UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE
MODERNÍ MIKROEXTRAKČNÍ METODY PRO ANALÝZY TĚKAVÝCH SLOŽEK VE VZORCÍCH BYLINNÉHO PŮVODU
DISERTAČNÍ PRÁCE
AUTOR PRÁCE: Ing. Andrea Čížková VEDOUCÍ PRÁCE: doc. Ing. Martin Adam, Ph.D. 2015
UNIVERSITY OF PARDUBICE FACULTY OF CHEMICAL-TECHNOLOGY DEPARTMENT OF ANALYTICAL CHEMISTRY
MODERN MICROEXTRACTION METHODS FOR ANALYSES OF VOLATILE COMPONENTS IN SAMPLES OF HERBAL ORIGIN
DISSERTATION THESIS
AUTHOR: Andrea Čížková, MSc. SUPERVISOR: Assoc. Prof. Martin Adam, Ph.D. 2015
Tímto prohlašuji, že tuto práci jsem vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahuje práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, zejména se skutečností, že Univerzita Pardubice má právo na uzavření licenční smlouvy o užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona, a s tím, že pokud dojde k užití této práce mnou nebo bude poskytnuta licence o užití jinému subjektu, je Univerzita Pardubice oprávněna ode mne požadovat přiměřený příspěvek na úhradu nákladů, které na vytvoření díla vynaložila, a to podle okolností až do jejich skutečné výše. Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v Univerzitní knihovně Univerzity Pardubice. V Pardubicích dne 1. 7. 2015 Andrea Čížková
Na tomto místě bych ráda poděkovala doc. Ing. Martinu Adamovi, Ph.D. za vedení, pomoc, odborné rady a trpělivost v průběhu celého studia a během zpracování disertační práce. Dále celému kolektivu KAlCh na Univerzitě Pardubice, především prof. Ing. Karlu Venturovi, CSc. a všem členům jeho pracovní skupiny. Také bych chtěla poděkovat své rodině a přátelům, kteří mě po celou dobu studia podporovali a poskytli důležité zázemí.
OBSAH OBSAH ...................................................................................................... 5 SEZNAM ZKRATEK .............................................................................. 10 SOUHRN .................................................................................................... 12 SUMMARY ............................................................................................... 13 CÍLE PRÁCE ........................................................................................... 14 1. ÚVOD .................................................................................................... 15 2. TEORETICKÉ ČÁST ......................................................................... 17 2.1. Senzorická analýza potravin ............................................................ 18 2.2. Aromatická látka ............................................................................... 19 2.2.1. Definice a vymezení pojmu „aromatická látka“ ....................................... 19 2.2.2. Složení a vnímání aroma ............................................................................ 20
2.2.3. Silice .................................................................................................. 21 2.2.3.1. Základní složky silic ................................................................................. 21 2.2.3.2. Vlastnosti a chemické složení silic ........................................................... 22 2.2.3.3. Výskyt silic ................................................................................................ 22 2.2.3.4. Použití silic ............................................................................................... 23 2.2.3.5. Zdravotní aspekty využívání silic ............................................................. 24 2.2.3.6. Získávání silic .......................................................................................... 25
2.3. Čaj ........................................................................................................ 26 2.3.1. Výroba čaje .................................................................................................. 26 2.3.2. Složení listů čajovníku................................................................................. 27 2.3.3. Druhy čaje .................................................................................................... 27 2.3.4. Výrobky z čaje ............................................................................................. 28 2.3.5. Prospěšné složky čaje .................................................................................. 29 2.3.5.1. Alkaloidy v čaji ......................................................................................... 29 2.3.5.2. Polyfenoly ................................................................................................. 29 2.3.6. Těkavé látky v čajích ................................................................................... 30
2.4. Koření ................................................................................................. 33 2.5. Metody kapalinové mikroextrakce ................................................... 34
2.5.1. Mikroextrakce jednou kapkou ................................................................... 34 2.5.1.1. Teoretické základy mikroextrakce jednou kapkou ................................... 36 2.5.1.2. Uspořádání metody .................................................................................. 36 2.5.1.3. Faktory ovlivňující mikroextrakci jednou kapkou.................................... 36 2.5.1.4. Způsoby provedení mikroextrakce jednou kapkou ................................... 37 2.5.2. Mikroextrakce založena na tvorbě disperzního systému ......................... 39 2.5.2.1. Klasické uspořádání mikroextrakce založené na tvorbě disperzního systému ..................................................................................................... 39 2.5.2.2. Mikroextrakce kapalnou fází využívající ztuhnutí organické fáze ........... 40 2.5.3. Mikroextrakce využívající dutého vlákna ................................................. 41 2.5.4. Vybrané aplikace mikroextrakce kapalnou fází....................................... 42 2.5.4.1. Analýza silic z rostlinného materiálu ....................................................... 42 2.5.4.2. Analýza silic z Fructus forsythiae ............................................................ 43 2.5.4.3. Analýza pesticidů v čaji ........................................................................... 44
2.6. Metody mikroextrakce tuhou fází .................................................... 45 2.6.1. Mikroextrakce tuhou fází ........................................................................... 45 2.6.1.1. Teoretické základy mikroextrakce tuhou fází ........................................... 45 2.6.1.2. Faktory ovlivňující mikroextrakci tuhou fází ........................................... 46 2.6.1.3. Způsob provedení mikroextrakce tuhou fází ............................................ 48 2.6.1.4. Vzorkování mikroextrakce tuhou fází ....................................................... 51 2.6.2. Mikroextrakce na magnetickém míchadle ................................................ 54 2.6.3. Mikroextrakce se sorbentem v mikrostříkačce ........................................ 56 2.6.4. Vybrané aplikace mikroextrakce tuhou fází ............................................. 59 2.6.4.1. Analýza Oolong čaje ................................................................................ 59 2.6.4.2. Analýza zeleného tureckého čaje ............................................................. 59 2.6.4.3. Analýza vzorků rostlinného původu ......................................................... 60 2.6.4.4. Analýza vitamínu C .................................................................................. 61
2.7. Retenční index .................................................................................... 62 2.8. Návrh experimentu (experimental design) ...................................... 64 2.8.1. Plackett-Burmanův návrh experiment ...................................................... 64 2.8.2. Kódování proměnných ................................................................................ 65 2.8.3. Faktorový plán ............................................................................................. 65 2.8.4. Neúplný faktorový plány ............................................................................ 66
2.8.5. Hvězdicový plan ........................................................................................... 67 2.8.6. Centrálně kompozitní plán (central composite design) ........................... 68
2.9. Metoda odezvové (responzní) plochy ............................................... 69 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................ 71 3.1. Použité vzorky, chemikálie a ostatní materiál ................................. 72 3.1.1. Analyzované vzorky ...................................................................................... 72 3.1.2. Rozpouštědla ................................................................................................. 75 3.1.3. Stlačené plyny ............................................................................................... 76 3.1.4. Standardy ...................................................................................................... 76
3.2. Použité přístroje a zařízení ............................................................... 78 3.3. Pracovní postupy ................................................................................ 79 3.3.1. Příprava čajů z bylinných směsí ................................................................ 79 3.3.2. Extrakce sledovaných sloučenin z nápoje ................................................. 79 3.3.2.1. Mikroextrakce tuhou fází ........................................................................ 79 3.3.2.2. Mikroextrakce jednou kapkou .................................................................. 80 3.3.3 Mikroextrakce tuhou fází sypkých bylinných čajů. .................................. 80 3.3.3.1. Headspace mikroextrakce tuhou fází pro 1 teplotu ................................. 80 3.3.3.2. Headspace mikroextrakce tuhou fází pro kombinaci 2 teplot - suchý způsob........................................................................................................ 81 3.3.3.3. Headspace mikroextrakce tuhou fází pro kombinaci 2 teplot - mokrý způsob......................................................................................................... 81 3.3.4. Mikroextrakce tuhou fází pro koření oregano ......................................... 81 3.3.4.1. Kvantitaviní analýza složek silic v koření oregano .................................. 81 3.3.4.2. Analýza aromaprofilu koření oregana ..................................................... 82 3.3.4.3. Mikrodestilace ......................................................................................... 82 3.3.5. Analýza vzorků plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem .................................................................................................... 83 3.3.6. Analýza vzorků plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí ............ 83
3.4. Výpočet retenčních indexů ................................................................ 84 4. VÝSLEDKY A DISKUZE .................................................................... 85 4.1. Analýza bylinných nápojů ................................................................ 86 4.1.1. Volba vhodné přípravy bylinných nápojů ................................................ 86
4.1.2. Senzorická analýza bylinných čajů ........................................................... 88 4.1.2.1. Bylinný čaj Štíhlá linie ............................................................................. 89 4.1.2.2. Bylinný čaj Imunostim .............................................................................. 89 4.1.2.3. Bylinný čaj Spánek a nervy ..................................................................... 90 4.1.2.4. Bylinný čaj Zažívání ................................................................................. 90 4.1.2.5. Lipton: Hrbal Alpy .................................................................................. 91 4.1.2.6. Zalití vodou o 70 °C a vyjmutí sáčku čaje po 10 minut ........................... 91 4.1.2.7. Zalití vodou o 70 °C a vyjmutí sáčku čaje po 20 minut ........................... 92 4.1.2.8. Zalití vodou o 90 °C a vyjmutí sáčku čaje po 5 minut ............................. 93 4.1.2.9. Zalití vodou o 90 °C a vyjmutí sáčku čaje po 20 minut. .......................... 93 4.1.2.10. Zalití vodou o 100 °C a vyjmutí sáčku čaje po 5 minut ......................... 94 4.1.3. Optimalizace mikroextrakce jednou kapkou ............................................ 94 4.1.4. Optimalizace mikroextrakce tuhou fází .................................................... 101 4.1.5. Mez detekce a mez stanovitelnosti ............................................................. 104 4.1.6. Kalibrační řady ............................................................................................ 105 4.1.7. Opakovatelnost metody .............................................................................. 108 4.1.8. Analýza silic v bylinných nápojích............................................................. 109 4.1.8.1. Kvantitativní analýza složek silic plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem ............................................................................... 109 4.1.8.2. Kvantitativní analýza složek silic plynovou chromatografií s hmotnostním spektrometrem .................................................................... 112
4.2. Analýza sypkého rostlinného materiálu ........................................... 116 4.2.1. Analýza sypkých bylinných čajů ................................................................ 116 4.2.1.1. Optimalizace headspace mikroextarkce tuhou fází s kombinací teplot........................................................................................................ 116 4.2.1.2. Optimalizace headspace mikroextrakce tuhou fází s úpravou iontové síly ........................................................................................................... 120 4.2.1.3. Analýza vzorků pomocí mikroextrakce tuhou fází při jedné teplotě ........ 121 4.2.1.4. Analýza bylinných čajů s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – suchý způsob........................................................................................................ 129 4.2.1.5. Analýza bylinných čajů s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – mokrý způsob........................................................................................................ 134 4.2.1.6. Headspace mikroextrakce tuhou fázínápojů pro 2 sorpční teploty .......... 139 4.2.1.7. Porovnání jednotlivých metod.................................................................. 142
4.2.2. Analýza koření ............................................................................................. 143 4.2.2.1. Kvalitativní analýza vzorků koření italského původu .............................. 143 4.2.2.2. Kvantitativní analýza thymolu a karvakrolu v koření oregano italského původu ....................................................................................................... 152 4.2.2.3. Kvalitativní analýza vzorků koření oregano českého a tureckého původu ....................................................................................................... 152 4.2.2.4. Statistické vyhodnocení kvalitativní analýzy vzorků koření oregano ....... 155
5. ZÁVĚR ................................................................................................... 157 6. LITERATURA ...................................................................................... 158 PŘÍLOHY SEZNAM PUBLIKAČNÍ ČINNOSTI
SEZNAM ZKRATEK CAR
carboxen
CCD
centrálně kompozitní plán (Central Composite Design)
CF
chlazené vlákno (Cold Fber)
CRM
certifikovaný referenční materiál
DI
extrakce v módu přímého vzorkování (Direct Immersion)
DLLME
disperzní kapalinová mikroextrakce (Dispersive Liquid-Liguid Mikroextraction)
DLLME-SFO
disperzní kapalinová mikroextrakce využívající ztuhnutí plovoucí kapky (Dispersive Liquid-Liguid Mikroextraction Based on the Solidification of Floating Organic Drop)
DVB
divinylbenzen
EF
obohacovací faktor (Enrichment Factor)
FID
plamenový ionizační detektor (Flame Ionisation Detector)
GC
plynová chromatografie (Gas Chromatography)
HF-LPME
mikroextrakce kapalnou fází s využitím dutého vlákna (Hollow Fibre Liquid Phase Mikroextraction)
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography)
HS
extrakce v headspace prostoru
HSME
headspace mikroextrakce kapalnou fází (Headspace Solvent Microextraction)
LC
kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography)
LLE
kapalinová extrakce (Liquid – Liquid Extracion)
LOD
mez detekce (Limit of Detection)
LOQ
mez stanovitelnosti (Limit of Quantification)
MHE
multi headspace extrakce
MS
hmotnostní spektroskopie (Mass Spectrometry)
OVAT
optimalizace po parametrech (One Variable at a Time)
PA
polyakrylát
PCA
analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis)
PDMS
polydimethylsiloxan
PT-SPE
extrakce tuhou fází ve špičce pipety (Pipette Tip Solid Phase Extraction)
RI
retenční index
RSD
relativní směrodatná odchylka (Relative Standard Deviation)
RSM
metoda odezvové plochy (Response Surface Methodology)
RT
retenční čas (Retention Time)
SBSE
sorpční mikroextrakce na míchací tyčince (Stir Bar Sorptive Extraction)
SDME
mikroextrakce jednou kapkou (Single Drop Microextraction)
SIM
monitorování vybraného iontu (Single Ion Monitoring)
SPE
extrakce tuhou fází (Solid Phase Extraction)
SPME
mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Microextraction)
TBE
reextrakce ze sorpční míchací tyčinky (Twister Back Extraction)
TDU
tepelně desorpční jednotka (Thermal Desorption Unit)
TDS
tepelně desorpční systém (Thermal Desorption Systém)
SOUHRN Disertační práce se zabývá analýzou senzoricky významných látek se zaměřením na analýzu silic v potravinách, a to především v bylinných čajích a sypkém rostlinném materiálu (čajové směsi a koření). Je zaměřena na širokou škálu mikroextrakčních technik, jako jsou mikroextrakce jednou kapkou, mikroextrakce založena na tvorbě disperzního systému, mikroextrakce využívající dutého vlákna, mikroextrakce na magnetickém míchadle či mikroextrakce se sorbentem v mikrostříkačce. Teoretická část práce je nejprve věnována senzoricky významným látkám, jejich aroma a zasloupení v bylinných čajích a koření. Další část tvoří kapitola o kapalinových mikroextrakcích a mikroextrakcích tuhými fázemi. Výsledková část je zaměřena především na optimalizaci přípravy vzorků před extrakcí a také jednotlichvých mikroextrakčních technik s následnou analýzou extraktů pomocí GC/FID a GC/MS. Za optimalizovaných podmínek byly následně analyzovány vzorky nápojů připravených z bylinných čajů a vzorky sypkého rostlinného materiálu (čajové směsi a koření), ve kterých byly jednotlivé složky silic identifikovány pomocí retenčních indexů a metodou standardního přídavku, popř. porovnáním s knihovnami hmotnostních spekter. Klíčová slova: Silice, Bylinné čaje a koření, Metody kapalinové mikroextrakce, Metody mikroextrakce tuhou fází, GC/FID a GC/MS
SUMMARY This thesis deals with the analysis of sensory significant substances with focus on the analysis of essential oils in foods, especially in herbal infusions and plant material (herbal teas and spices). It is aimed mainly to application of wide range of microextraction techniques such as single drop microextraction, dispersive liquid-liquid microextraction, stir bar sorptive microextraction and microextraction by packed sorbent. Beginning of theoretical part is addressed to sensory important substances, their aroma and representation in herbal teas and spices. The rest of theoretical part is dedicated to liquid microextraction and solid phase microextraction techniques. Used instrumentation, materials and procedures to performance of individual determinations are summarized in experimental part. Part “Results and discussion” deals mainly with the optimization of experimental conditions for tested microextraction techniques followed by analysis by GC/FID and GC/MS. Samples of herbal tea infusions and the plant material (herbal teas and spices) were analyzed over the optimized conditions. Individual ingredients were identified according to retention times, retention indices and method of standard addition. Keywords: Essential oils; Herbal teas and spices; Methods of liquid microextraction; Methods of solid phase microextraction; GC/FID; GC/MS
CÍLE PRÁCE Cílem disertační práce je nalézt vhodné mikroextrakční metody pro izolaci těkavých složek z rostlinného materiálu (čajové směsi a koření), a to jak na základě obsahu sledovaných sloučenin, tak i na základě celkového aromaprofilu analyzovaných vzorků. Za tímto účelem otestovat různé mikroextrakční postupy, tj. mikroextrakci jednou kapkou v módu přímého vzorkování a především mikroextrakci tuhou fází, přičemž především pro tuto metodu otestovat různé extrakční módy. V rámci optimalizace extrakčních podmínek prověřit možnosti využití metod plánování experimentu. Prvním cílem experimentální části práce je provést optimalizace podmínek obou mikroextrakčních technik pro analýzu vybraných složek silic v nápojích připravených z bylinných čajů a nalézt tak vhodné podmínky pro izolaci daných sloučenin dle přístupů založených na přímém vzorkování z kapalné fáze s následnou analýzou metodou plynové chromatografie s plamenové ionizačním, případně s hmotnostním detektorem. Dalším cílem práce je prověřit možnosti využití headspace mikroextrakce tuhou fází pro analýzu aromaprofilu čajových směsí, a to se zaměřením na možnosti využití více sorpčních teplot během jediné extrakční procedury a daný přístup porovnat s konvenční metodou realizovanou při konstantní sorpční teplotě. Posledním cílem práce je analýza těkavých složek v koření oregano opět s využitím headspace mikroextrakce tuhou fází. Účelem je pokusit se identifikovat specifika koření různého zeměpisného původu (ČR, Turecko a Itálie), na jejich základě by bylo možné jednotlivé vzorky vzájemně odlišit.
14
1 ÚVOD
15
Aroma potravin je výsledek celého komplexu nepřeberného množství chemických látek, které působí na naše smyslové receptory. Díky těmto rozeznávacím schopnostem můžeme již při prvním kontaktu s potravinou usuzovat o její kvalitě, čerstvosti či stáří. Vzájemná souhra všech složek v potravině nám prozradí mnohé důležité informace o typických vlastnostech vzniklého produktu. Určování základních organoleptických parametrů v potravinářském průmyslu má velký vliv na distribuci, potažmo i zájem koncového zákazníka o daný výrobek. Za velmi oblíbený nápoj, jenž je ve světě pokládán za nejběžněji konzumovaný, je považován čaj. Látky obsažené v čaji, mezi které patří i silice, se podílejí na jeho charakteristickém aroma, vůni i chuti. Vlastnosti čaje ovlivňují mnohé faktory. Mezi ty důležité patří například zeměpisné klima. Nejvíce je pěstován v tropických a subtropických oblastech světa. Silice obsažené v bylinných čajích se většinou stanovují chromatograficky. Pro jejich těkavost se využívá metoda plynové chromatografie s iontově plamenovou detekcí nebo plynová chromatografie s hmotnostní detekcí. Metoda je často spojena s předchozím zakoncentrováním analytu např. pomocí mikroextrakčních metod. Mezi nejčastěji používané mikroextrakční metody při analýze silic patří mikroextrakce jednou kapkou a mikroextrakce tuhou fází. Při mikroextrakci kapalnou fází se zakoncentrovává analyt z malého množství vzorku do malého objemu rozpouštědla (μl). Mikroextrakce probíhá po dobu, která je potřebná k ustavení rovnováhy mezi vzorkem a rozpouštědlem. Mikroextrakce tuhou fází je velmi účinnou metodu, která nevyžaduje rozpouštědlo ani použití komplikované aparatury. Jedná se o sorpčně - desorpční techniku, kde principem je interakce malého množství extrakční fáze s nadbytkem vzorku. Poměrně nový přístup při SPME je využití kombinace více sorpčních teplot během jednoho extrakčního procesu. Kombinace více sorpčních teplot v jedné SPME umožňuje analyzovat více látek najednou. Dochází k extrakci více těkavých a zároveň méně těkavých sloučenin v jedné extrakční proceduře. Časový poměr těchto teplot se musí optimalizovat a také se musí brát ohled na to, že může docházet k tepelné desorpci již nasorbovaných látek na vlákně. SPME v kombinaci více sorpčních teplot je efektivnější v porovnání s klasickou SPME při jedné teplotě.
16
2 TEORETICKÁ ČÁST
17
2.1. Senzorická analýza potravin Senzorická analýza potravin
patří
mezi
základní kontrolní
metody kvality
potravinářských surovin, přídatných a pomocných látek i hotových výrobků. Je to důležitá disciplína, která hodnotí, měří a následně interpretuje ty vlastnosti a charakteristiky potravin, jež jsou postřehnutelné lidskými smysly (pach, textura, barva a další) [1]. V odborné literatuře je senzorická analýza potravin definována jako analytická metoda, při níž se organoleptické vlastnosti potravin hodnotí výhradně lidskými smysly (bez použití přístrojů), a to za takových podmínek, které zajišťují spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Je nedílnou součástí posuzování celkové kvality potravinářských výrobků a je jedinou metodou, která může zhodnotit kvalitu výrobku tak, jak ji vnímá spotřebitel [2]. Senzorická analýza má za cíl zjistit informace potřebné pro rozhodnutí smyslových atributů výrobku, tj. o jeho vzhledu (barvě), chuti, vůni a konzistenci [2].
Vzhled (barva) - Vzhled se určuje zrakem, který má ze všech smyslových orgánů největší informační kapacitu. Pro člověka je důležitý, přičemž přenáší až 80 % informací o potravině.
Chuť – Jedná se o smysl, který dovoluje vnímat chemické látky rozpuštěné ve slinách nebo vodě. Chuť se přenáší chuťovými receptory, které se sdružují v pohárcích jazyka a končí tenkými chloupky nad povrchem jazyka, které odebírají informace o chuti toho, co se právě nachází v ústech. Sídlo chuťového smyslu je v ústní dutině, a to nejen na jazyku, ale také v zadní části měkkého patra a v horní části hltanu. Existuje pět základních chutí - sladká, slaná, kyselá, hořká a umami (specifický chuťový receptor pro umami mGluR4 byl objeven v roce 2000 [3] a vnímá v jídle obsaženou kyselinu - glutamovou nebo její soli).
Vůně - Vůni člověk rozeznává pomocí čichu. Jedná se o fylogenetický smysl a pro mnoho živočichů je životně důležitý. Hlavní čichový systém zajišťuje informace o okolním prostředí, potravinách apod. Čichový smysl bývá často spojován s nosem, ale ve skutečnosti 95 % nosní dutiny s čichem nesouvisí. Čichové podněty zachycují řasinky v nosní dutině. Tyto podněty putují jako nervové vzruchy do příslušných částí mozku.
Konzistence – Konzistence je u senzorické analýzy, ale i pro běžné spotřebitele, velmi důležitý faktor. Má-li potravina narušenou či neobvyklou konzistenci, tak velmi často podléhá mikrobiálnímu rozkladu, což je ve většině případů pro člověka nepřijatelné.
18
2.2. Aromatická látka Vzhledem k hlavnímu cíli práce budou další kapitoly zaměřeny především na vonné látky, jejich aroma a aroma profily ve vzorcích bylinných čajů a v koření. 2.2.1. Definice a vymezení pojmu „aromatická látka“ Mezi nejvýznamnější faktory ve výživě člověka patří senzorická jakost potravy určená přítomností senzoricky aktivních látek, které odpovídají za chuťové a vonné vlastnosti potraviny. Tyto látky hrají u konečného spotřebitele rozhodující roli při vytváření celkového dojmu o konkrétní potravině nebo pokrmu s přímými důsledky pro jeho dlouhodobý nutriční stav [4]. Termín „aroma“ pochází z řečtiny s původním významem „koření“. Obecně se pojednává o aroma ve třech základních souvislostech: Aroma – „vůně potraviny“ – vonné látky vznikající v normálním metabolismu živočichů a rostlin (byliny), činností mikroorganismů (sýr s ušlechtilou plísní) nebo specifickým technologickým zpracováním (pražená káva). Aroma – „éterický olej“ je pojem používaný zejména v aromaterapii nebo jako součást kosmetických přípravků. Aroma - „směs látek k aromatizaci potravin“ definovaných v Zákoně o potravinách a tabákových výrobcích jako látky určené k tomu, aby udělovaly potravině typickou vůni nebo chuť, kterou by potravina bez těchto látek neměla, nebo neměla v charakteristické intenzitě [4, 5]. Přibližně jedna třetina všech těkavých organických látek obsažených v potravině jsou užitečné jako aromatické (vonné) látky, tj. látky podílející se na vůni potravin. Objevení aromatických látek výrazně přispělo ke zvýšení kvality potravin. Potravinářské aroma vzniká při uvolňování těkavých sloučenin z potravin a má vliv i na jejich celkovou chuť. První komerčně využívaná aromatická látka byla vanilka, která byla extrahována z vanilkových lusků v roce 1858. Mezi nejvšestrannější aromatické látky s výraznou chutí patří furaneol. Poprvé byl objeven v jahodách, ale následně byla jeho přítomnost zjištěna i třeba v ananasu, malinách a rajčatech. Má sladkou ovocnou chuť, která je znakem mnoha druhů ovoce i různých potravinářských výrobků. Furaneol se významně podílí i na aroma kávy, sladu, pražených mandlí nebo i masa [6].
19
Aromatické látky mají těkavý charakter, zpravidla jsou málo polární nebo nepolární a ve vodě omezeně rozpustné. Naproti tomu chuťové látky jsou vesměs netěkavé, ve vodě dobře rozpustné a polární sloučeniny. Jistou hranicí mezi těmito dvěma skupinami jsou aromatické látky ovlivňující zároveň naše chuťové i čichové smysly. Obvykle se v potravinách vyskytuje několik set nejrůznějších aromatických látek, ovšem řada z nich se na tvorbě vlastního aroma nepodílí. V některých případech může být za vůni zodpovědná jedna nebo několik málo substancí s typickou vůní pro daný produkt, tzv. klíčová složka vůně (např. geraniol v muškátovém oříšku). Je třeba podotknout, že těkavé látky v potravinách nemusí mít jen příjemně vonící charakter. V řadě případů tak záleží na subjektivním posouzení. Mezi nejvýznamnější primární těkavé látky v potravinách patří terpeny, jejichž stavební jednotkou je isopren. Při výrobě potravin vznikají během celého výrobního procesu sekundární aromatické látky, na jejichž tvorbu mají vliv fermentační, degradační, oxidační a termicky podporované procesy (např.: Maillardovy reakce) [7]. 2.2.2. Složení a vnímání aroma Primárně se předpokládalo, že identifikací a izolací všech složek jednotlivých aromatických směsí, resp. aromat, lze lehce zreprodukovat jakékoli aroma. Bylo ovšem potvrzeno, že ne každá složka aroma přispívá stejným dílem ke konkrétnímu chuťovému vjemu. Na základě kalkulace poměru koncentrace složky směsi k její senzorické odezvě se předpokládá, že pro adekvátní vjem je potřebných přibližně 20 až 30 klíčových složek. Identifikace klíčových složek nemá jednotnou metodiku, protože je do značné míry zatížena systematickými chybami v podobě způsobů přípravy aromatického izolátu pro analýzu, lidského faktoru zahrnujícího rozdílnost ve vnímání a adaptačních mechanismech pro konkrétní vůni, ale i náročnosti slovní interpretace vjemu [8]. Vnímání aroma závisí nejen na koncentraci aroma, ale také na složení matrice a na dalších faktorech jako je teplota, při které je aroma vnímáno, nebo množství slin v ústech. Kromě majoritních složek (tuků, bílkovin nebo sacharidů) je vnímání ovlivněno minoritními složkami potravin, jako jsou například chuťové látky nebo další aromatické sloučeniny, které mohou způsobit zvýšení nebo snížení vnímání aroma.
20
2.2.3. Silice Silice (také esenciální či etherické oleje) jsou komplexní směsi těkavých látek obsažené v mnohých rostlinách. Jejich obsah v rostlině kolísá jak v průběhu dne, tak i v průběhu celého vývinu rostliny. V rostlinách jsou uloženy v siličných buňkách, ze kterých se po porušení struktury dostávají do prostředí [9]. Co se týče analýzy silic ve vzorcích rostlinného původu, tak přítomnost silic se zjišťuje jako celek nikoli jako jednotlivé silice. U vzorků se obvykle určuje procentuální zastoupení množství silic vztažené na dané množství vzorku. 2.2.3.1. Základní složky silic Silice jsou složité směsi organických sloučenin, které jsou směsí různých senzoricky aktivních látek. Mezi tyto látky patří látky vonné, chuťové a v některých případech i přírodní barviva. Mezi hlavní složky silic jsou řazeny:
Terpeny a terpenové deriváty (limonen, pinen, atd.)
Alkoholy (linalool, menthol, borneol, atd.)
Fenoly (thymol, eugenol, atd.)
Aldehydy (citral, benzaldehyd, atd.)
Ketony (menthon, α-thujon, kafr, atd.)
Ethery, estery a karboxylové kyseliny (estragol, anethol, atd.) [10] Terpenové uhlovodíky jsou nejčastější složkou silic. Terpeny jsou organické sloučeniny
rostlinného původu složené z jedné nebo více jednotek 5 členných uhlíkových jednotek (isoprenů). Podle počtu isoprenových jednotek (obrázek 1) se terpeny rozdělují do skupin: monoterpeny, seskviterpeny, diterpeny, triterpeny, tetraterpeny a polyterpeny. Až z 90 % převládají monoterpeny. Nejrozšířenějším monoterpenem je limonen, který se vyskytuje především v citrusových plodech. Vzniká spojením dvou isoprenových jednotek. Modifikací tohoto monoterpenu mohou vznikat oxidované monoterpeny, jako např. menthol nebo kafr. Silice jsou přítomny v rostlinách zpravidla volné, jen málokdy se mohou nalézat vázané glykosidickou vazbou [11].
isoprenová jednotka
2-methyl-1,3-butadien
Obrázek 1 Vzorce 2-methyl-1,3-butadienu a isoprenové jednotky [11] 21
Terpenové uhlovodíky mají vliv nejen na rozpustnost, ale také na kvalitu dané silice. Ke změnám ve složení silic dochází nejčastěji u silic s vysokým obsahem nenasycených terpenových
uhlovodíků.
Z tohoto
důvodu
se
provádí
deterpenace
(odstranění
sekviterpenových a monoterpenových uhlovodíků) jejich destilací, extrakcí nebo adsorpcí. Deterpenované silice jsou na rozdíl od neupravených odolnější vůči autooxidaci. Silice obsahující velké množství aldehydů a fenolů podléhají změnám jen velmi málo [4, 10]. 2.2.3.2. Vlastnosti a chemické složení silic Mezi hlavní vlastnosti silic patří jejich relativně velká těkavost a olejnatá konzistence. Dle těkavosti mohou být silice rozděleny na vysoce, středně a málo těkavé látky. Silice eukalyptu či máty peprné vyprchá zpravidla do dvaceti čtyř hodin. Řadí se mezi vysoce těkavé. Za středně těkavé jsou považovány například silice levandule či fenyklu, které vyprchají za dobu dvou dnů. Silice obsažené v jasmínu vyprchá přibližně až za jeden týden. Patří tak do skupiny silic s malou těkavostí [9]. Silice mívají menší hustotu než voda. Výjimkou jsou silice obsahující více aromatických sloučenin. Jsou rozpustné v tucích, chloroformu nebo v benzínu a téměř se nemísí s vodou. Proto je lze destilovat s vodní parou. Vyznačují se optickou otáčivostí a vysokým indexem lomu. Jsou většinou kapalné a bezbarvé, na vzduchu mohou tuhnout, tmavnout a mění se jejich aroma. Některé jsou zbarvené přirozeně, například žlutá je silice hřebíčková (Oleum caryophylli), nazelenavou až modravou barvu mívají silice obsahující azuleny - např. heřmánková silice (Oleum chamomillae) [4, 12]. 2.2.3.3. Výskyt silic Silice se hojně vyskytují v přírodě. Mohou se ukládat v některém rostlinném orgánu a podle toho pak lze rozlišit silici květů, listů, plodů, kůry a podobně. Silice někdy prostupují celou rostlinu, což je například u jehličnanů. V dnešní době je známých přes 300 druhů rostlin obsahujících silice, z nichž je přibližně 150 druhů farmaceuticky využitelných. Silice se vyskytují jak v bylinách čerstvých i sušených, tak i stromech. Lze je nalézt i v čerstvých ovocných šťávách, bylinných čajích či alkoholických nápojích. Příklad výskytu silic v některých typických rostlinách je uveden v tabulce 1 [13]. Typický výskyt silic je v následujících čeledích: hvězdicovité (Asteraceae), borovicovité (Pinaceae), zázvorníkovité (Zingiberaceae) nebo pepřovníkovité (Piperaceae). Produkce silic u rostlin souvisí hlavně s životním prostředím, složením půdy, klimatickými podmínkami, dobou sklizně či skladováním. Byliny se nejčastěji sbírají na jaře či v létě 22
a plody na podzim. Zajímavým poznáním je, že rostliny, které obsahují větší množství alkaloidů, mají málo silic nebo silice vůbec neobsahují a naopak [4, 13]. Tab. 1: Příklad výskytu silic, které vykazují antibakteriální účinky [13]: Obecný název
Latinský název
Hlavní složka
Přibližné zastoupení
Coriandrum sativum L. (semena)
linalool (E)-2-dekanal
70 % 20 %
Skořice
Cinnamomum zeylandicum Bl.
cinnamaldehyd
65 %
Oregano
Origanum vulgareL.
karvakrol thymol γ-terpinen p-cymen
0,1 – 80 % 0,1 - 64 % 2,0 – 52 % 0,1 – 52 %
Tymián
Thymus vulgarisL.
thymol karvakrol γ-terpinen p-cymen
0 – 64 % l2 – 11 % 2 – 31 % 10 – 56 %
Rosmarinus officinalisL.
α-pinen bornyl acetát kafr eukalyptol
2 – 25 % 0 – 17 % 2 – 14 % 3 – 89 %
Koriandr
Rozmarýn
2.2.3.4. Použití silic V rámci
Evropské
Unie
jsou
silice
nejčastěji
využívány
v potravinářství
pro své aromatické vlastnosti, kdy jsou jejich jednotlivé komponenty získávány buď extrakcí z rostlinného materiálu, nebo jsou vyrobeny synteticky. Jsou používány jako koření pro ochucení jídla (například silice česneku či hořčice). Nachází se v bylinných a ovocných nápojích, a to především v citrusových [4]. Silice jsou díky svým antimikrobiálním a antimykotickým vlastnostem považovány za prospěšné při eliminaci potravinových patogenů. Za významné inhibitory růstu patogeních mikroorganismů jsou považovány zejména fenolické látky, jako např. karvakrol, eugenol a thymol [14]. Silice mnohých bylin a koření byly studovány ohledně své antioxidační aktivity. I když např. thymol v tymiánu nebo thujon v šalvěji vykazují antioxidační vlastnosti, z důvodu aromatického charakteru, popř. i kvůli toxicitě, je jejich použití jako antioxidantů v potravinách značně omezeno [15]. Zvláštní význam mají silice obsažené ve chmelu, které jsou nejdůležitější skupinou obsahových látek chmele odpovědných za aroma chmele a piva [4].
23
Silice nacházejí uplatnění v chemickém průmyslu, kde jsou využívány například terpentýnové silice k výrobě laků, leštidel či syntetického kaučuku [16]. Dále se používají v kosmetickém průmyslu, farmacii nebo v lidovém léčitelství. Do kosmetických přípravků se přidávají zejména kvůli jejich vůni – například výroba parfémů z jasmínu. Ve farmaceutickém průmyslu se používají při výrobě koupelových solí, mastí, doplňků stravy, ale i léčiv [13, 16]. 2.2.3.5. Zdravotní aspekty využívání silic Silice jsou komplexní sloučeniny látek, z nichž některé jsou zdraví prospěšné, jiné jsou pro organismus toxické. U takových látek je třeba věnovat pozornost jak orální, tak i dermální toxicitě. Silice mohou být užívány vnitřně či zevně a vždy je nutné dodržet bezpečné množství konzumace či aplikace na pokožku. V potravinářství lze využívat jen silice z určitých rostlin. Používání některých rostlin je omezeno kvůli látkám, které jsou pro člověka ve vyšších koncentracích toxické [16].
Pozitivní účinky Silice mohou být využívány při léčbě řady zdravotních problémů. Pozitivně účinkují
např. prostředky určené k prokrvení kůže, kam patří silice s vyšším obsahem pinenů, cineolu, karvakrolu a limonenu. Silice mohou působit i jako karminativa. Ty ovlivňují hladké svalstvo zažívacího traktu a působí na střeva protikřečově a desinfekčně. Jsou to například plody kmínu, fenyklu a anýzu nebo květy heřmánku. Mezi diuretika, která působí močopudně, patří silice z plodu jalovce nebo z plodu a kořene petržele. Dezinfekční a protizánětlivé prostředky (antiflogistika) mohou působit jako prevence před zkažením masa [16].
Negativní účinky U některých jedinců se může projevit přecitlivělost na silice určené k aromatizaci
potravin. Potravinová přecitlivělost je dělena na alergii a nesnášenlivost neboli intoleranci. Např. v pelyňkové, šalvějové či řebříčkové silici se nacházejí α–thujon a β-thujon, což jsou bicyklické monoterpeny. Vyšší koncentrace thujonu mají neurotoxické účinky. Obě formy látky jsou používány při výrobě alkoholických nápojů (Absint), bylinných léčiv a k aromatizaci potravin. Při kontaktu silice obsahující thujon s pokožkou dochází k podráždění a svědění, objevit se mohou i ekzémy. Po konzumaci mohou nastat komplikace s játry, ledvinami a plícemi, opakovaný přísun této látky vyvolává poruchy centrálního nervového systému. Obsah thujonu v potravinách i nápojích podléhá přísné kontrole [17].
24
Estragol nacházející se v estragonové silici nebo methyleugenol silice hřebíčkové působí na organismus rakovinotvornými účinky. Patří do skupiny alkylbenzenů. Složkou mandlového oleje získávaného z hořkých mandlí je kyanogenní glykosid amygdalin, při jehož rozkládání (např. v žaludku za přítomnosti HCl) vzniká kyselina kyanovodíková, jež je pro organismus toxická [18]. Kumarin je látka patřící do skupiny kumarinů, v přírodě se jich vyskytuje přes 600 druhů. Byly u něho prokázány hepatotoxické účinky (poškozuje játra). Dále je kumarin zkoumán pro podezření z karcinogenity [18]. 2.2.3.6. Získávání silic Silice se v zásadě získávají třemi různými způsoby nebo jejich kombinacemi. První a nejpoužívanější způsob je destilace materiálů s vodní parou a oddělením vrstvy silice z destilátu (hlavně silice ze semen, stonků, listů, kořenů apod.). Páry jsou vedeny přes rostlinný materiál, kde se uvolňují aromatické molekuly těkavých olejů a ty z rostlinného materiálu přechází do páry. Jako rozpouštědlo pro zachycení silic se nejčastěji používá xylen. Teplota páry musí být kontrolována, aby nedošlo ke spálení rostlinného materiálu nebo silic. Pára se silicemi je dále vedena do chladicího systému, kde kondenzuje. Destilace může trvat i několik hodin, záleží na druhu rostliny. Získána je kapalina, ze které jsou silice a voda separovány. Z počátečního objemu rozpouštědla a objemu organické fáze po extrakci se vypočítá obsah silic vztažený na dané množství analyzovaného materiálu [4, 19]. Druhým způsobem je extrakce nepolárními rozpouštědly, jako jsou například benzin, petrolether aj. Takto se izolují hlavně silice z květů. Tato metoda může přivodit tepelný rozklad, hydrolýzu a rozpuštění některých vonných složek ve vodě. Nověji se extrahuje oxidem uhličitým při nadkritických podmínkách. Modifikací extrakčních metod jsou mikroextrakce kapalinou nebo na tuhý sorbent (tyčinky, destičky, membrány, kapka apod.). Třetím způsobem je lisování a oddělení vrstvy silice. Tato metoda se především používá pro citrusové plody. Vylisovaná tekutina není čistou silicí, ale obsahuje vodu a pektiny, proto je nutné provést čistící operace (například destilaci) [4].
25
2.3. Čaj Čaj je definován ministerstvem zemědělství dle zákona č. 110/1997 Sb., ve vyhlášce 30/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro čaj, kávu a kávoviny. Tato definice zní: „Čajem je výrobek rostlinného původu sloužící k přípravě nápoje určeného k přímé spotřebě nebo nápoj připravený z tohoto výrobku“ [5]. Čaj je hned po vodě nejrozšířenějším nápojem na Zemi. Je to kulturní nápoj připravovaný obvykle louhováním lístků rostliny čajovníku v horké vodě. Historie pěstování čajovníku sahá až do dob staré Číny v období 2000 let před naším letopočtem. Kvalita čaje je určována místem produkce, volbou lístků při sběru, pečlivou výrobou a vhodnou formou balení [20]. Čaj neobsahuje velké množství látek výživového charakteru a proto se řadí mezi pochutiny [5]. 2.3.1. Výroba čaje Sklízený čaj musí být zpracován co nejrychleji, jinak se jeho konečná kvalita zhorší. Provádí se to obvykle v provozovnách, které jsou přímo uprostřed pěstitelské oblasti. Zpracování čaje probíhá v šesti fázích. První fází je zavadnutí čajového listu. Čajovníkové listy se nejprve zváží a potom se v tenkých vrstvách rozloží na sušicí stojany. Zavadnutím jsou čerstvé čajovníkové listy zbaveny vlhkosti (ztratí asi 30 % vody). Důležité je ukončit zavadání ve správném okamžiku, aby nebyly listy příliš přesušené. Další fází je svinování. Původně byl lístek svinován mezi dvěma dlaněmi. Dnes však existují stroje, které tento postup napodobují. Při svinování jde o to, že buněčné stěny listu praskají a uvolňuje se buněčná šťáva. Jedině tak je možná fermentace, která je třetí fází (u zeleného čaje se fermentace neprovádí). Jde o proces oxidace a kvašení buněčné šťávy, která se uvolnila během svinování. Fermentace způsobí změnu barvy a čaj získá své charakteristické aroma. Probíhá při teplotě 35 - 40 °C. Čtvrtá fáze je sušení, při kterém čaj získává potřebnou trvanlivost. Sušení bezprostředně navazuje na fermentaci. Doba sušení závisí na typech používaných strojů a na teplotě. Pro sušení se používají patrové sušičky. Čajové lístky se suší na kovovém běžícím pásu za stálé cirkulace vzduchu s teplotou kolem 85 - 88 °C. Doba sušení je asi 20 - 22 minut. Během tohoto procesu se odpařuje zbývající voda a buněčná šťáva naschne na svinuté lístky. Čaj ještě více ztmavne, takže má nakonec hnědočernou až načernalou barvu. Další fází je třídění čaje, spolu s čištěním. V tomto posledním výrobním
26
procesu jde netříděný čaj přes tzv. vibrační třídící síta s odstupňovanou hustotou. Zde jsou oddělovány jednotlivé výrobní druhy (velikostní třídy) čaje. Velikost lístků v hotovém čaji nesouvisí s její kvalitou, ale s vydatností. Jako poslední šestá fáze je balení. Po čištění a třídění je čaj připravován k transportu. Vyrobený čaj se plní do beden, které jsou vyloženy kovovou fólií pro zachování aroma čaje. Ze 4 kg čerstvých listů vznikne později cca 1 kg hotového čaje [21]. 2.3.2. Složení listů čajovníku Čajovníků z rodu Camellia z čeledi Camelliaceae (čajovníkovité) je asi 50 druhů. Hospodářsky využívaný je pouze jeden druh Camellia sinennsis (L.). Mezi hlavní složky listů čajovníku patří voda, polyfenoly (třísloviny), kofein (též nazýván tein), silice, bílkoviny, sacharidy, aminokyseliny, vláknina, pigmenty, enzymy, minerální látky, vitamíny (C, B1, B2 a jiné), karoteny a další. Obvyklé složení látek v čerstvých čajových lístcích je uvedeno v tabulce 2 [22]. Tab. 2: Obvyklé složení látek v čerstvých čajových lístcích [22] Látky Flavanoly Flavonoly Polyfenolické kyseliny Jiné polyfenoly Kofein Teobromin Aminokyseliny Organické kyseliny Monosacharidy Polysacharidy Celulóza Protein Lignin Lipidy Chlorofyl a jiné pigmenty Popel Těkavé látky
Množství [hm %] 25,0 3,0 5,0 3,0 3,0 0,2 4,0 0,5 4,0 13,0 7,0 15,0 6,0 3,0 0,5 5,0 0,1
2.3.3. Druhy čaje Základní rozdělení čaje je podle stupně oxidace (fermentace) do 4 hlavních skupin [21]:
27
Čaj bílý - listy i s pupeny se rovnou suší a zpracovávají bez fermentace. Případně proběhne částečná fermentace.
Čaj zelený – při zpracování neprobíhá fermentace. Enzymy způsobující oxidaci jsou zničeny teplotou.
Čaj černý – listy se mechanicky naruší. Při zpracování probíhá úplná fermentace, která trvá minimálně týden.
Čaj žlutý – při zpracování listů probíhá částečná fermentace (jedná se o přechod mezi zeleným a černým čajem). Dále jsou čaje rozdělovány na [21]:
Ovocný čaj – obsahuje sušené ovoce nebo části sušených rostlin, jejichž obsah musí být minimálně 50 % hmotnosti.
Bylinný čaj – obsahuje části povolených bylin nebo jejich směsi. Obsah bylin musí být minimálně 50 % hmotnosti.
Ochucený čaj – pravý čaj ochucený částmi sušených plodů nebo kořením.
Aromatizovaný čaj – jedná se o černý čaj, který obsahuje příměsi extraktu ovoce či koření nebo aroma.
Ovoněný čaj – je zelený čaj, který obsahuje vůně a pachy. Nejčastěji se aromatizuje květy jasmínu, růže nebo pomerančovníku.
2.3.4. Výrobky z čaje Kromě čajů sypaných a porcovaných se lze setkat i s dalšími výrobky z čaje, jako jsou:
Čajový extrakt – připravuje se extrakcí černého čaje horkou vodou. Od instantního čaje se extrakt odlišuje přídavkem cukrů, barviv, vitamínů, kyseliny citrónové a dalších přísad [21].
Instantní čaj – je obvykle z černého čaje, ale může být i z čaje zeleného. Kapalný čaj je filtrací zbaven nečistot a následným odpařením je získán instantní čaj ve formě prášku nebo vloček. Nápoj se připravuje rozpuštěním ve studené či horké vodě [21].
Dekofeinový čaj – připravuje se jak z černého, tak i ze zeleného čaje. Odstranění kofeinu se provádí extrakcí nadkritickým CO2 nebo organickými rozpouštědly [21].
28
2.3.5. Prospěšné složky čaje Pití čaje má výrazně pozitivní účinky ohledně lidského zdraví. Mezi hlavní složky čaje, které působí na lidský organismus, patří polyfenoly, alkaloidy a silice čaje. Do skupiny polyfenolů patří flavonioidy, což jsou účinné přírodní antioxidanty. U mnohých osob bývá čaj hlavním potravinovým zdrojem antioxidantů [23]. Mnohé studie dokazují protirakovinné účinky polyfenolů. Bylo zjištěno, že mohou snižovat riziko vzniku rakoviny žaludku, jícnu a kůže. Další studie těchto látek ukazují, že pomáhají zabránit vzniku krevních sraženin. Mezi významné flavonoidy patří katechiny, které tvoří 15 – 30 % sušiny čajových listů a nejvíce jsou zastoupeny v čaji zeleném [23]. Bylo také zjištěno, že katechiny hrají důležitou roli při prevenci Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby. Jejich dlouhodobé užívání je vhodné při redukční dietě a jejich příjem může zvýšit vytrvalostní schopnosti konzumentů [46]. 2.3.5.1. Alkaloidy v čaji Čaj, ale i káva, obsahuje alkaloidy methylxantiny, z nichž nejznámější látkou je kofein. Bylo zjištěno, že nejvíce této látky obsahuje čaj černý. Jeho obsah v konečném nápoji ovlivňuje mnoho faktorů, kterými jsou množství použitých čajových listů, množství vody a délka louhování. Dalším důležitým alkaloidem obsaženým v čaji je látka teofylin [24]. K významným alkaloidům čaje patří kofein (tein), který působí především na celkový nervový systém, podporuje bdělost a snižuje pocit únavy. Další rozsáhlou skupinou přírodních antioxidantů jsou teaflaviny, které se nachází především v černém čaji a podílí se na snižování hladiny cholesterolu v krvi.
2.3.5.2. Polyfenoly Polyfenoly představují velmi rozsáhlou skupinu přírodních antioxidantů, mezi něž patří například flavonoidy, isoflavonoidy či fenolické kyseliny. Tyto kyseliny představují až třicet procent sušiny čajových listů. Mezi nejvýznamnější, vyskytující se především v čaji zeleném, patří kyselina gallová, chlorogenová a kávová. Flavonoidy jsou skupinou látek, které v sušině listů zaujímají téměř deset procent. Do této skupiny patří flavonoly, flavony nebo katechiny. Důležitými flavonoly v čajových listech jsou myricetin, kvercetin či caempferol. Základními stavebními jednotkami katechinů jsou látky katechin, epikatechin, epigalokatechin
29
a galokatechin. Flavonoidy jsou v černém i zeleném čaji obsaženy ve stejném množství. Jejich chemická struktura je však díky oxidačnímu procesu při výrobě černého čaje odlišná [25].
2.3.6. Těkavé látky v čajích Za senzorické vjemy při konzumaci čaje jsou zodpovědné dvě skupiny látek, a to těkavé a netěkavé organické látky. Těkavé látky dávají čaji jeho charakteristické aroma, zatímco netěkavé látky (např. kofein či aminokyseliny) jsou všeobecně zodpovědné za chuť [26]. Obsah těkavých látek v čajích je ve velmi malém množství, které představuje jen 0,01 % celkového obsahu sušiny, přesto má značný vliv na senzoriku čaje. Zastoupení a množství těkavých látek v čaji je ovlivněno mnoha faktory, jako jsou např. ekologické podmínky, prostředí, ve kterých je čaj pěstován, technologický způsob zpracování či skladování [27]. Silice jsou do určité míry nestabilní a z nápoje se po určité době odpaří, nicméně se v organismu podílí na rozpouštění tuků a napomáhají tak při trávení [20]. Těkavé látky v čaji se rozdělují do dvou hlavních skupin – neterpenoidní a terpenoidní látky. Přítomnost terpenoidů je v čaji vysoce žádoucí, přičemž poměr terpenoidů vůči neterpenoidním látkám přítomným v čaji, tzv. Flavour Index, je jedním ze znaků jeho senzorické kvality [28, 29]. Ve skupině neterpenoidních látek se vyskytují především sloučeniny vznikající rozkladem lipidů, k čemuž pravděpodobně dochází v průběhu technologického zpracování. Prekurzory neterpenoidních látek jsou hlavně nenasycené mastné kyseliny, z nichž účinkem lipoxygenáz vznikají aldehydy a ketony. Tyto karbonylové sloučeniny se v důsledku další degradace působením oxidoreduktáz redukují až na jednoduché alkoholy. Příkladem takové sloučeniny může být (3E)-hex-3-en-1-ol, jehož prekurzorem byla kyselina linoleová [28-30]. Degradací nenasycených mastných kyselin vznikají také ketony (např. alkenyl-2-ony), které se vytváří oxidací mastných kyselin na β-ketokyseliny, jež následně podléhají dekarboxylaci za vzniku odpovídajících ketonů (např. heptan-2-on, oktan-3,5-dien-2-on nebo pent-3-en-2-on) [26, 29-31]. Autooxidací nenasycených mastných kyselin vznikají hydroperoxidy, které jsou nestabilní a rozkládají se na nízkomolekulární sloučeniny (aldehydy, ketony či karboxylové kyseliny). Linoleová kyselina se tak může oxidovat na 13-hydroperoxylinoleovou kyselinu, jejíž redukcí vzniká hexanal [28]. Všechny tyto produkty degradace nenasycených mastných kyselin tvoří až 90 % celkového obsahu neterpenoidních látek v čaji. Zbylých cca 10 % tvoří karboxylové kyseliny např. hexanová a heptanová kyselina [28-30].
30
Obrázek 2 ukazuje nejvýznamnější terpenoidy vyskytující se v čajích a utvářející jejich aroma [26, 28-31], přičemž za klíčové látky lze označit linalool a geraniol [26, 31]. V případě nefermentovaných čajů se mezi terpenoidními látkami nevyskytuje indol. Důvodem je jeho velmi nízká koncentrace v tomto typu čajů. Obsah indolu rapidně stoupá až s procesem fermentace, což znamená, že může být významným indikátorem (spolu s benzenacetonitrilem a methylsalicylátem) pro rozpoznání zelených a černých čajů [26].
Obrázek 2 Strukturní vzorce vybraných terpenoidních látek vyskytujících se v čajích
Skupinu terpenoidních látek tvoří především terpeny, aromatické karbonylové sloučeniny a alkoholy odvozené převážně od terpenoidních glykosidů. Jsou to látky vznikající enzymatickou oxidací karotenoidů (např. β-ionon), hydrolýzou terpenoidních glykosidů a také jsou to deriváty aminokyselin a cukrů vzniklé Streckerovou degradací a Maillardovými reakcemi, které jsou podstatou neenzymatického hnědnutí potravin. Touto cestou vznikají aromatické aldehydy a jejich oxidací i příslušné alkoholy [28, 30].
31
Streckerova degradace Tento způsob degradace aminokyselin vede k tvorbě karbonylové sloučeniny většinou
o jeden atom uhlíku kratší, než byla původní aminokyselina. Streckerovo odbourávání patří mezi nejdůležitější reakce vedoucí ke konečné tvorbě sloučenin vzniklých v Maillardových reakcich [32]. Tyto sloučeniny, které patří mezi terpenoidní látky (epoxyalkenaly, epoxyketony, hydroxyalkoholy, atd.), vznikají reakcí aminokyselin s oxidovanými lipidy. Tyto sloučeniny reagují s aminoskupinou aminokyselin a poté dekarboxylací a hydrolýzou vzniká daný aldehyd. Zahříváním směsi oxidovaných lipidů a aminokyselin v přítomnosti kyslíku vznikají ketodieny. Lipidové hydroperoxidy vznikají oxidací aminokyselin [32].
Maillardovy reakce Maillardovy reakce patří mezi nejrozšířenější reakce sacharidů a sloučenin obsahujících
aminoskupinu za vzniku heterocyklických sloučenin a pigmentů nazývaných melanoidy. Maillardova reakce je zahájena vznikem Schiffovy báze, k níž dochází reakcí mezi karbonylovou skupinou redukujících se sacharidů a aminoskupinou příslušné aminokyseliny za vzniku příslušného iminu. Imin se transformuje Amadoriho přesmykem na 1-amino-1deoxyketózu, která podléhá enolizaci a uvolní tak aminoskupinu. Z enolu dalšími reakcemi, např. kondenzací, dehydratací a izomerací, vznikají konečné produkty neenzymatického hnědnutí, tzv. melanoidy [33].
32
2.4. Koření Tato práce se zabývá kořením orerano, a to především z důvodu analýzy tohoto koření během stáže na Univerzitě v Turíně (Itálie). Oregano (Origanum vulgare L.) je známé také pod názvem Dobromysl obecná či Červená lebeda. Oregano zahrnuje asi 20 druhů rostoucích převážně ve Středozemí a na Blízkém východě. V ČR je rozšířené v teplejších oblastech, ve středních polohách řidčeji, především v Krkonoších. Celkově se vyskytuje v celé Evropě vyjma Islandu. Je to vytrvalá, pýřitě až vlnatě chlupatá bylina 20 až 60 cm vysoká. Má načervenalou čtyřhrannou, chlupatou lodyhu a dřevnatý výběžkatý oddenek. Listy jsou vejčité, krátce řapíkaté, vstřícné, celokrajně nebo nezřetelně vroubkované. Spodní jsou největší, k vrcholu se zmenšují. Drobné nachové květy, shluklé v hlávky, zakončují větvičky vidlanovité laty. Kvítky vyrůstají v eliptických nebo oválných tvarech na špičce fialových listenů. Kalich je trubkovitě zvonkovitý, pětizubý, koruna je krátce dvoupyská. Celá rostlina příjemně aromaticky voní. Kvete obvykle v červenci a v srpnu. Nať dobromysli obsahuje asi 0,4 % silice (hlavně thymol a karvakrol) a asi 8 % tříslovin, hořčiny, tanin, gumopryskyřici a další látky. Kvetoucí nať (Herba origani vulgaris) se v červenci či v srpnu seřezává nad zemí. Suší se ve stínu nebo při umělém sušení s teplotou do 40 °C. Inhalace dobromyslových par se osvědčila při kašli a rýmě, ale i jako prostředek potlačující migrenózní bolesti hlavy. Zevně se užívá k přípravě sílících koupelí (zejména u slabých dětí). Negativní účinky se mohou vyskytovat u těhotných či kojících žen, proto je vhodné v tomto období dobromysl omezit. U málo odolných pacientů by mohlo neuvážené velké dávkování způsobit podráždění ledvin. Dobromysl je více známá jako výborné koření do polévek a omáček. V obchodech je známa pod názvem oregano [34].
33
2.5. Metody kapalinové mikroextrakce Klasické extrakce kapalina-kapalina (LLE) potřebují velká množství vysoce čistých rozpouštědel. Navíc je tato extrakce zdlouhavá, s vyššími provozními náklady a pracovníci jsou vystaveni zdravotním rizikům. Z těchto důvodů došlo k miniaturizaci celého procesu, což vedlo k vývoji metod kapalinové mikroextrakce (liquid phase microextraction). Hlavní výhodou těchto metod je nízká spotřeba toxických organických rozpouštědel i analyzovaného vzorku [35].
2.5.1. Mikroextrakce jednou kapkou Techniku mikroextrakce jednou kapkou (Single Drop Microextracion - SDME), představili v roce 1996 Jeannot a Cantwell se spolupracovníky, přičemž nejprve byla jako extrakční fáze použita kapka (8 μl) n-oktanu zavěšená na teflonové tyčince ponořené do míchaného vodného vzorku. Po extrakci byla teflonová tyčinka vyjmuta z roztoku vzorku a extrakční organická fáze byla nadávkována pomocí mikrostříkačky do plynového chromatografu [36]. Později byla tato technika zjednodušena tak, že teflonová tyčinka byla nahrazena hrotem mikrostříkačky [37]. Jedná se o rychlou, levnou, poměrně jednoduchou a časově nenáročnou techniku zkoncentrování analytu. Nevyžaduje použití komplikovaných aparatur, ale vystačí si jen s mikrostříkačkou pro plynovou chromatografii. Pro lepší stabilitu kapky se ukázalo, použití jehly se sešikmeným hrotem. Metodu SDME lze v kombinaci s vhodnou analytickou metodou použít jak pro kvalitativní, tak pro kvantitativní analýzu různých organických sloučenin. Poskytuje lineární odezvu v širokém koncentračním rozmezí [38]. Značnou výhodou SDME je fakt, že pro každou extrakci je vždy používána nová extrakční fáze, takže nedochází k přenosům analytů do následných analýz (tzv. carry over effect), k čemuž může vlivem nedokonalé desorpce docházet např. v případě použití tuhých sorbentů [39]. Metoda SDME nachází široké uplatnění především v analýze biologických látek, vzorků životního prostředí či vzorků potravin [40].
34
2.5.1.1. Teoretické základy mikroextrakce jednou kapkou Metoda SDME je v podstatě miniaturizovaná varianta klasické extrakce z kapaliny do kapaliny, která při miniaturizaci využívá poznatků z techniky mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Microextracion - SPME). U techniky SDME se jedná o dvoufázový systém, při kterém jsou sledované sloučeniny extrahovány z vodného vzorku (donorová fáze) do kapky organického rozpouštědla (akceptorová fáze). Pro množství analytu v systému platí vztah (1):
C0 .VD CD .VD CA .VA
(1)
kde C0 je počáteční koncentrace analytu ve vzorku, VD a VA jsou objemy vodné fáze (vzorek, donorová fáze) a organické fáze (extrakční rozpouštědlo, akceptorová fáze) a CD a C A jsou rovnovážné koncentrace analytu ve vzorku a v extrakčním rozpouštědle [41]. Pro rovnovážnou koncentraci sledované sloučeniny C A v extrakčním rozpouštědle, tj. v akceptorové fázi, fázi platí vztah (2):
CA
K .C0 .VD VD K .VA
(2)
kde K je distribuční konstanta analytu mezi extrakčním rozpouštědlem a vzorkem [42]. SDME je tedy rovnovážný proces, který však může být pro zakoncentrování cílových sloučenin velmi účinný [43]. Tuto účinnost lze definovat jako obohacovací faktor (Enrichment Factor - EF), který je pak vyjádřen rovnicí (3):
EF
CA C0
K 1 K.
(3)
VA VD
Uvedený dvoufázový systém však lze realizovat pouze v případě nemísitelnosti extrakčního rozpouštědla a vodného vzorku, přičemž je vhodný pro analyty s nižší polaritou. Pro těkavější sloučeniny lze techniku realizovat i v headspace uspořádání [44]. V tomto případě do výše uvedené rovnice (1) přibude ještě člen Ch .Vh představující množství sledované sloučeniny v plynném prostoru nad vzorkem a platí vztah (4). .
C0 .VD CD .VD CA .VA + Ch .Vh
35
(4)
2.5.1.2. Uspořádání metody Při této technice je mikrosříkačka naplněna organickým rozpouštědlem, které představuje extrakční činidlo. Jehlou mikrostříkačky je propíchnuto septum vzorkovací nádobky. Poté je pístem vytlačena kapka extrakčního činidla. Během extrakce je mikrokapka na sešikmeném hrotu a daný analyt je do ní extrahován. Kapka se dle způsobu extrakce nachází buď nad hladinou vzorku (v tzv. headspace prostoru), nebo je do roztoku ponořena. Po uplynutí vhodné doby extrakce je kapka pístem vtažena zpět a mikrostříkačka je vytažena přes septum nádobky. Nakonec je jehla zavedena do nástřikového prostoru plynového chromatografu, kde dojde k nadávkování extraktu [45].
2.5.1.3. Faktory ovlivňující mikroextrakci jednou kapkou Při aplikaci mikroextrakce kapalinou na daný typ vzorku je třeba nejprve optimalizovat jednotlivé parametry ovlivňující extrakční proces. Přestože maximální citlivosti metody je dosaženo po ustavení rovnovážném stavu, pro dostatečně přesné a správné výsledky není dosažení rovnovážného stavu nutné. Důležité však je co nejpřesněji dodržet jednotlivé experimentální podmínky. Mezi nejvýznamnější faktory ovlivňující extrakční proces [42] patří především: Extrakční rozpouštědlo – pro dosažení dostatečné selektivity extrakce cílených sloučenin je důležitá správná volba extrakčního rozpouštědla. Extrakční rozpouštědlo by mělo vyhovovat několika požadavkům, jako jsou například nemísitelnost s vodným vzorkem (popř. nízká těkavost v případě headspace módu), vysokou distribuční konstantu pro dané sloučeniny a při chromatografické analýze by jeho pík měl být dostatečně separován od píků stanovovaných látek [46]. Volba vhodného extrakčního rozpouštědla by měla být založena na porovnání selektivity a účinnosti extrakce, možnosti ztráty organické fáze částečným rozpuštěním nebo odpařením aale také i na čistotě a toxicitě rozpouštědla. V přímém módu vzorkování je také důležitá hustota daného extrakčního rozpouštědla, která by se od hustoty vzorku neměla příliš lišit. Velikost kapky – objem organické kapky během extrakce není konstantní z důvodu částečného rozpouštění kapky ve vzorku (popř. odpařování v plynném prostoru nad vzorkem). Obvykle platí, že větší objem kapky vede ke zvýšení odezvy analytického signálu, avšak větší kapky jsou méně stabilní, obtížněji se s nimi manipuluje a hrozí riziko odtržení kapky od jehly [47].
36
Extrakční teplota – při vyšších teplotách sice dochází k zakoncentrování těkavějších analytů v plynném prostoru nad vzorkem, avšak zároveň také dochází k rychlejšímu odpařování kapky. U přímého vzorkování je při vyšších teplotách rychleji ustavován rovnovážný stav, ale zvyšuje se rozpustnost organické kapky ve vodném vzorku. Tedy vhodná extrakční teplota by měla být volena s ohledem na dosažení dostatečné citlivosti v přijatelném čase [41]. Doba extrakce – při optimalizaci tohoto faktoru je třeba nalézt vhodnou kombinaci mezi dobou extrakce a koncentrací sledovaných sloučenin v organické kapce. Nadměrné prodlužování doby extrakce může vést ke zvýšenému riziku ztráty kapky rozpouštěním extrakčního rozpouštědla ve vzorku (popř. jejím odpařováním v headspace prostoru). Na druhou stranu příliš krátký extrakční čas může způsobit zhoršení reprodukovatelnosti metody [47]. Vliv míchání – míchání vzorku obvykle způsobuje zkrácení času potřebného pro dosažení termodynamické rovnováhy. Avšak pokud je mikrokapka přímo umístěna v kapalném vzorku a rychlost míchání je příliš vysoká, mohlo by dojít k odtržení kapky od hrotu mikrostříkačky [36]. Pro dostatečnou přesnost jsou vhodnější spíše malá míchadla a konstantní rychlost míchání. Vlivy pH a iontové síly – úpravou pH vodného vzorku lze ovlivnit extrakci kyselých a bazických sloučenin. pH se obvykle volí tak, aby byla ve vodné (donorové) fázi potlačena disociace těchto sloučenin. Vyšší reprodukovatelnosti lze dosáhnout použitím odpovídajícího pufru. Vlivem vysolovacího efektu dochází k snížení rozpustnosti analytů ve vodném vzorku a zlepšení jejich přestupu do organické fáze. Iontová síla u některých sloučenin nemá na účinnost extrakce buď žádný vliv, nebo ji naopak zhoršuje. Tento efekt je pravděpodobně způsoben tím, že při vyšších koncentracích soli dochází k pomalejšímu ustavování rovnovážného stavu [46]. 2.5.1.4. Způsoby provedení mikroextrakce jednou kapkou Mikroextrakce jednou kapkou je technika, kterou lze realizovat několika způsoby provedení. V závislosti na počtu fází, mezi nimiž se během extrakce ustavuje rovnováha, jde o metody probíhající ve dvoufázovém nebo třífázovém systému. Dvě základní uspořádání SDME, tj. přímé a headspace vzorkování (obrázek 3), lze bez větších obtíží realizovat manuálně s velmi dobrou reprodukovatelností [48].
37
Mikroextrakce jednou kapkou s využitím přímého ponoření (Direct Immersion Single Drop Microextracion DI-SDME) - protože je kapka v přímém kontaktu s roztokem vzorku, musí být použité extrakční činidlo s vodou nemísitelné. Lze používat jak nepolární, tak slabě polární rozpouštědla [42]. Proces mikroextrakce je řízen rozdílnými koncentracemi analytu ve vodné a organické fázi. Přenos částic analytu z kapaliny do kapky organického rozpouštědla probíhá až do ustavení termodynamické rovnováhy, poté je extrakce ukončena [42]. K výhodám extrakční techniky DI-SDME patří rychlost a cena. Není nutné používat velká množství toxických rozpouštědel a vyžaduje se běžné laboratorní vybavení [38]. Hlavní nevýhodou této techniky je stabilita visící kapky, která je často během extrakce rozpuštěna či odtržena od jehly [49]. Tato metoda je především používána pro extrakci těkavých látek z různých kapalných vzorků. Analyzují se hlavně dialkylftaláty, organofosforové insekticidy, aminokyseliny, organochlorované a organofosforové pesticidy a antimikrobiální látky [50, 51].
a
b
mikrostříkačka jehla mikrostříkačky
headspace
vodný vzorek
míchadlo
mikrostříkačka
organická kapka Obrázek 3 Zobrazení SDME procesu [52] (a – přímé vzorkování, b – heaspace vzorkování)
38
vodný vzorek míchadlo
Mikroextrakce jednou kapkou z Headspace prostoru (Headspace - Single Drop Microextracion HI-SDME) - je technika, kdy je kapka rozpouštědla umístěna nad hladinu vzorku. HI-SDME představuje třífázový systém, kdy k ustavení rovnováhy dochází mezi vzorkem a plynnou fází a následně mezi plynnou fází a extrakčním činidlem. Z tohoto důvodu může ustavení rovnováhy nastat za delší dobu, než je tomu u metody přímého ponoření. Dobu extrakce lze zkrátit zvýšením koncentrace analytu v plynné fázi. Toho lze dosáhnout zvýšením teploty vzorku, zde však hrozí desorpce analytu z kapky či odpaření kapky. Ztrátě citlivosti se lze vyhnout, pokud je rozpouštědlo chlazeno, zatímco je vzorek zahříván. Protože je toto experimentální uspořádání poměrně komplikované, bývá užíváno jen zřídka, např. při ultrastopových analýzách [53]. Mezi výhody patří rychlost a nízká cena extrakční techniky a především použití minima organického rozpouštědla. Touto metodou lze extrahovat širokou škálu analytů, jako jsou látky těkavé a středně těkavé, polární i nepolární [54]. Režim headspace bývá často aplikován při extrakci polárních těkavých sloučenin, jako jsou aldehydy. Mezi používaná rozpouštědla patří oktan-1-ol, hexadekan či dodekan [53]. 2.5.2. Mikroextrakce založená na tvorbě disperzního systému 2.5.2.1. Klasické uspořádání mikroextrakce založené na tvorbě disperzního systému Disperzní kapalinová mikroextrakce (Dispersive liquid-liquid microextraction DLLME) je metoda, která je založena na třísložkovém rozpouštědlovém systému. Představili ji Rezaee, Assadi a kolektiv v roce 2006. Používá se zde směs extrakčního činidla a disperzního rozpouštědla (obrázek 4) [55]. Vlastní extrakce je provedena rychlým vstříknutím vhodné směsi s vodou nemísitelného extrakčního rozpouštědla (o vyšší hustotě než voda) a disperzního rozpouštědla (které je s vodou i s extrakční fází mísitelné a relativně polární) do vzorku. Jako disperzní rozpouštědlo se může použít např. aceton, methanol nebo acetonitril. Jako extrakční rozpouštědlo může být použito některé z chlorovaných rozpouštědel (např. chlorbenzen, tetrachlormethan nebo tetrachlorethylen). Dochází ke vzniku jemných kapiček (disperze) a k rychlému ustálení rovnováhy. Následuje odstředení, kapičky extrakční fáze sedimentují do konického dna nádoby. Odtud je sediment nasát do mikrosktříkačky a následuje analýza [55].
39
Výhodou této metody je její jednoduchost, velká citlivost a nízká spotřeba organických rozpouštědel. Díky vytvoření velké styčné plochy mezi rozpouštědlem a vzorkem je extrakce rychlá a má vysoký koeficient obohacení [35, 56]. Metoda DLLME se používá například ke stanovení antioxidantů ve vodě [57]. Dále lze touto metodou stanovit chlorbenzeny nebo herbicidy ve vodě [58]. DLLME se také používá pro stanovení
polycyklických
aromatických
uhlovodíků
či
polárních organických
sloučenin [59]. Další možnost tvorby disperze je pomocí ultrazvuku nebo zvýšení teploty, bez pomoci disperzního rozpouštědla.
a
b
c
Obrázek 4 Znázornění extrakčního procesu při DLLME [55] (a – před extrakcí, b – vstřikování směsi rozpouštědel, c- tvorba disperzního systému) 2.5.2.2. Mikroextrakce kapalnou fází využívající ztuhnutí organické fáze Disperzní mikroextrakce využívající ztuhnutí organické fáze (Dispersive liquid - liquid mikroextraction Based on the Silidification od Floating Organic Drop DLLME-SFO) využívá extrakčního rozpouštědla teplotou tání, která je blízká laboratorní teplotě. Metoda je modifikací DLLME. Do vodného vzorku je rychle vstříknuta směs rozpouštědel. Směs obsahuje disperzní a extrakční rozpouštědla. Disperzní rozpouštědlo musí být rozpustné jak ve vodné, tak v přítomné organické fázi. Zajišťuje tak vysoké mezifázové rozhraní mezi vodnou a organickou složkou. Používají se stejná disperzní rozpouštědla jako u klasické DLLME. Extrakční rozpouštědlo musí být netoxické, mísitelné s disperzním rozpouštědlem, nemísitelné s vodou. Příkladem extrakčních rozpouštědel s potřebnou hodnotou teploty tání jsou dodekan-1-ol, undekan-1-ol, n-hexadekan a bromhexadekan. Po vstřiknutí této směsi je ve vzorku vytvořena mlha a následně probíhá extrakce. Ponořením tohoto roztoku do
40
ultrazvukové lázně lze extrakci ještě podpořit. Po následné centrifugaci je na hladině vyloučena organická fáze. Ponořením do ledové lázně a snížením teploty dojde ke ztuhnutí organické fáze obohacené extrahovanou látkou. Ztuhlá fáze je následně odebrána, při laboratorní teplotě je převedena do kapalného stavu a analyzována. Celý postup je znázorněn na obrázku 5 [42].
Vstříknutí směsi
Ztuhnutí
Analýza
rozpouštědel
organické fáze Obrázek 5 Metoda DLLME-SFO [42]
2.5.3. Mikroextrakce využívající dutého vlákna Metoda mikroextrakce využívající duté vlákno (Hollow fiber-based liquid phase microextracion HF- LPME) byla vyvinuta a poprvé publikována na přelomu 20. a 21. století, a to nejprve jako extrakční technika vhodná pro kapilární elektroforézu a poté modifikována i pro další separační metody [60]. Při této metodě jsou sledované sloučeniny extrahovány ze vzorku (donorová fáze) skrz organickou fázi s vodou nemísitelného rozpouštědla imobilizovaného v pórech dutého vlákna do kapalné fáze uvnitř dutého vlákna (akceptonová fáze). Při extrakci je pH vzorku voleno tak, aby byla co nejvíce potlačena ionizace extrahovaných látek, čímž se snižuje jejich rozpustnost ve vodě. Mezi hlavní výhody HF-LPME patří především to, že extrakční kapalina je mechanicky chráněna a je tak tudíž zabráněno jejímu pronikání do vzorku během extrakčního procesu [61]. Existují dva typy mikroextrakce využívající dutého vlákna, a to dvoufázové a třífázové uspořádání. Princip dvoufázového uspořádání spočívá v extrakci analytu z vodné fáze do fáze organické. V případě třífázového uspořádání je analyt z vodné fáze extrahován přes
41
membránu tvořenou organickým rozpouštědlem do vodného roztoku, kterým je naplněno duté vlákno (obrázek 6) [62]. Použití metod HF-LPME se v praxi stále víc rozšiřuje díky jejich jednoduchosti, účinnosti
a
všestrannému
použití.
Tyto
metody
se
využívají
v problematikách
potravinářských, biologických a životního prostředí. Lze jimi extrahovat organické i anorganické sloučeniny, a to i ve stopových množstvích.
a
b
Vodící trubička
Duté vlákno s organickou fází Donorová fáze (vzorek) Vzorkovací nádobka Akceptorová fáze (organické rozpouštědlo)
Akceptorová fáze (vodný roztok)
Obrázek 6 Uspořádání při HF LPME [62] (a – dvoufázový systém, b – třífázový systém) 2.5.4. Vybrané aplikace mikroextrakce kapalnou fází I když kapalinové mikroextrakce dosud nejsou tak rozšířeny jako technika SPME, jde vývoj i v této oblasti neustále dopředu. Svědčí o tom nárůst počtu publikovaných prací zabývajících se nejrůznějšími aplikacemi. V této kapitole jsou uvedeny příklady několika aplikací, které se zabývají metodami kapalinové mikroextrakce. 2.5.4.1. Analýza silic z rostlinného materiálu Y. Zhai a kolektiv [63] se zabýval mikroextrakcí jednou kapkou v módu headspace v kombinaci s extrakcí mikrovlnou, které byly použity na analýzu silic v sušených rostlinách Syzygium aromaticum (hřebíček) a Cuminum cyminum (kmín římský). Nejprve byla provedena optimalizace parametrů - objem kapky, extrakční čas, mikrovlnné absorpční médium a mikrovlnný výkon. Po optimalizaci byly zvoleny vhodné podmínky - 10 μl n-dekanu jako extrakčního rozpouštědla, 7 minut extrakční čas při mikrovlnném výkonu 440 W. Analýza všech vzorků čajů byla prováděna pomocí GC/MS na koloně Rxi-5 ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Jako nosný plyn bylo použito helium 42
s konstantní rychlostí průtoku 1 ml/min. Teplota nástřiku byla 250 °C, teplotní program začínal na 60 °C a teplota se zvyšovala na 110 °C rychlostí 10°C/minut, poté se teplota zvýšila na 120 °C rychlostí 2 °C/min, následně ze 120 °C na 145 °C rychlostí 5 °C/min. Poté byla teplota zvýšena na 240 °C rychlostí 20 °C/min. Navržená metoda byla porovnána s metodou destilační. V bylinách Syzygium aromaticum byly v největším množství stanoveny eugenol a karyofylen, a to pomocí obou extrakčních metod. V Cuminum cyminum byl obsah složek různý. 2.5.4.2. Analýza silic ve Fructus forsythiae J. Jiao a kolektiv [64] se zabývali mikrovlnnou destilací s iontovými kapalinami ve spojení s mikroextrakcí jednou kapkou v módu headspace (Ionic liquids-assisted microwave distillation coupled with headspace single-drop microextraction ILAMD-HSSDME) pro analýzu silic v čínské bylině Fructus forsythiae (zlatice převislá) pomocí plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií. Extrakční podmínky metody byly optimalizovány pomocí relativní plochy píků silic. Jako optimální parametry byly zvoleny: mikrovlnný výkon 300 W, navážka vzorku 0,7 g, poměr vzorku a iontové kapaliny 2:4, teplota 78 °C a čas 3,4 minut. Jako vhodné extrakční rozpouštědlo byl zvolen n-heptadekan a jako iontová kapalina 1-ethyl-3-methylimidazolium acetát. Extrakce byly prováděny v mikrovlnném extraktoru, který je na obrázku 7. Injekční stříkačka byla v prostoru nad destilační baňkou a aparatura byla opatřena chladičem. Do destilační baňky bylo vloženo dané množství vzorku s iontovou kapalinou a celý obsah byl po celou dobu extrakce míchán. Po skončení extrakce byla kapka rozpouštědla vtažena zpět do injekční stříkačky a nadávkována do nástřikového prostoru GC/MS. Analýza byla pomocí GC/MS na koloně kapilární DB-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Identifikováno bylo 21 složek silic, a to pomocí hmotnostních spekter a retenčních indexů. V největším zastoupení byli β-pinen 37,17 %, α-pinen 16,86 %, limonen 7,98 % a linalool 7,87 %.
43
Obrázek 7 Extrakce ILAMD-HS-SDME [64] 2.5.4.3. Stanovení pesticidů v čaji Tato studie [65] se zabývá analýzou pesticidů v čajích, jelikož koncentrace pesticidů v rostlinných vzorcích jsou povoleny pouze ve velmi nízkých koncentracích, a to v mg/l nebo méně. Přesto i tak představují pro člověka riziko kvůli jejich bioakumulaci v organismech. Byly použity 2 g zeleného čaje z oblasti Gilan, které byly extrahovány metodou DLLME pomocí směsi rozpouštědel acetonitrilu a n-hexanu. Směs rozpouštědel byla vytvořena smícháním 1 ml acetonitrilu a 1 ml n-hexanu a smíchána se vzorkem. Po 45 min při teplotě 42 °C byla extrakční fáze odebrána a odstřeďována po dobu 3 min. Tím se oddělily kapičky n-hexanu od vodné fáze. Tato část byla poté nadávkována do plynového chromatogramu. Analýza byla provedena na GC/FPD (Flame photometric detector) na koloně BP-5 (28,5 m x 0,22 mm x 0,25 μm). Osvědčilo se použití n-hexanu, protože nebylo nutné roztok filtrovat. Kromě objemu n-hexanu (1 ml) byly optimalizovány teplota a doba extrakce. Stanovená optimální teplota byla 42 °C. Při vyšší teplotě by extrakce nedosahovala požadované účinnosti. Rozsah doby extrakce byl od 20 do 50 min, optimální čas byl 45 min.
44
2.6. Metody mikroextrakce tuhou fází 2.6.1. Mikroextrakce tuhou fází Mikroextrakce tuhou fází je jednoduchá a účinná sorpčně-desorpční technika zakoncentrování analytu, která nevyžaduje rozpouštědla nebo složité aparatury. Metoda SPME byla vyvinuta kolektivem profesora Janusze Pawliszyna na Univerzitě ve Waterloo (Ontario, Kanada) na přelomu 80. a 90. let minulého století [66, 67]. Metoda je založena na rovnovážné extrakci sledovaných látek ze vzorku malým množstvím stacionární fáze ukotveným na povrchu tenkého křemenného vlákna. Principiálně lze SPME provést ve dvou základních módech, a to buď jako přímou sorpci analytů z roztoku (Direct Immersion – Solid Phase MicroExtracion, DI-SPME) nebo sorpci analytů z plynné fáze nad vzorkem (Headspace – Solid Phase MicroExtracion, HS-SPME) na vlákno s chemicky modifikovaným povrchem [68]. 2.6.1.1. Teoretické základy mikroextrakce tuhou fází Metoda SPME je rovnovážný proces v systém skládajícího se z několika fází. V případě přímé sorpce analytu z roztoku (DI-SPME) jde o dvoufázový systém, který je tvořen pouze vzorkem a povrchem SPME vlákna. V případě sopce analytu z plynné fáze nad vzorkem (HS-SPME) jde o systém třífázový. Protože celkové množství analytu by v systému během extrakce mělo být konstantní [69], lze rovnovážný stav popsat následující rovnicí (5):
C0 .Vs Cf .V f Ch .Vh Cs .Vs
(5)
kde C0 je počáteční koncentrace analytu ve vzorku, Vf, Vh a Vs jsou objemy stacionární fáze, plynné fáze (headspace) a vzorku a konečně C f , Ch a Cs jsou rovnovážné koncentrace
analytu ve stacionární fázi, v prostoru nad vzorkem a ve vzorku. V případě přímého vzorkování pak z rovnice vypadává prostřední člen na pravé straně. Pro celkové množství analytu n sorbovaného na vlákno v třífázovém systému při HS-SPME platí následující rovnice (6):
n
K fs .V f .C0 .Vs K fs .V f Khs .Vh Vs
45
(6)
kde je Kfs je distribuční konstanta analytu mezi stacionární fází a vzorkem a Khs distribuční konstanta analytu mezi plynnou fází a vzorkem [39]. Tato rovnice ve skutečnosti vyjadřuje fakt, že extrahované množství analytu je nezávislé na pozici vlákna v systému, pokud však jsou konstantní objemy stacionární fáze, plynné fáze i vzorku. Pro vzorkování lze tedy použít jak přímou, tak i headspace SPME metodu [69]. V případě přímého vzorkování, kdy ze systému vypadává plynná fáze nad vzorkem, se výše uvedená rovnice zjednoduší na podobu rovnice (7):
n
K fs .V f .C0 .Vs K fs .V f Vs
(7)
U většiny aplikací je hodnota Kfs relativně malá ve srovnání se vztahem mezi objemy stacionární fáze a vzorku (Vf << Vs) a celkové množství analytu sorbovaného na vlákně je v tomto případě dáno vztahem (8):
n K fs .V f .C0
(8)
Uvedená rovnice dokazuje, že množství analytu sorbovaného na vlákně není závislé na objemu vzorku [70]. Stejný případ nastává i v případě terénního vzorkování velmi velkých vzorků (např. rybníky, potoky, atd). Naopak v případě, kdy je hodnota distribuční konstanty Kfs velmi vysoká, tj. kdy je velká afinita analytu ke stacionární fázi, a současně objem vzorku je dostatečně malý, platí nerovnost Kfs.Vf >> Vs. Pro sorbované množství analytu platí v tomto případě vztah (9):
n Vs .C0
(9)
V tomto případě může dojít i ke kvantitativní extrakci a sorbované množství analytu je dáno pouze kapacitou stacionární fáze a počáteční koncentrací analytu ve vzorku. 2.6.1.2. Faktory ovlivňující mikroextrakci tuhou fází Ustavování rovnováhy, citlivost, opakovatelnost a rychlost SPME jsou ovlivněny řadou faktorů [39, 71]. Avšak při aplikaci SPME je třeba vzít v úvahu i to, že není třeba docílit rovnovážného stavu, ale důležitější je co nejpřesněji dodržet jednotlivé extrakční podmínky. Mezi důležité faktory ovlivňující extrakční proces patří především:
46
Sorpční fáze SPME vlákna – pro SPME se vlákna volí tak, aby jejich polarita byla blízká polaritě extrahovaných sloučenin. V tomto případě je hodnota distribuční konstanty Kfs větší, přičemž je větší i citlivost metody, ale k ustavování rovnovážného stavu může docházet pomaleji. Totožný vliv má i silnější vrstva sorpční fáze vlákna, přičemž tlustší vrstvy se obvykle volí pro těkavější analyty. Množství vzorku – s rostoucím množstvím vzorku roste množství analytů sorbovaných na vlákno, tedy i citlivost metody. V případě HS-SPME je třeba volit vhodný poměr mezi množstvím vzorku a velikostí nádobky, aby byl plynný prostor nad vzorkem dostatečně nasycen parami analytů a současně byl prostor dostatečně velký pro aplikaci SPME vlákna. Teplota při extrakci – při vyšších teplotách dochází k rychlejšímu ustavení rovnovážného stavu vlivem zvýšených hodnot difúzních koeficientů, avšak dochází ke snižování hodnot Kfs. V případě HS-SPME dochází při vyšších teplotách k nárůstu koncentrace těkavějších složek vzorku v plynné fázi, ale současně se zvyšuje riziko tepelné desorpce. Je tedy potřeba zvolit vhodnou kombinaci. Doba sorpce – doba potřebná k ustálení rovnováhy je ovlivněna především hodnotou distribuční konstanty Kfs, přičemž při vyšších hodnotách se na vlákno sorbuje více analytu, avšak prodlužuje se doba pro ustavení rovnovážného stavu. Vliv míchání – vlivem míchání dochází k rychlejšímu ustavení rovnovážného stavu díky rychlejšímu transportu analytů z roztoku směrem k vláknu. Vlivy pH a iontové síly – pH ovlivňuje sorpci především látek s funkčními skupinami, jejichž charakter se s hodnotou pH mění (-COOH, -OH nebo -NH2). Kyselé a bazické složky jsou mnohem účinněji extrahovány v kyselém, resp. bazickém prostředí, kde je potlačena jejich disociace Vliv iontové síly obecně roste s rostoucí polaritou analytu. S rostoucím obsahem soli (např. NaCl) vzrůstá extrakční výtěžek pouze do určitého maxima, s dalším přídavkem se výtěžek naopak snižuje. Při větších koncentracích soli také dochází k výraznějšímu zkracování životnosti vláken. Desorpční podmínky – vhodně zvolenými desorpčními podmínkami je zajištěno rychlé a kvantitativní uvolnění sorbovaných látek z vlákna. Je tedy třeba zvolit vhodnou teplotu a dostatečně dlouhou dobu v případě tepelné desorpce a vhodné rozpouštědlo, jeho množství a dobu statického (popř. dynamického) kroku v případě desorpce rozpouštědlem. Při zvolení nevhodných podmínek hrozí carry over efekt (paměťový efekt).
47
2.6.1.3. Způsob provedení mikroextrakce tuhou fází Při SPME je tenké křemenné vlákno o délce 1 cm (popř. 2 cm) potažené vrstvou sorbentu (stacionární fáze) připevněno pomocí pryskyřic k ocelové tyčince a ta je připojena k pístu sloužícímu k vysouvání a zasouvání vlákna z ochranné duté ocelové jehly. Celá tato aparatura je umístěna v držáku, na němž lze nastavit délku vysunutí jehly a ovlivnit tak polohu SPME vlákna během vzorkování a dávkování. Schéma zařízení používaného při SPME je zobrazeno na obrázku 8.
1
1 – píst
2
2 – aretace pístu
3
3 – Z-štěrbina
4
4 – okno pro barevný kód vlákna 5
5 – ochranná jehla 6
7
6 – ocelová tyčinka 7 – SPME vlákno
Obrázek 8 Schématické zobrazení zařízení používaného při SPME [71] SPME vlákna lze podle povahy stacionární fáze a mechanismu sorpce rozdělit [72]: Absorbenty – jde o homogenní čisté polymery, a to buď tuhé (PA – polyakrylát) nebo kapalné (PDMS – polydimethylsiloxan). Na těchto vláknech nedochází k soutěžení (kompetici) analytů o sorpční místa, proto mají obecně větší extrakční kapacitu. Adsorbenty – jde o porézní částice suspendované v polymeru. Těmito porézními částicemi jsou např. divinylbenzen (DVB) nebo carboxen (CAR™, částice na bázi grafitizovaného uhlíku). Vlákna mají větší selektivitu, ale nižší mechanickou odolnost. Adsorbenty zachycují analyty na základě fyzikálně-chemických interakcí na aktivních místech, jejichž počet je omezen. Proto je tedy omezena i sorpční kapacita vlákna a dochází tak k soutěžení analytů o tato aktivní místa. Příklady dostupných SPME stacionárních fází jsou uvedeny v tabulce 3, kde jsou rovněž uvedeny jejich doporučené aplikace.
48
Podle způsobu použití jsou komerčně k dispozici tři různé typy držáků SPME vlákna, které jsou určeny pro manuální, automatické a terénní vzorkování (obrázek 9) [73].
a b c Obrázek 9 Typy držáků SPME vlákna [73]. (a – pro manuální vzorkování, b – pro automatické vzorkování a HPLC adaptér, c – pro vzorkování v terénu) Držáky pro manuální i automatické vzorkování mají nastavitelnou hloubku vysunutí jehly neboli pozici vlákna při vzorkování a dávkování. Tyto držáky jsou univerzální a mohou být použity pro všechny typy vláken. Držák pro vzorkování v terénu je vybaven vnitřním septem, které má funkci těsnění. Z tohoto důvodu je v případě opotřebení SPME vlákna třeba vyměnit celý držák [73]. Tab. 3: Příklad komerčně dostupné SPME stacionární fáze a jejich doporučené aplikace [74] Stacionární fáze Polydimethylsiloxan (PDMS) 100 μm / nevázané 30 μm / nevázané 7 μm / vázané Polydimethylsiloxan / divinylbenzen (PDMS/DVB) 65 μm / částečně síťované 60 μm / částečně síťované Polydimethylsiloxan / Carboxen (PDMS/Car) 75 μm / částečně síťované Carbowax / divinylbenzen (CW/DVB) 65 μm / částečně síťované Carbowax / pryskyřice (CW/TPR) 50 μm / částečně síťované Polyakrylát (PA) 85 μm / částečně síťované Divinylbenzen / Carboxen (DVB/Car) 65 μm Polyethylenglykol (PEG) 60 μm (DVB/PDMS/Car) 50 / 30 μm
49
Doporučená aplikace Těkavé látky Nepolární, středně těkavé látky Středně polární až nepolární, středně těkavé látky Polární, těkavé látky Všeobecné použití (pouze pro HPLC) Stopová množství těkavých látek Polární látky Síťované povrchově aktivní látky (pro HPLC) Polární, středně těkavé látky Nepolární látky Polární látky Těkavé látky
SPME se může pojit s různými separačními metodami. Velmi jednoduché, relativně bezproblémové a vhodné pro stanovení stabilních složek s vysokou či střední těkavostí je spojení s plynovou chromatografií. Pro desorpci je SPME vlákno zavedeno přímo do prostoru nástřiku plynového chromatografu, kde dojde k tepelné desorpci, která je v tomto případě závislá na bodu varu analytu a tloušťce sorpční fáze vlákna. Na základě těchto faktorů je pak třeba zvolit vhodnou teplotu a dobu desorpce [66] Pomocí speciálního adaptéru je umožněno spojení SPME s kapalinovou chromatografií. Tento adaptér se skládá z šesticestného dávkovacího ventilu a desorpční komory, která nahrazuje dávkovací smyčku HPLC systému (obrázek 10). Na rozdíl od GC je v tomto případě desorpce provedena kapalnou fází, která je následně dávkována na chromatografickou kolonu. Podle síly sorpce analytu lze zvolit desorpci v proudu mobilní fáze (dynamická desorpce) nebo lze nechat vlákno v kontaktu s mobilní fází po určitý čas (statická desorpce) a teprve pak desorbované sloučeniny uvést na kolonu [75].
a
b desorpční komora
šesticestný ventil
Obrázek 10 Adaptér pro spojení SPME s kapalinovou chromatografií [76] (a – schématické znázornění, b – reálné zobrazení)
50
2.6.1.4. Vzorkování mikroextrakce tuhou fází SPME vzorkování může být provedeno pomocí třech základních režimů: přímá extrakce, extrakce z headspace prostoru a extrakce s membránovou ochranou. Rozdíly mezi těmito režimy jsou zobrazeny na obrázku 11.
Obrázek 11 Způsoby provedení extrakce: A-přímá extrakce, B-extrakce z headspace prostoru, C-přímá extrakce s membránovou ochranou [77]
Přímé extrakce – Používá se na všechny druhy kapalných vzorků, které obsahují organické látky. Nejprve se jehlou propíchne septum a následně vysune vlákno přímo do vzorku, kde dochází k extrakci stanovované látky. Až je dosaženo rovnováhy, je vlákno zasunuto do jehly a poté je vytaženo z nádobky. Nakonec jsou zachycené látky po desorpci analyzovány vhodnou analytickou metodou.
Extrakce z prostoru plynné fáze – tato technika může být použita na analýzu organických složek z různých vzorků, včetně vzorků tuhých. Vše je založeno na rovnováze mezi třemi fázemi, a to polymerní vrstvou vlákna, headspace prostorem a vzorkem. Jehlou je propíchnuto septum a po vysunutí vlákna nad hladinu analyzovaného vzorku dochází k sorpci na vrstvu pokrývající vlákno. Poté je vlákno zasunuto do jehly a vytaženo z nádobky. Nakonec je vlákno zavedeno do nástřikového prostoru GC případně desorpčního adaptéru v případě spojení s HPLC.
Extrakce s membránovou ochranou - Ve třetím způsobu vzorkování je vlákno odděleno od vzorku selektivní membránou. Ta umožňuje průchod analytu skrz membránu a zároveň zabraňuje kontaminaci. Hlavním důvodem použití membrány je
51
chránit vlákno před nepříznivými vlivy způsobenými vysokomolekulárními látkami, jsou-li analyzovány velmi kontaminované vzorky, např. biologického původu. V poslední době byly publikovány nové modifikace, jak provádět SPME, a to například potažení vnitřku nádoby sorbentem PDMS nebo potažení míchadla, ale také provedení v trubičce (in-tube SPME) či na membráně. Některé z těchto modifikací jsou zobrazeny na obrázku 12 [78, 79].
Obrázek 12 Příkaldy modifikací SPME
In tube extrakce - Zařízení pro in-tube SPME bylo vyvinuto pro spojení s HPLC nebo LC-MS
(spojení
kapalinové
chromatografie
s hmotnostním
spektrometrem).
Sloučeniny ve vodných roztocích jsou extrahovány přímo uvnitř kapiláry, jejichž vnitřní stěny jsou pokryty stacionární fází. Jedná se o modifikaci SPME, která probíhá buď v aktivním (dynamickém) nebo pasivním (statickém) módu. V obou módech může být sorbent zakotvený na vlákně uvnitř trubice nebo na vnitřní straně kapiláry. Na obrázku 13 jsou popsány obě tyto modifikace [78, 79]. V dynamickém systému může být křemenná kapilára potažena sorbentem zevnitř (GC kapilára) nebo může být sorbent dispergován na inertním nosiči v kapiláře. Vzorek proudí skrz tyto kapiláry. Statická in-tube extrakce se hlavně používá pro odběr vzorků v terénu. In-tube je omezeno na použití kapalných vzorků, které je možné odstředit nebo přefiltrovat.
52
Obrázek 13 In-tube SPME: a) statická, b) dynamická [79]
Extrakce využívající chlazené vlákno - Z. Zhang a J. Pawliszyn v roce 1995 publikovali uspořádání využívající chlazené vlákno „cold fiber“. Toto uspořádání využívalo CO2 pro chlazení vlákna [80]. Tato extrakce byla modifikována, minimalizována
a
automatizována.
V
roce
2012
bylo
publikováno
plně
automatizované „cold fiber“ zařízení, které je schopné analyzovat větší počet vzorků s minimálním zásahem lidského faktoru [81].
Obrázek 14 Schéma (A) a prototyp CF-SPME s termoelektrickým článkem (B) [82] 53
Jedním ze zdrojů chlazení může být termoelektrický chladič (obrázek 14). Výhodou tohoto chlazení je především nízká cena, rozměry a přesnost v řízení teploty [82]. Další způsob chlazení vlákna lze provádět pomocí kapalného dusíku umístěného v Dewarově nádobě (obrázek 15) [83].
Obrázek 15 Chladící zařízení pomocí kapalného dusíku [83] 2.6.2. Mikroextrakce na magnetickém míchadle Mikroextrakce využívající extrakce na magnetické míchadlo s vrstvou stacionární fáze (Stir Bar Sorptive Extraction - SBSE) byla vyvinuta a poprvé publikována [84] na konci minulého století. Hlavním cílem při vyvíjení této metody bylo eliminovat některé nedostatky techniky SPME, a to především omezenou sorpční kapacitu SPME vláken. Při metodě SBSE je magnetické míchadlo pokryté vrstvou sorbentu (např. polydimethylsiloxan) a vloženo přímo do kapalného vzorku, kde dochází k sorpci sledovaných sloučenin (obrázek 16). Míchadla jsou komerčně dostupná pod označením TWISTER. Existují 4 typy míchadel: 2 rozdílné délky (1 a 2 cm) a 2 různé tloušťky stacionární fáze (0,5 a 1 mm).
Obrázek 16 Vybavení pro mikroextrakci na magnetickém míchadle [85] 54
Doba potřebná k dosažení rovnovážného stavu při SBSE závisí především na objemu vzorku a rychlosti míchání, avšak obvykle se pohybuje do 60 min [86]. Sloučeniny, které jsou zachycené na sorpční vrstvě míchadla, lze stejně jako u SPME uvolnit několika způsoby, a to buď tepelnou desorpcí v případě GC analýzy nebo rozpouštědlem v případě HPLC analýzy. Ve spojení s GC je po dokončení extrakce Twister zaveden do tepelné desorpční jednotky TDU (Thermal Desorption Unit) nebo do tepelného desorpčního systému TDS (Thermal Desorption Systém). Oba systémy jsou přímo napojeny na GC. V případě, kdy se požaduje stanovení málo těkavých nebo tepelně labilních sloučenin, mohou být tyto látky reextrahovány pomocí TBE (Twister Back Extraction) a následně analyzovány LC nebo LC-MS [87]. Desorpce stanovovaných látek se provádí pomocí rozpouštědla (eluční činidlo). Aplikovatelnost jednotlivých rozpouštědel závisí především na vlastnostech stanovované látky. Mezi hlavní výhody SBSE techniky patří především dosahování vysokých stupňů zakoncentrování (velké hodnoty obohacovacího faktoru) sledovaných sloučenin [88], proto je metoda mikroextrakce na magnetickém míchadle citlivější než SPME [50]. Na teoretické úrovni je srovnání SBSE a SPME uvedeno na obrázku 17, který znázorňuje výtěžnost jednotlivých metod v závislosti na rozdělovacím koeficientu KOW (n-oktan-1-ol - voda). U SPME bylo použito křemenné vlákno s objemem 0,5 μl PDMS fáze a u zařízení pro SBSE (míchadlo) byl objem 100 μl PDMS fáze. Stanovovaný objem vzorku odpovídá velikosti 10 ml. Při použití SPME byla výtěžnost vyšší než 50 % až pro látky s hodnotou KOW > 10000, zatímco u SBSE je ta samá výtěžnost i pro látky, jejichž Kow > 100. Kdyby stanovované látky měly KOW > 10000, předpokládá se při SBSE téměř 100 % výtěžnost [89].
Kow Obrázek 17 Výtěžnost analytů u SBSE a SPME z 10 ml vzorku vody v závislosti na jejich rozdělovacím koeficientu n-oktanol – voda (KOW). Objem PDMS vlákna: 0,5 μl; objem PDMS na SBSE míchadle je 100 μl [89] 55
2.6.3. Mikroextrakce se sorbentem v mikrostříkačce Mikroextrakce se sorbentem umístěným ve speciálně upravené mikrostříkačce (MicroExtraction by Packed Sorbent – MEPS) byla v roce 2004 představena Abdel-Rehimem jako nová extrakční metoda pro stanovení lokálních anestetik v lidské plazmě [90]. Tato technika představuje nový vývoj v oblasti přípravy vzorků a manipulace s nimi. MEPS vznikl miniaturizací konvenční SPE (Solid Phase Extraction), která se používá pro objemy v mililitrech, zatímco MEPS v mikrolitrech. Princip této techniky spočívá v extrakci (sorpci) zkoumané látky na sorbent (stacionární fáze), který se nachází v injekční stříkačce v podobě „patrony“. U MEPS se aplikují podobné fáze jako u SPE [91]. MEPS se skládá ze dvou částí, stříkačky MEPS („MEPS Syringe“) a jehly s BIN („Barrel Insert and Needle Assembly“). BIN (obrázek 18) není nic jiného než ocelová jehla s malou patronou, která může obsahova různé SPE fáze - C18, C8, C8/SCX, C2 atd. BIN se používá s plynotěsnou injekční stříkačkou s objemem 100 μl nebo 250 μl, která umožňuje dávkování kapalin za běžných podmínek [90]. Je-li BIN spotřebována nebo je požadována jiná fáze, lze ji snadno vyměnit odšroubováním pojistné matice. Každá BIN jehla má své samostatné označení. MEPS plní stejné funkce jako SPE – odstranění rušivých komponent a zakoncentrování sledovaných sloučenin z matrice. Umožňuje selektivní izolaci a měření koncentrace analytů. MEPS se spojením s GC nebo HPLC systémy poskytuje dobré výsledky v některých parametrech zdaleka převyšující výhody SPE, a to zejména [91]:
výrazně snižuje čas potřebný na přípravu vzorků,
může být kombinována s HPLC nebo GC a plně automatizována - dané kroky jsou prováděny on-line pomocí stejné stříkačky,
vzorky procházejí přes sorbent vždy 2x (tam a zpět),
významně snižuje objem rozpouštědla a zvyšuje schopnost pracovat se vzorky velmi malého objemu, a to v řádech mikrolitrů oproti mnoha mililitrům pro SPE.
56
Obrázek 18 Schéma MEPS BIN v injekční stříkačce [91] Možnost provedení „on-line“ pomocí jednoho zařízení zkracuje danou dobu na zpracování vzorku a eliminuje nutnost častého zásahu analytika. Obvyklá životnost jehly BIN je 40 až 100 vzorků (konzervativní odhad), ale ta samozřejmě závisí na konkrétním typu vzorku a na experimentálních podmínkách (úprava pH, iontové síly atd.). Malé množství MEPS fáze v jehle BIN lze snadno a účinně promývat mezi jednotlivými vzorky, což snižuje riziko vzájemné kontaminace. Toto je u MEPS mnohem jednodušší ve srovnání s konvenční SPE [91]. Postup při práci s MEPS [90]:
kondicionace,
promýtí (eliminace interferentů),
aplikace vzorku,
eluce analytu vhodným rozpouštědlem, vstříknutí analytu do nástřikového prostoru analytického systému. Jako promývací a eluční roztoky bývají používána různá rozpouštědla, jako např. voda, směsi vody a organických rozpouštědel (například methanol, acetonitril atd.) nebo další organická rozpouštědla. Objem elučního roztoku bývá obvykle 20 μl [90]. Komerčně dostupné zařízení pro MEPS je zobrazeno na obrázku 19. Jedná se o speciálně upravenou jehlu mikrostříkačky obsahující příslušný sorbent (viz spodní část obrázku), která je připevněna k mikrostříkačce.
Obrízek 19 Zařízení používané pro MEPS [92]
57
Modifikací této mikroextrakce je extrakce na tuhou fázi ve špičce pipety (Pipette Tip Solid Phase Extraction PT-SPE). PT-SPE je vlastně zmenšený formát SPE, která se vyvinula na analýzu biologických látek. Sorbent je uložen v pipetovací špičce. Využívají se podobné sorbenty jako u SPE, například substituované silikagely (oktadecyl- C18, oktyl- C8 atd.), sorbenty na bázi uhlovodíků a další. Jedná se o levnou metodu, jelikož spotřeba sorbentu i rozpouštědel je malá a špičky i pipety jsou snadno dostupné [93, 94]. V současnosti existuje několik komerčních typů pipetovacích špiček se sorbenty. Jedná se např. o ZipTip (Millipore), HyperSet-Tip (Thermo Fisher Scientific), TopTip (Glysci) nebo Supel-Tip (Supelco). Všechny tyto typy jsou zobrazeny na obrázku 20. TopTip jsou pipetovací špičky s jemným zářezem ve spodní části (šířka štěrbiny 1 - 2 μm), který umožňuje průchod kapaliny, ale sorbent zůstává ve špičce. Kapalina prochází sorbentem pomocí tlaku. Ten je vytvořen pomocí injekční stříkačky, odstředivky nebo pipety. Při této technice dochází k minimálním ztrátám vzorku. Na sorbent se mohou aplikovat objemy 0,1 – 10 μl nebo 10 – 200 μl. HyperSep-Tip jsou pipetovací špičky rovněž s jemnou štěrbinou ve spodní části (1 – 2 μm), která umožňuje průchod kapaliny. Sorbent je přímo připojen k vnitřnímu povrchu pipetovací špičky bez použití polymerů nebo lepidla. Na HyperSet-Tip lze aplikovat minimálně 0,1 μl [95, 96]. Pipetovací špičky Supel-Tip jsou využívány k mikroextakci, čištění a obohacování biologických sloučenin. Sorbent je vázán na konci pipetovací špičky pomocí vysoce čistého lepidla a lze na něj aplikovat 0,5 – 10 μl vzorku. ZipTip špičky jsou vhodné pro vzorky, které obsahují peptidy, bílkoviny, nukleové kyseliny a další. Sorbent je opět umístěn na konci pipetovací špičky a lze na něj aplikovat 0,2 – 10 μl vzorku [97, 98].
a
a
b
c
d
Obrázek 20 Různé typy typetovacích špiček se sorbenty: a) HyperSet-Tip (Thermo Fisher Scientific), b) TopTip (Glysci), c) Supel-Tip (Supelco), d) ZipTip (Millipore) [95-98]
58
2.6.4. Vybrané aplikace mikroextrakce tuhou fází V této kapitole jsou uvedeny vybrané příklady studií mikroextrakce tuhou fází z posledních několika let. 2.6.4.1. Analýza Oolong čaje J. Lin a kolektiv [99] analyzovali vzorky oolong čajů (polofermentovaný čaj) pěti odrůd (Tieguanyin, Benshan, Maoxie, Huangjingui a Jinguanyin), které byly sklízeny v oblasti Anxi a Longquan v Číně. Jelikož je z odrůdy Tieguanyin vyráběn vysoce kvalitní čaj, který má na trhu vyšší cenu než ostatní, dochází k jeho falšování. Čaje Benshan, Maoxie či Huangjingui jsou často vydávány za Tieguanyin čaj. Autoři vyvinuli metodu pro rozeznání jednotlivých odrůd čajů, aby se zamezilo případnému falšování. K HS-SPME bylo použito 10 g suchého vzorku čaje (vzorky byly uchovávány při teplotě 4 °C uzavřených sáčcích), který byl převeden do 100 ml nádobky. Extrakce byla provedena po dobu 40 minut při 50 °C. Bylo použito vlákno 65 μm PDMS/DVB. Analýza všech vzorků čajů byla provedena pomocí GC/MS na koloně HP-INNOWax (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Jako nosný plyn bylo použito helium s konstantní rychlostí průtoku 1 ml/min. Teplotní program začínal na 50 °C po dobu 5 minut, poté se teplota zvýšila na 220 °C rychlostí 3 °C/min. Tato teplota byla udržována po dobu 5 minut a následoval nárůst na 240 °C rychlostí 10 °C/min. Identifikace všech píků byla provedena porovnáním spekter se spektry z knihovny a srovnáním jejich retenčních indexů. Ve všech 5 odrůdách oolong čajů byly identifikovány 3 hlavní složky, jednalo se o α-farnesen, nerolidol a indol. Nejvíce podobné odrůdy ze senzorického hlediska jsou Benshan a Tieguanyin, z tohoto důvodu dochází k jejich míchání a vydávání za odrůdu Tieguanyin (tj. kvalitnější čaj za vyšší cenu). Při této studii vědci na základě GC analýz extraktů zjistili, že dochází také k mísení Tieguanyin s Maoxii a tedy k falšování čajů. 2.6.4.2. Analýza zeleného tureckého čaje I. Tontul a kolektiv [100] analyzovali čajové výhonky odrůd Derepazari 7 a Fener, které byly vypěstované na plantáži Hayrat v Turecku. Tyto odrůdy byly pěstovány bez použití pesticidů. Čajové výhonky byly namlety na čajový prášek s tím, že 40 g čaje bylo propařováno při 120 °C po dobu 90 s a vysoušeno při 95 °C.
59
Pro extrakci byla použita HS-SPME metoda, která byla optimalizována a jako nejlepší podmínky byly zvoleny 2 g sušeného čaje, 20 ml nádobky, temperace při 60 °C po dobu 40 minut a následná extrakce při 60 °C po dobu 20 minut. Bylo použito vlákno 65 μm PDMS/DVB. Analýza těkavých složek v zeleném čaji byla provedena pomocí GC/MS na koloně TRB/DVB (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Teplotní program začínal na 50 °C po dobu 2,8 minut, poté se teplota zvýšila na 140 °C rychlostí 5,5 °C/min. Následně byla teplota zvýšena na 265 °C rychlostí 4,5 °C/min. Jako nosný plyn bylo použito helium. Identifikace všech píků byla provedena porovnáním spekter se spektry z knihovny a srovnáním jejich retenčních indexů. Jako hlavní složky byly identifikovány limonen, α-terpineol, heptanal, 2,2,4-trimethylhexan, linalool, nonanal a tridekan. 2.6.4.3. Analýza vzorků rostlinného původu Skupina kolem prof. Bicchiho [101] na univerzitě v Turíně (Itálie) se zabývala analýzou silic pomocí mikroextrakce využívající extrakce na magnetické míchadlo (SBSE). Byly použity 3 různé druhy míchadel - první bylo potaženo 25 μl polydimethylsiloxanem (PDMS), druhé 32 μl polyethylenglykol modifikovaným silikagelem (EG) a třetí 25 μl polyakrylpolyethyen glykoetherovou fází. Byly analyzovány vzorky rostlinného původu – jednalo se o vzorek parfému (který obsahoval látky rostlinného původu), vodný roztok máty peprné (z botanické zahrady na univerzitě Turín) a vzorek kávy Arabica pocházející z Kostariky. Ten byl analyzován jako nálev z kávy i jako káva mletá. Spařená káva byla připravena z praženého kávového prášku, bylo použito 16 g kávy ve 150 ml vody. Máta peprná byla rozpuštěna v malém množství ethanolu a parfém byl zředěný v poměru 1:5000. Po extrakci bylo míchadlo zavedeno do skleněné trubice a do tepelné desorpční jednotky. Desorbované analyty byly nadávkovány do systému GC/MS na koloně Megawax (60 m x 0,20 mm x 0,20 μm) pro kávu a Mega5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) pro mátu peprnou a parfém. Jako nosný plyn bylo použito helium o průtoku 1 ml/min v režimu konstantního tlaku. Teplotní program pro kávu začínal na 40 °C po dobu 5 minut, poté byla teplota zvýšena na 250 °C rychlostí 3 °C/min. Teplotní program pro mátu peprnou začínal na 0 °C a po 1 min byl zvýšen na 50 °C, poté byla teplota zvýšena na 250 °C rychlostí 3 °C/min a teplotní program pro parfémy začínal na -30 °C a během 1 minuty byl navýšen na 50 °C, poté byla teplota zvýšena na 120 °C rychlostí 3 °C/min a poté na 250 °C rychlostí 25 °C/min.
60
Získané výsledky z této studie ukázali, že míchadlo PA se může brát jako referenční ve srovnání s PDMS. Míchadlo EG je možné používat v širokém rozsahu polarity. 2.6.4.4. Analýza vitamínu C Adamem a kolektivem na Univerzitě Pardubice [102] byla stanovena kyselina L-askorbová
v nealkoholických
nápojích
pomocí
mikroextrakce
se
sorbentem
v mikrostříkačce (MEPS) s následnou HPLC-UV analýzou. Bylo analyzováno 10 vzorků nealkoholických nápojů, jednalo se o 5 vzorků ledových čajů a 5 vzorků ovocných šťáv. Pro MEPS byla použita jehla BIN – C 18. Optimalizovány byly tyto parametry: BIN jehla, množství vzorku, eluční rozpouštědlo a jeho objem. Analýza byla provedena pomocí HPLC s UV na koloně LiChrospher 100 RP-18e (250 x 4 mm, 5μm). Chromatografické podmínky - mobilní fáze A byla voda okyselená kyselinou octovou na pH 2,94, mobilní fáze B byl použit methanol (izokratická eluce: 80 % mobilní fáze A a 20 % mobilní fáze B). Doba analýzy byla 10 minut, rychlost průtoku 1 ml/min a dávkovaný objem 20 μl. Pro účel kvantifikace byla zvolena metoda standardního přídavku. Zásobní roztok kyseliny askorbové (s koncentrací 5 mg/ml) byl přidán do vzorků před aplikací metody MEPS. Získané výsledky všech 10 vzorků jsou shrnuty v tabulce 4. Z těchto výsledků je možné vidět, že koncentrace kyseliny L-askorbové v ovocných vzorcích je obvykle mnohem vyšší než koncentrace u vzorků ledových čajů. Tab 4: Koncentrace kyseliny askorbové v analyzovaných vzorcích [102]
Vzorek T1 T2 T3 T4 T5
Koncentrace [μg/ml] 56,5 160,9 195,4 124,0 87,1
Vzorek F1 F2 F3 F4 F5
Koncentrace [μg/ml] 684,1 559,1 130,4 990,8 1090,0
Ledové čaje RSD [%] 10,65 2,12 0,90 8,36 11,45 Ovocné šťávy RSD [%] 1,42 1,37 6,39 1,89 6,42
61
Typ vzorku ledový čaj -citrón bílý ledový čaj zelený ledový čaj ledový čaj – broskev ledový čaj – ginko a guarana Typ vzorku pomerančový juice jablkový juice mix juice mix juice mix juice
2.7. Retenční index Jednoznačný cíl chromatografických analýz je separace složek směsi. Chromatografický systém poskytuje retenční data, která jsou vhodná jako doplňující informace pro identifikaci látek. K tomuto účelu se využívají rovnice (10) a (11), které byly navržené Kovatsem a slouží pro izotermické analýzy. Výsledky jsou uváděny jako Kovatsův index. Pro chromatografické analýzy s teplopním gradientem se používá rovnice (12) navržená van den Doolem a Kratzem. Hodnoty získané z této druhé rovnice se v literatuře uvádí jako lineární retenční index nebo retenční index naprogramované teploty. Tyto hodnoty jsou využívány pro srovnání výsledků mezi laboratořemi [103]. Identifikace sloučenin u GC/MS je provedena na základě srovnání experimentálních hmotnostních spekter s údaji uloženými ve vhodné knihovně spekter. Identifikace strukturně podobných sloučenin, které poskytují podobná hmotnostní spektra, je však nejednoznačná. Z toho důvodu je i při GC/MS analyzách využíván retenční index za účelem sjednocení retenčních dat. Retenční index není závislý na provozních podmínkách s výjimkou polarity stacionární fáze. K dispozici je na internetu řada databází s několika sbírkami retenčních indexů [104]. Retenční index poskytuje informaci pro danou sloučeninu, která se nachází v analytické koloně. Je to retenční čas sloučeniny vyjádřený pomocí stupnice retenčních časů n-alkanů. Termodynamický princip je založen na korelaci s chemickou strukturou. Původní definice retenčního indexu za izotermických podmínek byla založena na analýze n-parafinů se sudým počtem C, jak je znázorněno v následující rovnici (10) [105]:
I 200
log X s log X z 100 z log X ( z 2) log X z
(10)
kde I je izotermický retenční index při teplotě T, s je s neznámá sloučenina, z je počet uhlíků a X může být retenční čas nebo retenční objem, atd. Později se však ukázalo, že je toto tvrzení chybné. Při použití n-parafinů se sudým počtem uhlíků docházelo k výkyvům v chromatografických vlastnostech série parafínů, proto Kovats upravil původní návrh do následující rovnice (11) [104]:
RI 100 z 100
log X s log X z log X ( z 1) log X z
kde RI je retenční index neznámé sloučeniny.
62
(11)
Kovatsovy retenční indexy jsou získány z údajů za izotermických podmínek. Van den Doolem s Kratzem byl navržen výpočet retenčního indexu při teplotním gradientu (viz rovnice 12). Ilustrační schéma pro výpočet retenčních indexů ukazuje obrázek 21 [104]:
RI 100 z 100
RTs RTz RT ( z 1) RTz
(12)
kde RT(x) je retenční čas neznámé sloučeniny, RT(z) je retenční čas n-alkanu eluovaného před sloučeninou x a RT(z+1) je retenční čas n-alkanu eluovaného po sloučenině x.
Neznámá sloučenina
C7 C8
C9
RT(z)
C10
RT(x) RT(z+1 )
RT
Obrázek 21 Schéma pro výpočet retenčních indexů [103]
63
2.8. Návrh experimentu (experimental design) Při hledání optimálních extrakčních podmínek je třeba vhodně navrhout model optimalizace (návrh experimentu) a správným způsobem vyhodnotit získaná data. Tento postup se využívá jednak pro optimalizaci procesů, ale lze jej také aplikovat i při návrhu nových
výrobků.
Experimentální
plánování
se
využívá
především
v chemickém,
farmaceutickém nebo zpracovatelském průmyslu, ale i v oblasti elektroniky a strojního inženýrství [106]. Při plánování pokusů pro optimalizaci analytických metod je důležité navolit vhodný experimentální model zahrnující vliv jednotlivých faktorů (parametrů systému). Na základě získaných dat lze následně vyhodnotit tzv. povrchovou (odezvovou) funkci. Klasický postup optimalizace (tzv. OVAT – one variable at a time), kdy je vždy jeden parametr proměnný a ostatní faktory se nemění, je nejen časově, ale i finančně nevýhodný. Pokud by byly zkoumány 2 faktory (parametry), oba na 10 různých úrovních, pak by celkový počet experimentů byl celkem 10x10, tedy 100. Při plánování experimentů lze počet pokusů snížit, a i přesto bude funkce dobře popsána [107, 108]. Základní koncept statistického plánování experimentu a analýzy dat byl navržen na počátku 20. století. Od té doby bylo navrženo velké množství typů plánování experimentů včetně různých technik analýzy získaných dat [109]. Mezi nejdůležitější cíle plánování experimentů patří [110, 111]:
určení faktorů, které mají vliv na výslednou analýzu,
určení optimálního nastavení jednotlivých faktorů.
2.8.1. Plackett-Burmanův návrh experimentu Konstrukce Plackett-Burmanových plánů je založena na ortogonálních sloupcích tvořených z horních (+1) a dolních (-1) úrovní faktorů a tvoří ortogonální soustavu. Cílem je otestovat co možná největší počet faktorů a nalézt ty, které mají významný vliv na výslednou analýzu. Je zadán první řádek návrhu pro maximální počet sledovaných faktorů. Postupnou úplnou rotací prvního řádku je získán druhý řádek a takto se pokračuje až do řádku N-1. Poslední řádek N obsahuje pouze dolní úroveň všech faktorů. Takto konstruované plány zaručují stejný počet měření na dolních a horních úrovních u každého faktoru. Nastavení
64
prvních řádků Plackett-Burmanova návrhu pro různý počet faktorů je znázorněno v tabulce 5 [112]. Tab. 5: Konstrukce prvních řádků Plackett-Burmanova návrhu experimentu [112] Počet faktorů 3 7 11 15 19
Počet měření 4 8 12 16 20
1.řádek +++++-+-++-+++---+++++-+-++--+++--++++-+-+----++-
2.8.2. Kódování proměnných Protože fyzikální stupnice jednotlivých proměnných parametrů se liší, je lepší pro získání představy o významu těchto hodnot nastavit srovnatelné měřítko. Výsledkem toho je použití společného kódu experimentálních dat. Každá proměnná se proto umístí do měřítka, kdy pro nejvyšší hodnotu se užívá kód +1, pro nejnižší -1 a pro střední hodnotu 0. Konstrukce matice se tím zjednodušuje [113]. 2.8.3. Faktorový plán Faktorový plán (factorial design) je často používaný systém uspořádání experimentu kvůli jeho jednoduchosti. Jeho výhodou je hlavně odhalení vzájemné interakce proměnných faktorů. Model lze prezentovat odpovídajícím počtem pokusů, aniž by byly hledány všechny kombinace proměnných parametrů na jednotlivých úrovních [108, 113]. Počet experimentů pro úplný faktorový plán (N) lze určit na základě vztahu (13), 𝑁 = 𝑙𝑓
(13)
kde f je počet proměnných faktorů a l je počet úrovní pro tyto faktory. Takže pro 2 faktory zvolené ve třech úrovních jejich hodnot bude celkový počet experimentů 32 = 9 (obrázek 22 a tabulka 6.). Při větším počtu faktorů lze použít tzv. zkrácený protokol.
65
Tab. 6: Příklad konstrukce kódované a reálné experimentální matice pro dva faktory na třech úrovních [111] Číslo experimentu 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Kódovaná Experimentální matice Matice Reálných hodnot faktor 1 faktor 2 pH teplota (°C) -1 -1 4 30 -1 0 4 45 -1 +1 4 60 0 -1 5 30 0 0 5 45 0 +1 5 60 +1 -1 6 30 +1 0 6 45 +1 +1 6 60
Obrázek 22 Princip kódování jednotlivých úrovní pro dva faktory a tři úrovně [111] Z rovnice (14) lze vyjádřit matematický model získaný vyhodnocením funkčních hodnot bodů plánu. Tato polynomická funkce zahrnuje konstantu b0, vliv prvního faktoru b1, vliv druhého faktoru b2 a jejich vzájemné interakce b12. [113] y=b0 +b1 ∙x1 +b2 ∙x2 +b1,2 ∙x1 x2
(14)
Pro složitější procesy s nelineárními vztahy je nutné použít aproximační rovnice vyšších řádů, které jsou získány použitím faktorového plánu se třemi (a více) úrovněmi. Tyto plány se nazývají RSM (Response Surface Methodology) a umožňují vykreslení zakřivených ploch. 2.8.4. Neúplný faktorový plán Když se vyskytne větší počet proměnných, kdy není možné hledat jejich jednotlivé vzájemné vazby, využívá se tzv. neúplného faktorového plánu (fractional factorial design). Tento model je jednak jednodušší, ale také vhodnější pro zjišťování významnosti jednotlivých
66
faktorů, kdy závislost mezi faktory je lineární. Srovnání mezi experimentální kódovanou maticí dat pro úplný a neúplný faktorový plán ukazuje tabulka 7 a obrázek 23. [108, 111]. Tab. 7: Srovnání úplného a neúplného faktorového plánu pro kódovanou experimentální matici dat pro 3 faktory na 2 úrovních [111] Číslo experimentu 1 2 3 4 5 6 7 8
Uplný faktorový plán Neúplný faktorový plán faktor 1 faktor 2 faktor 3 faktor 1 faktor 2 faktor 3 1 1 1 1 1 1 1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1
Obrázek 23 Prostorové zobrazení úplného faktorového plánu (A) a neúplného faktorového plánu (B) [113] 2.8.5. Hvězdicový plán Jedním z dalších typů plánu je hvězdicový plán (star design), který lze na rozdíl od ostatních použít pro vyjádření zakřivení plochy. Pro vystižení zakřivení plochy je potřeba minimálně tří úrovní pro každý faktor, které jsou nejběžněji označeny -1, 0 a +1, přičemž 0 popisuje střední úroveň. Pro tři faktory se hvězdicový plán skládá z centrálního bodu ve středu krychle a 6 bodů ve středu stěn krychle. Obecně tento plán obsahuje 2n + 1 experimentálních bodů, kde n charakterizuje počet faktorů [107, 111].
67
2.8.6. Centrálně kompozitní plán (central composite design) Kombinací úplného faktorového a hvězdicového plánu, který ve svém matematickém modelu zahrnuje zakřivení plochy, se získá tzv. centrálně kompozitní plán (CCD) pro kombinaci, ve které jsou středy obou plánů shodné (tabulka 8 a obrázek 24) [107]. Celkový počet experimentů (neboli bodů experimentální matice) bude 2n + 2∙n + C pro n faktorů na 2 úrovních. C udává počet měření středového bodu (obvykle 3 - 6), jehož opakovaným měřením lze získat data pro hodnocení opakovatelnosti. Pro 3 faktory bude matematická podoba modelu dle vztahu (15). y = b0 +b1 ∙x1 +b2 ∙x2 +b3 ∙x3 +b11 ∙x1 2 +b22 ∙x2 2 +b33 ∙x3 2 +b12 ∙x1 x2 +b13 ∙x1 x3 +b23 ∙x2 x3 (15) Pro přesnější popis daného systému byla provedena modifikace hvězdicové části návrhu, kdy hodnoty -1 a +1 byly nahrazeny hodnotami –α a +α (modely pro rotovatelnost nebo ortogonalitu návrhu), ležící mimo stěny pomyslné krychle (obrázek 24, tabulka 8). Ve výsledku je pak každý parametr testován ne na 3, ale na 5 úrovních při zachování počtu experimentu.
Obrázek 24 Prvky centrálně kompozitního plánu (každá osa prezentuje faktor) [107]
68
Tab. 8: Konstrukce centrálně kompozitního plánu [107] Neúplný faktorový plán 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 úplný faktorový plán centrálně kompozitní plán 1 1 1 1 1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 hvězdicový plán 0 0 -1(-α) 0 0 -1 0 0 1 0 0 1(α) 0 1 0 0 1(α) 0 0 -1 0 0 -1(-α) 0 1 0 0 1(α) 0 0 -1 0 0 -1(-α) 0 0 opakování ve středu 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2.9. Metoda odezvové (responzní) plochy Metoda odezvové plochy (Response Surface Methodology - RSM) je souhrn matematických a statistických technik, které se používají pro modelování a analýzu podmínek a jejich odezva je ovlivněna několika proměnnými s cílem optimalizovat tuto odezvu. Při modelování se nejčastěji používá explicitně vyjádřená matematická funkce, která popisuje celkovou variabilitu sledované odezvy (závisle proměnná y) vlivem vstupních faktorů (nezávisle proměnné x1, x2…xi) a náhodné složky (𝜖) zahrnující jak chybu měření, tak chybu modelu pro konkrétní pravděpodobnostní rozdělení. Tento model je popsán následujícím vztahem (16) [114]. 𝑦 = 𝑓 (𝑥1 , 𝑥2 … 𝑥𝑖 ) + 𝜖
69
(16)
Pro modelování odezvové plochy je obecně vhodný polynom nižšího stupně, většinou prvního nebo druhého. Pro určení směru, ve kterém se nachází optimum, se používá polynom prvního stupně (obrázek 25 a), jehož podobu lze vyjádřit vztahem (17), 𝑦 = 𝑏0 + 𝑏1 ∙ 𝑥1 + … + 𝑏𝑖 ∙ 𝑥𝑖
(17)
kde y je průměrná hodnota odezvy, 𝑏0 , 𝑏1 , … 𝑏𝑖 jsou odhady regresních koeficientů 𝑥1 , … 𝑥𝑖 jsou kódované nezávisle proměnná i udává počet nezávisle proměnných zohledněných v modelu. Pokud daný model zohledňuje zakřivení plochy, pak se užívá polynomu druhého stupně (obrázek 25 b), který lze vyjádřit vztahem (18), 𝑘 𝑦 = 𝑏0 + ∑𝑘𝑖=1 𝑏𝑖 ∙ 𝑥𝑖 + ∑𝑘𝑖=1 𝑏𝑖𝑖 ∙ 𝑥𝑖 2 + ∑𝑘−1 𝑖=1 ∑𝑗=𝑖+1 𝑏𝑖𝑗 ∙ 𝑥𝑖 ∙ 𝑥𝑗
(18)
kde 𝑦 je průměrná hodnota odezvy, b jsou odhady regresních koeficientů 𝑥1 , … 𝑥𝑘 jsou kódované nezávislé proměnné a k udává počet nezávisle proměnných [114]. Parametr b0 v rovnicích (17) a (18) pak odpovídá variabilitě náhodné složky (𝜖) a to v rovnici (16).
y
y
Obrázek 25: Příklady grafického znázornění průměrné odezvové plochy popsané oběma modely (a) modelem polynomu prvního stupně (b) modelem polynomu druhého stupně [115].
70
3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
71
3.1. Použité vzorky, chemikálie a ostatní materiál 3.1.1. Analyzované vzorky V průběhu práce bylo analyzováno deset vzorků bylinných čajů, které byly zakoupeny v lékárnách a v běžné obchodní síti v České republice. Tyto vzorky bylinných čajů jsou uvedeny v tabulce 9 a zobrazeny na obrázku 26. Dále byly použity vzorky rostlinného materiálu z Itálie. Jednalo se o patnáct kapalných extraktů rostlin (Origanum vulgare, Origanum sp.,,Pizza”, Nepeta cataria, Salvia sclarea a Saturaje hortensis, tabulka 10, obrázek 27). Tyto vzorky jsou specificky označeny od univerzity Turín. Dále bylo použito deset vzorků koření oregano pocházející z oblastí Turína (tabulka. 11), a také sedm vzorků koření oregana, které byly zakoupeny v obchodní síti v České republice (tabulka. 12, obrázek 28). Kapalné vzorky byly uchovávány za chladu v tmavých lahvičkách. Ostatní vzorky byly skladovány v suchém, tmavém místě, při laboratorní teplotě v originálních obalech. Tab. 9: Analyzované vzorky čaje Název
Výrobce
Typ čaje
Sedmero bylin s echinaceou
Mokate SA Ustroň, Polsko
Bylinný čaj porcovaný
Spánek a nervy
Leros Natur Zbraslav, ČR
Bylinný čaj v nálevových sáčcích
Štíhlá linie
Leros Natur Zbraslav, ČR
Bylinný čaj v nálevových sáčcích
Imunostim
Valdemar Grešík – Natura, Děčín, ČR
Bylinný čaj v sáčcích
Lipton - Herbal Alps
Unilever, Praha, ČR
Bylinný čaj
Zažívání
Leros Natur Zbraslav, ČR
Bylinný čaj
72
Složení Mateřídouška (44 %), anýz (18 %), fenykl (18 %), květ heřmánku (5 %), Echinacea (5 %), tymián (5 %), květ měsíčku Nať meduňky (55 %), heřmánkový květ (30 %), chmelová šištice, kořen kozlíku (5 %), levandulový květ (5 %) PhuEr (černý čaj), zelený čaj (20 %), nať máty peprné (20 %), list maté, list břízy, kopřivová nať (10 %), fenyklový plod, mořská řasa Kopřiva list, šípek, černý bez květ, černý rybíz list, benedikt nať, přeslička nať, šalvěj list, anýz plod, vřes nať Máta peprná (62,2 %), eukalyptus (26,6 %), aroma (11 %) Nať máty peprné (30 %), citronová tráva – lemongrass, plod kmínu, mateřídouška nať (20 %), květ heřmánku (10 %), zázvorový kořen
Název Fresh mint
Výrobce Biogena CB České Budějovice, ČR
Typ čaje
Složení
Bylinný porcovaný čaj
Máta peprná
Sedmero bylin
Mokate SA Ustroň, Polsko
Bylinný čaj porcovaný
Dobrou noc
Valdemar Grešík Natura, Děčín, ČR
Bylinný sypaný čaj
Urologická čajová směs
Megafyt pharma Vrané nad Vltavou, ČR
Bylinný léčivý čaj
Obrázek 26 Vzorky bylinných čajů
73
Rooibos (55 %), list máty peprné (12,5 %), list ostružníku (12 %), plod fenyklu (10%), sporýš lékařský (5 %), skořice (3 %), lékořice Dobromysl nať, meduňka nať, mateřídouška nať, chmel šištice, prvosenka květ, heřmánek květ, srdečník nať, mučenka nať, levandule květ Březový list (450 mg), medvědicový list (450 mg), nať máty peprné, jehlicový kořen, petrželový kořen, průtržníková nať
Tab. 10: Analyzované vzorky rostlinného původu z Itálie Vzorek Origanum vulgare L. 25 Origanum vulgare L. 26 Origanum vulgare L. 27 Origanum vulgare L. 29 Origanum vulgare L. 30 Origanum vulgare L. 31 Origanum vulgare L. 32 Origanum vulgare L. 33 Origanum vulgare L. 34 Origanum vulgare L. 35 Origanum vulgare L. 36 Origanum sp. ,,Pizza” Šanta kočičí (Nepeta cataria L.) Šalvěj obecná (Salvia sclarea L.) Saturejka zahradní (Satureja hortensis L.)
Specifikace Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek Kapalný vzorek
Tab. 11: Analyzované vzorky koření oregano z Itálie Označení vzorku A B C D E F G H I J
Vzorek Oregano listy - Cannamela Oregano listy - Carrefour Oregano listy - Calabria 2011 Oregano listy - Pantelleria 2013 Oregano listy - Calabria 2010-2011 Oregano listy - Ducroix Oregano listy - Kania Oregano listy – ze zahrady v Turíně Oregano listy – Cannamela 12 Oregano listy – Cannamela 20
Původ obchodní síť - Turín obchodní síť - Turín ze zahrady v oblasti Turín ze zahrady v oblasti Turín ze zahrady v oblasti Turín obchodní síť - Turín obchodní síť - Turín obchodní síť - Turín obchodní síť - Turín obchodní síť - Turín
Obrázek 27 Vzorky koření oregano z Itálie
74
Tab. 12: Analyzované vzorky koření oregano z České republiky Označení vzorku 1 2 3 4 5 6 7
Výrobce Kotányi, Wolkerdorf, Rakousko Vitana, Byšice, Česká republika Lidl, Česká republika Orient, Kotányi, Wolkerdorf, Rakousko Vitana, a.s., Byšice, Česká republika Thymos, Velká Lomnice, Česká republika Thymos, Velká Lomnice, Česká republika
Obrázek 28 Vzorky koření oregano z České republiky 3.1.2. Rozpouštědla Aceton p.a.
Penta, Chrudim, ČR
Acetonitril, Gradient grade
Sigma-Aldrich, Praha, ČR
1-dekanol, 99 %
Sigma-Aldrich, Praha, ČR
1-dodekanol, 98 %
Sigma-Aldrich, Praha, ČR
Cyklohexan
Sigma-Aldrich, Milano, Itálie
Dichlormethan p.a.
Lach-Ner, Neratovice, ČR
Ethylalkohol 96 %
Lach-Ner, Neratovice, ČR
Chloroform p.a.
Lach-Ner, Neratovice, ČR
Methanol p.a.
Penta, Chrudim, ČR
2-oktanol p.a.
Lach-Ner, Neratovice, ČR
p-xylen, 99 %
Merck, Darmstadt, Německo
2-propanol, 99,7 %
Lach-Ner, Neratovice, ČR
1-propanol p.a.
Penta, Chrudim, ČR
75
Země původu Turecko ČR ČR ČR ČR Turecko Turecko
Tetrachlormethan p.a.
Penta, Chrudim, ČR
1-undekanol 99 %
Sigma-Aldrich, Praha, ČR
3.1.3. Stlačené plyny Centrální rozvod tlakového vzduchu
Univerzita Pardubice, ČR
Dusík
čistota 5,0; Linde Gas, Praha, ČR
Vodík
čistota 3,0; Linde Gas, Praha, ČR čistota 2,8; Linde Gas, Milano, Itálie čistota 5,0; Linde Gas, Praha, ČR
Helium
3.1.4. Standardy Všechny standardy byly dodány firmou Sigma - Aldrich, Praha, ČR. Fyzikálně chemické vlastnosti těchto sloučenin jsou uvedeny v následující tabulce 13 a jejich strukturní vzorce jsou uvedeny na obrázku 29. Tab. 13: Fyzikální vlastnosti sledovaných složek silic
borneol cinamaldehyd eukalyptol kafr karvakrol limonen linalool menthol menthon nerol α-thujon thymol
Sumární vzorec C10H18O C9H8O C10H18O C10H16O C10H14O C10H16 C10H180 C10H20O C10H18O C10H18O C10H16O C10H18O
MR 154,25 132,15 154,25 152,25 150,22 136,24 154,24 156,27 154,25 154,25 152,23 150,22
Tv [°C] 208 248 176-177 204 236-237 176-177 198 - 199 212 207-210 225-230 17,49 232
ρ [g.cm-3] 1,011 1,050 0,921 0,990 0,976 0,843 0,868 0,890 0,893 0,877 0,920 0,965
MR – relativní molární hmotnost, Tv – teplota varu, ρ - hustota Řada n-alkanů (C8 - C20)
Sigma-Aldrich, Praha, ČR
Řada n-alkanů (C9 - C25)
Sigma-Aldrich, Milano, Itálie
76
CAS číslo 464-45-9 104-55-2 470-82-6 76-22-2 499-75-2 138-86-3 78-70-6 2216-51-5 89-80-5 106-25-2 546-80-5 89-83-8
Čistota[%] 99 98 98 95 98 99 98 99 99 97 98 99
Borneol
Cinamaldehyd
Eukalyptol
Kafr
Karvakrol
Limonen
Menthol
Menthon
Linalool
Nerol
α-Thujon
Thymol
Obrázek 29 Strukturní vzorce analyzovaných silic
77
3.2. Použité přístroje a zařízení Plynový chromatograf s plamenovým ionizačním detektorem HP-5890 - Hewlett–Packard, Avondale, PA, USA. Plynový chromatograf GC 17A s hmotnostním spektrometrem QP-5050A - Shimazu, Kyoto, Japonsko. Plynový chromatograf s hmpotnostním spektrometrem GC/MS Thermo DSQ - ThermoFisher, Milano, Itálie. Centrifuga NF 400 - NF 400R (průměr rotoru 16 cm, Núve, Ankara, Turecko). Ultrazvuková lázeň TK 52 (Bandelin Sonorex, Berlín, Německo). Digitální analytické váhy (HR-200, Helago s.r.o., Hradec Králové, ČR). Digitální analytické váhy (KERN ABT 220-4M, Kern, Berlín, Německo). Mikropipety (Biohit Proline, Biohit OY, Helsinky, Finsko). SPME vlákna: 65 μm DVB/CAR a 50/30 μm DVB/PDMS/CAR (Supelco, Bellefonte, PA, USA). SPME držák pro manuální vzorkování (Supelco, Bellefonte, PA, USA). Čistič stříkaček Syringe Clear (Hamilton-Bonaduz AG, Bonaduz, Švýcarsko). Magnetické míchadlo (Color Squid Num – Ika, Staufen, Německo). Mikrostříkačka GC Hamilton Microliter 701 se sešikmeným hrotem, objem 10 μl (Bonaduz AG, Bonaduz, Švýcarsko).
78
3.3. Pracovní postupy 3.3.1. Příprava čajů z bylinných směsí U postupu přípravy bylinných čajů byla sérií testů provedena optimalizace. Jako optimální byly zvoleny následující podmínky: jeden celý nálevový sáček byl přelit vodou o teplotě 90 °C v poměru 250 ml vody na 4 g sypkého čaje (množství vody přepočteno dle hmotnosti nálevového sáčku). Po 10 minutách byl sáček vyjmut a získaný nápoj použit k další analýze. 3.3.2. Extrakce sledovaných sloučenin z nápojů 3.3.2.1. Mikroextrakce tuhou fází Do extrakční nádobky o velikosti 15 ml bylo odměřeno 12 ml nálevu čaje (plná nádobka) a tato byla uzavřena víčkem se septem. SPME vlákno 65 μm DVB/CAR bylo vysunuto přibližně do středu výšky hlasiny vzorku v nádobce. Extrakce probíhala po dobu 30 minut při laboratorní teplotě a celý obsah byl míchán pomocí magnetického míchadla rychlostí 150 ot/min. Po skončení extrakce bylo vlákno převedeno do nástřikového prostoru plynového chromatografu. Tepelná desorpce extrahovaných látek probíhala po dobu 1 minuty při teplotě 250 °C. Dočištění vlákna bylo prováděno v čističi stříkaček při teplotě 250 °C po dobu 5 minut, čímž bylo zabráněno případnému „carry over“ efektu. Každá extrakce byla provedena třikrát. Celé uspořádání extrakce je zobrazeno na obrázku 30.
Obrázek 30 Uspořádání extrakce tuhou fází
79
3.3.2.2. Mikroextrakce jednou kapkou Do extrakční nádobky o velikosti 15 ml bylo odměřeno 12 ml připraveného čaje a nádobka byla uzavřena víčkem s propichovatelným septem. Do vzorku byla umístěna mikrostříkačka tak, aby se sešikmený hrot jehly nacházel ve středu výšky hlasiny vzorku v nádobce, a pístem mikrostříkačky byla vytlačena 1 μl kapka extrakčního rozpouštědla p-xylenu. Extrakce trvala 30 minut při laboratorní teplotě a obsah byl míchán magnetickým míchadlem rychlostí 100 ot/min. Po uplynutí této doby byla kapka vtažena zpět do jehly a analyzována pomocí plynového chromatografu. Každá extrakce byla provedena třikrát. Celé uspořádání SDME je zobrazeno na obrázku 31.
.
Obrázek 31 Uspořádání extrakce jednou kapkou
3.3.3. Mikroextrakce tuhou fází sypkých bylinných čajů 3.3.3.1.Headspace mikroextrakce tuhou fází pro 1 teplotu Pro extrakci bylo naváženo 0,5 g vzorku do 15 ml nádobky, která byla uzavřena víčkem se sepem potaženým teflonem. Každý vzorek byl před extrakcí temperován po dobu 30 minut při 70 °C. Po temperaci byla provedena extrakce při stejné teplotě po dobu 25 minut. Jehlou bylo propíchnuto septum a pomocí pohyblivého pístu bylo vysunuto vlákno 50/30 µm DVB/CAR/PDMS (hloubka 2 cm) do prostoru nad vzorek. Po extraci byla provedena tepelná desorpce v nástřikovém prostoru GC při teplotě 250 °C po dobu 1 minuty. Každá extrakce byla provedena třikrát. 80
3.3.3.2. Headspace mikroextrakce tuhou fází pro kombinaci 2 teplot - suchý způsob U metody využívající kombinaci dvou sorpčních teplot byla provedena SPME 50/30 µm DVB/CAR/PDMS pro teploty 40 °C, 80 °C a kombinaci obou teplot (80/40 °C). Extrakce probíhala vždy s 0,5 g vzorku sypkého čaje v 15 ml nádobce po celkovou dobu 25 minut v prostoru nad vzorkem. Každá extrakce byla provedena třikrát. Po extraci byla provedena tepelná desorpce v nástřikovém prostoru GC při teplotě 250 °C po dobu 1 minuty. Extrakční podmínky jsou uvedeny v tabulce 14. Tab. 14: Extrakční podmínky pro využití více sorpčních teplot Teplota [°C] 40 80 80:40
Čas [min] 25 25 12,5:12,5
Temperace [min]
Vlákno
30
50/30 µm DVB/CAR/PDMS
3.3.3.3. Headspace mikroextrakce tuhou fází pro kombinaci 2 teplot - mokrý způsob Byla provedena SPME 50/30 µm DVB/CAR/PDMS pro teploty 40 °C, 80 °C a kombinaci obou teplot. Extrakce probíhala vždy s 0,5 g vzorku sypkého čaje s přídavkem 1 ml roztoku soli (koncentrace soli 0-34 g/100 ml) v 15 ml nádobce po celkovou dobu 40 minut v prostoru nad vzorkem. Každá extrakce byla provedena třikrát. Po extraci byla provedena tepelná desorpce v nástřikovém prostoru GC při teplotě 250 °C po dobu 1 minuty. 3.3.4. Mikroextrakce tuhou fází pro koření oregano 3.3.4.1. Kvantitaviní analýza složek silic v koření oregano Koření oregano bylo naváženo 50 mg do vzorkovacích skleněných nádobek o objemu 20 ml. Extrakce byla provedena na 50/30 µm DVB/CAR/PDMS vláknu za pomoci autosampleru AS3000 (MPS Multi Purpose Sampler) za podmínek 30 min při 50 °C, dle podmínek pracoviště na univerzitě Turín. Po extraci byla provedena tepelná desorpce v nástřikovém prostoru GC při teplotě 250 °C po dobu 1 minuty. Každá extrakce byla provedena třikrát. Kvantitativní analýza byla provedena metodou kalibrační přímky pomocí MHE (multi headspace extrakce).
81
3.3.4.2. Analýza aromaprofilu koření oregana Pro určení aromaprofilu vzorku koření oregano bylo naváženo 500 mg vzorku do vzorkovacích skleněných nádobek o objemu 20 ml. Extrakce byla provedena na 50/30 µm DVB/CAR/PDMS vláknu po dobu 30 minut při 50 °C. Po extraci byla provedena tepelná desorpce v nástřikovém prostoru GC při teplotě 250 °C po dobu 1 minuty. Každá extrakce byla provedena třikrát.
3.3.4.3. Mikrodestilace Do destilační nádoby bylo nasypáno 10 g vzorků koření oregano, které bylo předem rozemleté. Poté bylo přidáno 100 ml destilované vody a vše zůstalo v klidu po dobu 45 minut. Poté bylo přidáno 150 ml destilované vody a do horní baňky sloužící pro záchyt extraktu bylo odměřeno 300 μl cyklohexanu. Následně byl zapnut topný aparát po dobu 2 hodin. Celá aparatura mikrodestilace je znázorněna na obrázku 32.
Obrázek 32 Aparatura mikrodestilace
82
3.3.5. Analýza vzorků plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Získané analyty byly analyzovány pomocí plynového chromatografu HP-5890 s plamenovým ionizačním detektorem (FID). K separaci jednotlivých analytů byla použita kapilární kolona HP-5 (délka 30 m, průměr 0,32 mm a tloušťka stacionární fáze 1 µm). Při dávkování vzorku byl nastaven dělič toku 1:10. Jako nosný plyn použit dusík. Nástřikový prostor i detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Na vstupu do kolony byl přetlak 50 kPa. Teplotní program pro GC je uveden v tabulce 15. Tab. 15: Teplotní program pro GC Teplota (°C) 80 250
Gradient (°C/min) 6 0
Izoterma (min) 6 0
3.3.6. Analýza vzorků plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí Vzorky byly analyzovány pomocí plynového chromatografu GC 17A spojeného s hmotnostním
spektrometrem
QP-5050A
(kvadrupólový
analyzátor).
Hmotnostní
spektrometr pracoval v režimu elektronové ionizace při 70 eV v rozsahu skenování 40 – 400 m/z. V tabulce 16 je uveden teplotní a tlakový program. Na univerzitě Turín byly vzorky analyzovány pomocí plynového chromatografu spojeného s hmotnostním spektrometrem Thermo DSQ (Thermo Fisher, Rodano, Milano, Itálie). K vyhodnocování dat byl použit měřící a vyhodnocovací program GC/MS solution 1.20, Shimadzu (Kyoto, Japonsko). Tento program umožňuje integraci píků, porovnání naměřených hmotnostních spekter s knihovnou spekter, porovnání a vyhodnocování chromatogramů. Tab. 16: Teplotní a tlakový program Teplota [°C] 55 250
Izoterma [min] 6 0
Gradient [°C/min] 6 0
Tlak [kPa] 27,5 74,8
Izobara [min] 6 0
Gradient [kPa/min] 1,5 0
83
3.4. Výpočet retenčních indexů a identifikace látek Pro výpočet RI jednotlivých složek extraktů byla změřena homologická řada n-alkanů. Do nástřikového prostoru GC byl nadávkován 1 µl neředěného standardu alkanů (C8 - C20), případně C9 - C25 na univerzitě Turín, dávkování probíhalo ve splitovacím poměru 1:50. Na obrázku 33 je znázorněn chromatogram homologické řady n-alkanů. Výpočet RI byl proveden
Intenzita
podle Kovatse a podle van den Doola viz rovnice (11) a (12) (kapitola 2.7.).
Čas [min]
Čas [min] Obrázek 33 Homologická řada n-alkanů (C8-C20). Pro spolehlivou identifikaci je nutnou podmínkou korelace hmotnostního spektra a retenčního indexu látky. Hmotnostní spektra jednotlivých píků byla v programu GCMS Solution 4.20 porovnána s knihovnami spekter FFNSC 2, NIST 11s, NIST 11 a WILEY 229. K porovnání retenčních indexů byly použity online databáze Volatile compounds in food (dále jen VCF) [116] a NIST Chemistry WebBook (dále jen Nist) [117]. Ve všech vzorcích byly identifikovány sloučeniny tvořící alespoň 80% plochy píků v TIC. Identifikace některých sloučenin nebyla možná, a to z důvodu příliš malé odezvy, kdy zaznamenané hmotnostní spektrum nebylo dostatečně intenzivní a bylo překryto šumem základní linie. Dalším důvodem byla nevyhovující shoda s knihovnou hmotnostních spekter nebo absence dat o retenčním indexu látky ve všech použitých zdrojích.
84
4 VÝSLEDKY A DISKUSE
85
4.1. Analýza bylinných nápojů 4.1.1. Volba vhodné přípravy bylinných nápojů Pro přípravu bylinných nápojů s následnou mikroextrakci jednou kapkou na GC/FID a pro mikroextrakci vláknem na GC/MS byla nejprve provedena optimalizace dle přístupu OVAT (One Variable at a Time), kdy byly jednotlivé parametry optimalizovány odděleně při konstantních hodnotách ostatních parametrů. K optimalizaci byly zvoleny bylinné čaje – Imunostim a Sedmero bylin s cílem získat co nejvíce sloučenin, a aby čaj stále vyhovoval stránce konzumační. Optimalizována byla navážka vzorku, teplota vody na zalití vzorku a doba, za kterou byl sáček čaje vyjmut (doba macerace). Všechny hodnoty byly měřeny třikrát. Původní postup přípravy nápoje byl následující – byly naváženy 3 g (s přesností na 0,0001 g) a zality převařenou vodou o teplotě 90 °C o objemu 250 ml. Doba macerace byla 5 minut. Při optimalizaci postupu přípravy bylinných čajů byla využita metoda DI-SDME s následnou GC/FID analýzou. Pro analýzu bylo použito 12 ml takto připraveného vzorku. Postup byl převzat z literatury [118].
Optimalizace navážky vzorku pro přípravu čaje - byla provedena na bylinném čaji Sedmero bylin s navážkami 1, 2, 3, 4, 5, 7 a 9 g. Získané výsledky jsou na obrázku 34 demonstrovány na eukalyptolu, karvakrolu a kafru. Vzorek byl zalit převařenou vodou o teplotě 90 °C a o objemu 250 ml. Doba macerace byla 5 minut. U navážky 1 g byla výtěžnost silic poměrně malá. U navážky 5, 7 a 9 g byl bylinný čaj už příliš koncentrovaný a pro běžné použití (horší senzorické vlastnosti) nevhodný. Jako vhodné množství vzorku byla určena navážka 4 g.
Optimalizace teploty vody u zalití nápoje - byla provedena na bylinném čaji Imunostim s použitím teploty vody 25 °C (laboratorní teplota), 50 °C, 70 °C, 90 °C a 100 °C. Získané výsledky jsou demonstrovány eukalyptolem, mentholem a kafrem na obrázku 35. Vzorek byl připraven navážením 4 g a byl zalit 250 ml vody o různých teplotách. Doba macerace byla 5 minut a bylo použito 12 ml vzorku nápoje. U teploty 100 °C byl objem 250 ml vody nalit do kádinky a za varu byl přidán bylinný čaj. Vše bylo necháno 5 minut vařit. U teplot 25 °C, 50 °C a 70 °C byla výtěžnost silic výrazně menší než u teploty 90 °C a 100 °C. Optimální je použití teploty vody 90 °C, i když je u 100 °C vyšší výtěžnost silic i dalších látek, příprava je nepraktická a získaný nápoj nemá dostatečnou kvalitu – nápoj je zakalený a jeho barva není příjemná, což dokazují i výsledky degustace (viz kapitola 4.1.2.). Jako optimální teplota zalití byla zvolena teplota 90 °C. 86
plocha (mV.s)
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1
2
3
4 navážka (g)
eukalyptol
5
karvakrol
7
9
kafr kampfor
Obrázek 34 Optimalizace navážky vzorku pro přípravu čaje 350 300
plocha (mV.s)
250 200 150 100 50 0 25
50
70 teplota (°C) eukalyptol
menthol
90
100
kampfor kafr
Obrázek 35 Optimalizace teploty vody u zalití čaje
Optimalizace doby macerace čajové směsi - byla provedena na bylinném čaji Imunostim. Byl zkoušen čas 3, 5, 10, 30 a 60 minut Získané výsledky byly demonstrovány eukalyptolem, thymolem a kafrem na obrázku 36. Vzorek byl připraven navážením 4 g a byl zalit 250 ml vody o teplotě 90 °C. U doby 3 minuty byla výtěžnost silic poměrně malá. Při 5 minutách byla výtěžnost už lepší, ale ještě přijatelnější sorpce silic byla u doby 10 minut. U 30 a 60 minut byla výtěžnost velká, ale kvalita získaného čaje byla nevyhovující – čaj měl tmavou barvu se zákalem. Jako optimální doba macerace čajové směsi bylo zvoleno 10 minut.
87
700
plocha (mV.s)
600 500 400 300 200 100 0 3
5
10
30
60
doba vyjmutí sáčku čaje (min) eukalyptol
thymol
kafr kamfor
Obrázek 36 Optimalizace doby macerace čajové směsi Jako vhodné podmíneky na přípravu bylinných nápojů byly zvoleny: navážka 4 g vzorku, přelito 90 °C o objemu 250 ml a doba macerace byla 10 min. 4.1.2. Senzorická analýza bylinných čajů K senzorické analýze bylo vybráno 5 bylinných čajů, jednalo se o Štíhlou linii, Imunostim, Zažívání, Spánek a nervy a Lipton Alps. Čaj Imunostim byl podáván dvakrát k ověření schopností hodnotitele (uveden jako šestý vzorek). Všechny čaje byly zality vodou o teplotě 90 °C a doba macerace byla 5 minut. Všichni zúčastnění degustéři z Univerzity Pardubice vyplnili dané formuláře k bylinným čajům seřazených dle aromatičnosti. Degustéři předem nevěděli, o jaké bylinné čaje se jedná. U vzorků bylinných čajů byly hodnoceny čirost, barva, vůně, chuť a celkový pohled na čaj. U každého parametru bylo k dispozici pět stupňů hodnocení. Výsledky byly statisticky zpracovány. K hodnocení jednotlivých parametrů byla použita stupnice od 1 do 5 s tím, že hodnota 5 je nejlepší, nejvýraznější a hodnota 1 je nedostačující, málo výrazná. Výsledky jsou znázorněny pomocí paprskových grafů, které jsou pro senzorickou analýzu typické.
88
4.1.2.1. Bylinný čaj Štíhlá linie U vzorku bylinného čaje Štíhlá linie byla zjištěna velmi dobrá čirost, dobře jevící se medová barva a středně intenzivní vůně. V chuti se tento čaj jevil hodně bylinný a hořký. Celkový dojem byl dobrý. Hodnocení čaje Štíhlá linie je znázorněno na obrázku 37.
Obrázek 37 Hodnocení čaje Štíhlá linie
4.1.2.2. Bylinný čaj Imunostim Vzorek bylinného čaje Imunostim byl zhodnocen velmi dobrou čirostí, dobře se jevící žlutohnědou barvou a středně intenzivní vůní. Chuťově se jedná o lehce kořeněný bylinný sladký čaj. Celkový dojem byl dobrý. Hodnocení čaje Imunostim je znázorněno na obrázku 38.
Obrázek 38 Hodnocení čaje Imunostim
89
4.1.2.3. Bylinný čaj Spánek a nervy U vzorku bylinného čaje Spánek, nervy byla zhodnocena velmi dobrá čirost, dobře se jevící žlutozelená barva a intenzivní vůně. Chuťově je tento čaj sladký a bylinný. Celkový dojem byl dobrý. Hodnocení čaje Spánek a nervy je znázorněno na obrázku 39.
Obrázek 39 Hodnocení čaje Spánek a nervy 4.1.2.4. Bylinný čaj Zažívání Vzorek
bylinného
čaje
Zažívání
byl
celkově
hodnocen
jako
nejlepší,
a to známkou velmi dobrý. Čirost u tohoto čaje byla dobrá, barva příjemně jevící se žlutozelená a vůně intenzivní. V chuti byl velmi pestrý. Jedná se o lehce bylinný hořkosladký čaj s ovocnou a kořeněnou chutí. Hodnocení čaje Zažívání je znázorněno na obrázku 40.
Obrázek 40 Hodnocení čaje Zažívání
90
4.1.2.5. Lipton: Hrbal Alpy Vzorek
bylinného
čaje
Alpy byl
zhodnocen
velmi
dobrou
čirostí,
dobře
se jevící žlutohnědou barvou a intenzivní vůní. Chuťově se jedná o hodně hořký kořeněný bylinný čaj. Celkový dojem byl dobrý. Hodnocení čaje Alpy je znázorněno na obrázku 41.
Obrázek 41 Hodnocení čaje Lipton: Herbal Alpy
Ze získaných výsledků byl zvolen nejlépe hodnocený bylinný čaj - jednalo se o čaj Zažívání. Tento čaj byl následně připraven při různé teplotě zalití a při různé době doba macerace po dobu 10 a 20 min, teplota zalití 90 °C a doba macerace po dobu 5 a 20 min a doba macerace po dobu 5 min při 100 °C. Takto připravené čaje byly opět anonymně degustovány. Výsledky jsou opět demonstrovány na paprskových diagramech (obr. 42 – 46). 4.1.2.6. Zalití vodou o 70 °C a doba macerace 10 minut Z výsledků, které jsou znázorněny na obrázku 42, je patrné, že čirost tohoto čaje je velmi dobrá. Barva byla zhodnocena jako dobrá s odstínem do žlutozelena. Vůně byla středně intenzivní a u chutě převládala chuť bylinná, která byla nejintenzivnější. Dále zde byla také indikována slabá hořká chuť a velmi slabá sladká chuť. Tyto chutě nebyly do grafu zaznamenány, graficky byla vyhodnocena pouze chuť bylinná, která byla nejintenzivnější. Celkový dojem čaje byl dobrý.
91
Obrázek 42 Bylinný čaj - se zalitím vodou o 70 °C a doba macerace 10 minut
4.1.2.7. Zalití vodou o 70 °C a doba macerace 20 minut Výsledky degustace ukázaly, že čirost bylinného čaje byla dobrá. Barva byla příjemná do žlutozelena a vůně byla středně intenzivní. Chuť byla zvolena slabě bylinná, slabě ovocná a velmi slabě sladká. Celkový dojem čaje se pohyboval mezi velmi dobrou a dobrou kvalitou, což je znázorněno na obrázku 43.
Obrázek 43 Bylinný čaj - se zalitím vodou o 70 °C a doba macerace 20 minut
92
4.1.2.8. Zalití vodou o 90 °C a doba macerace 5 minut Čirost bylinného čaje byla zvolena mezi velmi dobrou a dobrou. Barva jako dobrá s odstínem do žlutozelena. Vůně byla málo intenzivní a chuť bylinná střední se slabou hořkou a ovocnou chutí. Celkový dojem byl dobrý. Výsledné schéma čaje je znázorněno na obrázku 44.
Obrázek 44 Bylinný čaj – se zalitím vodou o 90 °C a doba macerace 5 minut
4.1.2.9. Zalití vodou o 90 °C a doba macerace 20 minut Čirost tohoto čaje byla dobrá a barva měla odstín žlutohnědé až do medova s dobrou kvalitou. Vůně byla intenzivní a chuť slabě bylinná, kořeněná a nahořklá. Celkový dojem čaje byl dobrý, což je znázorněno na obrázku 45.
Obrázek 45 Bylinný čaj – se zalitím vodou o 90 °C a doba macerace 20 minut
93
4.1.2.10. Zalití vodou o 100 °C a doba macerace 5 minut Z výsledků, které jsou znázorněny na obrázku 46, je vidět, že čirost tohoto čaje je dobrá. Barva byla zvolena jako příjemná s odstínem do žlutohněda. Vůně byla intenzivní a u chutě převládala chuť bylinná a hořká. Celkový dojem čaje byl nejhorší z hodnocených vzorků, čaj působil až odpudivě.
Obrázek 46 Bylinný čaj – se zalitím vodou o 90 °C a doba macerace 20 minut
4.1.3. Optimalizace mikroextrakce jednou kapkou Optimalizace byla provedena na bylinném čaji Imunostim. Nejprve bylo třeba zvolit vhodné množství vzorku pro extrakci. Byly testovány objemy 6, 8, 10, 12 a 15 ml, a to v nádobce o objemu 15 ml. Získané výsledky byly prezentovány eukalyptolem, nerolem a kafrem na obrázku 47. Vzorek byl připraven navážením 4 g a byl zalit 250 ml vody o teplotě 90 °C. Doba macerace byla 10 minut. Příslušný objem nápoje byl odměřen do vzorkovací nádobky, kde byla za stáleho míchání provedena extrakce metodou DI-SDME po dobu 30 min do 1 µl p-xylenu. U objemu vzorku 6 ml bylo množství získaných silic nejmenší. Lepší sorpce silic byla u objemu vzorků 8 a 10 ml, ale u objemu vzorku 12 ml bylo množství silic největší. U objemu 15 ml došlo ke zhoršení reprodukovatelnosti analýz a současně byl pozorován úbytek extrakční fáze související s částečným rozpouštěním kapky p-xylenu ve vzorku. Jako vhodné množství bylinného nápoje pro extrakci DI-SDME bylo zvleno 12 ml.
94
300
plocha píku (mV.s)
250 200 150 100 50 0 6
8
10 objem vzorku (ml) eukalyptol
nerol
12
15
kampfor kafr
Obrázek 47 Optimalizace objemu vzorku S využitím programu STATISTICA 12 byl navržen experiment pro optimalizaci jednotlivých parametrů extrakce s využitím CCD. Pro přesnější analýzu optimálních podmínek mikroextrakce byly sestaveny experimentální matice pro 3 a 5 úrovní optimalizovaných faktorů. Jedná se o vzájemně nezávislé parametry udávající počet současně pozorovaných hodnot, na kterých je daný faktor založen. Experimentální matice jsou uvedeny v tabulkách 17 a 18. Tab. 17: Experimentální matice pro 3 úrovně faktorů Faktor Otáčky [ot/min] změna pH* Doba extrakce [min] 0 +3 15 1 0 -3 45 2 200 +3 45 3 200 -3 15 4 100 0 30 5 (c) 100 0 30 6 (c) 0 +3 45 7 0 -3 15 8 200 +3 15 9 200 -3 45 10 100 0 30 11 (c) 100 0 30 12 (c) 0 0 30 13 200 0 30 14 100 +3 30 15 100 -3 30 16 100 0 15 17 100 0 45 18 100 0 30 19 (c) 100 0 30 20 (c) *pH upraveno přídavkem KOH (HCl), hodnoty uvádějí změnu pH, c – centrální bod návrhu Číslo experimentu
95
Do extrakční nádobky bylo odměřeno 12 ml nálevu vzorku bylinného čaje a dále bylo postupováno podle návrhu jednotlivých experimentů. Proměnnými byly doba extrakce, pH a rychlost otáček při míchání vzorku. Po skončení sorpce analytů do kapky organického rozpouštědla vždy následovala analýza extraktu pomocí GC/FID. Tab. 18: Experimentální matice pro 5 úrovní faktorů Faktor Otáčky [ot/min] změna pH* Doba extrakce [min] 50 (-1) -1,8 (-1) 20 (-1) 1 50 1,8 (+1) 40 (+1) 2 150 (+1) -1,8 40 3 150 1,8 20 4 100 (0) 0 (0) 30 (0) 5 (c) 100 0 30 6 (c) 50 -1,8 40 7 50 1,8 20 8 150 -1,8 20 9 150 1,8 40 10 100 0 30 11 (c) 100 0 30 12 (c) 0 (-α) 0 30 13 200 (+α) 0 30 14 100 -3 (-α) 30 15 100 3 (+α) 30 16 100 0 14 (-α) 17 100 0 46 (+α) 18 100 0 30 19 (c) 100 0 30 20 (c) *pH upraveno přídavkem KOH (HCl), hodnoty uvádějí změnu pH vůči původnímu vzorku Číslo experimentu
c – centrální bod návrhu
Po analýze extraktů byly získané chromatogramy vyhodnoceny za pomoci integrační stanice CSW32, Data Apex, Praha, ČR. Programem STATISTICA 12 byly vytvořeny vhodnostní profily a plošné vhodnostní grafy, které korespondují s vhodnostními profily a jsou vždy kombinací dvou faktorů. Členění osy pro míchání bylo provedeno po 50 ot/min dle možností nastavení magnetického míchadla, na kterém nelze jiné kroky volit. Časová osa byla členěna po 5 minutách, což bylo zvoleno jako dostatečné. Osa znázorňující pH byla členěna podrobněji, protože hodnotu pH lze libovolně upravovat. Profily a grafy pro experiment s 3 a 5 úrovni faktorů jsou uvedeny na obrázku 48 a 49.
96
Míchání (rpm) (min)rpm)
pH
Doba
0,447
0
150
200
-3
3
15
40 45
Obrázek 48 Profily a grafy vhodnosti pro optimalizaci se 3 úrovni faktorů
Míchání (rpm)
pH
Doba (min)
rpm)
0
200
-3 -2,5
3
15
45
Obrázek 49 Profily a grafy vhodnosti pro optimalizaci s 5 úrovni faktorů
97
Získaná optima parametrů byla aplikována na vzorky čajů Štíhlá linie a Spánek a nervy. Následně byly stejné vzorky analyzovány za použití podmínek, které byly získány metodou OVAT (rychlost míchání 50 ot/min, bez úpravy pH, 30 minut extrakce). Srovnání získaných dat bylo provedeno pomocí t-testu. Vyhodnocení bylo provedeno z ploch píků sledovaných sloučenin jednotlivých silic a dále také přepočtem složek na jednotnou plochu vnitřního standardu (IS). Výsledky t-testu a krabicové grafy pro vzorky Štíhlá linie a Spánek a nervy (bez přepočtu na IS) jsou uvedeny v tabulce 19 a 20 a na obrázku 50 a 51. Dále jsou pak pro stejné vzorky uvedeny výsledky t-testu a krabicové grafy hodnot přepočítaných na odezvu vnitřního standardu (tabulka 21 a 22, obrázek 52 a 53). Statistickou významnost udává hodnota p, kdy za statisticky významnou je považována hodnota p < 0,05. U každého testovaného vzorku byly provedeny 2 série měření po 10 experimentech. V první sérii bylo provedeno 5 extrakcí s využitím podmínek OVAT a 5 extrakcí s využitím podmínek CCD s 3 úrovni faktorů. V druhé sérii bylo postupováno stejným způsobem, pouze s tím rozdílem, že byly použity podmínky CCD s 5 úrovni faktorů. OVAT 1 a OVAT 2 označují stejné podmínky, pouze byly provedeny v jiné dny v kombinaci s rozdílnými podmínkami CCD. Tab. 19: Výsledky t-testu pro vzorek Štíhlá linie Průměr(1) Průměr(2) Hodnota t p Sm.odch(1) Sm.odch(2) 188,22 259,95 -1,4356 0,1817 34,57 117,42 OVAT 1 vs. CCD-5F 188,22 254,47 -4,3362 0,0015 34,57 14,34 OVAT 1 vs. OVAT 2 254,47 357,06 -1,7607 0,1088 14,34 142,00 OVAT 2 vs. CCD-3F 357,06 259,95 1,2910 0,2258 142,00 117,42 CCD-3F vs. CCD-5F OVAT 1 a 2 - rychlost míchání 50 ot/min, bez úpravy pH vzorku, trvání extrakce 30 minut CCD-3F - CCD s 3 úrovni faktorů, míchání 150 ot/min, změna pH +3, doba extrakce 40 minut CCD-5F - CCD s 5 úrovni faktorů, míchání 200 ot/min, změna pH-2,5, doba extrakce 45 minut
OVAT 1
CCD-5F
OVAT 2
CCD-3F
Obrázek 50 Krabicový graf pro vzorek Štíhlá linie
98
Tab. 20: Výsledky t-testu pro vzorek Spánek a nervy Průměr(1) Průměr(2) Hodnota t p Sm.odch(1) Sm.odch(2) 36,28 44,06 -0,9446 0,3671 6,11 19,24 OVAT 1 vs. CCD-5F 36,28 45,41 -1,7826 0,1050 6,11 10,95 OVAT 1 vs. OVAT 2 45,41 80,30 -3,9438 0,0028 10,95 18,70 OVAT 2 vs. CCD-3F 80,30 44,06 3,3079 0,0079 18,70 19,24 CCD-3F vs. CCD-5F OVAT 1 a 2 - rychlost míchání 50 ot/min, bez úpravy pH vzorku, trvání extrakce 30 minut 3n - CCD s 3 úrovni faktorů, míchání 150 ot/min, změna pH +3, doba extrakce 40 minut 5n - CCD s 5 úrovni faktorů, míchání 200 ot/min, změna pH-2,5, doba extrakce 45 minut
OVAT 1
CCD-5F
OVAT 2
CCD-3F
Obrázek 51 Krabicový graf pro vzorek Spánek a nervy Tab. 21: Výsledky t-testu pro vzorek Štíhlá linie po přepočtu na jednotnou odezvu IS Průměr (1) Průměr (2) Hodnota t p Sm.odch (1) Sm.odch (2) 186,30 201,14 -0,5949 0,5651 46,38 39,77 OVAT 1 vs. CCD-5F 186,30 203,51 -0,8697 0,4049 46,38 14,08 OVAT 1 vs. OVAT 2 203,51 212,19 -1,3362 0,2111 14,08 7,39 OVAT 2 vs. CCD-3F 212,19 201,14 0,6690 0,5186 7,39 39,77 CCD-3F vs. CCD-5F OVAT 1 a 2 - rychlost míchání 50 ot/min, bez úpravy pH vzorku, trvání extrakce 30 minut 3n - CCD s 3 úrovni faktorů, míchání 150 ot/min, změna pH +3, doba extrakce 40 minut 5n - CCD s 5 úrovni faktorů, míchání 200 ot/min, změna pH-2,5, doba extrakce 45 minut
OVAT 1
CCD-5F
OVAT 2
CCD-3F
Obrázek 52 Krabicový graf pro vzorek Štíhlá linie po přepočtu na jednotnou odezvu IS
99
Tab. 22:Výsledky t-testu pro vzorek Spánek a nervy po přepočtu na jednotnou odezvu IS Průměr (1) Průměr (2) Hodnota t p Sm.odch (1) Sm.odch (2) 161,59 124,03 2,4498 0,0343 28,94 23,93 OVAT 1 vs. CCD-5F 161,59 160,52 0,0719 0,9441 28,94 22,25 OVAT 1 vs. OVAT 2 160,52 159,04 0,1455 0,8872 22,25 11,02 OVAT 2 vs. CCD-3F 159,04 124,03 3,2550 0,0086 11,02 23,93 CCD-3F vs. CCD-5F OVAT 1 a 2 - rychlost míchání 50 ot/min, bez úpravy pH vzorku, trvání extrakce 30 minut 3n - CCD s 3 úrovni faktorů, míchání 150 ot/min, změna pH +3, doba extrakce 40 minut 5n - CCD s 5 úrovni faktorů, míchání 200 ot/min, změna pH-2,5, doba extrakce 45 minut
OVAT OVAT11
CCD-5F CCD-5F
OVAT OVAT22
CCD-5F CCD-3F
Obrázek 53 Krabicový graf pro vzorek Spánek a nervy po přepočtu na jednotnou odezvu IS Z výše uvedených výsledků vyplývá, že podmínky optimalizované metodou OVAT jsou pro mikroextrakci jednou kapkou vhodnější. I přesto, že se v t-testu objevuje několik statisticky významných hodnot s hladinou významnosti p < 0,05, jako např. u vzorku Štíhlá linie bez přepočtu na plochu vnitřního standardu, jsou u téhož vzorku při přepočítání dat na jednotnou plochu vnitřního standardu všechny rozdíly statisticky nevýznamné. Další podstatnou nevýhodou výsledků získaných pomocí návrhu CCD s 5 stupni volnosti je rychlost míchání vzorku. Vysoké otáčky způsobovaly mechanické odtržení kapky z hrotu jehly a z tohoto důvodu bylo nutné experimenty několikrát opakovat. U podmínek vyhodnocených z návrhu CCD se 3 stupni volnosti byl problém s hodnotou pH. Vzorky byly upravovány na hodnotu cca 10 a při mikroextrakci docházelo k téměř úplnému rozpuštění kapky. Významnou roli hraje také fakt, že jednotlivé experimenty nemohly být z důvodu časové náročnosti procesu optimalizace uskutečněny z jedné navážky vzorku. Větší vhodnost podmínek metody OVAT je patrná i z krabicových grafů, na kterých lze pozorovat výrazně nižší rozptyl hodnot, což svědčí o lepší opakovatelnosti, než je tomu u podmínek návrhu CCD s 3 a 5 úrovni faktorů.
100
4.1.4. Optimalizace mikroextrakce tuhou fází Volba objemu nápoje byla provedena dle stejné optimalizace jako DI-SDME (kapitola 4.1.3.) Jako vhodné množství bylinného nápoje pro extrakci DI-SPME bylo zvleno 15 ml. Návrh experimentu byl také realizován s využitím metody CCD. Matice opět obsahovala tři faktory, ale byl sestaven pouze model se třemi stupni volnosti. Experimentální matice je uvedena v tabulce 17, kapitola 4.1.3. Do extrakční nádobky bylo odměřeno 15 ml nálevu vzorku čaje a dále bylo postupováno podle návrhu jednotlivých experimentů. Proměnnými byly doba extrakce, pH a rychlost otáček při míchání vzorku. Po skončení adsorpce analytů do povrchu vlákna vždy následovala analýza extraktu na GC/FID. Programem STATISTICA byly vytvořeny vhodnostní profily a plošné vhodnostní grafy, které korespondují s profily a jsou vždy kombinací dvou faktorů. Profily a grafy pro experiment s 3 stupni volnosti jsou uvedeny na obrázku 54. Na základě statistického vyhodnocení jednotlivých parametrů byly jako vhodné vyhodnoceny následující podmínky: rychlost míchání 150 ot/min, pH vzorku bez úpravy a doba extrakce 45 min.
101
Míchání (rpm)
pH
Doba (min)
rpm)
Obrázek 54 Profily a grafy vhodnosti pro optimalizaci s 3 stupni volnosti pro SPME Stejně jako u mikroextrakce jednou kapkou byly vyhodnocené podmínky srovnány za pomoci t-testu s podmínkami získanými postupem OVAT (150 ot/min, bez úpravy pH, 30 minut extrakce). V tabulce 23 jsou uvedeny výsledky t-testu pro vzorky čajů Štíhlá linie a Spánek a nervy. Opět bylo provedeno srovnání ploch jednotlivých silic a ploch získaných po přepočtu na jednotnou plochu vnitřního standardu. Krabicové grafy vzorků jsou uvedeny na obrázku 55 a 56. Tab. 23: Výsledky t-testu pro vzorky Štíhlá linie a Spánek a nervy Průměr(1) OVAT vs. CCD OVAT (IS) vs. CCD (IS)
131,99 229,61
OVAT vs. CCD OVAT (IS) vs. CCD (IS)
19,69 33,02
Průměr (2) Hodnota t Štíhlá linie 159,51 -2,7930 192,27 1,6020 Spánek a nervy 20,07 -0,1279 34,22 -0,2527
102
p
Sm.odch(1)
Sm.odch(2)
0,0190 0,1402
16,23 51,68
17,86 24,31
0,9007 0,8056
5,53 9,10
4,75 7,28
Obrázek 55 Krabicové grafy pro vzorek Štíhlá linie (pravý graf uvádí hodnoty po přepočtu na jednotnou odezvu IS)
Obrázek 56 Krabicové grafy pro vzorek Spánek a nervy (pravý graf uvádí hodnoty po přepočtu na jednotnou odezvu IS) Podmínky OVAT a CCD se liší pouze dobou extrakce vzorku, zatímco rychlost míchání i úprava pH jsou totožné. Z grafu je patrné, že u vzorku Štíhlá linie existuje statisticky významný rozdíl mezi oběma metodami. Při bližším zkoumání však lze zjistit, a je to patrné i z grafu, že pokud se k průměru 1 přičte směrodatná odchylka 1 a od průměru 2 se odečte příslušná směrodatná odchylka, získají se hodnoty téměř srovnatelné, resp. dochází k překryvu hodnot. Z uvedených výsledků je tedy patrné, že prodlužování doby extrakce nepřinese významnější zlepšení účinnosti extrakce. Navíc lze konstatovat, že prodlužování doby extrakce má negativní vliv na počet provedených analýz na den, a tedy i na ekonomické důsledky. Proto byly jako vhodnější zvoleny podmínky OVAT, a to především z důvodu úspory času bez ztrát analytu.
103
4.1.5. Mez detekce a mez stanovitelnosti U metody mikroextrakce jednou kapkou (DI-SDME) byla stanovena mez detekce (LOD) a mez stanovitelnosti (LOQ). Tyto hodnoty byly získány postupným ředěním roztoku o známé koncentraci až do doby, kdy měl pík velikost trojnásobku šumu. Pro tyto analýzy na GC/FID a GC/MS byly použity bylinné čaje Imunostim, Dobrá noc a Sedmero bylin s echinaceou. Bylinných čaj byl pro stanovení daných sloučenin volen vždy tak, aby neobsahoval stanovované složky silic. Do 12 ml bylinného čaje bylo přidáno 50 μl příslušných roztoků silic, které byly následně extrahovány 30 minut a analyzovány v GC/FID. Mez detekce byla vypočtena jako trojnásobek průměrného šumu v okolí píku a mez stanovitelnosti byla vypočtena jako desetinásobek průměrného šumu. Všechny hodnoty jsou uvedeny v tabulce 24. Při GC/MS bylo měřeno v SIM módu při splitovacím poměru 1:10 a za sledování nejintenzivnějšího iontu každého standardu. Do 12 ml bylinného čaje bylo přidáno 50 μl příslušných
roztoků
silic,
které
byly
extrahovány
SPME
vláknem
30
minut
a analyzovány v GC/MS. Bylinný čaj byl vybrán tak, aby složky silic přítomné v nápoji neovlivňovaly složky silic do čaje přidané. Tato podmínka nemohla být splněna u borneolu, thymolu a karvakrolu, protože tyto složky byly nalezeny v SIM módu u všech vzorků čaje, a proto jejich limity detekce a kvantifikace nemohly být naměřeny, ale byly stanoveny na základě standardního přídavku. V tabulce 24 jsou naměřené hodnoty limitů detekce a kvantifikace jednotlivých standardů silic. Tab. 24: Mez stanovitelnosti a mez detekce sledovaných sloučenin pomocí DI-SDME analyzovaných na GC/FID a v SIM módu na GC/MS Složky silic
GC/FID GC/MS m/z LOD [ng/ml] LOQ [ng/ml] LOD [ng/ml] LOQ [ng/ml] 85,110,41 1,17 3,92 0,34* 1,12* borneol 43,111,71 2,35 7,84 1,88 6,27 1,4-cineol 43,93, 81 0,29 0,98 0,16 0,52 eukalyptol 95,41,81 0,58 1,93 0,77 2,58 kafr karvakrol 135,150,91 2,29 7,64 0,02* 0,08* 68,93,39 2,59 8,66 0,01 0,03 limonen 71,81,95 0,29 0,99 0,04 0,13 menthol 112,41,69 2,35 7,84 0,06 0,19 menthon 69,41,93 4,69 15,65 1,88 6,28 nerol 135,150,91 0,57 1,91 0,02* 0,06* thymol * LOQ a LOD borneolu, thymolu a karvakrolu byly stanoveny metodou standardního přídavku, m/z pro jednotlivé sloučeniny jsou řazeny sestupně od největčí intenzity
104
4.1.6. Kalibrační řady Kalibrace standardů silic pomocí mikroextrakce jednou kapkou v módu přímého vzorkování analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem: Kalibrace standardů silic byla provedena v bylinných čajích Imunostim, Dobrá noc a Sedmero bylin s echinaceou pomocí mikroextrakce jednou kapkou v módu přímého vzorkování analyzovaných na GC/FID. Silice byly v těchto bylinných čajích zastoupeny v malých množstvích a nerušily tak signály standardů při stanovení. Bylinné čaje byly připraveny dle kapitoly 3.3.1. Roztoky byly připraveny rozpuštěním příslušné standardu silice v 2-propanolu. Vždy bylo do nálevu přidáváno 50 µl kalibračního roztoku. Po proměření kalibrační řady silic o různých koncentracích byly sestrojeny kalibrační závislosti ploch píků na koncentracích. Rozsah kalibrace byl zvolen na základě očekávaného obsahu silic ve vzorcích. Rovnice křivek a hodnoty spolehlivosti jsou uvedeny v tabulce 25 a grafy kalibračních závislostí jsou uvedeny v příloze Ia. Tab. 25: Rovnice kalibračních křivek a korelační koeficienty silic Standard silice borneol 1,4-cineol eukalyptol kafr karvakrol limonen menthol menthon nerol thymol
Kalibrační rovnice y = 176,22 x + 16,60 y = 289,70 x + 8,89 y = 135,45 x + 165,40 y = 251,54 x + 49,00 y = 300,68 x – 80,68 y = 170,75 x + 10,16 y = 201,20 x + 83,49 y = 285,90 x + 31,54 y = 220,14 x + 16,44 y = 348,74 x – 31,98
Hodnota spolehlivosti R2 = 0,9951 R2 = 0,9987 R2 = 0,9960 R2 = 0,9975 R2 = 0,9972 R2 = 0,9993 R2 = 0,9974 R2 = 0,9996 R2 = 0,9914 R2 = 0,9981
Rozsah (µg/ml) LOQ – 9,7 LOQ – 0,6 LOQ – 38,0 LOQ – 9,7 LOQ – 9,7 LOQ – 9,4 LOQ – 38,0 LOQ – 9,7 LOQ – 0,6 LOQ – 9,4
Kalibrace standardů silic pomocí mikroextrakce jednou kapkou v módu přímého vzorkování s použitím vnitřního standardu, analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem: Kalibrace byla provedena v bylinných čajích Štíhlá linie, Imunostim a Devatero bylin - Dobrou noc. Standardy silic o různých koncentracích byly rozpuštěny v 2-propanolu. Ke 12 ml nálevu čaje bylo přidáno 40 µl roztoku standardu a 40 µl 2-oktanonu (vnitřní standard). Mikroextrakce do jedné kapky byla provedena dle postupu, který je popsán v kapitole 3.3.2.2. Po proměření standardů silic o různých koncentracích byly vytvořeny závislosti
105
poměru výšek standardů k výšce vnitřního standardu na poměru koncentrací standardů ke koncentraci vnitřního standardu. Rovnice kalibračních křivek jednotlivých standardů silic společně s hodnotami spolehlivosti R2 jsou uvedeny v tabulce 26 a grafy kalibračních závislostí jsou uvedeny v příloze Ib. Tab. 26: Kalibrační rovnice standardů silic a hodnoty spolehlivosti R2 Standard silice borneol cinamaldehyd eukalyptol kafr karvakrol limonen linalool menthol menthon α-thujon thymol
Kalibrační rovnice y = 0,757x + 0,14 y = 1,600x + 0,41 y = 0,709x + 0,57 y = 1,314x - 0,20 y = 1,334x + 0,66 y = 2,613x - 0,17 y = 1,423x - 0,05 y = 1,221x + 0,37 y = 0,723x - 0,07 y = 1,262x - 0,17 y = 1,474x + 0,20
Hodnota spolehlivosti R² = 0,9910 R² = 0,9912 R² = 0,9927 R² = 0,9966 R² = 0,9884 R² = 0,9912 R² = 0,9981 R² = 0,9930 R² = 0,9902 R² = 0,9968 R² = 0,9924
Kalibrace standardů silic metodou mikroextrakce tuhou fází s použitím vnitřního standardu, analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem: Kalibrace byla provedena v bylinných čajích Štíhlá linie, Imunostim a Devatero bylin - Dobrou noc. Roztoky standardů silic o různých koncentracích byly rozpuštěny v 2-propanolu. Ke 12 ml nálevu čaje bylo přidáno 50 µl roztoku standardu a 50 µl 2-oktanonu (vnitřní standard). Mikroextrakce tuhou fází byla provedena způsobem, který je popsán v kapitole 3.3.2.1. Po proměření standardů silic o různých koncentracích byly vytvořeny závislosti poměru výšek standardů k výšce vnitřního standardu na poměru koncentrací standardů ke koncentraci vnitřního standardu. Rovnice kalibračních křivek jednotlivých standardů silic společně s hodnotami spolehlivosti R2 jsou uvedeny v tabulce 27 a grafy kalibračních závislostí jsou uvedeny v příloze Ic.
106
Tab. 27: Kalibrační rovnice standardů silic a hodnoty spolehlivosti R2 Standard silice borneol cinamaldehyd eucalyptol kafr karvakrol limonen linalool menthol menthon α-thujon thymol
Kalibrační rovnice y = 0,231x + 0,02 y = 0,477x + 0,11 y = 0,193x + 0,07 y = 0,145x + 0,01 y = 0,618x + 0,09 y = 1,503x + 0,09 y = 0,389x + 0,03 y = 0,799x - 0,01 y = 1,052x - 0,01 y = 0,808x + 0,08 y = 0,745x + 0,08
Hodnota spolehlivosti R² = 0,9997 R² = 0,9945 R² = 0,9992 R² = 0,9990 R² = 0,9937 R² = 0,9936 R² = 0,9998 R² = 0,9984 R² = 0,9990 R² = 0,9958 R² = 0,9990
Kalibrace standardů silic metodou mikroextrakce tuhou fází analyzovaných plynovou chromatografií s hmotnostním spektrometrem: Kalibrace standardů byla prováděna v nálevu z bylinných čajů připravených za stejných podmínek i za stejných extrakčních podmínek, jako je popsáno v kapitole 3.3.1. Standardní roztoky silic byly analyzovány ve Scan módu při splitovacím poměru 1:50. Pro 1,4-cineol, limonen, menthon, menthol, nerol a karvakrol byl vybrán čaj Imunostim a pro eukalyptol, kafr, borneol a thymol byl vybrán čaj Štíhlá linie. Tyto čaje byly vybrány z toho důvodu, aby přítomné silice nerušily signály přidaného množství standardního roztoku. Kalibrační roztoky byly připraveny rozpuštěním příslušných silic v 2-propanolu. Do 12 ml bylinného nálevu bylo přidáváno 50 μl standardního roztoku analyzovaných silic a po promíchání byla provedena extrakce. Kalibrační křivky byly sestrojeny na základě závislosti plochy píků na koncentraci (v μg na 1 ml bylinného nálevu). Rovnice kalibračních křivek jednotlivých standardů silic společně s hodnotami spolehlivosti R2 jsou uvedeny v tabulce 28 a grafy kalibračních závislostí jsou uvedeny v příloze Id.
107
Tab. 28: Kalibrační rovnice standardů silic a hodnoty spolehlivosti R2 Standard silice borneol 1,4-cineol eukalyptol kafr karvakrol limonen menthol menthon nerol thymol
Kalibrační rovnice y = 364085 x + 160167 y = 1823555 x + 23823 y = 235762 x + 92302 y = 386808 x + 55700 y = 4726034 x + 165724 y = 2662236 x + 164684 y = 1864785 x + 92302 y = 1236572 x + 199997 y = 1926528 x + 23829 y = 2142526 x + 293772
Hodnota spolehlivosti R2 = 0,9423 R2 = 0,9977 R2 = 0,9986 R2 = 0,9975 R2 = 0,9984 R2 = 0,9974 R2 = 0,9986 R2 = 0,9935 R2 = 0,9994 R2 = 0,9941
4.1.7. Opakovatelnost metody Pro mikroextrakci jednou kapkou na GC/FID byla provedena opakovatelnost metody na třech různých koncentračních úrovních, a to nízké koncentraci 2,4414.10-6 mol/l, střední koncentraci 3,9063.10-5 mol/l a vysoké koncentraci 3,125.10-4 mol/l u 10 standardů silic. Nejprve byla proměřena každá koncentrace v jeden den třikrát (intra-day) a poté byly dané koncentrace proměřeny opět třikrát ve třech po sobě jdoucích dnech (inter-day). Ze získaých hodnot byla vyhodnocena směrodatná odchylka. Všechny hodnoty RSD u intraday byly v rozmezí od 0,40 do 12,71 % a u inter-day od 1,55 do 14,96 %. Hodnoty jsou uvedeny v příloze IIa. Opakovatelnost byla zjišťována i pro mikroextrakci vláknem s analýzou na GC/MS. Pro deset standardů ve vzorku bylinného čaje opět při zvolených třech různých koncentracích (3,125.10-4, 3,906.10-5 a 2,441.10-6 mol/l) v rámci intra-day a inter-day. U nerolu, vzhledem k detekčnímu limitu, byla jako nízká koncentrace použita 9,7656.10-6 mol/l. Bylo analyzováno v SIM módu (single ion monitoring) při splitovacím poměru 1:10. V SIM módu byl sledován nejintenzivnější iont každého standardu.. Z naměřených ploch píků byla vypočtena směrodatná odchylka a relativní směrodatná odchylka (RSD) v %. Z výsledků je patrné, že RSD se pohybují do 15,5 % a tudíž metoda SPME je vhodná pro stanovení silic v bylinných čajích. Tabulka se směrodatnou odchylkou a relativní směrodatnou odchylkou jednotlivých standardů je uvedena v příloze IIb. V téže příloze je i grafické znázornění opakovatelnosti metody SPME.
108
4.1.8. Analýza složek silic v bylinných nápojích 4.1.8.1. Kvantitativní analýza složek silic plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Složky silic byly analyzovány ve vzorcích deseti bylinných čajů. Jednotlivé složky byly identifikovány pomocí retenčních časů a dle metody standardního přídavku. Kvantitativní analýza byla provedena pomocí extrakce DI – SPME a DI – SDME metodou kalibrační křivky za použití 2-oktanonu jako vnitřního standardu. Z důvodu přímého srovnání obsahu složek silic v jednotlivých čajích extrahovanými metodami SPME a SDME byly oba typy extrakcí provedeny ve vzorku čaje o objemu 12 ml. Všechny vzorky byly měřeny třikrát. Obsahy složek silic získaných oběma metodami v jednotlivých bylinných čajích jsou uvedeny v tabulkách 29 - 38. Zjištěné množství silic je přepočítáno na μg v 1 ml nálevu čaje. Chromatogramy silic v bylinných čajích extrahovaných na tuhou fázi jsou uvedeny v příloze III. Tab. 29: Obsah silic v čaji Sedmero bylin s echinaceou, n = 3 Složky silice eukalyptol linalool kafr menthol thymol karvakol
DI – SPME Množství (µg/ml) 0,06 0,51 0,33 0,06 0,75 0,06
RSD (%) 4,00 4,92 3,03 6,77 4,42 4,00
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,03 0,14 0,18 0,02 0,32 0,03
RSD (%) 1,89 2,23 2,86 7,48 1,59 1,89
DI - SDME Množství (µg/ml) 1,36 0,19 0,02 6,03
RSD (%) 8,82 1,55 6,67 0,41
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,23 0,05 0,53 0,05 < LOQ
RSD (%) 4,35 1,96 3,39 3,70 -
Tab. 30: Obsah silic v čaji Sedmero bylin, n = 3 Složky silice linalool kafr menthol cinamaldehyd
DI – SPME Množství (µg/ml) 3,74 0,35 0,06 6,99
RSD (%) 5,35 1,77 3,52 4,25
Tab. 31: Obsah silic v čaji Spánek a nervy, n = 3 Složky silice eukalyptol linalool kafr menthol karvakrol
DI – SPME Množství (µg/ml) 1,29 0,27 1,36 0,07 0,30
RSD (%) 3,26 4,08 6,27 6,28 5,44
109
Tab. 32: Obsah silic v čaji Štíhlá linie, n = 3 Složky silice eucalyptol linalool menthon borneol menthol thymol
DI – SPME Množství (µg/ml) 0,46 0,31 0,25 0,10 0,40 0,35
RSD (%) 6,67 5,22 3,72 5,14 4,51 6,14
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,05 0,02 0,22 0,03 0,22 0,08
RSD (%) 4,56 2,44 9,48 4,42 1,93 5,66
RSD (%) 2,43 4,08 7,97 4,16 3,04 7,01
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,12 0,05 0,43 0,03 0,09 0,09
RSD (%) 9,43 9,12 4,14 7,38 8,77 3,49
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,09 0,11 0,56 0,04 0,17
RSD (%) 4,34 1,74 4,71 4,77 3,69
Tab. 33: Obsah silic v čaji Zažívání, n = 3 Složky silice eukalyptol kinalool menthon borneol menthol thymol
DI – SPME Množství (µg/ml) 0,34 0,19 0,73 0,12 0,36 0,80
Tab. 34: Obsah silic v čaji Imunostim, n = 3 Složky silice eukalyptol α-thujon kafr menthol thymol
DI – SPME Množství (µg/ml) 0,26 0,34 1,37 0,06 0,24
RSD (%) 5,44 2,40 1,24 3,17 7,18
Tab. 35: Obsah silic v čaji Devatero bylin – dobrou noc, n = 3 Složky silice eukalyptol linalool kafr menthol karvakrol
DI – SPME Množství (µg/ml) 3,53 2,77 5,52 0,20 0,44
RSD (%) 5,55 6,15 4,61 7,60 6,55
DI - SDME Množství (µg/ml) 1,59 0,77 1,64 0,14 0,10
RSD (%) 3,79 6,06 4,25 5,24 0,52
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,24 5,04 0,14 0,20 0,03 0,34
RSD (%) 2,75 3,17 4,41 3,81 3,45 7,11
Tab. 36: Obsah silic v čaji Herbal Alps, n = 3 Složky silice limonen eukalyptol linalool menthon borneol menthol
DI – SPME Množství (µg/ml) 0,34 9,30 0,33 0,71 0,09 0,37
RSD (%) 7,41 7,59 6,55 3,11 6,99 4,55
110
Tab. 37: Obsah silic v čaji Fresh Mint, n = 3 DI – SPME Množství (µg/ml) 1,62 0,22 2,46 1,04 5,89
Složky silice eukalyptol linalool menthon borneol menthol
RSD (%) 3,58 7,71 3,16 6,13 6,19
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,38 0,04 1,64 0,33 4,50
RSD (%) 6,24 0,02 3,66 3,66 4,56
DI - SDME Množství (µg/ml) 0,07 0,07 0,34 0,11 0,56
RSD (%) 6,43 5,19 5,05 4,76 5,93
Tab. 38: Obsah silic v čaji Urologická čajová směs, n = 3 DI – SPME Množství (µg/ml) 0,22 0,09 1,16 0,43 2,09
Složky silice eukalyptol linalool menthon borneol menthol
RSD (%) 2,18 2,67 3,60 4,82 7,05
Porovnání obouch metodou (mikroextrakce jednou kapkou a mikroextrakce tuhou fází je znázorněno pomocí youdenových grafů (obrázek 57). Z grafu je patrné, že metoda DI-SPME poskytuje vyšší výsledky, které jsou na zálkadě lineární regrese cca 1,45 krát vyšší než v případě metody DI-SDME. 10 y = 1,4505x + 0,3481 R² = 0,8668
DI-SPME
8
6
4
2
0 0
2
4
6
8
10
DI-SDME
Obrázek 57 Youdenův graf pro porovnání DI-SDME a DI-SPME (červená čára předsatvuje poměr výsledků DI-SDME a DI-SPME 1:1).
111
4.1.8.2. Kvantitativní analýza složek silic plynovou chromatografií s hmotnostním spektrometrem Bylo analyzováno 10 vzorků bylinných čajů, jednotlivé vzorky byly proměřeny opět třikrát (n = 3). K analýze bylo použito 12 ml bylinného nálevu. Při kvantitativní analýze bez vnitřních standardů byly zaznamenány velké směrodatné odchylky a velké rozdíly ve vypočtených koncentracích u třech použitých metod kvantifikace (externí kalibrace, kalibrace v matrici a standardní přídavek). Při použití vnitřních standardů se rozdíly v koncentracích mezi metodami snížily, ale použití vnitřního standardu nedokáže natolik eliminovat vliv matrice, aby mohla být sestrojena kalibrace přípravou kalibračních roztoků ve vodě. Nejméně se od sebe odlišovaly hodnoty získané metodou kalibrace v matrici a metodou standardního přídavku, v kombinaci s metodou vnitřního standardu. Pokud se hodnoty odlišovaly, jednalo se o důsledek toho, že kalibrace získaná proměřením v matrici jednoho čaje (např. Zažívání) nemusí být ideální pro všechny vzorky. Výsledky kvantitativní analýzy metodou externí kalibrace, standardního přídavku a kalibrace v matrici (bez použití vnitřního standardu a s použitím 1,4-cineolu jako vnitřního standardu) jsou uvedeny v tabulce 39 - 47. Tab. 39: Obsah silic v čaji Sedmero bylin s echinaceou, n = 3 Bez vnitřního standardu Vnitřní standard: 1,4 cineol Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%) c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1)
112
RSD (%) 5,70 7,97 12,72 8,38 15,25 11,41
Tab. 40: Obsah silic v čaji Sedmero bylin, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Vnitřní standard: 1,4 cineol a b c Metoda 1 Metoda 2 Metoda 3 RSD Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%) c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol
11,46 2,41 0,78 28,65 2,35 6,96 5,90 14,90
Tab. 41: Obsah silic v čaji Spánek a nervy, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Vnitřní standard: 1,4 cineol Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%) c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol 0,126 0,297 0,192 22,60 0,314 0,260 0,233 cinnamaldehyd 0,018 0,004 0,004 23,87 0,005 0,004 0,004 eukalyptol 0,080 0,185 0,187 21,74 0,248 0,216 0,220 kafr 0,182 0,583 0,512 23,66 0,626 0,566 0,655 karvakrol 0,026 0,016 0,015 23,54 0,015 0,014 0,017 linalool 0,127 0,326 0,227 23,55 0,323 0,315 0,275 menthol 0,038 0,035 0,034 24,21 n.d. 0,037 0,040 menthon 0,047 0,053 0,046 24,84 0,024 0,064 0,054 α-thujon 0,013 0,008 0,006 30,10 0,007 0,008 0,007 thymol 0,028 0,021 0,030 26,82 0,033 0,025 0,030 a b c Metoda externí kalibrace, Kalibrace v matrici, Standardní přídavek,
13,19 6,73 7,31 9,94 4,05 9,32 10,14 9,09 15,77 10,85
Tab. 42: Obsah silic v čaji Štíhlá linie, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Vnitřní standard: 1,4 cineol Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%) c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol
113
5,64 36,57 3,96 9,06 6,64 25,77
Tab. 43: Obsah silic v čaji Zažívání, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Vnitřní standard: 1,4 cineol a b c Metoda 1 Metoda 2 Metoda 3 RSD Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%) c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol 0,073 0,118 0,083 13,42 0,116 0,117 0,098 cinnamaldehyd 0,017 0,002 0,002 3,75 0,003 0,003 0,003 eukalyptol 0,041 0,085 0,087 2,29 0,130 0,112 0,103 kafr 0,009 0,015 0,012 12,65 0,020 0,016 0,014 karvakrol 0,175 0,479 0,360 9,54 0,595 0,502 0,506 lnalool 0,071 0,134 0,102 4,30 0,139 0,147 0,122 menthol 0,168 0,361 0,284 7,15 0,501 0,442 0,446 menthon 0,192 0,491 0,428 2,59 0,697 0,681 0,614 α-thujon
12,70 4,29 10,09 5,64 8,40 7,30 9,85 9,85 8,14
Tab. 44: Obsah silic v čaji Imunostim, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1)
RSD (%)
Vnitřní standard: 1,4 cineol Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol
5,42 3,62 9,36 8,85 7,95 4,87 20,92
Tab. 45: Obsah silic v čaji Devatero bylin – dobrou noc, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1)
RSD (%)
Vnitřní standard: 1,4 cineol Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol 0,254 0,727 0,580 7,98 1,073 0,811 0,841 cinnamaldehyd 0,018 0,004 0,004 33,96 0,011 0,009 0,009 eukalyptol 0,415 1,055 1,207 19,05 1,774 1,548 1,616 kafr 0,979 3,202 2,223 15,90 4,190 3,797 3,835 karvakrol 0,420 1,239 1,031 21,15 1,734 1,462 1,713 linalool 1,157 3,907 2,483 13,95 5,244 4,801 5,191 menthol 0,031 0,017 0,019 24,23 0,027 0,022 0,023 menthon 0,036 0,019 0,019 20,12 0,020 0,029 0,026 α-thujon 0,012 0,006 0,005 30,11 0,006 0,008 0,006 thymol 0,044 0,053 0,068 21,92 0,113 0,083 0,085 a Metoda externí kalibrace, b Kalibrace v matrici, c Standardní přídavek,
114
8,58 61,65 9,00 11,95 21,47 8,36 11,12 15,37 15,95 20,21
Tab. 46: Obsah silic v čaji Herbal Alps, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1)
RSD (%)
Vnitřní standard: 1,4 cineol Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol 0,088 0,169 0,130 13,51 0,287 0,240 0,202 5,00 innamaldehyd 0,018 0,004 0,005 13,82 0,011 0,007 0,007 7,48 eukalyptol 1,003 2,578 2,627 13,25 5,356 4,676 5,654 3,34 kafr 0,007 0,008 0,007 16,20 0,017 0,013 0,011 15,35 karvakrol 0,024 0,011 0,012 5,72 0,017 0,016 0,017 7,76 limonen 0,241 1,548 0,954 11,94 1,179 2,130 2,493 2,95 linalool 0,120 0,301 0,242 12,38 0,494 0,471 0,399 3,93 menthol 0,188 0,412 0,507 6,24 0,846 0,717 0,788 1,13 menthon 0,122 0,279 0,296 5,39 0,555 0,551 0,500 1,11 α-thujon 0,011 0,002 0,002 13,95 0,002 0,003 0,002 8,90 thymol 0,033 0,031 0,042 18,65 0,084 0,062 0,062 5,33 a Metoda externí kalibrace, b Kalibrace v matrici, c Standardní přídavek,
Tab. 47: Obsah silic v čaji Fresh Mint, n = 3 Složky silice
Bez vnitřního standardu Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1)
RSD (%)
Vnitřní standard: 1,4 cineol Metoda 1 a Metoda 2 b Metoda 3 c RSD c (mg.l-1) c (mg.l-1) c (mg.l-1) (%)
borneol 0,057 0,064 0,065 22,92 0,062 0,077 0,071 cinnamaldehyd 0,018 0,005 0,007 45,75 0,010 0,008 0,007 eukalyptol 0,152 0,372 0,568 26,00 0,664 0,579 0,624 kafr 0,006 0,007 0,008 23,32 0,012 0,009 0,008 karvakrol 0,023 0,008 0,008 22,87 0,010 0,010 0,009 limonen
115
21,31 11,57 1,56 13,39 5,25 4,58 8,89 8,65 11,43 21,31
4.2. Analýza sypkého rostlinného materiálu 4.2.1. Analýza sypkých bylinných směsí Bylo provedeno vzorkování metodou HS-SPME s využitím kombinace více sorpčních teplot, případně i se zvýšením iontové síly prostřednictvím přídavku NaCl, pro analýzu sypkých bylinných směsí. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek HS-SPME pro analýzu nápoje připraveného z bylinných směsí. Poté byly porovnány aromaprofily jednotlivých bylinných směsí. 4.2.1.1. Optimalizace headspace mikroextarkce tuhou fází s kombinací teplot Nejprve byla provedena volba jednotlivých teplot pro kombinaci sorpčních teplot. Píky více těkavých sloučenin vykazují na chromatogramech větší plochu při nižších teplotách a pro látky méně těkavé je efektivnější vyšší teplota vzorkování. Vyšší teploty vedou k nárůstu difuzních koeficientů a také umožnují rychlejší extrakci (u HS-SPME způsobují zvýšení koncentrace analytu v prostoru nad vzorkem, ale zároveň může docházet k desorpci více těkavých analytů). Pro volbu teploty byla použita čajová směs o hmotnosti 0,5 g. Jednalo se o čaje Babička Růženka s echinaceou, Spánek a nervy a Devatero bylin - Dobrou noc. Směs byla vložena do 10 ml nádobky a temperována na teplotu 30, 40, 50, 70 a 80 °C po dobu 30 minut. Během této doby došlo k ustanovení rovnováhy mezi vzorkem a headspace prostorem. Po temperaci byla provedena SPME vždy 25 minut při teplotě temperace [119]. Každá extrakce byla provedena třikrát. Všechny chromatogramy byly hodnoceny z hlediska celkového počtu píků a jejich celkové plochy. Jako vhodná kombinace sorpčních teplot bylo vybráno 80 °C a 40 °C. U teplot 70 °C a 80 °C byly výsledky velmi podobné. Při volbě mezi těmito teplotami rozhodovalo porovnání celkových ploch píků (obrázek 58).
116
90
79±4
80
25,0
79±5
21,5±0,8 20,0
60
Plocha píků x107
Počet píků
70 50 34±0,6
40 30
24±4 20±2
20
22,6±2
17,4±1,5
15,0 10,0 6,0±2 4,3±0,4
5,0
10 0
0,0 30°C
40°C
50°C
70°C
80°C
30°C
teplota
A
40°C
50°C
B
70°C
80°C
teplota
Obrázek 58 Vliv teplot na účinnost extrakce A) Celkový počet píků B) celková plocha píků pro volbu teplot Dále byla provedena volba časového poměru u kombinace více sorpčních teplot. Délka extrakce byla volena tak, aby docházelo k co možná nejúčinnější extrakci. Při vhodné kombinaci teplot a jejich doby působení může docházet k účinnější extrakci než při působení jedné z nich samostatně. Proto se musí správně zvolit časový poměr jednotlivých teplot, aby došlo k sorpci co nejvíce sloučenin o různé těkavosti na vlákno. Optimalizace poměru doby byla provedena u stejné bylinné směsi, pro kterou byla provedena extrakce při dvou teplotách (80 a 40 °C). Časové poměry byly měřeny v pětiminutových intervalech (5, 10, 15 a 20 minut) po celkovou dobu extrakce 25 minut. Vždy se začínalo extrahovat při vyšší teplotě, a to z důvodu případné zpětné desorpce více těkavých látek z vlákna. Z celkového počtu píků a z celkových ploch píků bylo vyhodnoceno několik časových poměrů. Optimální časový poměr při porovnání celkového počtu píků je 15:10 (obrázek 59a), zatímco při porovnání celkových ploch vyšel lépe poměr 10:15 (obrázek 59b). Proto byl zvolen kompromis a jako vhodný časový poměr byl stanoven 12,5 minut pro 80 °C a 12,5 minut pro 40 °C.
117
120
6,0 93±5
100
96±1
Plocha píků x108
Počet píků
4,6±0,1
5,0 80±2
80
5,5±0,2
62±4 60 40 20
3,7±0,2
4,0 3,0
2,7±0,3
2,0 1,0
0
0,0 5:20
A
10:15
15:10
20:05
5:20
Časový poměr [min:min]
B
10:15
15:10
20:05
Časový poměr [min:min]
Obrázek 59 Vliv časového poměru na účinnost extrakce A) Celkový počet píků, B) Celkové plochy Z chromatogramu čaje Babička Růženka s echinaceou při 40 °C a 80 °C (obrázek 60) je patrné, že při nižší teplotě SPME se přednostně eluují více těkavé látky. Zatímco při vyšší
Intenzita
teplotě dochází k eluci méně těkavých látek.
Čas Obrázek 60 Chromatogram vzorku čaje Babička Růženka s echinaceou. Modrá při 40 °C, červená při 80 °C
118
Kombinace více sorpčních teplot umožňuje identifikaci těkavějších látek zároveň s těmi, které se eluují později. Na obrázku 61 a 62 jsou viditelné rozdíly nejen v kvalitativním, ale i v kvantitativním zastoupení složek silic při kombinací obou teplot v porovnání se sorpcí pouze jednou z nich. Při optimální době působení každé z teplot je možné zaznamenat více látek, aniž by se některé z nich během vyšší teploty desorbovaly zpět
Intenzita
do vzorku.
Čas Obrázek 61 Porovnání chromatogramů vzorku čaje Babička Růženka s echinaceou. modrá
Intenzita
při kombinaci 80/40 °C, červená při 40 °C
Čas Obrázek 62 Porovnání chromatogramů vzorku čaje Babička Růženka s echinaceou. modrá při kombinaci 80/40 °C, červená při 80 °C
119
4.2.1.2. Optimalizace headspace mikroextrakce tuhou fází s úpravou iontové síly Iontová síla roztoku je zvyšována přidáním NaCl do vzorku. Tudíž je snižována rozpustnost některých analytů ve vzorku. Přídavkem soli do vzorku může být zvýšena účinnost extrakce. Z optimaliza vyšly jako nejvhodnější dvě koncentrace NaCl ve vzorku: 34 g/100 ml a bez přídavku NaCl. Obě tyto varianty mají pobný vliv na extrakci. Z důvodu snížení spotřeby činidel, zkrácení doby přípravy vzorku a také s ohledem na životnost vlákna byla zvolena varianta bez přídavku NaCl (obrázek 63).
Obrázek 63 Vyhodnocení odezvové plochy v závislosti na čase teplotě a množství NaCl Protože se při daném postupu přídavek NaCl neprovádí, nejedná se tedy o úpravu iontové síly, bude v dalším textu tato metoda nazývána – mokrý způsob. Dále byl určen časový poměr pro headspace mikroextrakci tuhou fází s úpravou iontové síly. Časové poměry byly měřeny v pětiminutových intervalech po celkovou dobu extrakce 40 minut. Vždy se začínalo extrahovat při vyšší teplotě z důvodu možné zpětné desorpce více těkavých látek. Časové poměry pro teplotu 80 °C byly 10, 15, 20, 25 a 30 minut. A pro teplotu 40 °C byly 30, 25, 20, 15 a 10 minut. Výsledky optimalizace byly vyhodnoceny z celkového počtu píků a jsou znázorněny na obrázku 64 A a B, kde je patrné, že optimální časový poměr je 20:20. Tento poměr byl vybrán s přihlédnutím ke směrodatné odchylce. Bylo voleno mezi dvěma poměry a to mezi 10:30 a 20:20. Časový poměr 20:20 vykazoval menší směrodatnou odchylku, proto byl vybrán jako optimální. Pro extrakci byly zvoleny podmínky: celkový čas 40 °C (80 °C po dobu 20 minut a 40 °C po dobu 20 minut) a koncentrace 0 g/100 ml (bez přídavku NaCl).
120
45 40
2,4 39±6 33±7
35
32±5
2,0
32±4
30
Plocha píků x108
Počet píků
39±6
25 20 15 10
1,9±0,2
1,9±0,4
1,5±0,4 1,5±0,2
1,6
1,4±0,2
1,2 0,8 0,4
5 0
0,0 10:30
15:25
20:20
25:15
30:10
10:30
15:25
20:20
25:15
30:10
Obr. 64: Celkový počet píků pro optimalizaci časového poměru s úpravou iontové síly a celková plocha píků pro optimalizaci časového poměru s úpravou iontové síly, n = 3 4.2.1.3. Analýza vzorků pomocí mikroextrakce tuhou fází při jedné teplotě Všechny čaje byly koupeny v běžně dostupných obchodech a lékárnách. V následujících odstavcích jsou uvedeny tabulky s identifikovanými a detekovanými sloučeninami daných vzorků bylinných čajů při teplotě 70 °C [119]. V tabulkách jsou dále uvedeny vypočtené retenční indexy, a to podle Kovatse (RIa), podle van den Doola (RIb), a také CAS číslo příslušné sloučeniny.
Bylinný čaj Štíhlá linie Identifikované a detekované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Leros natur Štíhlá line
č. šarže 02112011 02112014 PNY 09-02-04 a 09121012-09122015 PNY 09-02-04 jsou uvedeny v tabulce 48. Dále je zde uveden CAS čísla, retenční index, relativní plocha příslušných sloučenin. V příloze IV.1a je zobrazen aromaprofil vzorku Leros natur Štíhlá line č. šarže 02112011 02112014 PNY 09-02-04. Bylo detekováno 31 píků a identifikováno 25 sloučenin (z toho 3 monoterpeny, 8 oxidovaných monoterpenů, 4 alifatické sloučeniny, 2 fenolické látky, 1 aromatická sloučenina a 6 sekviterpenů), nejintenzivnější byl menthon, isomenthon a estragol. Výrobce na obalu uvádí, že největší zastoupení v obsahu čaje má PhuEr (černý čaj). L. Fang a kolektiv [120] se zabývali analýzou čínského PhuEr čaje. Zjistilii, že největší zastoupení mají methoxy-fenolické sloučeniny. Mezi methoxy-fenolické látky nepatří ani jedna ze zmíněných majoritních látek u tohoto vzorku.
121
V příloze IV.1b je zobrazen aromaprofil vzorku Leros Natur Štíhlá line č. šarže 09121012-09122015 PNY 09-02-04. Bylo detekováno 25 píků, z toho identifikováno 22 sloučenin (z toho 3 monoterpeny, 7 oxidovaných monoterpenů, 4 alifatické sloučeniny, 2 fenolické látky a 5 sekviterpenů), nejintenzivnější byl menthon, isomenthon a estragol. Tyto dvě šarže jsou kvalitativním zastoupením srovnatelné, liší se kvantitativním zastoupením detekovaných sloučenin. Tab. 48: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Štíhlá linie Šarže: 0211201102112014 RIa RIb A [%] m.h m.h. 0,95 m.h m.h. 0,36 m.h m.h. 0,15 839 855 0,33 912 910 0,26
Složky silic CAS β-jonon epoxid 23267-57-4 1 aceton 67-64-1 2 kyselina octová 64-19-7 3 hexanal 66-25-1 4 2-hexenal 6728-26-3 5 α-pinen 7785-26-4 6 benzaldehyd 100-52-7 1023 7 β-myrcen 123-25-3 1040 8 limonen 138-86-3 9 eukalyptol 470-82-6 1091 10 (Z)-sabinen hydrát 15537-55-0 11 β-terpinen 99-84-3 1127 12 L-fenchon 7787-20-4 13 n.i. 1155 14 menthon 89-80-5 1210 15 menthol 2216-51-5 1231 16 karvon 99-49-0 1294 17 piperiton 89-81-6 1306 18 n.i. 1329 19 estragol 140-67-0 1335 20 thymol 89-83-8 1343 21 β-bourbonen 5208-59-3 1439 22 dodekanal 112-54-9 23 (E)-karyofylen 00287-23-0 1475 24 n.i. 1485 25 D germakren 23986-74-5 1534 26 δ-kadinen 483-76-1 1563 27 dihydroaktinidiolid 17092-92-1 1584 28 n.i. 1640 29 viridiflorol 552-02-3 1650 30 bisabolol oxid B 26184-88-3 1697 31 n.i. 1719 32 n.i. 1761 33 oktadeken 822112 1813 34 2-undekanon 112-12-9 1857 35 dibutyl ftalát 1881 36 n.i.-nebylo identifikováno; m.h.-mimo homologickou řadu
122
1021 1037
0,66 0,29
1089
2,46
1125
1,28
1152 1209 1230 1294 1305 1328 1334 1341 1438
0,44 10,71 15,68 1,31 3,86 0,85 39,45 0,54 1,47
1474 1485 1533 1562 1584 1639 1649 1697 1719 1760 1813 1857 1880
2,63 5,57 3,94 0,97 1,32 1,70 1,40 0,77 1,91 0,59 0,49 1,05 0,31
Šarže: 0912101209122015 RIa RIb A [%] m.h m.h 0,33
835 908 991
853 907 990
0,41 0,19 0,28
1042 1084 1088 1123
1039 1082 1086 1122
0,26 0,65 3,09 0,32
1145
1142
1,12
1206 1227
1206 1226
28,46 19,20
1302
1301
1,82
1331 1349 1434 1440 1471 1481 1529 1558 1579 1635 1644
1330 1348 1432 1439 1470 1480 1528 1557 1578 1634 1643
30,82 0,34 1,27 0,51 3,52 1,79 3,31 0,47 0,37 0,50 0,62
1713
1713
0,42
1851
1851
0,59
Bylinný čaj Babička Růženka sedmero bylin s echinaceou Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Babička Růženka
s echinaceou č. šarže 112013 L03111130B a 01 2015 L09011330A jsou uvedeny v tabulce 49, kde je uvedeno CAS číslo, retenční index a relativní plocha příslušných sloučenin. V příloze IV. 2a je zobrazen aromaprofil vzorku Babička Růženka s echinaceou č. šarže 112013 L03111130B. Bylo zde detekováno 50 píků, z toho identifikováno 40 sloučenin (z toho 8 monoterpenů, 8 oxidovaných monoterpenů, 2 alifatické sloučeniny, 3 fenolické látky, 1 aromatická sloučenina, 6 sekviterpenů a zbytek nebyl určen), mezi klíčové sloučeniny patří thymol a estragol. Na obalu výrobce uvádí v prvním pořadí mateřídoušku, což znamená, že by měla být obsažena v největším množství. C. Bicchi a kolektiv [121] stanovili metodou HS-SPME a identifikovali pomocí GC/MS v mateřídoušce limonen, eukalyptol, α-terpinolen, kafr, thymol methyl ether, bornyl acetát, thymol, karvakrol a β-karyofylen. U tohoto vzorku byly stanoveny všechny zmíněné sloučeniny, kromě bornyl acetátu a karvakrolu. Aromaprofil vzorku Babička Růženka s echinaceou č. šarže 012015 L09011330A je uveden v příloze IV. 2b. Bylo detekováno 50 píků, z toho 36 identifikováno (z toho 9 monoterpenů, 8 oxidovaných monoterpenů, 1 alifatická sloučenina, 2 fenolické látky, 1 aromatická sloučenina, 6 sekviterpenů a zbytek nebyl určen). Jako hlavní sloučenina byla estragol. Obě tyto šarže jsou kvalitativním zastoupením srovnatelné, objevují se pouze rozdíly v intenzitě
některých
píků,
např.
u
sloučeniny
sabinen,
aldehyd
či
thymol.
U vzorku Babička Růženka sedmero bylin s echinaceou šarže 01 2015 L09011330A byly sabinen a thymol identifikovány s menší relativní plochou, naproti tomu plocha anisalaldehydu byla u této šarže dvojnásobná.
123
Tab. 49: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Babička Růženka sedmero bylin s echinaceou
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
Složky silic β-jonon epoxid n.i. aceton kyselina octová hexanal ethyl-2-methylbutyrát felandrena α-pinen kamfen sabinen 3-oktanon β-myrcen α-terpinen p-cymen β-ocimen eukalyptol n.i. γ-terpinen linalyl acetát L-fenchon n.i. (Z)-sabinen hydrát kafr menthon 4-terpineol α-terpineol n.i. thymol methylether geraniol karvon 2-methyl-5-(1-methyl)2,5-cyklohexadien-1,4dion anisaldehyd thymol estragol terpinyl acetát n.i. n.i. β-bourbonen n.i. (E)-karyofylen n.i. kurkumen D germakren β-bisabolen δ-kadinen n.i. dihydroaktinidiolid
CAS 23267-57-4 67-64-1 64-19-7 66-25-1 7452-79-1 814893 7785-26-4 820254 10408-16-9 106-68-3 123-25-3 86473 99-87-6 13877-91-3 470-82-6
Šarže: 012015 L09011330A RIa RIb A [%] m.h m.h. 0,95
839 904 986 994 1011 1033
855 903 983 992 1010 1030
0,13 0,09 0,24 0,17 0,12 0,40
1045 1075 1081 1087 1090
1042 1072 1079 1085 1089
0,34 0,25 6,54 0,40 0,36
1076-56-8 106-24-1 99-49-0
1112 1126 1148 1150 1158 1205 1230 1235 1249 1275 1284 1292 1294
1111 1125 1146 1148 1156 1205 1228 1234 1247 1274 1283 1291 1294
1,46 0,21 0,90 3,73 0,21 0,26 0,58 0,16 2,06 0,96 0,83 0,72 1,00
605-94-7
1296
1296
1,34
123-11-5 89-83-8 140-67-0 80-26-2
1305 1389 1396 1410
1305 1389 1395 1410
3,75 0,47 0,30 0,32
223190 115-95-7 7787-20-4 15537-55-0 76-22-2 89-80-5 562-74-3 98-55-5
5208-59-3
644-30-4 23986-74-5 495-61-4 483-76-1
1438 1444 1475 1485 1520 1533 1547 1563
1437 1443 1474 1484 1519 1532 1545 1562
0,58 0,32 1,91 1,89 0,37 2,34 3,45 0,92
17092-92-1
1584
1583
0,44
00287-23-0
124
Šarže: 112013 L03111130B RIa RIb A [%] m.h. m.h. m.h 838
m.h. m.h m.h. 854
0,43 0,09 0,17 0,16
985 993 1010 1032 1040 1044 1074 1081 1086 1089 1095 1111 1125 1149 1157
982 991 1009 1030 1037 1041 1072 1079 1084 1088 1095 1110 1124 1147 1155
0,28 0,23 0,14 1,44 0,30 0,56 0,31 7,72 0,59 0,74 0,17 2,21 0,33 5,46 0,30
1204 1229
1204 1228
0,19 0,89
1247 1274 1283 1291 1293
1245 1273 1282 1290 1293
1,20 0,90 0,75 0,75 0,92
1304 1388
1304 1388
1,83 1,55
1409 1426 1437
1408 1425 1436
0,17 0,30 0,97
1474 1484 1518 1532 1545 1562 1575 1583
1473 1483 1518 1531 1544 1561 1574 1582
2,31 2,02 0,28 2,71 3,27 1,47 0,23 0,49
Šarže: 012015 L09011330A 1614 1614 0,43 1629 1628 0,77
n.i. 48 spathulenol 6750-60-3 49 karyofylen oxid 1314-13-2 50 n.i. 1638 51 n.i. 52 bisabolol oxid B 26184-88-3 1697 53 bisabolol oxid 26184-88-3 1726 54 bisabolol oxid A 22567-36-8 1792 55 n.i. 1856 56 n.i. 1912 57 n.i.-nebylo identifikováno; m.h.-mimo homologickou řadu
1637
1,42
1697 1726 1792 1855 1912
3,11 1,25 1,60 0,97 0,29
Šarže: 112013 L03111130B 1622 1621 0,43 1627 1627 0,73 1636 1636 1,64 1672 1696 1725 1791 1855
1671 1696 1724 1791 1854
0,25 1,19 0,64 0,63 0,38
Bylinný čaj Imunostim Pro vzorek bylinné směsi Imunostimin č. šarže 250311/050411 a 070911/071011 jsou
vypsány detekované a identifikované sloučeniny v tabulce 50, kde je dále uvedené CAS číslo, retenční index a relativní plocha příslušných sloučenin. V příloze IV. 3a je zobrazen aromaprofil vzorku Imunostimin č. šarže 250311/050411. Bylo zde detekováno 37 píků, z toho identifikováno 28 sloučenin (z toho 2 monoterpeny, 8 oxidovaných monoterpenů, 4 alifatické sloučeniny, 2 fenolické látky, 2 aromatické sloučeniny a 8 sekviterpenů). Největší zastoupení v chromatogramu má pík příslušící estragolu. Výrobce na obalu uvádí, že největší zastoupení ve směsi má kopřivový list. V článku S. Gul a kolektiv [122] uvádějí, že dominantní sloučeniny v kopřivovém listu jsou karvakrol (38,2 %), karvon (9,0 %), naftalen (8,9 %), (E)-anethol (4,7 %), hexahydrofarnesyl aceton (3,0 %), (E)-geranyl aceton (2,9 %), (E)-β-ionon (2,8 %) a fytol (2,7 %). V tomto případě byla shoda v několika sloučeninách. Byl identifikován taktéž karvon a estragol neboli anethol. Aromaprofil vzorku Imunostimin č. šarže 070911/071011 je zobrazen V příloze IV. 3b bylo detekováno 34 píků, z toho identifikováno 25 sloučenin (z toho 5 monoterpenů, 7 oxidovaných monoterpenů, 4 alifatické sloučeniny, 2 fenolické látky, 1 aromatická sloučenina, 3 sekviterpenů a zbytek nebyl určen). Mezi majoritní píky patří α-thujon, kafr a estragol. Při porovnání těchto dvou šarží je zřetelné, že se liší množstvím některých sloučenin. To poukazuje na to, že mohlo dojít k nestejnému poměru smíchání surovin při výrobě, nebo že některá surovina chybí.
125
Tab. 50: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Imunostim
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
Složky silic β-jonon epoxid kyselina octová hexanal n.i. 1-hexanol α-pinen kamfen benzaldehyd β-myrcen p-cymen limonen eukalyptol n.i. n.i. α-thujen β-thujen kafr linalool oxid isoborneol α-terpineol karvon anisaldehyd n.i. estragol thymol n.i. α-kopaen (E)-karyofylen n.i. n.i. n.i. δ-kadinen alloaromadendren β-bisabolen dihydroactinidiolid karyofylen oxid viridiflorol humulene oxid n.i. n.i. n.i. bisabolol oxid A 2-undekanon nonadekan
CAS 23267-57-4 64-19-7 66-25-1 111-27-3 7785-26-4 79-92-5 100-52-7 123-25-3 99-87-6 138-86-3 470-82-6
2867-05-2 2867-05-2 76-22-2 1365-19-1 124-67-5 98-55-5 99-49-0 135-02-4 140-67-0 89-83-8 3856-25-5 00287-23-0
483-76-1 25246-27-9 495-61-4 17092-92-1 1139-30-6 552-02-3 19888-33-6
22567-36-8 112-12-9 629-92-5
Šarže: 250311 050411 RIa RIb A [%] m.h m.h. 0,92 m.h m.h. 1,05 m.h. m.h. 0,28 907 906 0,14 924 920 0,19 990 988 0,18 1018
1016
0,19
1077
1075
0,31
1087
1085
1,04
1146 1159 1169 1199 1216 1225 1244 1290 1300 1324 1330
1144 1157 1167 1199 1215 1223 1242 1289 1300 1323 1329
0,37 2,45 1,12 5,07 0,60 1,63 0,70 0,50 0,85 0,90 36,73
1391 1422 1469 1480
1390 1421 1468 1479
0,55 0,22 2,11 2,97
1503 1516 1527 1541 1578 1631 1643 1658 1678 1710 1755
1502 1515 1527 1540 1578 1631 1642 1657 1677 1710 1754
3,74 1,46 6,44 0,67 1,46 4,01 11,02 5,82 0,93 1,25 0,44
1850 1902
1849 1902
0,58 0,50
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
126
Šarže: 070911 071011 RIa RIb A [%] m.h m.h 0,87 m.h. m.h. 0,71 m.h. m.h. 0,32 907 906 0,25 907 906 0,25 990 989 1,69 1007 1006 2,08 1042 1078 1083 1087 1141 1146 1160 1170 1199
1038 1076 1081 1085 1139 1144 1157 1168 1199
2,21 2,45 6,11 5,77 0,44 0,72 11,96 7,50 11,78
1225
1224
2,17
1290 1300
1289 1300
0,99 0,86
1330 1337 1391
1328 1336 1391
16,19 0,70 0,98
1470 1480 1489 1503
1469 1479 1489 1503
2,40 3,75 0,80 2,62
1578 1633 1643
1578 1632 1642
0,85 1,38 6,23
1678 1712
1677 1712
0,87 1,26
1786 1850 1902
1786 1849 1902
0,92 0,95 0,51
Bylinný čaj Zažívání Ve vzorku bylinné směsi Leros natur Zažívání č. šarže 22102012 22102014
a 02112011 02112013 byly detekované a identifikované sloučeniny (tabulka 51). V tabulce 51 je uvedeno CAS číslo, retenční index a relativní plocha příslušných sloučenin. Aromaprofil vzorku Leros natur Zažívání č. šarže 22102012 22102014 je zobrazen v příloze IV. 4a. Bylo detekováno 40 píků, z toho identifikováno 35 sloučenin (z toho 3 monoterpeny, 12 oxidovaných monoterpenů, 4 alifatické sloučeniny, 3 fenolické látky, 1 aromatická sloučenina, 7 sekviterpenů a zbytek nebyl určen). Mezi hlavní píky patří carvon a estragol. Výrobce na obalu uvádí mátu peprnou a citronovou trávu. V článku C. L. Silva a kolektiv [123], který se zabýval analýzou máty peprné je uvedeno, že mezi dominantní složky máty peprné patří D-limonen a (+)-epbicykloseskvifelandren. Jiná studie, která se zabývá analýzou citronové trávy, uvádí majoritní sloučeniny obsažené v citronové trávě, a to geranial, neral, β-pinen a cis-geraniol [124]. U toho vzorku byl z těchto sloučenin identifikován pouze geraniol. V příloze
IV.
4b
je
zobrazen
aromaprofil
vzorku
Leros
Natur
Zažívání
č. šarže 02112011 02112013. Bylo detekováno 34 píků, z toho identifikováno 31 sloučenin (z toho 6 monoterpenů, 10 oxidovaných monoterpenů, 2 alifatické sloučeniny, 3 fenolické látky, 1 aromatická sloučenina, 7 sekviterpenů a zbytek nebyl určen). Mezi hlavní píky patří carvon a estragol. Tyto dvě šarže se liší zejména v kvantitativním zastoupení některých sloučenin. Mezi ně patří zejména sloučeniny p-cymen a kurkumen.
127
Tab. 51: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Zažívání
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
Složky silic β-jonon epoxid aceton kyselina octová 2-butenal hexanal n.i. α-pinen kamfen benzaldehyd 1-okten-3-ol sulcaton β-myrcen p-cymen limonen eukalyptol γ-terpinen (Z)-sabinen hydrát n.i. menthon isomenthol α-terpineol thymol methylether (Z)-citral geraniol karvon piperiton (E)-citral estragol thymol methyl acetát triacetin (E)-citral geranyl acetát β-bourbonen (E)-karyofylen n.i. aromadendren n.i. n.i. kurkumen zingiberen β-bisabolen δ-kadinen β-sescvifelandren n.i.
CAS 23267-57-4 67-64-1 64-19-7 4170-30-3 66-25-1 7785-26-4 79-92-5 100-52-7 3391-86-4 196522-54-0 123-25-3 99-87-6 138-86-3 470-82-6 223190 15537-55-0 89-80-5 23283-97-8 432628 1076-56-8 5392-40-5 106-24-1 99-49-0 89-81-6 141-27-5 140-67-0 89-83-8 79-20-9 102-76-1 141-27-5 105-87-3 5208-59-3 00287-23-0 489-39-4
644-30-4 495-60-3 495-61-4 483-76-1 8008-52-4
Šarže: 22102012 22102014 RIa RIb A [%] m.h m.h. 0,24 m.h m.h. 0,12 m.h m.h. 0,15 m.h. m.h. 0,09 m.h. m.h. 0,13 907 906 0,07 1007 1018 1031 1036
1006 1016 1029 1033
0,05 0,09 0,08 0,22
1078
1076
0,74
1087 1108 1122 1146 1204 1227 1244 1266 1281 1288 1291 1301 1305 1330 1338 1349 1365
1085 1107 1120 1144 1204 1225 1242 1264 1279 1287 1291 1300 1305 1328 1336 1347 1363
0,31 0,11 0,12 0,20 5,79 14,00 0,21 0,36 0,41 2,47 19,43 0,72 0,98 10,42 1,42 0,20 0,44
1405 1432 1470 1480 1487
1405 1431 1469 1480 1487
0,37 0,85 1,44 2,00 0,41
1508 1515 1528 1542 1547 1559 1563
1508 1514 1527 1541 1546 1558 1562
0,35 10,59 1,49 4,29 2,50 4,44 0,33
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
128
Šarže: 02112011 02112013 RIa RIb A [%] m.h m.h 0,69 m.h. m.h. 0,11 m.h. m.h. 0,25 m.h.
m.h.
0,20
990 1007 1018
989 1006 1016
0,26 0,31 0,18
1036 1042 1078 1083 1087 1108 1122 1146 1204 1226
1033 1038 1076 1081 1085 1107 1121 1145 1204 1225
0,72 0,27 3,27 0,55 1,86 0,45 0,63 0,60 9,27 8,70
1271 1280
1270 1279
0,48 1,54
1290 1300 1305 1329 1338
1289 1300 1305 1328 1336
11,29 1,50 2,10 2,08 2,08
1379
1378
0,55
1433 1470 1480
1432 1469 1480
0,36 1,25 1,91
1498
1498
0,61
1514 1528 1541 1547 1558
1514 1527 1540 1546 1557
3,12 6,09 2,40 0,76 2,57
4.2.1.4. Analýza bylinných směsí s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – suchý způsob V následující kapitole jsou uvedeny detekované a identifikované sloučeniny pro 3 vybrané vzorky bylinných čajů vždy při kombinaci těchto teplot. V tabulkách jsou uvedeny CAS čísla příslušných sloučenin, retenční index dle Kovatse (RIa) a van den Doola (RIb) a relativní plocha příslušné sloučeniny.
Bylinný čaj Imunostim Pro
vzorek
bylinné
směsi
Imunostimin
jsou
vypsány
složky
detekované
a identifikované sloučeniny v tabulkách. Při 40 °C bylo detekováno 19 píků, z toho identifikováno 14 sloučenin s velmi malou intenzitou. Při 80 °C bylo detekováno 26 píků, z toho identifikováno 18 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 22 sloučenin. Mezi hlavní složky patří estragol a viridiflorol. Při kombinaci teplot 80/40 °C bylo detekováno 37 píků, z toho identifikováno 23 sloučenin. Mezi majoritní složky patří eukalyptol, α-thujon, kafr a estragol (příloha V. 1, tabulka 52).
Bylinný čaj Zažívání Detekované a identifikované sloučeniny pro vzorkek bylinné směsi Leros zažívání jsou
vypsané v tabulkách. Při 40 °C bylo detekováno 21 píků, z toho identifikováno 17 sloučenin. Mezi nejintenzivnější píky patří isomenthol a karvon. Při 80 °C bylo detekováno 44 píků, z toho 37 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 40 sloučenin. Hlavní eluované sloučeniny byly isomenthol a karvon. Při kombinaci obou teplot 80/40 °C bylo detekováno 53 píků, z toho identifikováno 43 sloučenin. Mezi majoritní složky patří isomenthol a karvon (příloha V. 2, tabulka 53).
129
Tab. 52: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Imunostim při kombinaci extrakčních teplot 80/40 °C Složky silic CAS kyselina octová 64-19-7 1 3-methylbutanal 590-86-3 2 n.i. 3 hexanal 66-25-1 4 2-hexanal 6728-26-3 5 1-hexanol 111-27-3 6 heptanal 111-71-7 7 α-pinen 147524 8 kamfen 79-92-5 9 n.i. 10 n.i. 11 limonen 138-86-3 12 eukalyptol 470-82-6 13 n.i. 14 nonanal 124-19-6 15 α-thujen 2867-05-2 16 β-thujen 2867-05-2 17 kafr 76-22-2 18 epoxylinalool 60047-17-8 19 borneol 507-70-0 20 karvon 99-49-0 21 anisaldehyd 135-02-4 22 n.i. 23 estragol 140-67-0 24 n.i. 25 (E)-karyofylen 00287-23-0 26 n.i. 27 n.i. 28 alloaromadendren 25246-27-9 29 n.i. 30 n.i. 31 viridiflorol 552-02-3 32 n.i. 33 n.i. 34 n.i. 35 2-undekanone 112-12-9 36 n.i. 37 n.i.-nebylo identifikováno; m.h.-mimo homologickou řadu
130
RIa m.h. m.h. m.h. m.h. 912 928 961 994 1012 1047 1082 1087 1091 1151 1155 1165 1175 1205 122 1231 1295 1307 1330 1338 1399 1481 1491 1517 1543 1596 1652 1664 1680 1700 1736 1883 1941
RIb m.h. m.h. m.h. m.h. 910 924 957 993 1010 1044 1080 1085 1090 1149 1153 1162 1173 1205 1221 1229 1295 1307 1329 1336 1399 1480 1491 1516 1542 1595 1652 1663 1679 1700 1735 1883 1940
A [%] 0,62 0,88 0,88 2,24 0,65 0,60 0,36 0,94 0,73 0,96 1,31 1,32 9,21 0,71 1,63 11,28 4,91 12,90 1,07 2,88 0,64 0,80 0,63 26,79 1,17 1,88 2,69 1,47 1,25 1,05 1,50 4,87 1,83 0,76 0,24 0,42 0,25
Tab. 53: Detekované a identifikované sloučeniny vzorku Zažívání při kom. teplot 80/40 °C Složky silic CAS β-jonon epoxid 23267-57-4 1 aceton 67-64-1 2 kyselina octová 64-19-7 3 3-methyl butanol 123-51-3 4 propylenglykol 57-55-6 5 hexanal 66-25-1 6 n.i. 7 n.i. 8 felandren 814893 9 α-pinen 147524 10 kamfen 79-92-5 11 1-okten-3-ol 3391-86-4 12 sulcatone 409-02-9 13 β-myrcen 123-25-3 14 n.i. 15 tripropylenglykol 42978-66-5 16 p-cymen 99-87-6 17 limonen 138-86-3 18 eukalyptol 470-82-6 19 γ-terpinen 223190 20 n.i. 21 n.i. 22 kafr 76-22-2 23 menthon 89-80-5 24 isomenthol 23283-97-8 25 4-terpineol 562-74-3 26 linalyl propionat 144-39-8 27 n.i. 28 thymol methylether 1076-56-8 29 (Z)-citral 5392-40-5 30 n.i. 31 geraniol 106-24-1 32 karvon 99-49-0 33 piperiton 89-81-6 34 (E)-citral 141-27-5 35 estragol 140-67-0 36 thymol 89-83-8 37 terpinyl acetát 80-26-2 38 geranyl acetát 105-87-3 39 β-bourbonen 5208-59-3 40 (E)-karyofylen 00287-23-0 41 n.i. 42 kurkumen 644-30-4 43 zingiberen 495-60-3 44 β-bisabolen 495-61-4 45 β-sescvifelandren 8008-52-4 46 farnesol 4602-84-0 47 spathulenol 6750-60-3 48 n.i. 49 bisabolol oxid B 26184-88-3 50 bisabolol oxid A 22567-36-8 51 2-undekanon 112-12-9 52 n.i. 544-76-3 53 n.i.-nebylo identifikováno; m.h.-mimo homologickou řadu
131
RIa m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. 911 962 986 994 1011 1035 1040 1045 1052 1066 1082 1086 1090 1112 1126 1150 1204 1210 1232 1236 1249 1271 1276 1286 1290 1293 1297 1307 1311 1335 1343 1390 1410 1438 1475 1485 1520 1533 1547 1564 1591 1629 1638 1697 1793 1857 1917
RIb m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. 909 957 983 992 1010 1032 1037 1042 1049 1063 1080 1085 1089 1111 1125 1148 1204 1209 1230 1234 1247 1269 1275 1285 1290 1293 1297 1306 1311 1334 1341 1389 1410 1437 1474 1485 1520 1532 1546 1563 1591 1628 1637 1697 1793 1856 1916
A [%] 0,17 0,12 0,21 0,11 0,09 0,11 0,06 0,08 0,14 0,23 0,40 0,36 1,38 0,32 0,39 0,51 44,57 0,52 1,09 0,72 0,31 1,28 0,40 9,43 12,77 0,29 0,37 0,57 0,24 2,49 0,30 6,27 24,34 0,96 3,52 9,74 1,32 0,23 1,51 0,34 1,50 0,68 3,34 1,33 1,66 1,52 0,25 0,18 0,60 0,30 0,36 0,11 0,09
Bylinný čaj Babička Růženka s echinaceou Detekované a identifikované složky ve vzorku bylinné směsi Babička Růženka
s echinaceou jsou uvedeny v tabulkách. Při 40 °C bylo detekováno 31 píků, z toho identifikováno 25 slučenin (tabulka 54). Mezi nejintenzivnější píky patří p-cymen a estragol. Při 80 °C bylo detekováno 47 píků, z toho identifikováno 39 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 36 sloučenin. Mezi hlavní složky patří thymol a estragol. Při kombinaci obou teplot bylo detekováno 52 píků, z toho 38 identifikováno. Mezi majoritní složky patří p-cymen, thymol a estragol (příloha V. 3, tabulka 54).
132
Tab. 54: Detekované a identifikované sloučeniny u Babička Růženka s echin. při 80/40 °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
Složky silic β-jonon epoxid n.i. kyselina octová 3-methyl butanal n.i. hexanal n.i. felandren α-pinen kamfer n.i 1-okten-3-ol 3-oktanol β-myrcen n.i. n.i. tripropylenglykol n.i. p-cymen limonen eukalyptol β-ocimen γ-terpinen β-terpineol L-fenchon n.i. kafr borneol 4-terpineol α-terpineol thymol methylether geraniol karvon n.i. anisaldehyd thymol estragol terpinyl acetát geranyl acetát n.i. β-bourbonen (E)-karyofylen n.i. n.i. D germacren β-bisabolen δ-kadinen spathulenol n.i. bisabolol oxid B bisabolol oxid A n.i.
RIa m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. 899 985 992 1010 1032 1034 1039 1044 1051 1054 1064 1074 1081 1085 1089 1095 1111 1125 1147 1150 1203 1228 1234 1247 1274 1291 1293 1295 1304 1333 1336 1388 1408 1426 1436 1473 1483 1520 1531 1545 1562 1627 1636 1695 1791 1855
CAS 23267-57-4 64-19-7 590-86-3 66-25-1 814893 147524 79-92-5 3391-86-4 589-98-0 123-25-3
42978-66-5 99-87-6 138-86-3 470-82-6 3779-61-1 223190 138-87-4 7787-20-4 76-22-2 507-70-0 562-74-3 98-55-5 1076-56-8 106-24-1 99-49-0 123-11-5 89-83-8 140-67-0 80-26-2 105-87-3 5208-59-3 00287-23-0
23986-74-5 495-61-4 483-76-1 6750-60-3 26184-88-3 22567-36-8
n.i.-nebylo identifikováno; m.h.-mimo homologickou řadu
133
RIb m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. m.h. 899 982 991 1009 1029 1031 1036 1041 1048 1051 1061 1071 1079 1084 1088 1094 1110 1123 1144 1147 1203 1227 1232 1245 1272 1290 1293 1295 1304 1331 1334 1388 1408 1425 1435 1472 1483 1520 1530 1544 1561 1626 1635 1695 1790 1854
A [%] 0,28 0,11 0,06 0,15 0,14 0,17 0,12 0,79 0,53 0,38 0,98 0,95 0,54 1,10 0,35 0,20 0,80 0,69 11,37 1,16 1,48 0,20 2,79 0,37 2,03 12,99 0,29 0,87 0,54 2,43 1,09 2,66 0,31 1,19 1,29 13,88 17,93 3,52 2,17 0,45 0,91 2,29 1,14 0,21 0,76 2,48 0,94 0,26 0,81 0,40 0,28 0,17
Tato metoda se projevila jako účinnější s porovnáním s metodou SPME při jedné teplotě (70 °C). U analyzovaných bylinných čajů (Imunostim, Zažívání, Babička Růženka s echinaceou) bylo detekováno více sloučenin při kombinaci teplot (viz tabulka 55). Tab. 55: Počty detekovaných sloučenin vybraných bylinných směsí při jedné teplotě a kombinaci dvou teplot Vzorky čajů Imunostim Zažívání Babička Růženka s echinaceou
70 °C 36 40 50
80/40 °C 37 53 52
4.2.1.5. Analýza bylinných směsí s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – mokrý způsob U 3 vybraných bylinných směsí byla provedena analýza pro porovnání při 80 °C, 40 °C a kombinace teplot 80/40 °C. V následujících tabulkách jsou vypsány detekované a identifikované sloučeniny pro každý vzorek bylinné směsi, vždy pro teplotu při kombinaci těchto teplot. V tabulce je dále uvedeno CAS číslo, retenční index dle Kovatse (RIa) a van den Doola (RIb) a také relativní plocha příslušné sloučeniny.
Bylinný čaj Imunostim Pro 40 °C bylo detekováno 22 píků, z toho identifikováno 18 sloučenin s poměrně
nízkou intenzitou. Estragol patřil mezi hlavní pík. Při 80 °C bylo detekováno 24 píků, z toho identifikováno 18 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 22 sloučenin. K majoritním píkům patřil opět estragol. Při kombinaci teplot 80/40 °C bylo detekováno 28 píků, z toho identifikováno 23 sloučenin (tabulka 56). K hlavním píkům patřil estragol (příloha VI. 1).
134
Tab. 56: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Imunostim při kombinaci extrakčních teplot 80/40 °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Složky silic n.i. 3-methylbutanal n.i. hexanal 1-hexanol benzaldehyd p-cymen eukalyptol n.i. α-thujen β-thujen kafr menthon isomenthol α-terpineol linalyl acetate karvon anisaldehyd estragol (E)-karyofylen aromadendren dihydroactinolid karyofylen oxid viridiflorol n.i. n.i. 2-undekanone nonadekan
RIa m.h. m.h. m.h. m.h. 927 1021 1080 1089 1149 1162 1173 1203 1208 1229 1248 1288 1293 1304 1335 1532 1541 1583 1636 1647 1663 1682 1855 1907
CAS 590-86-3 66-25-1 111-27-3 100-52-7 99-87-6 470-82-6 2867-05-2 2867-05-2 76-22-2 89-80-5 23283-97-8 98-55-5 115-95-7 99-49-0 123-11-5 140-67-0 00287-23-0 489-39-4 17092-92-1 1314-13-2 552-02-3
112-12-9 629-92-5
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
135
RIb m.h. m.h. m.h. m.h. 923 1019 1078 1088 1147 1160 1171 1203 1207 1227 1246 1287 1293 1304 1334 1531 1540 1582 1635 1646 1662 1682 1854 1907
A [%] 3,02 0,22 0,255 0,30 0,22 0,32 0,45 2,35 1,96 2,63 0,74 4,59 4,08 1,79 1,29 0,84 0,71 2,37 61,72 0,57 0,72 0,74 0,87 3,59 1,47 1,16 0,58 0,45
Bylinný čaj Zažívání Bylo detekováno 32 píků, z toho identifikováno 29 sloučenin při 40 °C. Mezi hlavní
píky patří menthon, isomenthon a karvon. Při 80 °C bylo detekováno 52 píků, z toho identifikováno 45 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 45 sloučenin. K hlavním píkům patří isomenthol a karvon. Při kombinaci teplot 80/40 °C bylo detekováno 44 píků, z toho identifikováno 41 sloučenin (tabulka 57). Mezi majoritní píky patří isomenthol, geraniol a karvon (příloha VI. 2).
Bylinný čaj Babička Růženka s echinaceou Pro 40 °C bylo detekovano 29 píků, z toho identifikováno 26 sloučenin. Mezi hlavní
píky patří L-fenchon a estragol. Pro 80 °C bylo detekováno 35 píků, z toho identifikováno 30 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 38 sloučenin. Hlavním píkem je identifikován estragol. Při kombinaci teplot 80/40 °C bylo detekováno 42 píků, z toho identifikováno 37 sloučenin (tabulka 58). Majoritní pík je identifikován jako estragol (příloha VI. 3).
136
Tab. 57: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Zažívání při kombinaci extrakčních teplot 80/40 °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
Složky silic β-jonon epoxid α-pinen kamfen 1-okten-3-ol sulkaton β-myrcen 3-oktanol p-cymen limonen eukalyptol γ-terpinen n.i. kafr menthon isomenthol 4-terpineol α-terpineol n.i. (Z)-citral geraniol karvon piperiton (E)-citral methyl acetát thymol citronelyl acetát kyselina geranová geranyl acetát β-bourbonen 2-ethylidene-6-methyl-3,5heptadienal (E)-karyofylen n.i. kurkumen α-bergamot β-bisabolen β-sescvifelandren farnesol spathulenol karyofylen oxid viridiflorol bisabolol oxid B bisabolol oxid A 2-undekanone diisobutyl fthalát
5392-40-5 106-24-1 99-49-0 89-81-6 141-27-5 79-20-9 89-83-8 150-84-5 97-54-1 105-87-3 5208-59-3
RIa m.h. 992 1009 1034 1039 1044 1051 1080 1085 1089 1111 1149 1202 1208 1230 1234 1247 1269 1283 1292 1295 1304 1309 1333 1341 1352 1383 1408 1436
RIb m.h. 990 1008 1031 1036 1040 1047 1078 1083 1087 1110 1146 1202 1207 1228 1232 1245 1267 1282 1291 1295 1304 1309 1331 1339 1350 1382 1408 1435
A [%] 0,20 0,11 0,28 0,20 0,58 0,25 0,16 1,96 0,43 0,92 0,29 0,93 0,34 8,79 14,22 0,40 0,37 0,56 3,57 10,98 24,98 1,46 6,09 8,10 2,19 0,31 0,84 3,13 0,17
1604-28-0
1459
1457
0,36
00287-23-0
1473 1483 1518 1531 1545 1562 1589 1626 1635 1646 1695 1790 1854 1878
1472 1483 1517 1530 1543 1561 1588 1625 1634 1645 1694 1790 1853 1878
0,70 0,24 1,38 0,52 0,57 0,69 0,17 0,13 0,27 0,15 0,40 0,42 0,11 0,09
CAS 23267-57-4 147524 79-92-5 3391-86-4 409-02-9 123-25-3 589-98-0 99-87-6 138-86-3 470-82-6 223190 76-22-2 89-80-5 23283-97-8 562-74-3 98-55-5
644-30-4 8007-75-8 495-61-4 8008-52-4 4602-84-0 6750-60-3 1314-13-2 552-02-3 26184-88-3 22567-36-8 112-12-9 84-69-5
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
137
Tab. 58: Detekované a identifikvané sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Babička Růženka s echinaceou přikombinaci extrakčních teplot 80/40 °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Složky silic β-jonon epoxid n.i. felandren α-pinen kamfen n.i 1-okten-3-ol β-myrcen α-terpinen p-cymen limonen eukalyptol γ-terpinen L-fenchon n.i. kafr menthon isomenthol 4-terpineol α-terpineol thymol methylether n.i. geraniol thymochinon anisaldehyd estragol thymol terpinyl acetát geranyl acetát anisyl aceton β-bourbonen (E)-karyofylen aromadendren β-bisabolen δ-kadinen spathulenol karyofylen oxid bisabolol oxid B bisabolol oxid bisabolol oxid A n.i. diisobutyl fthalát
RIa m.h. m.h. 985 993 1009 1032 1034 1044 1074 1080 1085 1089 1111 1147 1149 1203 1207 1228 1234 1247 1274 1283 1291 1295 1304 1336 1341 1388 1408 1425 1436 1473 1531 1545 1561 1627 1635 1695 1724 1790 1854 1879
CAS 23267-57-4 814893 147524 97-54-1 3391-86-4 123-25-3 86743 99-87-6 138-86-3 470-82-6 223190 7787-20-4 76-22-2 89-80-5 23283-97-8 562-74-3 98-55-5 1076-56-8 106-24-1 490-91-5 123-11-5 140-67-0 89-83-8 80-26-2 105-87-3 104-20-1 5208-59-3 00287-23-0 489-39-4 495-61-4 483-76-1 6750-60-3 1314-13-2 26184-88-3 22567-36-8 22567-36-8 84-69-5
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
138
RIb m.h. m.h. 982 991 1008 1029 1031 1041 1071 1078 1083 1088 1110 1144 1147 1202 1207 1227 1232 1245 1272 1282 1290 1295 1304 1335 1340 1388 1408 1424 1435 1472 1530 1544 1560 1626 1635 1695 1724 1790 1853 1878
A [%] 0,47 0,06 0,15 0,28 0,12 0,22 0,24 0,24 0,26 6,07 0,51 0,49 0,85 3,67 10,67 0,16 0,22 0,91 0,54 2,66 0,89 0,94 1,64 1,47 2,42 50,28 0,65 4,36 1,07 0,56 0,23 1,17 0,75 1,42 0,73 0,29 0,79 0,78 0,31 0,52 0,32 0,14
4.2.1.6. Headspace mikroextrakce tuhou fází nápojů pro 2 sorpční teploty U 3 vybraných bylinný směsí byla provedena analýza pro porovnání při 80 °C, 40 °C a kombinaci
teplot
80/40 °C.
V následujících
tabulkách jsou
uvedeny
detekované
a identifikované sloučeniny pro každý vzorek bylinné směsi vždy při kombinaci 80/40 °C teplot. V tabulkách je také uvedeno CAS číslo, retenční index dle Kovatse (RIa) a van den Doola (RIb) a relativní plocha příslušné sloučeny.
Bylinný čaj Imunostim Pro 40 °C bylo detekováno 19 píků, z toho identifikováno 14 sloučenin. Mezi hlavní
píky
patří
kafr,
estragol
a
diisobutyl
ftalate.
Pro
80
°C
bylo
detekováno
24 píků, z toho identifikováno 17 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 18 sloučenin. Mezi majoritní píky patří estragol. Při kombinaci teplot 80/40 °C bylo detekováno 24 píků, z toho identifikováno 20 sloučenin. K hlavním píkům patří estragol (tabulka 59), ale ostatní sloučeniny vykazovaly vyšší relativní plochu v porovnání s předchozími teplotami (příloha VII. 1). Tab. 59: Detekované a identifikované sloučeniny pro Imunostim při kombinaci 80/40 °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Složky silic β-jonon epoxid β-myrcen p-cymen eukalyptol n.i. α-thujen n.i. kafr menthon isomenthol α-terpineol (Z)-citral linalyl acetát karvon (E)-citral geranyl acetát estragol methyl acetát (E)-karyofylen n.i. β-bisabolen viridiflorol n.i. diisobutyl fthalát
RIa m.h. 1044 1080 1089 1149 1162 1172 1202 1207 1229 1247 1283 1287 1293 1309 1319 1333 1408 1473 1541 1545 1647 1682 1879
CAS 23267-57-4 123-25-3 99-87-6 470-82-6 2867-05-2 76-22-2 89-80-5 23283-97-8 98-55-5 5392-40-5 115-95-7 99-49-0 96680-15-8 105-87-3 140-67-0 79-20-9 00287-23-0 495-61-4 552-02-3 84-69-5
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
139
RIb m.h. 1041 1078 1088 1146 1160 1170 1202 1207 1227 1245 1282 1287 1292 1309 1318 1332 1408 1472 1539 1544 1646 1682 1878
A [%] 5,68 0,77 0,76 2,60 6,80 1,04 0,78 3,50 4,88 5,64 1,29 1,43 6,49 7,10 0,97 1,56 33,49 0,78 0,78 0,45 0,37 0,80 0,56 11,48
Bylinný čaj Zažívání Pro 40 °C bylo detekováno 24 píků, z toho identifikováno 21 sloučenin. K hlavním
píkům patří menthon, isomenthol a karvon. Pro 80 °C bylo detekováno 22 píků, z toho identifikováno 21 sloučenin. Mezi hlavní píky patří isomenthol a karvon. Pro kombinaci teplot 80/40 °C bylo detekováno 23 píků, z toho identifikováno 22 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 25 sloučenin. K majoritním píkům patří isomenthol, karvon a estragol (příloha VII. 2, tabulka 60). Tyto tři sloučeniny byly identifikovány při všech aplikovaných teplotách. Estragol vykazoval nejvyšší relativní plochu při kombinaci teplot 80/40 °C. Karvon vykazoval relativní plochu srovnatelnou ve všech aplikovaných teplotách. Isomenthol vykazoval nejvyšší relativní plochu při 40 °C. Tab. 60: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Zažívání při kombinacicextrakčních teplot 80/40 °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Složky silic β-jonon epoxid β-myrcen p-cymen eukalyptol β-ocimen n.i. kafr menthon isomenthol α-terpineol (Z)-citral linalyl acetát geraniol karvon piperiton (E)-citral estragol thymol geranyl acetát (E)-karyofylen β-bisabolen bisabolol oxid B bisabolol oxid A
RIa m.h. 1044 1080 1089 1095 1149 1202 1207 1229 1247 1283 1287 1290 1293 1304 1309 1333 1341 1408 1473 1545 1675 1790
CAS 23267-57-4 123-25-3 99-87-6 470-82-6 13877-91-3 76-22-2 89-80-5 23283-97-8 98-55-5 5392-40-5 115-95-7 106-24-1 99-49-0 89-81-6 141-27-5 140-67-0 89-83-8 105-87-3 00287-23-0 495-61-4 26184-88-3 22567-36-8
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
140
RIb m.h. 1041 1078 1088 1094 1146 1202 1207 1227 1245 1282 1287 1290 1292 1303 1308 1331 1339 1408 1472 1544 1695 1790
A [%] 1,38 0,54 0,36 1,04 0,27 4,11 1,23 6,28 12,81 0,37 4,59 3,68 5,13 32,74 1,07 8,36 11,25 1,83 0,49 0,50 0,12 0,53 0,55
Bylinný čaj Babička Růženka s echinaceou Pro 40 °C bylo detekováno 16 píků, z toho identifikováno 14 sloučenin. Jako hlavní pík
je identifikován estragol. Pro 80 °C bylo detekováno 16 píků, z toho identifikováno 14 sloučenin. Dohromady by takto mohlo být identifikováno 21 sloučenin. Při kombinaci teplot 80/40 °C bylo detekováno 29 píků, z toho identifikováno 23 sloučenin. Jako majoritní pík je identifikován opět a estragol (příloha VII. 3, tabulka 61). U tohoto vzorku je jasné potvrzení faktu, že při kombinaci obou teplot dochází k sorpci a následné identifikaci většího množství sloučenin. Tab. 61: Detekované a identifikované sloučeniny ve vzorku bylinné směsi Babička Růženka s echinaceou při kombinaci extrakčních teplot 80/40 °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Složky silic β-jonon epoxid n.i. 1-okten-3-ol β-myrcen p-cymen eukalyptol L-fenchon n.i. n.i. menthon isomenthol 4-terpineol α-terpineol n.i. geraniol p-cymen-2,5-dion anisaaldehyd estragol thymol terpinyl acetát geranyl acetát (E)-karyofylen n.i. spathulenol karyofylen oxid bisabolol oxid B bisabolol oxid bisabolol oxid A n.i.
RIa m.h. m.h. 1034 1044 1080 1089 1146 1148 1171 1207 1228 1233 1246 1283 1290 1295 1304 1333 1340 1387 1408 1472 1483 1626 1635 1695 1724 1790 1854
CAS 23267-57-4 3391-86-4 123-25-3 99-87-6 470-82-6 7787-20-4
89-80-5 23283-97-8 562-74-3 98-55-5 106-24-1 73940-92-8 123-11-5 140-67-0 89-83-8 80-26-2 105-87-3 00287-23-0 6750-60-3 1314-13-2 26184-88-3 22567-36-8 22567-36-8
n.i. – nebylo identifikováno, m.h. – mimo homologickou řadu
141
RIb m.h. m.h. 1031 1040 1078 1087 1144 1146 1169 1206 1227 1232 1245 1281 1290 1294 1303 1332 1339 1387 1408 1471 1482 1625 1634 1694 1723 1790 1853
A [%] 2,01 0,20 0,13 0,17 0,27 0,27 1,63 11,88 0,19 5,36 5,98 0,43 2,39 0,23 1,40 3,47 1,01 59,18 1,14 0,47 0,16 0,22 0,09 0,24 0,16 0,53 0,23 0,34 0,25
4.2.1.7. Porovnání jednotlivých metod
Bylinný čaj Imunostim Pro aplikaci HS-SPME po dobu 25 minut při 70 °C u suchého bylinného čaje, byly
identifikovány jako hlavní píky α-thujon, camfor a estragol. Pro analýzu suchého bylinného čaje při kombinaci teplot 80/40 °C byly identifikovány píky α-thujon, kafr a estragol jako majoritní sloučeniny. V analýze suchého čaje s přídavkem roztoku soli při kombinaci teplot 80/40 °C byl pík estragolu identifikován jako nejintenzivnější.
Bylinný čaj Zažívání Pro aplikaci HS-SPME po dobu 25 minut při 70 °C u suchého bylinného čaje, byly
identifikovány jako hlavní píky karvon a estragol. V analýze suchého bylinného čaje při kombinaci teplot 80/40 °C byly majoritní píky isomenthol a carvon. V analýze suchého bylinnéhočaje s přídavkem roztoku soli při kombinaci teplot 80/40 °C byly jako nejintenzivnější sloučeniny identifikovány isomenthol, geraniol a carvon.
Bylinný čaj Babička Růženka s echinaceou Pro aplikaci HS-SPME po dobu 25 minut při 70 °C u suchého bylinného čaje, byly
identifikovány jako hlavní píky menthone a estragol. Při analýze suchého bylinného čaje při kombinaci teplot 80/40 °C byly identifikovány jako majoritní píky p-cymen, linalool (α-terpinolen), thymol a estragol. Při analýze suchého bylinného čaje s přídavkem roztoku soli při kombinaci teplot 80/40 °C byly identifikovány p-cymen, linalool (α-terpinolen), thymol, estragol a terpenyl acetát jako nejintenzivnější píky. Počet píků pro jednotlivé vzorky bylinných čajů jsou uvedeny v tabulce 62. Nejvyšší počet píků byl u kombinace teplot 80/40 °C. Tab. 62: Provnaní všech použitých metot z pohledu počtu píků Vzorky čajů Imunostim Zažívání Babička Růženka
70 °C 34 46 50
80/40 °C - suchý způsob 37 53 52
142
80/40 °C - mokrý způsob 42 45 42
nápoje 29 24 29
4.2.2. Analýza koření Byla provedena analýza vzorků koření (především oregano) pomocí metody HS-SPME. Vzorky koření pocházely z Itálie, České republiky a Turecka. Vzorky italského původu byly zakoupeny v běžných obchodních sítích nebo ze zahrad kolegů v okolí Turína. Vzorky oregana českého a tureckého původu byly zakoupeny v běžné obchodní síti v České republice. Nejprve byla provedena kvalitativní a kvantitativní analýza italských vzorků koření na Univerzitě v Turíně. Kvalitativní analýza byla provedena HS-SPME pomocí Kovats a van den Dool indexů s následným porovnáním těchto indexů s indexy z knihovny spekter. Pro kvantitativní analýzu thymolu a karvakrolu v oreganu byla použita metoda kalibrační přímky pomocí MHE (multi headspace extrakce). Poté byly provedany kvalitativní analýzy vzorků koření oregano zakoupených v České republice opět pomocí Kovats a van den Dool indexů a knihoven hmotnostních spekter. 4.2.2.1. Kvalitativní analýza vzorků koření italského původu Pomocí metody headspace mikroextrakce tuhou fází (HS-SPME) ve spojení s plynovou chromatografií (GC) byly stanoveny složky silic v různých vzorcích koření oregano. Také byla provedena analýza vzorku koření pomocí mikrodestilační metody. Nejprve byla proměřena řada uhlovodíků C9 - C25 pro výpočet obou typů retenčních indexů. Byla provedena analýza u 15 kapalných vzorků (viz tabulka 10), které byly rozpuštěny v cyclohexanu na koncentraci 5 mg extraktu/ml rozpouštědla. Byl dávkován 1 μl a všechny vzorky byly měřeny třikrát. V následujících tabulkách 63 - 67 jsou uvedeny identifikované sloučeny pro každý kapalný vzorek. Tabulka 63 je souhrnná pro 11 vzorků Oreganum vulgane, v tabulce 64 jsou identifikované sloučeniny pro vzorek Origanum sp. „Pizza”, v tabulce 65 pro vzorek Nepeta cataria, v tabulce 66 pro vzorek Salvia sclarea a v tabulce 67 pro vzorek Satureja hortensis.
143
Tab. 63: Identifikované sloučeniny pro kapalné vzorky Origanum vulgare L.
144
Složky silic
RIa
RIb
RIc
α-thujen α-pinen sabinen β-pinen 1-okten-3-ol β-myrcen α-terpinen p-cymen limonen eukalyptol (Z)-ocimen (E)-ocimen γ-terpinen (Z)-sabinen hydrát α-terpinolen (E)-sabinen hydrát linalool terpineol α-terpineol karvakrol methylether thymol karvakrol α-kopaen β-bourbonen β-elemen (E)-karyofylen α-humulen aromadendren D germakren bicyklo-germakren β-bisabolen δ-kadinen spathulenol karyofylen oxid
928 935 975 977 982 992 1017 1026 1030 1033 1041 1052 1061 1068 1088 1097 1100 1177 1189 1246 1294 1302 1373 1382 1390 1415 1449 1457 1478 1492 1507 1521 1574 1579
924 930 970 972 978 990 1014 1022 1026 1030 1037 1047 1056 1064 1086 1096 1100 1174 1188 1243 1293 1302 1372 1380 1389 1414 1448 1455 1477 1492 1507 1520 1572 1578
931 939 976 980 978 991 1018 1026 1031 1033 1040 1050 1062 1068 1088 1097 1098 1177 1189 1244 1290 1298 1376 1384 1391 1418 1454 1461 1480 1493 1509 1524 1576 1581
A [%] ore25 1,22 0,48 2,34 0,39 0,54 1,36 2,39 10,39 0,72 0,05 2,43 11,37 8,60 3,95 0,67 2,14 5,16 3,46 0,56 2,15 0,84 0,87 0,59 0,68 0,33 8,01 0,82 0,25 0,01 10,88 3,37 0,90 1,70 2,95
A [%] ore26 4,35 0,81 2,69 0,75 0,57 1,89 4,12 3,93 1,02 0,03 2,17 20,29 8,36 1,52 1,19 2,37 2,58 5,56 4,92 2,55 0,80 0,63 0,42 0,32 0,21 0,24 6,70 0,69 9,10 1,41 3,51 0,64 0,33 0,54
A [%] ore27 3,46 0,65 3,31 0,63 0,61 1,54 2,59 2,33 0,70 0,04 1,82 15,38 4,66 2,58 0,79 4,79 1,96 4,42 5,58 4,37 0,84 0,76 0,57 0,50 0,35 8,16 0,92 0,18 10,64 2,32 8,08 0,23 0,80 1,05
A [%] ore29 1,88 0,97 11,47 0,78 0,29 1,98 6,61 2,01 2,42 0,03 2,13 6,38 9,32 4,97 1,97 13,93 1,03 11,00 1,25 0,28 0,34 0,42 0,28 0,43 0,13 3,36 0,42 0,19 6,22 2,09 0,73 0,21 0,50 0,47
A [%] org30 2,71 0,83 13,39 0,77 0,63 1,35 3,13 0,88 1,34 0,29 2,52 10,34 4,86 7,18 1,05 10,07 5,41 5,59 0,84 0,44 0,21 0,03 0,27 0,77 0,24 6,29 0,77 0,24 10,78 2,53 1,81 0,54 0,70 0,51
A [%] ore31 2,80 0,92 15,34 0,80 0,46 1,67 4,99 1,08 2,06 0,53 2,75 9,86 746 3,85 1,58 8,62 2,74 8,48 1,02 0,98 0,20 n.i. 0,21 0,63 0,22 5,08 0,56 0,14 9,26 1,79 1,38 0,45 0,34 0,33
A [%] ore32 4,74 1,15 13,99 1,02 0,60 1,75 5,75 1,19 1,92 0,37 2,82 10,28 8,10 4,02 1,69 7,85 2,49 8,30 0,83 0,54 0,12 n.i. 0,25 0,53 0,16 4,44 0,49 0,13 8,87 1,77 1,40 0,12 0,25 0,18
A [%] ore33 0,50 0,55 15,64 0,36 0,30 1,37 2,69 1,08 1,54 0,38 4,87 5,08 4,53 2,02 0,79 6,42 2,41 4,64 0,69 0,78 0,37 0,10 0,16 0,88 0,35 12,31 0,76 0,31 16,34 3,59 3,20 0,21 1,28 0,98
A [%] ore34 0,40 0,57 13,89 0,46 0,44 1,16 3,51 0,52 1,87 0,55 3,34 5,91 5,12 2,79 1,08 7,75 1,51 5,78 0,82 0,49 0,20 0,05 0,22 0,99 0,36 11,46 0,68 0,34 17,61 2,95 2,16 1,08 1,32 0,43
n.i.-nebylo identifikováno, RIa-průměrný Kovatsův index, RIb -průměrný van den Doolův index, RIc-indexy z knihoven spekter, A – relativní plocha
A [%] ore35 0,57 0,77 17,40 0,54 0,19 2,22 7,50 1,05 3,08 0,51 3,76 5,37 10,23 1,72 2,18 7,18 0,96 11,28 1,09 0,63 0,15 <0,01 0,09 0,66 0,16 4,67 0,50 0,14 9,25 1,47 1,25 0,53 0,18 0,21
A [%] ore36 0,71 0,69 15,31 0,47 0,18 2,35 4,32 1,70 2,21 0,23 3,69 6,46 6.25 2,50 1,31 14,90 0.96 7,43 1,02 0,92 0,15 <0,03 0,09 0,79 0,84 0,22 5,28 0,79 0,21 10,17 1,28 3,87 0,54 0,61
Tab. 64: Identifikované sloučeniny pro kapalný vzorek Origanum sp. „Pizza” Složky silic CAS RIa RIb RIc A [%] α-thujen 2867-05-2 929 924 931 3,18 α-pinen 80-56-8 935 930 939 1,66 kamfen 79-92-5 949 943 953 0,55 sabinen 3378-41-5 975 970 976 0,11 β-pinen 127-91-3 977 972 980 0,39 1-okten-3-ol 3391-86-4 982 978 978 0,82 β-myrcen 123-25-3 992 990 991 3,86 α-felandren 4221-98-1 1003 1002 1005 0,49 δ-3-caren 13466-78-9 1009 1008 1011 0,20 α-terpinen 99-86-5 1017 1014 1018 2,59 p-cymen 99-87-6 1026 1022 1026 12,48 limonen 138-86-3 1030 1026 1031 0,89 (Z)-ocimen 3338-55-4 1052 1047 1040 0,07 (E)-ocimen 3779-61-1 1061 1056 1050 0,15 γ-terpenin 99-85-4 1062 1058 1062 9,19 (Z)-sabinen hydrát 15537-55-0 1068 1064 1068 0,58 α-terpinolen 69073-38-7 1088 1086 1088 0,21 (E)-sabinen hydrát 17699-16-0 1097 1097 1097 0,22 linalool 78-70-6 1100 1100 1098 0,24 borneol 507-70-0 1165 1162 1165 0,46 4-terpineol 562-74-3 1177 1174 1177 0,56 thymol 89-83-8 1294 1294 1290 0,25 karvakrol 499-75-2 1305 1304 1298 56,73 (E)-karyofylen 87-44-5 1415 1414 1418 1,98 α-humulen 6753-98-6 1450 1449 1454 0,20 β-bisabolen 495-61-4 1507 1507 1509 0,50 δ-kadinen 483-76-1 1521 1520 524 0.12 n.i.-nebylo identifikováno, RIa-průměrný Kovatsův index, RI b-průměrný van den Doolův index, RIc-indexy z knihovny spekter, A- relativní plocha
Tab. 65: Identifikované sloučeniny pro kapalný vzorek Nepeta cataria L. Složky silic α-thujen α-pinen kamfen sabinen β-pinen 1-okten-3-ol β-myrcen α-felandren α-terpinen p-cymen limonen (Z)-ocimen (E)-ocimen γ-terpinen (Z)-sabinen hydrát α-terpinolen (E)-sabinen hydrát linalool borneol 4-terpineol
CAS 2867-05-2 80-56-8 79-92-5 3378-41-5 127-91-3 3391-86-4 123-25-3 4221-98-1 99-86-5 99-87-6 138-86-3 3338-55-4 3779-61-1 99-85-4 15537-55-0 69073-38-7 17699-16-0 78-70-6 507-70-0 562-74-3
RIa 928 935 949 974 977 982 992 1004 1016 1025 1029 1042 1052 1061 1068 1088 1097 1100 1165 1177
RIb 924 930 945 971 974 980 992 1005 1016 1024 1028 1039 1050 1059 1067 1089 1100 1103 1167 1179
145
RIc 931 939 953 976 980 978 991 1005 1018 1026 1031 1040 1050 1062 1068 1088 1097 1098 1165 1177
A [%] 0,04 0,15 0,01 0,44 1,39 0,02 0,07 0,04 0,09 0,19 0,06 0,18 0,65 0,61 0,03 0,01 0,04 0,06 0,01 0,11
Složky silic CAS RIa RIb RIc A [%] thymol 89-83-8 1306 1313 1290 0,31 karvakrol 499-75-2 1318 1325 1298 1,47 nepetalakton 21651-62-7 1366 1373 1370 86,84 (E)-karyofylen 87-44-5 1417 1427 1418 4,87 α-humulen 6753-98-6 1451 1460 1454 0,32 (E)-β-farnesen 18794-84-8 1460 1469 1458 0,79 D germakren 23986-74-5 1478 1489 1480 0.03 karyofylen oxid 1139-30-6 1578 1591 1581 0,13 n.i.-nebylo identifikováno, RIa-průměrný Kovatsův index, RI b-průměrný van den Doolův index, RIc-indexy z knihovny spekter, A- relativní plocha
Tab. 66: Identifikované sloučeniny pro kapalný vzorek Salvia sclarea L. Složky silic CAS RIa RIb RIc A [%] α-pinen 80-56-8 935 930 939 0,48 kamfen 79-92-5 949 943 953 0,15 sabinen 79-92-5 974 970 976 0,10 β-pinen 3378-41-5 977 972 980 0,69 β-myrcen 123-25-3 992 990 991 2,64 limonen 138-86-3 1029 1025 1031 0,72 (Z)-ocimen 3338-55-4 1042 1037 1040 0,87 (E)-ocimen 3779-61-1 1052 1047 1050 1,64 α-terpinolen 69073-38-7 1088 1086 1086 0,46 linalool 78-70-6 1101 1101 1098 21,22 borneol 507-70-0 1165 1162 1165 0,06 4-terpineol 562-74-3 1177 1174 1177 0,04 α-terpineol 98-55-5 1189 1188 1189 3,45 nerol 106-25-2 1231 1228 1228 0,42 linalyl acetát 115-95-7 1262 1259 1257 48,21 thymol 89-83-8 1294 1294 1290 0,10 karvakrol 499-75-2 1303 1303 1298 0,24 neryl acetát 141-12-8 1368 1366 1365 0,85 α-kopaen 3856-25-5 1374 1372 1376 0,61 β-bourbonen 5208-59-3 1382 1380 1384 0,24 geranyl acetát 105-87-3 1387 1386 1383 1,78 β-elemen 515-13-9 1390 1389 1391 0,26 (E)-karyofylen 87-44-5 1415 1414 1418 1,76 D germakren 23986-74-5 1478 1475 1480 8,12 α-farnesen 502-61-4 1509 1509 1508 0,28 δ-kadinen 483-76-1 1521 1520 1524 0,13 β-eudesmol 473-15-4 1646 1644 1649 0,17 sclareol 515-03-7 2210 2210 2220 0,18 n.i.-nebylo identifikováno, RIa-průměrný Kovatsův index, RI b-průměrný van den Doolův index, RIc-indexy z knihovny spekter, A- relativní plocha
146
Tab. 67: Identifikované sloučeniny pro kapalný vzorek Satureja hortensis L. Složky silic CAS RIa RIb RIc A [%] α-thujen 2867-05-2 929 924 931 2,04 α-pinen 80-56-8 935 930 939 1,42 kamfen 79-92-5 949 943 953 0,10 sabinen 3378-41-5 974 970 976 0,16 β-pinen 127-91-3 977 972 980 0,74 1-okten-3-ol 3391-86-4 982 978 978 0,38 β-myrcen 123-25-3 992 990 991 2,62 α-felandren 4221-98-1 1003 1002 1005 0,45 α-terpinen 99-86-5 1017 1014 1018 5,96 p-cymen 99-87-6 1025 1022 1026 4,17 limonen 138-86-3 1030 1026 1031 0,71 (E)-ocimen 3779-61-1 1052 1047 1050 0,13 γ-terpinen 99-85-4 1061 1057 1062 52,47 (Z)-sabinen hydrát 15537-55-0 1068 1064 1068 0,42 α-terpinolen 69073-38-7 1088 1086 1088 0,07 (E)-sabinen hydrát 17699-16-0 1097 1096 1097 0,11 borneol 507-70-0 1165 1162 1165 0,10 4-terpineol 562-74-3 1177 1174 1177 0,34 karvakrol methylether 6379-73-3 1246 1243 1244 0,36 thymol 89-83-8 1294 1294 1290 0,09 karvakrol 499-75-2 1303 1303 1298 24,48 (E)-karyofylen 87-44-5 1415 1414 1418 1,68 β-bisabolen 495-61-4 1507 1507 1509 0,48 n.i.-nebylo identifikováno, RIa-průměrný Kovatsův index, RI b-průměrný van den Doolův index, RIc-indexy z knihovny spekter, A- relativní plocha
147
V kapalných vzorcích Origanum vulgare L. bylo identifikováno 34 sloučenin (kromě vzorku ore 31 a ore 32, zde bylo 33 sloučenin, jelikož karvakrol nebyl identifikován). K majoritním píkům patří sabinen, (E)-ocimen a D germakren. Ve vzorku Origanum sp. „Pizza” bylo identifikováno 27 sloučenin. K hlavním píkům patří karvakrol a p-cymen. Bylo identifikováno 28 sloučenin v kapalném vzorku Nepeta cataria L. Majoritní sloučenina byla nepetalakton, tato látka je typická pro rostlinu Nepeta cataria dle celé řady studií, jako je například studie R.Baranauskiena [125]. Ve vzorku Salvia sclarea L. bylo identifikováno 28 sloučenin. K hlavním píkům patřil linalyl acetát a linalool. Typická sloučenina pro tuto rostlinu je sclareol [126], který byl v tomto vzorku taktéž identifikován. V posledním vzorku, a to Saturaje hortensis L., bylo identifikováno 23 sloučenin. K nejintenzivnějším píkům patří γ-terpinen a karvakol. Dále byla provedena kvalitativní analýza silic v pevných vzorcích koření oregano (viz tabulka 11 v experimentální části) pomocí metody HS-SPME a mikrodestilací. Pro mikrodestilaci byly vybrány 3 vzorky koření (vzorek A, B a G) z důvodu velké spotřeby vzorku během destilace. Identifikované sloučeniny v těchto třech vzorcích koření jsou uvedeny v tabulce 68. Majoritní pík ve všech třech vzorcích koření je karvakrol (ve vzorku B i thymol). V tabulce 69 jsou uvedeny identifikované látky v 10 vzorcích koření oregano, jejich CAS čísla, retenční index dle Kovatse (RIa) a van den Doola (RIb) a relativní plocha příslušné sloučeniny (A [%]). K hlavním píkům patří karvakrol a thymol, což jsou typické sloučeniny pro koření oregano. Pro tyty dvě sloučeny byla dále provedena kvantitavní analýza pomocí MHE (multi-headspace extracion).
148
Tab. 68: Identifikované sloučeniny ve vzorcích koření oregano italského původu (A,B a G) pomocí destilace Složky silic CAS RIa RIb A [%] vz A A [%] vz B A [%] vz G α-thujen 2867-05-2 929 924 n.i. 0,02 0,08 α-pinen 80-56-8 932 927 n.i. 0,07 0,11 kamfen 79-92-5 950 944 n.i. n.i. 0,06 sabinen 3378-41-5 978 974 0,01 n.i. 0,04 β-pinen 18172-67-3 980 976 0,02 n.i. 0,06 1-okten-3-ol 3391-86-4 983 979 n.i. 0,14 n.i. β-myrcen 123-25-3 992 990 n.i. 0,08 0,38 α-felandren 4221-98-1 1003 1003 n.i. n.i. 0,07 δ-3caren 13466-78-9 1012 1010 0,05 0,03 0,03 α-terpinen 99-86-5 1020 1017 0,04 0,15 0,48 p-cymen 99-87-6 1028 1024 0,50 2,26 2,66 limonen 138-86-3 1032 1028 0,21 0,07 0,17 eukalyptol 470-82-6 1035 1031 0,20 0,33 0,03 γ-terpinen 99-85-4 1063 1058 0,13 0,54 2,32 (Z)-sabinen hydrát 15537-55-0 1071 1067 0,41 0,12 0,14 (E)-sabinen hydrát 17699-16-0 1099 1099 0,26 0,09 0,10 linalool 78-70-6 1102 1102 0,43 1,31 1,95 kafr 76-22-2 1146 1143 0,17 0,10 n.i. borneol 507-70-0 1168 1164 2,41 0,93 0,77 terpine-4-ol 562-74-3 1179 1176 1,38 0,54 0,52 α-terpineol 98-55-5 1192 1191 0,46 0,06 0,16 thymol methylether 1076-56-8 1237 1234 n.i. 0,18 n.i. karvakrol 6379-73-3 1247 1244 0,57 0,23 0,34 methylether thymochinon 490-91-5 1253 1250 2,79 0,04 0,14 thymol 89-83-8 1296 1296 1,34 29,26 1,56 karvakrol 499-75-2 1307 1307 67,70 59,41 84,07 α-kopaen 3856-25-5 1374 1373 0,46 0,04 0,10 β-bourbonen 5208-59-3 1382 1381 0,10 0,01 n.i. (E)-karyofylen 87-44-5 1415 1414 1,98 0,61 0,53 aromadenden 489-39-4 1435 1433 n.i. n.i. 0,05 α-humulen 6753-98-6 1450 1448 0,14 0,05 0,03 allo-aromadendren 25246-27-9 1475 1473 n.i. n.i. 0,05 β-bisabolen 495-61-4 1506 1506 7,03 0,66 0,73 δ-kadinen 483-76-1 1521 1520 0,43 0,12 0,07 karyofylen oxid 1139-30-6 1577 1576 0,10 0,76 0,46 n.i.-nebylo identifikováno, RIa-průměrný Kovatsův index, RI b-průměrný van den Doolův index, A- relativní plocha
149
Tab. 69: Identifikované sloučeniny ve vzorcích koření oregano italského původu
150
Složky silic
CAS
RIa
RIb
α-thujen α-pinen kamfen sabinen β-pinen 1-okten-3-ol β-myrcen α-felandren δ-3caren α-terpinen p-cymen β-felandren limonen eukalyptol γ-terpinen (Z)-sabinen hydrát α-terpinolen (E)-sabinen hydrát linalool kafr borneol 4-terpineol α-terpineol thymol methylether karvakrol methylether thymochinon thymol karvakrol α-kopaen β-bourbonen (E)-karyofylen aromadenden α-humulen
2867-05-2 80-56-8 79-92-5 3378-41-5 18172-67-3 3391-86-4 123-25-3 4221-98-1 13466-78-9 99-86-5 99-87-6 555-10-2 138-86-3 470-82-6 99-85-4 15537-55-0 69073-38-7 17699-16-0 78-70-6 76-22-2 507-70-0 562-74-3 98-55-5 1076-56-8 6379-73-3 490-91-5 89-83-8 499-75-2 3856-25-5 5208-59-3 87-44-5 489-39-4 6753-98-6
933 939 954 978 980 986 995 1007 1013 1020 1028 1033 1032 1035 1063 1071 1090 1099 1102 1146 1168 1179 1192 1238 1247 1253 1296 1307 1374 1382 1415 1435 1451
928 934 948 973 976 983 994 1005 1011 1017 1024 1028 1028 1031 1058 1067 1088 1099 1102 1143 1164 1177 1191 1235 1244 1250 1296 1307 1372 1381 1414 1434 1449
A [%] vz A n.i. n.i. n.i. 0,01 0,02 n.i. n.i. n.i. 0,05 0,04 0,50 n.i. 0,21 0,20 0,13 0,41 n.i. 0,26 0,43 0,17 2,41 1,38 0,46 n.i. 0,57 2,79 1,34 67,70 0,46 0,10 1,98 n.i. 0,14
A [%] vz B 0,01 0,01 n.i. 0,01 0,02 0,40 0,09 n.i. 0,07 0,05 2,35 n.i. 0,23 0,67 0,57 0,63 n.i. 0,40 4,78 0,46 2,09 1,50 0,44 1,08 1,40 0,58 24,68 39,12 0,25 0,18 4,86 n.i. 0,23
A [%] vz C 0,16 n.i. n.i. 0,40 n.i. n.i. 0,29 0,17 n.i. 0,70 1,70 0,69 n.i. n.i. 2,47 3,77 0,29 17,31 0,80 n.i. 0,69 12,11 4,82 n.i. 0,76 0,34 38,24 1,55 n.i. n.i. 1,96 n.i. 0,21
A [%] vz D 0,12 0,02 n.i. 0,40 n.i. n.i. 0,29 0,17 n.i. 0,70 1,70 0,69 n.i. n.i. 2,47 3,77 0,29 17,31 n.i. n.i. 0,69 12,11 4,82 0,76 n.i. n.i. 38,24 n.i. n.i. n.i. 1,96 n.i. 0,21
A [%] vz E n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. 4,30 n.i. n.i. n.i. 0,33 0,16 n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. 0,42 n.i. 0,21 1,52 0,99 82,55 3,57 n.i. n.i. 0,32 n.i. 0,04
A [%] vz F n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. 0,48 0,76 n.i. n.i. 0,25 0,66 8,60 80,37 n.i. n.i. 1,36 n.i. 0,19
A [%] vz G 0,06 0,08 0,03 0,02 0,04 0,06 0,42 0,07 0,09 0,23 1,89 n.i. 0,60 0,02 1,28 0,40 n.i. 0,19 5,49 n.i. 1,27 0,97 0,34 n,i. 0.59 0,84 1,53 66,37 0,10 0,12 2,55 0,47 0,12
A [%] vz H n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. 0,08 n.i. 0,06 0,04 0,03 0,06 n.i. 0,06 0,90 0,11 3,35 1,03 2,37 n.i. 0,32 1,18 39,74 39,98 0,29 n.i. 2,24 0,47 0,04
A [%] vz I n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. 0,42 n.i. 1,20 n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. 0,92 n.i. 0,41 0,18 n.i. n.i. n.i. 2,58 2,69 79,16 n.i. n.i. 0,34 n.i. n.i.
A [%] vz J n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. 0,19 0,58 n.i. 1,01 n.i. 0.98 n.i. n.i. n.i. 0,45 n.i. 0,23 n.i. n.i. n.i. n.i. 1,99 2,42 84,89 n.i. n.i. 0,57 n.i. n.i.
A [%] A [%] A [%] A [%] A [%] vz A vz B vz C vz D vz E allo-aromadendren 25246-27-9 1474 1473 n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. D germakren 23986-74-5 1477 1476 n.i. n.i. n.i. 0,20 n.i. β-bisabolen 495-61-4 1506 1506 7,03 4,08 3,17 0,08 0,79 δ-kadinen 483-76-1 1521 1520 0,43 0,50 n.i. n.i. 0,23 karyfylen oxid 1139-30-6 1577 1576 0,10 0,72 n.i. n.i. n.i. n.i.-nebylo identifikováno, RIa-průměrný Kovatsův index, RI b-průměrný van den Doolův index, A- relativní plocha Složky silic
CAS
RIa
RIb
A [%] vz F n.i. n.i. 1,59 0,57 n.i.
A [%] vz G 0,07 n.i. 5,62 0,24 0,21
A [%] vz H 0,08 n.i. 2,87 0,25 0,06
A [%] vz I n.i. n.i. 0,44 n.i. n.i.
A [%] vz J n.i. n.i. 0,32 n.i. n.i.
151
4.2.2.2. Kvantitativní analýza thymolu a karvakrolu v koření oregano italského původu Kvantitativní analýza byla provedena metodou kalibrační přímky pomocí MHE (multi headspace extrakce). MHE se provádí v několika stupních a je založena na opakované heaspace extrakci (extrakce byla 3x opakována). Touto metodou se zabývá profesor Bichci a jeho kolektiv na Univerzině v Turíně [127]. U vzorků koření oregano byly identifikovány jako majoritní sloučeniny karvakrol a thymol. Tyto těkavé látky byly ve vzorcích koření oregano v největším zastoupení. Kalibrační řady standardů karvakrolu a thymolu byly připraveny v rozsahu 250 – 10 000 ppm (tabulka 70) a to v 7 kalibračních bodech. Výsledky analýz jednotlivých vzorků jsou uvedeny v tabulce 71. Tab 70: Koncentrační rozsah, rovnice regrese a R2 pro carvacrol a thymolu Koncentrační rozsah (ppm) 250 - 10000 250 - 10000
thymol karvakrol
R2 0,9822 0,9984
rovnice regrese y = 14,64.106x + 5,85.106 y = 12,02.106x + 3,89.106
Tab 71: Zjištěné množství (μg/mg) karvakrol a thymolu ve vzorcích koření oregano Vzorek thymol*
A
B C D E F G 1,106 1,012 1,876 1,535 1,608 (3,70) (2,11) (2,46) (4,81) (5,44) 2,907 3,833 9,820 karvakrol* 3,271 (4,61) (6,12) (2,15) (1,91) * v závorkách jsou prezentovány hodnoty relativní směrodatné odchylky (RSD, n=3)
H 0,951 (7,14) 1,669 (1,82)
I
J
-
-
4,020 (2,37)
1,562 (2,71)
4.2.2.3. Kvalitativní analýza vzorků koření oregano českého a tureckého původu Pomocí metody headspace mikroextrakce tuhou fází (HS-SPME) ve spojení s plynovou chromatografií (GC) byly stanoveny složky silic ve vzorcích koření oregano. Kvalitativní analýza byla provedena pomocí retenčních indexů (Kovats a van den Dool). Nejprve byla proměřena řada uhlovodíků C8 - C22 pro výpočet obou retenčních indexů. Byla provedena analýza u 7 vzorků koření oregano zakoupených v České republice (viz tabulka 12). Z toho byly 4 vzorky českého původu a 3 vzorky původu tureckého. Bylo naváženo 500 mg vzorku koření do 15 ml vzorkovacích nádobek. V následujích tabulkách 72 a 73 jsou uvedeny identifikované sloučeniny ve vzorcích koření oregano.
152
Tab. 72: Identifikované sloučeniny ve vzorku koření oregano číslo 1,6 a 7 (turecký původ) Složky silic
CAS
RIa
RIb
RIc
VCF
NIST
A [%] VZ 1 n.i. 0,17 0,03 0,13 0,72 0,03 n.i. 0,06 0,53
A [%] VZ 6 0,81 1,07 n.i. n.i. 1,05 0,59 3,84 n.i. 0,59
A [%] VZ 7 0,14 0,17 n.i. n.i. 0,89 0,40 2,00 n.i. 0,06
α-pinen 80-56-8 941 937 948 934 939 β-myrcen 123-25-3 991 989 991 990 991 α-felandren 99-83-2 1010 1009 1007 1005 1005 α-terpinen 99-86-5 1022 1020 1018 1015 1018 p-cymen 99-87-6 1030 1027 1025 1026 1026 limonen 138-86-3 1035 1032 1030 1030 1031 eukalyptol 470-82-6 1040 1037 1032 1032 1033 β-felandren 555-10-2 1038 1035 1031 1030 1031 γ-terpinen 99-85-4 1064 1061 n.n. 1059 1062 (Z)-sabinen 15537-55-0 1076 1074 1069 1069 1068 0,13 0,10 0,15 hydrát linalool 78-70-6 1095 1095 1103 1098 1098 0,08 2,60 2,39 nonanal 124-19-6 1105 1105 1107 1103 1102 0,40 0,40 0,66 (E)-sabinen 17699-16-0 1106 1106 1099 1100 1097 0,10 n.i. n.i. hydrát borneol 507-70-0 1180 1178 n.n. 1169 1177 1,09 0,31 0,65 4-terpineol 562-74-3 1186 1185 n.n. 1178 1184 1,13 0,38 0,89 acetofenon 98-86-2 1192 1192 1188 1198 n.n. n.i. n.i. 0,18 estragol 140-67-0 1201 1201 1201 n.n.. 1195 n.i. 1,44 2,44 α-terpineol 98-55-5 1203 1204 n.n. 1190 1189 0,11 n.i. n.i. thymol 1076-56-8 1243 1241 1239 1234 1235 n.i. 6,14 0,17 methylether linalyl acetát 115-95-7 1252 1250 1250 1260 1257 1,24 0,23 0,89 thymolchinon 490-91-5 1257 1255 n.n. 1252 1252 n.i. 0,16 1,83 thymol 89-83-8 1291 1292 1293 1292 1292 2,40 1,15 5,77 karvakrol 499-75-2 1316 1315 n.n. 1299 1298 60,09 61,66 57,31 eugenol 97-53-0 1359 1358 1357 1358 1356 n.i. 0,08 0,13 α-kopaen 3856-25-5 1384 1385 1375 1376 1377 0,09 0,21 n.i. β-bourbonen 5208-59-3 1395 1394 1382 1386 1385 0,17 0,49 n.i. (E)-β-karyofylen 87-44-5 1418 1417 1413 1421 1409 2,10 0,94 0,72 (Z)-α17699-05-7 1441 1440 1416 n.n. 1436 0,42 0,10 n.i. bergamoten D germakren 23986-74-5 1486 1485 1480 1481 1480 0,23 0,21 0,26 α-bulnesen 3691-11-0 1503 1503 1505 1497 n.n. 0,28 n.i. 0,29 β-bisabolen 495-61-4 1507 1507 1508 1501 1509 19,74 3,10 13,89 δ-kadinen 483-76-1 1526 1525 1518 1521 n.n. 0,43 0,16 0,29 karyfylen oxid 1139-30-6 1597 1597 1587 1579 1589 0,75 1,04 0,41 α-muurolol 19435-97-3 1655 1654 1651 1648 1645 0,27 0,77 0,36 δ-kadinol 36564-42-8 1654 1653 1651 n.n. 1660 0,77 n.i. n.i. a b n.n.-nebylo nalezeno v dané knihovně, n.i.-nebylo identifikováno, RI -průměrný Kovatsův index, RI -průměrný van den Doolův index, RIc-indexy z knihovny spekter, VCF a NIST – online knihovny, A- relativní plocha
153
Tab. 73: Identifikace sloučenin ve vzorku koření oregano číslo 2,3,4 a 5 (český původ) Složky silic
CAS
RIa
RIb
RIc
VCF
NIST
A [%] VZ 2 n.i. 0,35 1,81 0,37 2,75 0,28 0,21 0,09 1,16
A [%] VZ 3 0,45 n.i. 0,71 0,11 1,64 0,04 n.i. n.i. 0,05 0,60
A [%] VZ 4 0,34 0,24 1,25 0,26 2,67 0,26 0,05 n.i. 0,07 1,14
A [%] VZ 5 n.i. n.i. 0,73 0,21 1,04 0,17 n.i. 0,09 0,06 0,99
1-okten-3-on 3391-86-4 979 977 973 979 979 oktan-3-on 106-68-3 986 985 986 n.i. 985 β-myrcen 123-25-3 990 988 991 990 991 α-terpinen 99-86-5 1022 1019 1018 1015 1018 p-cymen 99-87-6 1031 1028 1025 1026 1026 limonen 138-86-3 1035 1032 1030 1030 1031 β-felandren 555-10-2 1038 1034 1031 1030 1031 eukalyptol 470-82-6 1040 1037 1032 1032 1033 (E)-β-ocimen 3779-61-1 1049 1046 1046 1046 1050 γ-terpinen 99-85-4 1064 1061 n.n. 1059 1062 (Z)-sabinen 15537-55-0 1076 1074 1069 1069 n.n. n.i. 0,24 n.i. 0,14 hydrát p-cymenen 1195-32-0 1094 1093 1093 1088 1090 n.i. 0,18 0,20 0,08 linalool 78-70-6 1100 1100 1101 1098 1098 6,77 5,71 4,74 3,36 nonanal 124-19-6 1106 1105 1107 1103 1102 n.i. n.i. n.i. 0,16 borneol 507-70-0 1181 1179 n.n. 1169 1177 0,74 0,84 0,82 0,88 4-terpineol 562-74-3 1187 1186 n.n. 1178 1184 1,61 0,94 1,03 1,11 acetofenon 98-86-2 1193 1192 1188 1198 n.n. n.i. n.i. n.i. 0,11 estragol 140-67-0 1201 1201 1201 n.n. 1195 n.i. 0,24 1,15 1,35 thymol 1076-56-8 1243 1241 1239 1234 1235 1,24 0,15 0,27 0,11 methylether linalyl acetát 115-95-7 1253 1251 1250 1260 1257 0,32 0,37 0,20 0,14 thymochinon 490-91-5 1258 1256 n.n. 1252 1252 2,38 1,76 n.i. 1,91 cinnamaldehyd 104-55-2 1285 1284 1273 n.n. 1280 n.i. n.i. n.i. 0,30 thymol 89-83-8 1293 1292 1293 1292 1292 1,95 2,17 1,26 2,96 karvakrol 499-75-2 1305 1305 n.n.. 1299 1298 61,51 67,34 57,75 56,72 karvakrol acetát 6380-28-5 1369 1367 1365 1372 1371 n.i. 0,11 n.i. n.i. eugenol 97-53-0 1359 1358 1357 1358 1356 n.i. n.i. 0,09 0,15 α-kopaen 3856-25-5 1386 1385 1375 1376 1377 n.i. 0,23 0,20 0,73 β-bourbonen 5208-59-3 1395 1394 1382 1386 1385 0,14 0,19 0,16 0,13 (E)-β-karofylen 87-44-5 1434 1433 1424 1421 1409 n.i. 1,90 1,80 2,10 α-bergamoten 17699-05-7 1441 1440 1416 n.n. 1436 0,29 0,27 0,37 0,44 γ-muurolen 30021-74-0 1475 1474 1478 1475 n.n. n.i. 0,13 0,06 n.i. D germakren 23986-74-5 1486 1485 1480 1481 1480 0,15 n.i. 0,16 0,30 (E)-β55123-21-2 1493 1493 1483 n.n.. 1436 n.i. n.i. 0,10 0,12 bergamoten α-bulnesen 3691-11-0 1503 1503 1505 1497 n.n. n.i. n.i. 0,18 0,16 β-bisabolen 495-61-4 1515 1514 1508 1501 1509 10,34 9,65 15,86 18,26 δ-kadinen 483-76-1 1526 1525 1518 1521 n.n. n.i. 0,29 0,40 0,46 karyofylen oxid 1139-30-6 1599 1599 1587 1579 1589 0,94 0,80 1,23 1,37 α-muurolol 19435-97-3 1655 1654 1651 1648 1645 0,51 0,46 0,82 0,80 δ-kadinol 5937-11-1 1656 1655 1651 n.n. 1660 n.i. 0,04 n.i. n.i. n.n.-nebylo nalezeno v dané knihovně, n.n.-nebylo nalezeno v dané knihovně, n.i.-nebylo identifikováno, RIaprůměrný Kovatsův index, RIb-průměrný van den Doolův index, RIc-indexy z knihovny spekter, VCF a NIST – online knihovny, A- relativní plocha
154
Výsledný počet všech identifikovaných vzorků koření oregano je uveden v tabulce 74. Ve všech vzorcích jsou majoritní píky karvakrol a β-bisabolen. Tabl. 74: Počet všech identifikovaných vzorků koření oregano Vzorky 1 2 3 4 5 6 7
Země původu Turecko Česká republika Česká republika Česká republika Česká republika Turecko Turecko
Počet identifikovaných látek 28 23 31 31 33 27 26
4.2.2.4. Statistické vyhodnocení kvalitativní analýzy vzorků koření oregano Pro vzorky koření oregano (italského, českého a tureckého původu) bylo provedeno statistické vyhodnocení pomocí Analýzy hlavních komponent (PCA - Principal Component Analysis) (viz obrázek 65). Ze všech vzoků bylo vybráno 19 nejintenzivnějších identifikovaných sloučenin, které byly podrobeny analýze hlavních komponent. Byly náhodně vybrány tři vzorky italského původu, a tyto vytvořily jednu množinu v pravém dolním kvadrantu. Vzorky českého původu vytvořiny další množinu v levém horním kvadrantu. Poslední množinu tvoří vzorky tureckého původu. Ty vytvořily množinu v levém dolním kvadrantu.
155
Obrázek 65 PCA koření oregano italského, českého a tureckého původu Z obrázku 65 je patrné, že došlo k rozseparování jednotlivých vzorků, a to dle země původu. Vzorky z jednotlivých zemí se od sebe liší, a to pravděpodobně vlivem řady faktorů, jako jsou převším klimatické podmínky pěstování, odbdobí sklizně, způsob a podmínky skladování či balení a balící materiál. Pomocí této metody lze určit, z jaké země koření pochází, což se může využít například u kontrol falšování vzorků.
156
ZÁVĚR Tato práce se zabývala analýzou silic v rostlinném materiálu (bylinné čaje a koření) se zaměřením na mikroextrakční metody s následnou analýzou plynovou chromatografií s plamenovou ionizační, případně hmotnostní detekcí. Práce byla rozdělena do tří sekcí, kde první je zaměřena na analýzu bylinných čajů metodami SPME a SDME v módu přímého vzorkování z kapalné fáze. U obou metod byla na základě centrálně kompozitního plánu provedena optimalizace experimentálních podmínek a tyto byly porovnány s podmínkami nalezenými dle klasického příástupu OVAT. Součástí optimalizace byl rozněž i způsob přípravi bylinného čaje, přičemž provedeno bylo i senzorické hodnocení. Jako vhodné podmínky na přípravu bylinných nápojů byly zvoleny: navážka 4 g vzorku, přelito 250 ml vody o teplotě 90 °C a doba macerace 10 minut. Jako nejlépe ohodnocený čaj dle senzorické analýzy byl čaj Leros Natur – Zažívání. Optimalizované podmínky obou mikroextrakcí byly aplikovány na reálné vzorky bylinných čajů a získané výsledky byly navzájem porovnány. Stanovením bylo zjištěno, že větší množství silic bylo nalezeno za použití metody DI – SPME. Druhá část práce měla za cíl identifikovat co nejvíce těkavých, aromatických sloučenin v bylinných směsích metodou HS-SPME. Byly optimalizovány podmínky pro vzorkování HS-SPME s využitím dvou sorpčních teplot. Na základě vyhodnocení celkových ploch píků a celkového počtu píků byly vybrány teploty 80 °C a 40 °C po celkovou dobu extrakce 25 minut. HS-SPME využívající dvou teplot ukázala lepší schopnost sorpce méně těkavých a zároveň více těkavých látek v jednom kroku, než u postupu využívající pouze jednu teplotu. Kromě toho HS-SPME využívající dvou sorpčních teplot nevyžaduje složité postupy a může být použita na širokou škálu vzorků. Poslední část se zabývala analýzou těkavých složek v koření, a to především v oreganu, s využitím headspace mikroextrakce tuhou fází. Byla realizována jak kvalitativní, tak kvantitativní analýza koření. Kvantitativní analýza byla provedena u vzorků oregana italského původu na univeverzitě Turín. Pomocí multi-headspace mikroextrakce bylo určeno množství nejvíce thymol a karvakrol, tj. majoritních složek silic. Kvalitativní analýza byla provedena pomocí retenčních indexů (Kovats a van den Dool) a porovnáním s knihovnami hmotnostních spekter u vzorků koření českého, italského a tureckého původu. Následně bylo provedeno statistické vyhodnocení, kdy se za pomocí analýzy hlavních komponend podařilo jednotlivé vzorky rozdělit do skupin dle půdovu. Pomocí tohoto vyhodnocení lze tedy určit, o jaký vzorek se jedná, což se může využít například u testování flašování vzorků.
157
LITERATURA [1] V. Kinclová, A. Jarošová, B. Tremlová, Senzorická analýza potravin, Veterinářství, (2004). [2] J. Pokorný, H. Valentová, Z. Panovská, Senzorická analýza potravin, VŠCHT, Praha, (1999). [3] N. Sako, S. Harada, T. Yamamoto, Physiology and Behavior 7, (2000), pp. 193. [4] J. Velíšek, Chemie potravin 2, OSSIS, Tábor, (1999). [5] Předpis č. 110/1997 Sb.Zákon o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů. (2011), Sbírka zákonu České republiky. [6] H. Taylor, J. Andrew, Modifying Flavour in Food, Woodhead Publishing (2007). [7] F. Yu, R. Utsumi, Cellular and Molecular Life Sciences, 3043, (2009). [8] G. Reineccius, Flavor Chemistry and Technology, CRC Press - Taylor and Francis, (2006). [9]
, staženo 9.10.2014. [10] I. Bulánková, Léčivé rostliny na naší zahradě, Grada Publishing a.s., Praha, (2005). [11] H. Ye, J. Ji, C. Deng, N. Yao, N. Li, X. Zhang, Chromatographia, 591, (2006), pp. 63. [12] , staženo 15.10.2014. [13] S. Burt, International Journal of Food Microbiology, 223, (2004), pp. 94. [14] C.F. Bagmboula, M. Uyttendaele, J. Debevere, Food Microbiology, 21, (2004), pp. 33. [15] J. Pokorný, N. Yanishlieva, M. Gordon, Woodhead Publishing Ltd, (2001). [16] J. Hubík, J. Dušek, J. Spilková, Š. J., Obecná farmakognosie II., Státní pedagogické nakladatelství, Praha, (1989). [17] , staženo 16.10.2014. [18] , staženo 16.10.2014. [19] ČSN ISO 6571: Stanovení obsahu těkavých olejů (silic), Praha. (1995), Český normalizační institut. [20] H. McGee´s, On food and cooking, Scribner, New York, (2004). [21] P. Kadlec (Ed.), Technologie potravin II., VŠCHT, Praha, (2002). [22] D.A. Balentine, Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley, USA, (2000). [23] J.M. Hodgson, Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 17, (2008), pp. 288. [24] M. Pössl, Čaj jako životní styl, Grada Publishing, a.s., Praha, (2010). [25] D. Komes, D. Horžić, A. Belščak, G. Kovačević, I. Vulić, Food Research International, 43, (2010), pp. 167.
158
[26] L.-F. Wang, J.-Y. Lee, J.-O. Chung, J.-H. Baik, S. So, S.-K. Park, Food Chemistry, 109, (2008), pp. 196. [27] R. Rawat, A. Gulati, G.D. Kiran Babu, R. Acharya, V.K. Kaul, B. Singh, Food Chemistry, 105, (2007), pp. 229. [28] R. Ravichandran, R. Parthiban, Food Chemistry, 62, (1998), pp. 347. [29] P. Pripdeevech, T. Machan, Food Chemistry, 125, (2011), pp. 797. [30] J.A.B. Baptista, J.F.d.P. Tavares, R.C.B. Carvalho, Food Research International, 31, (1998), pp. 729. [31] M. Zhu, E. Li, H. He, Chromatographia, 68, (2008), pp. 603. [32] R. Zamora, E. Gallardo, F.J. Hidalgo, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, (2008), pp. 7970. [33] B. Vanderhaegen, F. Delvaux, L. Daenen, H. Verachtert, F.R. Delvaux, Food Chemistry, 103, (2007), pp. 404. [34] V. Grešík, Léčivé rostliny, jejich vlastnosti, účinky a použití 2 - Evropa, Praha, (2013). [35] H. Xu, Z. Ding, L. Lili, D. Song, Y. Feng, Analytica Chimica Acta, 636, (2009), pp. 28. [36] M.A. Jeannot, F.F. Cantwell, Analytical Chemistry, 68, (1996), pp. 2236. [37] M.A. Jeannot, F.F. Cantwell, Analytical Chemistry, 69, (1997), pp. 235. [38] E. Zhao, L. Han, S. Juany, Q. Wang, Z. Zhou, Journal of Chromatography A, 1114, (2006), pp. 269. [39] K. Riddelová, Habilitační práce, Vysoká škola chemicko-technologická Praha, (2008). [40] T. Horák, J. Čulík, M. Jurková, P. Čejka, V. Kellner, J. Dvořák, D. Hašková, Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva, Praha, (2010). [41] D.A. Lambropoulou, T.A. Albanis, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70, (2007), pp. 195. [42] E. Psillakis, N. Kalogerakis, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 21, (2002), pp. 54. [43] F.F. Cantwell, M. Losier, Sampling and Sample Preparation for Field and Laboratory, Amsterdam, (2002). [44] L. Theis, A.J. Waldack, S.M. Hansen, M.A. Jeannot, Analytical Chemistry, 73, (2001), pp. 5651. [45] C. Stalikas, J. Pak, Pakistan, Journal of Analytical & Environmental Chemistry, 1, (2007), pp. 72. [46] M. Gupta, A. Jain, K.K. Verma, Talanta 71, (2007), pp. 1039. [47] Y. He, H.K. Lee, Analytical Chemistry, 69, (1997), pp. 4634. 159
[48] M. Asensio-Ramos, L.M. Ravelo-Pérez, M.A. Gonzáles-Curbelo, Journal of Chromatography A, 1280, (2011), pp. 7415. [49] A. Rodríguez, S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, C. Nerín, Journal of Chromatography A, 1198, (2008), pp. 38. [50] K. Ridgway, S.P.D. Lalljie, R.M. Smith, Journal of Chromatography A, 1153, (2007), pp. 36. [51] J. Romero, P. López, C. Rubio, R. Batlle, C. Nerín, Journal of Chromatography A, 1166, (2007), pp. 24. [52] L. Xu, C. Basheer, H.K. Lee, Journal of Chromatography A, 1152, (2007), pp. 184. [53] M.A. Jeannot, A. Przyjazny, J.M. Kokosa, Journal of Chromatography A, 1217, (2010), pp. 2326. [54] M. Hakkarainen, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70, (2007), pp. 229. [55] M. Rezaee, Y. Assadi, M.R.M. Hosseini, E. Aghaee, F. Ahmadi, S. Berijani, Journal of Chromatography A, 1116, (2006), pp. 1. [56] L. Xu, C. Basheer, H.K. Lee, Journal of Chromatography A, 1216, (2009), pp. 701. [57] M.A. Farajzadeh, M. Bahman, J.A. Jónsson, Analytica Chimica Acta, 591, (2007), pp. 69. [58] D. Nagaraju, S.D. Huang, Journal of Chromatography A, 1116, (2007), pp. 89. [59] M.B. Melwanki, M.R. Fuh, Journal of Chromatography A, 1207, (2008), pp. 24. [60] S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, Analytical Chemistry, 71, (1999), pp. 2650. [61] A. Sarafraz-Yazdi, A. Amiri, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 29, (2010), pp. 1. [62] J. Lee, H.K. Lee, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Analytica Chimica Acta, 624, (2008), pp. 253. [63] Y. Zhai, S. Sun, Z. Wang, Y. Zhang, H. Liu, Y. Sun, H. Zhang, A. Yu, Journal of Separation Science, 34, (2011), pp. 1069. [64] J. Jiao, D.-H. Ma, Q.-Y. Gai, W. Wang, M. Luo, Y.-J. Fu, W. Ma, Analytica Chimica Acta, 804, (2013), pp. 143. [65] S. Moinfar, M.-R.M. Hosseini, Journal of Hazardous Materials, 169, (2009), pp. 907. [66] C.L. Arthur, J. Pawliszyn, Analytical Chemistry, 62, (1990), pp. 2145. [67] C.L. Arthur, L.M. Killam, S. Motlagh, L. Lim, D.W. Potter, J. Pawliszyn, Environmental Science & Technology, 26, (1992), pp. 979. [68] J. Pawliszyn, B. Pawliszyn, M. Pawliszyn, Journal of Chemical Education, 2, (1997), pp. 1. [69] Y. Luo, J. Pawliszyn, Extraction methods in organic analysis Sheffield Academic Press, Sheffield, (1999). [70] Z. Zhang, M.J. Yang, J. Pawliszyn, Analytical Chemistry, 66, (1994), pp. 844. 160
[71] J. Pawliszyn, Solid Phase Microextraction: Theory and Practice, Wiley–VCh, New York, (1997). [72] D. Procházková, Chemické Listy, 96, (2002), pp. 827. [73] C. Sigma-Aldrich, Supelco Bulletin 928 - Solid Phase Microextraction Troubleshooting Guide, (2001). [74] Z. Mester, R. Sturgeon, J. Pawliszyn, Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 56, (2011), pp. 233. [75] J. Chen, J. Pawliszyn, Analytical Chemistry, 67, (1995), pp. 2530. [76] C. Sigma-Aldrich, Supelco Bulletin 923 - Solid Phase Microextraction: Theory and Optimization of Conditions, (1998). [77] , staženo 4.3.2015. [78] W. Zhao, Solid phase microextraction in aqueous sample analysis (2008). [79] , staženo 4.3.2015. [80] Z.Y. Zhao, J. Pawliszan, Analytical Chemistry, 67, (1995), pp. 34. [81] R. Jiang, S. Carasek, E. Risticevic, J. Cudjoe, J. Warren, J. Pawliszyn, Analytica Chimica Acta, 742, (2012), pp. 22. [82] S.H. Haddadi, J. Pawliszyn, Journal of chromatography A,1216, (2009), pp. 2783. [83] H.C. Menezes, B.P. Paulo, N.T. Costa, Z.L. Cardeal, Microchemical Journal, 109, (2013), pp. 93. [84] E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers, Journal of Microcolumn Separations, 11, (1999), pp. 737. [85] , staženo 4.3.2015. [86] M.J.M. Wells, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry John Wiley & Sons, New Jersey (2003). [87] , staženo 4.3.2015. [88] B. Tienpont, F. David, A. Stopforth, P. Sandra, LC GC Europe, 16, (2003), pp. 5. [89] E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers, Journal of Microcolumn Separations,11, (1999), pp. 737. [90] M. Abdel-Rehim, Journal of Chromatography B, 801, (2004), pp. 317. [91] M. Abdel-Rehim, Z. Altun, B. L., Journal of Mass Spectrometry, 39, (2004), pp. 1488.
161
[92] A. El-Beqqalia, A. Kussaka, M. Abdel-Rehim, Journal of Chromatography A, 1114, (2006), pp. 234. [93] Q. Shen, W. Dong, Y. Wang, L. Gong, Z. Dai, C. H., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, (2013), pp. 136. [94] G. Zhu, X. He, X. Li, S. Wang, Y. Luo, B. Yuan, Y. Feng, Journal of Chromatography A., (2013), pp. 23. [95] , staženo 5.3.2015. [96] , staženo 5.3.2015. [97] , staženo 5.3.2015. [98] , staženo 5.3.2015. [99] J. Lin, Z. Zhang, Q. Pan, H.R. Xu, Y.P. Luo, X.C. Wang, Food Chemistry, 141, (2013), pp. 259. [100] I. Tontul, M. Torun, C. Dincer, H. Sahin-Nadeem, A. Topuz, T. Turna, F. Ozdemir, Food Research International 53 (2013), pp. 744. [101] B. Sgorbini, C. Cagliero, C. Cordero, E. Liberto, P. Rubiolo, M.R. Ruosi, C. Bicchi, Journal of Chromatography A, 1265, (2012), pp. 39. [102] M. Adam, P. Pavlíková, A. Čížková, P. Bajerová, K. Ventura, Food Chemistry, 135, (2012), pp. 1613. [103] B.d.A. Zellner, C. Bicchi, P. Dugo, P. Rubiolo, G. Dugo, L. Mondello, Flavour and Fragrance Journal, 23, (2008), pp. 297. [104] F. Bianchi, M. Careri, A. Mangia, M. Musci, Journal of Separation Science, 30, (2007), pp. 563. [105] , staženo 9.3.2015. [106] I. Miller, Co to je statisticky navržený experiment?, http://www.interquality.cz/INTERNÍKURZY/DOEInterquality/tabid/79/Default.aspx, staženo 9.3.2015 [107] D.L.E. Massart, Chemometrics: A Textbook, Elsevier, Amsterdam, (1988). [108] K. Štrausová, P. Dolejš, Pitná voda 2010, Sborník konference (Kalousková N., Dolejš P.), str. 95. W&ET Team, České Budějovice (Tábor 17. - 20. 5. 2010).
162
[109] I.D. Froment, ANTEC 1998 Plastics: Plastics on My Mind, , Sborník výroční odborné konference Společnosti plastických inženýrů (Society of Plastics Engineers) svazek 1, str. 1055, (Atlanta 26. - 30. 4. 1998). [110] E. Klimešová, J. Tošenovský, CHEMagazín 6, (2011), pp. 6. [111] R. Brereton, Applied Chemometrics for Scientists, John Wiley & Sons, Chichester (2007). [112] P. Pošík, Statistika - Navrhování a analýza experimentů, StatSoft, (2014). [113] R. Brereton, Chemometrics: Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant, John Wiley & Sons, Chichester (2003). [114] D.C. Montgomery, John Wiley & Sons (2009). [115] R. Novotný, Řízení technologických procesů, VUT Brno, Brno, (2005). [116] , staženo 19.3.2015 [117] , staženo 19.3.2015 [118] M.D. Baslos, E.Y. Ishimoto, M.O. Marques, A.F. Ferri, E.A.F. Torres, Journal of Food Composition and Analysis, 19, (2006). [119] M. Adam, P. Dobiáš, P. Pavlíková, K. Ventura, Central European Journal of Chemistry, 7, (2009), pp. 303. [120] L.H. Fang, M.L. Qi, T. Li, Q.L. Shao, R.N. Fu, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, (2006), pp. 791. [121] C. Bicchi, S. Drigo, P. Rubiolo, Chromatography A, 892, (2000), pp. 469. [122] S. Gul, B. Demirci, K.H.C. Baser, H.A. Akpulat, P. Aksu, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 88, (2012), pp. 666. [123] C.L. Silva, J.S. Camara, Food Research International 51, (2013), pp. 378. [124] S. Kpoviessi, J. Bero, P. Agbani, F. Gbaguidi, B. Kpadonou-Kpoviessi, B. Sinsin, G. Accrombessi, M. Frederich, M. Moudachirou, J. Quetin-Leclercq, Journal of Ethnopharmacology, 151, (2014), pp. 652. [125] R. Baranauskiene, R.P. Venskutonis, J.C.R. Demyttenaere, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, (2003), pp. 3840. [126] J.-C. Caissard, T. Olivier, C. Delbecque, S. Palle, P.-P. Garry, A. Audran, N. Valot, S. Moja, F. Nicolé, J.-L. Magnard, S. Legrand, S. Baudino, F. Jullien, PLoS One, 7, (2012). [127] B. Sgorbini, C. Bicchi, C. Cagliero, C. Cordero, E. Liberto, P. Rubiolo, Journal of Chromatography A, 1376, (2015), pp. 9.
163
PŘÍLOHY
164
Příloha I: Kalibrační křivky Příloha Ia: Kalibrace standardů silic pomocí mikroextrakce jednou kapkou v módu přímého vzorkování analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Ia 1): Kalibrační křivka eukalyptolu a mentholu 8000 y = 201,20x + 83,49 R2 = 0,9974
plocha [mV.s]
7000 6000 5000 4000 3000
y = 135,45x + 165,40 R2 = 0,9962
2000 1000 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
koncentrace [μg/ml] eukalyptol
menthol
Ia 2): Kalibrační křivka menthonu a karvakrolu 6000 y = 300,68x - 80,86 R2 = 0,9975
plocha [mV.s]
5000 4000 3000 2000
y = 285,90x + 31,54 R2 = 0,9993
1000 0 0
2
4
6
koncentrace [μg/ml] menthon
karvakrol
165
8
10
Ia 3): Kalibrační křivka borneolu a kafru 3000 y = 251,54x + 49,00 R2 = 0,9970
plocha [mV.s]
2500 2000 1500 1000
y = 176,22x + 16,60 R2 = 0,9954
500 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
koncentrace [μg/ml] kafr kampfor
borneol
Ia 4): Kalibrační křivka limonenu a thymolu 3500
plocha [mV.s]
3000 y = 348,74x - 31,98 R2 = 0,9985
2500 2000 1500
y = 170,75x + 10,16 R2 = 0,9999
1000 500 0 0
2
4
6
8
10
koncentrace [μg/ml] limonen
thymol
Ia 5): Kalibrační křivka nerolu a cineolu 200 y = 289,70x + 8,89 R2 = 0,9979
plocha [mV.s]
160 120
y = 220,14x + 16,44 R2 = 0,9905
80 40 0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
koncentrace [μg/ml] nerol
cineol
166
0,5
0,6
0,7
Příloha Ib: Kalibrace standardů silic pomocí mikroextrakce jednou kapkou v módu přímého
vzorkování
s použitím
vnitřního
standardu
analyzovaných
plynovou
chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem
poměr výšek píků
Ib 1): Kalibrační křivky eukalyptolu a mentholu 14 12 10 8 6 4 2 0
y = 0,709x + 0,57 R² = 0,9927 y =1,221x - 0,37 R² = 0,9930
0
2
4
6
8
10
12
14
16
poměr koncentrací Eukalyptol
Menthol
Ib 2): Kalibrační křivky linaloolu a thujonu poměr výšek píků
4 y = 1,262x - 0,17 R² = 0,9968
3
y = 1,423x - 0,05 R² = 0,9981
2 1 0 0
1
2
3
4
5
poměr koncentrací Linalool
Thujon
Ib 3): Kalibrační křivky borneolu a thymolu poměr výšek píků
5 y = 0,757x + 0,14 R² = 0,9910
4 3 2
y = 1,474x + 0,20 R² = 0,9924
1 0 0
0,5 Borneol
1 Thymol
1,5
2
2,5
poměr koncentrací
167
3
3,5
4
4,5
5
Ib 4): Kalibrační křivky limonenu a kafru
poměr výšek píků
y=1,314x – 0,20 R2 = 0,9966
y=2,613x – 0,17 R2= 0,9912
Kafr Karf
Ib 5): Kalibrační křivky karvakrolu a cinamaldehydu
poměr výšek píků
y=1,334x+0,66 R2=9844 y=1,600x+0,41 R2=0,9912
Ib 6): Kalibrační křivka menthonu poměr výšek píků
10 8 y = 0,723x - 0,07 R² = 0,9902
6 4 2 0 0
2
4
6
poměr koncentrací
168
8
10
Příloha Ic: Kalibrace standardů silic metodou mikroextrakce tuhou fází s použitím vnitřního standardu analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Ic 1): Kalibrační křivky eukalyptolu a mentholu poměr výšek píků
14 12 10 8 6 4 2 0
y = 0,7997x - 0,0118 R² = 0,9988 y = 0,193x + 0,0748 R² = 0,9996
0
2
4
6
8
10
12
14
16
poměr koncentrací Eukalyptol
Menthol
Ic 2): Kalibrační křivky linaloolu a thujonu poměr výšek píků
4 y = 0,8089x + 0,0879 R² = 0,9952
3 2
y = 0,3897x + 0,0308 R² = 0,9992
1 0 0
1 Linalool
2
3
4
5
poměr koncentrací
Thujon
poměr výšek píků
Ic 3): Kalibrační křivky kafru a thymolu 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
y = 0,7455x + 0,0861 R² = 0,9993
y = 0,1457x + 0,0192 R² = 0,9999
0
1 Kafr Kamfor
Thymol
2
3
poměr koncentrací
169
4
5
poměr výšek píků
Ic 4): Kalibrační křivky limonenu a karvakrolu
8 7 6 5 4 3 2 1 0
y = 1,5039x + 0,0954 R² = 0,9931
0
1 Limonen
2
Karvakrol
3
y = 0,6184x + 0,0961 R² = 0,9934
4
5
poměr koncentrací
Ic 5): Kalibrační křivky cinamaldehydu a borneolu
poměr výšek píků
3 y = 0,4773x + 0,1159 R² = 0,9945
2 1
y = 0,2315x + 0,0279 R² = 0,9992
0 0
1 Cinamaldehyd
2 Borneol
3
4
5
poměr koncentrací
Ic 6): Kalibrační křivky menthonu
poměr výšek píků
10 8 6
y = 1,0523x - 0,017 R² = 0,9998
4 2 0 0
2
4
6
poměr koncentrací
170
8
10
Příloha Id: Kalibrace standardů silic metodou mikroextrakce tuhou fází analyzovaných plynovou chromatografií s hmotnostním spektrometrem Id 1): Kalibrační křivky 1,4-cineolu a nerolu
Id 2): Kalibrační křivky mentholu a eukalyptolu
171
Id 3): Kalibrační křivky menthonu a borneolu
Id 4): Kalibrační křivky karvakrolu a limonenu
Id 5): Kalibrační křivky thymolu a kafru
172
Příloha IIa: Opakovatelnost pomocí mikroextrakce jednou kapkou analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Tab. IIa – 1: Opakovatelnost v rámci jednoho dne (intra-day)
Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol + borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 0,92 18,20 138,54 4,11 8,49 117,98 17,73 46,41 196,83 183,02 224,01 548,73 99,42 21,45 227,02 33,16 61,55 331,59 2,10 6,34 149,83 91,87 62,88 270,13 2,45 22,34 173,348
Koncentrace 4,710 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,104 ng/ml 0,066 μg/ml 0,532 μg/ml 4,724 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,631 ng/ml 0,074 μg/ml 0,594 μg/ml 4,700 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml (4,700 + 4,404) ng/ml (0,076 + 0,075) μg/ml (0,610 + 0,602) μg/ml 4,702 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,528 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml 4,514 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml
* píky příslušných standardů nebyly při této koncentraci rozděleny
173
RSD (%) 10,81 0,71 2,09 6,97 11,36 3,27 9,21 2,43 1,95 1,62 3,14 4,28 1,62 7,72 1,29 3,18 2,40 2,22 6,36 2,43 4,44 2,77 12,71 0,40 8,15 1,97 1,92
Tab. IIa – 2: Opakovatelnost v rámci jednoho týdne (inter-day) Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol + borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 1,40 16,17 180,77 1,60 14,80 98,654 12,41 21,49 151,08 87,64 162,11 463,53 77,17 12,91 216,31 7,68 46,41 275,56 6,55 5,44 142,09 126,11 62,88 302,98 3,61 21,35 241,59
Koncentrace 4,742 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,100 ng/ml 0,066 μg/ml 0,532 μg/ml 4,741 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,627 ng/ml 0,074 μg/ml 0,594 μg/ml 4,743 ng(ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml (4,044 + 4,124) ng/ml (0,076 + 0,075) μg/ml (0,610 + 0,602) μg/ml 4,587 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,528 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml 4,142 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml
* píky příslušných standardů nebyly při této koncentraci rozděleny
174
RSD (%) 12,54 3,75 3,62 10,52 5,87 10,32 12,32 13,27 7,27 4,41 5,94 6,07 4,42 10,42 2,94 2,97 4,20 1,72 14,96 9,81 6,59 1,95 12,72 4,50 6,25 1,55 6,93
Příloha IIb: Opakovatelnost pomocí mikroextrakce tuhou fází analyzovaných plynovou chromatografií s hmotnostím detektorem Tab. IIb - 1: Opakovatelnost v rámci jednoho dne (intra-day) Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol
borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 118,3 1441,3 10342 496,7 1724,0 15141 139,0 438,3 1971,7 4316,3 5438,7 7110,0 26581,3 35966,0 46578,7 15750,0 20890,0 22626,7 12701,7 17335,3 21256,0 1119,3 2844,7 7063,3 1973,7 9777,3 71410,3 561,7 5808,7 81003,7
Koncentrace 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,108 ng/ml 0,017 μg/ml 0,141 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,238 ng/ml 0,019 μg/ml 0,158 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,271 ng/ml 0,020 μg/ml 0,162 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 5,021 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml
* počítáno pro plochy píků
175
RSD* (%) 3,1 15,3 9,9 3,6 14,5 8,5 2,1 4,2 6,5 5,6 6,4 7,3 7,6 6,9 8,9 1,1 9,7 4,9 2,5 8,3 8,8 7,6 1,3 3,1 3,9 3,3 12,5 1,7 13,8 11,9
Tab. IIb - 2: Opakovatelnost v rámci jednoho týdne (inter-day) Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol
borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 188,3 2648,6 14799,8 372,5 2828,3 26175,8 178,3 678,5 2193,3 1688,3 3608,3 10400,0 22217,5 24242,0 66278,0 16676,8 17207,8 27538,8 11869,0 15790,3 27944,5 669,8 5098,0 7689,8 4632,5 15541,0 98498,0 824,5 7977,0 111865,0
Koncentrace 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,108 ng/ml 0,017 μg/ml 0,141 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,238 ng/ml 0,019 μg/ml 0,158 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,271 ng/ml 0,020 μg/ml 0,162 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 5,021 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml
* počítáno pro plochy píků
176
RSD* (%) 14,1 11,8 13,5 7,9 15,4 15,3 13,3 9,5 15,2 15,2 8,8 10,9 11,9 10,6 12,1 13,9 15,2 14,8 14,0 13,9 13,3 11,8 10,6 15,4 7,2 14,5 10,7 15,5 13,7 11,9
Příloha III.: Chromatogramy bylinných čajů získané metodou DI - SPME a DI - SDME Obr. III. 1a: Čaj Sedmero bylin s echinaceou metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – thymol, 6 - karvakrol
Obr. III 1b: Čaj Sedmero bylin s echinaceou metodou DI – SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – thymol, 6 - karvakrol
Obr. III. 2a: Čaj Sedmero bylin metodou DI - SPME 1 – linalool, 2 – kafr, 3 – menthol, 4 – cinamaldehyd
177
Obr. III. 2b: Čaj Sedmero bylin metodou DI - SDME 1 – linalool, 2 – kafr, 3 – menthol, 4 – cinamaldehyd
Obr. III. 3a: Čaj Spánek a nervy metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – karvakrol
Obr. III. 3b: Čaj Spánek a nervy metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol
178
Obr. III. 4a: Čaj Štíhlá linie metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
Obr. III. 4b: Čaj Štíhlá linie metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
Obr. III. 5a: Čaj Zažívání metodou DI – SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
179
Obr. III. 5b: Čaj Zažívání metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
Obr. III. 6a: Čaj Imunostim metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – α-thujon, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – thymol
Obr. III. 6b: Čaj Imunostim metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – α-thujon, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 - thymol
180
Obr. III. 7a: Čaj Devatero bylin – Dobrou noc metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – karvakrol
Obr. III. 7b: Čaj Devatero bylin – Dobrou noc metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – karvakrol
Obr. III. 8a: Čaj Herbal Alps metodou DI - SPME 1 – limonen, 2 – eukalyptol, 3 – linalool, 4 – menthon, 5 – borneol, 6 - menthol
181
Obr. III. 8b: Čaj Herbal Alps metodou DI - SDME 1 – limonen, 2 – eukalyptol, 3 – linalool, 4 – menthon, 5 – borneol, 6 - menthol
Obr. III. 9a: Čaj Fresh Mint metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthon
Obr. III. 9b: Čaj Fresh Mint metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthon
182
Obr. III. 10a: Čaj Urologická bylinná směs metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – thymol
Obr. III. 10b: Čaj Urologická bylinná směs metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – thymol
183
Příloha IV.: Aromaprofily bylinných čajů při 70 °C Obr. IV. 1a: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Štíhlá line č. šarže 02112011 02112014 PNY 09/02/04 (seznam sloučenin v tabulce 48)
Obr. IV. 1b: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Štíhlá line č. šarže 09121012-09122015 PNY 09/02/04 (seznam sloučenin v tabulce 48)
Obr. IV. 2a: Aromaprofil vzorku čaje Babička Růženka sedmero bylin šarže 01 2015 L09011330B (seznam sloučenin v tabulce 49)
184
Obr. IV. 2b: Aromaprofil vzorku čaje Babička Růženka sedmero bylin šarže 11 2013 L25111130B (seznam sloučenin v tabulce 49)
Obr. IV. 3a: Aromaprofil vzorku čaje Imunostimin č. šarže 250311/050411 (seznam sloučenin v tabulce 50)
Obr. IV. 3b: Aromaprofil vzorku čaje Imunostimin č. šarže 070911/071011 (seznam sloučenin v tabulce 50)
185
Obr. IV. 4a: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Zažívání č. šarže 22102012 22102014 (seznam sloučenin v tabulce 51)
Obr. IV. 4b: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Zažívání č. šarže 02112011 02112013 (seznam sloučenin v tabulce 51)
186
Příloha V.: Analýza bylinných čajů s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – suchý způsob Obr. V. 1: Chromatogram vzorku Imunostim při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 52)
Obr. V. 2: Chromatogram vzorku Zažívání při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 53)
Obr. V. 3: Chromatogram vzorku Babička Růženka s echinaceou při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 54)
187
Příloha VI.: Analýza bylinných čajů s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – mokrý způsob Obr. VI. 1: Chromatogram vzorku Imunostim při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 56)
Obr. VI. 2: Chromatogram vzorku Zažívání při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 57)
Obr. VI. 3: Chromatogram vzorku Babička Růženka s echinaceou při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 58)
188
Příloha VII.: Headspace mikroextrakce tuhou fází nápojů pro 2 sorpční teploty Obr. VII. 1: Chromatogram vzorku Imunostim při kombinaci 80/ 40 °C (seznam sloučenin v tabulce 59)
Obr. VII. 2: Chromatogram vzorku Zažívání při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 60)
Obr. VII. 3: Chromatogram vzorku Babička Růženka s echinaceou při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 61)
189
Publikace v mezinárodních odborných časopisech
Martin Adam, Petra Pavlíková, Andrea Čížková, Petra Bajerová, Karel Ventura: Microextraction by packed sorbent (MEPS) as a suitable selective method for Lascorbic acid determination in beverages. Food Chemistry 135, 1613–1618, (2012).
Martin Adam, Andrea Čížková, Aleš Eisner, Karel Ventura: Solid-phase microextraction based method for determination in herbal beverages. Journal Separation Science, 36, 764-772, (2013). Publikace v domácích odborných časopisech
Aleš Eisner, Silvie Surmová, Martin Adam, Petra Bajerová, Tomáš Bajer, Andrea Čížková, Daniel Kremr, Karel Ventura: Vodík jako alternativa helia v plynové chromatografii, Časopis CHEMAGAZÍN, vol. 3 XXIV, str. 25, (2014).
Stáž
Univerzita Turín, Itálie, prof. Carlo Bicchi, délka pobytu 3 měsíce – od 18. 9. 2013 do 20. 12. 2014. Přednášky prezentované na mezinárodních a domácích konferencích a seminářích
Andrea Čížková, Petra Pavlíková, Martin Adam, Karel Ventura, Aplikace metody mikroextrakce jednou kapkou pro stanovení složek silic v nápojích, Luka nad Jihlavou, Sborník str. 13-20, (20. - 22.9. 2011).
Martin Adam, Petra Pavlíková, Andrea Čížková, Aleš Eisner, Karel Ventura, Evaluation and application of solid-phase microextraction method for analysis of essential oils in herbal tea infusions, 5 International Symposium on Recent advances in food analysis, Praha, Sborník str. 198, (14.11.2011).
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Analýza silic v nápojích s využitím metody mikroextrakcetuhou fází, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 33, (17. - 19.4. 2012).
190
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Analysis of essential oils in beverages using single-drop microextraction technique, Yisac, Nova Gorice, Slovinsko, Sborník str. 1., (27. - 29.6.2012)
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Single-drop Microextraction Method Application to Essential Oils Analysis in Real Samples of Herbal Tea, 8th International Students Conference „Modern Analytical Chemistry“, Praha, Sborník str. 19, (24. 25.9. 2012).
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Analýza syntetických potravinářských barviv s využitím metody QuEChERS, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 21, (10. 12.4. 2013).
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, The analysis of essential oils in herbal tea by means of single – drop and solid – phase microextraction methods and their comparison, Yisac 2013, Maribor, Slovinsko, Sborník str. 3, (26. - 29.3. 2013).
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Analýza těkavých složek oregana s využitím metod mikroextrakce tuhou fází a mikrodestilace, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 19, (9. - 11. 4. 2014).
Silvie Surmová, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Nosné plyny v plynové chromatografii s hmotnostní detekcí, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 87, (9. - 11. 4. 2014).
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Analýza syntetických potravinářských barviv s využitím metody QuEChERS, Studentská vědecká konference Ostrava, Sborník str. 5, (6. 5. 2014).
Silvie Surmová, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Gas chromatographic methods for analysis of perfumes, YISAC 2014, Universita of Pardubice, The Czech Republic, Sborník str. 44, (25. - 28. 6. 2014).
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová Karel Ventura, Analysis of essential oils in herbal teas by means of dispersive liquid – liquid microextraction method, YISAC 2014, Universita of Pardubice, The Czech Republic, Sborník str. 41, (25. - 28. 6. 2014).
Karolína Adámková, Daniel Kremr, Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Stanovení těkavých látek u vzorků ječného a pšeničného sladu, Studentská Vědecká Odborná Činnost 2013/2014, Univerzita Pardubice, Sborník str. 1, (11. 6. 2014).
191
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Dispersive Liquid – Liquid microextraction method application to essential oils analysis in real samples of herbal beverages, 10th International Students Conference ”Modern Analytical Chemistry” Charles University in Prague, Faculty of Science, The Czech Republic, Sborník, (22. – 23. 2014).
Silvie Surmová, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Analysis of perfumes by using multidimensional gas chromatography, 10th International Students Conference ”Modern Analytical Chemistry” Charles University in Prague, Faculty of Science, The Czech Republic, Sborník, (22. – 23. 2014).
Andrea Čížková Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Mikroextrakce tuhou fází v módu headspace aplikovaná na vzorky oregan, Ovčárna pod Pradědem, Sborník, (8. – 10. 4. 2015). Plakátová sdělení prezentovaná na mezinárodních a domácích vědeckých konferencích
Martin Adam, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Petra Pavlíková, Karel Ventura, Evaluation of various quantification methods for analysis of essential oils in herbal infusions by single-drop microextraction method. 29th International Symposium on Chromatography (29th ISC), Toruń, Polsko, (9. - 13. 9. 2012).
Karel Ventura, Petra Bajerová, Martin Adam, Andrea Čížková, Analysis of essential oils components in herbal beverages by means of single-drop microextraction evaluation of various quantification methods. 14th International Symposium on Advances in Extraction Technologies - ExTech 2012, Messina, Itálie, (24. - 26. 9. 2012).
Martin Adam, Petr Česla, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Development and evaluation of QuEChERS-based extraction and HPLC method for quantifying of synthetic food dyes in confectionery samples, 39th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC 2013, Amsterdam, Nizozemí, (16. - 20. 6. 2013).
Karel Ventura, Petra Bajerová, Martin Adam, Andrea Čížková, Analysis of synthetic food dyes in confectionery samples by modified QuEChERS extraction method, 15th International Symposium on Advances in Extraction Technologies - ExTech® 2013, João Pessoa, Brazílie, (4. - 7. 8. 2013). 192
Martin Adam, Tomáš Bajer, Andrea Čížková, Daniel Kremr, Aleš Eisner, Petra Bajerová, Karel Ventura, Screening of Volatile Compounds in Herbal Teas by HSSPME/GC-MS Using Two Temperatures in the Same Extraction Procedure, ExTech 2014, Chania Crete, Greece, Sborník str. 128, (25. - 28.3.5. 2014
193
PŘÍLOHY
194
Příloha I: Kalibrační křivky Příloha Ia: Kalibrace standardů silic pomocí mikroextrakce jednou kapkou v módu přímého vzorkování analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Ia 1): Kalibrační křivka eukalyptolu a mentholu 8000 y = 201,20x + 83,49 R2 = 0,9974
plocha [mV.s]
7000 6000 5000 4000 3000
y = 135,45x + 165,40 R2 = 0,9962
2000 1000 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
koncentrace [μg/ml] eukalyptol
menthol
Ia 2): Kalibrační křivka menthonu a karvakrolu 6000 y = 300,68x - 80,86 R2 = 0,9975
plocha [mV.s]
5000 4000 3000 2000
y = 285,90x + 31,54 R2 = 0,9993
1000 0 0
2
4
6
koncentrace [μg/ml] menthon
karvakrol
195
8
10
Ia 3): Kalibrační křivka borneolu a kafru 3000 y = 251,54x + 49,00 R2 = 0,9970
plocha [mV.s]
2500 2000 1500 1000
y = 176,22x + 16,60 R2 = 0,9954
500 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
koncentrace [μg/ml] kafr kampfor
borneol
Ia 4): Kalibrační křivka limonenu a thymolu 3500
plocha [mV.s]
3000 y = 348,74x - 31,98 R2 = 0,9985
2500 2000 1500
y = 170,75x + 10,16 R2 = 0,9999
1000 500 0 0
2
4
6
8
10
koncentrace [μg/ml] limonen
thymol
Ia 5): Kalibrační křivka nerolu a cineolu 200 y = 289,70x + 8,89 R2 = 0,9979
plocha [mV.s]
160 120
y = 220,14x + 16,44 R2 = 0,9905
80 40 0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
koncentrace [μg/ml] nerol
cineol
196
0,5
0,6
0,7
Příloha Ib: Kalibrace standardů silic pomocí mikroextrakce jednou kapkou v módu přímého
vzorkování
s použitím
vnitřního
standardu
analyzovaných
plynovou
chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem
poměr výšek píků
Ib 1): Kalibrační křivky eukalyptolu a mentholu 14 12 10 8 6 4 2 0
y = 0,193x + 0,0748 R² = 0,9996 y = 0,7997x - 0,0118 R² = 0,9988
0
2
4
6
8
10
12
14
16
poměr koncentrací Eukalyptol
Menthol
Ib 2): Kalibrační křivky linaloolu a thujonu poměr výšek píků
4 y = 0,8089x + 0,0879 R² = 0,9952
3
y = 0,3897x + 0,0308 R² = 0,9992
2 1 0 0
1
2
3
4
5
poměr koncentrací Linalool
Thujon
Ib 3): Kalibrační křivky borneolu a thymolu poměr výšek píků
5 y = 0,1457x + 0,0192 R² = 0,9999
4 3 2
y = 0,7455x + 0,0861 R² = 0,9993
1 0 0
0,5 Borneol
1 Thymol
1,5
2
2,5
poměr koncentrací
197
3
3,5
4
4,5
5
Ib 4): Kalibrační křivky limonenu a kafru
poměr výšek
4
y = 0,6184x + 0,0961 R² = 0,9934
3 2
y = 1,5039x + 0,0954 R² = 0,9931
1 0 0 Limonen
1 Kafr Kamfor
2
3
4
5
poměr koncentrací
poměr výšek píků
Ib 5): Kalibrační křivky karvakrolu a cinamaldehydu
Ib 6): Kalibrační křivka menthonu poměr výšek píků
10 8 y = 1,0523x - 0,017 R² = 0,9998
6 4 2 0 0
2
4
6
poměr koncentrací
198
8
10
Příloha Ic: Kalibrace standardů silic metodou mikroextrakce tuhou fází s použitím vnitřního standardu analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Ic 1): Kalibrační křivky eukalyptolu a mentholu poměr výšek píků
14 12 10 8 6 4 2 0
y = 0,7997x - 0,0118 R² = 0,9988 y = 0,193x + 0,0748 R² = 0,9996
0
2
4
6
8
10
12
14
16
poměr koncentrací Eukalyptol
Menthol
Ic 2): Kalibrační křivky linaloolu a thujonu poměr výšek píků
4 y = 0,8089x + 0,0879 R² = 0,9952
3 2
y = 0,3897x + 0,0308 R² = 0,9992
1 0 0
1 Linalool
2
3
4
5
poměr koncentrací
Thujon
poměr výšek píků
Ic 3): Kalibrační křivky kafru a thymolu 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
y = 0,7455x + 0,0861 R² = 0,9993
y = 0,1457x + 0,0192 R² = 0,9999
0
1 Kafr Kamfor
Thymol
2
3
poměr koncentrací
199
4
5
poměr výšek píků
Ic 4): Kalibrační křivky limonenu a karvakrolu
8 7 6 5 4 3 2 1 0
y = 1,5039x + 0,0954 R² = 0,9931
0
1 Limonen
2
Karvakrol
3
y = 0,6184x + 0,0961 R² = 0,9934
4
5
poměr koncentrací
Ic 5): Kalibrační křivky cinamaldehydu a borneolu
poměr výšek píků
3 y = 0,4773x + 0,1159 R² = 0,9945
2 1
y = 0,2315x + 0,0279 R² = 0,9992
0 0
1 Cinamaldehyd
2 Borneol
3
4
5
poměr koncentrací
Ic 6): Kalibrační křivky menthonu
poměr výšek píků
10 8 6
y = 1,0523x - 0,017 R² = 0,9998
4 2 0 0
2
4
6
poměr koncentrací
200
8
10
Příloha Id: Kalibrace standardů silic metodou mikroextrakce tuhou fází analyzovaných plynovou chromatografií s hmotnostním spektrometrem Id 1): Kalibrační křivky 1,4-cineolu a nerolu
Id 2): Kalibrační křivky mentholu a eukalyptolu
201
Id 3): Kalibrační křivky menthonu a borneolu
Id 4): Kalibrační křivky karvakrolu a limonenu
Id 5): Kalibrační křivky thymolu a kafru
202
Příloha IIa: Opakovatelnost pomocí mikroextrakce jednou kapkou analyzovaných plynovou chromatografií s plamenovým ionizačním detektorem Tab. IIa – 1: Opakovatelnost v rámci jednoho dne (intra-day)
Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol + borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 0,92 18,20 138,54 4,11 8,49 117,98 17,73 46,41 196,83 183,02 224,01 548,73 99,42 21,45 227,02 33,16 61,55 331,59 2,10 6,34 149,83 91,87 62,88 270,13 2,45 22,34 173,348
Koncentrace 4,710 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,104 ng/ml 0,066 μg/ml 0,532 μg/ml 4,724 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,631 ng/ml 0,074 μg/ml 0,594 μg/ml 4,700 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml (4,700 + 4,404) ng/ml (0,076 + 0,075) μg/ml (0,610 + 0,602) μg/ml 4,702 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,528 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml 4,514 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml
* píky příslušných standardů nebyly při této koncentraci rozděleny
203
RSD (%) 10,81 0,71 2,09 6,97 11,36 3,27 9,21 2,43 1,95 1,62 3,14 4,28 1,62 7,72 1,29 3,18 2,40 2,22 6,36 2,43 4,44 2,77 12,71 0,40 8,15 1,97 1,92
Tab. IIa – 2: Opakovatelnost v rámci jednoho týdne (inter-day) Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol + borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 1,40 16,17 180,77 1,60 14,80 98,654 12,41 21,49 151,08 87,64 162,11 463,53 77,17 12,91 216,31 7,68 46,41 275,56 6,55 5,44 142,09 126,11 62,88 302,98 3,61 21,35 241,59
Koncentrace 4,742 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,100 ng/ml 0,066 μg/ml 0,532 μg/ml 4,741 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,627 ng/ml 0,074 μg/ml 0,594 μg/ml 4,743 ng(ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml (4,044 + 4,124) ng/ml (0,076 + 0,075) μg/ml (0,610 + 0,602) μg/ml 4,587 ng/ml 0,075 μg/ml 0,602 μg/ml 4,528 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml 4,142 ng/ml 0,073 μg/ml 0,586 μg/ml
* píky příslušných standardů nebyly při této koncentraci rozděleny
204
RSD (%) 12,54 3,75 3,62 10,52 5,87 10,32 12,32 13,27 7,27 4,41 5,94 6,07 4,42 10,42 2,94 2,97 4,20 1,72 14,96 9,81 6,59 1,95 12,72 4,50 6,25 1,55 6,93
Příloha IIb: Opakovatelnost pomocí mikroextrakce tuhou fází analyzovaných plynovou chromatografií s hmotnostím detektorem Tab. IIb - 1: Opakovatelnost v rámci jednoho dne (intra-day) Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol
borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 118,3 1441,3 10342 496,7 1724,0 15141 139,0 438,3 1971,7 4316,3 5438,7 7110,0 26581,3 35966,0 46578,7 15750,0 20890,0 22626,7 12701,7 17335,3 21256,0 1119,3 2844,7 7063,3 1973,7 9777,3 71410,3 561,7 5808,7 81003,7
Koncentrace 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,108 ng/ml 0,017 μg/ml 0,141 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,238 ng/ml 0,019 μg/ml 0,158 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,271 ng/ml 0,020 μg/ml 0,162 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 5,021 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml
* počítáno pro plochy píků
205
RSD* (%) 3,1 15,3 9,9 3,6 14,5 8,5 2,1 4,2 6,5 5,6 6,4 7,3 7,6 6,9 8,9 1,1 9,7 4,9 2,5 8,3 8,8 7,6 1,3 3,1 3,9 3,3 12,5 1,7 13,8 11,9
Tab. IIb - 2: Opakovatelnost v rámci jednoho týdne (inter-day) Standard 1,4-cineol
limonen
eukalyptol
kafr
menthon
menthol
borneol
nerol
thymol
karvakrol
Plocha píku 188,3 2648,6 14799,8 372,5 2828,3 26175,8 178,3 678,5 2193,3 1688,3 3608,3 10400,0 22217,5 24242,0 66278,0 16676,8 17207,8 27538,8 11869,0 15790,3 27944,5 669,8 5098,0 7689,8 4632,5 15541,0 98498,0 824,5 7977,0 111865,0
Koncentrace 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,108 ng/ml 0,017 μg/ml 0,141 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,238 ng/ml 0,019 μg/ml 0,158 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,271 ng/ml 0,020 μg/ml 0,162 μg/ml 1,255 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 5,021 ng/ml 0,020 μg/ml 0,160 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml 1,222 ng/ml 0,019 μg/ml 0,156 μg/ml
* počítáno pro plochy píků
206
RSD* (%) 14,1 11,8 13,5 7,9 15,4 15,3 13,3 9,5 15,2 15,2 8,8 10,9 11,9 10,6 12,1 13,9 15,2 14,8 14,0 13,9 13,3 11,8 10,6 15,4 7,2 14,5 10,7 15,5 13,7 11,9
Příloha III.: Chromatogramy bylinných čajů získané metodou DI - SPME a DI - SDME Obr. III. 1a: Čaj Sedmero bylin s echinaceou metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – thymol, 6 - karvakrol
Obr. III 1b: Čaj Sedmero bylin s echinaceou metodou DI – SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – thymol, 6 - karvakrol
Obr. III. 2a: Čaj Sedmero bylin metodou DI - SPME 1 – linalool, 2 – kafr, 3 – menthol, 4 – cinamaldehyd
207
Obr. III. 2b: Čaj Sedmero bylin metodou DI - SDME 1 – linalool, 2 – kafr, 3 – menthol, 4 – cinamaldehyd
Obr. III. 3a: Čaj Spánek a nervy metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – karvakrol
Obr. III. 3b: Čaj Spánek a nervy metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol
208
Obr. III. 4a: Čaj Štíhlá linie metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
Obr. III. 4b: Čaj Štíhlá linie metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
Obr. III. 5a: Čaj Zažívání metodou DI – SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
209
Obr. III. 5b: Čaj Zažívání metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthol, 6 – thymol
Obr. III. 6a: Čaj Imunostim metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – α-thujon, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – thymol
Obr. III. 6b: Čaj Imunostim metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – α-thujon, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 - thymol
210
Obr. III. 7a: Čaj Devatero bylin – Dobrou noc metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – karvakrol
Obr. III. 7b: Čaj Devatero bylin – Dobrou noc metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – kafr, 4 – menthol, 5 – karvakrol
Obr. III. 8a: Čaj Herbal Alps metodou DI - SPME 1 – limonen, 2 – eukalyptol, 3 – linalool, 4 – menthon, 5 – borneol, 6 - menthol
211
Obr. III. 8b: Čaj Herbal Alps metodou DI - SDME 1 – limonen, 2 – eukalyptol, 3 – linalool, 4 – menthon, 5 – borneol, 6 - menthol
Obr. III. 9a: Čaj Fresh Mint metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthon
Obr. III. 9b: Čaj Fresh Mint metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – menthon
212
Obr. III. 10a: Čaj Urologická bylinná směs metodou DI - SPME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – thymol
Obr. III. 10b: Čaj Urologická bylinná směs metodou DI - SDME 1 – eukalyptol, 2 – linalool, 3 – menthon, 4 – borneol, 5 – thymol
213
Příloha IV.: Aromaprofily bylinných čajů při 70 °C Obr. IV. 1a: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Štíhlá line č. šarže 02112011 02112014 PNY 09/02/04 (seznam sloučenin v tabulce 48)
Obr. IV. 1b: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Štíhlá line č. šarže 09121012-09122015 PNY 09/02/04 (seznam sloučenin v tabulce 48)
Obr. IV. 2a: Aromaprofil vzorku čaje Babička Růženka sedmero bylin šarže 01 2015 L09011330B (seznam sloučenin v tabulce 49)
214
Obr. IV. 2b: Aromaprofil vzorku čaje Babička Růženka sedmero bylin šarže 11 2013 L25111130B (seznam sloučenin v tabulce 49)
Obr. IV. 3a: Aromaprofil vzorku čaje Imunostimin č. šarže 250311/050411 (seznam sloučenin v tabulce 50)
Obr. IV. 3b: Aromaprofil vzorku čaje Imunostimin č. šarže 070911/071011 (seznam sloučenin v tabulce 50)
215
Obr. IV. 4a: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Zažívání č. šarže 22102012 22102014 (seznam sloučenin v tabulce 51)
Obr. IV. 4b: Aromaprofil vzorku čaje Leros natur Zažívání č. šarže 02112011 02112013 (seznam sloučenin v tabulce 51)
216
Příloha V.: Analýza bylinných čajů s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – suchý způsob Obr. V. 1: Chromatogram vzorku Imunostim při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 52)
Obr. V. 2: Chromatogram vzorku Zažívání při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 53)
Obr. V. 3: Chromatogram vzorku Babička Růženka s echinaceou při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 54)
217
Příloha VI.: Analýza bylinných čajů s využitím mikroextrakce pro 2 teploty – mokrý způsob Obr. VI. 1: Chromatogram vzorku Imunostim při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 56)
Obr. VI. 2: Chromatogram vzorku Zažívání při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 57)
Obr. VI. 3: Chromatogram vzorku Babička Růženka s echinaceou při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 58)
218
Příloha VII.: Headspace mikroextrakce tuhou fází nápojů pro 2 sorpční teploty Obr. VII. 1: Chromatogram vzorku Imunostim při kombinaci 80/ 40 °C (seznam sloučenin v tabulce 59)
Obr. VII. 2: Chromatogram vzorku Zažívání při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 60)
Obr. VII. 3: Chromatogram vzorku Babička Růženka s echinaceou při kombinaci 80/40 °C (seznam sloučenin v tabulce 61)
219
Publikace v mezinárodních odborných časopisech
Martin Adam, Petra Pavlíková, Andrea Čížková, Petra Bajerová, Karel Ventura: Microextraction by packed sorbent (MEPS) as a suitable selective method for Lascorbic acid determination in beverages. Food Chemistry 135, 1613–1618, (2012).
Martin Adam, Andrea Čížková, Aleš Eisner, Karel Ventura: Solid-phase microextraction based method for determination in herbal beverages. Journal Separation Science, 36, 764-772, (2013). Publikace v domácích odborných časopisech
Aleš Eisner, Silvie Surmová, Martin Adam, Petra Bajerová, Tomáš Bajer, Andrea Čížková, Daniel Kremr, Karel Ventura: Vodík jako alternativa helia v plynové chromatografii, Časopis CHEMAGAZÍN, vol. 3 XXIV, str. 25, (2014).
Stáž
Univerzita Turín, Itálie, prof. Carlo Bicchi, délka pobytu 3 měsíce – od 18. 9. 2013 do 20. 12. 2014. Přednášky prezentované na mezinárodních a domácích konferencích a seminářích
Andrea Čížková, Petra Pavlíková, Martin Adam, Karel Ventura, Aplikace metody mikroextrakce jednou kapkou pro stanovení složek silic v nápojích, Luka nad Jihlavou, Sborník str. 13-20, (20. - 22.9. 2011).
Martin Adam, Petra Pavlíková, Andrea Čížková, Aleš Eisner, Karel Ventura, Evaluation and application of solid-phase microextraction method for analysis of essential oils in herbal tea infusions, 5 International Symposium on Recent advances in food analysis, Praha, Sborník str. 198, (14.11.2011).
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Analýza silic v nápojích s využitím metody mikroextrakcetuhou fází, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 33, (17. - 19.4. 2012).
220
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Analysis of essential oils in beverages using single-drop microextraction technique, Yisac, Nova Gorice, Slovinsko, Sborník str. 1., (27. - 29.6.2012)
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Single-drop Microextraction Method Application to Essential Oils Analysis in Real Samples of Herbal Tea, 8th International Students Conference „Modern Analytical Chemistry“, Praha, Sborník str. 19, (24. 25.9. 2012).
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Analýza syntetických potravinářských barviv s využitím metody QuEChERS, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 21, (10. 12.4. 2013).
Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, The analysis of essential oils in herbal tea by means of single – drop and solid – phase microextraction methods and their comparison, Yisac 2013, Maribor, Slovinsko, Sborník str. 3, (26. - 29.3. 2013).
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Analýza těkavých složek oregana s využitím metod mikroextrakce tuhou fází a mikrodestilace, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 19, (9. - 11. 4. 2014).
Silvie Surmová, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Nosné plyny v plynové chromatografii s hmotnostní detekcí, Ovčárna pod Pradědem, Sborník str. 87, (9. - 11. 4. 2014).
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Analýza syntetických potravinářských barviv s využitím metody QuEChERS, Studentská vědecká konference Ostrava, Sborník str. 5, (6. 5. 2014).
Silvie Surmová, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Gas chromatographic methods for analysis of perfumes, YISAC 2014, Universita of Pardubice, The Czech Republic, Sborník str. 44, (25. - 28. 6. 2014).
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová Karel Ventura, Analysis of essential oils in herbal teas by means of dispersive liquid – liquid microextraction method, YISAC 2014, Universita of Pardubice, The Czech Republic, Sborník str. 41, (25. - 28. 6. 2014).
Karolína Adámková, Daniel Kremr, Andrea Čížková, Martin Adam, Karel Ventura, Stanovení těkavých látek u vzorků ječného a pšeničného sladu, Studentská Vědecká Odborná Činnost 2013/2014, Univerzita Pardubice, Sborník str. 1, (11. 6. 2014).
221
Andrea Čížková, Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Dispersive Liquid – Liquid microextraction method application to essential oils analysis in real samples of herbal beverages, 10th International Students Conference ”Modern Analytical Chemistry” Charles University in Prague, Faculty of Science, The Czech Republic, Sborník, (22. – 23. 2014).
Silvie Surmová, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Analysis of perfumes by using multidimensional gas chromatography, 10th International Students Conference ”Modern Analytical Chemistry” Charles University in Prague, Faculty of Science, The Czech Republic, Sborník, (22. – 23. 2014).
Andrea Čížková Martin Adam, Silvie Surmová, Karel Ventura, Mikroextrakce tuhou fází v módu headspace aplikovaná na vzorky oregan, Ovčárna pod Pradědem, Sborník, (8. – 10. 4. 2015). Plakátová sdělení prezentovaná na mezinárodních a domácích vědeckých konferencích
Martin Adam, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Petra Pavlíková, Karel Ventura, Evaluation of various quantification methods for analysis of essential oils in herbal infusions by single-drop microextraction method. 29th International Symposium on Chromatography (29th ISC), Toruń, Polsko, (9. - 13. 9. 2012).
Karel Ventura, Petra Bajerová, Martin Adam, Andrea Čížková, Analysis of essential oils components in herbal beverages by means of single-drop microextraction evaluation of various quantification methods. 14th International Symposium on Advances in Extraction Technologies - ExTech 2012, Messina, Itálie, (24. - 26. 9. 2012).
Martin Adam, Petr Česla, Aleš Eisner, Andrea Čížková, Karel Ventura, Development and evaluation of QuEChERS-based extraction and HPLC method for quantifying of synthetic food dyes in confectionery samples, 39th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC 2013, Amsterdam, Nizozemí, (16. - 20. 6. 2013).
Karel Ventura, Petra Bajerová, Martin Adam, Andrea Čížková, Analysis of synthetic food dyes in confectionery samples by modified QuEChERS extraction method, 15th International Symposium on Advances in Extraction Technologies - ExTech® 2013, João Pessoa, Brazílie, (4. - 7. 8. 2013). 222
Martin Adam, Tomáš Bajer, Andrea Čížková, Daniel Kremr, Aleš Eisner, Petra Bajerová, Karel Ventura, Screening of Volatile Compounds in Herbal Teas by HSSPME/GC-MS Using Two Temperatures in the Same Extraction Procedure, ExTech 2014, Chania Crete, Greece, Sborník str. 128, (25. - 28.3.5. 2014).
223
