Ábra: MexAB-OprM rendszer sematikus képe
A kutatás hosszú távú célja, hogy megértsük a MexAB-OprM pumpa szerkezetét, működését, és ezek után olyan gyógyszereket tudjunk tervezni amelyek hatásosan veszik fel a harcot a gyógyszerrezisztenciáért felelős pumpákat tartalmazó baktériumokkal.
4
MexAB-OprM rendszer összetevőinek struktúrája A MexAB-OprM rendszer szerkezetét röntgen-diffrakcióval határozták meg. Az egyes alkotóelemeket külön-külön állították elő, majd fehérje kristályt növesztettek belőle, végül röntgen-diffrakcióval megállapították térszerkezetüket. Így derült ki, hogy az OprM tag 100 Ängström magas, és 6-8 Ängström széles hordó alakú résszel rendelkezik [8]. A MexA és MexB térszerkezetét is hasonló módon, röntgen-diffrakcióval térképezték fel [6,7]. MexA A MexA periplazma beli adapter négy lineárisan rendezett szubdoménből áll: α-helikális rész, egy lipoil domén, egy β-hordó és egy β-kanyar. Az α-helikális rész egy tipikus coiledcoil (csavart csavar) szerkezet [2.Ábra] [9].
2.Ábra: MexA kristályszerkezetének szalagmodellje, a képen látszik a belső membrán is (IM)
MexB A korábbi kutatásokból már kiderült, hogy a MexB trimereket alkot [7]. A 3. ábra az egész MexB trimer struktúráját ábrázolja szalagdiagrammal a membrán síkjából nézve. A három kiemelkedő domén, és a belső membrán körülbelüli pozíciója is fel van tüntetve. Egy MexB monomer ki van színezve hasonlóan mint az aldoménjei [3.Ábra].
5
3.Ábra : MexB kristályszerkezete [10]
OprM A MexB taghoz hasonlóan az OprM is trimereket alkot, két doménnel [8]: membránkötődési ponttal rendelkező β-hordó és az üregformáló α-hordó. A β-hordónak lyukacsos teteje van ami túl kicsi, hogy hozzá tudjon illeszkedni a MexB trimerjéhez. Az αhordó egy α-hélixekből álló gyűrű, ami elszigeteli az oldószerrel telt üreget. A periplazma felöli vége össze van szűkülve, hogy meggátolja a gyógyszer bármiféle mozgását mindaddig, amíg a konformációs változások következtében egy nyitott állapot nem jön létre [4.Ábra].
6
4.Ábra : OprM kristályszerkezete [10]
Amit a MexAB-OprM komplex funkcionalitásáról tudunk, nagyban az Escherichia coli-ban megtalálható AcrAB-TolC gyógyszerpumpáról szerzett ismeretekből merítkezik [9].A MexB és az AcrB 70%-os aminosav homológiát mutat. A MexA és OprM fehérjéknek is van E.coli ban előforduló megfelelője: AcrA és TolC.
7
Gyógyszerkilökés mechanizmusa A kristályszerkezetek és az AcrAB-TolC modelljei kínálnak egy kis belátást abba, hogy a protonaktiváló ereje hogyan alakul át mechanikai változásba, ami lehasítja a gyógyszert a transzporterről. Valószínűsíthetőleg a MexAB-OprM azonos mechanizmus alapján működik. A legújabb bizonyítékok alátámasztják egy perisztaltikus pumpa modelljét [10] (5. Kép). Az AcrB kristályszerkezetében a trimer három protomerje [Függ.] nagyjából azonos konformációval bír, és trimerenként csak egyetlen protomernek ( a kötő protomernek ) volt szubsztrát kötése. Másik protomer a kilökő protomer. A szubsztrát kilökődése után a harmadik protomer átmenetet mutat a két állapot között. A kilökő protomer központi α-helixe közel 15o-ban hajlik a kötő protomer felé. Ez nyitja fel a kötő protomer kötő oldalát a szubsztrát bejáratához, majd a kilökő protomer becsapódásával lehasítja, és kilöki a szubsztrátot a TolC hordója felé. A gyógyszer belépése a periplazmából kötő és belépési állapotban engedélyezett, kilökő állapotban gátolt. A három különböző konformáció lehetővé teszi a három lépéses kötésváltásos mechanizmust, melyet proton-aktivációs erők irányítanak. A TolC kinyitódása valószínű az AcrA-val történő kötődésből adódó konformációváltozás miatt történik meg [5.Ábra].
5. Ábra: a, Sematikus felülnézeti kép az ArcB trimerjéről és mechanizmusáról. A mechanizmus a perisztaltikus pumpa mechanizmus. b, Sematikus oldalnézeti kép a kötő és kilökő promoterekről, és a transzlokálódott proton útjáról.
8
Az első lépésben a gyógyszer megkötési ciklusban amikor a szubsztrát belép az átengedő protomer előcsarnokába. Ezek után a protomer kötési állapotra vált, és a gyógyszer áttranszportálódik a hidrofób kötési zsákba. Végül a protomer a kilökő állapotba vált, és a gyógyszert továbbítja a TolC felé. A proton motivált erő segíti az átváltást a kilökési állapotból átengedő állapotba.
A projekt célja A gyógyszer-rezisztencia hatalmas akadály, hogy rendesen kezelhetőek legyenek a Pseudomonas aeruginosa által fertőzött betegek. Rengeteg standard antibiotikum elavulttá válik, így egyre sürgetőbb egy új, specifikus gyógyszer kifejlesztése, amelyet a pumpa rezisztencia-mechanizmusa nem tud eltávolítani a sejtből. Egyik érdekes lehetőség, hogy tanulmányozzuk a MexAB-OprM gyógyszerpumpát. A tanulmány célja, hogy előállítsuk az OprM fehérjét, majd két további mutánsát is, valamint, hogy a fehérjét kódoló DNS-t bejuttatva más sejtekbe élősejt-mérgezéses vizsgálatokat elvégezve vizsgálhassuk a mutációt.
9
Anyagok és eljárások Baktérium sejtek, plazmidok és növesztési körülmények Az E.coli sejtek és plazmidok [Függ.] amiket ezen kutatásban használtam, az 1. és 2. táblázatban vannak összefoglalva. A MexA, MexB és OprM plazmidok mindegyike tartalmazott egy antibiotikum rezisztencia markert, egy IPTG-vel [Függ.] (izopropil-β-Dtiogalaktopiranozid) indukálható fehérjetermelő rendszert, és egy terminális His toldalékot (His-tag). Az alkalmazott antibiotikum a Kanamycin [Függ.] (25µg/ml, Fluka). Minden egyéb anyag (ha más nincs írva) Sigma termék. A növesztéshez használt táptalajok minden esetben sterilizálva voltak autoklávban. A C41(DE3) sejteket a pOprMH-t kódoló DNS-el fehérje expresszálásra Luria Bertani (LB) medium (FormediumTM) táptalajban növesztettem, amibe kanamycint (25µg/ml-végleges koncentráció) injektáltam. A sejtszaporítást 37°C-on 200rpm fordulatszámú rázató inkubátorban végeztem.
1. Táblázat: Az általam alkalmazott E. coli sejtek E. coli sejt
Jellemzés
Referencia / Forrás
DH5α
Klónozásra
Bioline
C41(DE3)
BL21(DE3)
Speciálisan fehérje expresszálásra és membrán-proteinek termelésére Fehérjék expresszálására
10
Miroux and Walker (1996)
Promega
2.Táblázat: Az előállított plazmidok Plazmid
Jellemzés
pET41a(+)
Kontrol plazmid
Rezisztencia
Referencia /
marker
Forrás
Kanamycin
Novagen
MexA pET41a(+)-be pHMexA
klónozva 28b(+) N-terminális 6-His toldalék, és thrombin
Kanamycin
Venter H ( nem publikált)
hasítási hellyel Venter H
MexB pET41a(+)-be pMexBH
klónozva C-terminális
Kanamycin
8-His toldalék
klónozva C-terminális 6-His
Kanamycin
toldalék
pOprMH Y421F
pOprMH D433A
2009 Nature Methods )
OprM pET 41a(+)-be pHOprM
(Barrera et al.,
pOprMH Y421F
Kanamycin
szubsztitúcióval
pOprMH Y421F
Kanamycin
szubsztitúcióval
11
Venter H (nem publikált)
Ebben a tanulmányban
Ebben a tanulmányban
1. PCR Az Oprm-et kódoló DNS már rendelkezésemre állt, mikor elkezdtem a kutatást, de a két mutánst még elő kellett állítani. A PCR [Függ.] során 55oC-on a következő oligonukleotidokat (primereket) használtam: OprM Y421F F: 5’ GACAAGCGCTTTCGCACGGGGGTGGACAAC 3’ R: 5’ CCCCGTGCGAAAGCGCTTGTCGGCGAGC 3’ OprM D433A F: 5’ GACCCTGCTCGCCGCGCAACGCTCGCTGTTC 3’ R: 5’ GCGTTGCGCGGCGAGCAGGGTCAGGTAG 3’
6.Ábra: Pontmutáció előidézése:a, Pontmutáció helyét kiválasztom b,c, A mutációt tartalmazó forward F (előre) és reverse R (hátra) primerek a megfelelő helyre jutnak és kicserélik az eredetit Pfu polimeráz segítségével d, Létrejön a pontmutációt tartalmazó DNS
A termelés 55oC-os anellációs hőmérsékleten történt [6.Ábra]. 12
2. Plazmid készítés Az OprM-et kódoló DNS már régebben bele lett transzformálva [Függ.]
pET41a(+)
(Venter H, nem publikált adat) sejtekbe. A plazmidot [Függ.] pHOprM-nek neveztem el, és JM109-es E. coli sejtben szaporítottam. A kinyert plazmidot szekvenáltattuk, hogy megbizonyodhassak róla, hogy a plazmid tényleg jó-e. A megfelelő plazmidot expresszáló [Függ.] E. coli BL21(DE3) és C41(DE3) sejtekbe transzformáltam. Agaróz gél elektroforézishez a plazmidot a Sigma GenElute Plasmid Miniprep Kit-tel tártam fel. 3. Agaróz gél-elektroforézis [Függ.] A DNS-t elektroforézis útján vizualizáltam, 1%-os agaróz gél mátrixban, melyhez 1,5µM etídium-bromidot adtam. A futtató puffer TAE puffer (89mM Tris bázis, 89mM ecetsav, 2mM EDTA). A futtató berendezést a Bio-Rad szolgáltatta. A DNS nagyságát 1kb DNA Ladder (Promega) segítségével határoztam meg.
4. DNS transzformáció [Függ.] A BL21 (DE3) és C41 (DE3) kompetens E. coli sejtekbe a következőképpen transzformáltam a plazmidot: 1µl plazmidot adtam 100µl kompetens sejthez. Ügyelve, hogy a sejteket nagyon óvatosan kezeljem a teljes eljárás folyamán. Jégen tartottam 30 percig, majd hősokkot alkalmaztam: 42°C-os vízben tartottam 45 másodpercig. Ezzel késztetve a sejteket, hogy felvegyék a plazmidot. Majd 2 percig szobahőmérsékleten hagytam állni. Mindezek után 800µl SOC táptalajt adtam, és rázató inkubátorban 37°C-on rázattam 110rpm-mel 60 percen keresztül. Ezek után a sejtek már készen álltak, hogy kikenjem LB medium agar [Függ.] lemezre. Az agar lemezekre kikent baktériumokat 37°C-on növesztettem egész éjszakán keresztül (Overnight). Az egyedi kolóniákat egyenként 5ml kanamycines (25µg/ml – végleges koncentráció ) LB táptalajba tettem.
13
5. Glicerin törzs (stock) készítése A kanamycines (25µg/ml) LB medium táptalajban felnevelt sejtekből 500µl-t és 50%-os 500µl glicerinből törzset (stockot) készítettem, melyet -80oC-on tároltam, hogy később is kikenhessem, és szaporíthassam a sejteket, hogy bármikor reprodukálhatóak legyenek az adatok.
6. Fehérje expresszálása és ISOV gyártás OprM expresszálásához a C41(DE3) sejteket használtam. LB táptalajt kevertem, és autoklávozás után kanamycint (25µg/ml) adtam hozzá. Egész éjszakán át szaporított sejtekből 2ml-t fecskendeztem minden mintához, majd szobahőmérsékleten szaporítottam a sejteket rázatva 200rpm-el, mindaddig amíg elérte OD660 ~0.8 értéket [Függ.]. Ekkor indukáltam IPTG-vel [Függ.] (1mM). Ez azt jelenti, hogy nagymértékben lelassult a sejtek szaporodása, és a saját fehérjénk termelése felgyorsult. 2 óra múlva a sejteket centrifugálással kiülepítettem (Beckman GS3 rotor,15 perc, 6500rpm, 4oC). A sejteket újra felszuszpendáltam 0,1M KPi [Függ.] pH=7,0 oldattal. Újra lecentrifugáltam a sejteket (Beckman GS3 rotor 25perc, 4000rpm, 4oC). A felülúszót leöntöttem, majd a sejteket ismét felszuszpendáltam 0,1M KPi pH=7,0 oldattal, majd DNase (10µg/ml) és 10mM MgSO4 hozzáadása után a szuszpenziót kétszer átvezettem egy ún. French pressen [Függ.] mindig jégen hűtve (Basic Z 0,75-kilowatt Benchtop Cell Disruptor, Constant Systems, Northants, UK) 20 Kpsi nyomást alkalmazva, hogy fel tudjam tárni a membrán-fehérjémet. 15 percig szobahőmérsékleten hagytam, hogy hasson a DNase. Először lassabb centrifugálást alkalmaztam, hogy a sejttörmelék kiülepedjen (Evolution RC26 SS34 rotor,10000 rpm, 10 perc, 4°C). A felülúszót újra lecentrifugáltam nagy sebességgel (Evolution RC26 Ti70 rotor, 40000 rpm, 40 perc, 4°C). A leülepedett anyagot 50mM KPi pH=7,0 oldattal felszuszpendáltam, mely még 10% glicerint is tartalmazott. 20µl-t elraktam fehérje koncentráció meghatározásra, és SDS PAGE-re. A maradékot 1,5ml-es részletekben hűtőben -80oC-on tároltam későbbi felhasználásra.
7. Fehérje-koncentráció meghatározás A fehérjekoncentrációt a Bio-Rad DC Protein Assay Kit-tel határoztam meg. Hígítási sort készítettem (standard), majd a készletben lévő anyagokkal elvégeztem a reakciót (a meghatározandó anyaggal is). Ez egy színváltozással járó reakció, mely során karakterisztikus 14
kék színű oldat jön létre, így spektrofotométerrel vizsgáltam a mintákat 750nm-en az oldatok fény-abszorbanciáját. Az így kapott értékkel kalibráló egyenest tudtam számolni, majd ebből az ismeretlen fehérjekoncentráció is könnyedén kiszámolható volt. 8. Fehérje tisztítás A fehérjéket az ISOV-ből (Függ.) nyertem ki. A fehérje tisztításhoz szükséges gyantát 3szor 5 gyanta térfogatú MilliQ vízzel mostam (MilliQ H2O-ionmentes víz), hogy minden esetleges alkoholt eltávolítsak a gyantából, ami denaturálhatná a fehérjémet. Ezután egyensúlyba hoztam a gyantát: kétszer mostam 5 gyanta térfogatú A mosó pufferrel [Függ.]. A gyantát mindig gravitációs úton szedimentáltam. A kifordított sejtek (5mg/ml) szolubilizációs pufferben [Függ.] rázódtak jégen hűtve egy órán keresztül, hogy szolubilizáljam a fehérjét a membránból. A szuszpenziót lecentrifugáltam, hogy eltávolítsam a fel nem oldódott fehérjét (Evolution RC26 Ti70 rotor, 40 perc, 45 000 rpm, 4°C). A felülúszót a Ni-NTA gyantán szűrtem, miközben a fehérjém rákötődött (1ml gyanta / 10mg His toldalékos fehérje). Azért alkalmaztam ezt a gyantát, mivel a Ni2+ ion a His-hez tud kapcsolódni ami van a mi fehérjénkben. Majd a gyantát 20 gyanta térfogatú A mosó pufferrel, majd 30-40 gyanta térfogatú B mosó pufferrel mostam [Függ.]. Az imidazol kompetitív kötődéssel leszorítja a fehérjét a gyantáról. A gyantát 2 gyanta mennyiségű hasító pufferben [Függ.] szuszpendálom, majd ülepedés után 150µl átesőt gyűjtök.
9. SDS-PAGE SDS poli-akrilamid gél elektroforízis (SDS PAGE). Poli-akrilamid gélt készítettem (alul szeparáló gél, fölül koncentráló gél).
Törzsoldat
Szeparáló gél
Koncentráló gél
3,75ml
0,625ml
1,5M Tris
3,75ml (pH=8,8)
1,25ml (pH=6,8)
10% SDS
150µl
50 µl
H2O
7,2ml
3ml
10% APS
75µl
25 µl
TEMED
23µl
5 µl
40% akrilamid bis mix
15
A fehérje méretét a 175kDa (New England Biolabs) marker segítségével határoztam meg. A cellát Bio Rad készülékben állítottam össze. A gélt Coomassie Blue oldattal festettem meg (0.1% Coomassie Brilliant Blue, 45% metanol, 10% ecetsav). A gélt ezután tintamentesítettem (10% metanol, 10% ecetsav, H2O) 10. Élősejt-mérgezéses vizsgálat (Cytotoxicity Assay ) A megfelelő plazmidot tartalmazó E. Coli sejteket kanamycines (25µg/ml) LB medium táptalajban neveltem 1 órán keresztül. 96 lyukú mikro tálcán végeztem a kísérletet. Minden lyukba 100µl kanamycines (25µg/ml) LB táptalajt mérek. Az első oszlopba 250µg/ml végső koncentrációban, és minden egyes következőbe az előtte lévőnek fele végső koncentrációnyi mérgező anyagot raktam. Az utolsóba nem raktam mérgező anyagot. A három mérgező anyag:
Etídium-bromid,
Novobiocin,
Oxacillin
(A
Novobiocin
és
az
Oxacillin
antibiotikumok, és mivel ezekre az antibiotikumokra nem volt rezisztencia kódolva a sejtek DNS-eiben, így sejtjeinkre nézve mérgezőek). Ezeket külön-külön alkalmaztam. Végül 100100µl növesztett sejtet is hozzáadtam minden egyes lyukhoz. Természetesen előtte minden sejtet tartalmazó oldatnak megnéztem az OD-ját 660nm-es hullámhosszon, és egyforma koncentrációra hígítottam őket. A tálcákat 37oC-os rázó inkubátorba raktam 22 órán keresztül 150rpm-en. 22 órányi szaporítás után a Versa Max microplate reader nevű géppel leolvastam a tálca minden egyes lyukában lévő folyadék OD-ját 620nm-es hullámhosszon.
16
Eredmények A PCR termelés során sikerült előállítanom a mutáns DNS-eket [7.Ábra], melyek a szekvenálás során is jóknak bizonyultak, így a kész vektorokat DH5α kompetens sejtekbe transzformáltam, majd BW25113 delTolC (DE3) sejtekbe későbbi vizsgálatra.
7.Ábra: OprM mutánsok plazmidjai (nyilak mutatják) agaróz mátrixban Control: 1kb DNA Ladder (Promega)
Az OprM egyik mutánsában a 421. helyen lévő tirozint fenil-alanin (Y421F mutáns), míg a másikban a 433. helyen lévő glutamint alanin váltja fel (D433A mutáns) [ 8.Ábra] .
8.Ábra: OprM kristály-struktúrája az Y421 (piros) és a D433 (kék) mutációs pontokkal. A bal oldali kép az oldalnézeti, a jobboldali az alulnézeti kép.
17
Azért mutáltam ezeket az aminosavakat, hogy tanulmányozni tudjuk a MexAB-OprM pumpát, és tömegspektrometriai méréseket végezzünk rajta. De ehhez nekünk is elő kell tudnunk állítani. Sajnos idáig ez nem sikerült, mivel nagyon nehezen kötődött az OprM a MexAB komplexhez in vitro. Ezért ezzel a két mutánssal próbáltam egy nyíltabb szerkezetű egységet létrehozni, mivel ez a konformáció részt vesz az összekötődésnél, így úgy sejtjük, elő fogja segíteni a kötődést. A konformációt tesztelendő végeztem el később az élősejtmérgezéses vizsgálatot. Mivel ha az E. coliban megjelent a TolC (OprM egy homológja E. coliban) akkor a sejt lyukacsossá vált, így érzékenyebb lett több gyógyszerre. Így azt várjuk, hogy az OprM mutánsokat a sejtbe juttatva sokkal érzékenyebbek lesznek a baktériumok a gyógyszerekre (mérgezésre). Először az OprM-et kódoló vektorral dolgoztam tovább. Beletranszformáltam a vektort C41(DE3) E.coli sejtekbe. Elvégeztem az expresszálást és a megtermelt fehérje koncentrációjának meghatározását is [9.Ábra]
9.Ábra: Fehérje koncentráció meghatározásához használt kalibrációs görbe Tisztítás előtt 40mg/ml volt a fehérjekoncentráció, ami a tisztítás során jelentősen hígult (2,5mg/ml lett a koncentrációja), majd koncentrálás után töményedett. Így ebből a termelésből 150µl 7,45mg/ml OprM koncentrációjú tiszta terméket [10.Ábra] sikerült előállítani, melyet a későbbiekben tömegspektrometriai vizsgálatokra is kitűnően lehet használni.
18
10.Ábra: SDS PAGE a MexA,B és OprM fehérjékről tisztítás után. A 175kDa marker a kép bal oldalán látható
A OprM-et és a másik két mutánst kódoló DNS-t mind BW25113 (DE3) dTolC sejtekbe transzformáltam. Ezek olyan E.coli sejtek, melyekből a TolC-t kódoló DNS el lett távolítva. (ez az OprM-hez hasonló pumpa részlet az E.coli baktériumban). Ezekkel a sejtekkel elvégeztük az élősejt mérgezéses vizsgálatot. Mind a 3 fajtával, plusz egy kontrol sejttel (Pet41 plazmiddal), amiben nem volt OprM-et kódoló DNS. A tálca első sorába mindig a Pet41-es plazmiddal ellátott sejteket injektáltam. A tálca második sorába a normál OprM-et kódoló plazmiddal rendelkező sejteket injektáltam. A tálca harmadik sorába OprM Y421F-et kódoló plazmiddal rendelkező sejteket, míg a tálca negyedik sorába OprM D433A-t kódoló plazmiddal rendelkező sejteket injektáltam. Mind a 3 tálcán ilyen volt a sejtek eloszlása. Az első tálca minden tartójába Oxacillint, a másodikéba Novobiocint, a harmadikéba pedig etídium-bromidot injektáltam. A szaporodott sejtek mennyiségét OD-ját spektrofotométerrel 620nm-en monitoroztam. Minél több sejt élte túl a mérgezést, annél nagyobb az OD.
19
11.Ábra: A mérgezéses vizsgálat eredménye vizuálisan. A szaporodott sejtek mennyiségét spektrofotométerrel mértem. 1-4 oszlopban lévő sejteket Oxacillinnel, 6-9 oszlopban lévőket Novobiocinnel és a 11-14 oszlopban lévőket Etilbromiddal mérgeztem. Az 1,6,11-es oszlopokban lévők a kontrol sejtek, a 2,7,12-es oszlopokban Oprm-et tartalmazó sejtek, a 3,8,13-as oszlopokban OprM Y421F-et tartalmazó sejtek és a 4,9,14-es oszlopokban OprM D433A-t tartalmazó sejtek voltak. A mérgező anyag koncentrációja a nyíl irányába nőtt.
Az eredményeket a [11.Ábra]-n szemléletesen ábrázoltam. Rögtön szembetűnik, hogy az OprM D433A mutánsát tartalmazó sejtek nagyon rezisztensekké váltak. Ez igen meglepő, mivel elméletileg pont a fordítottjának kéne történni, mint ahogyan azt korábban taglaltam. Az OprM Y421F mutánst tartalmazó sejtek többé-kevésbé követik az elvárt trendet, de a különbség nem szignifikáns mint ahogyan az OprM-et tartalmazó sejtek sem produkáltak jelentős különbséget a Pet41-hez képest [3.Táblázat]. 3. Táblázat: Minimum mérgezési koncentrációk a vizsgált sejtek és anyagok függvényében
Minta
Oxacillin (µM)
Novobiocin (µM)
EtBr (µM)
Kontrol (Pet41)
3,9
3,9
15,6
OprM
3,9
3,9
15,6
OprM Y421F
3,9
3,9
7,8
OprM D433A
125
31,25
62,5
20
Konklúzió Munkám során az MexAB-OprM komplex OprM részét vizsgáltam normál, és mutáns formában. A két OprM mutáns DNS-ét előállítottam pontmutációval, szaporítottam őket, amiből sikerült jelentős mennyiséget eltárolni a jövőbeni kutatásokhoz. Ezen kívül az így előállított sejtekkel elvégeztem több élősejt-mérgezéses vizsgálatot is, melyekből innovatív eredmények születtek. A sejtek nem minden esetben a várakozásoknak megfelelően működtek. A kialakult rezisztencia oka nem ismert, tehát ennek megmagyarázása további kutatás tárgyát képezi. Kiderült, hogy a normál OprM tartalmú sejtek szinte azonosan viselkedtek, mint amiben nem volt semmilyen OprM. Ez feltételezhetően azért lehet, mert az OprM egy zártabb konformációban volt jelen. Az OprM Y421F viszont kicsiny javulást mutat e téren, mivel úgy tűnik, kicsit nyíltabb lett a szerkezet, így a jövőben ezzel is ki kell próbálni a MexAB-OprM pumpa felépítését. A Pseudomonas aeruginosa gyógyszerpumpája még mindig rengeteg kutatásra ad alapot, de sikerült kutatásommal közelebb jutni megértéséhez, ezzel jelentős lépést tettünk a leendő gyógyszer felé, amely gyenge immunrendszerű emberek ezreit mentheti meg a jövőben. A célt, melyet kitűztem, sikerült elérni. A normál OprM fehérjét sikerült nagy tisztaságban, nagy koncentrációban előállítani. Összesen 150µl 7,5mg/ml koncentrációjú OprM-et
sikerült
expresszálni,
és
tisztán
előállítani,
melyet
később
akár
tömegspektrometriai vizsgálatokra is lehet használni.
Így egy újabb nagy lépést tettünk a Pseudomonas aeruginosa gyógyszerpumpájának megértése felé.
21
Köszönetnyilvánítás
Köszönet Prof. Dr. Perczel Andrásnak, aki támogatta, hogy Cambridge-ben végezhessem kutatásomat, és végig figyelemmel kísérte munkámat. Köszönet Dr. Henrietta Venternek, aki lehetőséget biztosított laborjában a kutatómunka megtervezésére és elvégzésére. Továbbá köszönet mindenkinek, aki ötletekkel, tanácsokkal és építő kritikával segítette a kutatást és a TDK előmenetelét.
22
Függelék
Agaróz gél elektroforézis A DNS és RNS láncok méret szerinti elválasztását és detektálását lehetővé tevő folyamat. Lényege, hogy etídium-bromidos agaróz mátrixban az elektromos tér hatására a negatívan töltött DNS és RNS molekulák a pozitív töltés felé mozdulnak el. Nagyobb méretű DNS láncok lassabban, a kisebb méretűek gyorsabban képesek vándorolni az agaróz mátrixban. Így megfelelő idő elteltével szeparálódnak tömeg (és alak) szerint. Detektálásuk optikailag, UV fényben történik, mivel a DNS-hez hozzákötődik az etídium-bromid, ami UV fényben lumineszkál. A mosó puffer 10mM Bis-Tris pH=7,2, 10% glicerin, 0,5M NaCl, 10mM imidazol pH=8,0, 0,1% DDM APS (ammónium-peroxo-diszulfát)
Autokláv Olyan berendezés, mely nyomás alatt vízgőzzel sterilizál. Lényege, hogy a vizet 126oC -ra hevíti, majd 15 percig tartja a hőmérsékletet. Ez alatt a bele helyezett folyadék vagy edény sterilizálódik. A folyamat végén a berendezés visszahűl. B mosó puffer 10mM K-HEPES pH=7,5, 10% glicerin, 0,5M NaCl, 10mM imidazol pH=8,0, 0,1% DDM 23
DDM (dodecil-β-D-maltozid)
DNase Dezoxiribonukleáz DNS emésztő enzim.Marhák hasnyálmirigyéből állítják elő, Sigma termék. DNS transzformáció Az a folyamat, mely során a kompetens sejtbe az idegen DNS-t bejuttatjuk. dNTPs A 4 dezoxi-nukleozid-trifoszfátot tartalmazza: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Domén Kompakt, kvázi-független folding egység
EDTA (etilén-diamon-tertaecetsav)
24
Fehérje expresszálás Fehérje biológiai előállítása élő sejtekben. (esetünkben E.coliban) Fehérje szolubilizációs puffer 10mM Bis-Tris pH=7,2, 20% glicerin, 0,5M NaCl, 2% DDM [Függ.](Melford), 10mM imidazol pH=8,0 ’French Press’ – Francia pumpa Egy olyan berendezés, melynek működésének lényege, hogy a belehelyezett mintát egy dugóval hatalmas nyomással megnyomja, és egy tű hegyén préseli keresztül. Ekkor a minta hirtelen nyomáscsökkenést szenved, és a benne található sejtek roncsolódnak. A sejtek ekkor úgy nevezett ISO ( In-Side Out – Kifordított) sejtekké változnak, amit több biokémiai in vitro vizsgálatban használnak. Hasító puffer 20mM K-HEPES pH= 8,3, 50mM NaCl, 2mM CaCl2, DDM 0,1% Indukálás Az a folyamat mely során egy kémiai anyaggal (IPTG) arra kényszerítünk egy sejtet, hogy szaporodás helyett főként a célfehérjét termelje meg.
IPTG (izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid)
25
ISOV ( In-Side Out Vesicle – Kifordított sejt) A Francia pumpa hatására létrejövő kifordított sejt-hólyagok. Kanamycin
K-HEPES (2-[4-(2-hidroxietil)piperazin1-il]etánszulfonsav)
Kálium sója.
Kompetens sejt Olyan sejt, ami képes arra, hogy környezetéből DNS-t vegyen fel.
Kpi Egy puffer, ami K2HPO4 és KH2PO4 megfelelő arányú oldata. Attól függ, mekkora pH-t akarunk beállítani.
LB medium Ez is egy sejt táptalaj. 1l-hez 12g tripton, 5g élesztő 10g NaCl és víz kell
26
LB medium agar Úgy készül, hogy az LB medium agar oldatot autoklávba helyeztem, majd miután 60oC-ra hűlt, hozzáadom 25µg/ml végső koncentrációban az antibiotikumot (esetünkben kanamycint), és műanyag petricsészékbe öntöm, majd hűtőben tárolom későbbi felhasználásra. Novobiocin
OD Optikai denzitás Oxacillin
PCR – Polimeráz lánc reakció (Polymerase Chain Reaction) A molekuláris biológiában alkalmazott eljárás, mely azt a célt hivatott megvalósítani, hogy egy vagy pár azonos DNS láncból több százezer vagy millió darabot állíthassunk elő. Az eljárás a termális ciklusokon alapszik amely felfűtések és lehűtések sorozata. A primerek (rövid DNS szakaszok) elengedhetetlen fontosságúak az eljáráshoz. Láncreakciónak azért nevezhetjük, mivel a DNS exponenciálisan növekvő mennyiségben keletkezik.
27
Az általam végzett PCR termeléshez 1µl előre (forward) és 1 µl vissza (reverse) primer, 20 µl 10xPfu puffer, 8µl 10mM dNTP mix (dNTPs)[Függ.], 3 µl DNS, és a legvégén 4µl Pfu [Függ.] enzim (mind Stratagene termék) szükséges. Ezeket összeelegyítve egy kis Eppendorfba raktam, majd egy PCR gépbe tettem (Eppendorf Mastercycler Gradient). Egy fűtési ciklus a következő: denaturáció
94oC
120s
denaturáció
94 oC
30s
anelláció
55 oC
30s
elongáció
68 oC
240s
1X
elongáció
68 oC
420s
∞
hűtés
4 oC
∞
1X
25X
Pfu DNS polimeráz enzim, nagyon jó hatásfokú.
Plazmid A plazmid egy extra kromoszomális DNS molekula, mely főként baktériumokban fordul elő, kettős-szálú. Esetünkben egy ilyen DNS kódolja a fehérjéket. Protomer A legkisebb aktív fehérje szerkezet. SDS (nátrium-dodecil-szulfát)
28
SOB (Super Optimal Broth) Egy speciálisan E.coli baktérium növesztésére kifejlesztett táptalaj, melybe triptont, élesztőt, NaCl-ot és KCl-ot adtak. Én a Melford cég által előre gyártott táptalajt használtam. SOC 500µl SOB (Melford), 0,5% glükóz TEMED (tetra-metil-etilén-diamin)
Tris bis (Bis-(2hidroxi-etil)-amino-tris(hidroximetil)metán)
29
OprM mutánsok aminosav szekvenciája OprM aminosav szekvencia MKRSFLSLAVAAVVLSGCSLIPDYQRPEAPVAAAYPQGQAYGQNTGAAAVPAADIG WREFFRDPQLQQLIGVALENNRDLRVAALNVEAFRAQYRIQRADLFPRIGVDGSGTR QRLPGDLSTTGSPAISSQYGVTLGTTAWELDLFGRLRSLRDQALEQYLATEQAQRSA QTTLVASVATAYLTLKADQAQLQLTKDTLGTYQKSFDLTQRSYDVGVASALDLRQA QTAVEGARATLAQYTRLVAQDQNALVLLLGSGIPANLPQGLGLDQTLLTEVPAGLPS DLLQRRPDILEAEHQLMAANASIGAARAAFFPSISLTANAGTMSRQLSGLFDAGSGS WLFQPSINLPIFTAGSLRASLDYAKIQKDINVAQYEKAIQTAFQEVADGLAARGTFTE QLQAQRDLVKASDEYYQLADKRYRTGVDNYLTLLDAQRSLFTAQQQLITDRLNQLT SEVNLYKALGGGWNQQTVTQQQTAKKEDPQA OprM Y421F aminosav szekvencia MKRSFLSLAVAAVVLSGCSLIPDYQRPEAPVAAAYPQGQAYGQNTGAAAVPAADIG WREFFRDPQLQQLIGVALENNRDLRVAALNVEAFRAQYRIQRADLFPRIGVDGSGTR QRLPGDLSTTGSPAISSQYGVTLGTTAWELDLFGRLRSLRDQALEQYLATEQAQRSA QTTLVASVATAYLTLKADQAQLQLTKDTLGTYQKSFDLTQRSYDVGVASALDLRQA QTAVEGARATLAQYTRLVAQDQNALVLLLGSGIPANLPQGLGLDQTLLTEVPAGLPS DLLQRRPDILEAEHQLMAANASIGAARAAFFPSISLTANAGTMSRQLSGLFDAGSGS WLFQPSINLPIFTAGSLRASLDYAKIQKDINVAQYEKAIQTAFQEVADGLAARGTFTE QLQAQRDLVKASDEYYQLADKRFRTGVDNYLTLLDAQRSLFTAQQQLITDRLNQLT SEVNLYKALGGGWNQQTVTQQQTAKKEDPQA OprM D433A aminosav szekvencia MKRSFLSLAVAAVVLSGCSLIPDYQRPEAPVAAAYPQGQAYGQNTGAAAVPAADIG WREFFRDPQLQQLIGVALENNRDLRVAALNVEAFRAQYRIQRADLFPRIGVDGSGTR QRLPGDLSTTGSPAISSQYGVTLGTTAWELDLFGRLRSLRDQALEQYLATEQAQRSA QTTLVASVATAYLTLKADQAQLQLTKDTLGTYQKSFDLTQRSYDVGVASALDLRQA QTAVEGARATLAQYTRLVAQDQNALVLLLGSGIPANLPQGLGLDQTLLTEVPAGLPS DLLQRRPDILEAEHQLMAANASIGAARAAFFPSISLTANAGTMSRQLSGLFDAGSGS WLFQPSINLPIFTAGSLRASLDYAKIQKDINVAQYEKAIQTAFQEVADGLAARGTFTE QLQAQRDLVKASDEYYQLADKRYRTGVDNYLTLLAAQRSLFTAQQQLITDRLNQLT SEVNLYKALGGGWNQQTVTQQQTAKKEDPQA
30
Referenciák [1] Hancock, W. , and Speert. 2000. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and impact on treatment. Drug Resist. Updat. 3:247–255. [2] Todar’s online textbook of bacteriology, http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html [3] http://www.phar.cam.ac.uk/ri/venter.html [4] Poole, K. 2004. Efflux-mediated multiresistance in gram-negative bacteria. Clin. Microbiol. Infect. 10:12–26. [5] Nehme and Poole. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2007, p. 6118–6127 [6] Akama, H., Matsuura, T. , Kashiwagi, S., Yoneyama, H., Tsukihara, T., Nakagawa, A., Nakae, T. Crystal structure of the membrane fusion protein, MexA, of the multidrug transporter in Pseudomonas aeruginosa. J.Biol.Chem. v279 pp. 25939-42, 2004 [7] Sennhauser, G., Bukowska, M.A.,Gruetter, M.G., Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa. J.Mol.Biol. v389 pp. 134-45, 2009 [8] Akama, H., Kanemaki, M., Yoshimura, M.,Tsukihara, T.,Kashiwagi, T.,Narita, S., Nakagawa, A.,Nakae, T. Crystal structure of the drug discharge outer membrane protein, OprM, of Pseudomonas aeruginosa: dual modes of membrane anchoring and occluded cavity end. J.Biol.Chem. v279 pp. 52816-9 2004 [9] Symmons, Bokma, E. Koronakis, Hughes, and V. Koronakis, The assembled structure of a complete tripartite bacterial multidrug efflux pump, PNAS 2009 [10] Blair and Piddock, Structure, function and inhibition of RND efflux pumps in Gramnegative bacteria: an update Current Opinion in Microbiology 2009, 12:512–519
31
Megjegyzések
32
