Urofollitropinum
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 1
01/2008:0958
UROFOLLITROPINUM Urofollitropin [97048-13-0] DEFINÍCIÓ Az urofollitropin menopauzán átesett nők vizeletéből nyert, menopauzális gonadotropint tartalmazó száraz készítmény. A készítmény follikulusstimuláló aktivitással rendelkezik, és egyáltalán nincs vagy gyakorlatilag nincs luteinizáló aktivitása. A készítmény hatóértéke legalább 90 NE/mg follikulusstimuláló hormon (hFSH). A luteinizáló hormon (intersticiális sejtstimuláló hormon [hLH(ICSH)]) egységeinek és a follikulusstimuláló hormon egységeinek aránya legfeljebb 1:60. ELŐÁLLÍTÁS A készítmény előállítható megfelelő frakcionálási eljárást követő immunaffinitási kromatográfiával. SAJÁTSÁGOK Küllem: csaknem fehér vagy enyhén sárgás por. Oldékonyság: vízben oldódik. AZONOSÍTÁS Amennyiben a készítményt a tartalmi meghatározásban előírtak szerint adjuk be, ivaréretlen nőstény patkányokban petefészek-megnagyobbodást okoz. VIZSGÁLATOK Hepatitis vírus antigének. Megfelelően érzékeny immunkémiai módszerrel (2.7.1) vizsgálva hepatitis vírus antigének ne legyenek kimutathatók.
Urofollitropinum
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 2
HIV antigén. Megfelelően érzékeny immunkémiai módszerrel (2.7.1) vizsgálva HIV-antigén ne legyen kimutatható. Fennmaradó luteinizáló aktivitás. Az FSH és LH Nemzetközi Egysége a humán vizeletben található follikulus stimuláló hormon és luteinizáló hormon (intersticiális sejtstimuláló hormon) Nemzetközi Standardjának meghatározott mennyiségeiben található aktivitás. A Nemzetközi Standard olyan keverék, amely menopauzán átesett nők vizeletéből készült liofilizált kivonat és laktóz keverékéből áll. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységekben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet határozza meg. A meghatározáshoz körülbelül 21 napos, ivaréretlen nőstény patkányokat használunk. A legnehezebb és a legkönnyebb patkány testsúlyának különbsége legfeljebb 10 g legyen. A patkányokat véletlenszerűen 4 egyenlő nagyságú, egyenként legalább 6 egyedet tartalmazó csoportba osztjuk. Amennyiben rendelkezésünkre áll 4-4, egy alomban született egyed, ezekből minden csoportba egyet-egyet osztunk be, és alom szerint megjelöljük őket. Első nap minden patkányt szubkután 50 NE, 0,5 ml R nátrium-klorid-tartalmú foszfát-albumin tompítóoldatban (pH 7,2) oldott R gonadotropin szérummal, a negyedik napon pedig 25 NE, 0,5 ml R nátrium-klorid-tartalmú foszfát-albumin tompítóoldatban (pH 7,2) oldott R koriongonadotropinnal oltunk be. Az összehasonlító készítményből kiválasztunk 3 dózist úgy, hogy már a legkisebb dózis is minden patkányban a petefészek aszkorbinsav-tartalmának csökkenését idézze elő, de a legnagyobb dózis se okozzon minden patkányban maximális aszkorbinsav kiürülést. A felhasznált dózisok mértani sort adjanak. Első közelítésként 0,5 NE, 1,0 NE, illetve 2,0 NE dózisokat próbálhatunk ki, bár a felhasznált dózis az állatok érzékenységétől függ. A vizsgálandó készítmény akkora dózisát válasszuk, amely várhatóan 60X NE follikulusstimuláló hormont (hFSH) tartalmaz, ahol X = az összehasonlító készítmény középső dózisának hLH aktivitása NE-ben. A vizsgálandó készítmény teljes dózisát és külön az összehasonlító készítmény teljes dózisait 1,0–1,0 ml R nátrium-klorid-tartalmú foszfát-albumin tompítóoldatban (pH 7,2) feloldjuk. Az oldatokat a koriongonadotropin befecskendezése után 6 nappal fecskendezzük be az egyes patkány-csoportok farki vénájába. A beadás után pontosan 4 órával leöljük a patkányokat, és kivesszük a petefészkeket. A petefészkekről minden külső folyadékot és szövetet eltávolítunk, és késedelem nélkül megmérjük a tömegüket. Minden egyes patkány petefészkét a következőképpen kezeljük. A petefészket szétzúzzuk, és 4 °C-on, 2 percen belül, frissen elkészített, 25 g/l töménységű R metafoszforsavban homogenizáljuk, majd ugyanezen oldattal 7 ml-re hígítjuk.
Urofollitropinum
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 3
A homogenizátumot 30 percig 4 °C-on állni hagyjuk, majd ugyanezen a hőmérsékleten körülbelül 2500 g-vel centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot szükség esetén 0,22 μm-es szűrőn átszűrjük. Friss oldatot készítünk a következő módon: R nátrium-acetát 45,3 g/l töménységű, R ecetsavval pH 7-re beállított oldatoának 2 ml-ét, 3 ml R vizet és 2 ml R standardizált diklórfenolindofenol–oldatot elegyítünk. Az így kapott oldat 2 mlét 2 ml tiszta felülúszó folyadékkal elegyítjük, majd az elegyítés után 30 másodperccel körülbelül 520 nm-es maximumon megmérjük az oldat abszorbanciáját (2.2.25). Összehasonlító oldatként 25 g/l töménységű R metafoszforsavban oldott, ismert mennyiségű CRS aszkorbinsavat tartalmazó oldatot használunk, amelyet ugyanúgy kezeltünk, mint a vizsgálati oldatot. Az aszkorbinsav mennyiségét az aszkorbinsavval kapott kalibrációs görbéből számítjuk ki, és mg/0,1 g petefészek-tömegben fejezzük ki, hogy megkapjuk a petefészkek aszkorbinsav-tartalmát. Kiszámítjuk a vizsgálandó készítménnyel kezelt patkányok petefészkei aszkorbinsav-tartalmának középértékét és a középérték szórását. Az összehasonlító készítmény mindegyik dóziscsoportjából származó petefészkek aszkorbinsav-középértékét a dózis logaritmusának függvényében ábrázoljuk, és standard analízis-módszerek segítségével (a legkisebb négyzetek módszere) elemezzük az aszkorbinsav-tartalom csökkenés és a befecskendezett dózis logaritmusa közötti regressziót. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, amennyiben: −
a meredekség b állandója szignifikáns az 5%-os szignifikancia szinten,
−
az összehasonlító készítménnyel kezelt csoportok esetében a lineáris regresszió négyzetösszege az aszkorbinsav-tartalom teljes négyzetösszegének legalább 95%-ával egyenlő,
−
a vizsgálandó készítménnyel beoltott csoport csoporton belüli aszkorbinsavtartalom varianciája az 5%-os szignifikancia szinten nem különbözik szignifikánsan az összehasonlító készítménnyel beoltott csoport csoporton belüli aszkorbinsav-tartalom varianciájától.
Az 5%-os szignifikancia szinten a vizsgálandó készítménnyel kezelt patkányok petefészkei aszkorbinsav-tartalmának középértéke ne legyen szignifikánsan alacsonyabb, mint az összehasonlító készítmény középdózisával kezelt patkányoké (melyet a regressziós egyenletből számítunk ki). Víztartalom (2.5.32): legfeljebb 5,0%.
Urofollitropinum
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 4
Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 0,40 NE/NE urofollitropin. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag – abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást – feleljen meg e vizsgálat követelményének is. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Az urofollitropin follikulusstimuláló aktivitását úgy becsüljük meg, hogy adott körülmények között összehasonlítjuk a petefészek-megnagyobbító hatását koriongonadotropinnal kezelt ivaréretlen patkányokban a humán vizelet follikulusstimuláló hormon és luteinizáló hormon Nemzetközi Standard készítménynek vagy egy Nemzetközi Egységekben kalibrált összehasonlító készítmény ugyanilyen hatásával. Az FSH és LH Nemzetközi Egysége az az aktivitás, amelyet a humán vizelet follikulusstimuláló hormonja és luteinizáló hormonja (intersticiális sejt-stimuláló hormonja) Nemzetközi Standardjának meghatározott mennyisége tartalmaz. A Nemzetközi Standard menopauzán átesett nők vizeletéből származó liofilizált kivonat és laktóz keveréke. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységekben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet határozza meg. A meghatározáshoz azonos fajtájú, 19–28 napos, ivaréretlen nőstény patkányokat használunk, amelyek korkülönbsége legfeljebb 3 nap, és amelyeknél a legnehezebb és a legkönnyebb egyed testtömege között legfeljebb 10 g a különbség. A patkányokat véletlenszerűen 6 egyenlő nagyságú, legalább 5–5 egyedet tartalmazó csoportra osztjuk. Amennyiben rendelkezésünkre áll 6–6, egy alomban született egyed, minden csoportba beosztunk egyet-egyet, és alom szerint megjelöljük őket. Kiválasztunk 3 dózist az összehasonlító készítményből és 3 dózist a vizsgálandó készítményből úgy, hogy a legkisebb dózis néhány patkányban pozitív választ váltson ki, de a legnagyobb dózis se váltson ki minden egyedben maximális reakciót. A felhasznált dózisok mértani sor szerint növekedjenek. Első közelítésként 1,5 NE, 3,0 NE, illetve 6,0 NE dózisokat próbálhatunk ki, bár a felhasznált dózis a felhasznált állatok érzékenységétől füg, ami tág határok közt változhat. A vizsgálandó készítmény összmennyiségét és a felhasználandó napi adagoknak megfelelő összehasonlító készítmény teljes dózisát megfelelő mennyiségű R nátrium-klorid-tartalmú foszfát-albumin tompítóoldatban (pH 7,2) feloldjuk úgy, hogy a napi adagot körülbelül 0,5 ml-es térfogatokban adjuk be. A tompítóoldat a napi adagban legalább 14 NE koriongonadotropint tartalmazzon a teljes luteinizáció biztosítása céljából. Megfelelő mennyiségű mikrobiológiai
Urofollitropinum
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 5
tartósítószert, pl. 4 g/l töménységű fenolt vagy 0,02 g/l töménységű tiomerzált adunk a készítményekhez. Az oldatokat 5 ± 3 °C-on tároljuk. Minden patkányba szubkután befecskendezzük a csoportjához rendelt napi dózist. Az első injekció után 24, majd 48 órával megismételjük a beadást. Az utolsó injekció után kb. 24 órával leöljük a patkányokat, és kivesszük a petefészkeket. A petefészkekről minden külső folyadékot és szövetet eltávolítunk, és azonnal megmérjük minden állat 2 petefészkének tömegét. A szokásos statisztikai módszerek segítségével kiszámoljuk az eredményt, a 2 petefészek együttes tömegét véve válasznak. (A tartalmi meghatározás pontossága növelhető a szerv tömegének megfelelő korrekciójával, amennyiben azt az adott egyed tömegéhez viszonyítjuk; a kovariancia analízis módszere is alkalmazható). A becsült hatóérték a deklarált érték 80–125%-a legyen. A becsült hatóérték megbízhatósági határértékei (P = 0,95) a deklarált érték 64–156%-a között legyenek. ELTARTÁS Légmentesen záró, garanciazáras tartályban, fénytől védve, 2–8 °C-on. Amennyiben az anyag steril, úgy steril, légmentesen záró, garanciazáras tartályban. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: −
tartályonként a készítmény follikulusstimuláló hormon aktivitását, Nemzetközi Egységekben kifejezve,
−
a hatóértéket, NE follikulusstimuláló hormon/mg-ban.
