UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ
DISERTAČNÍ PRÁCE
2015
Mgr. Jana Srbová
Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie
Biofunkcionalizace moderních materiálů pro afinitní separace a biokatalýzu
Disertační práce
Autor práce: Mgr. Jana Srbová (roz. Kučerová) Školitel: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph. D. Školitel specialista: Mgr. Marcela Slováková, Ph.D.
2015
Prohlašují: Tuto práci jsem vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, zejména se skutečností, že Univerzita Pardubice má právo na uzavření licenční smlouvy o užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona, a s tím, že pokud dojde k užití této práce mnou nebo bude poskytnuta licence o užití jinému subjektu, je Univerzita Pardubice oprávněna ode mne požadovat přiměřený příspěvek na úhradu nákladů, které na vytvoření díla vynaložila, a to podle okolností až do jejich skutečné výše.
Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v Univerzitní knihovně.
V Pardubicích dne 16. září 2015
….……………………. Mgr. Jana Srbová
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala oběma svým vedoucím disertační práce, prof. RNDr. Zuzaně Bílkové, Ph.D. a Mgr. Marcele Slovákové, Ph.D., za cenné rady, nápady, nadšení a pomoc při studiu. Dále bych chtěla poděkovat celé skupině imunochemie a všem ostatním kolegům za vytvoření přátelské atmosféry a příjemného pracovního prostředí. Velký dík patří rovněž projektovým partnerům, ať už z Ústavu makromolekulární chemie v Praze nebo z pařížského Institutu Curie. V neposlední řadě děkuji své rodině za dlouhodobou podporu při studiu a pochopení.
Anotace Disertační práce se zabývá biofunkcionalizací vybraných materiálů (nanovlákna a magnetické částice) bioaktivními ligandy a polymery. Takto modifikované nosiče pak byly použity pro různé aplikace – např. hojení ran, separaci cirkulujících nádorových buněk a selektivní záchyt bakterií rodu Salmonella z mléka. Klíčová slova Biofunkcionalizace; imobilizace; bioafinitní separace; biokatalýza; magnetické částice; nanovlákna; mikrofluidika Title Biofunctionalization of Modern Materials for Affinity Separations and Biocatalysis Annotation This dissertation deals with biofunctionalization of chosen materials (nanofibers and magnetic particles) with bioactive ligands and polymers. Such modified carriers were subsequently applied for different purposes – wound healing, separation of circulating tumour cells and selective immunocapturing of Salmonella from milk. Keywords Biofunctionalization; immobilization; bioaffinity separation; biocatalysis; magnetic particles; nanofibers; microfluidics
SOUHRN
Tato disertační práce se zabývá biofunkcionalizací vybraných moderních materiálů (nanovlákna a magnetické částice) pro účely bioafinitních separací v mikrofluidním uspořádání nebo pro podporu hojení ran nosičem s imobilizovanými proteolytickými enzymy. V první části práce je popsána biofunkcionalizace nově připravených magnetických částic proteolytickým enzymem trypsinem. Vazba trypsinu byla optimalizována a byla stanovena skladovací i operační stabilita bioaktivního nosiče. Enzym trypsin v tomto případě sloužil jako modelový biokatalyticky aktivní ligand, jehož přítomnost a aktivitu lze snadno monitorovat pomocí reakce s nízkomolekulárním chromogenním substrátem. Dále byl enzym vázán
trypsin
na
nanovlákna
připravená
metodou
elektrospinningu,
která
se po biofunkcionalizaci stala výchozím materiálem pro nový typ bioaktivního krytu ran vhodného pro proteolytické štěpení nekrotické tkáně a debridementu v ráně. Druhá část práce se zabývala povrchovou modifikací magnetických mikročástic polymerem poly(ethylenglykolem) (PEG). Tento inertní polymer zvyšuje biokompatibilitu nosiče a snižuje nespecifickou adsorpci proteinů a buněk na jeho povrch, zároveň i snižuje adhezi
částic
na
vnitřní
stěny
mikrofluidních
čipů.
Je-li
navíc
použit
derivát
poly(ethylenglykolu) s vhodnými terminálními skupinami, je možné ho využít jako tzv. „raménko“ pro imobilizaci bioaktivních látek. Magnetické částice byly PEGylovány a poté biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami. Tento nosič byl použit pro imunomagnetický záchyt EpCAM-pozitivních buněčných linií (modelový systém pro cirkulující nádorové buňky) v mikrofluidním uspořádání. Dosažená účinnost záchytu buněk byla porovnávána s analogickým komerčně dostupným nosičem. Poslední
část
práce
byla
směřována
k vývoji
specifického
imunosorbentu
pro mikrofluidní záchyt modelového mikroorganismu, Salmonella Typhimurium, v mléčných výrobcích. Pro přípravu nosiče byly vybrány vhodné magnetické částice i protilátky. Po vazbě protilátek byla ve vsádkovém uspořádání ověřena schopnost nosiče selektivně a účinně separovat
cílové
bakterie
z mléka.
Následně
byla
optimalizována
technika
imunomagnetického záchytu v mikrofluidním čipu – magneticky stabilizovaném fluidním loži.
SUMMARY
This Ph.D. thesis deals with the biofunctionalization of selected modern materials (nanofibers and magnetic microspheres) for the purposes of bioaffinity separations in microfluidic systems or the promotion of wound healing using a carrier with immobilized proteolytic enzymes. In the first part of the thesis the magnetic microspheres were biofunctionalized with proteolytic enzyme trypsin. Method for trypsin immobilization was optimized, and storage as well as operational stabilities of the prepared bioactive carrier were monitored. Here the enzyme trypsin served as a model biocatalytic ligand whose presence and activity can be easily followed by reaction with a low molecular-weight chromogenic substrate. Enzyme trypsin was also immobilized on the electrospun nanofibers with the aim to prepare a new type of bioactive wound dressing for enhanced proteolytic cleavage of necrotic tissue, i.e. enzymatic wound debridement. The second part of the thesis deals with the surface modification of magnetic microspheres with the inert polymer poly(ethylene glycol) (PEG). Generally PEG increases the biocompatibility of carriers and decreases the nonspecific adsorption of proteins and cells. At the same time, it reduces the carrier´s adhesion on the inner walls of microfluidic chips. Moreover when a PEG derivative with suitable terminal groups is immobilized it can be also utilized as a spacer for subsequent binding of bioactive ligands. Here magnetic microspheres were PEGylated and biofunctionalized with specific anti-EpCAM antibodies. The carrier was applied for microfluidic immunomagnetic separation of EpCAM-positive cell lines (model system for circulating tumour cells). The capture efficiency of cells was compared with the results achieved with the analogous commercial carrier. The last part of this thesis was intended to the development of specific immunosorbent for microfluidic immunocapture of a model microorganism, Salmonella Typhimurium, in dairy products. Both magnetic particles and the anti-Salmonella antibodies were thoroughly selected. After antibodies´ immobilization the selectivity and the efficiency of the carrier were tested in milk. Finally, this technique was adapted to microfluidic chip – magnetically stabilized fluidized bed.
OBSAH SOUHRN .................................................................................................................................... 5 SUMMARY ............................................................................................................................... 6 OBSAH....................................................................................................................................... 7 SEZNAM ZKRATEK ................................................................................................................ 9 1.
ÚVOD................................................................................................................................ 11
2.
TEORETICKÁ ČÁST ....................................................................................................... 12 2.1. Bioafinitní chromatografie ....................................................................................... 12 2.2
Ligandy pro bioafinitní chromatografii.................................................................... 15
2.3
Nosiče pro bioafinitní chromatografii ...................................................................... 17
2.3.1 Magnetické mikročástice a nanočástice ............................................................. 18 2.3.2 Nanovlákna ......................................................................................................... 22 2.4
Povrchová modifikace nosičů .................................................................................. 26
2.4.1 Modifikace nosičů s cílem zavést vhodné chemické skupiny pro vazbu ligandů............................................................................................................... 26 2.4.2 Modifikace nosičů s cílem zlepšit jejich povrchové vlastnosti .......................... 27 2.4.3 Víceúčelová modifikace nosičů polymery ......................................................... 27 2.5
Biofunkcionalizace nosičů ....................................................................................... 30
2.5.1 Nekovalentní techniky imobilizace ligandů ....................................................... 31 2.5.2 Kovalentní techniky imobilizace ligandů ........................................................... 32 2.6
Vsádkové a průtokové systémy pro bioafinitní interakce ........................................ 37
2.6.1 Bioafinitní nosiče v mikrofluidních systémech .................................................. 39 2.6.2 Specifika mikrofluidních systémů pro buněčné aplikace ................................... 44 3
SEZNAM LITERATURY................................................................................................. 46
4
CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE............................................................................................ 62
5
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST, VÝSLEDKY A DISKUZE ............................................... 64
5.1
Biofunkcionalizace magnetických mikročástic a nanovláken proteolytickým enzymem trypsinem ................................................................................................. 64
5.1.1 Článek I .............................................................................................................. 66 5.1.2 Rukopis (manuskript) I ....................................................................................... 76 5.1.3 Užitný vzor ......................................................................................................... 95 5.2
Modifikace magnetických částice poly(ethylenglykolem) a anti-EpCAM protilátkami pro mikrofluidní separaci EpCAM pozitivních buněk ...................... 104
5.2.1 Článek II ........................................................................................................... 105 5.2.2 Článek III .......................................................................................................... 114 5.3
Vývoj nosiče pro imunomagnetickou separaci salmonel v mikrofluidním čipu ......................................................................................................................... 122
5.3.1 Rukopis (manuskript) II ................................................................................... 123 5.3.2 Rukopis (manuskript) III .................................................................................. 125 6
ZÁVĚR ............................................................................................................................ 146
7
PŘEHLED PUBLIKAČNÍCH VÝSTUPŮ ..................................................................... 149
SEZNAM ZKRATEK AFM
mikroskopie atomárních sil (z angl. atomic force microscopy)
APTS
γ-aminopropyltriethoxysilan
BApNA
N-α-benzoyl-D,L-arginine-4-nitroanilid
BET
Brunauer-Emmet-Teller analýza
CDI
N, N´- karbonyldiimidazol (z angl. N, N´- carbonyldiimidazole)
CnBr
kyanbromid (z angl. cyanogen bromide)
COC
kopolymer cyklického olefinu (z angl. cyclic olefin copolymer)
CTC
cirkulující nádorové buňky (z angl. circulating tumor cells)
DMF
digitální mikrofluidika (z angl. digital microfluidics)
dsDNA
dvouvláknová DNA (z angl. double-stranded DNA)
EDC/EDAC
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid
ELISA
heterogenní enzymo-imunoanalýza (z angl. enzyme-linked immunosorbent assay)
EpCAM
adhezní molekula epiteliálních buněk (z angl. epithelial cell adhesion molecule)
IČ
infračervená spektroskopie
LoC
laboratoř na čipu (z angl. Lab-on-a-Chip)
MSFB
magneticky stabilizované fluidní lože (z angl. magnetically stabilized fluidized bed)
PCL
poly(ɛ-kaprolakton) (z angl. poly(ɛ-caprolactone)
PE
poly(ethylen)
PEG
poly(ethylenglykol)
PEO
poly(ethylenoxid)
PGMA
poly(glycidylmethakrylát)
PHEMA
poly(2-hydroxyethylmethakrylát)
PLA
kyselina polymléčná (z angl. polylactic acid)
PNA
peptidová nukleová kyselina (angl. peptide nucleic acid)
PDMS
poly(dimethylsiloxan)
PMMA
poly(methylmethakrylát)
PS
poly(styren)
PVA
poly(vinylalkohol)
SEM
skenovací elektronová mikroskopie (z angl. scanning electron microscopy)
ssDNA
jednovláknová DNA (z angl. single-stranded DNA)
SMCC
sukcinimidyl 4-(N-maleiimidomethyl)-cyklohexan-1-karboxylát
sulfo-NHS
sodná sůl N-hydroxysulfosukcinimidu
sulfo-SMCC
sulfosukcinimidyl 4-(N-maleiimidomethyl)-cyklohexan-1-karboxylát
TEM
transmisní elektronová mikroskopie
XRD
rentgenová difrakční analýza (z angl. X-ray diffraction analysis)
1. ÚVOD Bioafinitní chromatografie je unikátní separační technika založená na specifickém rozpoznávání a interakci mezi biologicky aktivními látkami a komplementárními molekulami (afinitní ligandy, afinanty) ukotvenými na stacionární fázi. Od 70. let 20. století, kdy nastal „boom“ bioafinitní chromatografie, našla tato metoda uplatnění v celé řadě oborů a položila základy mnoha dalším moderním vědám a technikám (studium protein-proteinových interakcí, vývoj kombinatorických knihoven, DNA biosenzorů apod.). Princip bioafinitní chromatografie je tak hojně využíván v mnoha obměnách dodnes, a nejen v akademické rovině,
ale
i
v klinické
medicíně
nebo
v environmentálních
aplikacích.
Použití
imobilizovaných ligandů se rovněž významně rozšířilo i do biotechnologických oborů s průmyslovým využitím. Pro bioafinitní separaci nebo biokatalýzu je klíčová příprava dostatečně kvalitní stacionární fáze, nosiče s imobilizovaným ligandem (protilátkou, enzymem, nukleovou kyselinou, aptamerem, apod). Mezi jednotlivé kroky přípravy patří: (i) výběr vhodného nosiče s odpovídajícími fyzikálně-chemickými vlastnostmi požadovanými dle účelu jeho použití; (ii) výběr vhodného afinantu, tj. molekuly vykazující afinitu k cílovému analytu; (iii) výběr takové metody vazby ligandu, aby nedošlo ke snížení nebo ztrátě jeho biologické aktivity; (iv) důkladná charakterizace připraveného nosiče, tj. stanovení množství navázaného ligandu, stanovení vazebné kapacity nosiče, koloidální stability v různých podmínkách prostředí a v neposlední řadě operační a skladovací stability. Takto připravené nosiče pak mohou být použity pro cílovou aplikaci. Jejich použití je velmi široké, od biotechnologicky významných enzymů imobilizovaných na stacionárních fázích v reaktorech, přes imunomagnetické čipy pro izolaci a detekci patogenních mikroorganizmů v potravinách až po bioaktivní kryty ran využívané v lékařství. Vývoji těchto moderních nosičů a jejich použitím se zabývá i tato dizertační práce, shrnující na první pohled různorodé, avšak ve své podstatě principiálně velmi obdobné bioafinitní systémy.
11
2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1.
Bioafinitní chromatografie Bioafinitní chromatografie je separační technika využívající schopnosti biologicky
aktivních látek tvořit stabilní, specifické a reverzibilní biokomplexy. Imobilizací jedné z reagujících složek (afinitního ligandu, tzv. afinantu) na matrici vznikne specifický nosič. Ten je poté schopen biospecificky interagovat s komplementární molekulou a vytvořit biospecifický pár (viz Obrázek 1). Všechny ostatní molekuly, které s ligandem nereagují, procházejí daným prostředím beze změny. Zachycený analyt (peptid, protein, buňka, nukleová kyselina, aj.) je v posledním kroku této techniky eluován ve velmi čisté formě a zakoncentrován. Nosič může být nakonec regenerován a opakovaně používán (Turková 1993).
Obrázek 1: Schéma afinitní chromatografie: (a) specifická vazba analytu na biospecifický nosič, (b) promytí nosiče s biokomplexem, (c) eluce analytu. Přepracováno podle: (Turková 1993).
Mezi přednosti bioafinitní chromatografie patří nenáročnost, rychlost, výtěžek dosahující při optimálních podmínkách až 90 %, vysoká čistota eluovaného analytu, izolace analytu přítomného ve vzorcích ve velmi nízkých koncentracích a možnost jeho zakoncentrování (Johnstone a Thorpe 1996). Afinitní interakce je komplexní soubor nekovalentních interakcí zahrnujících elektrostatické, polární a hydrofobní interakce, vodíkové vazby, dipól-dipól interakce a další. Sílu vazby mezi ligandem a analytem vyjadřuje tzv. afinitní (asociační) konstanta KA. Pro efektivní separaci a zároveň účinnou eluci je nutné, aby afinitní konstanta vznikajícího komplexu dosahovala hodnot od 104 do 108 mol.l-1. Při hodnotách KA větších než 109 mol.l-1 je nutné použít pro eluci velmi drastických podmínek, což může následně ovlivnit biologickou funkci analytu. Pro biospecifickou vazbu jsou rovněž stěžejní vlastnosti reakčního prostředí a vhodná geometrie vazebného místa - prostorové uspořádání funkčních skupin a jejích stérická dostupnost (Turková 1993). Eluce izolovaného analytu z matrice může probíhat dvěma způsoby. Častěji využívaná je eluce nespecifická, tj. eluce změnou složení mobilní fáze, často změnou pH nebo iontovou 12
silou. Druhý způsob eluce představuje eluce specifická, při které se do mobilní fáze přidá látka, která vytvoří s ligandem pevnější komplex než je původní komplex ligand-analyt; jedná se tedy o vytěsnění analytu z jeho původní vazby s ligandem. Tento druhý způsob eluce je šetrnější k izolovanému analytu, ale bývá mnohonásobně dražší než první varianta. Dále rozlišujeme eluce izokratické a gradientové (Turková 1993). Podle charakteru vázaného ligandu, resp. typu interakce ligand-analyt, lze rozdělit techniky bioafinitní chromatografie na několik druhů. Je-li interakce založena na imunoreaktivitě protilátek a příslušného antigenu, nazývá se imunoafinitní chromatografie (Murphy a kol. 1976). Lektinová chromatografie (LC) je založena na komplexotvornosti mezi lektiny a oligosacharidovými epitopy různých biomolekul (Gurd a Mahler 1974). Chromatografie na imobilizovaných iontech kovů (IMAC) využívá schopnosti proteinů tvořit koordinační vazbu s ionty kovů (Porath a kol. 1975). Boronátová afinitní chromatografie využívá specifické schopnosti kyseliny borité tvořit komplexy s glykovanými proteinys 1,2cis-diolovou skupinou (Mallia a kol. 1981). Mezi další typy bioafinitní chromatografie patří chromatografie na imobilizovaných barvivech (DLAC) (Bouriotis a Dean 1981); thiofilní afinitní chromatografie (TAC) (Porath a kol. 1985); afinitní chromatografie na bázi oxidů kovů (MOAC) (Pinkse a kol. 2004). Bioafinitní chromatografie je zpravidla využívána jako nástroj pro izolaci specifického bioanalytu z komplexního vzorku, tj. pozitivní selekci. Lze ji ovšem aplikovat i opačně, jako tzv. negativní selekci nebo depleci nežádoucích látek. Toho lze využít jako purifikační krok před vlastní pozitivní izolací cílového analytu - například k potlačení maskování analytu abundantními proteiny (albuminy, imunoglobuliny) (Zeng a kol. 2011) nebo buňkami ve vzorku (Wu a kol. 2014a). První zmínka o bioafinitní chromatografii pochází již z r. 1910 (Starkenstein 1910), její koncept byl poté detailně rozpracován v šedesátých letech minulého století týmem amerického biochemika Pedra Cuatrecasase, Meira Wilcheka a Christiana B. Anfinsena (Cuatrecasas a kol. 1968). Přestože se jedná o již velmi dobře popsanou a rutinně zavedenou techniku, vývoj nových nosičů (Chernukhin a kol. 2011, Wu a kol. 2014b), ligandů (Carredano a Baumann 2011) a analytických platforem (Li a kol. 2012, Ohlson a kol. 2010) přináší stále nové možnosti využití principu tradiční afinitní chromatografie. Dále se vyvíjí techniky kombinující bioafinitní interakce s dalšími separačními technikami – např. afinoforéza (Shimura a Kasai 1987), afinitní kapilární elektroforéza (Guttman a Cooke 1991), afinitní membránová filtrace (Mattiasson a Ramstorp 1984), afinitní precipitace (Costioli a kol. 2003, Hilbrig a kol. 2006, Larsson a Mosbach 1979), tandemová afinitní purifikace 13
(Puig a kol. 2001). Základní princip afinitního biologického rozpoznávání (biorekognice) stál rovněž u zrodu mnoha oblastí současné vědy – studia proteinových interakcí, vývoje metod kombinatorických knihoven, DNA-biosenzorů nebo proteinových čipů (Wilchek 2004).
14
2.2
Ligandy pro bioafinitní chromatografii Mezi tradiční biospecifické afinanty a jejich komplementární vazebné partnery patří
protilátka-antigen,
substrát/inhibitor-enzym,
lektin-polysacharid/glykoprotein,
hormon-
receptor, DNA-DNA vazebný protein (Batista-Viera a kol. 2011). Vedle těchto tradičních přirozených afinantů mohou být použity i ligandy tzv. biomimetické, které se přirozeně nevyskytují v žádných živých systémech, ale jsou schopny tvořit komplexy s cílovými analyty. Jedná se především o syntetická triazinová barviva, v čele s modelovým barvivem Cibacron blue F3G-A (Bouriotis a Dean 1981, Lowe a Pearson 1984, Scopes 1986), a jejich novější chimérické analogy typu „barvivo-ligand“ (Clonis a kol. 2000, Labrou 2003). Příkladem je ligand pro L-laktát dehydrogenázu (Labrou a kol. 1999) nebo pro analogy glutathionu (Melissis a kol. 2001). V posledních letech stále více nabývá na významu nová generace afinantů (zpravidla peptidů, funkčních fragmentů protilátek nebo tzv. „scaffold“ proteinů) vyselektovaných pomocí chemických (Carredano a Baumann 2011) nebo biologických kombinatorických knihoven (Clonis 2006, Nygren 2011). V případě biologických knihoven je náhodně syntetizováno velké množství peptidů (zpravidla 107-1013), které jsou poté selektovány na základě jejich reaktivity s cílovými molekulami. Nejčastějším příkladem těchto biologických technik jsou fágové peptidové knihovny (Cwirla a kol. 1990, Noren a Noren 2001, Smith 1985) nebo ribozomální display (Hanes a Pluckthun 1997). Úspěšným typem afinantů
vytypovaným
pomocí
fágové
peptidové
knihovny
a následně
komerčně
produkovaným jsou tzv. „affibodies“ odvozené od proteinu A bakterie Staphylococcus aureus (Nord a kol. 2000). Pomocí in vitro technologie SELEX (z angl. Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (Tuerk a Gold 1990)) a Cell-SELEX (Morris a kol. 1998) byly chemicky syntetizovány a následně vyselektovány aptamery (Ellington a Szostak 1992). Jsou to úseky ssDNA nebo RNA vykazující vysokou specificitu a afinitu vůči příslušné cílové struktuře - např. iontům, organickým molekulám typu antibiotik a vitamínů, peptidům, proteinům, nukleotidům, celým buňkám (Famulok 1999, You a kol. 2003). Aptamery začaly být záhy využívány jako ligandy v bioafinitní chromatografii a začaly nahrazovat tradiční protilátky (Romig a kol. 1999). Další příklady těchto nových, nejčastěji protein-vázajících, molekul jsou přehledně zpracovány např. v (Bílková 2014, Binz a kol. 2005, Skerra 2007). V DNA-biosenzorech bývají kromě klasických oligonukleotidových hybridizačních sond využívány peptidové nukleové kyseliny (PNA) (Briones a Moreno 2012, Orum a kol. 1995), chemické analogy nukleových kyselin, jejichž páteř netvoří cukr-fosfátová vazba, ale N-(215
aminoethyl) glycinpolyamid (Nielsen a kol. 1991). Takové molekuly jsou schopné rozpoznat a navázat molekuly DNA, RNA, jiných PNA, nikoliv však proteinů. Další analogy nukleových kyselin schopných hybridizace s cílovými molekulami, jako například „locked nucleic acid“ (LNA), “glycerol-derived nucleic acid” (GNA), “pyranosyl-RNA” (p-RNA) nebo “threose nucleic acid” (TNA) (shrnuty např. v Briones a Moreno 2012), se jako nové ligandy v bioafinitní chromatografii příliš nerozšířily a jejich použití zůstává víceméně ojedinělé. Důvodem hledání nových bioafinitních ligandů je nedostatečná skladovací stabilita a nízká odolnost přirozených ligandů vůči extrémnímu pH, vůči degradaci (proteolýza, denaturace, aj.) a jejich relativně vysoká cena (Carredano a Baumann 2011). Nalezení nových levných, robustních a dostatečně afinitních ligandů by mohlo umožnit další rozšíření bioafinitní chromatografie (Labrou 2003).
16
2.3
Nosiče pro bioafinitní chromatografii Ideální nosič pro bioafinitní chromatografii by měl splňovat následující kritéria:
nerozpustnost, nulová reaktivita matrice nosiče s analytem, vysoká chemická i mechanická odolnost, rezistence vůči mikrobiální a enzymatické degradaci, hydrofilní charakter, vysoký specifický povrch a vysoký obsah funkčních skupin na nosiči vhodných pro vazbu ligandu (Turková 1993). Tabulka 1 shrnuje matrice, které bývají nejčastěji pro bioafinitní chromatografii používány. Jsou běžně komerčně dostupné, některé z nich jsou dostupné s již navázanými afinanty, např. protein A, protein G, konkanavalin A, oligo (dT) -, Ni2+, Co2+ a další. Tabulka 1: Tradiční nosiče používané v bioafinitní chromatografii (podle Turková 1993).
Silika a silikagel
Agaróza a její deriváty
Anorganické oxidy Al2O3, TiO2, ZrO2
Polyakrylamid a jeho deriváty
Hydroxyalkylmethakrylát
Dextran (Sephadex)
Celulóza a její deriváty
Polystyren
Za posledních 30 let byla vyvinuta celá řada nových nosičů pro bioafinitní chromatografii (shrnuto například v Calleri a kol. 2012, Varilova 2005). Cílem této literární rešerše však není poskytnout jejich kompletní přehled, ale upozornit na nové materiály a vybrané typy používaných moderních nosičů, zejména magnetické částice a nanovlákna. Vývoj stacionárních fází pro bioafinitní chromatografii odráží trendy a požadavky současné analytické chemie. Technika bioafinitní chromatografie ve vysokotlakém uspořádání přinesla potřebu vytvořit takové nosiče, které by byly schopny odolávat vysokým tlakům. Rozvoj magnetických separací analogicky přinesl velký zájem o různé typy magnetických částic. V souladu s miniaturizací analytických systémů se trendem staly nosičové systémy mikro- až nanometrových rozměrů, nabízející kromě malé velikosti, a tudíž i kompatibility s mikroprůtokovými systémy, extrémně velký specifický povrch. Mezi ně patří kromě klasických sférických mikro- a nanočástic (Corman a kol. 2010) i fullereny (Amirshakhi a kol. 2008), nanotrubky (Assali a kol. 2013), mesoporézní částice (Nakanishi a kol. 2013). Z planárních struktur se jedná především o nanovlákna (Che a kol. 2011). Další nanostruktury jsou používány zejména ke značení biomolekul nebo k vývoji nosičů pro doručování léčiv a jejich využití na poli bioafinitní chromatografie je omezené (kvantové tečky, liposomy, dendrimery). Mezi další relativně nové stacionární fáze pro bioafinitní chromatografii patří
17
nosiče připravené sol-gel technologií (Haginaka 2008), vtištěné syntetické receptory (Haginaka 2008, Sellergren 1994) nebo monolitické fáze (Spross a Sinz 2011). V následující kapitole je pozornost zaměřena na nosiče, které si v oboru bioafinitní chromatografie vydobyly velmi významné místo – magnetické mikro- a nanočástice. 2.3.1
Magnetické mikročástice a nanočástice
Magnetické mikro- a nanočástice se staly před více než 30 lety předmětem velkého zájmu a postupně si našly své uplatnění nejen v akademické sféře, ale i v klinické praxi a průmyslu (Ito a kol. 2005, Pecova a kol. 2011, Šafařík a Šafaříková 2009, Thanh 2012). S rozvojem nanobiotechnologií se do popředí dostaly zejména magnetické nanočástice, které se v současnosti intenzivně zkoumají pro svůj obrovský potenciál při medicinálních in vivo aplikacích (např. (Pankhurst a kol. 2009). Souhrn biologických a biochemických oblastí a technik, ve kterých se magnetických částic využívá, je schematicky znázorněn na Obrázku 2. Ve většině bioaplikací se používá magnetických částic o velikosti 50 nm až 10 µm (Andrä a kol. 2007). Magnetické částice o velikosti několika jednotek mikrometrů (1-5 µm) jsou velice vhodné pro separace v in vitro laboratorní diagnostice, stávají se tak jádrem mnoha bioanalytických procesů (Basinska 2005). Tato velikost částic je rovněž atraktivní pro mikrofluidní systémy (Fan a kol. 1999).
Obrázek 2: Oblasti využití magnetických částic.
18
Tyto částice se i v odborné literatuře často označují jako částice magnetické, přestože se ve skutečnosti jedná o částice superparamagnetické. Magnetické vlastnosti vykazují pouze po vložení do magnetického pole, po jeho odstranění nevykazují žádný zbytkový magnetismus. V angličtině jsou označovány jako „magnetic beads“, „magnetic particles“ nebo méně častěji „magnetic spheres“. Použití magnetických částic v in vitro biologických aplikacích bývá nejčastěji založeno na následujících principech: imunomagnetická separace, imunoprecipitace a hybridizace nebo extrakce na pevnou fázi (v případě extrakce nukleových kyselin). V neposlední řadě se využívá imobilizace bioaktivních látek (nejčastěji enzymů) na magnetické částice a jejich následné uplatnění v biokatalýze. Výhody používání magnetických částic v těchto technikách spočívají v rychlé a jednoduché možnosti oddělit izolovaný analyt od zbytku reakční směsi (a to i z hrubého buněčného lyzátu), tj. bez nutnosti centrifugace (Obrázek 3), dále v jednoduché manipulaci a nenáročné instrumentaci, minimálním zřeďování analytu, možné automatizaci a minimálním ztrátám nosiče v průběhu promývání (Šafařík a Šafaříková 1999).
Obrázek 3: Manipulace s magnetickými částicemi ve vsádkovém uspořádání (Lehmann 2008).
Historicky první práce popisující úspěšnou přípravu stabilizovaných magnetických částic pochází z r. 1938 (Elmore 1938). Rozkvět v technologiích přípravy magnetických mikroa nanočástic nastal až v 60. letech 20. století. Za průlom je v přípravě magnetických částic považována práce Johna Ugelstada, který v letech 1979 a 1980 popsal přípravu magnetických vysoce uniformních polystyrenových mikročástic (Ugelstad a Mork 1980). Tento objev byl během dalších let zdokonalen a v r. 1992 uveden na trh pod komerčním označením Dynabeads®. V současnosti se jedná o celosvětově nejpoužívanější komerční částice. Vývoj metod pro výrobu částic ještě zdaleka není u konce, každým rokem přibývá řada prací popisujících nové postupy jejich výroby a modifikace (Kaewsaneha a kol. 2014, Liu a Choi 2014, Wang a kol. 2013). Novým trendem v přípravě nových magnetických částic se staly 19
vysoce porézní, tzv. hypersíťované částice (Fontanals a kol. 2008, Šálek a kol. 2011) a mesoporézní silika nanočástice (Knezevic a kol. 2013, Zhang a kol. 2013). Oba typy nosičů vynikají oproti neporézním částicím velkým specifickým povrchem (> 1000 m2/g) pro vazbu afinitních ligandů a interakci s cílovými látkami. Metody přípravy různých typů magnetických nano- a mikročástic byly přehledně shrnuty v publikacích (Horák a kol. 2007, Laurent a kol. 2008, Roca a kol. 2009). Nejčastěji se jedná o spolusrážecí (koprecipitační) reakce solí železa, termické rozklady prekurzorů obsahujících železo, sol-gel reakce, heterogenní polymerizační techniky, sonochemické syntézy aj. Zcela odlišným způsobem přípravy magnetických částic ve srovnání s výše vyjmenovanými technikami je jejich biogenní produkce magnetotaktickými bakteriemi (Blakemore 1975) (Obrázek 4). Ty jsou schopné vytvářet tzv. magnetozómy, krystaly tvořené magnetitem a/nebo greigitem o velikostech přibližně 35-120 nm (shrnuto v Šafařík a Šafaříková 2009).
Obrázek 4: Produkce magnetických částic magnetotaktickými bakteriemi: (a) TEM snímek Magnetospirillum gryphiswaldense (Schueler 2008), (b) a (c) TEM snímky magnetozómů (Šafařík a Šafaříková 2002).
V závislosti na volbě metody výroby můžeme připravit částice lišící se svou morfologií (Obrázek 5), velikostí i uniformitou (monodisperzita vs. polydisperzita). Speciální formou nanočástic je tzv. „ferrofluid“ neboli magnetický „nanofluid“, koloidální suspenze magnetických nanočástic ve vhodné nemagnetické kapalině.
Obrázek 5: Morfologické typy magnetických polymerních mikročástic. (a) částice typu jádro-plášť, angl. coreshell, (b) částice s mnohočetným magnetickými jádry obklopenými polymerem, (c) částice s mnohočetnými magnetickými jádry přítomnými na povrchu částice (d) „vlasaté“ částice tvořené magnetickým jádrem a jednotlivými řetězci polymeru (Horák a kol. 2007).
20
Magnetickou složkou částic bývají nejčastěji superparamagnetické oxidy kovů – magnetit (FeO.Fe2O3) nebo maghemit (γ-Fe2O3). Mají nejvyšší saturační magnetizaci, vysokou magnetickou susceptibilitu, jsou biodegradabilní a přirozeně biokompatibilní. Méně často se pak setkáváme s ferrity obsahujícími Mn, Co, Zn, Cu nebo Ni (Horák a kol. 2007). Obaly magnetických částic se skládají z rozličných materiálů – z polymerů, anorganických látek nebo kovů. Stejně jako v případě klasických stacionárních fází pro kolonové bioafinitní chromatografie se i obaly magnetických částic nejčastěji připravují z anorganické siliky (Tada a kol. 2007, Tsang a kol. 2006, Zhang a kol. 2007) nebo z různých typů syntetických, bio- nebo kopolymerů. Jedná se např. o polystyrenové (latexové) částice (Gu a kol. 2003, Yanase a kol. 1993), částice z celulózy (Yan a kol. 2013), alginátu (Joshi a kol. 2011), z poly(methylmethakrylátu) (PMMA) (Qu a kol. 2009), z poly(hydroxyethyl methakrylátu) (PHEMA) (Horák a kol. 1999) aj. Aby bylo dosaženo požadovaných cílových vlastností částic (minimální nespecifická adsorpce proteinů a buněk, minimální agregace částic ve vodném prostředí, přítomnost vhodných skupiny pro vazbu ligandu, atd.), lze jejich povrch post-synteticky modifikovat. O těchto povrchových modifikacích pojednává kapitola 2.4. Mezi klíčové parametry, které je nutno zohlednit při výběru částic pro konkrétní aplikaci, patří: velikost částic, jejich struktura, superparamagnetické vlastnosti, povrchový náboj, hydrofobicita/hydrofilicita, porozita, typ a hustota funkčních skupin pro následnou biofunkcionalizaci. Některé z těchto údajů poskytují samotní výrobci magnetických částic, některé však poskytnuty nebývají, a je tak nutné požadované parametry dodatečně proměřit. Metody pro charakterizaci magnetických částic se liší v závislosti na velikosti částic. Pro analýzu struktury a povrchu částic nanometrových rozměrů se dnes stále více používají mikroskopické metody – transmisní a skenovací elektronová mikroskopie (TEM a SEM), cryo-TEM a mikroskopie atomárních sil (AFM). Pro stanovení hydrodynamických velikostí nanočástic se začala masivně používat technika dynamického rozptylu světla (DLS), pro určení velikosti mikročástic pak metoda laserové difrakce. Měření zeta potenciálu se rovněž stalo rutinním nástrojem pro stanovení tzv. bodu nulového náboje částic (angl. Point of Zero Charge, PZC), ekvivalentu izoelektrického bodu u proteinů. Z tradičních metod analýzy magnetických částic se běžně používá rentgenová difrakce XRD (z angl. X-Ray Diffraction) a infračervená spektroskopie (IČ) pro analýzu chemického složení částic, SQUID (z angl. Super-conducting Quantum Interference Device) nebo VSM magnetometrie (z angl.Vibrating Sample Magnetometer) pro analýzu magnetických vlastností částic. Velikost povrchu lze kvantifikovat pomocí analýzy BET (angl. Brunauer Emmet Teller). Metody pro 21
charakterizaci magnetických částic byly několikrát přehledně shrnuty, např. v Duguet a kol. 2012 nebo Laurent a kol. 2008. Vzhledem ke stále rostoucí popularitě magnetických částic roste celosvětově počet komerčních firem dodávajících částice i spektrum nabízených částic (v současné době nabízí magnetické částice více než 70 firem (www.magneticmicrospheres.com)). Dostupné jsou jak částice holé, bez biofunkcionalizace, tak částice s navázanými afinanty – nejčastěji s univerzálními ligandy typu streptavidin, oligoDT, protein A a G. Lze ale zakoupit i magnetické částice se specifickými protilátkami, například Dynabeads® Epithelial Enrich s protilátkami proti lidskému povrchovému antigenu EpCAM. Tabulka 2 shrnuje příklady komerčních magnetických částic a jejich producenty. Tabulka 2: Příklady největších světových výrobců magnetických částic (vybráno z Horák a kol. 2007).
Označení částic Dynabeads® SiMAG® Sera-Mag® Adembeads® Biomag® a Promag® MicroBeads®
2.3.2
Výrobce, sídlo
Typ částic
Life Technologies, Thermo Fisher Vysoce uniformní polymerní magnetické Scientific, Spojené státy americké mikročástice (≥1 µm) Chemicell, Německo Silika magnetické nano- a mikročástice (0,5 – 1 µm) Seradyn, Thermo Fisher Polystyrenové magnetické částice (1 µm) Scientific, Spojené státy americké Ademtech, Francie Magnetické „core-shell“ částice (200– 500 nm) Bangs Laboratories, Spojené státy Magnetické monodisperzní polymerní americké částice (1 – 12 µm) Miltenyi Biotec, Německo Magnetické částice s protilátkami pro separaci buněk
Nanovlákna
Podle doporučení komise Evropské unie č. 96/2011 jsou nanomateriály materiály, které mají nejméně jeden rozměr mezi 1 až 100 nm. Nanovlákna v užším slova smyslu tuto definici splňují a jejich průměr se pohybuje pod 100 nm. V širším slova smyslu jsou však k nanovláknům běžně řazena všechna vlákna, jejichž průměr je menší než 1 000 nm, a měly by tedy nést vhodnější označení „submikronová vlákna“. Nanovlákna vynikají následujícími vlastnostmi: velký specifický povrch, vysoká porozita, malý rozměr pórů. Díky těmto vlastnostem našly uplatnění především ve filtračních procesech (Qin a Wang 2006), textilním průmyslu (Schreuder-Gibson a kol. 2002) a nanoelektronice i optice (Long a kol. 2012). Jejich spojení s biologicky aktivními látkami
22
přináší nové možnosti v tzv. „life science“ oblasti, zejména pak v tkáňovém inženýrství, kde jsou využívany jako nosné struktury, tzv. „scaffoldy“ (Katsanevakis a kol. 2012), při krytí ran (Dubsky a kol. 2012) a doručování léčiv nebo genů (tzv. „Drug Delivery Systems“, DDS) (Sharma a kol. 2014). V biomedicínských aplikacích se navíc k výše uvedeným výhodám nanovláken využívá následujících vlastností: biokompatibilní nanovlákna dokáží imitovat přirozenou strukturu extracelulární matrix; nanovlákna podporují proliferaci, diferenciaci a i migraci buněk; díky vysoké porozitě jsou nanovlákna permeabilní pro plyn i kapaliny (Kubínová a Syková 2010). Nanovlákna lze připravit několika různými technikami – dloužením (Ondarcuhu a Joachim 1998), matricovou syntézou (Che a kol. 1998), fázovou separací (Ma a kol. 2007, Mu a kol. 2012), samo-organizováním (Hartgerink a kol. 2001) a v neposlední řadě elektrostatickým zvlákňováním neboli elektrospinningem. Princip elektrospinningu byl patentován v r. 1934 Formhalsem (Formhals 1934), na kterého navázal počátkem 70. let minulého století Baumgarten (Baumgarten 1971) a další (Larrondo a Manley 1981, Reneker a Chun 1996). Zjednodušeně se jedná se o metodu využívající vysokonapěťového elektrostatického pole, kdy je jedna elektroda umístěna v roztoku polymeru nebo taveniny a druhá elektroda je spojena s kolektorem tvořeným stacionární nebo rotující deskou. V důsledku přítomnosti elektrického pole dochází k indukci náboje mezi zvlákňovací tryskou a kolektorem, což následně vede k přitažení zvlákňovaného roztoku ve formě vláken ke kolektoru, kde jsou vlákna ukládána. Mechanismus tvorby nanovláken je poměrně složitý, detailně se mu věnuje celá řada prací (Bhardwaj a Kundu 2010, He a kol. 2005). V roce 2006 byla představena modifikovaná technologie elektrospinningu, ve které se nezvlákňuje z trysky, ale z povrchu rotační elektrody, zvaná Nanospider® neboli zvlákňování z volné hladiny (Jirsák a kol. 2006, Petřík a Malý 2008). Tato modifikace přinesla možnost průmyslové výroby nanovláken o vysoké homogenitě. Nanovlákna připravená touto technologií byla v rámci této dizertační práce využita jako nosič pro imobilizaci enzymů při vývoji krytů ran. Metodou zvlákňování z volné hladiny lze připravit nanovlákna z celé řady materiálů (Tabulka 3). Zaměříme-li se na biologické použití nanovláken, používají se zejména organické polymery a biopolymery. Pro vývoj nových krytů ran a tkáňové inženýrství se nejčastěji využívá nanovláken z chitosanu (Bhattarai a kol. 2005), ze směsi chitosanu/želatiny (Qian a kol. 2011), chitosanu/polyvinylalkoholu (Kang a kol. 2010), kolagenu/polykaprolaktamu (Lee a kol. 2009), želatiny/polykaprolaktamu (Chandrasekaran a kol. 2011) kyseliny polymléčné (Callahan a kol. 2013) a dalších. 23
Nanovlákenné vrstvy mohou mít strukturu monolitických (zvlákněná z homogenního roztoku polymeru nebo taveniny), dutých (Bognitzki a kol. 2000), helikálních (Kessick a Tepper 2004), magnetických (Li a kol. 2003) nebo koaxiálních nanovláken (Obrázek 6). Koaxiální nanovlákna vyrobená metodou koaxiálního elektrospinningu představují slibnou novinku na poli biomedicínských aplikací. Tato nanovlákna zvlákněná z trysky mají strukturu typu jádro-plášť (Sun a kol. 2003), lze do nich tak snadno enkapsulovat bioaktivní látky (Zhang a kol. 2006). Na konci roku 2013 byla představena technologie koaxiálního elektrospinningu z volné hladiny umožňující průmyslovou produkci těchto nanovláken (Forward a kol. 2013), čímž se otevírají nové možnosti v regenerativní medicíně a řízeném uvolňování léčiv. Tabulka 2: Příklady polymerů a tavenin, které lze zvláknit technologií Nanospider® (www.elmarco.cz).
Organické polymery PA (polyamid) PAI (polyamidimid) PUR (polyurethan) PES (polyethersulfon) PVA (polyvinylalkohol) PEO (polyethyleneoxid) PS (polystyren) Stejně
jako
Anorganické polymery TiO2 SiO2 SnO2 WO3 Al2O3 Li4Ti5O12
v případě
magnetických
Kovy
Biopolymery
Pt Cu Mn
Želatina Chitosan Kolagen PVA (Polyvinylalkohol) PLA (Kys. polymléčná) PCL (Polykaprolaktam)
částic
lze
nanovlákna
charakterizovat
mikroskopickými metodami typu SEM, TEM nebo AFM. Stupeň porozity a obecně specifický povrch lze stanovit metodou BET nebo rtuťovou porozimetrií, povrchové vlastnosti nanovláken (hydrofilicitu/hydrofobicitu) měřením kontaktních úhlů. Metodou XRD nebo IČ bývá analyzováno chemické složení nanovláken. Metody pro charakterizaci nanovláken byly velice dobře shrnuty v (Ramakrishna a kol. 2005).
Obrázek 6: SEM snímky nanovláken: (a) koaxiální nanovlákna typu ze směsi PEO/PEG a PS (převzato z (Forward a kol. 2013) (b) dutá nanovlákna z PLA/poly(p-xylylenu) (převzato z Bognitzki a kol. 2000) (c) monolitická nanovlákna z chitosanu (snímek Mgr. Martina Juklíčková, Elmarco, CZ).
24
Povrchová modifikace nanovláken, zvláště těch připravených metodou elektrospinningu, není tak častá jako v případě magnetických částic. Metodou elektrospinningu lze totiž zvláknit celou řadu polymerů (a jejich směsí) různých vlastností v závislosti na cílové aplikaci, následná postsyntetická modifikace tak nebývá nutná. Využívá-li se, pak zpravidla ke zvýšení hydrofility nanovláken pro biomedicínské aplikace (Nam a kol. 1999, Park a kol. 2007), nikoliv pro účely bioafinitní chromatografie.
25
2.4
Povrchová modifikace nosičů Důvody pro povrchovou modifikaci nosičů jsou: absence vhodných chemických skupin
nebo raménka pro následnou vazbu afinitního ligandu (tzv. biofunkcionalizaci), hydrofobní povrch nebo samovolná agregace nosiče v důsledku špatné koloidální stability, vysoká nespecifická adsorpce proteinů nebo buněk z komplexního materiálu na nosič a v neposlední řadě adheze samotného nosiče na vnitřní stěny reakčních nádob. Nosiče lze modifikovat celou řadou způsobů – chemicky nebo fyzikálně, adsorpcí nebo kovalentně, nízko- nebo vysokomolekulárními látkami. 2.4.1
Modifikace nosičů s cílem zavést vhodné chemické skupiny pro vazbu ligandů
Většina nosičů pro bioafinitní chromatografii na svém povrchu přirozeně nese některé funkční skupiny, jsou tzv. funkcionalizované. Pokud však přítomné skupiny nejsou dostatečně reaktivní nebo vhodné biofunkcionalizaci, je nezbytné jejich povrch post-synteticky modifikovat. Vyhovuje-li materiál nosiče cílové aplikaci a jeho jediným nedostatkem je absence vhodných skupin pro vazbu ligandu, můžeme povrch nosiče pouze chemicky aktivovat, tj. zavést požadované funkční skupiny bez nanesení další vrstvy materiálu na jeho povrch. Toho lze dosáhnout například pomocí hydrolýzy oxiranových skupin PGMA na hydroxylové (Horák a kol. 2012), oxidace poly(ethylenu) kyselinou chromovou (Rasmussen a kol. 1977) nebo hydrolýzy PMMA kyselinou sírovou za vzniku karboxylových skupin (Brown a kol. 2006). Polymery typu PCL, PE nebo PMMA je možné funkcionalizovat fyzikálně - plazmou (argonem, dusíkem, kyslíkem, oxidem uhličitým atd.) (Chan a kol. 1996, Ozdemir a kol. 1999). Jedná se o velmi šetrný a ekologický způsob, jak zavést do svrchní vrstvy polymeru například karboxylové nebo aminové skupiny. Ošetření povrchů plazmou může být navíc zkombinováno s dalšími technikami pro modifikaci povrchu, například ultrafialovou polymerizací (Situma a kol. 2005) nebo silanizací (Long a kol. 2006) vnášející na povrch nosiče další chemickou vrstvu. Další možností je zavedení nových funkčních skupin na povrch nosičů pomocí polymerů, tzv. polymerní „coating“ (viz kap. 2.4.3). Silanizace je častý typ chemické modifikace povrchů s hydroxylovými skupinami (např. silika, sklo) (např. (Grama a kol. 2014, Huang a kol. 2005). Jedná se o funkcionalizaci alkoxysloučeninami (mono-, di-, nebo trialkoxysilany) s vhodnou terminální funkční skupinou (např. –NH2) za vzniku vazby Si-O-Si. Silanizaci je možné provést pomocí silanizačních činidel jako je γ-aminopropyltriethoxysilan (APTS, APTES) (Obrázek 7), 26
glycidyloxypropyltriethoxysilan (GOPS) nebo tetraethyl orthosilikát (TEOS). Silanizací zavedená terminální funkční skupina může být poté využita pro následnou vazbu různých typů biologických afinantů – DNA (Halliwell a Cass 2001, Phaner-Goutorbe a kol. 2011), protilátek (Joshi a kol. 2007) a podobně.
Obrázek 7: Modifikace povrchu s hydroxylovými skupinami pomocí APTS činidla: (a) strukturní vzorec APTS; (b) APTS po hydrolýze a kondenzaci silanolových skupin; (c) APTS po vazbě na povrch s hydroxylovými funkčními skupinami. Převzato z (Hermanson 2008).
2.4.2 Modifikace nosičů s cílem zlepšit jejich povrchové vlastnosti K potlačení samovolné agregace nosičů ve vodných roztocích a v komplexním biologickém materiálu stačí často přídavek stabilizačních nízkomolekulárních látek typu kyseliny citronové (Sahoo a kol. 2005), olejové (Hajdu a kol. 2008) nebo fosforečnanů (Mutin a kol. 2003). Magnetické nanočástice obalené vrstvou hydrofobních surfaktantů mohou být stabilizovány na základě hydrofobních interakcí s amfifilními molekulami typu cetyl triemthylammonium bromid (CTAB), kopolymerů poly(ethylenglykolu) nebo Pluronicu (shrnuto v Begin-Colin a Felder-Flesch 2012). Magnetické částice lze rovněž povrchově modifikovat inertními anorganickými materiály, jako zlatem (Lin a kol. 2001) nebo silikou (van Ewijk a kol. 1999), které částice důkladně obalí a vznikají tak částice s typickou strukturou jádro-plášť (angl. core-shell). Tyto obaly pak zajistí dobrou koloidální stabilitu nosičů a znemožní tak jejich agregaci. Dalším častým typem modifikace nosičů s cílem zlepšit jejich povrchové vlastno sti je modifikace polymery, o které pojednává následující kapitola. 2.4.3 Víceúčelová modifikace nosičů polymery Nejčastějším typem funkcionalizace, zvláště u magnetických mikročástic, je modifikace polymery (Audonnet a kol. 2011). Obecný koncept této modifikace a následné biofunkcionalizace povrchu nosič znázorňuje Obrázek 8. Polymerní modifikace nosičů je výhodná v tom, že se částice po modifikaci elektrostaticky odpuzují, což je jev označovaný jako elektrostatická stabilizace. Polymery jako poly(ethylenglykol) (PEG) nebo cukry typu 27
dextran navíc slouží k tzv. stérické stabilizaci, jelikož řetězce makromolekulárního stabilizačního činidla slouží jako fyzikální stérická bariéra, která tak potlačuje agregaci částic (shnuto v Duguet a kol. 2012). Výběrem vhodného polymeru nesoucího vhodné terminální skupiny na svých řetězcích (za použití tzv. heterobifunkčního polymeru) lze významně ovlivnit koloidální stabilitu částic a potlačit tak jejich agregaci. Naopak při modifikaci částic homobifunkčním polymerem (například při funkcionalizaci karboxylových nosičů polymerem s terminálními aminoskupinami) může docházet k agregaci částic z důvodu chemického „síťování“ polymerem. Volba polymeru a příslušných terminálních skupin poté určuje i následnou metodu vazby biologického ligandu, jeho hustotu na nosiči i jeho finální orientaci. Zároveň polymer slouží jako raménko, které pomáhá imobilizovanému afinantu v lepší orientaci a stérické dostupnosti pro reakci s izolovaným analytem.
Obrázek 8: Koncept povrchové modifikace polymery a následné biofunkcionalizace povrchů. Přepracováno podle Goddard a Hotchkiss 2007.
Částice lze funkcionalizovat polymery syntetickými, jako např. PEG (Betancourt a kol. 2009, Gbadamosi a kol. 2002), polyvinylalkoholem (PVA) (Davies a kol. 2008), polykaprolaktamem (PCL) (Flesch a kol. 2004), poly[D,L-(laktid-ko-glykolidem)] (Pandey a kol. 2013) aj. nebo přírodními jako např. dextranem (Lacava a kol. 2001), alginátem (Ma a kol. 2007), chitosanem (Talbert a Hotchkiss 2012) aj. Typ polymeru, jeho struktura (případné větvení) i hustota na částicích významně ovlivňuje finální vlastnosti i chování modifikovaných částic. Ze zmíněných polymerů je povrchová modifikace částic hydrofilním polymerem PEGem, tzv. PEGylace, zlatým standardem a bývá pro bioaplikace používána nejčastěji (Gong a Grainger 2007). PEG je polyether složený z opakujících se jednotek ethylenoxidu. Jeho racionální vzorec je HO-(CH2—CH2-O)n-H, jako monomer má molekulovou hmotnost 44 g/mol. Je nábojově neutrální a vysoce hydrofilní, rozpustný ve vodných roztocích i v mnoha organických rozpouštědlech. Významně zvyšuje biokompatibilitu povrchů 28
a zvyšuje odolnost vůči nespecifické adsorpci (Goddard a Hotchkiss 2007, Wattendorf a Merkle 2008). Je vyhledávaným polymerem pro konjugaci s terapeutiky pro in vivo použití, jelikož je neimunogenní a není toxický pro živé organismy. Bez jakékoliv modifikace je PEG poměrně málo reaktivní. PEG lze však chemicky modifikovat a v současné době je již k dispozici široká komerční nabídka lineárních i různě větvených modifikovaných homonebo heterobifunkčních PEGů. PEGylací příslušného nosiče pro bioafinitní chromatografii tak můžeme na jeho povrch zavést téměř jakoukoliv terminální funkční skupinu, např. karboxylovou, amino, hydrazidovou, hydroxylovou, thiolovou, epoxidovou a mnoho dalších. PEG bývá na povrchy nosičů post-synteticky imobilizován analogickými metodami, které se běžně využívají pro imobilizaci proteinů. Pro kovalentní imobilizaci PEGu bývá nejčastěji využívána karbodiimidová technika vazby s využitím NHS-esterů (Wattendorf a Merkle 2008) (viz kap. 2.5.2). Používaná je rovněž kombinace PEGylace s některou z již uvedených metod – například silanizací.
29
2.5
Biofunkcionalizace nosičů Mezi nejčastější biospecifické ligandy imobilizované na pevnou fázi patří peptidy,
proteiny (protilátky, enzymy) a nukleové kyseliny. Nosiče s imobilizovanými biomolekulami je možné použít pro bioafinitní chromatografii často opakovaně, což s sebou přináší nemalé ekonomické úspory. Imobilizované ligandy nabízí ve srovnání s prací se solubilní formou zpravidla výhodu v možnosti kontrolovat reakci (např. odstranit ligand z reakční směsi), zvýšení stability a aktivity biomolekul a v čistotě získaného produktu (shrnuto v Cao a Schmid 2006, Liese a Hilterhaus 2013). Ligandy pro bioafinitní interakce je možné na povrch nosičů ukotvit celou řadou metod. Ty lze rozdělit na metody vedoucí ke vzniku kovalentní nebo nekovalentní vazby – zachycení v polymeru, enkapsulace, adsorpce a afinitní interakce (Obrázek 9).
Obrázek 9: Hlavní přístupy pro biofunkcionalizaci nosičů biospecifickými ligandy (červeně). Upraveno a přepracováno podle (Brena a Batista-Viera 2006, Goddard a Hotchkiss 2007).
Při volbě metody vazby je nutné vzít v úvahu požadovanou prostorovou orientaci ligandu na nosiči, a tudíž i následnou neporušenost a přístupnost vazebných center molekuly pro biospecifického partnera. Ligandy lze ukotvit na pevný nosič orientovaně nebo neorientovaně, tj. náhodně. Orientovaná vazba, tedy místně-specifická vazba kotvící ligand přes selektivní strukturu, je výhodná zejména u protilátek a oligonukleotidů. Při orientované vazbě protilátek třídy IgG se využívá dvou kvalitativně odlišných přístupů – přes jejich Fc část nebo přes redukovanou S-S vazbu v pantové oblasti těžkých řetězců (např. pomocí 2-merkaptoethylaminu). Imobilizace protilátek přes jejich Fc část lze dosáhnout několika technikami - kovalentní vazbou přes oligosacharidové řetězce lokalizované právě v Fc části molekuly IgG (více viz kap. 2.5.2), s využitím imunoglobulinvázajících proteinů (např. protein A) nebo pomocí afinitního systému biotin-avidin (viz kap. 2.5.1) (Hermanson a kol. 1992, Turková 1993). Naprosto nezbytná je orientovaná vazba v případě imobilizace oligonukleotidu, který má následně hybridizovat s komplementárním řetězcem ssDNA ze vzorku. Orientované imobilizace nukleových kyselin lze docílit například 30
využitím systému biotin-avidin, komplementarity mezi oligo(dT) a polyA konce mRNA, fosforamidovou metodou vazby nebo s využitím tzv. samoskladných monovrstev (viz kap. 2.5.2). 2.5.1 Nekovalentní techniky imobilizace ligandů Prostá adsorpce bioligandu na nosič na základě elektrostatických interakcí nevyžaduje žádnou předchozí chemickou modifikaci ligandu, je tak populární a široce používanou technikou. V případě amfoterních proteinů může být například využita při pasivní vazbě protilátek na jamky polystyrenových ELISA destiček. Polystyrenové povrchy jsou přirozeně hydrofobní, adsorpce protilátek v prostředí blízkému jejich izoelektrickému bodu je tak důsledkem komplexního působení hydrofobních sil, van der Waalsových, iontových a vodíkových interakcí (Davies 2013). S ukotvením ligandu na základě elektrostatických interakcí se rovněž často setkáváme u imobilizace DNA. Jelikož je DNA díky přítomnosti fosfátových skupin negativně nabitá, nabízí se její adsorpce na pozitivně nabité povrchy. Obecnými nevýhodami prosté adsorpce je možnost zpětné desorpce navázaného ligandu, nepředvídatelná orientace ligandu na pevné fázi, možnost nízké účinnosti vazby a rovněž riziko nespecifické adsorpce balastního materiálu ze vzorku (He 2013). Zvláštním případem nekovalentní imobilizace bioligandů je afinitní vazba. V případě afinitního páru avidin-biotin se jedná se o nejsilnější známou nekovalentní interakci - afinitní konstanta dosahuje hodnot až 1015 mol.l-1. Vazba mezi avidinem a biotinem je odolná i vůči extrémně chaotropním podmínkám, např. působení 8M guanidin hydrochloridu o pH 5,2 (Hermanson 2013). Tento typ vazby tak tvoří rozhraní mezi kovalentními a nekovalentními technikami imobilizace. Nejčastějším případem ukotvení biospecifického ligandu pomocí interakce avidin-biotin je použití stacionární fáze s navázaným avidinem, se kterým následně interaguje biotinylovaný ligand. V tomto uspořádání je avidin teoreticky schopen interagovat s až čtyřmi molekulami biotinu (schéma interakce je znázorněno na Obrázku 10). Kromě avidinu jsou pro tyto interakce využívány i jiné biotin-vázající proteiny. Jedná se o následující deriváty avidinu lišící se chemickou strukturou a tudíž i fyzikálně chemickými vlastnostmi (pI, rozpustností ve vodném prostředí, disociační konstantou): streptavidin, neutravidin, nitroavidin (Morag a kol. 1996) známý pod komerčním názvem jako CaptAvidin, rhizavidin (Helppolainen a kol. 2007) a další.
31
Obrázek 10: Schéma interakce mezi biotinem konjugovaným s protilátkou třídy IgG a avidinem (převzato z Johnstone a Thorpe 1996).
Dalším
příkladem
vysokoafinitní
a tzv. imunoglobulin-vázajícími
vazby
proteiny
jsou
interakce
odvozenými
od
mezi
imunoglobuliny
sekrečních
produktů
grampozitivních koků - proteiny A, G, A/G, L, H, aj. (Johnstone a Thorpe 1996). Nejčastější z nich, Protein A, je 42kDa protein teoreticky schopný afinitní vazby s až čtyřmi molekulami IgG, které mohou následně sloužit jako biospecifické ligandy pro izolaci analytu. Afinitní konstanta mezi proteinem A a molekulou IgG dosahuje hodnot až 108 mol.l-1 (Hermanson a kol. 1992). Vazbu IgG (bioligandu) přes protein A přítomný na nosiči lze ještě dodatečně posílit vytvořením vazby kovalentní. Příkladem je dodatečné irreverzibilní síťování homobifunkčními činidly nesoucími terminální -NHS estery (Huang a Kim 2013) nebo kovalentní provázaní fotoreaktivním analogem aminokyselin (Hui a kol. 2014). 2.5.2 Kovalentní techniky imobilizace ligandů Kovalentní vazba představuje nejpevnější možné ukotvení ligandu, které odolává i extrémním podmínkám prostředí, jako např. teplotě, pH, vysokému tlaku, prostředí o vysoké iontové síle aj. Tento typ vazby je ireverzibilní. Imobilizační techniky, které vedou ke vzniku kovalentní vazby, jsou tak v současnosti nejčastěji používanými metodami a byly přehledně shrnuty v publikacích (Hermanson a kol. 1992, Hermanson 2008). Nejčastěji využívanými skupinami pro vazbu ligandů jsou aldehydové, karboxylové, thiolové, hydroxylové a aminové skupiny. Pro tyto reakce bylo proto vyvinuto velké množství konjugačních nebo aktivačních činidel (výběr nejčastějších v Tabulce 4) lišících se optimálním prostředím, ve kterém působí, a svojí rozpustností. Podmínky vazby musí být především šetrné ke konjugovanému ligandu, jehož aktivitu je nutné zachovat pro následnou biospecifickou interakci; výběr těchto činidel je tedy přímo závislý na typu ligandu, který bude imobilizován. 32
Tabulka 3: Příklady nejpoužívanějších biokonjugačních činidel (výběr z Hermanson 2008).
Reagující skupiny karboxylové a primární aminy
primární aminy a primární aminy
thioly a primární aminy
Konjugační/aktivační činidlo
Zkratka
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid N,N´-karbonyldiimidazol 1-cyklohexyl-3-(2-morfolinoethyl) karbodiimid dicyklohexyl karbodiimid glutaraldehyd formaldehyd sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-3acetát dithio bis(sulfosukcinimidyl propionát) sulfosukcinimidyl 4-(N-maleiimidomethyl)cyklohexan-1-karboxylát maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimid ester
EDC/EDAC CDI CMC DCC GTA FA sulfoSAMCA DSP sulfo-SMCC MBS
Biokonjugační činidla mohou zprostředkovat ukotvení ligandu bez nutnosti včlenění spojovacího článku mezi ligand a nosič (tzv. „činidla s nulovou délkou“, angl. zero-length crosslinkers; např. EDC, CDI, CMC, DCC) nebo naopak mohou vnést do vazby nové atomy, a v některých případech tak působit jako raménko. Druhý zmíněný typ činidel můžeme dále rozdělit na činidla homobifunkční, zpravidla osově souměrná síťovadla nesoucí na obou svých koncích identické reaktivní skupiny (např. DSP, GTA, FA), a heterobifunkční, nesoucí skupiny
rozdílné
(např.
sulfo-SMCC,
sulfo-SAMCA,
MBS).
Zajímavými
typy
biokonjugačních činidel jsou tzv. UV světlem aktivovatelné linkery (Brunner 1993, Hermanson a kol. 1992) a trifunkční činidla obsahující tři reaktivní skupiny, z nichž jedno bývá obsazeno biotinem (Goddard a Hotchkiss 2007, Hermanson 2008). 2.5.2.1
Vybrané techniky kovalentní imobilizace ligandů
Mezi tradiční metody imobilizace afinitních ligandů na polysacharidové nosiče typu agarózy patří aktivace kyanbromidem (CNBr) (Axen a kol. 1967). Tato metoda jako historicky první umožnila ukotvení ligandu na nosič, aniž by došlo ke ztrátě biologické aktivity ligandu; její objev je tak spjat s velkým pokrokem na poli bioafinitní chromatografie (Kohn a Wilchek 1984). CNBr aktivuje –OH skupiny nosiče a mění je na reaktivní imidokarbonáty, které následně reagují s –NH2 skupinami ligandu za vzniku různých derivátů (deriváty isomočoviny, imidokarbonáty a N-substituované karbamáty). Výhodou metody je možnost pracovat ve vodném prostředí, nevýhoda naopak spočívá v těkavosti a toxicitě kyanbromidu a ve snížené stabilitě vazby.
33
V 70. letech 20. století byla rovněž popsána triazinová metoda vyvinutá pro vazbu enzymů na celulózové nosiče (Kay a Crook 1967). Tato metoda využívá kyanurchloridů (derivátů 2,4,6-trichloro-s-triazinu), které po reakci s hydroxylovými skupinami nosičů umožňují kovalentní vazbu molekul s aminoskupinami. Obdobně lze využít i epichlorhydrin, který po aktivaci nosiče s hydroxylovou skupinou vytváří reaktivní epoxy skupinu schopnou vytvářet vazbu s nukleofilními sloučeninami obsahujícími amino-, hydroxylové nebo thiolové skupiny (Matsumoto a kol. 1979). Obdobně jako CNBr jsou však kyanurchlorid i epichlorhydrin toxické reagencie a jsou-li dnes pro imobilizaci ligandu využívány, pak zpravidla
již
v podobě
konjugátů
s komerčně
dostupnými
nosiči
(např.
agaróza
aktivovaná CnBr). V dnešní době nejpoužívanějšími činidly pro biokonjugační reakce je skupina karbodiimidů. Zprostředkovávají amidovou vazbu mezi karboxylovou a amino funkční skupinou nebo fosforamidovou vazbu mezi aminem a fosfátem (Chu a Orgel 1988, Ghosh a kol. 1990, Hoare a Koshland Jr. 1966). Karbodiimidy se osvědčily zejména při imobilizaci proteinů, peptidů a oligonukleotidů na nejrůznější povrchy a při konjugaci těchto biomolekul navzájem (mnohokrát shrnuto v (Al-Warhi a kol. 2012, El-Faham a Albericio 2011, Hermanson 2008, Williams a Ibrahim 1981). Tyto látky se dělí na skupinu ve vodných roztocích
rozpustných
karbodiimidů
a
skupinu
karbodiimidů
rozpustných
pouze
v organických rozpouštědlech. Nejčastěji používaným karbodiimidem je ve vodě rozpustný 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid hydrochlorid (EDC, EDAC). Po reakci EDC s nosičem nebo s biomolekulou, zpravidla proteinem, obsahující karboxylovou funkční skupinu se vytváří vysoce reaktivní meziprodukt (o-acylisomočovina). Ten následně reaguje s nukleofilní aminoskupinou a vznikne stabilní amidová vazba. Přídavek sodné soli N-hydroxysulfosukcinimidu (sulfo-NHS) do reakce zvýší rozpustnost aktivního intermediátu a zároveň prodlouží jeho stabilitu, čímž zvýší pravděpodobnost kolize s aminoskupinou, se kterou záhy vytváří amidovou vazbu (Obrázek 11). V případě orientované imobilizace DNA se využívá reaktivity EDC s 5´ terminální fosfátovou skupinou oligonukleotidu. Vzniklý reaktivní fosfodiesterový intermediát poté vytváří fosforamidovou vazbu s nosičem nebo s oddalujícím raménkem nesoucím nukleofilní aminoskupinu. Přídavek imidazolu do reakce a následná tvorba dalšího meziproduktu (fosforimidazolidu) zajišťuje vyšší reaktivitu a tudíž i vyšší výtěžky konjugace (Hermanson 2008).
34
Obrázek 11: Mechanismus konjugace molekul s karboxylovou a aminoskupinou pomocí činidel EDC a sulfoNHS. Převzato z (Hermanson 2008).
Konjugační činidla odvozená od imidů kys. maleinové (maleiimidů) patří mezi oblíbená heterobifunkční činidla nesoucí na jednom konci zpravidla reaktivní ester, který reaguje nukleofilní substitucí s primárními aminoskupinami, a na svém druhém konci maleiimid schopný tvořit thioetherovou vazbu s thioly. Příkladem je ve vodě rozpustný sulfo-SMCC (Obrázek 12a) a ve vodě nerozpustný SMCC. Jedná se o činidla využívaná zejména pro biokonjugace proteinů.
(A)
(B)
Obrázek 12: (a) Strukturní vzorec sulfo-SMCC (b) Schéma oxidace hydroxylových skupin cukrů protilátky třídy IgG jodistanem sodným na reaktivní aldehydy. Převzato z (Hermanson 2008).
Častým typem reakce je konjugace vysoce reaktivních aldehydů s hydrazidovými skupinami nebo aminoskupinami. Těmito konjugacemi vznikne hydrazonová vazba (v případě reakce s hydrazidy) nebo labilní Schiffova báze (v případě reakce s aminy), kterou je nutné následně stabilizovat reduktivní aminací. Tohoto chemismu se využívá např. při orientované imobilizace protilátek třídy IgG nebo jiných glykoproteinů. Protilátky IgG však ve své struktuře nenesou přirozené aldehydové skupiny pro vazbu, proto je nutné nejdříve oxidovat hydroxylové skupiny glykoproteinů přítomné na druhé konstantní doméně těžkého řetězce Fc části IgG. Oxidací (nejčastěji jodistanem sodným, NaIO4) dochází
35
k vytvoření aldehydů (Obrázek 12b), které poté reagují s amino- nebo hydrazidovými skupinami nosiče. Další atraktivní možností kovalentní imobilizace ligandů jsou tzv. samoskladné monovrstvy (angl. Self-Assembled Monolayers, SAM). Jedná se o speciální případ spontánní chemisorpce, kterou lze imobilizovat organické látky, nejčastěji alkanthioly, na povrchy složené z kovů, oxidů kovů nebo polovodičů (shrnuto v (Chaki a Vijayamohanan 2002, Love a kol. 2005). Příkladem bioafinitního „samoskládání“ je spontánní vazba thiolovaných oligonukleotidů na vzácné kovy, nejčastěji zlato nebo platinu (Sakao a kol. 2005, Wong a kol. 2005). Po konjugaci bioaktivního ligandu s nosičem je nutné neobsazené reaktivní skupiny nosiče tzv. zablokovat. Důvodem blokace je potlačení nežádoucích nespecifických interakcí mezi reaktivními skupinami nosiče a analytem nebo balastními látkami přítomnými v analyzovaném vzorku v průběhu bioafinitní chromatografie. Blokace se provádí zpravidla organickými látkami inertní povahy, které nesou takovou funkční skupinu, aby mohly s reaktivní skupinou nosiče reagovat. K blokaci aldehydových nebo karboxylových skupin nosičů se využívá nejčastěji Trisu, ethanolaminu, k blokaci aminoskupin pak sulfo-NHS acetátu, anhydridu kys. octové nebo maleinové. Další možností blokace nosičů je pomocí inertních proteinů (hovězí sérový albumin, kasein, želatina) nebo komplexním materiálem – např. nízkotučným sušeným mlékem.
36
2.6
Vsádkové a průtokové systémy pro bioafinitní interakce Techniku bioafinitní chromatografie lze provádět v závislosti na konkrétní aplikaci
v různém uspořádání – vsádkovém i průtokovém, na tradičních nebo alternativních nosičích, v reakčních objemech v řádu mikrolitrů až po litry. Masivnímu rozšíření této techniky do průmyslu brání vysoké pořizovací ceny a nižší stabilita bioaktivních ligandů společně s nižší robustností metody ve srovnání s jinými technikami kapalinové chromatografie (Clonis 2006, Labrou 2003). Ve vsádkovém (diskontinuálním) uspořádání (angl. batch) lze pracovat v různých typech reakčních nádob, oblíbené jsou polypropylenové mikrozkumavky o objemu 1,5 nebo 2 ml. Jako stacionární fáze lze ve vsádkovém uspořádání použít různé typy nosičů, největší oblibě se však těší nosiče magnetické, jelikož je při práci s nimi možné eliminovat centrifugační kroky, práce s nimi je jednoduchá a rychlá (viz kap. 2.3.1). Pro magnetické bioafinitní separace se využívají různé typy magnetických separátorů speciálně vyrobených pro manipulaci částic v mikrozkumavkách (Obrázek 13a), mikrotitračních destičkách (Obrázek 13b), kyvetách, centrifugačních 15 ml nebo až 50 ml zkumavkách. Pro separaci z větších objemů jsou konstruovány vysokogradientové separátory (angl. High-GradientMagnetic Separators, HGMS). Pro magnetickou separaci buněk byly vyvinuty separátory pro MACS technologii (Miltenyi Biotec), kde jsou cílové buňky ve směsi označeny magnetickými nanočásticemi (o velikosti 50 nm) a směs je poté přivedena na kolonu obsahující ferromagnetický materiál. Kolona je během separace umístěná v magnetickém separátoru (Obrázek 13c). Označené buňky zůstanou zadrženy v koloně, zbytek směsi projde kolonou beze změny. Eluce cílových buněk s magnetickými nanočásticemi probíhá vyjmutím kolony z magnetického separátoru. S magnetickými nosiči lze manipulovat i opačně – po proběhnutí reakce lze magnetický nosič odebrat pomocí magnetických per nesoucích komerční název „PickPen“ (Šafařík a Šafaříková 2004).
Obrázek 13: Příklady vsádkových magnetických separátorů: (a) separátor na 1,5 ml zkumavky (Life Technologies); (b) separátor na mikrotitrační destičky (Chemicell); (c) MACS separátor (Miltenyi Biotec).
37
Průtokové (kontinuální) uspořádání bioafinitní chromatografie nabízí ve srovnání se vsádkovým větší různorodost. Tradičně se tato technika provádí v klasickém sloupcovém uspořádání ve skleněných nebo plastových kolonách nebo mikrokolonách, ve kterých vytváří nosič (nejčastěji dextran nebo celulóza, viz Tabulka 1) kompaktní lože (angl. packed bed; Obrázek 14a). Alternativou k tomuto uspořádání se stala fluidní neboli expandovaná vrstva/lože (angl. fluidized bed) (Obrázek 14b). Vzorek je v tomto případě přiváděn k nosiči ze spodní části kolony. Nosič je během reakce se vzorkem neustále ve vznosu, jelikož je vyrovnána gravitační síla nosiče se silovými účinky proudící kapaliny. Ve srovnání s kompaktním ložem je tak docíleno rychlejšího přestupu hmoty a nižšího rizika ucpání kolony při aplikaci komplexního vzorku (Roy a Gupta 2006, Spence a Bailon 2000). Technika fluidního lože byla poté zdokonalena jeho kombinací s magnetickými nosiči, čímž vznikla metoda magneticky stabilizovaného fluidního lože (angl. Magnetically Stabilized Fluidized Beds, MSFB; Obrázek 14c), kde je nosič navíc zafixován magnetickými silami v reakční komoře (Hristov a Fachikov 2007, Webb a kol. 1996).
Obrázek 14: Kolony pro průtokové uspořádání afinitní chromatografie: schéma náplňové kolony s (a) kompaktním nosičem (upraveno dle Roy a Gupta 2006); (b) s fluidním ložem (upraveno dle Roy a Gupta 2006); (c) s magneticky stabilizovaným fluidním ložem (C; převzato z Putnam a kol. 2003).
Miniaturizace v průtokovém uspořádání bylo dosaženo vyvinutím mikroprůtokových systémů (kapilár, čipů), ve kterých lze analyzovat vzorek o objemu jednotek mikrolitrů až nanolitrů (více v kap. 2.6.1). Nespornou výhodou všech průtokových systémů je možnost jejich on-line spojení s další technikou (nejčastěji detekční - spektrofotometrie, fluorescence, konduktometrie, apod.), nevýhodou je pak ve srovnání se vsádkovými technikami náročnější provedení a často i potřebná instrumentace (pumpy, regulátory průtoků, apod.). 38
2.6.1 Bioafinitní nosiče v mikrofluidních systémech Trendem v bioafinitní chromatografii se stejně jako v celé bioanalytické chemii stala automatizace a miniaturizace (Ríos a kol. 2006). Smysl těchto trendů je zřejmý – snížení nákladů na analýzu díky snížení objemů používaných reagencií, snížení objemu analyzovaného vzorku (krve, plazmy, séra, mozkomíšního moku), možnost rychlé a paralelní analýzy více vzorků (tzv. „high-throughput), kompatibilita s detekčními systémy, rychlejší reakční časy díky rychlé difúzi, v nejvyspělejších
zemích
světa
do
rozšíření technologií ze speciálních laboratoří přenosných
nízkonákladových
systémů
apod.
Miniaturizace a automatizace se stala univerzálním „všelékem“ a ovládla celé odvětví bioanalýzy, přestože ne vždy je zcela opodstatněná (de Castro a Capote 2008). Většina vyvíjených mikro- a nanosystémů funguje zatím na ideálních vzorcích (Crevillén a kol. 2007). Mikrofluidní analytické a separační systémy, neboli mikrofluidní čipy, jsou průtoková zařízení pracující s kapalinami v kanálcích a rezervoárech o velmi malých rozměrech – desítkách až stovkách µm (zpravidla do 500 µm). Pomocí takových čipů lze velice přesně pracovat s kapalinami o objemu několika nanolitrů až attolitrů (Whitesides 2006). Proudění kapaliny bývá z důvodu nízkých Reynoldsových čísel laminární, čili neturbulentní, a k míchání dochází pouze vlivem difuze. Rychlosti průtoků dosahují nejčastěji několika jednotek mikrolitrů za minutu. Z těchto důvodů je možné velmi dobře předvídat pohyb kapaliny i difuzi látek v mikrofluidním čipu a pomocí speciálních softwarů tyto jevy počítačově simulovat (softwary COMSOL, FEMM, atd.). Rozměry typického mikrofluidního kanálku pro elektroforetickou separaci jsou (š x v x d): 50 µm x 15 µm x 5 cm; vnitřní objem kanálku tak činí 37,5 nl (Nge a kol. 2013). Pracujeme-li pak s čipy, které mají alespoň jeden rozměr do 100 nm (Abgrall a Nguyen 2008), nehovoříme již o systémech mikrofluidních, ale nanofluidních. Vrcholem těchto fluidních systémů je tzv. laboratoř na čipu (Lab-on-aChip, LoC), zařízení o velikosti několika čtverečních centimetrů integrující všechny kroky analýzy od zpracování komplexního vzorku až po detekci analytu za současné maximální míry automatizace (Reyes a kol. 2002) (Obrázek 15). Do LoC lze včlenit takové procesy jako například sekvenaci (Paegel a kol. 2003) a PCR nukleových kyselin (Khandurina a kol. 2000), kapilární elektroforézu (Fang a kol. 2002), 2D-elektroforézu (Chen a Fan 2009), kapalinovou chromatografii (Lazar a kol. 2006), jejich kombinace a mnoho dalších technik.
39
Obrázek 15: Schématické znázornění Lab-on-a-Chip systému.
Princip bioafinitní chromatografie byl ve spojení s mikrofluidikou využit zejména pro různé typy imunoanalytických metod (Hayes a kol. 2001, Herrmann a kol. 2007), separace proteinů (Otieno a kol. 2014), virů (Zhang a kol. 2013) a prokaryotických (Guan a kol. 2010) nebo eukaryotických buněk (Furdui a Harrison 2004, Saliba a kol. 2010). Mikrofluidní systémy bývají rovněž často využívány pro extrakci a purifikace DNA. Techniky její čipové izolace však bývají nejčastěji založeny na principu extrakce na pevné fázi (Wen a kol. 2008), nejedná se tedy o separaci založenou na biospecifických interakcích, jako je tomu u bioafinitních separací. Historicky první mikrofluidní čipy byly vyrobeny z anorganických materiálů – nejdříve ze silikonu, později i ze skla. Během posledních 15 let získaly v mikrofluidice velkou pozornost relativně levné organické polymery, elastomery (polydimethylsiloxan, PDMS) a termoplasty (polymethylmethakrylát, PMMA; kopolymer cyklického olefinu, COC). Velké oblibě se rovněž těší celulózové čipy, čili papírové, a to zvláště díky své extrémně nízké výrobní ceně, nenákladné likvidaci, biokompatibilitě, snadné funkcionalizaci a možnosti vytvoření vzoru (tzv. „patternu“) čipu pomocí vosku. V dnešní době je v akademické sféře nejpoužívanějším materiálem pro výrobu mikrofluidních čipů PDMS (shrnuto v Nge a kol. 2013, Ren a kol. 2014). Příklady čipů vyrobených z různých materiálů jsou zobrazeny na Obrázku 16. Jednotlivé materiály se vzájemně odlišují způsobem výroby i fyzikálněchemickými vlastnostmi: ohebností, propustností pro vzduch a další plyny, elektrickou vodivostí,
povrchovým
nábojem
(elektroendoosmotický
tok,
EOF),
kompatibilitou
s používanými roztoky (zvláště s organickými rozpouštědly), biokompatibilitou nebo optickou transparentností (Shadpour a kol. 2006). Výrazný rozvoj mikrofluidiky v posledních 20 letech byl přirozeně doprovázen i množstvím společností nabízejícími ve svém portfoliu výrobu mikrofluidních čipů nebo také hotové přístroje využívající mikrofluidní technologie. Mezi nejznámější výrobce dnes patří například Abbott, Agilent, Caliper, Dolomite, Micralyne, Microfluidic Chip Shop, Micrux Technologies a Waters.
40
Obrázek 16: Příklad mikrofluidních čipů z různých materiálů: (a) polystyren (Young a kol. 2011), (b) papír (Martinez a kol. 2010), (c) kopolymer cyklického olefinu; COC (Miserere a kol. 2012).
Přizpůsobení techniky bioafinitní chromatografie do miniaturizovaného formátu čipů vyžaduje ukotvení biospecifických ligandů do nitra mikrofluidních systémů. Toho lze dosáhnout dvěma postupy. Prvním z nich je biofunkcionalizace vnitřní stěny kanálků (Lahann a kol. 2003), které mohou být navíc tzv. nanostrukturované, čímž je dosaženo jejich vyššího specifického povrchu pro vazbu ligandů (Malhotra a kol. 2012). Druhou možností je vložení stacionárních fází s již imobilizovanými ligandy do soustavy kanálků nebo reakčních cel. Můžeme se setkat s monolitickými fázemi (Celebi a kol. 2012, Ro a kol. 2006) nebo častěji se sférickými nemagnetickými nebo magnetickými částicemi (Gijs a kol. 2010, Gijs 2004, Pamme 2012). Jsou-li částice v čipech pouze unášeny tokem proudícího vzorku, je pravděpodobnost interakce mezi ligandem na nosiči a analytem ze vzorku výrazně snížená. Z tohoto důvodu se využívá zafixování částic v reakčních komůrkách – v případě nemagnetických částic zpravidla mechanicky, tj. pomocí filtrů (Moorthy a kol. 2004), chemicky (Gumpenberger a kol. 2006, Liuni a kol. 2010) nebo například kombinací afinitních a fyzikálních interakcí (Malmstadt a kol. 2003). Při použití částic magnetických se přirozeně využívá možnosti jejich jednoduché a efektivní fixace v čipu pomocí externího magnetického pole. K zafixování magnetických částic v požadované oblasti čipu se používají silné permanentní neodymové magnety (neodym-železo-bor, NdFeB) (Otieno a kol. 2014, Slováková a kol. 2005) nebo elektro- a mikroelektromagnety (cívky) (Choi a kol. 2002). Magnety bývají v mikrofluidních čipech umísťovány externě - magnetické síly působící na magnetický nosič uvnitř soustavy kanálků jsou tak nezávislé na pH, iontové síle a teplotě okolní kapaliny. Výhodou permanentních magnetů je jejich jednoduché použití bez nutnosti připojení ke zdroji elektrického napětí, jejich dostupnost v mnoha velikostech i tvarech a vysoká magnetická indukce (v řádku stovek mT až k 1 T). Naproti tomu magnetické pole generované elektromagnety dosahuje nižších hodnost magnetické indukce a dochází 41
k výraznému zahřívání systémů umístěných uvnitř magnetického pole. Naopak mezi výhody elektromagnetů patří možnost přesného nastavení intenzity elektrického pole, vytvoření požadovaného gradientu, integrace elektrod do čipů a podobně. Další velkou výhodou je možnost magnetické pole zapnout a vypnout bez nutnosti přikládání/odstraňování magnetu, jako je tomu v případě permanentních magnetů (shrnuto v (Cetin a kol. 2014, Pamme 2006). Zvolením vhodné geometrie čipu, vzájemné pozice i síly magnetů a umístěním magnetických „kotev“ pak mohou částice nabývat v čipech mnoha uspořádání. Příkladem je čip s magnetickými částicemi, které vytvořily nepohyblivou zátku (angl. plug) dobře prostupnou
pro
analyzovaný
vzorek
(Obrázek
17a)
(Slováková
a
kol.
2005)
nebo samoskladné (angl. self-assembled) řetízky na předem vytvořených magnetických kotvách (Obrázek 17b) (Saliba a kol. 2010). Novinkou je pak mikrofluidní čip pracující na principu MSFB, ve kterém jsou magnetické částice neustále ve vznosu a navíc cirkulují, čímž je dosaženo jejich maximálního možného kontaktu s molekulami analytu (Obrázek 17c) (Viovy a kol. 2014).
Obrázek 17: Příklady mikrofluidních čipů s magnetickými částicemi. (a) mikrokanálek s magnetickou zátkou (Slováková a kol. 2005); (b) samoskladné řetízky magnetických částic na prefabrikovaných magnetických kotvách (Saliba a kol. 2010); (c) mikrofluidní magneticky stabilizované fluidní lože (Pereiro a kol. 2014).
Mezi největší výhodu používání magnetických částic v mikrofluidice patří snadná manipulace. Částice lze v mikrofluidních systémech cíleně a přesně ovládat - je možné je zachytit, přepravovat je z místa na místo, promíchat je (Gijs a kol. 2010). V průtoku je lze separovat
ve
speciálně
větvených
kanálcích
od
balastního
materiálu
pomocí
tzv. magnetoforézy (viz Obrázek 18a) (Lee a kol. 2011). Lze je také využít jako nástroj k dalším potřebným krokům – k míchání okolní kapaliny, k přenosu analytů navázaných na jejich povrchu z jednoho prostředí do druhého, ke značení analytů nebo k jejich detekci a podobně (shrnuto ve van Reenen a kol. 2014). Použití částic v mikrofluidních systémech je 42
výhodné i z důvodu vysoké pravděpodobnosti setkání ligandu navázaného na částicích s cílovým analytem, a tedy i vyšší účinnosti separace. Vyšší pravděpodobnost setkání je způsobena malými reakčními objemy, ve kterých separace probíhá, což je spojeno s rychlou difuzí látek a s minimálními vzdálenostmi, které musí reakční partneři urazit. Naopak mezi nevýhodu používání magnetických částic v mikrofluidním uspořádání patří velmi vysoké nároky kladené na jejich kvalitu. Ty bývají zpravidla vyšší než požadavky na částice pro vsádkové uspořádání. Aby bylo možné částice cíleně a kontrolovaně ovládat, je nutné, aby navzájem neagregovaly, aby neadsorbovaly na stěny čipů a aby měly povrch ošetřený tak, aby míra nespecifické adsorpce proteinů, buněk nebo dalších složek komplexního biologického materiálu byla minimální. Povrch částic je tak často nutné blokovat a povrchově modifikovat.
Obrázek 18: (a) Mikrofluidní průtoková magnetoforetická separace hemoglobinu (Hb) na PDMS čipu pomocí magnetických silika částic (SMNC) a permanentního magnetu (Lee a kol. 2011); (b) Manipulace s magnetickými částicemi v kapce pomocí permanentního magnetu umístěného pod čipem (Shikida a kol. 2004); (c) schématické znázornění protokolu pro heterogenní imunoanalytickou reakci na DMF platformě: (1) injekování mikrokapky (1 µL) s vyšetřovaným analytem a mikrokapky (3 µL) s primárními Ab na magnetických částicích, se sekundární Ab značenou alkalickou fosfatázou a s blokačními proteiny mezi hydrofobní vrstvy skla a obklopení kapek silikonovým olejem, (2) smíchání kapek metodou „elektrosmáčení“ a promíchání pomocí permanentního magnetu umístěného pod čipem, vznik imunokomplexu, (3) fixace imunokomplexu magnetem a (4) odmytí nenavázaných molekul, (5) promytí imunokomplexu a smíchání s 1 µL chemiluminiscenčního substrátu (Sista a kol. 2008).
43
Mezi nové směry mikrofluidiky patří tzv. digitální mikrofluidika (angl. digital microfluidics, DMF). Jedná se o techniku založenou na manipulaci s „mikrokapkami“ o objemu pikolitrů až nanolitrů, kde každá taková kapka slouží jako samostatný mikroreaktor. Kapky se jednotlivě pohybují v hydrofobní kapalině v definovaných mikrokanálcích (poté se techniky označují častěji jako tzv. „droplet microfluidics“) nebo častěji je směr jejich pohybu řízen integrovanými elektrodami, které umožňují jejich ovládání – promíchání, rozdělení i opětovné sloučení. Pohyb mikrokapek podél elektrod funguje nejčastěji na principu tzv. „elektrosmáčení“ (angl. electrowetting on dielectrics) (shrnuto v Choi a kol. 2012, Kokalj a kol. 2015). Jelikož mohou jednotlivé mikrokapky přenášet i částicový materiál, nabízí se tak jejich spojení s magnetickými částicemi, které navíc zvyšují kontrolovatelnost pohybu kapek pomocí magnetických sil a mohou sloužit jako pevná fáze přenášející mezi jednotlivými kapkami analyty/reagencie nebo jako optický indikátor (viz Obrázky 18b a 18c). Za pionýrskou práci je v této oblasti považován studie Ulrike Lehmannové z r. 2006, která publikovala práci o extrakci a purifikaci DNA na magnetických silika částicích v DMF čipu (Lehmann a kol. 2006). 2.6.2
Specifika mikrofluidních systémů pro buněčné aplikace
Mikrofluidní „boom“ posledního desetiletí zasáhl kromě jiných i celé odvětví proteomiky, buněčné biologie a mikrobiologie. Pro oblast mikrofluidních systémů zabývajících se kultivací buněk na čipu, jejich manipulací, tříděním a analýzou se vžil název „cellomics“ (Andersson a van den Berg 2003). Většina publikací pojednávajících o mikrofluidní magnetické separaci buněk se zabývá záchytem leukocytů, buněk asociovaných s rakovinou (jako např. cirkulující nádorové buňky – angl. circulating tumor cells, CTC) nebo bakterií, a to zpravidla z plné krve nebo séra. Magnetické částice lze v mikrofluidních systémech pro buněčné aplikace využít buď jako imunoafinitní nosič pro prekoncentraci a purifikaci buněk nebo jako magnetické značky. Buňky mohou být magneticky označeny pomocí magnetických částic navázaných na jejich povrchu nebo mohou být buňkou pohlceny, fagocytovány. Manipulujeme-li s buňkami v mikrofluidních systémech a chceme-li zachovat jejich viabilitu (a tudíž i exprimaci a stérickou přístupnost povrchových antigenů), je potřeba ověřit v prvé řadě biokompatibilitu materiálu čipu, všech používaných pufrů a reagencií. Neméně podstatné je ověřit odolnost používaných buněk vůči tlakům a teplotám, se kterými buňky při průchodu mikrofluidními systémy přijdou do kontaktu. Lyze buněk v mikrofluidních systémech může znamenat selhání celé analýzy – může dojít k uvolnění buněčného obsahu včetně plazmatických proteinů a DNA, což může vést 44
ke snížené průchodnosti až k totálnímu ucpání mikrofluidního systému. Z tohoto důvodu je výhodnější použití bakteriálních buněk, které mají na svém povrchu buněčnou stěnu. Ta bývá odolnější než vnější struktury eukaryotických buněk, bakteriím dodává kromě pevnosti i elasticitu a flexibilitu. Bakteriální buňky mívají rovněž menší rozměry než běžné eukaryotické buňky; v případě jejich lyze tak většinou k ucpávání kanálků nedochází. Dalším problematickým aspektem mikrofluidních separací buněk je jejich detekce. Eluce viabilní buňky, která je imunoafinitně navázaná na magnetický nosič, je značně náročná. Běžná eluční činidla používaná pro eluci ostatních bioanalytů (proteiny, peptidy) jsou pro buňku zpravidla neslučitelná se životem (kyselá nebo zásaditá eluce, eluce změnou iontové síly pufru, teploty, vlivem přídavku detergentů). Slibnou variantou je kompetitivní eluce nadbytkem volné protilátky, což je v případě specifických protilátek možnost účinná, ale také značně finančně nákladná. Z tohoto důvodu se vyvíjí např. syntetické peptidy soutěžící o buněčný receptor s protilátkou imunokomplexu (např. peptid PR34+ Stem Cell Releasing Agent pro eluci CD34-pozitivních buněk, Baxter). Další možností je použití proteolytických enzymů (např. chymopapain) narušujících povrchové znaky CD buněk nebo použití polyklonálních protilátek reagujících s Fab fragmentem protilátky imunokomplexu (komerčně dostupné proti vybraným CD znakům pod názvem DETACHaBEAD®, Life Technologies) (shrnuto v Šafařík a Šafaříková 1999). V současné době však není dostupné žádné univerzální a robustní řešení pro šetrnou a účinnou eluci buněk. Detekce buněk po jejich mikrofluidním záchytu tak bývá založena na tradičních optických (mikroskopických) metodách, na použití fluorescenčních značek v kombinaci s fluorimetry nebo příslušnými mikroskopickými technikami, na molekulárně-biologických (PCR a její varianty) a imunoanalytických metodách (ELISA). V případě buněk bakteriálních lze buňky po jejich záchytu i vyočkovat na živná média a vykultivovat pomocí tradičních mikrobiologických metod.
45
3 SEZNAM LITERATURY Abgrall, P. a Nguyen, N.T., 2008. Nanofluidic devices and their applications. Anal. Chem., 80 (7), 2326-2341. Al-Warhi, T.I., Al-Hazimi, H.M.A. a El-Faham, A., 2012. Recent development in peptide coupling reagents. J. Saudi Chem. Soc., 16 (2), 97-116. Amirshakhi, N., Alyautdin, R.N., Orlov, A.P., Poloznikov, A.A. a Kuznetsov, D.A., 2008. A fullerene C-60-based ligand in a stationary phase for affine chromatography of membrane porphyrin-binding proteins. Russ. J. Phys. Chem. A, 82 (11), 1952-1957. Andersson, H. a van den Berg, A., 2003. Microfluidic devices for cellomics: a review. Sens. Actuator B-Chem., 92 (3), 315-325. Andrä, W., Häfeli, U., Hergt, R. a Misri, R., 2007. Application of magnetic particles in medicine and biology. In: Handbook of magnetism and advanced magnetic materials. John Wiley & Sons, Ltd ISBN 9780470022184. Assali, M., Pernia Leal, M., Fernandez, I. a Khiar, N., 2013. Synthesis and non-covalent functionalization of carbon nanotubes rings: new nanomaterials with lectin affinity. Nanotechnology, 24 (8), 085604. Audonnet, V., Malaquin, L. a Viovy, J., 2011. Polymeric coatings on micro- and nanometric particles for bioapplications. Bioanal. Rev., 3 (2), 41-66. Axen, R., Porath, J. a Ernback, S., 1967. Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides. Nature, 214 (5095), 1302. Basinska, T., 2005. Hydrophilic core-shell microspheres: A suitable support for controlled attachment of proteins and biomedical diagnostics. Macromol. Biosci., 5 (12),1145-1168. Batista-Viera, F., Janson, J. a Carlsson, J., 2011. Affinity chromatography. In: Protein purification. John Wiley & Sons, Ltd., pp. 221-258 ISBN 9780470939932. Baumgarten, P., 1971. Electrostatic spinning of acrylic microfibers. J. Colloid Interface Sci., 36 (1),71. Begin-Colin, S. a Felder-Flesch, D., 2012. Functionalisation of magnetic iron oxide nanoparticles. In: N.T. Thanh ed., Magnetic nanoparticles: from fabrication to clinical applications. 1st ed. Boca Raton: CRC Press, pp. 151-191 ISBN 978-1-4398-6932-1. Betancourt, T., Byrne, J.D., Sunaryo, N., Crowder, S.W., Kadapakkam, M., Patel, S., Casciato, S. a Brannon-Peppas, L., 2009. PEGylation strategies for active targeting of PLA/PLGA nanoparticles. J. Biomed. Mater. Res. Part A, 91A (1),263-276. Bhardwaj, N. a Kundu, S.C., 2010. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol. Adv., 28 (3), 325-347. Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. a Zhang, M., 2005. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials, 26 (31), 6176-6184. Bílková, Z., 2014. Nové formáty antigen-vázajících molekul. Chemické Listy, 108, 198-204. Binz, H., Amstutz, P. a Pluckthun, A., 2005. Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol., 23 (10), 1257-1268. 46
Blakemore, R., 1975. Magnetotactic bacteria. Science, 190 (4212), 377-379. Bognitzki, M., Hou, H., Ishaque, M., Frese, T., Hellwig, M., Schwarte, C., Schaper, A., Wendorff, J. a Greiner, A., 2000. Polymer, metal, and hybrid nano- and mesotubes by coating degradable polymer template fibers (TUFT process). Adv Mater, 12 (9), 637. Bouriotis, V. a Dean, P.D.G., 1981. Use of triazine dyes in the affinity chromatographic purification of alkaline phosphatase from calf intestine. JoJ. Chromatogr. A, 206 (3), 521530. Brena, B.M. and Batista-Viera, F., 2006. Immobilization of enzymes. In: J.M. Guisán ed., Immobilization of enzymes and cells., 03/15, pp. 15-30. Briones, C. a Moreno, M., 2012. Applications of peptide nucleic acids (PNAs) and locked nucleic acids (LNAs) in biosensor development. Anal. Bioanal. Chem., 402 (10),3071-3089. Brown, L., Koerner, T., Horton, J. a Oleschuk, R., 2006. Fabrication and characterization of poly(methylmethacrylate) microfluidic devices bonded using surface modifications and solvents. Lab Chip, 6 (1),66-73. Brunner, J., 1993. New photolabeling and cross-linking methods. Annu.Rev.Biochem., 62, 483-514. Callahan, L.A.S., Xie, S., Barker, I.A., Zheng, J., Reneker, D.H., Dove, A.P. a Becker, M.L., 2013. Directed differentiation and neurite extension of mouse embryonic stem cell on aligned poly(lactide) nanofibers functionalized with YIGSR peptide. Biomaterials, 34 (36), 90899095. Calleri, E., Ambrosini, S., Temporini, C. a Massolini, G., 2012. New monolithic chromatographic supports for macromolecules immobilization: Challenges and opportunities. J. Pharm. Biomed. Anal., 69 (0), 64-76. Cao, L. a Schmid, R.D., 2006. Carrier-bound immobilized enzymes: principles, application and design. 1st ed. Weinhein: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Carredano, E. a Baumann, H., 2011. Affinity ligands from chemical combinatorial libraries. In: J. Janson ed., protein purification: principles, high resolution methods and applications, Third Edition. Hoboken, New Jersey, US: John Wiley & Sons, Inc., pp. 259-267 ISBN 9780470939932. Celebi, B., Bayraktar, A. a Tuncel, A., 2012. Synthesis of a monolithic, micro-immobilised enzyme reactor via click-chemistry. Anal. Bioanal. Chem., 403 (9), 2655-2663. Cetin, B., Ozer, M.B. a Solmaz, M.E., 2014. Microfluidic bio-particle manipulation for biotechnology. Biochem. Eng. J., 92 , 63-82. Chaki, N. a Vijayamohanan, K., 2002. Self-assembled monolayers as a tunable platform for biosensor applications. Biosens. Bioelectron., 17 (1-2), 1-12. Chan, C., Ko, T. a Hiraoka, H., 1996. Polymer surface modification by plasmas and photons. Surf. Sci. Rep., 24 (1-2), 3-54. Chandrasekaran, A.R., Venugopal, J., Sundarrajan, S. a Ramakrishna, S., 2011. Fabrication of a nanofibrous scaffold with improved bioactivity for culture of human dermal fibroblasts for skin regeneration. Biomed.Mater., 6 (1), 015001. 47
Che, A., Huang, X. a Xu, Z., 2011. Polyacrylonitrile-based nanofibrous membrane with glycosylated surface for lectin affinity adsorption. J. Membr. Sci., 366 (1-2), 272-277. Che, G., Lakshmi, B., Martin, C., Fisher, E. a Ruoff, R., 1998. Chemical vapor deposition based synthesis of carbon nanotubes and nanofibers using a template method. Chem. Mat., 10 (1), 260-267. Chen, H. a Fan, Z.H., 2009. Two-dimensional protein separation in microfluidic devices. Electrophoresis, 30 (5), 758-765. Chernukhin, I., Kang, S.Y., Brown, S., Gretton, S., Mendez-Catala, C.F., Cowieson, D. a Klenova, E., 2011. BioVyon Protein A, an alternative solid-phase affinity matrix for chromatin immunoprecipitation. Anal. Biochem., 412 (2), 183-188. Choi, J., Oh, K., Thomas, J., Heineman, W., Halsall, H., Nevin, J., Helmicki, A., Henderson, H. a Ahn, C., 2002. An integrated microfluidic biochemical detection system for protein analysis with magnetic bead-based sampling capabilities. Lab Chip, 2 (1),27-30. Choi, K., Ng, A.H.C., Fobel, R. a Wheeler, A.R., 2012. Digital Microfluidics. Annu. Rev. Anal. Chem, 5 , 413-440. Chu, B. a Orgel, L., 1988. Ligation of oligonucleotides to nucleic-acids or proteins via disulfide bonds. Nucleic Acids Res., 16 (9), 3671-3691. Clonis, Y.D., Labrou, N.E., Kotsira, V.P., Mazitsos, C., Melissis, S. a Gogolas, G., 2000. Biomimetic dyes as affinity chromatography tools in enzyme purification. J. Chromatogr. A, 891 (1), 33-44. Clonis, Y., 2006. Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop. J. Chromatogr.A, 1101 (1-2), 1-24. Corman, M.E., Ozturk, N., Tuzmen, N., Akgol, S. a Denizli, A., 2010. Magnetic polymeric nanospheres as an immobilized metal affinity chromatography (IMAC) support for catalase. Biochem. Eng. J., 49 (2), 159-164. Costioli, M., Fisch, I., Garret-Flaudy, F., Hilbrig, F. a Freitag, R., 2003. DNA purification by triple-helix affinity precipitation. Biotechnol. Bioeng., 81 (5), 535-545. Crevillén, A.G., Hervás, M., López, M.A., González, M.C. a Escarpa, A., 2007. Real sample analysis on microfluidic devices. Talanta, 74 (3), 342-357. Cuatrecasas, P., Wilchek, M. a Anfinsen, C., 1968. Selective enzyme purification by affinity chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 61 (2), 636. Cwirla, S., Peters, E., Barrett, R. a Dower, W., 1990. Peptides on phage - a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87 (16), 6378-6382. Davies, C., 2013. Chapter 2.1 - principles of competitive and immunometric assays (Including ELISA)1. In: D. Wild ed., The Immunoassay Handbook (Fourth Edition). Oxford: Elsevier, pp. 29-59 ISBN 9780080970370. Davies, O.R., Head, L., Armitage, D., Pearson, E.A., Davies, M.C., Marlow, M. a Stolnik, S., 2008. Surface modification of microspheres with steric stabilizing and cationic polymers for gene delivery. Langmuir, 24 (14), 7138-7146.
48
de Castro, M.D.L. a Capote, F.P., 2008. Miniaturisation of analytical steps: necessity and snobbism. Anal. Bioanal. Chem., 390 (1), 67-69. Dubsky, M., Kubinova, S., Sirc, J., Voska, L., Zajicek, R., Zajicova, A., Lesny, P., Jirkovska, A., Michalek, J., Munzarova, M., Holan, V. a Sykova, E., 2012. Nanofibers prepared by needleless electrospinning technology as scaffolds for wound healing. J. Mater. Sci.Mater. Med., 23 (4), 931-941. Duguet, E., Delville M.-H. a Mornet S., 2012. Synthesis and characterisation of iron oxide ferrite nanoparticles and ferrite-based aqueous fluids. In: N.T. Thanh ed., magnetic nanoparticles: from fabrication to clinical applications.CRC Press,02/01; 2014/07, pp. 47-72 ISBN 978-1-4398-6932-1. El-Faham, A. a Albericio, F., 2011. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chem. Rev., 111 (11), 6557-6602. Ellington, A. a Szostak, J., 1992. Selection invitro of single-stranded-dna molecules that fold into specific ligand-binding structures. Nature, 355 (6363), 850-852. Elmore, W.C., 1938. Ferromagnetic colloid for studying magnetic structures. Phys. Rev., 54 (4), 309-310. Famulok, M., 1999. Oligonucleotide aptamers that recognize small molecules. Curr. Opin. Struct. Biol., 9 (3), 324-329. Fan, Z., Mangru, S., Granzow, R., Heaney, P., Ho, W., Dong, Q. a Kumar, R., 1999. Dynamic DNA hybridization on a chip using paramagnetic beads. Anal. Chem., 71 (21), 4851-4859. Fang, Q., Xu, G. a Fang, Z., 2002. A high-throughput continuous sample introduction interface for microfluidic chip-based capillary electrophoresis systems. Anal. Chem., 74 (6), 1223-1231. Flesch, C., Delaite, C., Dumas, P., Bourgeat-Lami, E. a Duguet, E., 2004. Grafting of poly(epsilon-caprolactone) onto maghemite nanoparticles. J. Polym. Sci. Pol. Chem. 42 (23), 6011-6020. Fontanals, N., Cormack, P.A.G. a Sherrington, D.C., 2008. Hypercrosslinked polymer microspheres with weak anion-exchange character Preparation of the microspheres and their applications in pH-tuneable, selective extractions of analytes from complex environmental samples. J. Chromatogr. A, 1215 (1-2), 21-29. Formhals, A., 1934. Process and apparatus for preparing artificial threads. A. Formhals a Schreiber Gastell R. eds., patent US 1975504 A. 02/10/1934. Forward, K.M., Flores, A. a Rutledge, G.C., 2013. Production of core/shell fibers by electrospinning from a free surface. Chem. Eng. Sci., 104 , 250-259. Furdui, V. a Harrison, D., 2004. Immunomagnetic T cell capture from blood for PCR analysis using microfluidic systems. Lab Chip, 4 (6), 614-618. Gbadamosi, J.K., Hunter, A.C. a Moghimi, S.M., 2002. PEGylation of microspheres generates a heterogeneous population of particles with differential surface characteristics and biological performance. FEBS Lett., 532 (3), 338-344.
49
Ghosh, S.S., Kao, P.M., McCue, A.W. a Chappelle, H.L., 1990. Use of maleimide-thiol coupling chemistry for efficient syntheses of oligonucleotide-enzyme conjugate hybridization probes. Bioconjug. Chem., 1 (1), 71-76. Gijs, M.A.M., Lacharme, F. a Lehmann, U., 2010. Microfluidic applications of magnetic particles for biological analysis and catalysis. Chem. Rev., 110 (3), 1518-1563. Gijs, M.A., 2004. Magnetic bead handling on-chip: new opportunities for analytical applications. Microfluid. Nanofluid., 1 (1), 22-40. Goddard, J.M. a Hotchkiss, J.H., 2007. Polymer surface modification for the attachment of bioactive compounds. Prog. Polym. Sci., 32 (7), 698-725. Gong, P. and Grainger, D.W., 2007. Nonfouling surfaces. In: J.B. Rampal ed., methods in molecular biology, vol. 381: Microarrays, 2nd Edition: vol. 1: Synthesis Methods.2nd ed. Totowa, New Jersey: Humana Press, pp. 59-92 ISBN 978-1-59745-303-5. Grama, S., Plichta, Z., Trchová, M., Kovářová, J., Beneš, M. a Horák, D., 2014. Monodisperse macroporous poly(glycidyl methacrylate) microspheres coated with silica: Design, preparation and characterization. React Funct Polym, 77 (0), 11-17. Gu, S., Shiratori, T. a Konno, M., 2003. Synthesis of monodisperse, magnetic latex particles with polystyrene core. Colloid Polym. Sci., 281 (11), 1076-1081. Guan, X., Zhang, H., Bi, Y., Zhang, L. a Hao, D., 2010. Rapid detection of pathogens using antibody-coated microbeads with bioluminescence in microfluidic chips. Biomed.Microdevices, 12 (4), 683-691. Gumpenberger, T., Sato, T., Narazaki, A., Kawaguchi, Y., Kurosaki, R. a Niino, H., 2006. Fabrication and characterisation of a microfluidic device for bead-array analysis by the LIBWE method. J. Laser Micro Nanoeng., 1 (3), 201-206. Gurd, J. a Mahler, H., 1974. Fractionation of synaptic plasma-membrane glycoproteins by lectin affinity chromatography. Biochemistry, 13 (25), 5193-5198. Guttman, A. a Cooke, N., 1991. Capillary gel affinity electrophoresis of DNA fragments. Anal. Chem., 63 (18), 2038-2042. Haginaka, J., 2008. Monodispersed, molecularly imprinted polymers as affinity-based chromatography media. J. Chromatogr. A, 866 (1–2), 3-13. Hajdu, A., Tombacz, E., Illes, E., Bica, D. a Vekas, L., 2008. Magnetite nanoparticles stabilized under physiological conditions for biomedical application. Colloids for Nanoand Biotechnology, 135, 29-37. Halliwell, C. a Cass, A., 2001. A factorial analysis of silanization conditions for the immobilization of oligonucleotides on glass surfaces. Anal. Chem., 73 (11), 24762483. Hanes, J. a Pluckthun, A., 1997. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94 (10), 4937-4942. Hartgerink, J., Beniash, E. a Stupp, S., 2001. Self-assembly and mineralization of peptideamphiphile nanofibers. Science, 294 (5547), 1684-1688.
50
Hayes, M., Polson, N., Phayre, A. a Garcia, A., 2001. Flow-based microimmunoassay. Anal. Chem., 73 (24), 5896-5902. He, J., Wu, Y. a Zuo, W., 2005. Critical length of straight jet in electrospinning. Polymer, 46 (26), 12637-12640. He, J., 2013. Chapter 5.1 - Practical Guide to ELISA Development. In: D. Wild ed., The Immunoassay Handbook (Fourth Edition). Oxford: Elsevier, pp. 381-393 ISBN 9780080970370. Helppolainen, S.H., Nurminen, K.P., Maatta, J.A.E., Halling, K.K., Slotte, J.P., Huhtala, T., Liimatainen, T., Yla-Herttuala, S., Airenne, K.J., Narvanen, A., Janis, J., Vainiotalo, P., Valjakka, J., Kulomaa, M.S. a Nordlund, H.R., 2007. Rhizavidin from Rhizohium etli: the first natural dimer in the avidin protein family. Biochem. J., 405, 397-405. Hermanson, G.T., 2013. Chapter 11 - (Strept)avidin–Biotin Systems. In: G.T. Hermanson ed., Bioconjugate Techniques (Third edition). Boston: Academic Press, pp. 465-505 ISBN 9780123822390. Hermanson, G.T., 2008. Bioconjugate techniques. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press Books. ISBN 0123705010. Hermanson, G.T., Mallia, K.,A and Smith, P.,K., 1992. Immobilized affinity ligand techniques. San Diego: Academic Press ISBN 0123423309. Herrmann, M., Roy, E., Veres, T. a Tabrizian, M., 2007. Microfluidic ELISA on nonpassivated PDMS chip using magnetic bead transfer inside dual networks of channels. Lab Chip, 7 (11), 1546-1552. Hilbrig, F., Stocker, G., Schlappi, J., Kocher, H. a Freitag, R., 2006. Utilization of group specific ligands in the downstream processing of proteins by affinity precipitation. Food Bioprod.Process., 84 (C1), 28-36. Hoare, D.G. a Koshland Jr., D.E., 1966. A procedure for the selective modification of carboxyl groups in proteins. J. Am. Chem. Soc., 88 (9), 2057-2058. Horák, D., Karpíšek, M., Turková, J. a Beneš, M., 1999. Hydrazide-functionalized poly(2hydroxyethyl methacrylate) microspheres for immobilization of horseradish peroxidase. Biotechnol. Prog., 15 (2), 208-215. Horák, D., Babič, M., Macková, H. a Beneš, M.J., 2007. Preparation and properties of magnetic nano- and microsized particles for biological and environmental separations. J. Sep. Sci., 30 (11), 1751-1772. Horák, D., Kučerová, J., Korecká, L., Jankovičová, B., Palarčík, J., Mikulášek, P. a Bílková, Z., 2012. New Monodisperse Magnetic Polymer Microspheres Biofunctionalized for Enzyme Catalysis and Bioaffinity Separations. Macromol. Biosci., 12 (5), 647-655. Hristov, J. a Fachikov, L., 2007. An overview of separation by magnetically stabilized beds: State-of-the-art and potential applications. China Part., 5 (1-2), 11-18. Huang, B.X. a Kim, H., 2013. Effective Identification of Akt Interacting Proteins by TwoStep Chemical Crosslinking, Co-Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. PLoS One, 8 (4), e61430.
51
Huang, S., Chin, W. a Yang, W.P., 2005. Structural characteristics and properties of silica/poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) nanocomposites prepared by mixing colloidal silica or tetraethyloxysilane (TEOS) with PHEMA. Polymer, 46 (6), 1865-1877. Hui, J.Z., Zaki, A.A., Cheng, Z., Popik, V., Zhang, H., Luning Prak, E.T. a Tsourkas, A., 2014. Facile method for the site-specific, covalent attachment of full-length IgG onto nanoparticles. Small. 10(16), 3354-63. Ito, A., Shinkai, M., Honda, H. a Kobayashi, T., 2005. Medical application of functionalized magnetic nanoparticles. J. Biosci. Bioeng., 100 (1), 1-11. Jirsák, O., Kalinová, K. a Stránská, D., 2006. Nanofibre technologies and Nanospider applications. Nanofair 2006 New Ideas for Industry, 1940, 41-44. Johnstone, A., P. aThorpe, R., 1996. Immunochemistry in Practice. 3rd Edition ed.WileyBlackwell ISBN 978-0-86542-633-7. Joshi, A., Solanki, S., Chaudhari, R., Bahadur, D., Aslam, M. a Srivastava, R., 2011. Multifunctional alginate microspheres for biosensing, drug delivery and magnetic resonance imaging. Acta Biomater., 7 (11), 3955-3963. Joshi, M., Pinto, R., Rao, V.R. a Mukherji, S., 2007. Silanization and antibody immobilization on SU-8. Appl. Surf. Sci., 253 (6), 3127-3132. Kaewsaneha, C., Bitar, A., Tangboriboonrat, P., Polpanich, D. a Elaissari, A., 2014. Fluorescent-magnetic Janus particles prepared via seed emulsion polymerization. J.Colloid Interface Sci., 424, 98-103. Kang, Y.O., Yoon, I., Lee, S.Y., Kim, D., Lee, S.J., Park, W.H. a Hudson, S.M., 2010. Chitosan-Coated Poly(vinyl alcohol) Nanofibers For Wound Dressings. J. Biomed. Mater. Res. Part B, 92B (2), 568-576. Katsanevakis, E., Wen, X. a Zhang, N., 2012. Creating Electrospun Nanofiber-Based Biomimetic Scaffolds for Bone Regeneration. In: R. Jayakumar and S. Nair eds., Biomedical Applications of Polymeric Nanofibers.Springer Berlin Heidelberg,01/01, pp. 63-100 ISBN 978-3-642-27147-2. Kay, G. a Crook, E., 1967. Coupling of enzymes to cellulose using chloro-s-triazines. Nature, 216 (5114), 514. Kessick, R. a Tepper, G., 2004. Microscale polymeric helical structures produced by electrospinning. Appl. Phys. Lett., 84 (23), 4807-4809. Khandurina, J., McKnight, T., Jacobson, S., Waters, L., Foote, R. a Ramsey, J., 2000. Integrated system for rapid PCR-based DNA analysis in microfluidic devices. Anal. Chem., 72 (13), 2995-3000. Knezevic, N.Z., Ruiz-Hernandez, E., Hennink, W.E. a Vallet-Regi, M., 2013. Magnetic mesoporous silica-based core/shell nanoparticles for biomedical applications. RSC Adv., 3 (25), 9584-9593. Kohn, J. a Wilchek, M., 1984. The use of cyanogen-bromide and other novel cyanylating agents for the activation of polysaccharide resins. Appl. Biochem. Biotechnol., 9 (3), 285-305.
52
Kokalj, T., Perez-Ruiz, E. a Lammertyn, J., 2015. Building bio-assays with magnetic particles on a digital microfluidic platform. New Biotech., 32 (5), 485-503. Kubinova, S. a Sykova, E., 2010. Nanotechnologies in regenerative medicine. Minim. Invasive Ther. Allied Technol., 19 (3-4), 144-156. Labrou, N.E., 2003. Design and selection of ligands for affinity chromatography. J. Chromatogr. B, 790 (1–2), 67-78. Labrou, N., Eliopoulos, E. a Clonis, Y., 1999. Molecular modeling for the design of a biomimetic chimeric ligand. Application to the purification of bovine heart L-lactate dehydrogenase. Biotechnol. Bioeng., 63 (3), 322-332. Lacava, L.M., Lacava, Z.G.M., Da Silva, M.F., Silva, O., Chaves, S.B., Azevedo, R.B., Pelegrini, F., Gansau, C., Buske, N., Sabolovic, D. a Morais, P.C., 2001. Magnetic Resonance of a Dextran-Coated Magnetic Fluid Intravenously Administered in Mice. Biophys. J., 80 (5), 2483-2486. Lahann, J., Balcells, M., Lu, H., Rodon, T., Jensen, K. a Langer, R., 2003. Reactive polymer coatings: A first step toward surface engineering of microfluidic devices. Anal. Chem., 75 (9), 2117-2122. Larrondo, L. a Manley, R., 1981. Electrostatic fiber spinning from polymer melts. Experimental-observations on fiber formation and properties. J. Polym. Sci. Pt. BPolym.Phys., 19 (6), 909-920. Larsson, P. a Mosbach, K., 1979. Affinity precipitation of enzymes. FEBS Lett., 98 (2), 333338. Laurent, S., Forge, D., Port, M., Roch, A., Robic, C., Elst, L.V. a Muller, R.N., 2008. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical characterizations, and biological applications. Chem. Rev., 108 (6), 2064-2110. Lazar, I.M., Trisiripisal, P. a Sarvaiya, H.A., 2006. Microfluidic liquid chromatography system for proteomic applications and biomarker screening. Anal. Chem., 78 (15), 5513-5524. Lee, J., Yu, H., Hong, S., Jeong, I., Jang, J. a Kim, H., 2009. Nanofibrous membrane of collagen-polycaprolactone for cell growth and tissue regeneration. J. Mater. Sci.-Mater. Med., 20 (9), 1927-1935. Lee, S.H.S., Hatton, T.A. a Khan, S.A., 2011. Microfluidic continuous magnetophoretic protein separation using nanoparticle aggregates. Microfluid. Nanofluid., 11 (4), 429-438. Lehmann, U., 2008. Manipulation of magnetic microparticles in liquid phases for on-chip biomedical analysis methods. M. Gijs ed., PhD Thesis ed. Lausanne, Switzerland: Thèse École polytechnique fédérale de Lausanne EPFL, n° 4072 (2008). Lehmann, U., Vandevyver, C., Parashar, V. a Gijs, M., 2006. Droplet-based DNA purification in a magnetic lab-on-a-chip. Angew. Chem.- Int. Edit., 45 (19), 3062-3067. Li, D., Herricks, T. a Xia, Y., 2003. Magnetic nanofibers of nickel ferrite prepared by electrospinning. Appl. Phys. Lett., 83 (22), 4586-4588. Li, P., Gao, Y. a Pappas, D., 2012. Multiparameter cell affinity chromatography: separation and analysis in a single microfluidic channel. Anal. Chem., 84 (19), 8140-8148. 53
Liese, A. a Hilterhaus, L., 2013. Evaluation of immobilized enzymes for industrial applications. Chem. Soc. Rev., 42 (15), 6236-6249. Lin, J., Zhou, W., Kumbhar, A., Wiemann, J., Fang, J., Carpenter, E. a O'Connor, C., 2001. Gold-coated iron (Fe@Au) nanoparticles: Synthesis, characterization, and magnetic fieldinduced self-assembly. J. Solid State Chem., 159 (1), 26-31. Liu, Y.D. a Choi, H.J., 2014. Fabrication of anisotropic snowman-like magnetic particles and their magnetorheological response. J. Appl. Phys., 115 (17), 17B529. Liuni, P., Rob, T. a Wilson, D.J., 2010. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom., 24 (3), 315-320. Long, T., Prakash, S., Shannon, M. a Moore, J., 2006. Water-vapor plasma-based surface activation for trichlorosilane modification of PMMA. Langmuir, 22 (9), 4104-4109. Long, Y., Yu, M., Sun, B., Gu, C. a Fan, Z., 2012. Recent advances in large-scale assembly of semiconducting inorganic nanowires and nanofibers for electronics, sensors and photovoltaics. Chem. Soc. Rev., 41 (12), 4560-4580. Love, J., Estroff, L., Kriebel, J., Nuzzo, R. a Whitesides, G., 2005. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev., 105 (4), 11031169. Lowe, C. a Pearson, J., 1984. Affinity-chromatography on immobilized dyes. Meth. Enzymol., 104, 97-113. Ma, H., Qi, X., Maitani, Y. a Nagai, T., 2007. Preparation and characterization of superparamagnetic iron oxide nanoparticles stabilized by alginate. Int. J. Pharm., 333 (12), 177-186. Malhotra, R., Patel, V., Chikkaveeraiah, B.V., Munge, B.S., Cheong, S.C., Zain, R.B., Abraham, M.T., Dey, D.K., Gutkind, J.S. a Rusling, J.F., 2012. Ultrasensitive detection of cancer biomarkers in the clinic by use of a nanostructured microfluidic array. Anal. Chem., 84 (14), 6249-6255. Mallia, A., Hermnason, G., Krohn, R., FujimoTO, E. a Smith, P., 1981. Preparation and use of a boronic acid affinity support for separation and quantitation of glycosylated hemoglobins. Anal. Lett. Part B, 14 (8), 649-661. Malmstadt, N., Yager, P., Hoffman, A. a Stayton, P., 2003. A smart microfluidic affinity chromatography matrix composed of poly(N-isopropylacrylamide)-coated beads. Anal. Chem., 75 (13), 2943-2949. Martinez, A.W., Phillips, S.T., Whitesides, G.M. a Carrilho, E., 2010. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem., 82 (1), 310. Matsumoto, I., Mizuno, Y. a Seno, N., 1979. Activation of sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand for affinity adsorbent. J. Biochem., 85 (4), 10911098. Mattiasson, B. a Ramstorp, M., 1984. Ultrafiltration Affinity Purification - isolation of concanavalin a from seeds of canavalia-ensiformis. J. Chromatogr., 283, 323-330. 54
Melissis, S., Rigden, D. a Clonis, Y., 2001. New family of glutathionyl-biomimetic ligands for affinity chromatography of glutathione-recognising enzymes. J. Chromatogr. A, 917 (1-2), 29-42. Miserere, S., Mottet, G., Taniga, V., Descroix, S., Viovy, J. a Malaquin, L., 2012. Fabrication of thermoplastics chips through lamination based techniques. Lab Chip, 12 (10), 1849-1856. Moorthy, J., Mensing, G., Kim, D., Mohanty, S., Eddington, D., Tepp, W., Johnson, E. a Beebe, D., 2004. Microfluidic tectonics platform: A colorimetric, disposable botulinum toxin enzyme-linked immunosorbent assay system. Electrophoresis, 25 (10-11), 1705-1713. Morag, E., Bayer, E.A. a Wilchek, M., 1996. Immobilized nitro-avidin and nitro-streptavidin as reusable affinity matrices for application in avidin–biotin technology. Anal. Biochem., 243 (2), 257-263. Morris, K., Jensen, K., Julin, C., Weil, M. a Gold, L., 1998. High affinity ligands from in vitro selection: Complex targets. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 95 (6), 2902-2907. Mu, X., Liu, Y., Fang, D., Wang, Z., Nie, J. a Ma, G., 2012. Electric field induced phase separation on electrospinning polyelectrolyte based core-shell nanofibers. Carbohydr. Polym., 90 (4), 1582-1586. Murphy, R., Imam, A., Hughes, A., McGucken, M., Buchanan, K., Conlon, J. a Elmore, D., 1976. Avoidance of strongly chaotropic eluents for immunoaffinity chromatography by chemical modification of immobilized ligand. Biochim. Biophys. Acta, 420 (1), 87-96. Mutin, P., Guerrero, G. a Vioux, A., 2003. Organic-inorganic hybrid materials based on organophosphorus coupling molecules: from metal phosphonates to surface modification of oxides. C.R. Chim., 6 (8-10), 1153-1164. Nakanishi, K., Tomita, M., Nakamura, H. a Kato, K., 2013. Specific binding of immunoglobulin G to protein A-mesoporous silica composites for affinity column chromatography. J. Mat. Chem. B, 1 (45), 6321-6328. Nam, Y., Yoon, J., Lee, J. a Park, T., 1999. Adhesion behaviours of hepatocytes cultured onto biodegradable polymer surface modified by alkali hydrolysis process. J. Biomater. Sci.Polym. Ed., 10 (11), 1145-1158. Nge, P.N., Rogers, C.I. a Woolley, A.T., 2013. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem. Rev., 113 (4), 2550-2583. Nielsen, P., Egholm, M., Berg, R. a BuchtardT, O., 1991. Sequence-selective recognition of dna by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science, 254 (5037), 1497-1500. Nord, K., Gunneriusson, E., Uhlén, M. a Nygren, P., 2000. Ligands selected from combinatorial libraries of protein A for use in affinity capture of apolipoprotein A-1M and Taq DNA polymerase. J. Biotechnol., 80 (1), 45-54. Noren, K. a Noren, C., 2001. Construction of high-complexity combinatorial phage display peptide libraries. Methods, 23 (2), 169-178. Nygren, P., 2011. Affinity ligands from biological combinatorial libraries. In: J. Janson ed., Protein Purification: Principles, high resolution methods, and applications.John Wiley & Sons, Inc., pp. 269-278 ISBN 9780470939932. 55
Ohlson, S., Duong-Thi, M., Bergstrom, M., Fex, T., Hansson, L., Pedersen, L., Guazotti, S. a Isaksson, R., 2010. Toward high-throughput drug screening on a chip-based parallel affinity separation platform. J. Sep. Sci., 33 (17-18), 2575-2581. Ondarcuhu, T. a Joachim, C., 1998. Drawing a single nanofibre over hundreds of microns. Europhys. Lett., 42 (2), 215-220. Orum, H., Nielsen, P., Jorgensen, M., Larsson, C., Stanley, C. a Koch, T., 1995. Sequencespecific purification of nucleic-acids by pna-controlled hybrid selection. BioTechniques, 19 (3), 472-480. Otieno, B.A., Krause, C.E., Latus, A., Chikkaveeraiah, B.V., Faria, R.C. a Rusting, J.F., 2014. On-line protein capture on magnetic beads for ultrasensitive microfluidic immunoassays of cancer biomarkers. Biosens. Bioelectron., 53, 268-274. Ozdemir, M., Yurteri, C. a Sadikoglu, H., 1999. Physical polymer surface modification methods and applications in food packaging polymers. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 39 (5), 457-477. Paegel, B., Blazej, R. a Mathies, R., 2003. Microfluidic devices for DNA sequencing: sample preparation and electrophoretic analysis. Curr. Opin. Biotechnol., 14 (1), 42-50. Pamme, N., 2006. Magnetism and microfluidics. Lab Chip, 6 (1), 24-38. Pamme, N., 2012. On-chip bioanalysis with magnetic particles. Curr. Opin. Chem. Biol., 16 (3-4), 436-443. Pandey, C.M., Sharma, A., Sumana, G., Tiwari, I. a Malhotra, B.D., 2013. Cationic poly(lactic-co-glycolic acid) iron oxide microspheres for nucleic acid detection. Nanoscale, 5 (9), 3800-3807. Pankhurst, Q.A., Thanh, N.T.K., Jones, S.K. a Dobson, J., 2009. Progress in applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. J.Phys.D-Appl.Phys., 42 (22), 224001. Park, K., Ju, Y.M., Son, J.S., Ahn, K. a Han, D.K., 2007. Surface modification of biodegradable electrospun nanofiber scaffolds and their interaction with fibroblasts. J. Biomater. Sci.-Polym. Ed., 18 (4), 369-382. Pečová, M., Zajoncová, L., Poláková, K., Čuda, J., Šafaříková, M., Šebela, M. a Šafařík, I., 2011. Biologically active compounds immobilized on magnetic carriers and their utilization in biochemistry and biotechnology. Chem. Listy, 105 (7), 524-530. Pereiro, I., Kučerová, J., Alexandre, L., Dupuy, B., Bílková, Z., Viovy, J.-L-, Malaquin, L. a Descroix, S. Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria extraction, growth and detection. Proceedings of the MicroTAS 2014 Conference, ISBN 978-0-979806426-30-76, San Antonio, Texas, USA, s. 437-439. s. 437-439. Petřík, S. a Malý, M. Electrospun Nanofiber – The Tiny Layers that add Great Value to Nonwovens, 2008. In: Proc. of International Nonwoven Symposium, EDANA, Stockholm. Phaner-Goutorbe, M., Dugas, V., Chevolot, Y. a Souteyrand, E., 2011. Silanization of silica and glass slides for DNA microarrays by impregnation and gas phase protocols: A comparative study. Mater. Sci. Eng. C- Mater. Biol. Appl., 31 (2), 384-390.
56
Pinkse, M., Uitto, P., Hilhorst, M., Ooms, B. a Heck, A., 2004. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-nanoLC-ESIMS/MS and titanium oxide precolumns. Anal. Chem., 76 (14), 3935-3943. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. a Belfrage, G., 1975. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 258 (5536), 598-599. Porath, J., Maisano, F. a Belew, M., 1985. Thiophilic Adsorption - a New Method for Protein Fractionation. FEBS Lett., 185 (2), 306-310. Puig, O., Caspary, F., Rigaut, G., Rutz, B., Bouveret, E., Bragado-Nilsson, E., Wilm, M. a Seraphin, B., 2001. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods, 24 (3), 218-229. Putnam, D.D., Namasivayam, V. a Burns, M.A., 2003. Cell affinity separations using magnetically stabilized fluidized beds: Erythrocyte subpopulation fractionation utilizing a lectin-magnetite support. Biotechnol. Bioeng., 81 (6), 650-665. Qian, Y., Zhang, K., Chen, F., Ke, Q. a Mo, X., 2011. Cross-linking of gelatin and chitosan complex nanofibers for tissue-engineering scaffolds. J.Biomater. Sci.-Polym. Ed., 22 (8), 1099-1113. Qin, X. a Wang, S., 2006. Filtration properties of electrospinning nanofibers. J. Appl. Polym. Sci., 102 (2), 1285-1290. Qu, F., Guan, Y., Ma, Z. a Zhang, Q., 2009. Synthesis of Cibacron Blue F3GA-coupled magnetic PMMA nanospheres and their use for protein affinity separation. Polym. Int., 58 (8), 888-892. Ramakrishna, S., Fujihara, K., Wee-Eong, T., Teik-Cheng, L. a Zuwei, M., 2005. An Introduction to Electrospinning and Nanofibers. Singapore: Worl d Scientific Publishing Co . Pte . Ltd . ISBN 978-981-256-415-3. Rasmussen, J.,R, Štědronský, E.,R a Whitesides, G.,M., 1977. - Introduction, modification, and characterization of functional groups on the surface of low-density polyethylene film. J. Am. Chem. Soc., 14, 4736-4745. ISBN - 0002-7863. Ren, K., Chen, Y. a Wu, H., 2014. New materials for microfluidics in biology. Curr. Opin. Biotechnol., 25, 78-85. Reneker, D. a Chun, I., 1996. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology, 7 (3), 216-223. Reyes, D., Iossifidis, D., Auroux, P. a Manz, A., 2002. Micro total analysis systems. 1. Introduction, theory, and technology. Anal. Chem., 74 (12), 2623-2636. Ríos, A., Escarpa, A., González, M.C. a Crevillén, A.G., 2006. Challenges of analytical microsystems. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 25 (5), 467-479. Ro, K.W., Nayalk, R. a Knapp, D.R., 2006. Monolithic media in microfluidic devices for proteomics. Electrophoresis, 27 (18), 3547-3558. Roca, A.G., Costo, R., Rebolledo, A.F., Veintemillas-Verdaguer, S., Tartaj, P., GonzalezCarreno, T., Morales, M.P. a Serna, C.J., 2009. Progress in the preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. J. Phys. D-Appl. Phys., 42 (22), 224002. 57
Romig, T.S., Bell, C. a Drolet, D.W., 1999. Aptamer affinity chromatography:: combinatorial chemistry applied to protein purification. J. Chromatogt. B, 731 (2), 275-284. Roy, I. and Gupta, M., 2006. Use of Immobilized Biocatalysts in Fluidized Bed Format. In: J. Guisan ed., Immobilization of Enzymes and Cells, Methods in Biotechnology.Humana Press, pp. 311-319 ISBN 978-1-58829-290-2. Šafařík, I. a Šafaříková, M., 2002. Magnetic nanoparticles and biosciences. Mon. Chem., 133 (6), 737-759. Šafařík, I. a Šafaříková, M., 1999. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B, 722 (1-2), 33-53. Šafařík, I. a Šafaříková, M., 2009. Magnetic nano- and microparticles in biotechnology. Chem. Pap., 63 (5), 497-505. Šafařík, I. a Šafaříková, M., 2004. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. BioMagnetic Research and Technology, 2 (1),7. Sahoo, Y., Goodarzi, A., Swihart, M., Ohulchanskyy, T., Kaur, N., Furlani, E. a Prasad, P., 2005. Aqueous ferrofluid of magnetite nanoparticles: Fluorescence labeling and magnetophoretic control. J. Phys. Chem. B, 109 (9), 3879-3885. Sakao, Y., Nakamura, F., Ueno, N. a Hara, M., 2005. Hybridization of oligonucleotide by using DNA self-assembled monolayer. Colloid Surf.B-Biointerfaces, 40 (3-4), 149-152. Šálek, P., Korecká, L., Horák, D., Petrovský, E., Kovářová, J., Metelka, R., Čadková, M. a Bílková, Z., 2011. Immunomagnetic sulfonated hypercrosslinked polystyrene microspheres for electrochemical detection of proteins. J. Mater. Chem., 21 (38), 14783-14792. Saliba, A., Saias, L., Psychari, E., Minc, N., Simon, D., Bidard, F., Mathiot, C., Pierga, J., Fraisier, V., Salamero, J., Saada, V., Farace, F., Vielh, P., Malaquin, L. a Viovy, J., 2010. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 107 (33), 14524-14529. Schreuder-Gibson, H., Gibson, P., Senecal, K., Sennett, M., Walker, J., Yeomans, W., Ziegler, D. a Tsai, P., 2002. Protective textile materials based on electrospun nanofibers. J. Adv. Mater., 34 (3) ,44-55. Scopes, R.K., 1986. Strategies for enzyme isolation using dye-ligand and related adsorbents. J. Chromatogr. B, 376 (0), 131-140. Sellergren, B., 1994. Imprinted dispersion polymers - a new class of easily accessible affinity stationary phases. J. Chromatogr. A, 673 (1), 133-141. Shadpour, H., Musyimi, H., Chen, J.F. a Soper, S.A., 2006. Physiochemical properties of various polymer substrates and their effects on microchip electrophoresis performance. J. Chromatogr. A, 1111 (2), 238-251. Sharma, R., Singh, H., Joshi, M., Sharma, A., Garg, T., Goyal, A.K. a Rath, G., 2014. Recent advances in polymeric electrospun nanofibers for drug delivery. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 31 (3), 187-217.
58
Shikida, M., Inouchi, K., Honda, H. a Sato, K., 2004. Magnetic handling of droplet in micro chemical analysis system utilizing surface tension and wettability. Mems 2004: 17th Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems, Technical Digest, 359-362. Shimura, K. a Kasai, K., 1987. Affinophoresis in two-dimensional agarose-gel electrophoresis - specific separation of biomolecules by a moving affinity ligand. Anal. Biochem., 161 (1), 200-206. Sista, R.S., Eckhardt, A.E., Srinivasan, V., Pollack, M.G., Palanki, S. a Pamula, V.K., 2008. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip, 8 (12), 2188-2196. Situma, C., Wang, Y., Hupert, M., Barany, F., McCarley, R. a Soper, S., 2005. Fabrication of DNA microarrays onto poly(methyl methacrylate) with ultraviolet patterning and microfluidics for the detection of low-abundant point mutations. Anal. Biochem., 340 (1), 123-135. Skerra, A., 2007. Alternative non-antibody scaffolds for molecular recognition. Curr. Opin. Biotechnol., 18 (4), 295-304. Slováková, M., Minc, N., Bílková, Z., Smadja, C., Faigle, W., Futterer, C., Taverna, M. a Viovy, J., 2005. Use of self assembled magnetic beads for on-chip protein digestion. Lab Chip, 5 (9) , 935-942. Smith, G., 1985. Filamentous fusion phage - novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 228 (4705), 1315-1317. Spence, C. a Bailon, P., 2000. Fluidized-Bed Receptor-Affinity Chromatography. In: P. Bailon, G. Ehrlich K, W. Fung and W. Berthold eds., Methods in Molecular Biology, Methods and Protocols: Affinity Chromatography,Humana Press, pp. 25-39 ISBN 978-0-89603-694-9. Spross, J. a Sinz, A., 2011. Monolithic media for applications in affinity chromatography. J. Sep. Sci., 34 (16-17), 1958-1973. Starkenstein, E., 1910. Ferment action and the influence upon it of neutral salts. Biochem. Z., 24, 210-218. Sun, Z., Zussman, E., Yarin, A., Wendorff, J. a Greiner, A., 2003. Compound core-shell polymer nanofibers by co-electrospinning. Adv Mater, 15 (22), 1929. Tada, D.B., Vono, L.L.R., Duarte, E.L., Itri, R., Kiyohara, P.K., Baptista, M.S. a Rossi, L.M., 2007. Methylene blue-containing silica-coated magnetic particles: A potential magnetic carrier for photodynamic therapy. Langmuir, 23 (15), 8194-8199. Talbert, J.N. a Hotchkiss, J.H., 2012. Chitosan-tethered microspheres for lactase immobilization. J. Mol. Catal. B-Enzym., 78, 78-84. Thanh, N.T., 2012. Magnetic Nanoparticles: from fabrication to clinical applications. 1st ed. Boca Raton: CRC Press. Tsang, S.C., Yu, C.H., Gao, X. a Tam, K., 2006. Silica-encapsulated nanomagnetic particle as a new recoverable biocatalyst carrier. J. Phys. Chem. B, 110 (34), 16914-16922. Tuerk, C. a Gold, L., 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment – RNA ligands to bacteriophage-T4 DNA-polymerase. Science, 249 (4968), 505-510. 59
Turková, J., 1993. Bioaffinity Chromatography. Elsevier. Ugelstad, J. a Mork, P., 1980. Swelling of oligomer-polymer particles - new methods of preparation of emulsions and polymer dispersions. Adv. Colloid Interface Sci., 13 (1-2), 101-140. van Ewijk, G., Vroege, G. a Philipse, A., 1999. Convenient preparation methods for magnetic colloids. J .Magn. Magn. Mater., 201, 31-33. van Reenen, A., de Jong, A.M., den Toonder, J.M.J. a Prins, M.W.J., 2014. Integrated lab-on-chip biosensing systems based on magnetic particle actuation - a comprehensive review. Lab Chip, 14 (12), 1966-1986. Varilova, T., 2005. Stationary phases for affinity chromatography. Chem. Listy, 99 (8), 570577. Viovy, J., Tabnaoui, S., Malaquin, L. a Descroix, S., 2014. Systeme microfluidique presentant un lit de particules magnetiques. Patent WO2014037674 A1. 13.3.2014. PCT/FR2013/052057. Wang, Z., Yue, T., Yuan, Y., Cai, R., Niu, C. a Guo, C., 2013. Development and evaluation of an immunomagnetic separation-ELISA for the detection of Alicyclobacillus spp. in apple juice. Int. J. Food Microbiol., 166 (1), 28-33. Wattendorf, U. a Merkle, H.P., 2008. PEGylation as a Tool for the Biomedical Engineering of Surface Modified Microparticles. J. Pharm. Sci., 97 (11), 4655-4669. Webb, C., Kang, H., Moffat, G., Williams, R., Estevez, A., Cuellar, J., Jaraiz, E. a Galan, M., 1996. The magnetically stabilized fluidized bed bioreactor: A tool for improved mass transfer in immobilized enzyme systems?. Chem. Eng. J. Biochem. Eng. J., 61 (3), 241-246. Wen, J., Legendre, L.A., Bienvenue, J.M. a Landers, J.P., 2008. Purification of nucleic acids in microfluidic devices. Anal. Chem., 80 (17), 6472-6479. Whitesides, G.M., 2006. The origins and the future of microfluidics. Nature, 442 (7101), 368373. Wilchek, M., 2004. My life with affinity. Protein Sci., 13 (11), 3066-3070. Williams, A. a Ibrahim, I., 1981. Carbodiimide Chemistry - Recent Advances. Chem. Rev., 81 (6), 589-636. Wong, E., Mearns, F. a Gooding, J., 2005. Further development of an electrochemical DNA hybridization biosensor based on long-range electron transfer. Sens. Actuator B-Chem., 111, 515-521. Wu, S., Liu, Z., Liu, S., Lin, L., Yang, W. a Xu, J., 2014. Enrichment and enumeration of circulating tumor cells by efficient depletion of leukocyte fractions. Clin. Chem. Lab. Med., 52 (2), 243-251. Wu, Y., Chang, G., Zhao, Y. a Zhang, Y., 2014b. Hierarchical Fe3O4@NixSiOy microspheres for affinity separation of His-tagged proteins. J. Nanopart. Res., 16 (4), 2358. Yan, J., Horák, D., Lenfeld, J., Hammond, M. a Kamali-Moghaddam, M., 2013. A tosylactivated magnetic bead cellulose as solid support for sensitive protein detection. J. Biotechnol., 167 (3), 235-240. 60
Yanase, N., Noguchi, H., Asakura, H. a Suzuta, T., 1993. Preparation of magnetic latexparticles by emulsion polymerization of styrene in the presence of a ferrofluid. J. Appl. Polym. Sci., 50 (5), 765-776. You, K., Lee, S., Im, A. a Lee, S., 2003. Aptamers as functional nucleic acids: In vitro selection and biotechnological applications. Biotechnol. Bioprocess Eng., 8 (2), 64-75. Young, E.W.K., Berthier, E., Guckenberger, D.J., Sackmann, E., Lamers, C., Meyvantsson, I., Huttenocher, A. a Beebe, D.J., 2011. Rapid prototyping of arrayed microfluidic systems in polystyrene for cell-based assays. Anal. Chem., 83 (4), 1408-1417. Zeng, Z., Hincapie, M., Pitteri, S.J., Hanash, S., Schakwijk, J., Hogan, J.M., Wang, H. a Hancock, W.S., 2011. A proteomics platform combining depletion, multi-lectin affinity chromatography (M-LAC), and isoelectric focusing to study the breast cancer proteome. Anal. Chem., 83 (12), 4845-4854. Zhang, C., Waengler, B., Morgenstern, B., Zentgraf, H., Eisenhut, M., Untenecker, H., Krueger, R., Huss, R., Seliger, C., Semmler, W. a Kiessling, F., 2007. Silica- and alkoxysilane-coated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles: A promising tool to label cells for magnetic resonance imaging. Langmuir, 23 (3), 1427-1434. Zhang, R., Liu, S., Zhao, W., Zhang, W., Yu, X., Li, Y., Li, A., Pang, D. a Zhang, Z., 2013. A simple point-of-care microfluidic immunomagnetic fluorescence assay for pathogens. Anal. Chem., 85 (5), 2645-2651. Zhang, Y., Wang, X., Feng, Y., Li, J., Lim, C. a Ramakrishna, S., 2006. Coaxial electrospinning of (fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin)encapsulated poly(epsilon-caprolactone) nanofibers for sustained release. Biomacromolecules, 7 (4), 1049-1057.
61
4
CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE Cílem dizertační práce bylo navázat vybrané bioaktivní ligandy (enzymy, protilátky)
na moderní nano- a mikromateriály (nanovlákna a magnetické mikročástice). Typ imobilizovaných ligandů, stacionárních fází, způsobu ukotvení ligandu i finálního použití nosičů se lišilo v závislosti na konkrétních projektech, v rámci kterých byly nosiče vyvíjeny (viz Tabulka 5, Obrázek 19). Tabulka 5: Přehled cílů dizertační práce
Nosič
Ligand
Chitosanová nanovlákna
Enzym trypsin
Magnetické mikročástice
Magnetické mikročástice
Obr. 18
Číslo a název projektu
Hojení ran
A
MPO FR-TI1/436, Využití nanovlákenných membrán pro řízené uvolňování aktivních látek.
Enzym trypsin
Potenciální aplikace: biokatalýza
B
PEG a antiEpCAM protilátky
Imunomagnetická separace EpCAM pozitivních buněk v mikrofluidním čipu
C, D
AntiSalmonella protilátky
Imunomagnetická separace Salmonella Typhimurium z mléka v mikrofluidním čipu
Aplikace
E
CAMINEMS č. projektu 228980, Integrated MicroNano-Opto fluidic systems for high-content diagnosis and studies of rare cancer cells.
LOVE-FOOD, č. projektu 317742, Love wave fully integrated Lab-on-Chip platform for food pathogen detection.
Obrázek 19: Přehled připravovaných nosičů v rámci disertační práce: (a) nanovlákna s imobilizovanými enzymy; (b) magnetické částice s imobilizovanými enzymy; (c) magnetické částice povrchově modifikované PEGem; (d) magnetické částice povrchově modifikované PEGem a biofunkcionalizované specifickými Ab (anti-EpCAM); (e) magnetické částice biofunkcionalizované specifickými Ab (anti-Salmonella).
62
Aby bylo možné splnit zadání disertační práce a připravit kvalitní nosiče pro uvedené bioafinitní separace nebo katalýzu, bylo nutné důkladně vybrat vhodné nosiče, ligandy i způsoby jejich vazby na nosič. Následující parametry byly zohledňovány při vývoji všech uvedených nosičových systémů: Rozhodující parametry při výběr nosičů:
velikost nosiče (v případě částic zpravidla jejich hydrodynamický průměr) a související specifický povrch,
složení nosiče a s ním související biokompatibilita,
přítomnost a četnost funkčních skupin pro imobilizaci bioligandu,
nízká nespecifická adsorpce komplexního materiálu na povrch nosiče,
v případě částic hustota, jejich koloidální stabilita sledovaná v různých podmínkách prostředí,
v případě magnetických částic obsah magnetického materiálu a magnetické vlastnosti částic,
cena nosiče.
Kritéria pro výběr vhodného ligandu:
dostatečná čistota a integrita ligandu,
v případě protilátek klonalita, použitý imunogen a druh imunizovaného zvířete,
dostatečná reaktivita s cílovým analytem (v případě protilátek afinita),
nepřítomnost stabilizačních látek (želatina, albumin, azid sodný, aj.) u komerčně dostupných ligandů,
cena ligandu a jeho dostupnost na trhu.
Požadavky na metodu vazby ligandu:
orientovaná vs. neorientovaná imobilizace
nekovalentní vs. kovalentní vazba
Parametry sledované po imobilizaci ligandu na nosič:
hustota ligandu na nosiči a s ní související vazebná kapacita nebo aktivita,
stabilita vůči chemickým činidlům (vliv pH, detergentů, molarity pufru aj.)
v případě částic koloidální stabilita
operační a skladovací stabilita nosiče
63
5 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST, VÝSLEDKY A DISKUZE V této části disertační práce jsou shrnuty výsledky práce publikované v recenzovaných odborných periodikách doplněné o podíl autorky na publikacích včetně uvedení souvislostí a pozadí jejich vzniku. 5.1
Biofunkcionalizace magnetických mikročástic a nanovláken proteolytickým enzymem trypsinem Práce na téma biofunkcionalizace magnetických mikročástic enzymem trypsinem
vznikla pod záštitou evropského projektu CAMINEMS (2009-2012) ve spolupráci s Ústavem makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. v Praze (ÚMCH), konkrétně se skupinou vedenou Ing. Danielem Horákem Ph.D. Této skupině se podařilo připravit nové polymerní magnetické mikročástice z poly(glycidyl methakrylátu) (PGMA) a poly(2-hydroxyethyl methakrylátu) (PHEMA). Imobilizace enzymu trypsinu zde sloužila jako modelová aplikace ověřující vhodnost těchto částic pro biokatalýzu. Na tyto částice byly rovněž imobilizovány protilátky (nespecifické lidské IgG), avšak pouze jako další z řady testovaných ligandů rozšiřující spektrum aplikací, pro které mohou být částice použity. Experimentální podíl autorky na publikaci (Článek I) spočíval ve veškerých imobilizacích trypsinu prezentovaných v článku (optimalizacích metody imobilizace, sledování skladovací i operační stability enzymu) a v přípravě vzorků pro měření zeta potenciálu částic včetně optimalizace jeho měření. Dizertantka je autorkou těch částí článku, které korespondovaly s jejími experimenty, procentuálně lze podíl na publikaci vyjádřit jako 40 %. Biofunkcionalizace nanovláken byla zaštítěna MPO projektem s libereckou firmou Elmarco, s.r.o. (2009-2011, hlavní řešitelka: Ing. Denisa Stránská). Smyslem projektu byl vývoj biokompatibilních nanovlákenných vrstev a jejich následná biofunkcionalizace enzymy. V rámci projektu byla testována nanovlákna z různých materiálů (acetylcelulóza, chitosan, kys. polymléčná, polyvinylalkohol), různé techniky imobilizace (karbodiimidová s EDC ve vodném a s CDI v organickém prostředí, oxidace hydroxylových skupin nanovláken jodistanem sodným a následná vazba přes amino-skupiny enzymu, předchozí varianta s dodatečným síťováním glutaraldehydem) v kombinaci s různými enzymy (trypsin, chymotrypsin, lysozym). Pravděpodobně největší úskalí přinesla tato práce ve způsobu manipulace
s nanovlákny,
ve
volbě
reakčních
nádob,
ve
způsobu
sušení
biofunkcionalizovaných vrstev, apod. Projekt byl zakončen in vitro a in vivo testy cytotoxicity připraveného materiálu (chitosanová nanovlákna s trypsinem), které byly provedeny na externích pracovištích. Na základě tohoto projektu vznikl národní užitný vzor a posléze 64
i publikace, která je nyní v recenzním řízení. Oba výstupy projektu jsou však pouhým výběrem nejzajímavějších výsledků, které projekt přinesl. Experimentální podíl autorky na užitném vzoru i publikaci (Rukopis I) spočíval v imobilizacích enzymů, výběru a optimalizacích metod vazby, stanovení aktivity imobilizovaných enzymů a přípravě vzorků pro testy cytotoxicity. Na rutinních dílčích úkolech autorce pomáhaly i studentky magisterského studijního programu Analýza biologických materiálů Univerzity Pardubice, které se tak staly spoluautorkami připravené publikace. Podíl autorky na psaní publikace je většinový, s výjimkou pasáží o přípravě nanovláken, které byly v gesci spolupracujícího Elmarca; procentuálně vyjádřeno 90%.
65
5.1.1 Článek I New monodisperse magnetic polymer microspheres biofunctionalized for enzyme catalysis and bioaffinity separations. HORÁK D.1, KUČEROVÁ J.2, KORECKÁ L.2, JANKOVIČOVÁ B.2, PALARČÍK J.3, MIKULÁŠEK P.3 a BÍLKOVÁ Z.2 1 Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic 2 Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic 3 Institute of Environmental and Chemical Engineering, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic Macromolecular. Bioscience, 2012, 12, 647-655. DOI 10.1002/mabi.201100393. IF (2012) 3,742
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
5.1.2 Rukopis (manuskript) I
Covalent Biofunctionalization of Chitosan Nanofibers with Proteolytic Enzyme for Wound Healing SRBOVÁ J. 1, SLOVÁKOVÁ M.1, KŘÍPALOVÁ Z.1, ŽÁRSKÁ M.1, ŠPAČKOVÁ M.2, STRÁNSKÁ D.2 a BÍLKOVÁ Z.1
1Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic 2 Elmarco Ltd Co, Liberec, Czech Republic Odesláno 1.7.2015 k recenznímu řízení do Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. IF (2014) 2,759
76
77
Covalent Biofunctionalization of Chitosan Nanofibers with Proteolytic Enzyme for Wound Healing Running Head: Chitosan nanofibers functionalized with enzymes for wound healing Jana Srbova1, Marcela Slovakova1, Zuzana Kripalova1, Monika Zarska1, Martina Spackova2, Denisa Stranska2, Zuzana Bílková1 1
Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic 2
Elmarco Ltd Co, Liberec, Czech Republic
Corresponding author: Mgr. Marcela Slovakova, Ph.D. Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573,
532
10
Pardubice,
Czech
Republic;
telephone:
+420-466-037-721;
fax:
+420-466-037-068; e-mail:
[email protected].
Abstract The electrospun chitosan nanofibers can provide excellent material for immobilized proteolytic enzymes, particularly in the field of wound healing or tissue engineering, which demand biocompatible, nontoxic and hydrophilic matrices with large specific area. This paper deals with an application of electrospun chitosan nanofibers and optimizing conditions for their biofunctionalization by trypsin, model proteolytic enzyme able to effectively degrade necrotic debris in wounds. Nanofibers from pure chitosan were prepared using NanospiderTM technology and covalent immobilization of trypsin followed. Three immobilization techniques utilizing amine and/or hydroxyl groups of chitosan were optimized to achieve maximum proteolytic activity per cm2 of the functionalized chitosan nanofibers (Tryp-NF). Significant differences were observed. Trypsin immobilized by the carbodiimide one-step protocol demonstrated the highest activity of the three procedures, ranging from 132 to 210 IU/cm2 (i.e., 548 – 874 IU/mg of nanofibers), depending on the initial amount of trypsin used. Longterm storage stability together with high operational stability of Tryp-NF supported the intended application of this bioactive nanomaterial. Thereafter the preliminary in vitro tests ruled out the cytotoxicity of Tryp-NF and the in vivo tests for irritation and skin sensitization
78
demonstrated no undesirable skin reactions. All these results demonstrated the potential use of these newly developed Tryp-NF for wound healing.
Keywords trypsin; chitosan; electrospun nanofibers; wound healing; biofunctionalization
Introduction Recently, together with the expanding area of nanotechnologies, increasing interest has been reported in biofunctionalization of such various nanostructures as carbon nanotubes, metallic nanoparticles or nanocomposites.1 The utilization of nanofibers as a support for enzymes immobilization was first reported by Jia et al. in 2002.2 Thus immobilized, the enzymes offer such benefits vis-à-vis their use in soluble forms as controllability of the reaction, reusability, and often both enhanced stability and activity.3-6 Electrospun nanofibers have been proven to provide excellent support for enzyme immobilization7 because of their high specific surface area-to-volume ratios, mass transfer resistance, and effective loading.8,9 Moreover, because they can be manufactured in various formats and from different synthetic and natural polymers, they afford great flexibility in surface functionality.9 In 2005 and 2006, the new technology for a needle-free, high-voltage electrospinning process known as Nanospider was introduced.10,11 It enables the production of nanofibers on an industrial scale. Nanofibers prepared using this revolutionary technique are excellent for their high fiber-diameter uniformity and layer homogeneity. A joining of these properties with the potential for largescale fabrication makes these nanofibers even more attractive from a commercial point of view. Biofunctionalized nanofibers (i.e. modified with biological ligands such as enzymes, growth factors, antibiotics etc.) have found interesting applications in different environmental12,13 or scientific areas,14-16 but their significant characteristics and superiority was demonstrated especially in the expanding area of biomedicine. They can serve as scaffolds or vehicles in drug delivery systems,17 tissue engineering18 or wound healing.19 We have focused on the chitosan nanofibers and their biofunctionalization with enzymes for the purpose of wound healing. Chitosan is a derivative of chitin and is a natural polyaminosaccharide offering a set of unique characteristics that include (among others) biocompatibility, biodegradability, nontoxicity, antibacterial properties, and hydrophilicity.20 The nanofibrous form of chitosan brings additional attractive features like large surface area and porosity leading to good permeability for oxygen and water.21,22 These properties support cell respiration, skin regeneration, moisture retention, removal of exudates, and hemostasis.23 79
The idea of using proteolytic enzymes during the treatment of wounds is rather old24-27 and relies on enzymatic debridement of necrotic tissue in wounds and support of cell migration. It can be used alone or in combination with other techniques, such as negative pressure therapy28 or surgical debridement.27 Typical debriding agents are collagenase and papain in combination with urea; they are commercially available in the form of ointments.29 Here, trypsin, serine protease cleaving the peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues, was selected as a model proteolytic enzyme with a well-understood mode of action and undemanding colorimetric measurement of its activity. The benefits of using immobilized proteolytic enzymes for wound healing are the possibility to control the cleavage of necrotic tissue and also the prolonged enzymatic activity compared to the soluble form of enzyme. The goal of this work was to optimize the preparation of enzymatically highly active and stable nanofibers which have the potential to be used as a bioactive wound dressing. Electrospun nanofibers from pure chitosan were prepared using the needleless Nanospider technology and applied as support for immobilization of trypsin. Even though chitosan nanofibers have tremendous potential for applications in biomedicine,21 techniques for their biofunctionalization with proteolytic enzymes have been poorly explored to date. In this study, three different immobilization strategies, carbodiimide one-step and two-step coupling through the terminal amine and hydroxyl moieties and periodate oxidation targeting hydroxyl groups of chitosan, were applied. All techniques were optimized from the perspective of enzyme yields. The operational and storage stabilities of enzyme-functionalized nanofibers were investigated. Then, both in vitro and in vivo cytotoxicity testing of the trypsinfunctionalized nanofibers followed.
Materials and Methods Chemicals Trypsin from bovine pancreas (EC 3.4.21.4; 13,335 IU/mg), sodium cyanoborohydride, sodium (meta) periodate, benzamidine hydrochloride hydrate, N-(3-Dimethylaminopropyl)N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS), N-α-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride (BApNA), tris (hydroxymethyl) aminomethane, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine1-ethanesulfonic acid (HEPES), and 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Chitosan was purchased from AK 80
Biotech (Qianlong, China) and polyethylene oxide from Scientific Polymer Products (New York, NY, USA). Other chemicals were of analytical grade and obtained from Penta (Chrudim, Czech Republic) or Lach-Ner (Neratovice, Czech Republic). All buffers and solutions were prepared from ultrapure water filtered through a TKA Smart2Pure system (Thermo Scientific TKA, Niederelbert, Germany). Manufacturing of Chitosan Nanofibers A solution of chitosan in 66% acetic acid (6 wt%) was stirred at 50°C until a homogeneous polymer solution was obtained. An aqueous solution of 3% polyethylene oxide was subsequently added to the cooled chitosan solution. The nanofibers were prepared using the modified needleless NanospiderTM technology30 on an NS LAB 500 S electrospinning laboratory device from Elmarco Ltd. (Liberec, Czech Republic). The conditions during the electrospinning process were as follow: the spinning electrode was cylindrical (rotation speed 4 rpm), electrode distance was 130 mm, and voltage was 60 kV. Polypropylene spunbond (17 g/m2; Pegas Nonwovens, Znojmo, Czech Republic) was used as the substrate, and the speed depended on the required basis weight. The crosslinking of nanofibers was achieved by heat treatment (130°C, 1 h). Chitosan nanofibers were cut into squares (1.5 × 1.5 cm). Prior to biofunctionalization of the nanofibers, polypropylene spunbonds were then torn off and all squares were weighted. Scanning Electron Microscopy (SEM) An FEI Quanta 200 scanning electron microscope (FEI, Hillsboro, OR, USA) was used to observe the nanofibers’ structure and evaluate their diameters. Fiber diameters were determined as mean values of 35 measurements on the SEM images at 5,000x magnification. Immobilization of Trypsin The enzyme trypsin was immobilized on the 1.5 × 1.5 cm chitosan squares according to the protocols described below. All measurements were repeated a minimum of three times, the calculated means and SD values of which are shown in the graphs herein. Sodium Periodate Oxidation of Chitosan and Trypsin Immobilization Nanofibrous squares were placed in 2.0 mL polypropylene tubes and rehydrated using 0.5 mL of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3). A solution of sodium periodate was added (volume of 0.5 mL; 0.05 M periodate in 0.025 M HEPES pH 7.3). This was followed by oxidation in darkness under rotation (1.5 h) and five washing steps with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3). A trypsin solution with benzamidine in the volume of 0.9 mL was added to the activated nanofibers (unless stated otherwise, 3 mg of trypsin with 0.3 mg of benzamidine dissolved in the 0.01 M phosphate buffer [pH 7.3]). After 10 min of incubation (RT, rotation), 3 mg of 81
sodium cyanoborohydride in 0.1 mL of the 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) was pipetted to the nanofibers to stabilize the labile Schiff base. Immobilization was carried out at 4°C and rotation for 16 h. The Tryp-NF were washed three times using 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3), once with 1 mL of the same buffer containing 1M NaCl, and twice with 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3). Carbodiimide Method of Trypsin Immobilization One step carbodiimide method: Nanofibrous squares were rehydrated by 1 mL of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3). The supernatant was removed and the zero-length crosslinker EDC (7.5 mg) and sulfo-NHS (1.25 mg) reagent (each dissolved in 0.25 mL of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3)) were quickly added to the nanofibers. Immediate addition of trypsin solution with benzamidine followed (unless stated otherwise, 3 mg of trypsin with 0.3 mg of benzamidine dissolved in 0.5 mL of 0.01 M phosphate buffer [pH 7.3]). The immobilization proceeded at 4°C for 16 h under rotation. Subsequent washing was carried out identically as in the periodate method. For the in vitro and in vivo experiments Tryp-NF squares with dimensions of 9x9 cm were prepared with slight modifications. Briefly, the nanofibers were cut and rehydrated in 15 mL of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3). The addition of EDC (56 mg), sulfo-NHS (9.4 mg) and trypsin with benzamidine (10 mg of trypsin, 1 mg of benzamidine) followed; the immobilization was performed in the total volume of 15 mL. The Tryp-NF were washed three times using 15 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3), once with 15 mL of the same buffer containing 1M NaCl, and twice with 15 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3). Two-step carbodiimide method: The procedure was similar to the one-step procedure with the following distinction. The EDC and sulfo-NHS were dissolved in the volume of 0.5 mL and were added to the washed nanofibers. The activation process continued for 120 min and the supernatant was then replaced by 1 mL of trypsin solution with benzamidine (unless stated otherwise, 3 mg of trypsin with 0.3 mg of benzamidine dissolved in 1 mL of the 0.01 M phosphate buffer [pH 7.3]). Storage and Desiccation Tryp-NF were stored in 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) with sodium azide (0.1% w/v) and benzamidine (0.03 w/v) at 4°C. Desiccation (24 h) and storage of desiccated nanofibers occurred in the air at laboratory temperature. Prior to determining trypsin activity, Tryp-NF were rehydrated for 10 min in 2 mL of ultrapure water and then washed with ultrapure water (3 × 1 mL) and finally with 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.8 (1 × 1 mL).
82
Determination of Trypsin Activity Trypsin activity was determined using the low-molecular-weight chromogenic substrate BApNA according to a method from the literature31 in the final reaction volume of 2 mL. Using a MultiScan RC spectrophotometric reader (Labsystems, Helsinki, Finland), absorbance at 405 nm was measured and trypsin activity per cm2 was calculated. The following formula can be used for recalculating the trypsin activity to IU/mg: (enzyme activity per cm2) / (weight of 2.25 cm2 of nanofibers of the particular basis weight [i.e., 0.54 mg for 2.4 g/m2 and 0.63 for 2.8 g/m2 nanofibers]). Tests for in vitro Cytotoxicity For these experiments squares of Tryp-NF were prepared according to the method described above (One step carbodiimide method of trypsin immobilization). The cytotoxicity of prepared Tryp-NF was examined in the Certified Laboratory of Tissue Cultures in Nove Hrady, Czech Republic, according to the CSN EN ISO 10993-5, Biological evaluation of medical devices — Tests for in vitro cytotoxicity (8.2 and 8.3). All experiments were performed with HeLa cells (ECACC 09E047). Tests for in vivo Irritation and Skin Sensitization For these experiments squares of Tryp-NF were prepared according to the method described above (One step carbodiimide method of trypsin immobilization). The intracutaneous (intradermal) reactivity test after the application of Tryp-NF to the albino rabbits was carried out in the Certified Laboratory Nr. 1057 of VUOS, Rybitvi, Czech Republic according to the CSN EN ISO 10993-10, Biological evaluation of medical devices — Tests for irritation and skin sensitization (6.4).
Results Preparation of Chitosan Nanofibers Nanofibers of different basis weight (i.e., fiber weight per area) ranging from 1 to 2.8 g/m2 with diameters between 107.7 and 128.9 nm were prepared and characterized, as summarized in Table I. The homogeneity and uniformity of the prepared chitosan nanofibers was evaluated using SEM (Fig. 1A–C). Nanofiber squares with a high degree of homogeneity and no structural defects were chosen. Unless specified otherwise in the text, nanofibers of 2.4 or 2.8 g/m2 were used for the functionalization.
83
Table I. Characteristics of prepared chitosan nanofibers. Polymer Basis weight [g/m2] Fiber diameter ± SD [nm]
Chitosan
1.0 1.2 1.4 1.7 2.2 2.5 2.4 2.8
128.9 ± 18.9
107.7 ± 18.8 114.3 ± 11.9
Figure 1. Scanning electron microscope images of prepared chitosan nanofibers (basis weight 2.8 g per m2). Magnification: (A) 150x, (B) 600x, (C) 5,000x.
Trypsin Conjugation to Periodate-Activated Carbohydrates of Chitosan Nanofibers Nanofibers oxidation was performed in distilled water, 0.1 M borate buffer (pH 10), 0.1 M carbonate buffer (pH 9.0), 0.1M, 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3), 0.025 M HEPES (pH 7.3) or their mixtures. The only option leading to unmodified appearance of nanofibers after the oxidation step (evaluated using SEM) consisted in the dissolution of the sodium periodate in 0.025 M HEPES (pH 7.3) and the addition of nanofibers that had previously been hydrated in 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3). The effect of increasing the amount of trypsin (1, 2, 3, 4 and 5 mg) used for the biofunctionalization of periodate-activated nanofibers on the final activity of immobilized trypsin was then investigated (see Fig. 2). The maximum achieved enzyme activity was 57.58 IU/cm2 and was attained after the immobilization of 4 mg of trypsin. The immobilization of higher quantities of trypsin (>4 mg) did not lead to higher enzyme activity and was thus redundant.
84
Figure 2. Optimization of the amount of trypsin to be immobilized on chitosan nanofibers (1.5 × 1.5 cm) by the trypsin conjugation to periodate-activated nanofibers.
Trypsin Conjugation to Chitosan Nanofibers by Carbodiimide Method The suitable pH for immobilization of trypsin using the one-step carbodiimide technique was investigated with the aim of achieving maximum activity of immobilized trypsin while maintaining the integrity of chitosan nanofibers. No pronounced influence of pH of phosphate buffer on trypsin coupling was observed (Fig. 3). Although the highest trypsin activity was measured after immobilization at pH 6.5 (190.36 IU of trypsin per cm2 of nanofibers), the structure of nanofibers was in that case slightly disintegrated. Phosphate buffer at pH 7.3 was selected as a coupling buffer for the subsequent experiments (167.7 IU of trypsin per cm2), and this provided a good environment to maintain the structural integrity of nanofibers.
Figure 3. Effect of pH of immobilization buffer on activity of immobilized trypsin (carbodiimide one-step method).
85
In the case of the two-step carbodiimide immobilization method, the extra optimization time required for the activation of nanofibers with EDC and sulfo-NHS reagents was vital. Different activation times in the interval from 15 to 120 min were tested in order to achieve maximum proteolytic activity of the prepared nanofibers. An increasing trend was observed; the highest trypsin activity was achieved after the longest activation time (i.e., 120 min; Fig. 4). Further prolongation of the activation time has not been tested since it would lead to the unwanted extension of biofunctionalization time of Tryp-NF. Even after this improvement in the method, however, enzyme yields did not exceed the trypsin activity achieved after trypsin immobilization using the previously described one-step carbodiimide method.
Figure 4. Effect of activation time (i.e., activation of nanofibers with EDC plus sulfo-NHS reagents) on activity of trypsin immobilized by the two-step carbodiimide method on chitosan nanofibers.
To find the optimal amount of trypsin for the biofunctionalization of chitosan nanofibers using both variants of the carbodiimide protocols, increasing quantities of trypsin were added to the immobilization mixture (1, 2, 3, 4, and 5 mg of trypsin, see Fig. 5). Significant differences were observed between the one-step and two-step variants in the final activities of immobilized trypsin. With increasing amounts of trypsin added into the reaction, the activity of trypsin-functionalized nanofibers using the one-step protocol increased almost linearly. Trypsin immobilization using the one-step carbodiimide method was proved as the best approach resulting in the activity from 131.51 IU/cm2 up to 209.80 IU/cm2 and was applied for preparation of Tryp-NF for the stability experiments and also for preliminary toxicity testing.
86
Figure 5. Optimization of the amount of trypsin to be immobilized on chitosan nanofibers (1.5 × 1.5 cm) by the carbodiimide method.
The effect of different basis weights of chitosan nanofibers on trypsin loading was also investigated. Electrospun chitosan nanofibers of the same diameter but different weights were prepared and biofunctionalized using the one-step carbodiimide method as you can see in Figure 6. There was no unambiguous dependence between the density of nanofibers and the amount of active trypsin immobilized on them.
Figure 6. Effect of different basis weights of chitosan nanofibers on activity of trypsin immobilized by the carbodiimide one-step procedure.
87
Storage and Operational Stability of Trypsin-Functionalized Nanofibers To demonstrate the long-term usability of Tryp-NF, their storage stability was monitored for 4 weeks in dry or hydrated forms. Higher enzyme activity was achieved when the biofunctionalized nanofibers were desiccated and stored in a dried state. Nevertheless, in both cases trypsin activity after 4 weeks of storage exceeded 90% compared to the initial activity measured immediately after immobilization (Fig. 7).
Figure 7. Effect of storage time and conditions on activity of trypsin immobilized on chitosan nanofibers by the carbodiimide one-step procedure.
The operational stability of trypsin immobilized on nanofibers was determined five times in a row during 1 day and even after the last run the enzyme activity did not fall under 97% (98.4 ± 1.2). Preliminary In vitro Evaluation of Cytotoxicity of Tryp-NF and in vivo Tests for Irriation and Skin Sensitization The in vitro experiments with Hela Cells showed that Tryp-NF exhibited no cytotoxicity after the direct contact nor the infusion from Tryp-NF showed no sign of cytotoxicity. The in vitro tests for intracutaneous (intradermal) reactivity demonstrated that Tryp-NF has not caused any cutaneous reaction on albino rabbit and no signs of toxicity were observed.
Discussion In this study a robust strategy for covalent biofunctionalization of chitosan nanofibers with proteolytic enzymes without altering their mechanical integrity is presented. The work was carried out with the aim to prepare enzymatically active and stable nanofibers that will be applied as advanced bioactive wound dressing. Due to proposed application, the following 88
particularities were defined for this study: (i) the enzyme activity per unit area (cm2) was more relevant than was the usual activity per mass expression (see Materials and Methods for recalculating activity per unit area to mass); (ii) nanofibers from the biocompatible polymer chitosan and heat-mediated post-synthetic crosslinking of nanofibers without any additional chemicals were chosen; (iii) glutaraldehyde, an often used homobifunctional crosslinking agent for enzyme immobilization, was deliberately omitted from the procedure to assure the highest possible biocompatibility and minimal irritant effects when coming into contact with tissues. For preparation of the nanofibers, we used the modified needleless NanospiderTM technology,30 in which polymeric jets are spontaneously formed from liquid surfaces on a rotating spinning electrode. Generally, this technology enables flexibly the formation of fibers tens of nanometers to tens of micrometers in diameter and the preparation of nanofibers with masses per unit area ranging from 1 to 100 g/m2. The thinner the nanofibers are the higher specific surface area is achieved which is advantageous for the immobilization of enzymes. Here we aimed at chitosan matrices with fibers diameter from 107.7 up to 128.9 nm and low basis weight supporting the oxygen permeability and thus the breathability of the nanofibrous layer. As has been described in numerous reviews, the methods applied for enzyme immobilization on nanofibers do not differ from standard bioconjugation techniques32 and include adsorption, covalent immobilization, enzyme entrapment and encapsulation.5,33,34 From this list, covalent bonding is often preferred because it provides stable linkage between enzymes and nanofibers. Glutaraldehyde crosslinking35,36 and carbodiimide chemistry37,38 are two covalent techniques most commonly applied for biofunctionalization of nanofibers and typically result in high loading yields. Here, two different immobilization approaches (oxidation of carbohydrates on chitosan and carbodiimide coupling) were used with various modifications, optimized, and finally compared from the viewpoint of the immobilized trypsin’s activity achieved. The first immobilization method applied in this study is based upon mild oxidation of carbohydrates on chitosan using sodium periodate, which acts on the adjacent hydroxyl groups. Highly reactive aldehyde groups are thereby created and react with an aminecontaining ligand, in our case trypsin. Reductive amination follows to form a highly stable covalent linkage and a zero-length crosslink.39 Chitosan is insoluble in water, but the presence of amine groups makes it soluble in acidic solutions with pH below 6.5.20 Therefore careful choice of the reaction environment (pH, buffer type and its molarity) during all steps of 89
trypsin conjugation by this approach is a key condition for preserving nanofibers integrity and thus the development of stable nanofibrous layers with high proteolytic activity. The second immobilization approach relies on the formation of amide and ester linkages mediated by the zero-length crosslinker carbodiimide (EDC). The addition of sulfo-NHS to the EDC-mediated reaction increases the solubility and stability of the active intermediate O-acylisourea subsequently reacting with the amine and hydroxyl group of chitosan.40 EDC/sulfo-NHScoupled reactions are generally considered as highly efficient39 and can be performed using a one- or two-step procedure. Here both variants were tried. As written above, the highest trypsin activity of Tryp-NF was achieved when carbodiimide one-step conjugation protocol was applied. The reported trypsin loading (expressed as IU/mg) was comparable or even higher than in the literature describing the immobilization of alpha-chymotrypsin on silk fibroin nanofibers36 or lipase to poly(acrylonitrile-co-maleic acid) 35. Storage as well as operational stability are generally important parameters for enzyme carriers applied in the field of biocatalysis. Enzyme immobilization typically improves the stability of enzymes,5 as has been reported several times already when nanofibers have been used as support.41 These parameters are particularly important in case of enzymes with the ability of autolysis, as trypsin. In our case the storage stability Tryp-NF was excellent. An increase in trypsin activity recorded after 1 week of storage (particularly evident on dry nanofibers, Figure 7) is a commonly observed phenomenon caused by the restoration of functional conformation leading to enzyme reactivation.35 These experiments repeatedly confirmed high and sufficient proteolytic activity of stored Tryp-NF. Storage of Tryp-NF in a dry form lead to higher trypsin activity after 4 weeks of storage compared to the hydrated form, indicating their usability as wound dressings since the dry form is more practical and also strongly demanded by the potential end users. Dry form of storage also excludes the risk of autolytic self-degradation of trypsin in time. High operational stability of Tryp-NF determined after the 5th reuse clearly showed its excellent ability to repeatedly cleave the target substrate without any substantial activity loss. This is extremely beneficial feature from the point of view of the intended application, since it might prolong the duration of the action of this wound dressing without the need of redressing. In the end the preliminary toxicity tests with Tryp-NF were done according to standardized ISO procedures in the certified laboratories with the appropriate facilities. The in vitro tests were designed to determine the biological response of mammalian cells (HeLa cells) exposed directly to Tryp-NF and to extracts of Tryp-NF in EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium). In the in vivo experiments, the Tryp-NF were extracted to sterile water (as a polar 90
solvent) and olive oil (nonpolar solvent) and both extracts were injected intracutaneously at five sites on one side of each albino rabbit. The appearance of each injection site immediately after injection and at (24 ± 2) h, (48 ± 2) h and (72 ± 2) h after injection were observed and possible skin reactions (erythema and/or oedema) were recorded. Results from both in vitro and in vivo tests showed no cytotoxicity of Tryp-NF, which supported the idea of using of nanofibers with immobilized proteolytic enzymes as the bioactive wound dressings.
Conclusions In this work, biocompatible chitosan electrospun nanofibers prepared using a needleless electrospinning technology were biofunctionalized by the enzyme trypsin. Not only trypsin activity but also the nanofibers’ integrity were important parameters taken into account in optimizing all steps during the nanofibers’ biofunctionalization. Maximum trypsin activity and excellent wholeness of chitosan nanofibers were achieved when the one-step EDC+sulfoNHS method was performed. This resulted in activity up to 209.8 ± 0.6 IU/cm2 of nanofibers. The two-step EDC+sulfo-NHS protocol yielded activity up to 88.2 ± 8.9 IU/cm2 and the periodate oxidation method up to 57.6 ± 14.7 IU/cm2. This study confirmed that nanofibers from pure chitosan can serve as an excellent support for enzyme immobilization, and especially when each step of biofunctionalization is thoroughly optimized in order to prevent dissolution or disintegration of the nanofibrous structure. The excellent stability of trypsin immobilized on chitosan nanofibers together with no toxicity of Tryp-NF reported here suggests their potential commercial applicability.
Acknowledgement The authors wish to acknowledge the Ministry of Industry and Trade for financial support of the research program under grant MPO TIP FR-TI1/0436.
References 1. Kumar C. Biofunctionalization of nanomaterials. 1st ed. Weinheim: Wiley; 2005. 2. Jia H, Zhu G, Vugrinovich B, Kataphinan W, Reneker DH, Wang P. Enzyme-carrying polymeric nanofibers prepared via electrospinning for use as unique biocatalysts. Biotechnol Prog 2002;18:1027-1032. 3. Liese A, Hilterhaus L. Evaluation of immobilized enzymes for industrial applications. Chem Soc Rev 2013;42:6236-6249.
91
4. Katchalski-Katzir E. Immobilized enzymes - learning from past successes and failures. Trends Biotechnol 1993;11:471-478. 5. Cao L, Schmid RD. Carrier-bound immobilized enzymes: Principles, application and design. 1st ed. Weinhein: Wiley; 2006. 6. Tischer W, Wedekind F. Immobilized enzymes: Methods and applications. Fessner W, Archelas A, Demirjian DC, editors. Biocatalysis - from discovery to application, vol 200. Berlin: Springer; 1999:95-126. 7. Wang Z, Wan L, Liu Z, Huang X, Xu Z. Enzyme immobilization on electrospun polymer nanofibers: An overview. J Molec Catal B 2009;56:189-195. 8. Jia H. Enzyme-carrying electrospun nanofibers. In: Wang P, editor. Nanoscale biocatalysis: Methods and protocols, vol 743, New York: Humana Press; 2011:205–212. 9. Huang Z, Zhang Y, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Composites Sci Technol 2003;63:2223-2253. 10. Petrik S, Maly M, Rubacek L, Macak J, Stranska D, Duchoslav J, Coppe A. Electrospun nanofiber – the tiny layers that add great value to nonwovens. Proceedings of International Nonwoven Symposium. Stockholm: EDANA, 2008. 11. Jirsak O, Kalinova K, Stranska D. Nanofibre technologies and nanospider applications. Presented at the 5th International Nanotechnology Symposium “Nanofair - New Ideas for Industry”, Karlsruhe, November 21-22, 2006. 12. Kim SH, Kim J. COLL 437-highly active and stable enzyme-coated nanofibers for detection and decontamination. Abstr Pap Am Chem S 2007; 234: U437-U437. 13. Han D, Filocamo S, Kirby R, Steckl AJ. Deactivating chemical agents using enzymecoated nanofibers formed by electrospinning. ACS Appl Mater Interfaces 2011;3:46334639. 14. du Plessis DM, Botes M, Dicks LMT, Cloete TE. Immobilization of commercial hydrolytic enzymes on poly (acrylonitrile) nanofibers for anti-biofilm activity. J Chem Technol and Biot 2013;88:585-593. 15. Ren G, Xu X, Liu Q, et al. Electrospun poly(vinyl alcohol)/glucose oxidase biocomposite membranes for biosensor applications. React Funct Polym 2006;66:1559-1564. 16. Sawicka K, Gouma P, Simon S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem 2005;108:585–588. 17. Buschle-Diller G, Cooper J, Xie Z, Wu Y, Waldrup J, Ren X. Release of antibiotics from electrospun bicomponent fibers. Cellulose 2007;14:553-562. 18. Sahoo S, Ang LT, Goh JC, Toh S. Growth factor delivery through electrospun nanofibers in scaffolds for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res Part A 2010;93A:1539-1550. 19. Choi JS, Choi SH, Yoo HS. Coaxial electrospun nanofibers for treatment of diabetic ulcers with binary release of multiple growth factors. J Mater Chem 2011;21:5258-5267. 20. Krajewska B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: A review. Enzyme Microb Technol 2004;35:126-139.
92
21. Ding F, Deng H, Du Y, Shi X, Wang Q. Emerging chitin and chitosan nanofibrous materials for biomedical applications. Nanoscale 2014;6:9477-9493. 22. Kubinova S, Sykova E. Nanotechnologies in regenerative medicine. Minim Invasive Ther 2010;19:144-156. 23. Rieger KA, Birch NP, Schiffman JD. Designing electrospun nanofiber mats to promote wound healing - a review. J Mat Chem B 2013;1:4531-4541. 24. Sinclair And RD, Ryan TJ. Proteolytic enzymes in wound healing: The role of enzymatic debridement. Australas J Dermatol 1994;35:35-41. 25. Mekkes JR, Le Poole IC, Das PK, Bos JD, Westerhof W. Efficient debridement of necrotic wounds using proteolytic enzymes derived from antarctic krill: A double-blind, placebo-controlled study in a standardized animal wound model. Wound Repair Regen 1998;6:50-57. 26. Connell J, Rousselot L. The use of enzymatic agents in the debridement of burn and wound sloughs. Surgery 1951;30:43-55. 27. Ramundo J, Gray M. Enzymatic wound debridement. J Wound Ostomy Cont Nurs 2008;35:273-280. 28. Miller JD, Carter E, Hatch DC, Zhubrak M, Giovinco NA, Armstrong DG. Use of collagenase ointment in conjunction with negative pressure wound therapy in the care of diabetic wounds: A case series of six patients. Diabetic Foot & Ankle 2014;6. 29. Ramundo J, Gray M. Collagenase for enzymatic debridement A systematic review. J Wound Ostomy Cont Nurs 2009;36:S4-S11. 30. Jirsak O, Sanetrnik F, Lukas D, Kotek K, Martinova L, Chaloupek J. U.S. patent No. WO205024101. 2005. 31. Korecka L, Jezova J, Bílková Z, Horák D, Hradcova O, Slovakova M, Viovy JL. Magnetic enzyme reactors for isolation and study of heterogeneous glycoproteins. J Magn Magn Mater 2005;293:349-357. 32. Agarwal S, Wendorff JH, Greiner A. Chemistry on electrospun polymeric nanofibers: Merely routine chemistry or a real challenge? Macromol Rapid Commun 2010;31:13171331. 33. Brena BM, Batista-Viera F. Immobilization of enzymes. Guisán JM, editor. Immobilization of enzymes and cells, vol 22, Totowa, NJ: Humana Press;2006:15-30. 34. Sassolas A, Blum LJ, Leca-Bouvier BD. Immobilization strategies to develop enzymatic biosensors. Biotechnol Adv 2012;30:489-511. 35. Ye P, Xu Z, Wu J, Innocent C, Seta P. Nanofibrous membranes containing reactive groups: Electrospinning from poly(acrylonitrile-co-maleic acid) for lipase immobilization. Macromolecules 2006;39:1041-1045. 36. Lee K, Ki C, Baek D, Kang G, Ihm D, Park Y. Application of electrospun silk fibroin nanofibers as an immobilization support of enzyme. Fiber Polym 2005;6:181-185. 37. Ye P, Xu Z, Wu J, Innocent C, Seta P. Nanofibrous poly(acrylonitrile-co-maleic acid) membranes functionalized with gelatin and chitosan for lipase immobilization. Biomaterials 2006;27:4169-4176.
93
38. Huang X, Yu A, Jiang J, Pan C, Qian J, Xu Z. Surface modification of nanofibrous poly(acrylonitrile-co-acrylic acid) membrane with biomacromolecules for lipase immobilization. J Mol Catal B-Enzym 2009;57:250-256. 39. Hermanson GT. Bioconjugate techniques. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press; 2008:1202. 40. Hermanson GT. Chapter 4 - Zero-length crosslinkers. Hermanson GT, editor. Bioconjugate techniques. Boston: Academic Press; 2013:259-273. 41. Li Y, Quan J, Branford-White C, Williams GR, Wu J, Zhu L. Electrospun polyacrylonitrile-glycopolymer nanofibrous membranes for enzyme immobilization. J Mol Catal B-Enzym 2012;76:15-22.
94
5.1.3 Užitný vzor
Prostředek pro aplikaci proteolytických enzymů na ránu a prostředek ke krytí ran Národní užitný vzor č. 26861 Číslo přihlášky: 2012-27049 Datum podání přihlášky: 21.11.2012 Datum zápisu užitného vzoru: 28.4.2014 Původci:
STRÁNSKÁ D., SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J., BÍLKOVÁ Z.
Přihlašovatelé: Elmarco, s.r.o., Univerzita Pardubice
95
96
97
98
99
100
101
102
103
5.2
Modifikace magnetických částic poly(ethylenglykolem) a anti-EpCAM protilátkami pro mikrofluidní separaci EpCAM pozitivních buněk Tato práce navazovala na Článek I a rovněž vznikla v rámci evropského projektu
CAMINEMS. V tomto projektu byl vyvíjen magnetický imunosorbent pro mikrofluidní izolaci cirkulujících nádorových buněk (angl. circulating tumor cells, CTC) exprimující diagnostický povrchový marker – glykoprotein EpCAM. Vyvinuté magnetické PGMA částice tak byly biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami, avšak po jejich vložení do mikrofluidního PDMS čipu, nazvaného Ephesia, vyvinutém na spolupracujícím pracovišti Institutu Curie v Paříži, došlo k masivní agregaci imunosorbentu a k adhezi na stěny kanálků. Přirozeně tak bylo nutné částice před imobilizací protilátek povrchově modifikovat, konkrétne polymerem poly(ethylenglykolem), PEGem. Výsledkem je Článek II zabývající se nejen vazbou PEGu na částice, ale především metodami jeho průkazu a kvantifikace jeho množství na povrchu částic, což se ukázalo být poměrně komplikované. Součástí práce je rovněž hodnocení míry nespecifické adsorpce proteinů a buněk na povrch částic a ověření jejich chování v mikrofluidních systémech. Aby bylo možné PEG využít jako raménko pro následnou imobilizaci bioaktivních látek, byla křenová peroxidáza jako modelový enzym imobilizována přes PEG nesoucí terminální hydroxylovou skupinu. Podíl autorky na experimentální části práce byl většinový, s výjimkou syntézy částic, SEM mikroskopie, IČ analýzy částic a provedení experimentů s nespecifickou adhezí buněk. Rovněž sepsání publikace bylo výhradně v gesci autorky, opět s výjimkou specifických pasáží týkajících se výše zmíněných technik; celkový podíl dizertantky na publikaci činil 85 %. PEGylované částice byly následně biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami
a
tento
imunosorbent
byl
použit
pro
imunomagnetickou
separaci
(homobifunkční hydrazid-PEG-hydrazid a heterobifunkční amin-PEG-karboxyl) a tedy i metodou imobilizace na magnetické částice byly testovány coby raménko pro následnou vazbu anti-EpCAM protilátek. Výsledkem této práce je Článek III, ve kterém měla autorka pouze částečný podíl na experimentech (výběr PEGů, PEGylace částic, případně vazba protilátek a spolupráce na experimentech v čipu). Sepsání výsledků do formy publikace bylo dílem prvního autora článku. Procentuálně lze podíl dizertantky na publikaci vyjádřit jako 40%.
104
5.2.1 Článek II
PEGylation of magnetic poly(glycidyl methacrylate) microparticles for microfluidic bioassays KUČEROVÁ J.A, SVOBODOVÁ Z.A, KNOTEK P.B, PALARČÍK J.C, VLČEK M.D1, KINCL M.D1, HORÁK D.D, AUTEBERT J.E, VIOVY J-LE a BÍLKOVÁ ZA* a Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic. b Joint Laboratory of Solid State Chemistry of IMC and University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic. c Institute of Environmental and Chemical Engineering, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic. d Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Heyrovsky Sq. 2, 162 06 Prague 6, Czech Republic. e Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26 Rue d′Ulm, 75005 Paris, France. 1 Present address: Joint Laboratory of Solid State Chemistry of Institute of Macromolecular Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic and University of Pardubice, Studentska 84, 532 10 Pardubice, Czech Republic. Mater. Sci. Eng. C-Mater. Biol. Appl. C, 40 308–315. DOI 10.1016/j.msec.2014.04.011. IF (2014) 3,088
105
106
107
108
109
110
111
112
113
5.2.2 Článek III
Application of an improved magnetic immunosorbent in an Ephesia chip designed for circulating tumor cell capture SVOBODOVÁ Z.1, KUČEROVÁ J.1, AUTEBERT J.2, HORÁK D.3, BRUČKOVÁ L.1, VIOVY J.-L.2, BÍLKOVÁ Z.1 1Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic 2Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, Paris, France 3Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic Electrophoresis, 35, 323-329. DOI 10.1002/elps.201300196. IF (2014) 3,028
114
115
116
117
118
119
120
121
5.3
Vývoj nosiče pro imunomagnetickou separaci salmonel v mikrofluidním čipu Cílem evropského projektu LOVE-FOOD (2012-2016) je vyvinout mikrofluidní
analyzátor pro průkaz vybraných patogenů (Salmonella Typhimurium, Bacillus cereus) z mléčných výrobků. Pro mikrofluidní imunoprecipitace byl v r. 2012 vyvinut na partnerském pracovišti Curie Institut, Paříž, Francie zcela nový typ čipu inspirovaný kolonovým magneticky stabilizovaným fluidním ložem (prezentováno formou konferenčního příspěvku: Tabnaoui a kol. 2012). Tento typ čipu byl v r. 2014 patentován (Viovy a kol. 2014). V rámci projektu LOVE- FOOD byl čip konstrukčně přizpůsoben konkrétně pro mikrofluidní záchyt bakterií a byla v něm následně ve spolupráci s naším pracovištěm a s Institutem Pasteur, Paříž, Francie, optimalizována technika imunomagnetického záchytu buněk a jejich následná detekce (prezentováno zatím pouze formou konferenčního příspěvku: Pereiro a kol. 2014). Výsledky z této práce byly sepsány formou publikace, kterou spolupracující pracoviště aktuálně připravuje pro odeslání do prestižního časopisu Nature Communications (IF 11,470) (Rukopis II). Podíl dizertantky na tomto rukopisu je 30 %. Úkolem našeho pracoviště v rámci projektu bylo připravit účinný specifický imunosorbent pro mikrofluidní magnetickou separaci bakterií Salmonella Typhimurium. Výsledky této navazující práce byly již rovněž sepsány do podoby rukopisu (Rukopis III), který však nesmí být odeslán do chvíle, než bude opublikována pilotní práce detailně popisující mikrofluidní čip (viz prohlášení Stephanie Descroix, Ph.D., str. 126). Poté bude rukopis odeslán k posouzení do International Journal of Food Microgiology (IF 3,082). Podíl autorky na experimentech je většinový (s výjimkou vývoje mikrofluidního čipu), stejně tak jako na psaní publikace; procentuálně vyjádřeno 90 %.
Pereiro, I., Kučerová, J., Alexandre, L., Dupuy, B., Bílková, Z., Viovy, J.-L-, Malaquin, L., Descroix, S.:Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria extraction, growth and detection. In Proceedings of the MicroTAS 2014 Conference, ISBN 978-0-979806426-30-7-6, San Antonio, Texas, USA, s. 437-439. Tabnaoui, S., Malaquin, L., Descroix, S., Viovy J-L.: Integrated microfluidic fluidized bed for sample preconcentration and immunoextraction. In Proceedings of the MicroTAS 2012 Conference, ISBN 978-09798064-5-2, Okinawa, Japonsko, s. 1408-1410. Viovy, J., Tabnaoui, S., Malaquin, L. a Descroix, S., 2014. Systeme microfluidique presentant un lit de particules magnetiques. Patent WO2014037674 A1. 13.3.2014. PCT/FR2013/052057.
122
5.3.1 Rukopis (manuskript) II Microfluidic fluidized bed: a new microfluidic module for bacteria detection PEREIRO I.1, TABNANOUI S.1, BENDALI A.1, SRBOVÁ J.2, BÍLKOVÁ Z.2, DUPUY B.3, DESCROIX S.3 1Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26 Rue d′Ulm, 75005 Paris, France 2Dept. of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573, 53210 Pardubice, Czech Republic 3Lab. of Pathogenesis of Bacterial Anaerobes, Dept. Microbiol., Institut Pasteur, 25 rue du docteur roux, 75724 Paris, France. Připravováno pro odeslání v listopadu 2015 do Nat. Commun. IF (2014) 11,470
123
Příprava rukopisu je v gesci spolupracujícího pracoviště, Institutu Curie. Z tohoto důvodu zde není uveden připravovaný rukopis v celém rozsahu. Na následujících řádcích je tedy alespoň zjednodušeně popsán princip vyvinutého mikrofluidního systému, aby bylo možné plné porozumění Rukopisu III. Obsahem tohoto rukopisu je popis a aplikace vyvinutého mikrofluidního analyzátoru pracujícího na principu magneticky stabilizovaného fluidního lože. V tomto mikrofluidním čipu se magnetické částice nachází ve vznosu ve stavu ustálené dynamické rovnováhy. Tohoto stavu je dosaženo díky následujícím vzájemně se vyrovnávajícím silám působícím na částice: hydrodynamická síla okolní proudící kapaliny a magnetická síla způsobená přiloženým permanentním magnetem (Obrázek 1a). Rozměry, geometrie a kónický tvar hlavní komory čipu jsou přizpůsobeny tomu, aby byly částice ve vznosu stabilní, aby nedocházelo k jejich ztrátě a zároveň aby probíhala jejich neustálá recirkulace. Tento mikrofluidní čip může pracovat v režimu aplikovaného konstantního tlaku nebo průtoku. Při minimálním průtoku kapaliny nebo při jeho úplném zastavení dochází k tzv. „zavírání“ fluidního lože ve směru k přiloženému magnetu a vytvoření tzv. kompaktního lože, zátky (angl. packed bed regime) (Obrázek 1b). Naopak při průtoku kapaliny (až do rychlosti 3 µl/min) dochází k vytvoření dynamické rovnováhy a částice vytvoří v čipu tzv. fluidní lože, vrstvu (angl. fluidized bed regime). Ve fluidním režimu je dosaženo vysoké porozity vrstvy a recirkulace částic, čímž je zajištěn vysoký specifický povrch částic pro interakci s analyzovaným
kapalným
vzorkem.
V
tomto
režimu
probíhají
imunoprecipitace
(b)
MAGNET
(a)
MAGNET
Intenzita magnetického pole
nebo imunomagnetické separace cílových analytů.
Obrázek 1: (a) Schématické znázornění principu mikrofluidního magneticky stabilizovaného fluidního lože. (b) Snímek PDMS mikrofluidního čipu ve dvou různých pracovních režimech: horní snímek znázorňuje kompaktní lože magnetických částic (stav bez průtoku kapaliny, působí pouze magnetická přitažlivá síla), spodní snímek znázorňuje stejný čip po spuštění průtoku kapaliny čipem a vytvoření fluidní vrstvy, ve které jsou částice v dynamické rovnováze a recirkulují.
124
5.3.2 Rukopis (manuskript) III Advanced specific immunosorbent for microfluidic capturing and pre-concentration of milkborn pathogens SRBOVÁ J.1, HOLUBOVÁ L.1, KRULIŠOVÁ P.1, PEREIRO I.2, BENDALI A.2, DUPUY B.3, HAMIOT A.3, DESCORIX S.2, VIOVY J.-L.2, BÍLKOVÁ Z.1 1Dept. of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573, 53210 Pardubice, Czech Republic 2Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26 Rue d′Ulm, 75005 Paris, France 3Lab. of Pathogenesis of Bacterial Anaerobes, Dept. Microbiol., Institut Pasteur, 25 rue du docteur roux, 75724 Paris, France. Připraveno k odeslání do Int. J. Food Microbiol. IF (2014) 3,082.
125
126
Specific Immunosorbent for Advanced Microfluidic Capturing and Pre-Concentration of Milkborn Pathogens Jana Srbova1, Lucie Holubova1, Pavla Krulisova1, Iago Pereiro2, Amel Bendali2, Bruno Dupuy3, Audrey Hamiot3, Stephanie Descroix2, Jean-Louis Viovy2, Zuzana Bilkova1 1
Dept. of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573, 53210 Pardubice, Czech Republic; Email:
[email protected].
2
Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26 Rue d′Ulm, 75005 Paris, France
3
Lab. of Pathogenesis of Bacterial Anaerobes, Dept. Microbiol., Institut Pasteur, 25 rue du docteur roux, 75724 Paris, France.
Abbreviations Ab
antibodies
CE
capture efficiency
EDC
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride
HRP
horseradish peroxidase
IMS
immunomagnetic separation
MES
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
Promag-KPL Promag microspheres biofunctionalized with the polyclonal anti-Salmonella Ab sulfo-NHS
from KPL sodium salt of N-hydroxysulfosuccinimide
Abstract Recent outbreaks of food-borne infections even in countries with advanced economics accelerated the development of highly sensitive biosensors and portable microfluidic devices for rapid pathogen detection. Therefore, the step-by-step preparation of the efficient antiSalmonella
immunosorbent
for
microfluidic
immunocapture
and
pre-concentration
of Salmonella Typhimurium from whole milk together with immunosorbent´s validation is presented. Different factors were considered while choosing the suitable antibodies (Ab) and particles, e.g. clonality and specificity of Ab, particles´ size, their binding capacity and compatibility with microfluidics. This resulted in the development of the magnetic 127
immunosorbent carrying polyclonal goat anti-Salmonella Ab, further denoted as “PromagKPL”. Depending on the initial concentration of a pure culture of Salmonella (101 up to 105 CFU/mL) 69.2±23.5 % up to 86.2±12.6% capture efficiency (CE) were achieved using our Promag-KPL microspheres. The selectivity of the immunosorbent was demonstrated by immunomagnetic separation (IMS) from mixed cultures of Salmonella and E. coli; even under the hundredfold surplus of E. coli the CE of Salmonella did not decline to less than 76.3±3.0 %. Then the IMS from milk differing in fat content (0.5-3.5%) artificially spiked with Salmonella followed. The presence of milk globules and micelles neither affected the behaviour of the prepared immunosorbent nor the achieved CE of Salmonella cells. After that analogous experiments were performed in a microfluidic chip - magnetically stabilized fluidized bed; CE from 86.4 up to 99.2 % were achieved. All these results pointed out the quality of prepared immunosorbent and emphasized the efficiency of the miniaturized systems compared to the experiments in larger sample volumes (0.5 mL). Magnetically stabilized fluidized bed showed to be excellent in term of immunosorbents´ recirculation assuring a high probability of collision with target bacteria which lead to high and specific CE. Almost 100 % CE achieved during this separation and pre-concentration step is a perfect springboard for some of the following microfluidic end-detection technique which could lead to development of highly-sensitive and robust microfluidic device for detection of various bacteria in liquid food samples. Keywords: immunomagnetic separation; immobilization; antibodies; microfluidics; capture efficiency; immunocapturing Highlights
1.
Magnetic immunosorbent for the microfluidic capture of Salmonella was developed.
Capture rate of Salmonella in batch reached up to 86.2 % in a model buffer.
Immunocapture of Salmonella from milk was demonstrated in a microfluidic chip.
The capture efficiency of Salmonella increased in the microfluidic chip up to 99.3 %.
Introduction Immunomagnetic separation (IMS) is an effective tool for selective isolation,
purification and pre-concentration of target analyte – peptides, proteins or whole cells like bacteria – using magnetic beads coated with specific antibodies (e.g., reviewed in Cudjoe, 2014; Olsvik et al., 1994; Safarik and Safarikova, 2004). It can greatly increase the detection 128
probability and thereby the sensitivity of the whole detection or diagnostic assays (Duodu et al., 2009). This technique is especially advantageous for the isolation of cells due to its gentleness assuring high viability of captured cells (Safarik and Safarikova, 1999). The IMS has become a widely applied approach also in the field of food microbiology where IMS of bacteria from various complex food matrices like meat (Favrin et al., 2003; Hagren et al., 2008; Zheng et al., 2014), eggs (Mine, 1997; Rijpens et al., 1999), fruit (Najafi et al., 2014; Wang et al., 2014) or dairy products (Fisher et al., 2009; Liebana et al., 2009; Rijpens et al., 1999) has been reported. IMS is not detection method in itself. It is usually connected with the end-detection methods like plating, PCR/real-time PCR (Metzger-Boddien et al., 2006; Zheng et al., 2014), ELISA (Wang et al., 2013), lateral flow tests (Fisher et al., 2009) and others (Favrin et al., 2003; Najafi et al., 2014; Perez et al., 1998). IMS is typically realized in batch – tubes or flasks - but due to the magnetic properties of the immunosorbents it can be also automatized and carried out in a microfluidic format. Choice of the detection methods compatible with microfluidics (such as PCR) enables the development of miniaturized, automatized and portable platforms integrating the pre-concentration step (IMS) and the final detection of food pathogens. The need for development of such portable devices for routine and rapid monitoring of food quality is still emerging in order to prevent massive food outbreaks (Newell et al., 2010) such as Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany. This effort is supported by the recent expansion of published papers dealing with rapid biosensors-based immunocapture and detection of food-borne pathogens (Kim et al., 2015; Wang et al., 2015; Zhang et al., 2011). Magnetic immunosorbents, i.e. magnetic microspheres grafted with the antibodies of desired specificity, applied for IMS of bacteria must meet at least these requirements: excellent immunoreactivity with target bacteria and minimal nonspecific adsorption of the abundant food matrices and accompanying non-target bacteria. The advantage of using Ab immobilized on magnetic beads inserted and held in the particular chamber of microfluidic chips over the Ab immobilized directly on the inner surface of the chips is potentially higher specific surface and the possibility to wash away the immunocomplexes of bead-bacteria for further analysis without the need of drastic disrupting the bead-bacteria bonding. When inserting the immunosorbent into the microfluidic chips, following additional demands are placed: (i) high colloidal stability under different conditions; (ii) satisfactory magnetic response of the immunosorbent enabling rapid operation times; (iii) minimal adhesion of the immunosorbent on the inner walls of microfluidic devices. However the offer of 129
the commercially available anti-bacterial immunosorbents is limited to selected common pathogens, such as E. coli O57:H7, Listeria spp., Salmonella spp., Cryptosporidium oocysts and sometimes they do not meet all the aforementioned criterions. In this study, we focused on the development of our specific immunosorbent for microfluidic IMS of a representative of common food-borne pathogens - Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium from milk. Attention was paid on the choice of the anti-Salmonella antibodies used for immobilization on magnetic microspheres whose choice was also discussed. The capture efficiency, CE, of Salmonella Typhimurium achieved with our Promag-KPL immunosorbent was thoroughly evaluated in a batch-wise arrangement in a model buffer. The IMS from artificially spiked milk differing in fat content (skimmed UHT, semi-skimmed UHT, whole UHT, and pasteurized) followed. Finally, the developed immunosorbent was applied for IMS from the whole milk in a novel microfluidic PDMS chip (Pereiro et al., 2014; Viovy et al., 2014). 2.
Materials and Methods 2.1. Chemicals and Antibodies (Ab) Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enterica serotype Enteritidis, bovine
serum albumin (BSA), Tween 20, NiCl2, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC),
the
sodium
salt
of
N-hydroxysulfosuccinimide
(sulfo-NHS),
2-(N-
morpholino)ethanesulfonic acid (MES) were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) and Immuno-Blot PVDF membrane (0.2µm) were acquired from Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) was from Gibco, Life Technologies (Waltham, MA, USA). Other chemicals were of analytical grade and obtained from Penta (Chrudim, the Czech Republic). All buffers were prepared from ultrapure water filtered through a TKA Smart2Pure system (Thermo Scientific TKA, Niederelbert, Germany). Skimmed UHT (fat content 0.5%), semi-skimmed UHT (fat content 1.5%), whole UHT milk (fat content 3.5%) as well as high-temperature pasteurized milk (fat content 1.5%), were bought in a common grocery. Primary Ab for immobilization and dot blot: (i) Mouse monoclonal Ab: anti-LPS core IgG2a Clone No M9011222 was acquired from MyBiosource (San Diego, CA, USA) and anti-LPS core IgG2a with ID GWB-115B3D was produced by GenWay Biotech (San Diego, CA, USA). (ii) Polyclonal Ab: rabbit anti-Salmonella sp. Ab was provided by Virostat (Portland, ME, USA), and goat Ab of the same specificity were from KPL (Gaithersburg, MD, USA). Nonspecific IgG from human serum (huIgG) was purchased from Sigma Aldrich 130
(St. Louis, MO, USA). Secondary antibodies for dot blot: goat anti-mouse IgG with horseradish peroxidase (HRP) and goat anti-rabbit IgG with HRP were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Rabbit anti-goat IgG-HRP were from Dako (Glostrup, Denmark). 2.2. Magnetic Microspheres Micromer®-M
-
PEG-COOH
particles
were
purchased
from
Micromod
Partikeltechnologie GmbH (Rostock, Germany), ProMag™ 1 Series COOH Surfactant Free (further denoted as Promag) were from Bangs Laboratories, Inc. (Fishers, IN, USA), SiMAGCarboxyl particles were from Chemicell (Berlin, Germany), and Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynabeads MyOne Carboxylic Acid and Dynabeads® anti-Salmonella were from Dynabeads, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). 2.3. Bacterial Cultures S. enterica subspecies enterica Le Minor and Popoff serovar Typhimurium ATCC 43971, Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers ATCC 25922 and Citrobacter braakii CCM 3393 (from Czech Collection of Microorganisms, Brno, the Czech Republic) were cultured on nutrient agar No. 2 (HiMedia, Mumbai, India) or Chromocult Coliform Agar (Merck, Darmstadt, Germany) at 37 °C. For dot blot experiments, 18-24 h cultures of all tested bacterial strains were suspended in phosphate-buffered saline (PBS) to an optical density of 1.5 at 600 nm and prior to application on the membrane diluted with PBS in a 1:1 ratio. Various dilutions of the above suspension were tested to optimize the appropriate concentration of bacteria to be applied to the membrane (from 1:200 up to 2:1 (v/v)). For immunomagnetic separation, 18-24 h culture of S. Typhimurium or E. coli was resuspended in a physiological solution to an optical density of 0.5 of McFarland (~1-2x108 CFU/mL) and diluted in PBS containing 0.05% v/v Tween 20 (PBS-T) or milk, respectively, down to the required concentration (down to 101 CFU/mL). 2.4. Whole Cell Dot blot The dot blot experiment was performed according to the previously published method (Svobodova et al., 2013) but omitting the step with the chaotropic agent. For this experiment, a Dot-blot DHM-96 unit manifold from Scie-Plast (Cambridge, UK) and vacuum pump rated at 600 mm Hg (0.8 Bar) were used. The suspensions of bacterial cells (S. Typhimurium, Escherichia coli, and Citrobacter braakii; see 2.3) were spotted 131
on the PVDF membrane in a volume of 100 µL. Lipopolysaccharide was spotted at a concentration of 5 µg per 100 µL of PBS. Blocking step, incubation with different primary and secondary Ab with HRP (a dilution factor 1:1000 was used for both Ab; for a list of Ab used for dot blot see Table 2) followed. For detailed information see (Kucerova et al., 2013). 2.5. Immobilization of Antibodies on Magnetic Microspheres One milligram of Promag microspheres was five times washed with 0.1M MES (1 mL; pH 5) and activated with EDC (7.5 mg in 0.25 mL of 0.1M MES pH 5) and sulfo-NHS (1.25 mg in 0.25 mL of the same buffer), the volume was filled up to 1 mL with the same buffer and incubation followed (room temperature, rotation, 10 min). The microspheres were washed with 1 mL of 0.1M MES pH 5, unless stated otherwise 25 µg of the anti-Salmonella Ab (KPL or MyBiosource; see 2.1) was added to the microspheres, the volume was filled up to 1 mL and immobilization continued overnight at 4 °C and rotation. The anti-Salmonella microspheres were two times washed with 0.1M MES pH 5, once with the same buffer containing 1M NaCl, five times with 0.1M MES pH 5. To estimate the maximum binding efficiency of Ab on different microspheres with carboxyl terminal groups (see 2.2), 100 µg of huIgG Ab were immobilized on their surface (1 mg of each microspheres) using exactly the same protocol as in case of immobilization of the anti-Salmonella Ab. The binding efficiencies were determined indirectly using SDSPAGE with densitometry. Immobilized IgG was designated from difference of densities of IgG in the initial solution of huIgG used for immobilization, and the sum of IgG in the supernatant after immobilization, supernatant after washing with 0.1M MES buffer/ MES buffer with 1M NaCl. Binding efficiencies were expressed as the percentage of huIgG molecules immobilized on the beads´ surface vs. the initial amount of huIgG used for immobilization (i.e., 100 µg). 2.6. Batch Immunomagnetic Separation Prior using 0.5 mg of prepared anti-Salmonella microspheres (with KPL or MyBiosource Ab) or 20/100 µl of commercial Dynabeads® anti-Salmonella were three times washed with 1 mL of sterile PBS-T. Washed beads were gently mixed with 1 mL of PBS-T (unless stated otherwise) or milk spiked with Salmonella or the mixture of Salmonella + E. coli, 10 min incubation under rotation followed. After that bead-bacteria complexes were magnetically separated for 3 min and then washed twice with 1 mL of 132
PBS-T, resuspended in 100 µL of the same buffer and spread-plated on nutrient agar No. 2 (after IMS with Salmonella only) or Chromocult Coliform Agar (after IMS from mixed cultures of E. coli and Salmonella) (Merck, Darmstadt, Germany). Cultivation 18 – 24 h at 37° C and bacteria enumeration followed. 2.7. Microfluidic Immunomagnetic Separation The microfluidic IMS was performed exactly according to the literature (Pereiro et al., 2014; Viovy et al., 2014) except applied immunosorbent. Instead of the commercial Dynabeads anti-Salmonella, our Promag-KPL immunosorbent was utilized here. Briefly, 50 µg of prepared Promag-KPL immunosorbent was washed with PBS containing 1% w/v BSA and two times with PBS-T, and introduced to the main chamber of the chip. 50 µL of whole UHT milk artificially spiked with Salmonella of desired concentration was loaded to the inlet and made a pass through the fluidized Promag-KPL under the constant flow 1 µL/min. Washing of immunosorbent with 40 µL of PBS-T at a flow rate of 1.5 µL/min followed. Experiments were observed using a Nikon TI-E inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan). All unbound bacteria were collected in the tubing which was connected directly to the chip outlet and were spread-plated. This empty tubing was for the last time rinsed with 100 µL of PBS-T, and this washing fraction was also plated for bacteria enumeration. Beads-bacteria complexes were also washed away out from the chip and spreadplated. Cultivation on LB medium or Chromocult Coliform Agar (after IMS from mixed cultures of E. coli and Salmonella) for 18 – 24 h at 37° C and bacteria enumeration followed. 2.8 Capture efficiency (CE) calculations Capture efficiency (CE) was calculated using following equation: CE (%): Nc / N0 x 100 where Nc is an average total number of cells captured with the immunosorbent (CFU/mL) and N0 is an average total number of cells counted after plating of the initial cell suspension (CFU/mL). In case of experiments in microfluidic chip, N0 value was calculated as an average total number of cells recovered from the chip, i.e. the sum of the cells captured using immunosorbent and cells present in the effluents after immunocapturing and chip washing (i.e. non-captured cells). All average numbers of CFUs and standard deviations (SD) were calculated of at least triplicate.
133
3.
Results and Discussion Quality immunosorbent is a key prerequisite to performing successful IMS. The higher
CE is achieved with IMS, the lower limit of detection can be reached by subsequent end-detection technique. However the immunosorbents of desired specificity and parameters are not always commercially available, especially for immunocapturing of foodborne bacteria. The goal of this study was to develop an efficient magnetic immunosorbent for IMS of Salmonella Typhimurium from milk in PDMS microfluidic chip and compare it with the commercial immunosorbent (Dynabeads® anti-Salmonella), as far as we know one of only two immunosorbents which are available on the market. While there are numerous papers dealing with the development of different assays for immunodetection of bacteria in food, works describing the step-by-step development of the immunosorbent compatible with microfluidic systems still lack. Here we present a workflow which can serve as a guideline for the preparation of the immunosorbent for microfluidic isolation and
pre-concentration of any foodborne pathogen from milk.
3.1 Selection of Suitable Magnetic Microspheres In the beginning, it was necessary to specify criterions for the selection of suitable magnetic particles for microfluidic systems, as mentioned in section 1. The attention was paid on microspheres in the size range between 1 to 3 µm which is the size suitable for in vitro laboratory diagnostics (Basinska, 2005) and at the same time suitable for microfluidics (Fan et al., 1999). We preferred microspheres with the terminal carboxyl functional groups which are suitable for covalent biofunctionalization using the carbodiimide (EDC+sulfo-NHS) chemistry. Five different commercial microspheres from different suppliers were chosen and compared from the point of view of huIgG binding efficiencies (Table 1). Since the Ab are usually the most expensive component of the prepared immunosorbent, the binding capacity of microspheres was at first evaluated using model human IgG. Highest binding efficiencies were repeatedly achieved with Promag microspheres. Then their behaviour in microfluidic PDMS chip, i.e. their stability and very low aggregation or adsorption on the walls of channels was examined and found to be excellent (data not shown). Therefore, these particles were chosen for the biofunctionalization with the specific anti-Salmonella Ab.
134
Table 1: List of –COOH magnetic microspheres which were compared in this study. Binding efficiency was determined as a % of immobilized human IgG.
Magnetic Microspheres Dynabeads MyOne COOH Dynabeads M270 COOH SiMAG-Carboxyl micromer-M - PEG-COOH ProMag™ 1 Series COOH
Size (µm) 1 2.8 1 2 1
Binding Efficiency (% ) 43 55 34 17 82
3.2 Selection of the anti-Salmonella Antibodies High immunoreactivity between the anti-Salmonella antibodies and Salmonella Typhimurium was the most important parameter which was taken in account. Next, the purity and integrity of Ab together with the availability of Ab with the absence of any high-molecular weight stabilizing agents such as gelatin or albumin, which could interfere during immobilization, were also considered. Monoclonal Ab used for IMS bears the risk that the Ab´ specificity will be restricted to bacteria with the common antigenic epitopes which don´t have to be present for. ex. in old or stressed cultures (Cudjoe, 2014). Therefore, polyclonal Ab seem to be a better choice for the immunocapturing of bacteria. However, to the best of our knowledge they are commercially available only as a pool of purified IgG fraction, not as immunogen affinity purified Ab. When such Ab are used for particles´ biofunctionalization, specific as well as nonspecific Ab will naturally appear on the bead´s surface which can affect their CE. Here, four anti-Salmonella antibodies differing in its clonality, host animal, immunogens as well as manufacturer were chosen for this study (Table 2). In case of the monoclonal
antibodies,
specificity
against
the
core
oligosaccharide
region
of the lipopolysaccharide (LPS) was sought, since it is a relatively conserved structure. This should assure the Ab´ reactivity with a broad range of more than 2 500 serotypes of Salmonella which are currently known (Grimont and Weill, 2007). The quality (i. e. the purity and wholeness) of all four tested antibodies (summarized in Table 2) was evaluated using traditional SDS-PAGE (data not shown). Based on the results from electrophoresis, all tested Ab seemed to be pure, intact and non-aggregated.
135
Table 2: List of primary anti-Salmonella Ab selected for the evaluation of immunoreactivity with core lipopolysaccharide of Salmonella (LPS) and whole cells of Salmonella Typhimurium using dot blot.
Clonality polyclonal
monoclonal
ND…
Host Isotype Animal goat ND rabbit
ND
mouse
IgG2a
mouse IgG2a data not provided
Immunogen
Supplier
various strains of KPL Salmonella mixture of S. Enteritidis, S. Virostat Typhimurium, S. Heidelburg LPS core of Salmonella GenWay Biotech LPS core of Salmonella MyBiosource
The immunoreactivity between the anti-Salmonella Ab and Salmonella Typhimurium and respective controls (LPS, E. coli, and C. braakii) was assessed using whole-cell dot blot method. Scheme of the applied method is presented in Figure 1a. The results from this method are shown in Figure 1b. The immunoreactivity of both polyclonal Ab to Salmonella was comparable, but rabbit polyclonal antibodies from Virostat were found to be more cross-reactive with both C. braakii and E. coli than the goat antibodies from KPL. Surprising results were achieved with the tested monoclonal Ab. While the Ab from MyBisource proved to be excellent in terms of their reactivity to both LPS and Salmonella, the immunoreactivity of GenWay Ab was significantly reduced. Based on these results the monoclonal Ab from MyBiosource and polyclonal Ab from KPL were selected for immobilization on magnetic microspheres.
(a)
(b)
Figure 1: (a) Scheme of whole-cell dot blot applied for immunoreactivity evaluation between the anti-Salmonella Ab and Salmonella Typhimurium. (b) The integrated density of spots as a function of immunoreactivity of particular antibodies with corresponding antigens. Values are presented as mean ± standard deviations of three experiments.
136
3.3 Immunomagnetic Separation (IMS) in Batch Two different conjugation strategies were applied to immobilize both monoclonal MyBiosource and polyclonal KPL Ab on Promag microspheres. The first strategy was based on the carbodiimide coupling method with the use of sulfo-NHS which enables direct but random Ab immobilization, whereas the second method exploited Hydrazide-PEGHydrazide as a homobifunctional spacer through which are the Ab immobilized in a
site-directed orientation, as in details described here (Svobodova et al., 2014). Immobilization of the anti-Salmonella Ab was followed by IMS of Salmonella
in batch using the procedure adapted from recommendations from Dynal Thermo Fisher Scientific (see 2.6). The method applied for the enumeration of captured cells, i.e. the evaluation of quality of immunosorbent, was standard spread-plate and count method. Although this method was time consuming and the quantity of captured cells could be underestimated since more than one bacterium could bind to one bead it was selected as a convenient and cheap method providing reproducible results in our study. ELISA-based sandwich assay utilizing secondary anti-Salmonella Ab (polyclonal rabbit anti-SalmonellaAb-HRP from MyBiosource, dilution 1:500) was also tried for quantification of captured Salmonella cells but turned out to be insufficiently sensitive for low concentrations of cells (less than approx. 2 x 103 CFU/mL), data not shown. Monoclonal Ab from MyBiosource immobilized on Promag particles showed to be inappropriate for Salmonella immunocapturing at all; capture rate has never exceeded more than 3% (after IMS from both 102 and 103 CFU/mL). On the contrary after the aforementioned carbodiimide conjugation of KPL Ab on Promag microspheres the CE was very high (≥ 89.5±3.3 % after IMS from 102 CFU/mL; see Fig. 2). This experiment also served as an optimization of the quantity of Ab used for biofunctionalization of 1 mg of microspheres. It is evident that immobilization of 25 µg of Ab is sufficient, and that binding of higher amounts of Ab does not lead to any further dramatic increase in CE and is uneconomical (see Fig. 2). Moreover, too dense Ab´ concentration on the surface of the immunosorbent can lead to unwanted bead-bacteria aggregation (Cudjoe, 2014). For all remaining experiments, following conditions were kept: 25 µg of KPL Ab/mg of Promag microspheres, carbodiimide coupling. This immunosorbent is further denoted as PromagKPL.
137
Figure 2: Dependence of quantity of Ab (KPL) applied for biofunctionalization of 1 mg of Promag particles using the carbodiimide method on the number of captured cells of Salmonella expressed as a capture efficiency. IMS was performed from 102 CFU/mL, 1.93 x 102.Values are presented as mean±standard deviations of three experiments.
To compare the CE achieved with our developed Promag-KPL immunosorbent and with the commercial one, Dynabeads® anti-Salmonella, IMS in PBS-T buffer from 103 CFU/mL (1.76 x 103 CFU/mL) followed. When 100 µL of Dynabeads suspension was used for IMS and standard protocol suggested by Dynal was followed (see 2.6), CE of 30.0 ± 9.5% was achieved, while when 20 µL of the same suspension was applied, only 15.3 ± 3.8% captures were observed. These results were under our expectations since the authors typically demonstrated much higher capture efficiencies. Recently, (Zheng et al., 2014) achieved 39.5 ± 1.88 % CE after IMS from a pure culture with 20 µL of Dynabeads suspension and after 10 min of bead-bacteria incubation time. (Brandao et al., 2013) reported the capture efficiencies from 92 up to 100 %, depending on the initial concentration of Salmonella used for IMS. Then the effect of the increasing concentration of Salmonella applied for IMS using Promag-KPL on the CE was investigated (Figure 3). Following CE were achieved for particular concentrations of Salmonella (from 101 up to 105 CFU/mL): 69.2 ± 23.5 %, 86.2 ± 12.6 %, 63.2 ± 3.8 %, 64.9 ± 4.5 %, 69.3 ± 3.5 %. These results were in agreement with the literature (Najafi et al., 2014) where was also demonstrated that higher concentrations of bacteria are not a limiting factor significantly affecting CE. In parallel, the immunosorbent carrying huIgG was applied as a control carrier for monitoring the specificity of the immunocapturing. After IMS from 105 CFU/mL using such immunosorbent, only 1.0 ± 0.3 % CE was attained (see Fig. 3, note the log scale of the y-axis).
138
Figure 3: The effect of increasing concentration of Salmonella in 1 mL of suspension applied for IMS using Promag-KPL and Promag-huIgG immunosorbent, a control of nonspecific adhesion of Salmonella. Values are presented as mean±standard deviations of three experiments.
After these experiments, the CE of Promag-KPL was investigated under the excess of competing microbiota (E. coli) (see Fig. 4). Certain immunoreactivity with E. coli was expected since the Ab are polyclonal and may slightly crossreact with closely related bacteria, as also demonstrated by dot blot, Figure 2. In case of 1:1 ratio the nonspecific capture of E. coli using Promag-KPL was 5.1% and with the increasing surplus of E. coli the CE decreased down to 0.9%. The CE of Salmonella was slightly affected by the abundant microbiota only when 1:1 000 and 1:10 000 ratios of bacteria were applied for IMS. These results confirmed the high sensitivity of prepared immunosorbent and low nonspecific reactivity with non-target microbiota.
Figure 4: The effect of increasing concentration of competing microbiota (E. coli) on capture efficiency of Salmonella using Promag-KPL. Values are presented as mean±standard deviations of three experiments.
139
Finally after all these experiments the CE of Salmonella was evaluated in real food samples - milk differing in fat content and type of thermal treatment. Here we demonstrated that complex milk, i.e. emulsion of a colloid of butterfat globules and water with dissolved carbohydrates and proteins, does not affect the CE of Salmonella (Table 3). Apparently the abundant milk protein micelles and lipids did not cover the binding sites of Ab on Promag-KPL. No correlation was found between fat content in milk and CE of Salmonella. Fat present in milk can interfere with some detection techniques based on DNA analysis, such as real-time PCR (Le Drean et al., 2010; Riyaz-Ul-Hassan et al., 2013), so IMS doesn´t serve only as a tool for pre-concentration of target bacteria but also replaces sample preparation such as delipidation. Table 3: The effect of different fat content in milk spiked with Salmonella (103 CFU/mL) on the capture efficiency ± standard deviation (SD) from three experiments.
Type of milk UHT milk, skimmed UHT milk, semi-skimmed UHT milk, whole High-temperature pasteurized milk
Fat content (%) 0.5 1.5 3.5 1.5
Capture efficiency ± SD (%) 83.5 ± 4.1 70.1 ± 2.8 72.5 ± 1.0 91.3 ± 11.2
Immunomagnetic Separation (IMS) in Microfluidic Chip Then the IMS of Salmonella from spiked milk in microfluidic chip without any prior sample treatment followed. To do that, a newly developed and recently published magnetically stabilized fluidized bed was prepared (Pereiro et al., 2014; Viovy et al., 2014) (Fig 5a). This chip was inspired by large fluidized-bed reactors and is based on dynamic recirculation of magnetic microspheres which are in equilibrium due to the opposing magnetic and drag forces, leading to a high bed porosity and recirculation. The immunocapturing was carried out in a cone-shaped chamber specifically dimensioned for bacteria capture and possible following on-chip cultivation. Promag-KPL immunosorbent was during capture step homogenously spread across the chamber (see Fig. 5b) and recirculated. Even if high concentrations of Salmonella (e.g. 106 CFU/mL) were passed through the fluidized bed the immunosorbent did not aggregate as a result of captured bacteria, as can happen in batch (Cudjoe, 2014). The presence of milk did not significantly affect the particles´ behaviour; the globules of fat present in milk were visible under the microscope but did not cause any problems during the bacteria capturing.
140
(b)
(a)
Figure 5: (a) Macrophotography of microfluidic chip with Promag-KPL (50 µg), packed working mode; (b) Microphotography of the main chip chamber during Salmonella immunocapturing from whole milk using Promag-KPL (50 µg), fluidized working mode.
For the present study, the spread-plate and count method, as in the case of IMS in tubes, was applied to assess the CE in the microchip. Nevertheless, in-line IMS with the on chip-cultivation with the quantification by bed expansion which can be easily followed with a low-end camera was recently demonstrated in this chip (unpublished data, Viovy´ s group). Other detection techniques integrated with microfluidic immunocapture of bacteria were reported during the past few years, such as fluorescent dyes- (Mai et al., 2014; Verbarg et al., 2013) or quantum dots-based immunoassays (Kim et al., 2015; Wang et al., 2015), light scattering (Fronczek et al., 2013), surface-plasmon resonance (Tokel et al., 2015) or PCRbased techniques. For the further development of our microfluidic platform, the end-detection technique will be chosen with respect to short assay time, low limit of detection and compatibility with the IMS pre-concentration module. The CE of Salmonella using Promag-KPL immunosorbent in the chip was evaluated directly in milk. Similarly as in the case of batch IMS, the milk was spiked with the increasing concentration of Salmonella (from 101 up to 101 CFU/50 µL) and IMS followed (see Fig. 6a).
To evaluate the effect of small reaction volume and distinguish it from
the effect of microfluidics, parallel experiment under exactly same conditions (50 µg of immunosorbent in 50 µL of milk, capture time 50 min) was done in batch-wise arrangement, i.e. in tubes. It is evident from the results that the miniaturized format of the IMS (both in tubes and chip) significantly improved achieved CE compared to our standard protocol in batch (0.5 mg of immunosorbent in 1 mL of milk, capture time 10 min), Fig. 3. Microfluidic immunocapturing seems to work with higher efficiency for denser bacterial suspensions (104 and 105 CFU/50 µL), compared to IMS in tubes. Other advantages of microfluidic IMS making it preferable than batch are the possibility to automatize the protocol, to accurately dose the required sample volumes, control the flow rate and run the experiments under strictly reproducible conditions. 141
(b)
(a)
Figure 6: (a) The effect of the increasing concentration of Salmonella in milk on CE of Salmonella in microchip and tubes. 50 µg of Promag-KPL immunosorbent and volume of 50 µL was used for both types of IMS. Values are presented as mean±standard deviations of three experiments. (b) The capture efficiency of Salmonella achieved in a microfluidic chip using Promag-KPL immunosorbent from milk spiked with mixed culture of Salmonella and E. coli. Values are presented as mean±standard deviations of three experiments.
After that an aliquot of milk was artificially spiked with mixed culture of Salmonella and E. coli in two different ratios (1:1 and 1:100) to confirm the selectivity of Promag-KPL immunosorbent in microchip (Figure 6b). Both achieved CE were above our expectations; the surplus (100:1) of competing microbiota increased CE of Salmonella even up to 99.3 ± 0.5 %. The nonspecific capture of E. coli was negligible and reached only 2.1±0.8%. 4
Conclusion The present study deals with the development of efficient magnetic immunosorbent
for microfluidic immunocapturing and pre-concentration of the model milk-borne pathogen, namely
Salmonella
Typhimurium. The characteristics of developed
Promag-KPL
immunosorbent were investigated in detail in batchwise arrangement. After that the immunocapturing was also performed in magnetically stabilized fluidized bed. The immunosorbent showed to be stable and highly specific towards the cells of Salmonella; the nonspecific capture proved to be insignificant. It was demonstrated that the use of miniaturized format of the assay increases the CE of Salmonella which opens possibilities for
further
development
of
integrated
device
combining
magnetic
beads-based
immuno-pre-concentration of Salmonella followed by its detection.
142
Acknowledgement This work was supported by the European Union´s LOVE-FOOD project under Contract No. 317742. References Basinska, T., 2005. Hydrophilic core-shell microspheres: A suitable support for controlled attachment of proteins and biomedical diagnostics. Macromol. Biosci. 5, 1145-1168. Brandao, D., Liebana, S., Campoy, S., Cortes, P., Alegret, S., Pividori, M.I., 2013. Electrochemical magneto-immunosensing of Salmonella based on nano and micro-sized magnetic particles. 8th Ibero-American Congress on Sensors (Ibersensor 2012) 421, 012020. Cudjoe, K.S., 2014. Immunomagnetic particle-based techniques: overview, In C.A.B.L. Tortorello (Ed.), Encyclopedia of Food Microbiology (Second Edition). Academic Press, Oxford, pp. 351-357. Duodu, S., Mehmeti, I., Holst-Jensen, A., Loncarevic, S., 2009. Improved sample preparation for real-time pcr detection of listeria monocytogenes in hot-smoked salmon using filtering and immunomagnetic separation techniques. Food Anal. Meth. 2, 23-29. Fan, Z., Mangru, S., Granzow, R., Heaney, P., Ho, W., Dong, Q., Kumar, R., 1999. Dynamic DNA hybridization on a chip using paramagnetic beads. Anal. Chem. 71, 4851-4859. Favrin, S.J., Jassim, S.A., Griffiths, M.W., 2003. Application of a novel immunomagnetic separation–bacteriophage assay for the detection of Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7 in food. Int. J. Food Microbiol. 85, 63-71. Fisher, M., Atiya-Nasagi, Y., Simon, I., Gordin, M., Mechaly, A., Yitzhaki, S., 2009. A combined immunomagnetic separation and lateral flow method for a sensitive on-site detection of Bacillus anthracis spores - assessment in water and dairy products. Lett. Appl. Microbiol. 48, 413-418. Fronczek, C.F., You, D.J., Yoon, J., 2013. Single-pipetting microfluidic assay device for rapid detection of Salmonella from poultry package. Biosens. Bioelectron. 40, 342-349. Grimont, P., A.D., Weill, F., 2007. Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9th Edition. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, 1-167. Hagren, V., von Lode, P., Syrjälä, A., Korpimäki, T., Tuomola, M., Kauko, O., Nurmi, J., 2008. An 8-hour system for Salmonella detection with immunomagnetic separation and homogeneous time-resolved fluorescence PCR. Int. J. Food Microbiol. 125, 158-161. Kim, G., Moon, J., Moh, C., Lim, J., 2015. A microfluidic nano-biosensor for the detection of pathogenic Salmonella. Biosens. Bioelectron. 67, 243-247. Kucerova, J., Holubova, L., Jankovicova, B., Dvorakova, V., Motkova, P., Bilkova, Z., 2013. Quality evaluation of commercial anti-salmonella antibodies for immunomagnetic separation using whole-cell dot blot. Scientific Papers of the University of Pardubice, Series A, Faculty of Chemical Technology, 57-66. Le Drean, G., Mounier, J., Vasseur, V., Arzur, D., Habrylo, O., Barbier, G., 2010. Quantification of Penicillium camemberti and P. roqueforti mycelium by real-time PCR to assess their growth dynamics during ripening cheese. Int. J. Food Microbiol. 138, 100-107.
143
Liebana, S., Lermo, A., Campoy, S., Pilar Cortes, M., Alegret, S., Isabel Pividori, M., 2009. Rapid detection of Salmonella in milk by electrochemical magneto-immunosensing. Biosens. Bioelectron. 25, 510-513. Mai, J., Abhyankar, V.V., Piccini, M.E., Olano, J.P., Willson, R., Hatch, A.V., 2014. Rapid detection of trace bacteria in biofluids using porous monoliths in microchannels. Biosens. Bioelectron. 54, 435-441. Metzger-Boddien, C., Khaschabi, D., Schoenbauer, M., Boddien, S., Schlederer, T., Kehle, J., 2006. Automated high-throughput immunomagnetic separation-PCR for detection of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in bovine milk. Int. J. Food Microbiol. 110, 201-208. Mine, Y., 1997. Separation of Salmonella enteritidis from experimentally contaminated liquid eggs using a hen IgY immobilized immunomagnetic separation system. J. Agric. Food Chem. 45, 3723-3727. Najafi, R., Mukherjee, S., Hudson Jr., J., Sharma, A., Banerjee, P., 2014. Development of a rapid capture-cum-detection method for Escherichia coli O157 from apple juice comprising nano-immunomagnetic separation in tandem with surface enhanced Raman scattering. Int. J. Food Microbiol. 189, 89-97. Newell, D.G., Koopmans, M., Verhoef, L., Duizer, E., Aidara-Kane, A., Sprong, H., Opsteegh, M., Langelaar, M., Threfall, J., Scheutz, F., van der Giessen, J., Kruse, H., 2010. Food-borne diseases - The challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge. Int. J. Food Microbiol. 139, S3-S15. Olsvik, O., Popovic, T., SkjerveE, E., Cudjoe, K., Hornes, E., Ugelstad, J., Uhlen, M., 1994. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 7, 43-54. Pereiro, I., Kucerova, J., Alexandre, L., Dupuy, B., Bilkova, Z., Viovy, J., Malaquin, L., Descroix, S., 2014. Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria extraction, growth and detection. In: Proceedings of the 18th International conference on miniaturized systems for chemistry and life sciences, MicroTAS 2014. Perez, F., Mascini, M., Tothill, I., Turner, A., 1998. Immunomagnetic separation with mediated flow injection analysis amperometric detection of viable Escherichia coli O157. Anal. Chem. 70, 2380-2386. Rijpens, N., Herman, L., Vereccken, F., Jannes, G., De Smedt, J., De Zutter, L., 1999. Rapid detection of stressed Salmonella spp. in dairy and egg products using immunomagnetic separation and PCR. Int. J. Food Microbiol. 46, 37-44. Riyaz-Ul-Hassan, S., Verma, V., Qazi, G.N., 2013. Real-time PCR-based rapid and cultureindependent detection of Salmonella in dairy milk addressing some core issues. Lett. Appl. Microbiol. 56, 275-282. Safarik, I., Safarikova, M., 1999. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B 722, 33-53. Safarik, I., Safarikova, M., 2004. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. BioMagnetic Res. and Tech. 2, 7. Svobodova, Z., Jankovicova, B., Horak, D., Bilkova, Z., 2013. Dot-ELISA Affinity Test: An easy, low-cost method to estimate binding activity of monoclonal antibodies. J. Anal Bioanal Tech 4 (3), 168.
144
Svobodova, Z., Kucerova, J., Autebert, J., Horak, D., Bruckova, L., Viovy, J., Bilkova, Z., 2014. Application of an improved magnetic immunosorbent in an Ephesia chip designed for circulating tumor cell capture. Electrophoresis 35, 323-329. Tokel, O., Yildiz, U.H., Inci, F., Durmus, N.G., Ekiz, O.O., Turker, B., Cetin, C., Rao, S., Sridhar, K., Natarajan, N., Shafiee, H., Dana, A., Demirci, U., 2015. Portable microfluidic integrated plasmonic platform for pathogen detection. Sci Rep 5, 9152. Verbarg, J., Plath, W.D., Shriver-Lake, L.C., Howell, P.B., Jr., Erickson, J.S., Golden, J.P., Ligler, F.S., 2013. Catch and release: integrated system for multiplexed detection of bacteria. Anal. Chem. 85, 4944-4950. Viovy, J., Tabnaoui, S., Malaquin, L., Descroix, S., 2014. Systeme microfluidique presentant un lit de particules magnetiques. Patent WO2014037674 A1. 13.3.2014. PCT/FR2013/052057. Wang, R., Ni, Y., Xu, Y., Jiang, Y., Dong, C., Chuan, N., 2015. Immuno-capture and in situ detection of Salmonella typhimurium on a novel microfluidic chip. Anal. Chim. Acta 853, 710-717. Wang, Z., Cai, R., Yuan, Y., Niu, C., Hu, Z., Yue, T., 2014. An immunomagnetic separationreal-time PCR system for the detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit products. Int. J. Food Microbiol. 175, 30-35. Wang, Z., Yue, T., Yuan, Y., Cai, R., Niu, C., Guo, C., 2013. Development and evaluation of an immunomagnetic separation-ELISA for the detection of Alicyclobacillus spp. in apple juice. Int. J. Food Microbiol. 166, 28-33. Zhang, C., Wang, H., Xing, D., 2011. Multichannel oscillatory-flow multiplex PCR microfluidics for high-throughput and fast detection of foodborne bacterial pathogens. Biomed. Microdevices 13, 885-897. Zheng, Q., Mikš-Krajnik, M., Yang, Y., Xu, W., Yuk, H., 2014. Real-time PCR method combined with immunomagnetic separation for detecting healthy and heat-injured Salmonella Typhimurium on raw duck wings. Int. J. Food Microbiol. 186, 6-13.
145
6 ZÁVĚR Předložená disertační práce se zabývá vývojem bioafinitních a enzymaticky aktivních nosičových systémů pro afinitní separace nebo biokatalýzu. Vývoj a příprava jednotlivých nosičů se odvíjely od cílových aplikací, pro které byly určeny. V rámci
biofunkcionalizace
magnetických
částic
enzymem
trypsinem
byla
optimalizována metoda vazby trypsinu a následně byly připraveny dva typy proteolyticky aktivních magnetických nosičů, označovaných jako Tryp-PGMA-COOH a Tryp-PHEMACOOH. Trypsin imobilizovaný na nosičích vykazoval vysokou enzymovou aktivitu při reakci s nízkomolekulárním substrátem BApNA, dosahující 1 021-1 418 IU/mg Tryp-PGMA-COOH a Tryp-PHEMA-COOH. U obou nosičů byla rovněž prokázána vysoká skladovací stabilita, po 7 týdnech skladování ve vodném pufru si oba nosiče zachovaly více než 70% aktivitu vůči hodnotám aktivity naměřenými po imobilizaci. Při sledování operační stability nosičů bylo lepších výsledků dosaženo v případě Tryp-PHEMA-COOH, při pátém stanovení aktivity trypsinu v rámci jednoho dne si nosič zachoval 60% aktivitu ve srovnání s aktivitou naměřenou v prvním stanovení. Dále byly na magnetické částice vázány modelové protilátky třídy IgG. Všechny získané výsledky potvrdily vhodnost nově připravených částic pro vazbu biologicky aktivních látek a jejich využití pro účely bioafinitních separací a biokatalýzy. Další část práce se věnovala možnostem vazby trypsinu na chitosanová nanovlákna s cílem připravit bioaktivní vrstvu pro vývoj nových krytů ran. Nanovlákna byla připravená elektrospinningem pomocí technologie Nanospider®. Po důkladných optimalizacích metody vazby bylo dosaženo aktivity imobilizovaného trypsinu odpovídající 210 IU/cm2, tj. 874 IU/mg příslušných nanovláken. Po jejich čtyřtýdenním skladování ve vysušeném stavu byla naměřená aktivita trypsinu vyšší než bezprostředně po imobilizaci, po skladování v hydratované formě dosahovala aktivita 91 %. Při předběžných testech cytotoxicity nanovláken s imobilizovaným trypsinem nebyly shledány žádné známky toxicity. Všechny tyto
výsledky
podpořily
vhodnost
chitosanových
nanovláken
pro
enzymatickou
biofunkcionalizaci a aplikaci na poli hojení ran. Před přípravou specifického imunosorbentu pro mikrofluidní záchyt cirkulujících nádorových buněk bylo nutné magnetické částice polymerně modifikovat polymerem PEG. Toho bylo dosaženo pomocí konjugační reakce založené na karbodiimidu EDC ve vodném prostředí. Přítomnost PEGu na částicích byla následně ověřena pomocí několika technik: měřením zeta potenciálu částic před a po modifikaci, dále SEM mikroskopií částic 146
s následnou
analýzou
obrazu,
infračervenou
spektroskopií,
sandwichovou
metodou
využívající afinitních interakcí avidin-biotin (imobilizace biotinylovaného PEGu a jeho průkaz konjugátem streptavidin-HRP), a v neposlední řadě pomocí komerční anti-PEG ELISA metody. Z výsledků vyplynulo, že se PEGylací částic zvýšil jejich průměr o cca 100 nm, naznačující přítomnost 50-nm vrstvy PEGu na částicích. Dále byl hodnocen rozdíl v nespecifické adsorpci modelového proteinu albuminu a eukaryotických buněk na holé a modifikované částice. V případě sledování adsorpce albuminu došlo k 45% snížení míry nespecifické adsorpce u částic po PEGylaci, v případě buněk dokonce k 74% úbytku nespecificky navázaných buněk. Závěrem bylo chování holých a modifikovaných částic porovnáno v mikrofluidních systémech z PDMS a COC polymerů. V obou čipech byly zjištěny výhodnější vlastnosti částic po jejich modifikaci polymerem PEG, jelikož klesla míra adheze částic na stěny kanálků. Tím byla ověřena jejich vhodnost pro separace z komplexního biologického materiálu a zároveň pro mikrofluidní použití. Magnetické mikročástice byly povrchově modifikovány polymerem PEG nesoucícím vhodné terminální skupiny (Hydrazid-PEG-Hydrazid) pro následnou orientovanaou vazbu anti-EpCAM protilátek. Tyto částice poté sloužily jako výchozí stacionární fáze pro následnou biofunkcionalizaci specifickými protilátkami pro mikrofluidní záchyt cirkulujících
nádorových
buněk
exprimujících
povrchový
glykoprotein
EpCAM.
Po imobilizaci protilátek byla sledována účinnost záchytu EpCAM-pozitivních buněk ve vsádkovém uspořádání. Připravený nosič nesoucí anti-EpCAM protilátky, označený jako anti-EpCAM-PEG-PGMA,
specificky
interagoval
s EpCAM-pozitivními
buňkami,
na příslušný alikvot částic bylo zachyceno v průměru 331 buněk. Naproti tomu na PEGylovaný nosič bez protilátek se nespecificky adsorbovalo pouze 10 buněk. Anti-EpCAMPEG-PGMA nosič byl rovněž porovnáván z pohledu účinnosti záchytu s komerčně dostupnými částicemi Dynabeads Epithelial Enrich firmy Thermo Fisher Scientific; pomocí obou nosičů bylo dosaženo srovnatelných výsledků. V závěru byl připravený immunosorbent vložen do mikrofluidního Ephesia čipu, ve kterém byl prokázán 65% specifický záchyt EpCAM-pozitivních buněk, míra nespecifické adsorpce činila pouze 1,2 %. Poslední část práce byla zaměřena na vývoj specifického imunosorbentu pro mikrofluidní záchyt potencionálně patogenních bakterií z mléka. Jako modelový analyt byla vybrána bakterie Salmonella Typhimurium. V rámci vývoje nosiče byly důkladně vybrány nejen příslušné magnetické částice, ale i komerčně dostupné anti-Salmonella protilátky. Účinnost záchytu připraveného imunosorbentu, označovaného jako Promag-KPL, byla poté testována 147
ve vsádkovém uspořádání. V závislosti na koncentraci bakterií v modelovém pufru (101 – 105 CFU/ml) bylo dosaženo účinnosti záchytu od 69,2 do 86,2 %. Nosič Promag-KPL byl rovněž vysoce selektivní. Po optimalizaci imunomagnetického záchytu ve vsádkovém uspořádání a v prostředí modelového pufru bylo přikročeno k záchytu z mléka a k přizpůsobení techniky do mikrofluidního systému, magneticky stabilizovaného fluidního lože. V čipovém uspořádání bylo dosaženo pomocí Promag-KPL nosiče záchytu až 99,3±0,5 %, účinnosti záchytů byly reprodukovatelné. Nosič vyvinutý v rámci disertační práce tak splnil veškeré požadavky, které byly na jeho vlastnosti kladené, a je tak připravený na následnou integraci do zařízení, na jehož komercionalizaci se bude dále pokračovat. Uvedené cíle práce tak byly splněny, připravené nosiče se osvědčily pro uvedené cílové aplikace a dosažené výsledky již byly nebo v nejlibžší době budou publikovány formou recenzovaných odborných článků.
148
7 PŘEHLED PUBLIKAČNÍCH VÝSTUPŮ Původní vědecké práce v časopisech s IF, dle WoS zařazeny do kategorie „Article”: Článek I: HORÁK D., KUČEROVÁ J., KORECKÁ L., JANKOVIČOVÁ B., PALARČÍK J., MIKULÁŠEK P. a BÍLKOVÁ Z.: New monodisperse magnetic polymer microspheres biofunctionalized for enzyme catalysis and bioaffinity separations. Macromol. Biosci., 2012, 12, 647-655. IF (2012) 3,742. Článek II: KUČEROVÁ J., SVOBODOVÁ Z., KNOTEK P., PALARČÍK J., VLČEK M., KINCL M., HORÁK D., AUTEBERT J., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: PEGylation of magnetic poly(glycidyl methacrylate) microparticles for microfluidic bioassays. Mater. Sci. Eng. C-Mater. Biol. Appl. C, 2014, 40, 308–315. IF (2014) 3,088. Článek III: SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., AUTEBERT J., HORÁK D., BRŮČKOVÁ L., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: Application of an improved magnetic immunosorbent in an Ephesia chip designed for circulating tumor cell capture. Electrophoresis, 2014, 35, 323-329. IF (2014) 3,028. Rukopis (manuskript) I: SRBOVÁ J., SLOVÁKOVÁ M., KŘÍPALOVÁ Z., ŽÁRSKÁ M., ŠPAČKOVÁ M., STRÁNSKÁ D. a BÍLKOVÁ Z.: Covalent biofunctionalization of chitosan nanofibers with proteolytic enzyme for wound healing. Odesláno k recenznímu řízení 1.7.2015 do J. Biomed. Mater. Res. Part B. IF (2014) 2,759. Rukopis (manuskript) II: PEREIRO I., TABNANOUI S., BENDALI A., SRBOVÁ J., BÍLKOVÁ Z., DUPUY B., DESCROIX S.: Microfluidic fluidized bed: a new microfluidic module for bacteria detection. Připravováno pro odeslání v listopadu 2015 do Nat. Commun. IF (2014) 11,470. Rukopis (manuskript) III: SRBOVÁ J., KRULIŠOVÁ P., HOLUBOVÁ L., PEREIRO I., BENDALI A., DESCROIX S., VIOVY J-L a BÍLKOVÁ Z.: Development of the specific immunosorbent for microfluidic capturing and pre-concentration of milkborn pathogens. Připraveno k odeslání do Int. J. Food Microbiol. IF (2014) 3,082. Původní práce v recenzovaných sbornících, dle WoS zařazeno do kategorie „Proceedings Paper”: SVOBODOVÁ Z., JANKOVIČOVÁ B., KUČEROVÁ J. a BÍLKOVÁ Z.: Magnetic beadsbased immunocapture of clinical biomarkers in microfluidic devices: from peptides to whole cells. In Sborník CECE 2014: 11th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis, 2014, ISBN 978-80-904959-2-0, Brno, ČR: Institute of Analytical Chemistry AS CR, s. 7780. PEREIRO I., KUČEROVÁ J., ALEXANDRE L., DUPUY B., BÍLKOVÁ Z., VIOVY J-L, MALAQUIN L. a DESCROIX S.: Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria extraction, growth and detection. In Proceedings of the 18th International Conference on
149
Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences 2014, MicroTAS, 2014, ISBN 978-0-979806426-30-7-6, San Antonio, Texas, USA, s. 437-439. Patenty: STRÁNSKÁ D., SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J. a BÍLKOVÁ Z.: Prostředek pro aplikaci proteolytických enzymů na ránu a prostředek ke krytí ran. Národní užitný vzor č. 26861. Číslo přihlášky 2012-27049, Datum zápisu užitného vzoru: 28.4.2014. Aplikované výsledky, funkční vzorek: STRÁNSKÁ D., SLOVÁKOVÁ M. a KUČEROVÁ J.: Chitosan s imobilizovaným trypsinem pro kryty ran. 2013. Funkční vzorek. Obor FR - Farmakologie a lékárnická chemie. Vlastník Elmarco s.r.o. Abstrakty v časopisech s IF: KRULIŠOVÁ P., JANKOVIČOVÁ B., KUČEROVÁ J. a BÍLKOVÁ Z.: Optimization of magnetic bead enzyme-linked immunosorbent assay for detection of specific antibodies against Amyloid beta representing biomarkers of Alzheimer's disease. Meeting Abstract: International congress on amino acids, peptides and proteins 2013, 2013, ISSN 0939-4451, Vídeň, Rakousko: Springer, s. 585. Články v časopisech ze seznamu recenzovaných neimpaktovaných periodik platných pro ČR: KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L., JANKOVIČOVÁ B., DVOŘÁKOVÁ V., MOŤKOVÁ P. a BÍLKOVÁ Z.: Quality evaluation of commercial anti-Salmonella antibodies for immunomagnetic separation using whole-cell dot blot. Scientific Papers of the University of Pardubice, Series A, Faculty of Chemical Technology, 2013, ISSN 1211-5541, Pardubice, ČR: Univerzita Pardubice, s. 57-66. Původní práce ve sbornících s ISBN: KUČEROVÁ J., PALARČÍK J. a BÍLKOVÁ Z.: Sledování koloidální stability superparamagnetických částic pro biomedicínu. In Sborník příspěvků 15. ročníku konference o speciálních anorganických pigmentech a práškových materiálech KSAP-PM 2013, 2013, ISBN 978-80-7395-604-2, Pardubice, ČR: Univerzita Pardubice, s. 84-87. PALARČÍK J. a KUČEROVÁ J.: Měření velikosti částic se superparamagnetickým obsahem metodou dynamického rozptylu světla. In Sborník příspěvků 15. ročníku konference o speciálních anorganických pigmentech a práškových materiálech KSAP-PM 2013, 2013, ISBN 978-80-7395-604-2, Pardubice, ČR: Univerzita Pardubice, s. 102-204. Příspěvky prezentované na mezinárodních vědeckých konferencích (přednášky): KUČEROVÁ J., SLOVÁKOVÁ M., BÍLKOVÁ Z., JUKLÍČKOVÁ M., KLABANOVÁ A. a STRÁNSKÁ D.: Enzyme-biofunctionalized nanofibers as a new material for wound treatment. EWMA 2011, 25. – 27. 5. 2011, Brusel, Belgie. Abstrakt ve sborníku EWMA 150
Journal Supplement, Vol. 11, No 2, 2011, ISSN 1609-2759, Frederiksberg, Holandsko: EWMA, s. 66. KUČEROVÁ J., SVOBODOVÁ Z. a BÍLKOVÁ Z.: Biofunctionalization of magnetic particles: theory and practice. Přednáška na meetingu evropského projektu CAMINEMS, č. 228980, 7. Rámcový program EU. 30. -31. 1. 2012, Mnichov, Německo. KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L. a BÍLKOVÁ Z.: Biofunctionalization of magnetic particles: theory and practice. Přednáška na meetingu evropského projektu CAMINEMS, č. 228980, 7. Rámcový program EU. 28. 2. - 1. 3. 2013, Paříž, Francie. KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L. a BÍLKOVÁ Z.: Quality evaluation of commercial antiSalmonella antibodies for immunomagnetic separation of Salmonella. Přednáška na meetingu evropského projektu LOVE-FOOD č. 317742, 7. Rámcový program EU. 5. - 6. 9. 2013, Athény, Řecko. KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L. a BÍLKOVÁ Z.: Development of the specific antiSalmonella immunosorbent for on-chip immunoextraction of bacteria. Přednáška na meetingu evropského projektu LOVE-FOOD č. 317742, 7. Rámcový program EU. 28. 2. – 1. 3. 2014, Freiburg, Německo. SRBOVÁ J., HOLUBOVÁ L., KRULIŠOVÁ P. a BÍLKOVÁ Z.: Methods for magnetic beads-based DNA purification. Přednáška na meetingu evropského projektu LOVE-FOOD č. 317742, 7. Rámcový program EU. 1. – 2. 9. 2014, Pardubice, Česká republika. SRBOVÁ J., KRULIŠOVÁ P. a BÍLKOVÁ Z.: Advances in immunomagnetic separation of Salmonella Typhimurium and Bacillus cereus. Přednáška na meetingu evropského projektu LOVE-FOOD č. 317742, 7. Rámcový program EU. 2. - 3. 3.2015, Paříž, Francie. Příspěvky prezentované na národních vědeckých konferencích (přednášky): SRBOVÁ J., HOLUBOVÁ L., KRULIŠOVÁ P. a BÍLKOVÁ Z.: Vývoj magnetického imunosorbentu pro průkaz Salmonella Typhimurium pro mikrofluidní aplikace. XXIV. Tomáškovy dny mladých mikrobiologů, 5. - 6. 6. 2015, Brno, Česká republika. Sborník ISBN 978-80-210-7851-2, Brno, ČR: Masarykova univerzita, s. 19. Příspěvky prezentované na mezinárodních vědeckých konferencích (plakátová sdělení): SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J., JUKLÍČKOVÁ M., STRÁNSKÁ D., KORECKÁ L., HOLUBOVÁ L., BÍLKOVÁ Z. a VLČEK M.: Fabrication and enzymatic biofunctionalization of nanofibers as a new material for wound dressings. Poster prezentovaný na International Conference on Antimicrobial Research, 3. - 5. 11. 2010, Valladolid, Španělsko. Abstrakt ve sborníku ICAR 2010 Book of Abstracts bez ISBN, s. 231 BÍLKOVÁ Z., SVOBODOVÁ Z., ESSLEMANN H., JANKOVIČOVÁ B. a KUČEROVÁ J.: Biofunctionalized magnetic microparticles for efficient biomarkers capturing adapted for magnetic force-based microfluidic device. Poster prezentovaný na 25th International Symposium on Microscale Bioseparations MSB 2010, 21. – 25. 3. 2010, Praha, ČR. Abstrakt 151
ve sborníku MSB 2010, ISBN 978-80-254-6631-5, Brno, ČR: Institute of Analytical Chemistry AS CR, s. 63. SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J., JUKLÍČKOVÁ M., STRÁNSKÁ D. a BÍLKOVÁ Z.: Enzymatically-modified nanofibers for biomedical applications. Poster prezentovaný na 2nd International Conference NANOCON 2010, 12. - 14. 10. 2010, Olomouc, ČR. Abstrakt ve sborníku NANOCON 2010 Conference proceedings, ISBN 978-80-87294-18-5, Ostrava, ČR: Tanger Ltd., s. 91. SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., NOVOTNÁ E., PLICHTA Z., HORÁK D. a BÍLKOVÁ Z.: First steps in preparation of magnetic immunosorbent for CTC isolation and characterisation. Poster prezentovaný v rámci CECHTUMA 2010 – X. International conference on tumor markers, 16. - 18. 5. 2010, Mikulov, ČR. Abstrakt ve sborníku XXXI. Imunoanalytické dny, ISBN 978-80-7399-953-7, Brno, ČR: CECHTUMA, s. 169. SVOBODOVÁ Z., HORÁK D., KRÁLOVEC K., KUČEROVÁ J., AUTEBERT J., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: Circulating tumour cell capturing by efficient magnetic immunosorbent, 19th Biennial meeting of the international society for molecular recognition: Affinity, 16. – 19. 6. 2011, Tavira, Portugalsko. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN. SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., HORÁK D., AUTEBERT J., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: Development of magnetic immunosorbent for circulating tumour cells immunocapture in microfluidic device. Bubble Tech to Bio App - "LAB-ON-A-CHIP", 2nd Korea - EU Workshop on microfluidic technology for chemical, biological and medical applications, 17. – 18. 10. 2011, Saarbrucken, Německo. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN. KUČEROVÁ J., SVOBODOVÁ Z., HORÁK D., AUTEBERT J., PALARČÍK J., BÍLKOVÁ Z. a VIOVY J.-L.: PEGylation as a tool for enhancing the quality of magnetic immunosorbents used in microfluidic devices. 9th International conference on the scientific and clinical applications of magnetic carriers, 22. - 26. 5. 2012, Minneapolis, Minnesota, USA. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN. SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L., HORÁK D., AUTEBERT J., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: Magnetic poly(glycidyl methacrylate) particles with various coatings for on-chip immunocapture of rare cells for diagnosis of cancer relapse. NanoBioTech Montreux 2012, 12. – 14. 11. 2012, Montreux, Švýcarsko. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN. KUČEROVÁ J., DUPUY B., PAPADAKIS G., KORDAS A., HOLUBOVÁ L., GIZELI E. a BÍLKOVÁ Z.: Magnetic beads-based DNA extraction: different techniques compatible with PCR and microfluidic systems. International conference on the scientific and clinical applications of magnetic carriers, 10. -14. 6. 2014, Drážďany, Německo. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN.
152
