Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie
Semestrální práce 2000
2.2 - Kalibrace a limity její přesnosti
Přednášející:
Prof. RNDr. Milan Meloun, DrSc.
Vypracoval:
Ing. Vladimír Bartoš FNsP Ostrava Imunoanalytická laboratoř Kliniky nukleární medicíny a Referenční laboratoř MZ ČR pro metody RSA
1
Příklad 1: Lineární kalibrace U přímkové kalibrační závislosti vyčíslete bodový a intervalový odhad pro tři neznámé koncentrace a současně vyčíslete i limity přesnosti. Kalibrační závislost, charakterizující naměřené četnosti radioaktivity (cpm) na koncentraci thymidinkinázy lze u radioreceptorové analýzy (RRA), v případě koncentrací do 100 U/l, považovat za lineární. Zjistěte koncentrace thymidinkinázy ve třech kontrolních vzorcích, jestliže u těchto vzorků byly změřeny hodnoty cpm: 749, 2458 a 4579. Současně vyčíslete limity přesnosti stanovení, jestliže byly experimentálně zjištěny následující odezvy kalibrátorů A, B, C, D, E a F, přičemž analýza každého z nich byla provedena třikrát: Kalibrátor Označení A B C D E F
Koncentrace [U/l] 2,50 5,00 10,0 20,0 40,0 80,0
Analýza 1 [cpm] 555 974 1951 3787 7313 14396
Analýza 2 [cpm] 521 972 1867 3650 7206 14379
Analýza 3 [cpm] 561 1013 1886 3635 7356 14339
Řešení:
S využitím programu ADSTAT (modul Kalibrace : Kalibrační přímka) byla experimentálními daty pomocí metody nejmenších čtverců proložena kalibrační přímka ve tvaru: cpm = 178,5 (±0,4)*c + 112,2(±16,7) přičemž oba parametry, směrnice i úsek jsou statisticky významné na hladině významnosti 0,05.
Obr.1.1: Kalibrační přímka – kalibrace TK Odhad směrodatné odchylky reziduí s(e) se rovná 50,8 cpm což je mírně nad úrovní přirozeného pozadí měření radioaktivity (cca 40 cpm).
2
Z analýzy vlivných bodů by se dalo usuzovat na přítomnost vlivných bodů v případě bodu 10 a 15, které se dají charakterizovat jako středně vlivné outliery, body 16, 17 a 18 jsou charakterizovány jako extrémní. V případě řešení úkolu však nebyl vyloučen žádný vlivný bod. Limity přesnosti kalibrace jsou uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT – Příloha č. 1, pod bodem (4) Kalibrační meze. Přímé bodové odhady i korigované Naszodiho modifikované odhady koncentrací jsou v případě všech tří kontrolních vzorků vždy prakticky shodné, z čehož vyplývá, že provedení korekce na vychýlení přímého bodového odhadu v daném případě není nutná. Bodové i intervalové odhady jsou pro jednotlivé kontrolní vzorky uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT – Příloha č. 1, pod bodem (5) Kalibrační tabulka. Závěr: Nalezené koncentrace jednotlivých kontrolních vzorků tedy jsou: Vz. č. 1: Vz. č. 2: Vz. č. 3:
c1 = 3,567 (2,936 – 4,199); 0,395; (2,37) U/l c2 = 13,15 (12,52 – 13,77); 0,395; (2,37) U/l c3 = 25,02 (24,44 – 25,64); 0,395; (2,37) U/l
Byly stanoveny následující limity přesnosti kalibrační přímky: Kritická úroveň,
yc: 1.4760E+02
xc:
1.9812E-01
Limita detekce,
yd: 1.8271E+02
xd:
3.9480E-01
Mez stanovitelnosti,
ys: 5.3478E+02
xs:
2.3672E+00
3
Příklad 2: Nelineární kalibrace U nellineární (křivkové) kalibrační závislosti vyčíslete bodový a intervalový odhad pro tři neznámé koncentrace a současně vyčíslete i limity přesnosti. Kalibrační závislost v případě imunoradiometrické analýzy (IRMA) neuron-specifické enolázy (NSE), charakterizující změnu naměřené četnosti radioaktivity (cpm) v závislosti na koncentraci NSE, má nelineární charakter. Zjistěte koncentrace NSE v případě tří kontrolních vzorků, jestliže při analýze těchto vzorků byly změřeny hodnoty cpm: 550, 4310 a 6350. Současně vyčíslete limity přesnosti stanovení, jestliže byly experimentálně zjištěny pro jednotlivé kalibrátory A, B, C, D a E následující hodnoty cpm (přičemž analýza každého z nich byla provedena třikrát): Kalibrátor Označení A B C D E
Koncentrace [µg/l] 0,00 24,5 49,0 98,0 154,0
Analýza 1 [cpm] 208 2380 7805 19596 26900
Analýza 2 [cpm] 221 2490 7783 19635 27009
Analýza 3 [cpm] 215 2394 7853 19619 26831
Řešení:
Vzhledem k tvaru kalibrační závislosti byla pro proložení kalibrační křivky zvolena v programu ADSTAT metoda „Kubický spline“ v modulu Kalibrace. S ohledem na esovitý charakter křivky, na základě srovnání hodnot parametrů RSC, Mer[%] a s(e) a z porovnání limit přesností stanovení, byla zvolena varianta s jedním uzlovým bodem, přičemž jeho umístění bylo zvoleno pro souřadnici x = 55 µg/l. Umístění uzlového bodu v oblasti mezi 40-80 µg/l nemělo zásadní vliv na uvedené parametry. Počet uzlů Reziduální součet čtverců, RSC Průměr absolutních hodnot reziduí, Me Průměr relativních reziduí, Mer[%] Odhad reziduálního rozptylu, s^2(e) Odhad směrodatné odchylky reziduí, s(e)
0 4.1627E+05 1.3954E+02 14.394 3.7843E+04 1.9453E+02
1 2.6695E+04 3.0800E+01 0.921 2.6695E+03 5.1668E+01
Koeficienty kalibrační rovnice ve tvaru y = e[i]*x3 + f[i]*x2 + g[i]*x + h[i] jsou pro oba úseky i=1,2 uvedeny v Příloze č.2, část „Výstup“ pod bodem (1)Parametry kalibrace. Proložená kalibrační křivka je znázorněna na obr. č. 2.1.
4
Obr.2.1.: Kalibrační křivka – kalibrace NSE Odhad směrodatné odchylky reziduí s(e) se rovná 51,7 cpm což je mírně nad úrovní přirozeného pozadí měření radioaktivity (cca 40 cpm). Limity přesnosti kalibrace jsou uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT – Příloha č. 1, pod bodem (4) Kalibrační meze. Inverzní bodové odhady koncentrací i jejich intervalové odhady jsou pro jednotlivé kontrolní vzorky uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT – Příloha č. 2, část výstup, pod bodem (5) Kalibrační tabulka. Závěr: Nalezené koncentrace jednotlivých kontrolních vzorků tedy jsou: Vz. č. 1: Vz. č. 2: Vz. č. 3:
c1 = 9,78 (8,92 – 10,61); 4,975; (6,370) µg/l c2 = 34,17 (33,92 – 34,41); 4,975; (6,370) µg/l c3 = 43,05 (42,83 – 43,29); 4,975; (6,370) µg/l
Byly stanoveny následující limity přesnosti kalibrační závislosti:
Kritická úroveň,
yc: 2.811329E+02
xc: 4.975441E+00
Limita detekce,
yd: 3.393416E+02
xd: 6.370262E+00
5
Příklad 3: Rozlišení mezi lineární a nelineární kalibrací U experimentální kalibrační závislosti rozhodněte o počtu uzlových bodů, typu splinové závislosti a současně vyčíslete bodový a intervalový odhad pro tři neznámé koncentrace a současně vyčíslete i limity přesnosti. V případě imunoradiometrického stanovení růstového hormonu (STH) vyjadřuje kalibrační křivka závislost naměřené četnosti radioaktivity (cpm) na koncentraci STH. Pro konstrukci kalibrační závislosti použijte následující experimentální data zjištěná při analýze jednotlivých kalibrátorů (opakovaně, každý 3x), obsahujících deklarované množství růstového hormonu. (viz. Tabulka 3.1.). Současně vyčíslete limity přesnosti stanovení Pro tři neznámé vzorky, u nichž byly změřeny hodnoty cpm: 556, 2385 5265 zjistěte jako bodové a intervalové odhady odpovídající koncentrace STH.,
Kalibrátor Označení
Koncentrace [µg/l] cpm1
cpm2
cpm3
A B C D E F G H
0 0,5 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0
7,500000 E+01 3,120000 E+02 5,280000 E+02 1,120000 E+03 2,531000 E+03 4,052000 E+03 5,443000 E+03 6,545000 E+03
9,400000 E+01 2,770000 E+02 5,590000 E+02 1,151000 E+03 2,518000 E+03 4,079000 E+03 5,420000 E+03 6,581000 E+03
6,000000 E+01 2,950000 E+02 5,730000 E+02 1,095000 E+03 2,550000 E+03 4,031000 E+03 5,472000 E+03 6,567000 E+03
Tabulka 3.1.: Experimentální data kalibrace STH Řešení:
S využitím programu ADSTAT (modul Lineární regrese : Regresní diagnostika) byla indikována nevhodnost použití lineárního kalibračního modelu (zřetelně vyplývá z rozložení experimentálních dat i z nenáhodného rozložení tvaru závislosti reziduí na predikci. (viz. Obr.3.1.)
Obr.3.1.: Kalibrační přímka a závislost reziduí na predikci. Ve druhé fázi bylo provedeno pomocí programu ADSTAT (modul Kalibrace – Kalibrační přímka) zhodnocení vhodnosti jednotlivých typů nelineární kalibrace pomocí funkcí Kvadratický spline a
6
Kubický spline, přičemž byl sledován vliv počtu uzlů na reziduální součet čtverců (RSC), průměr relativních reziduí (Mer[%]) a odhad směrodatné odchylky reziduí s(e). Rovněž byl sledován vliv na kritickou úroveň a limitu detekce kalibrace. Výsledky testování optimálního způsobu proložení nelineární kalibrační závislosti jsou shrnuty v tabulce č. 3.2.
Uzly RSC Me Mer s(e) xc xd
0 274000 96,6 34,8 114 -
Kvadratický spline 1 2 14100 8670 20,1 16,3 5,79 3,32 26,5 21,3 0,051 0,052 0,098
3 7740 15,3 3,30 20,7 0,053 0,099
0 9070 16,5 3,35 21,3 0,049 0,093
1 8170 16,0 3,43 20,7 0,055 0,102
Kubický spline 1 [6,0] 2 7995 7820 15,7 15,4 3,40 3,31 20,5 20,8 0,053 0,057 0,099 0,104
3 7640 15,1 3,25 21,2 0,059 0,105
Tabulka 3.2. Testování optimálního počtu uzlů a způsobu proložení splinové kalibrační závislosti. Na základě provedeného rozboru lze usuzovat, že optimálním způsobem proložení nelineární kalibrační závislosti je použití kubického splinu, přičemž počet uzlů neovlivňuje zásadním způsobem parametry charakterizující reziduální rozptyl proložení. Optimálním počtem se jeví 1 uzel, přičemž by bylo vhodnější jeho mírně excentrické umístění k vyšším hodnotám vzhledem k rozsahu koncentrací (např. jeho posunutí do polohy c = 6,0 µg/l). I když při použití polynomu 3. stupně je docíleno dobré vizuální shody regresní křivky s experimentálními body, je na grafu závislosti reziduí na predikci i z grafu Jacknife reziduí patrná přítomnost bodů, ovlivňujících kvalitu proložení (viz. Obr. 3,2,).
Obr.3.2.: Graf závislosti reziduí na predikci a graf Jacknife reziduí . Z tohoto pohledu se jako vlivné body jeví především měření č. 10 a 21, podezřelým je i měření č. 18. Tato skutečnost byla rovněž potvrzena na základě detekce vlivných bodů provedené programem ADSTAT (modul Lineární regrese : Regresní diagnostika), což je zřejmé např. z L-R grafu nebo i McCulloh-Meeterova grafu pro indikaci vlivných bodů (viz. Obr. 3.3.). Z originálních experimentálních dat byly proto vyloučeny body č. 10 a 21 a bylo opakovaně provedeno zhodnocení reziduálních parametrů kalibrace a zjištěny limity přesnosti kalibrace. Výsledné parametry se pouze zanedbatelně lišily při použití jednoho a žádného uzlu (při použití nulového počtu uzlů však nebyly vyčísleny limity přesnosti kalibrace xc a xd).
7
Závěr: Proto byl jako výsledný model kalibrace použit kubický spline s jedním uzlovým bodem ve středu rozsahu nezávisle proměnné, tj. pro koncentraci STH c=5,0 µg/l. Proložená kalibrační křivka je uvedena na Obr. 3.4. Hodnoty jednotlivých parametrů kalibrační křivky jsou uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT –Příloha č. 3, část Výstup, bod (1) Parametry kalibrace.
Obr.3.3.: L-R a McCulloh-Meeterův graf pro indikaci vlivných bodů.
Obr.3.4.: kalibrace STH. Limity přesnosti kalibrace byly zjištěny pomocí programu ADSTAT : xc = 0,048 µg/l
xd = 0,090 µg/l
a jsou uvedeny rovněž v Příloze č. 3, Výstupu z programu ADSTAT , část Výstup, bod (4) Kalibrační meze . Inverzní bodové odhady koncentrací jsou pro jednotlivé kontrolní vzorky uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT – Příloha č. 3, část Výstup, bod (5) Kalibrační tabulka, kromě toho také v následující tabulce č. 3.4..
Vzorek č. 1 Vzorek č. 2 Vzorek č. 3
y Cpm 556 2385 5265
x µg/l 1,012 3,797 7,702
LL µg/l 0,985 3,773 7,667
LU µg/l 1,040 3,820 7,738
Tabullka 3.4.: Nalezené koncentrace jednotlivých kontrolních vzorků 8
Název souboru: Adresář: Šablona: Název: Předmět: Autor: Klíčová slova: Komentáře: Datum vytvoření: Číslo revize: Poslední uložení: Uložil: Celková doba úprav: Poslední tisk: Jako poslední úplný tisk Počet stránek: Počet slov: Počet znaků:
Kalibrace E:\VYUKA\LS\Diskety\LS89002\Bartos\Kalibrace D:\Program Files\Microsoft Office\Sablony\Normal.dot 1 Ing. Vladimír Bartoš
31.08.00 14:35 3 31.08.00 14:57 Ing. Vladimír Bartoš 20 min. 14.09.00 13:12 8 1 614 (přibližně) 9 204 (přibližně)
