ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1.LF UK
Elektroforesa v biochemii
Jan Pláteník (grafická úprava obrázků Richard Buchal)
2007/2008
Elektroforesa
Pojem elektroforesa znamená jakoukoliv experimentální techniku, založenou na pohybu nabitých částic (iontů, molekul, makromolekul) v elektrickém poli v tekutém mediu. Jakákoliv nabitá částice volně existující ve vodném roztoku ve stejnosměrném elektrickém poli zahájí pohyb k opačně nabité elektrodě, rychlost jejího pohybu bude přitom přímo úměrná vloženému napětí, velikosti náboje částice, a nepřímo úměrná její velikosti. Molekuly lišící se v náboji a/nebo ve velikosti lze tak od sebe rozdělit. Elektroforetická analýza je v principu aplikovatelná na jakékoliv částice vybavené za daných experimentálních podmínek nábojem, jako malé kationty či anionty, organické kyseliny, aminokyseliny, peptidy, sacharidy, lipidy, proteiny, nukleotidy, nukleové kyseliny, případně i celé subcelulární částice či celé buňky. Prakticky ale zdaleka nejčastěji jsou předmětem elektroforesy proteiny nebo nukleové kyseliny. Obecné experimentální uspořádání elektroforesy Aby k elektroforetickému dělení vůbec došlo, makromolekuly musí za daných podmínek nést nějaký náboj. Fosfátové skupiny ve struktuře DNA a RNA celkem spolehlivě udělují těmto látkám povahu polyaniontů, které při neutrálním nebo zásaditém pH putují ke kladně nabité elektrodě (anodě). U proteinů je situace poněkud složitější, neboť bílkoviny jsou amfolyty, tj. nesou kladné i záporné skupiny a záleží na pH prostředí (elektroforetického pufru), bude-li výsledný náboj bílkoviny kladný nebo záporný (obr. 1). Většina přirozených živočišných proteinů má isoelektrický bod ve slabě kyselé oblasti, pI = 5-6. Tudíž v mírně alkalickém elektroforetickém pufru (pH asi 8,5), který se používá zdaleka nejčastěji, jsou i proteiny polyanionty a migrují tedy od katody (–) k anodě (+).
Obr. 1: Náboj proteinů. a) Distribuce a počet nábojů v jednoduchém tripeptidu Glu-Ala-Lys ve srovnání s původními aminokyselinami: Peptidová vazba sama je bez nábojů a jejím vznikem tedy původní náboje karboxylů a α-aminoskupin zanikají. V polypeptidovém řetězci může nést náboj jen N-terminální aminoskupina, C-terminální karboxyl a ionizované skupiny v postranních řetězcích aminokyselin, především karboxyly Asp, Glu a amino- či iminoskupiny Arg, Lys a His. b) Typický protein obsahuje mnoho kyselých i bazických ionizovatelných skupin, z nichž každá má svou vlastní disociační konstantu a její protonace závisí na pH media. Obecně v kyselém prostředí jsou karboxylové skupiny protonované a tudíž bez náboje, zatímco v neutrálním a zásaditém nesou záporné náboje. Naopak aminoskupiny jsou v neutrálním a kyselém prostředí protonované a tudíž kladně nabité, zatímco v zásaditém protony i náboje ztrácejí. Při velkém počtu ionizovatelných skupin je výsledný náboj celé proteinové makromolekuly plynulou funkcí pH. Isoelektrický bod (pI) je pH, při kterém se intenzita kladných a záporných nábojů proteinu právě vyrovnává a celkový výsledný náboj makromolekuly je nulový. Hodnota isoelektrického bodu je dána sekvencí (primární strukturou) bíkoviny a je přirozeně pro různé proteiny různá.
2
Elektroforesa O rozdělení sérových proteinů elektroforesou se poprvé pokusil Tiselius v r. 1937. V jeho provedení bílkoviny putovaly k opačně nabité elektrodě ve volném roztoku. Zásadní nevýhodou této tzv. volné elektroforesy je skutečnost, že průchodem elektrického proudu vzniká teplo, a následné konvekční proudění media naruší rozhraní jednotlivých proteinových zón. Proto se dnes elektroforesa obvykle provádí v nějakém nosiči, kterým může být papír, celulosa acetát, gel škrobový, agarosový nebo polyakrylamidový. Poslední dva zmíněné materiály se používají zdaleka nejvíce. Nosič – gel – si můžeme představit jako trojrozměrnou strukturu otevřených pórů vyplněných kapalinou, tato prostorová struktura brání konvekčnímu promíchávání elektroforetického pufru během dělení. Zároveň ale velikost pórů gelu, kterou lze zejména u polyakrylamidu snadno kontrolovat, představuje další důležitý faktor ovlivňující výsledek elektroforetického dělení. Pokud jsou póry velké a nebrání pohybu makromolekul, proteiny se budou od sebe dělit stejně jako ve volném roztoku, tedy podle poměru náboje/velikosti (přesně řečeno, podle povrchové hustoty náboje). Hustší gel s menšími póry ale bude klást pohybu makromolekul i mechanický odpor, tedy bude vykonávat funkci „molekulárního síta“, a proteiny budou ve svém pohybu zpomaleny tím více, čím jsou větší. Jak ukážeme dále, elektroforesu proteinů lze modifikovat tak, aby dělila proteiny čistě a pouze podle náboje, anebo pouze podle velikosti. Nukleové kyseliny, jelikož hustota jejich náboje nezávisí na jejich velikosti (každý další nukleotid je nabitý stejně), lze dělit vlastně pouze podle velikosti, tj. v gelech dostatečně hustých na to, aby fungovaly jako molekulární síta. Dalším důležitým atributem jednotlivých elektroforetických technik je jejich rozlišovací schopnost, což lze zjednodušeně definovat jako počet proteinových zón/skvrn, které lze rozdělením nějaké komplexní směsi získat. V jednoduchém uspořádání, kdy směs proteinů putuje k opačné elektrodě v nějakém nosiči, se jednotlivé zóny proteinů během putování zároveň rozšiřují současně probíhající difúzí. Jeden přístup, jak toto základní omezení rozlišovací schopnosti překonat, je prostě dělení zrychlit, tj. aplikovat vyšší napětí. Rychlost pohybu nabité částice v elektrickém poli v tekutém mediu je obecně přímo úměrná velikosti pole (ve V/cm), náboji částice, a též teplotě prostředí, naopak nepřímo úměrná velikosti částice a odporu prostředí. Při vyšším napětí budou částice migrovat rychleji, zároveň ale při daném odporu systému dle Ohmova zákona musí být i vyšší proud a tudíž i (výrazně) větší produkce tepla. Tak zvané Joulovo teplo vznikající průchodem elektrického proudu totiž závisí na hodnotě odporu prostředí lineárně, ale na intenzitě procházejícího proudu exponenciálně (na druhé mocnině). Jinou možností jak zlepšit rozlišení je zvýšit iontovou sílu elektroforetického media, dokonalejší rozdělení proteinových zón se zde vysvětluje jako důsledek silnějších iontových oblaků obklopujících dělené makromolekuly. Na druhé straně však vyšší iontová síla znamená větší konduktivitu (menší odpor) prostředí a tedy při stejném vloženém napětí opět více procházejícího proudu a produkci tepla. Nakonec tedy praktickým limitem rozlišovací schopnosti základní elektroforesy proteinů se stává schopnost zajistit celému systému účinné chlazení. Existuje však řada elektroforetických technik, ve kterých určité fyzikálně chemické podmínky experimentu pomáhají jednotlivé zóny proteinů během dělení zároveň zaostřovat a vysoké rozlišovací schopnosti se tak dosahuje jiným způsobem. Dále si uvedeme principy základních technik elektroforesy (především) proteinů, jejich aplikací a následných postupů (více o elektroforese DNA je ve stati o molekulárně biologických metodách). Nativní elektroforesa proteinů Základní uspořádání elektroforesy, proteiny vzorku si podržují svou původní (nativní) konformaci, případně oligomerní strukturu (z více podjednotek), náboj i biologickou aktivitu, a v mírně zásaditém pufru putují ke kladně nabité elektrodě. Agarosa je asi nejčastějším nosičem pro tento typ analýzy, i když lze s obdobným výsledkem použít i celulosa acetát a řidší polyakrylamid (jako na obr. 3). Agarosový gel se používá běžně pro základní elektroforesu nukleových kyselin, a ty se v něm dělí podle velikosti. Pro bílkoviny jsou ale póry v agarose příliš veliké, takže funkce molekulového síta se pro ně neuplatňuje – dělení proteinů probíhá podle povrchové hustoty jejich náboje. Bílkoviny, které se liší velikostí, ale nikoliv hustotou náboje, migrují stejně a nelze je od sebe takto oddělit (např. albumin monomer a dimer). Rozlišovací schopnost zde není veliká neboť žádný zaostřovací mechanismus se neuplatňuje. Normální lidské serum se klasicky dělí na 5 frakcí: albumin, α1-, α2-, β- a γ-globulin.
3
Elektroforesa Dělení bílkovin na agarose někdy vykazuje zajímavý, i když spíše nežádoucí jev elektroendosmosy, což se projeví jako pohyb nejpomalejší frakce (γ-globulinů) proti směru jejich elektroforetické pohyblivosti, tj. od startu ke katodě (záporné elektrodě). Podstatou jevu je přítomnost záporně nabitých skupin v agarose, kolem kterých se vytvoří oblak částečně pohyblivých kladných iontů z elektroforetického pufru. Po vložení napětí se tyto kladné ionty pohybují ke katodě a strhávají s sebou nejpomaleji migrující bílkoviny. V agarose zbavené nabitých skupin ani v polyakrylamidu se elektroendosmosa nevyskytuje. Nativní elektroforesa bílkovin lidského sera je jedním ze základních biochemických vyšetření, rutinně prováděných v laboratořích klinické biochemie. Užívá se i pro analýzu isoenzymů, spektra sérových lipoproteinů, variant hemoglobinu apod.
Elektroforesa v polyakrylamidu v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) V této technice předchází elektroforetickému dělení proteinů jejich denaturace (obr. 2a), totiž reakce se silným aniontovým detergentem dodecylsulfátem sodným (SDS, CH3(CH2)11OSO3Na). Všechny bílkoviny bez rozdílu vážou SDS, i když k plné vazbě je třeba vzorek zahřát, typicky 100 ˚C 10 minut, a zároveň umožnit rozštěpení (redukci) disulfidových můstků uvnitř a mezi řetězci přídavkem merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu. Takto zpracovaný protein ztrácí svou nativní konformaci i biologickou aktivitu, navíc množství navázaných aniontů SDS je takové, že vlastní původní náboj bílkoviny se stává zcela nesignifikantní. Všechny polypeptidové řetězce pak mají stejnou hustotu náboje, a následná elektroforesa na polyakrylamidu v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) je dělí čistě a výhradně podle velikosti. S použitím vhodných standardů lze touto technikou zjistit či změřit molekulovou hmotnost studovaného polypeptidového řetězce. SDS-PAGE se obvykle provádí jako diskontinuální, což znamená že polyakrylamidový gel se odlévá ve dvou vrstvách, proteiny vzorku nejdříve vstupují do řidšího koncentračního gelu, kde se zaostřují do úzké zóny, následně ve druhém hustším separačním gelu a vyšším pH se dělí podle velikosti (podrobněji viz obr. 2b). Takto se dosahuje značné rozlišovací schopnosti, sérum lze například rozdělit na několik desítek proteinových zón (obr. 3). Tato technika je dnes patrně nejrozšířenější metodou elektroforetické analýzy proteinů ve výzkumných laboratořích, oblíbená pro stabilitu denaturovaných vzorků, relativní snadnost a vysokou rozlišovací schopnost. Uplatnění nachází i v klinicko-biochemických analýzách proteinového spektra tělních tekutin, například při analýze proteinurie (patologické přítomnosti bílkovin v moči).
Gradientová PAGE Velikost pórů polyakrylamidového gelu lze snadno kontrolovat složením a výchozí koncentrací monomerů polymerační směsi. Je možné připravit i takový gel, ve kterém se velikost pórů směrem k anodě plynule zmenšuje, tj. gel se stává stále hustší. Proteiny se tak během elektroforesy střetávají se stále větším odporem nosiče, a jejich migrace se tím postupně zpomaluje, až konečně se v určité oblasti gelu zcela zastaví. Záleží přitom na velikosti bílkoviny (menší protein doputuje dále) a tak tato technika umožňuje dělení nativních proteinů podle velikosti. Rozlišovací schopnost je vysoká neboť zóny proteinů mají během dělení tendenci se zaostřovat; protože proteinové molekuly, které jsou „pozadu“, jsou ještě v řidším gelu, migrují rychleji a mají tendenci dohánět molekuly, které jsou více „napřed“ a tudíž více zpomaleny odporem nosiče.
4
Elektroforesa
Obr. 2: Princip diskontinuální SDSPAGE. a) Denaturace vzorku povařením s dodecylsulfátem sodným (SDS, váže se na polypeptidový řetězec a ruší strukturní organizaci bílkoviny, zároveň jí uděluje silný záporný náboj) a dithiothreitolem (DTT, redukuje a tím štěpí disulfidové vazby). b) Mechanismus zaostřování proteinových zón. Elektroforetický pufr obsahuje jediný + – kation (Tris ) a více aniontů (Cl a glycinát). Uprostřed: SDS-denaturované proteiny vzorku nejprve vstupují do řidšího koncentračního gelu, který nebrání pohybu bílkovin a ty vzhledem ke stejné hustotě náboje (dané navázaným SDS) migrují všechny stejně. Zároveň ale i ostatní anionty pufru putují k anodě, při pH 6,8 jsou proteiny sevřeny mezi zónou chloridů a glycinátových iontů, tím se zaostřují do jediné úzké zóny. Vpravo: po vstupu do separačního gelu a vyššího pH se zvyšuje ionizace glycinátových iontů a ty předeženou proteiny. Hustší gel zároveň zpomaluje pohyb proteinů, a to tím více čím je bílkovina větší. Zóna proteinů vstupující do separačního gelu se tak začne dělit podle velikosti.
Obr. 3: Normální králičí sérum rozdělené na polyakrylamidu za nativních podmínek (vlevo) a technikou SDS-PAGE. Za pozornost stojí podstatně větší rozlišovací schopnost SDS-PAGE. Albumin (MW cca 66000) jako nejhojnější sérový protein tvořený jediným polypeptidovým řetězcem snadno identifikujeme na obou elektroforeogramech. Naopak pro imunoglobulin IgG, což je tetramer složený ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců spojených disulfidovými můstky, se výsledek obou elektrofores dost liší: zatímco za nativních podmínek migruje jako nejpomalejší γ-globulinová frakce, na SDS-PAGE se objevují zvlášť jeho těžké řetězce (MW cca 55000) a lehké řetězce (MW cca 25000).
5
Elektroforesa Isoelektrická fokusace Isoelektrická fokusace (IEF) naopak dělí proteiny čistě a výhradně podle náboje a umožňuje zjištění isoelektrického bodu bílkoviny. Dosahuje se toho elektroforetickým dělením proteinů v gradientu pH, vytvořeném komplexní směsí (50-100) amfolytů (amfoterních polyaminokarboxylových kyselin), z nichž každá má jiný isoelektrický bod, a v gelu po vložení elektrického napětí se rozmístí dle hodnot svých isoelektrických bodů tak, že výsledkem je plynulý gradient pH. Jednotlivé proteiny pak v tomto gradientu migrují k anodě či katodě tak dlouho až naleznou místo, kde lokální pH odpovídá jejich isoelektrickému bodu, a tam se zastaví, neboť při pH=pI výsledný náboj bílkoviny je 0. Zóny mají opět tendenci k zaostřování, neboť molekula bílkoviny, která difunduje mimo místo, kde pH=pI, opět náboj získá a je v elektrickém poli nucena k pohybu zpět do středu zóny (proto isoelektrická fokusace). Lze tak od sebe rozdělit proteiny, jejichž pI se liší o pouhých 0,02 jednotek pH. 2D Elektroforesa Při elektroforese ve dvou dimenzích (2D) se směs proteinů nejprve dělí podle náboje isoelektrickou fokusací, a potom ve druhé dimensi podle velikosti v přítomnosti SDS (obr. 4). Kombinace separace podle pI a podle molekulární hmotnosti umožňuje rozlišení nedosažitelné kteroukoliv z „1D“ technik – z jednoho vzorku lze tak na jediném gelu získat až několik tisíc proteinových skvrn.
Obr. 4: Princip 2D elektroforesy. Vlevo: isoelektrická fokusace ve válečcích řídkého polyakrylamidu, proteiny se rozdělí podle isoelektrického bodu. Vpravo: gel po fokusaci se ekvilibruje s SDS a přiloží na destičku hustšího polyakrylamidu, dělení jednotlivých zón z první dimense nyní probíhá podle velikosti polypeptidových řetězců. (Podle materiálů firmy Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden, 1983)
Barvení, densitometrie a blotting Po gelové elektroforese proteinů nebo nukleových kyselin následuje vždy detekce rozdělených komponent vzorku. Tak pro zviditelnění DNA v agarosovém gelu se používá fluoreskující ethidium bromid. Obdobně můžeme všechny proteiny bez rozdílu přímo v gelu obarvit např. Coomassie briliantovou modří nebo amidočerní. Když elektroforeogram sérových bílkovin obarvíme například na lipidy (Sudanovou černí), získáme informaci o spektru sérových lipoproteinů. Ke kvantifikaci jednotlivých zón obarvených proteinů slouží densitometrie, což je v zásadě fotometrická analýza – paprsek světla o určité vlnové délce prochází skrz obarvený a fixovaný
6
Elektroforesa elektroforeogram, a stupeň jeho absorpce jednotlivými zónami čte fotodetektor na druhé straně. Výsledky elektroforesy sérových bílkovin v klinické biochemii se obvykle vydávají s densitometrickým vyhodnocením jako % jednotlivých frakcí z celku. Nesmírně účinné a rozšířené jsou přístupy, které spojují rozlišovací schopnost elektroforesy se specifickou detekcí určité sekvence DNA pomocí hybridizace s vhodně značenou DNA sondou, anebo detekcí určité bílkoviny pomocí interakce se specifickou a rovněž označenou protilátkou. Tyto reakce je však obtížné provádět s komponenty vzorku po elektroforese uvězněnými v trojrozměrné struktuře gelového nosiče. Proto se velmi často po elektroforese provádí blotting, což znamená transfer fragmentů DNA nebo proteinů z gelu na povrch blotovací membrány. Materiál membrány může být nitrocelulosa, nylon nebo PVDF (polyvinyliden fluorid), hybnou silou transferu může být jen vzlínání tekutiny skrz póry v gelu, na který je přiložena blotovací membrána, nebo se využívá vakua či příčně aplikovaného elektrického pole. Blotovací techniku poprvé použil profesor Edward Southern v roce 1975 pro fragmenty DNA. Na jeho počest se blotování DNA říká Southern blotting. Pro další aplikace tohoto přístupu se ujalo pojmenovávání podle světových stran: tak blotování RNA se říká Northern blotting, zatímco blotování proteinů se označuje jako Western blotting. Kapilární elektroforesa Všechny výše zmíněné příklady gelové elektroforesy se provádějí ve válečcích nebo (mnohem častěji) v destičkách odlitého gelu. U kapilární elektroforesy je však technické uspořádání odlišné – dělení probíhá v tenké (vnitřní průměr 10-100 µm) a dosti dlouhé (20-200 cm) kapiláře, která svými konci zasahuje do komor s elektroforetickým pufrem a elektrodami. Vlastní elektroforetická separace přitom může být podle kteréhokoliv z výše uvedených principů, tedy může probíhat jako volná nebo gelová elektroforesa, isoelektrická fokusace apod. Část kapiláry obvykle slouží pro detekci jednotlivých rozdělených komponent vzorku, která může být založena na fotometrii nebo laserem excitované fluorescenci. Nezískává se tak žádný permanentní elektroforeogram, ale celé uspořádání se spíše blíží chromatografickým analyzátorům. Kapilární elektroforesa má dvě zásadní výhody. Tou první je možnost účinnějšího odvodu tepla vznikajícího průchodem elektrického proudu právě v důsledku malého průměru kapiláry. Díky tomu je možné aplikovat vysoké napětí a zkrátit tak čas celé analýzy (někdy i méně než 1 minuta/vzorek). Úzká kapilára také odstraňuje problém konvekčního proudění u volné elektroforesy. Druhou zásadní výhodou je snadná automatizace. Výše zmíněnou základní elektroforesu lidského sera v klinické biochemii lze takto úplně automatizovat. Jiným příkladem může být Sangerova metoda sekvenování DNA, která je též založena na elektroforese. Nahrazení původních pracně a ručně odlévaných sekvenačních gelů kapilární elektroforesou bylo jednou z hlavních technologických inovací, které umožnily konstrukci výkonných automatických sekvenátorů, nezbytných pro úspěšné „přečtení“ velkých genomů člověka a dalších modelových organismů. Proteomika Po sekvenování genomu člověka a dalších organismů se hlavní výzvou pro biomedicínský výzkum stává katalogizace a charakterizace všech proteinů lidského těla a dalších modelových organismů – tedy celého proteomu. Vědnímu oboru zabývajícímu se studiem proteomu se říká proteomika. Experimentálním základem proteomiky je 2D elektroforesa, jejíž obrovská rozlišovací schopnost umožňuje i nejkomplexnější vzorek rozdělit na tisíce skvrn - jednotlivých proteinů. Dalším krokem je vystřižení skvrn z gelu a identifikace každé bílkoviny. To se typicky provádí tak, že bílkovina se natráví specifickou proteasou, která štěpí jen určité sekvence (například trypsin štěpí jen za Arg a Lys, pokud nenásleduje Pro), a výsledná směs fragmentů se podrobí analýze hmotnostním spektrometrem, který změří jejich molekulovou hmotnost s přesností na desetiny Daltonu. Porovnání změřených hmotností s předpovězenými na základě sekvencí v proteinových a genových databázích v internetu pak umožňuje identifikaci bílkoviny. Cílem je i pro velmi komplexní vzorky získat jako výsledek úplný seznam proteinů ve vzorku přítomných, přičemž i tady technologický vývoj směřuje k systémům, které celou sekvenci analýz, tj. 2D elektroforesu, vystřihování skvrn, trávení trypsinem a analýzu hmotnostním spektrometrem co možná nejvíce automatizují.
7
