UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE
BIOLOGICKÁ AKTIVITA OBSAHOVÝCH LÁTEK ROSTLIN XXIII. ALKALOIDY CORYDALIS CAVA (L.) SCHWEIGG. ET KOERTE A JEJICH ÚČINEK NA ACETYLCHOLINESTERASU A BUTYRYLCHOLINESTERASU
(diplomová práce)
Vedoucí diplomové práce:
Prof. RNDr. Lubomír Opletal, CSc.
Vedoucí katedry:
Prof. RNDr. Luděk Jahodář, CSc.
Hradec Králové, 2013
Bc. Blanka Kaluzsná
CHARLES UNIVERSITY IN PRAGUE FACULTY OF PHARMACY IN HRADEC KRÁLOVÉ DEPARTMENT OF PHARMACEUTICAL BOTANY AND ECOLOGY
BIOLOGICAL ACTIVITY OF PLANT METABOLITES XXIII. ALKALOIDS OF CORYDALIS CAVA (L.) SCHWEIGG. & KÖRTE AND THEIR EFFECT ON ACETYLCHOLINESTERASE AND BUTYRYLCHOLINESTERASE
(diploma thesis)
Supervisor:
Prof. RNDr. Lubomír Opletal, CSc.
Head of department:
Prof. RNDr. Luděk Jahodář, CSc.
Hradec Králové, 2013
Bc. Blanka Kaluzsná
Poděkování: Touto cestou chci poděkovat Prof. RNDr. Lubomíru Opletalovi, CSc. za jeho odborné vedení, vstřícnost, trpělivost a pomoc při vypracování této diplomové práce. Zároveň chci poděkovat Mgr. Nině Benešové, Mgr. Anně Hošťálkové a PharmDr. Jakubovi Chlebkovi, Ph.D. za vytvoření příjemného pracovního kolektivu, za jejich nápady a praktické připomínky při zpracovávání praktické části této diplomové práce. Dále děkuji Ing. Lucii Cáhlíkové, Ph.D. a Ing. Miroslavu Ločárkovi za změření a interpretaci hmotnostních spekter a Mgr. Zdeňku Novákovi za interpretaci NMR spekter.
Prohlášení: Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Tato práce byla finančně podpořena granty SVV 267 002, FRVŠ 664/2011 a FRVŠ 190/2012.
V Hradci Králové dne Bc. Blanka Kaluzsná
Obsah OBSAH.................................................................................................................................. - 1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK .................................................................................. - 5 1. ÚVOD ............................................................................................................................... - 7 1.
CÍL PRÁCE ................................................................................................................. - 8 -
TEORETICKÁ ČÁST .......................................................................................................... - 9 3. ALZHEIMEROVA CHOROBA ..................................................................................... - 9 3.1 Klinický obraz ............................................................................................................................ - 9 3.2 Etiologie .................................................................................................................................... - 9 3.2.1. Makroskopické změny mozku u AD ........................................................................................ - 9 3.2.2. Mikroskopické změny mozku u AD ....................................................................................... - 10 3.2.2.1. Senilní plaky .................................................................................................................. - 10 3.2.2.2. Neurofibrilární klubka (NFTs) ........................................................................................ - 11 3.2.3. Změny v metabolismu proteinů asociovaných s AD a další patofyziologické děje podílející se na rozvoji AD ........................................................................................................................................ - 11 3.2.3.1. β-amyloid (Aβ)............................................................................................................... - 11 3.2.3.2.Τ-protein ........................................................................................................................ - 12 3.2.3.3. Oxidační stres ................................................................................................................ - 13 3.2.3.4. Zánět ............................................................................................................................. - 14 3.2.3.5. Metabolismus cholesterolu........................................................................................... - 14 3.3. Cholinesterasy ve spojitosti s AD ............................................................................................ - 15 3.3.1. Funkce acetylcholinu v lidském organismu........................................................................... - 15 3.3.2. Acetylcholinesterasa a butyrylcholinesterasa....................................................................... - 16 3.4. Léčba Alzheimerovy choroby .................................................................................................. - 17 3.4.1. Inhibitory cholinesteras ........................................................................................................ - 17 3.4.1.1. Donepezil ...................................................................................................................... - 17 3.4.1.2. Rivastigmin .................................................................................................................... - 17 -
3.4.1.3. Galanthamin .................................................................................................................. - 18 3.4.2. Inhibitory NMDA receptorů glutamatergního systému ........................................................ - 18 3.4.2.1. Memantin ...................................................................................................................... - 18 3.4.3. Nové perspektivy léčby AD přírodními látkami a jejich deriváty. ......................................... - 19 3.4.3.1. Huperzin A ..................................................................................................................... - 20 3.4.3.2. Hupriny .......................................................................................................................... - 20 -
4. CORYDALIS CAVA (L.) SCHWEIGG. & KOERTE (FUMARIACEAE) .............. - 21 4.1. Taxonomické zařazení ............................................................................................................ - 21 4.2. Botanická charakteristika rostliny .......................................................................................... - 21 4.2.1. Morfologický popis rostliny .................................................................................................. - 22 4.2.2. Stanoviště.............................................................................................................................. - 22 4.3. Obsahové látky ....................................................................................................................... - 22 4.3.1. Isochinolinové alkaloidy Corydalis cava ................................................................................ - 22 4.3.2. Biologická aktivita obsahových látek .................................................................................... - 23 4.3.3. Struktura obsahových látek .................................................................................................. - 29 -
5. METODY STANOVENÍ CHOLINESTERASOVÉ INHIBICE ................................ - 33 5.1. Metody založené na spektrofotometrické detekci .................................................................. - 33 5.2. Metody založené na fluorimetrické detekci ............................................................................ - 34 5.3. Metody založené na hmotnostní spektrometrii ...................................................................... - 34 -
6. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ........................................................................................ - 35 6.1. Obecné postupy ..................................................................................................................... - 35 6.1.1 Příprava a čištění rozpouštědel .............................................................................................. - 35 6.1.2. Odpařování extraktů a frakcí, jejich sušení a skladování ...................................................... - 35 6.1.3. Rostlinný materiál ................................................................................................................. - 35 6.1.4. Tenkovrstvá chromatografie ................................................................................................. - 35 6.1.5. Detekce alkaloidů po TLC ...................................................................................................... - 35 6.1.6. Příprava sloupcové chromatografie se silikagelem ............................................................... - 35 6.1.7. Příprava litých vrstev pro preparativní TLC ........................................................................... - 36 6.1.8. Příprava alkaloidních koncentrátů pro izolaci ....................................................................... - 36 -
6.2. Materiál .................................................................................................................................. - 36 6.2.1. Chemikálie............................................................................................................................. - 36 6.2.2. Rozpouštědla ........................................................................................................................ - 37 6.2.3. Pufry ...................................................................................................................................... - 37 6.2.3.1. 5mM Fosfátový pufr pH 7,4 .......................................................................................... - 37 6.2.3.2. 5mM Fosfátový pufr pH 7,4 obsahující 150 mM NaCl .................................................. - 38 6.2.3.3. 100mM Fosfátový pufr, pH 7,4 ..................................................................................... - 38 6.2.5. Chromatografické adsorbenty .............................................................................................. - 38 6.2.6. Vyvíjecí soustavy pro tenkovrstvou chromatografii (TLC)..................................................... - 38 6.2.7. Pomocné materiály, roztoky a činidla ................................................................................... - 39 6.2.8. Přístroje a software ............................................................................................................... - 39 6.3 Izolace alkaloidů ...................................................................................................................... - 40 6.3.1 Screening cholinesterasové inhibiční aktivity alkaloidů dymnivky duté: bio-guided assay využívající Ellmanovu metodu......................................................................................................... - 40 6.3.1.1 Příprava sumárního alkaloidního extraktu pro screening .............................................. - 40 6.3.1.2 Cholinesterasová aktivita sumárního alkaloidního extraktu .......................................... - 40 6.3.2 Izolace isochinolinových alkaloidů pro biologické testy ........................................................ - 41 6.3.2.1 Příprava alkaloidních koncentrátů ................................................................................. - 41 6.3.2.2 Separace alkaloidního výtřepku A na chromatografickém sloupci ................................ - 42 6.3.2.3. Izolace alkaloidů z matečného louhu podfrakce B/2 (vlastní práce) ............................. - 42 6.4. Stanovení inhibiční aktivity alkaloidů vůči acetylcholinesterase a butyrylcholinesterase ....... - 44 6.4.1. Příprava erytrocytárních pouzder ......................................................................................... - 44 6.4.2. Stanovení inhibiční aktivity AChE a BuChE ............................................................................ - 45 -
7. VÝSLEDKY ................................................................................................................... - 46 7.1. Cholinesterasová inhibiční aktivita sumárního alkaloidního extraktu ..................................... - 46 7.2. Struktura izolovaných alkaloidů.............................................................................................. - 46 7.2.1. (+)-kanadin (BK-1) ................................................................................................................. - 46 7.2.1.1. MS analýza .................................................................................................................... - 46 7.2.1.2. NMR analýza ................................................................................................................. - 47 7.2.1.3. Optická otáčivost........................................................................................................... - 47 7.2.2. (+)-tetrahydropalmatin (BK-2) .............................................................................................. - 47 7.2.2.1. MS analýza .................................................................................................................... - 47 7.2.2.2. NMR analýza ................................................................................................................. - 47 7.2.2.3. Optická otáčivost .......................................................................................................... - 47 -
7.2.3. domestin (BK-3) .................................................................................................................... - 48 7.2.3.1. MS analýza .................................................................................................................... - 48 7.2.3.2. NMR analýza ................................................................................................................. - 48 7.3. Cholinesterasová inhibiční aktivita izolovaných látek ............................................................. - 48 -
8. DISKUZE ...................................................................................................................... - 49 9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ......................................................................... - 52 -
Seznam použitých zkratek Aβ
beta-amyloid
ACh
acetylcholin
AChE
acetylcholinesterasa
AD
Alzheimerova choroba
ApoE
apolipoprotein E
APP
amyloidový prekurzorový peptid
ATCh
acetylthiocholin
ATChI
acetylthiocholinjodid
ATP
adenosintrifosfát
BuCh
butyrylcholin
BuChE
butyrylcholinesterasa
BTCh
butyrylthiocholin
BTChI
butyrylthiocholinjodid
cAMP
cyklický adenosinmonofosfát
CAT
cholinacetyltransferasa
CDCl3
deuterizovaný chloroform
Cdk1
cyklin dependentní kinasa 1
CHAPS
3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonát
ChE
cholinesterasa
CNS
centrální nervový systém
CYP
cytochrom P
D receptory
dopaminové receptory
DMSO
dimethylsulfoxid
DNA
deoxyribonukleová kyselina
DTNB
5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina
DPPH
2,2´-difenyl-1-pikrylhydrazyl radikál
GABA
kyselina gama-aminomáselná
GADD
gen indukovatelný zástavou růstu a poškozením DNA
GSK3 - β
3-glykogensynthasa kinasa beta
HBsAg
povrchový antigen viru hepatitidy B
HBeAG
sekreční antigen viru hepatitidy B
HeLa
linie lidských nádorových epiteliálních buněk
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina
HMG-CoA
3-hydroxy-3-methylglutaryl koenzym A
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
HRPC
buňky hormonálně refrakterního karcinomu prostaty
5-HT1A
serotoninový receptor
HT 29
buňky lidského adenokarcinomu trakčníku
IP3
inositoltrifosfát
LoVo
buňky střevního nádoru
MAPS
proteiny asociované s mikrotubuly
MCF-7/6
tumorové buňky rakoviny prsu
Mcl-1
protein myeloidní leukemie
MDMA
3,4-methylendioxy-N-methylamfetamin
mRNA
informační ribonukleová kyselina
MS
hmotnostní spektrometrie
NAP 226-90
metabolit rivastigminu
NFTs
neurofibrilární klubka
NMDA
N-methyl-D-asparagová kyselina
NMR
nukleární magnetická rezonance
PAF
faktor aktivující destičky
PC12
buněčná linie
PTFE
polytetrafluorethylen
RAW 264.7
makrofágová buněčná linie
RhoA/ROCK cytoskeletární kinasy RNA
ribonukleová kyselina
TLC
tenkovrstvá chromatografie
U2SO
buněčná linie lidského osteosarkomu
1. Úvod Vzhledem ke stárnutí populace, se čím dál tím častěji setkáváme s neurodegenerativními chorobami, především s Alzheimerovou chorobou (AD). V průběhu posledních 100 let vzrostla průměrná délka života z 50 let na 80 let, což znamená, že naše populace má dostatek potravy, stálou ekonomickou situaci a velmi dobrou zdravotní péči. Ale i přesto každý 20. člověk starší 65 let trpí AD u osob nad 85 let je to dokonce každý 5. člověk. Samozřejmě nelze tato onemocnění připisovat pouze procesu stárnutí. Na rozvoj AD může mít vliv genetická predispozice, kraniocerebrální poranění, volné radikály, imunitní systém a životní prostředí, vůči kterému je člověk v průběhu svého života exponován [1]. Ačkoliv jsme schopni najít příčinu choroby, popsat její průběh a správně ji diagnostikovat, stále jsme poměrně bezradní v léčbě AD. Momentálně dostupná léčiva dovedou pouze zmírnit progresi a projevy onemocnění, ale jen v určité fázi onemocnění a na omezenou dobu. Vzhledem k těmto skutečnostem, se provádí výzkumy v oblasti izolace alkaloidů z různých rostlin a měří se jejich inhibiční aktivita vůči AChE a BuChE. Můžeme tedy říci, že léčba AD se částečně opírá o přírodní látky, vzhledem k tomu, že některé látky přírodního původu (galanthamin, huperzin A), vykazují silnější účinky a výhodnější farmakokinetické vlastnosti než současná léčiva [2]. Z těchto důvodů funguje na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie, Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové výzkumná skupina ADINACO Research Group, která studuje látky izolované z rostlin a hub a zkoumá jejich vliv na patofyziologické procesy ovlivňující rozvoj AD. Mezi hlavní zkoumané čeledě patří Amaryllidaceae, Papaveraceae, a Fumariaceae. Do čeledi Fumariaceae patří i Corydalis cava, o jejíž některých obsahových alkaloidech bude pojednáno dále v této práci.
1. Cíl práce Cílem diplomové práce bylo: 1. Seznámení se s výsledky dosavadní práce v oblasti izolace alkaloidů z hlíz Corydalis cava. 2. Studium odpovídající literatury. 3. Chromatografické
zpracování
podfrakce
B/2
z
výtřepku
z
primárního
diethyletherového extraktu z hlíz Corydalis cava. 4. Izolace minimálně 1 alkaloidu v čistém stavu, určení jeho základních fyzikálněchemických charakteristik. 5. Podíl na stanovení inhibice látek AChE a BuChE. 6. Vyhodnocení výsledků a zpracování práce.
Teoretická část 3. Alzheimerova choroba AD je neurodegenerativní onemocnění, jehož prevalence se exponenciálně zvyšuje s věkem. Jedná se o nejčastější formu demence. Toto onemocnění je velmi zatěžující, značně deklasuje kvalitu života jak samotných pacientů, tak i jejich blízkých rodinných přislušníků a pečujících osob [3].
3.1 Klinický obraz Pro AD je charakteristický pomalý nástup s nespecifickými projevy, které jsou velmi často připisovány stárnutí. Osoby zapomínají co chtěli právě říci či udělat, ztrácejí věci apod. Ne vždy musí tato roztržitost být příznakem AD, avšak při zhoršujícím se stavu, by se mělo provést neurologické vyšetření. O zhoršení stavu můžeme mluvit v případě ztráty úsudku, logického myšlení a orientace v prostoru a čase [3]. V ranné fázi AD bývá postižena zejména krátkodobá paměť, která vyžaduje správnou funkci hipokampu. Pacienti si nepamatují co měli k jídlu, jestli byli příbuzní na návštěvě apod. V této fázi nebývá dlouhodobá paměť zasažena, avšak vzhledem k progresivnímu vývoji onemocnění dochází postupem času i k zasažení dlouhodobé paměti a nejenom jí. S progresí onemocnění je spojena zhoršená orientace v prostoru, narušení komunikace s okolím, neschopnost plnit základní denní povinnosti včetně osobní hygieny, poruchy chování, spánkového cyklu atd. V poslední fázi onemocnění jsou pacienti odkázáni na péči svého okolí, neboť již nejsou schopni pohybu, trpí inkontinencí a nepoznávají ani osoby blízké. V průměru se pacient, jemuž byla diagnostikována ranná forma AD, dožívá dalších 7 – 10 let. Pacienti umírají často na přidružené choroby (např. bronchopneumonie) a úrazy způsobené pádem [3, 4].
3.2 Etiologie Příčina AD není zcela objasněna. U pacientů se objevují typické neurobiologické změny na mozku jak makroskopické, tak mikroskopické, které však nemusí být samou podstatou této zrádné nemoci. 3.2.1. Makroskopické změny mozku u AD Makroskopické změny mozku u AD se do značné míry překrývají s příznaky stárnutí. Dochází k atrofii mozkové tkáně, která je nejvýraznější v oblasti hippokampu a entorhinální
kůry a zároveň dochází k rozšiřování mozkových komor. Rozdíly mezi AD a stárnutím jsou nejmarkantněji vidět u presenilních forem AD, kdy dochází ke komplexní atrofii mozku, zatímco pro pozdní formy je charakteristická atrofie spánkového laloku. Naproti tomu numerická atrofie neuronů u AD značně převyšuje numerickou atrofii neuronů doprovázející stárnutí jak v mozkové kůře, tak v podkorových oblastech. Nejvíce zasažené jsou neurony s plochou nad 90 µm2, které se nejenom zmenšují, ale i mizí. Mezi selektivně zranitelné patří neurony somatostatinové. Již od ranného stádia AD bývá poškozena enterorhinální kůra, kde dochází k úbytku neuronů ve II. vrstvě a dochází k poškození pyramidálních neuronů hippokampálního sektoru CA1, což se odráží v kognitivních změnách. Zároveň dochází k numerické atrofii cholinergních neuronů bazálního telencefala, což se projevuje snížením koncentrace korové AChE a CAT. Při AD je postižena i populace noradrenergní v locus coeruleus, dopaminergní v substatia nigra, jakož i populace hypothalamického nucleus suprachiasmaticus, anterodorzálního a dorzomediálního jádra thalamu a některé další [3 - 5]. 3.2.2. Mikroskopické změny mozku u AD Zatímco makroskopické změny mozku u AD můžeme sledovat pomocí zobrazovacích technik, mikroskopické nám odhalí až histologické vyšetření po smrti a pitvě pacienta. Mezi typické mikroskopické změny patří senilní plaky a neuronální klubka. 3.2.2.1. Senilní plaky Senilní plaky jsou tvořeny kumulovaným Aβ. V histologických řezech je nacházíme jako nepravidelné oválné útvary o velikosti 10 – 200 µm. Lze je zviditelnit řadou barvících a impregnačních technik jak v mozkové kůře, tak v podkorové šedi a v kůře mozečku. Různými typy histologického barvení bylo rozlišeno celkem 8 typů senilních plaků a příbuzných struktur. Rozdělení je založeno na přítomnosti a druhu degenerace neuritů a přítomnosti amyloidu. Senilní plaky mohou obsahovat 2 druhy neuritů a to dystrofické neurity a neurity s párovými spinálními vlákny. První druh neuritů se objevuje v průběhu fyziologického stárnutí lidí. Obsahují APP, konkavalin A a chromogranin. Je pravděpodobné, že vlastnosti dystrofických neuritů určují děje v okolí senilních plaků. Neurity s párovými spinálními vlákny jsou typické pro AD. Vlákna mají průměr 20 nm a jsou otočena každých 80 nm. Lze v nich pomocí imunocytochemických metod prokázat τ – protein a ubikvitin.
V placích lze prokázat aktivovanou mikroglii, která se tvarově liší od klidové mikroglie. Z tohoto můžeme předpokládat, že aktivace mikroglie má podíl na tvorbě senilních plaků a tím i na patogenezi AD v rámci zánětlivých mechanismů společně s oxidačním stresem [3, 4]. 3.2.2.2. Neurofibrilární klubka (NFTs) NFTs obsahují párová helikální filamenta, která jsou tvořena především nerozpustnou hyperfosforylovanou formou τ-proteinu. Z fyziologického hlediska τ-protein stabilizuje mikrotubuly v axonech a reguluje dynamiku mikrotubulární sítě, především těch struktur, které se podílejí na axonálním transportu a plasticitě neuronů. Při AD je τ-protein hyperfosforylován a dochází k jeho agregaci. To naruší stabilitu a transport v axonu, což vede k zhroucení cytoskeletu a vzniku neurofibrilárních klubek [6, 7]. 3.2.3. Změny v metabolismu proteinů asociovaných s AD a další patofyziologické děje podílející se na rozvoji AD S pojmem AD jsou spojeny určité proteiny a děje, jež se podílejí na patofyziologických procesech v mozku pacientů s AD. Patří k nim Aβ, τ-protein, oxidační stres, zánět a metabolismus cholesterolu. 3.2.3.1. β-amyloid (Aβ) Předstupněm Aβ je amyloidový prekurzorový protein (APP), který je fyziologickou součástí buněčné membrány. Skládá se z velkého extracelulárního řetězce, jedné transmembranózní jednotky a krátkého cytoplazmatického úseku. Fyziologická funkce APP není ještě zcela objasněna. Pravděpodobně má podíl na růstu a plasticitě neuronů, migraci a umisťování neuronů v průběhu vývoje mozku [4]. APP podléhá následně štěpení, které se může dít jednou ze dvou cest. První cestou je štěpení APP za pomoci α-sekretasy. Jedná se o fyziologické štěpení, kdy vznikají malé, plně solubilní fragmenty, tzv Aβ1-40, které se podílejí na tvorbě nových synapsí. Pokud však štěpení APP probíhá druhou cestou pomocí enzymů β- a γsekretasy, tak výsledkem štěpení jsou peptidy o 42 a více aminokyselinách, které zpočátku agregují v oligopeptidy. Ty se vyznačují výraznou neurotoxicitou. Následně dochází ke kumulaci těchto oligopeptidů v extracelulárním prostoru mozkové kůry a poté k jejich polymeraci, tedy vzniku Aβ, který je klinicky reprezentován senilními plaky. Aβ se společně se sterilním zánětem a oxidativním stresem podílí na rozvoji demence [3, 4, 8].
3.2.3.2.Τ-protein T-protein patří do skupiny proteinů zvané MAPs (proteiny asociované s mikrotubuly) a za fyziologických podmínek se podílí na stabilizaci mikrotubulární sítě neuronů. Existuje 6 izoforem τ-proteinu, které jsou kódovány jedním genem, který se nachází na dlouhém raménku chromozomu 17 a vznikají alternativním sestřihem. Strukturně můžeme izoformy τ-proteinu rozdělit na dvě rozsáhlé domény. Na vyčnívající doménu, která obsahuje aminové zakončení a na doménu, která se váže na mikrotubuly karboxylovým koncem. Navíc, vyčnívající doména může být rozdělena na další dvě části. Na amino-terminální část vyznačující se vysokým podílem kyselých reziduí a na část bohatou na prolin. Doména vázající mikrotubuly je dále dělena na hlavní, tubulin vázající oblast a na karboxy-terminální oblast [7, 9 – 11]. Pro vyčnívající doménu bylo navrženo několik různých funkcí zahrnující určování vzdálenosti mezi axonálními mikrotubuly, vzájemné ovlivňování ostatních cytoskeletárních proteinů, nebo vázání kationtů kvůli přítomnosti kyselých reziduí [10]. Mikrotubuly vázající doména obsahuje tři nebo čtyři podobné, ne však identické, repetitivní sekvence o 31 nebo 32 reziduí. Každá z těchto repetic může být rozdělena na dvě části. První se skládá ze sekvence o 18 reziduích, která obsahuje minimum kapacity pro navázání tubulinu a druhá, méně konzervativní část o 13 nebo 14 reziduí, známá jako mezi-repetice. Je třeba poznamenat, že v oblastech vázajících tubulin, sekvence s největší kapacitou vázat mikrotubuly je obsažena v první repetici, mezi-repetici a druhé repetici. Tyto repetice vážou mikrotubuly a mohou podporovat jejich uspořádání [10]. U AD je fyziologická funkce τ-proteinu narušena, neboť ztrácí kapacitu pro navázání mikrotubulů. Toto abnormální chování je způsobeno konformačními změnami v normální struktuře proteinu, což vede k jeho patologické agregaci do fibrilárních struktur, které se hromadí v neuronech. O mechanismech, jimiž se τ-protein stává nefukčním, se stále vedou debaty. Jako hlavní příčina jsou navrhovány abnormální posttranslační změny, tedy hyperfosforylace, acetylace, glykace, ubikvitinace, nitrace, proteolytické štěpení, konformační změny a některé další modifikace, které mají za důsledek patologické chování τ-proteinu [12]. Z jmenovaných posttraslačních změn se na patofyziologii τ-proteinu nejvíce podílí hyperfosforylace a acetylace [12].
Hyperfosforylaci τ-proteinu katalyzují enzymy ze třídy kinas. Z nejdůležitějších to jsou 3-glykogensyntasa, cyklin-dependentní kinasa 5, cAMP-dependentní protein kinasa a kalcium/kalmomodulin dependentní kinasa II. Vlivem hyperfosforylace není τ-protein schopen se vázat na mikrotubuly, agreguje a dochází ke ztrátě stability cytoskeletu, poruše axonálního transportu a vzniku neurofibrilárních klubek [12, 13]. Acetylace τ-proteinu patří mezi posttranslační modifikace. Ukázalo se, že reverzibilní acetylace lysinu
může mít
vliv jako
potenciální
regulátor při
AD a dalších
neurodegenerativních poruchách. Vzhledem k tomu, že acetylace neutralizuje náboje na mikrotubuly vázající doméně, může odchylná acetylace interferovat s vazbou mikrotubulů a τ-proteinu, což může vést k dyfunkci τ-proteinu a jeho agregaci. Především zvýšená acetylace lysinu 280 by mohla oslabit interakce τ-proteinu s mikrotubuly a zároveň tím poskytovat zvýšenou koncentraci τ-proteinu v cytosolu, kde může podlehnout patologické agregaci. Z toho vyplývá, že na negativní regulaci τ-proteinu se může podílet hyperfosforylace i acetylace, a to buď jednotlivě, nebo v kombinaci. Enzymy kazalyzující acetylaci se nazývají histon acetyltransferasa nebo lysin acetyltransferasa [12]. 3.2.3.3. Oxidační stres Oxidační stres je obecně používaný termín, který popisuje míru oxidačního poškození buňky, tkáně nebo orgánu. Toto poškození může být způsobeno reaktivními formami kyslíku, dusíku a síry, ale i nerovnováhou oxidačních a antioxidačních procesů buňky. Toto poškození může ovlivnit jak konkrétní molekulu, tak celý organismus. Aktivovaná mikroglie a astrocyty uvolňují volné radikály a zánětlivé faktory při AD. Volné radikály a zánětlivé faktory přispívají k patogenezi oxidačního stresu. Kromě toho, oxidační poškození a citlivost k oxidačnímu stresu se zvyšuje s věkem. Oxidační poškození se na AD podílí několika mechanismy, zejména : - peroxidací lipidů, při jejímž analytickém měření nacházíme zvýšené hladiny reaktivních kyselých
thiobarbiturových
látek,
malondialdehydu,
4-hydroxy-2-trans-nonenalu
a
isoprostanů, - oxidací proteinů, která se vyznačuje výrazně zvýšenou karbonylací a nitrací tyrosinových zbytků, - oxidací DNA a RNA, která je charakterizována zvýšenými hladinami 8-hydroxy-2deoxyguanosinu a 8-hydroxyguanosinu [14, 15].
Obecně platí, že oxidační poškození buněčných složek má za následek změny v chování buněčné membrány, ovlivňuje její fluiditu, transport iontů, enzymatickou aktivitu a příčné vazby. Nadměrné oxidační poškození nakonec vyústí v buněčnou smrt [16]. 3.2.3.4. Zánět Zánětlivé procesy, bez ohledu na jejich konkrétní lokalizaci v organismu, mohou mít pozitivní, ale i negativní účinky. Pozitivní účinky se mohou vyskytnout v průběhu akutní fáze zánětu, zatímco dlouhodobě trvající zánět může zhoršit základní patologii četných onemocnění. Za přirozenou imunitu a zánětlivé signály v CNS je zodpovědná převážně mikroglie. Mikroglie může exprimovat receptory, přes které získává varovné signály o endogenním poškození buňky. Nicméně, stále více důkazů podporuje teorii, která pokládá astrocyty za buňky přirozené imunity, které jsou schopné se zapojit do rozpoznávání a modulace
imunitních
a
zánětlivých
procesů
v CNS,
tedy
i
u
chronických
neurodegenerativních onemocnění jako je AD [17]. Bylo zjištěno, že kromě přímých toxických účinků Aβ, může Aβ současně podporovat neurodegeneraci mechanismy, které zahrnují aktivaci mikroglie a astrocytů. Mikroglií navozená zánětlivá reakce má za následek uvolnění různých mediátorů zánětu. Jednou aktivovaná mikroglie může rovněž stimulovat astrocyty, které aktivně prodlužují zánětlivou reakci na extracelulárních reziduích Aβ. Tato neurozánětlivá složka AD je dále charakterizována
místní
cytokiny
zprostředkovanou
akutní
fází
reakce,
aktivací
komplementové kaskády a indukcí zánětlivých enzymatických systémů, jako je oxidem dusnatým indukovatelná syntasa a prostanoidem generovaná cyklooxygenasa-2. Z několika důkazů vyplývá, že všechny tyto faktory mohou přispět k dysfunkci neuronů a buněčné smrti, buď samostatně, nebo vzájemnou kooperací [18]. 3.2.3.5. Metabolismus cholesterolu Homeostáza lipidů v CNS je důležitá pro neuronální vývoj, reparaci poraněného mozku a pro zachování efektivního neuronálního přenosu. Některé neurodegenerativní poruchy se vyskytují jako přímý výsledek dysfunkce neuronálních lipidů a základní patologické procesy, které jsou spojeny s AD, zřejmě také souvisí s rozvratem homeostázy lipidů v CNS. S rozvratem lipidového metabolismu CNS je zejména spojován apolipoproteinE (ApoE) a jeho isoformy. ApoE polymorfismus je výrazným genetickým rizikovým faktorem pro AD. ApoE je jedním z nejvýznamnějších transportérů lipidů v mozku. V CNS je ApoE tvořen převážně astrocyty a mikroglií. Existují tři izoformy ApoE: ApoE2, ApoE3, ApoE4, které se
liší svou biologickou funkcí, díky rozdílnému uspořádání aminokyselin v polohách 112 a 158. ApoE2 má v obou polohách cystein, ApoE3 má v poloze 112 cystein a v poloze 158 arginin, zatímco ApoE4 má arginin jak poloze 112, tak v poloze 158. Většina lidí disponuje isoformou ApoE3. Izoformy ApoE2 a ApoE4 se vyskytují v menším rozsahu a mají spojitost s AD. V nejvyšším riziku jsou lidé s isoformou ApoE4. Navíc apoE isoformy se mohou podílet na clearance Aβ. ApoE se naváže na Aβ a transportuje ho přes hematoencefalickou bariéru do periférie, čímž dojde ke zmírnění jeho toxických účinků. Záleží však na síle vazby, která je u každé isoformy jiná [19 - 21]. Metabolismus cholesterolu se může podílet i na tvorbě Aβ. Pokud je v neuronální membráně zvýšené množství cholesterolu, dochází ke zvýšenému štěpení APP β- i γsekretasou, které jsou v membráně zakotveny. Vzniká tak patologický Aβ. Existují důkazy o tom, že nízká hladina cholesterolu vede ke štěpení APP převážně α-sekretasou, čímž vzniká rozpustná forma Aβ. Z toho vyplývá, že vysoké hladiny cholesterolu mohou být rizikovým faktorem AD. Pro snižování hladiny cholesterolu se používají statiny. Ty inhibují enzym HMG-CoA synthasu, která katalyzuje regulační krok v biosyntéze cholesterolu. Tímto mechanismem snižují hladinu cirkulujícího cholesterolu a také inhibují syntézu cholesterolu de novo v mozku. Je možné, že statiny snižují hladinu cholesterolu v mozku prostřednictvím ApoE, ale je možný i přímý účinek, neboť lipofilní statiny jsou schopny překročit hematoencefalitickou bariéru. I hydrofilní statiny jako je pravastatin a atorvastatin
také
vykazují vliv na snížení rizika AD, avšak nepřímým účinkem [21, 22].
3.3. Cholinesterasy ve spojitosti s AD Jedním z hlavních patofyziologických projevů AD je progredující ztráta cholinergních neuronů. Cholinergní deficit vede ke kognitivním poruchám, poklesu pozornosti, koncentrace a rychlosti zpracování informací a nemalou mírou také k poruchám chování. V mozku pacientů s AD jsou postiženy všechny oddíly cholinergního systému. Dochází ke snížení celkového množství ACh, deficitu CAT, která je zodpovědná za syntézu ACh a také AChE, která ACh odbourává. Zajímavostí je, že hladina BuChE, která se také podílí na odbourávání ACh, při AD progresivně a významně stoupá [23]. 3.3.1. Funkce acetylcholinu v lidském organismu ACh je neuromediátor, který je odpovědný za přenos vzruchu v cholinergních synapsích. Syntetizuje se v presynaptické oblasti motorického neuronu přenosem acetylu z acetyl-CoA na cholin. Tuto reakci katalyzuje již výše zmíněná CAT, která se vyskytuje pouze
v cholinergních neuronech. ACh se váže na receptory dvojího druhu – nikotinové a muskarinové. Nikotinové receptory se nacházejí v nervosvalové ploténce a sympatických gangliích. Každý receptor se skládá z pěti podjednotek a poskytuje dvě vazebná místa pro ACh. Muskarinové receptory se vyskytují v CNS i periferním nervstvu. Jedná se o bílkoviný řetězec, který se meandrovitě proplétá membránou neuronu, kooperuje s G-proteiny a tvoří druhé posly, cAMP či IP3 [24]. Po přenosu vzruchu dochází k hydrolýze ACh za pomocí AChE, kdy ACh se váže na serinový zbytek v aktivním místě enzymu. Produktem hydrolýzy je cholin, který se zpětně využije na syntézu ACh a acetyl, který s vodou přechází na acetát [24]. 3.3.2. Acetylcholinesterasa a butyrylcholinesterasa AChE i BuChE jsou enzymy, které patří do skupiny serinových hydrolas. AChE a BuChE sdílí z 65% sekvenční homologii aminokyselin a mají obdobné molekulární formy a strukturu aktivního místa, přestože jsou kódovány různými geny. AChE je kódována geny na chromosomu 7 a BuChE na chromosomu 3 [25]. O vzniku různých molekulárních forem AChE a BuChE rozhoduje vždy jediný gen, a to v důsledku alternativního sestřihu kódovací oblasti původniho transkriptu. Strukturní vlastnosti těchto dvou cholinesteras určují rozdíly v jejich substrátové specifitě. AChE se vyznačuje vysokou selektivitou pro hydrolýzu ACh, zatímco BuChE se vyznačuje vyšší variabilitou, neboť je schopna metabolizovat několik druhů molekul včetně různých neuroaktivních peptidů [23]. AChE se vyskytuje ve třech globulárních formách, které obsahují jednu, dvě nebo čtyři katalytické podjednotky, monomerní G1, dimerní G2 a tetramerní G4. G1 AChE existuje výlučně jako solubilní složka, zatímco G4 AChE existuje jak v rozpustné, tak v membránově vázané formě. V lidském mozku se AChE vyskytuje v G1 a G4 formě, přičemž se jejich poměr v různých oblastech mozku liší. Forma G4 převažuje v mozku zdravého člověka a při AD je její koncentrace minoritní, zatímco G1 forma je v mozku zdravého člověka minimálně zastoupena, ale její podíl se výrazně zvyšuje při AD [23, 26]. Dalším enzymem je BuChE. BuChE se farmakologicky liší od AChE, jak reakcí se substráty a inhibitory, tak i svou kinetikou, protože substrát spíše aktivuje než aby ho inhibovala. Zatímco AChE hydrolyzuje pouze ACh, který je nejmenší z řady esterů cholin, BuChE je schopna hydrolyzovat větší substráty, zejména BuCh, od kterého byla pojmenována [27]. BuChE se vyskytuje nejenom v CNS, ale i na periférii, kde je snytetizována parenchymatickými jaterními buňkami a tukovou tkání. BuChE se také nachází
v cholinergních synapsích autonomního nervového systému a v endoteliálních buňkách. V CNS se BuChE vyskytuje převážně ve spojení s gliovými buňkami včetně oligodendritů, astrocytů a mikroglie. Množství BuChE v CNS se fyziologicky zvyšuje s věkem, ale i při AD, kdy však zároveň dochází k úbytku AChE [28].
3.4. Léčba Alzheimerovy choroby Vzhledem k tomu, že etiologie AD není ještě zcela objasněna, se léčba zaměřuje převážně na oddálení těžkých stádií nemoci a zlepšení kvality života pacientů. Pro farmakoterapii se používají dvě hlavní skupiny léčiv: - inhibitory cholinesteras - inhibitory NMDA receptorů glutamatergního systému [3, 29]. 3.4.1. Inhibitory cholinesteras Inhibitory cholinesteras jsou nejpoužívanější skupinou léčiv pro modulaci AD. Mechanismus jejich působení je založen na inhibici AChE, u některých přípravků i BuChE, což vede ke zvýšení množství ACh pro cholinergní transmisi a zároveň se vyznačují neuroprotektivním efektem. V současnosti se klinicky používají tři přípravky: donepezil, rivastigmin a galanthamin [3, 29]. 3.4.1.1. Donepezil Donepezil je selektivní reverzibilní ihibitor AChE a z dostupných inhibitorů cholinesteras je na trhu nejdéle a to od roku 1997. Strukturou se jedná o derivát piperidinu. Donepezil inhibuje pouze AChE, na inhibici BuChE nemá významný vliv. Výhodou donepezilu je dlouhý poločas účinku, což umožňuje podání léku jedenkrát denně. Donepezil je charakterizován pozitivním vlivem na kognitivní funkce, behaviorální symptomy a aktivity denního života. Používá se při lehké a střední formě AD a tedy snižuje rychlost progrese AD do terminálních stádií. Donepezil má však širší klinické využití, neboť řada klinických studií zjistila pozitivní účinek také u vaskulární demence a Parkinsonovy choroby [3, 30 - 32]. 3.4.1.2. Rivastigmin Jedná se o další inhibitor cholinesteras, který na rozdíl od donepezilu, pseudoireverzibilně inhibuje jak AChE, tak i BuChE. Pseudoireverzibilně znamená, že inhibice AChE (BuChE) trvá 12 hodin, ale molekula rivastigminu se váže na receptor pouze 30 – 60 minut, poté podléhá degradaci. Rivastigmin obsazuje obě aktivní místa AChE, jak esterové tak ionické. Rivastigmin se klinicky používá od roku 1998 a dle chemické struktury se řadí k derivátům
karbamátu. Rivastigmin se používá pro modelaci lehké a střední formy AD a u demence s Lewyho tělísky [26, 31, 33]. 3.4.1.3. Galanthamin Galanthamin je k dispozici na trhu nejkratší dobu a to od roku 2000. Jedná se o selektivní kompetitivní reverzibilní inhibitor AChE, který zvyšuje koncentraci Ach v místě neurotransmise a používá se pro modulaci lehké a střední formy AD [31]. Galanthamin je přírodní látka, která je obsažena v rostlinách čeledi Amaryllidaceae. Nejdříve byl izolován z cibulí sněženky Galanthus woronowii z rodu Galanthus, ale je obsažen v mnoha dalších rostliných rodech jako je Amaryllis, Hippeastrum, Lycoris, Ungernia, Leucojum, Narcissus, Zephyranthes, Hymenocallis a Haemanthus [31, 34, 35]. Galanthamin se používal již v 60. letech 20. století k antagonizmu neuromuskulární blokády vyvolané pachykurarovými látkami a pro terapii paralytické poliomyelitidy nebo myasthenia gravis. Galanthamin působí jako antagonista dechového útlumu navozeného opioidy a dále také antagonizuje centrální anticholinergní syndrom způsobený hyoscinem a některé z centrálních účinků droperidolu a diazepamu [36]. 3.4.2. Inhibitory NMDA receptorů glutamatergního systému Mometálně je k dispozici pouze jediný přípravek z této skupiny léčiv pro terapii AD a tím je memantin. 3.4.2.1. Memantin Memantin je parciální, nekompetitivní, napěťově závislý antagonista receptorů excitačních aminokyselin typu N-metyl-D-aspartátu (NMDA). Původně byl syntetizován v 60. letech jako potenciální antidiabetikum, bohužel bez úspěchu. Avšak v 80. letech byl registrován pro léčbu Parkinsonovy choroby a spasticity a v 90. letech byly provedeny studie, které prokázaly překvapivě pozitivní účinek v léčbě AD a vaskulární demence a to zejména ve středních a těžkých stádiích choroby [37, 38]. Glutamát vystupuje v CNS jako hlavní excitační neurotransmiter, který zajišťuje přenos signálu na 40 – 60 % všech synapsí v mozku a to převážně v hippokampu a neokortexu a za fyziologických podmínek má vliv na paměť a učení. Avšak glutamát má také podíl na rozvoji neurodegenerativních chorob [38].
Při AD dochází k excitotoxicitě, tedy k nadměrnému uvolňování excitačních aminokyselin jako je glutamát či aspartát, což způsobí hyperexcitaci NMDA receptorů, která je navíc podnícena snížením zpětného vychytávání glutamátu v určitých částech mozku. Tento proces vede ke zvýšenému influxu kalciových iontů do neuronů, čímž dochází k aktivaci kalcium dependentních enzymů, vzniku volných radikálů a v závěru k apoptóze neuronů. Memantin tedy působí neuroprotektivně před neurotoxickým vlivem glutamátu tím, že v iontovém kanálu blokuje nadměrný vstup vápníkových iontů do buňky. Memantin se vyznačuje pouze mírnou až střední afinitou a vysokou napěťovou závislostí, což umožňuje plnit glutamátu jeho fyziologickou funkci v procesu učení a paměti [3, 38]. Tabulka č.1 Základní farmakologické vlastnosti léčiv pro terapii AD [31, 38] Základní farmakologické vlastnosti léčiv pro terapii AD název
donepezil
rivastigmin galanthamin
memantin
inhibitor cholinesteras
ano
ano
ano
ne
ne
ne
ne
ano
1997
1998
2000
2002
alkaloid
derivát
fenantrenu
adamantanu
inhibitor NMDA receptorů dostupnost na trhu od chemická struktura
derivát piperidinu
karbamát
inhibice AChE
ano
ano
ano
ne
inhibice BuChE
ne
ano
ne
ne
ne
ne
ne
ano
poločas (hod.)
70
1,5
6
60 - 100
T.max (hod.)
3-4
0,8 – 1,2
1-2
3–8
počet denních dávek
1
2
1
1
potřeba titrace
vhodná
ano
ano
ano
metabolismus CYP 450
ano
ne
ano
ne
inhibice NMDA receptorů
3.4.3. Nové perspektivy léčby AD přírodními látkami a jejich deriváty. Momentálně používané terapeutické postupy založené na důkazech, tedy inhibitory mozkových cholinesteras a inhibitor NMDA receptorů, jsou v současnosti zkoumány z hlediska nových aplikačních forem i nověji zjištěných dalších pozitivních farmakologických
efektů. Do praxe se zavádějí náplasťové formy inhibitorů cholinesteras, což vede k minimalizaci nežádoucích gastrointestinálních účinků [39]. Další výzkumy se zaměřují na jednotlivé kompartmenty z patofyziologie AD, ať už se jedná o inhibici či modulaci β- a γ- sekretázy, blokádu polymerace oligopeptidů β-amyloidu, vakcinace zaměřené proti Aβ a τ-proteinu či výzkum kmenových buněk [39]. Další velmi nadějnou cestou je izolace sekundárních metabolitů rostlin a jejich použití při terapii AD. Mezi ty významné patří huperzin A a hupriny. 3.4.3.1. Huperzin A Huperzin A je lykodinový alkaloid rostliny Huperzia serrata z čeledi Huperziaceae. Nachází se i v dalších rostlinách čeledí Huperziaceae, Lycopodiaceae a rodu Selaginella. Největší zastoupení huperzinu A je ve vrancích Huperzia serrata, H. herteriana a H. ovatifolia. Tyto rostliny jsou používány pro izolaci účinné látky [40]. Huperzin A splňuje kritéria jako potenciální nové léčivo pro symptomatickou léčbu AD. Je specifickým inhibitorem AChE s vysokou selektivitou pro mozkovou AChE, vyznačuje se déletrvajícím účinkem, vysokou biologickou dostupností po perorálním podání a silnější inhibicí AChE ve srovnání s používanými inhibitory AChE. Dále je účinný proti glutamát-indukované neuronální smrti. Jeho klinické hodnocení pro léčbu AD se nyní nachází ve 4. fázi klinických studiích [41]. 3.4.3.2. Hupriny Hupriny byly popsány před několika lety jako potenciální inhibitory AChE. Jedná se o sloučeniny, které vznikají kombinací takrinu a huperzinu A, konkrétně kombinují karbobicyklickou strukturu huperzinu A a 4-aminochinolinovou strukturu takrinu. Takrin byl kvůli své hepatotoxicitě a gastrointestinálním vedlejším účinkům stažen z trhu, avšak v kombinaci s huperzinem A ve formě huprinu jsou tyto vedlejší účinky eliminovány. Hupriny vykazují vyšší inhibiční aktivitu AChE než samotný takrin a huperzin A. Huprin X vykazuje jednu z nejvyšších inhibičních aktivit AChE a zároveň vystupuje jako agonista muskarinových receptorů, zeména M1 receptorů. Další dva zajímavé deriváty huprinu jsou halogenované, huprin Y má v pozici 3 substituovaný chlor a huprin Z fluor. Huprin Y vykazuje také inhibiční aktivitu k AChE, agonismus k muskarinovým receptorům a zároveň je zajímavý pro svůj neuroprotektivní efekt proti glutamátem indukované neurotoxicitě, která zahrnuje změny v intracelulární homeostáze vápníku a vznik reaktivních kyslíkových radikálů, které přispívají
k urychlení apoptózy neuronů. Huprin Z se rovněž řadí mezi inhibitory AChE a stejně jako huprin X a huprin Y vystupuje jako agonista muskarinových receptorů M1 [42 - 46].
4. Corydalis cava (L.) Schweigg. & Koerte (Fumariaceae) 4.1. Taxonomické zařazení Oddělení:
Magnoliophyta
Třída:
Magnoliopsida
Podtřída:
Ranunculidae
Řád:
Papaverales
Čeleď:
Fumariaceae
Rod:
Corydalis DC.
Druh:
Corydalis cava (L.) Schweigg. & Koerte [47]
Obrázek 1. Corydalis cava (L.) Schweigg.& Koerte [48]
4.2. Botanická charakteristika rostliny Do rodu Corydalis DC. řadíme asi 80 druhů, které jsou rozšířeny v mírném pásmu Eurasie, s těžištěm rozšíření ve střední a východní Asii. Na území České republiky se vyskytuje několik druhů dymnivek: dymnivka dutá – Corydalis cava (L.) Schweigg & Koerte, dymnivka bobovitá – Corydalis intermedia (L.) Mérat, dymnivka nízká – Corydalis pumila
(HOST) Reichenb. a dymnivka plná – Corydalis solida (L.) Clairv. Můžeme se setkat i s kříženci těchto druhů [47]. 4.2.1. Morfologický popis rostliny Dymnivka dutá je vytrvalá bylina s velkou dutou podzemní hlízou, která má kořínky po celém svém povrchu. Lodyha je přímá jednoduchá, dorůstající výšky 10 – 35 cm, vzácně až 50 cm, zelená až hnědočervená. Vyrůstají na ní 2 – 3 dlouze řapíkaté lodyžní listy, které jsou v obrysu široce trojúhelníkovité, dvakrát trojčetné, modrozeleného zbarvení. Květenstvím je hrozen s 8 – 20 květy. Listeny jsou vejčité nebo skoro eliptické, celokrajné, většinou sivomodré barvy. Květy dorůstají délky 18 – 28 mm a jsou zbarveny lila nachově, bíle, žlutobíle, méně častěji růžově, tmavomodře nebo hnědavě nachově a mají ostruhu pravoúhle ohnutou dolů. Tobolky jsou v obrysu podlouhle kopinaté 20 – 25 mm dlouhé [47]. 4.2.2. Stanoviště Dymnivka dutá roste především ve svělých humózních hájích, lužních a smíšených lesích, zejména na půdách bohatých na humus. Za příznivých podmínek roste pospolitě a kvete od března do května. Vyskytuje se v celé střední a jižní Evropě [47].
4.3. Obsahové látky Dymnivka dutá patří mezi jedovaté rostliny. Její hlízy obsahují až 6 % alkaloidů, z nichž majoritní je bulbokapnin. Kromě bulbokapninu je v hlízách obsaženo více než 20 dalších alkaloidů. Hlavní skupinu sekundárních metabolitů rodu Corydalis DC. tvoří isochinolinové alkaloidy. Isochinolinové alkaloidy jsou jednou z největších skupin aklaloidů. Isochinolinová kostra
je
základním
stavebním
kamenem
pro
různé
druhy
alkaloidů,
včetně
benzylisochinolinových, protopinových, benzofenanthridinových a protoberberinových alkaloidů [49, 50]. 4.3.1. Isochinolinové alkaloidy Corydalis cava Z hlíz dymnivky duté bylo vyizolováno několik různých strukturních typů isochinolinových alkaloidů: Tabulka č. 2 Přehled isochinolinových alkaloidů Corydalis cava [51 – 55] typ alkaloidu
zástupci danného typu (+)-bulbokapnin, (±)-domesticin, (+)-domestin, glaucin,
aporfinový
(+)-isoboldin, (+)-korydin, (+)-korytuberin, 1,2-methylenedioxy-6a,7-dehydroaporfin-10,11-chinon,
Tabulka č. 2 pokračování
typ alkaloidu
zástupci danného typu
aporfinový
(+)-N-methyllaurotetanin, (+)-predicentrin
benzofenanthridinový
koptisin, korynolin, korysamin
ftalidisochinolinový
(-)-kapnoidin apokavidin, berberin, dehydroapokavidin, jatrorrhizin,
protoberberinový
(+)-kanadin, kolumbamin, korybulbin, korydalin, korypalmin, 8-oxokoptisin, palmatin, skulerin, (+)-stylopin, (-)-stylopin, (±)-tetrahydropalmatin allokryptopin, fagarin, korykavamin, korykavidin , korykavin,
protopinový
protopin
promorfinanový
sinoakutin
sekoberberinový
(-)-kanadalin
sekoftalidisochinolinový
adlumidicein
4.3.2. Biologická aktivita obsahových látek Vzhledem ke strukturní různorodosti isochinolinových alkaloidů jsou i jejich biologické účinky poměrně rozsáhlé. Kromě dobře známých účinků analgetických, antitussických, myorelaxačních a cholagogních byly a jsou široce studovány účinky antiinvazivní, tedy antivirotické,
antimikrobiální,
antiprotozoální a antineoplastické,
dále pak
účinky
na enzymové systémy savců jako jsou monoaminooxidasa, cholinesterasy, β-glukuronidasa, ATP-asy apod. U isochinolinových alkaloidů dymnivky duté byla prokázána rozmanitá biologická aktivita, která je pro jednotlivé alkaloidy popsána v následující tabulce [56]. Tabulka č. 3 Biologická aktivita alkaloidů dymnivky duté
Obsahová látka
Biologická aktivita antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57], anthelmintická (Strongyloides ratti, Strongyloides venezuelensis) [58], antibakteriální (Staphylococcus aureus,
allokryptopin (Obr. 2)
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae) [59], antifungální (Microsporum gypseum, Epidermophyton floccosum) [60], inhibice cytochromů CYP2D6, CYP2C19, CYP2C8, zvýšení úrovně mRNA CYP1A [61],
Tabulka č. 3 pokračování Obsahová látka allokryptopin (Obr. 2)
Biologická aktivita zvýšení vazby GABA na membránové synaptické receptory [62] antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57], anthelmintická (Strongyloides ratti, Strongyloides venezuelensis) [58], imunostimulační, antikonvulzivní, sedativní, hypotenzivní, karminativní, antihistaminická, antimuskarinová, antibakteriální (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Chlamydia aureus, Corynebacterium diphtheriae, Salmonella typhi, Diplococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Treponema pallidum), antiprotozoální (Giardia lamblia, Leishmania donovani) [62], protizánětlivá inhibice genové exprese prostaglandin H synthasy, inhibice
berberin (Obr.3)
draslíkových kanálů, hepatoprotektivní aktivita [63], aktivita antineoplastická, cytotoxická, antiproliferativní, inhibice topoisomerasy I, navození apoptózy, up-regulace GADD153, inhibice cyklooxygenasy-2 a antiapoptického proteinu Mcl-1, down-regulace nukleárního fosfoproteinu nukleofosminu a telomerasy [64], inhibice arylamin N-acetyltransferasy, inhibice cytochromů CYP3A4, CYP2C a CYP2D v lidských mikrosomech, inhibice syntézy NO [65], snížení glukosy v krvi zvýšením citlivosti k inzulínu, up-regulace LDL receptorů - snížení hladiny cholesterolu v krvi, inhibice α-glukosidasy – snížení absorpce glukózy ve střevech, potlačení adipogeneze, antioxidační aktivita [66], inhibice angiotenzinu I [67], protiprůjmový efekt [68] snížení koncentrace dopaminu v buněčné linii PC12 - inhibice tyrosinhydroxylasy, snížení intracelulární koncentrace vápenatých
bulbokapnin (Obr.4)
iontů [69], inhibice AChE, BuChE [70], účinky antimikrobiální, antihypertenzivní, sedativní, adrenolytické a kataleptické, v nízkých dávkách potlačuje spinální synaptické motoneuronové reflexy [71],
Tabulka č.3 pokračování Obsahová látka
Biologická aktivita antioxidační aktivita – inhibice mikrosomální lipidové peroxidace
bulbokapnin (Obr.4)
[72], inhibice cytochromů CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 [73]
dehydroapokavidin
účinek antivirotický (inhibice HBsAg a HBeAg) [74], cytotoxický
(Obr.5)
účinek na buněčné linie Saso-2, A375 a HeLa [75] účinek protizánětlivý, antioxidační, antihyperglykemický, antitussický [76], bronchospasmolytický účinek - selektivní inhibice
glaucin (Obr.6)
fosfodiesterasy 4 v lidské bronchiální tkáni a granulocytech, neselektivní antagonista α-receptorů, blokátor vápníkových kanálů [77], inhibice AChE [78], antagonista dopaminových receptorů D1 a D2 [79] antifungální aktivita [80, 82], antivirotický účinek (poliovirus Sabin
(+)-isoboldin (Obr.7)
II) [81], inhibice AChE, α-glukosidasy, antiprotozoální účinky (Leishmania spp.) [82] antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57], protizánětlivá, antioxidační a hepatoprotektivní aktivita [83] antimutagenní aktivita [84], antiarytmický efekt, vazba na imobilizovanou DNA (efektivní alternativa pro screening a analýzu více DNA-vazebných aktivních látek ve složitých vzorcích, jako jsou přírodní produkty), vazba na β2-adrenoreceptory – nejméně dvěmi vazebnými místy [85], antihyperglykemická aktivita
jatrorrhizin (Obr.8)
– stimulace β-buněk Langerhansových ostrůvků k sekreci inzulínu u krys [86] antifungální aktivita (Colletotrichum gloeosporioides, Gymnosporangium haraeanum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum f.sp. niveum a Mycosphaerella sentina), antimikrobiální aktivita (Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Salmonella typhi, Micrococcus lysodeikticus, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Streptococcus epidermidis, Escherichia coli) [87] ochrana DNA proti poškození a
Tabulka č. 3 pokračování Obsahová látka
Biologická aktivita snížení její fragmentace, podpora vitality renálních epiteliálních
jatrorrhizin (Obr.8)
buněk [88], antiinvazní aktivita proti tumorovým buňkám rakoviny prsu MCF-7/6 [89] inhibice acetylcholinesterasy a butyrylcholinesterasy [90],
(+)-kanadalin (Obr.9)
antimikrobiální aktivita ( Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus sanguis) [91] aktivita antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57], inhibice AChE [90], antioxidační
(+)-kanadin (Obr.10)
aktivita – inhibice peroxidace mikrosomálních lipidů [82] inhibice GABA-transaminasy [93], inhibice cytochromů CYP1A2, CYP2B6, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 [73] aktivita antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57], inhibice BuChE [94], protizánětlivý účinek – inhibice produkce NO a nukleárního faktoru κB v
kolumbamin (Obr.11)
makrofázích RAW 264.7, antinociceptivní účinek [95], antiproliferativní účinek – potlačení proliferace buněk osteosarkomu, inhibice neovaskularizace, invaze a migrace metastázujících buněk U2OS osteosarkomu [96] aktivita anthelmintická (Strongyloides ratti, Strongyloides venezuelensis) [58], antiproliferativní – inhibice proliferace buněk
koptisin (Obr.12)
hladkého svaloviny cév [97, 100], kompetitivní inhibice monoaminooxidasy [98] cytotoxická aktivita k LoVo, L1210 a HT 29 buněčné linii [99], antioxidativní a kardioprotektivní účinek – udržuje integritu buněčné membrány, redukuje apoptózu buněk myokardu, inhibuje RhoA/ROCK expresi [101] aktivita anthelmintická (Strongyloides ratti, Strongyloides
(+)-korydalin (Obr.13)
venezuelensis), cytotoxická [58], inhibice AChE [70], inhibice cytochromů CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19,CYP2D6, CYP3A4 [73]
(+)-korydin (Obr.14)
aktivita antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57], inhibice BuChE [70],
Tabulka č.3 pokračování Obsahová látka (+)-korydin (Obr.14)
Biologická aktivita inhibice cytochromů CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 [73]
(+)-korykavamin
inhibice cytochromů CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C19,
(Obr.15)
CYP2D6, CYP3A4 [73]
(+)-korykavidin (Obr.16) (+)-korypalmin (Obr.17) korysamin (Obr.18)
inhibice BuChE [90], inhibice cytochromů CYP2B6, CYP2C8, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 [73] antihyperlipidemická aktivita [102] cytotoxický účinek na buněčné linie Saso-2, A375 a HeLa [75], antimalarická aktivita (Plasmodium falciparum) [103] antibakteriální účinek – nekompetitivní inhibitor malonyl koenzym
(+)-korytuberin (Obr.19)
A acyl carrier protein acyltransferasy z Helicobacter pylori [105], neuroleptický a antikonvulzivní účinek [106] vysoká afinita k 5-HT1A receptorům [107], antivirový efekt
(+)-N-methyllaurotetanin (Obr.20)
(poliovirus Sabin II) [81], antifungální účinek (Ceratocystis coerulescens, Fusarium oxysporum, Phialophora melinii, Pleurotus ostreatus, Polyporus sulphureus) [108], antioxidační aktivita – inhibice lipidové peroxidace DPPH radikálu [109] protizánětlivá a hepatoprotektivní aktivita [83], antiarytmický efekt, vazba na imobilizovanou DNA (efektivní alternativa pro screening a analýzu více DNA-vazebných aktivních látek ve složitých vzorcích, jako jsou přírodní produkty), vazba na β2-adrenoreceptory – jedno vazebné místo [85], antihyperglykemická aktivita – stimulace β-buněk Langerhansových ostrůvků k sekreci inzulínu u
palmatin (Obr.21)
krys [86], antifungální aktivita (Colletotrichum gloeosporioides, Gymnosporangium haraeanum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum f.sp. niveum a Mycosphaerella sentina, Rhizoctonia solani, Pestalotia mangiferae), antimikrobiální aktivita (Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Salmonella typhi, Micrococcus lysodeikticus, Bacillus cereus, Bacillus megaterium,
Tabulka č.3 pokračování Obsahová látka palmatin (Obr.21)
predicentrin (Obr.|22)
Biologická aktivita Staphylococcus aureus, Streptococcus epidermidis, Escherichia coli) [87] inhibice PAF receptorů [110], slabá cytotoxická a antiplasmodiální aktivita (Plasmodium falciparum) [111] aktivita antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57], anthelmintická (Strongyloides ratti, Strongyloides venezuelensis) [58], antibakteriální ( Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae) [59], antifungální (Microsporum canis, Trychophyton mentagrophytes) [60], cytoprotektivní účinek proti oxidačnímu stresu, inhibice vápníkových, sodíkových a draslíkových kanálů,
protopin (Obr.23)
inhibice cytochromů CYP2D6, CYP2C19, CYP2C8, zvýšení úrovně mRNA CYP1A [61], zvýšení vazby GABA na membránové synaptické receptory [62], inhibice GABA-transaminasy [93], antitrombotický efekt – selektivní inhibice syntézy tromboxanu A2 a PAF, protizánětlivý účinek [112], hepatoprotektivní aktivita [113], inhibice transportu serotoninu a noradrenalinu, inhibice AChE [114], antikancerogenní účinky – polymerizace mikrotubulů vedoucí k aktivaci Cdk1, zpomalení buněčného cyklu a spuštění apoptózy v HRPC buňkách [115]
(-)-sinoakutin (Obr.24)
aktivita antiprotozoální (Plasmodium falciparum, Entamoeba hiystolytica), cytotoxická [57] aktivita antimalarická (Plasmodium falciparum), antiemetická,
(-)-skulerin (Obr.25)
antitussická, antibakteriální, inhibice topoisomerasy I, agonista GABAA receptorů [104] aktivita anthelmintická (Strongyloides ratti, Strongyloides
(-)-stylopin (Obr.26)
venezuelensis), cytotoxická [58], inhibice cytochromů CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 [73]
(±)-tetrahydropalmatin (Obr.27)
aktivita anthelmintická (Strongyloides ratti, Strongyloides venezuelensis), cytotoxická [58], inhibice cytochromů CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 [73], antihypertenzivní,
Tabulka č.3 pokračování Obsahová látka
Biologická aktivita sedativní, hypnotický, neuroprotektivní účinek u krys [116],
(±)-tetrahydropalmatin (Obr.27)
analgetický, anxiolytický účinek na D1/D2 a GABA1 receptory [117], antioxidační aktivita – ochrana buněčné membrány proti lipidové peroxidaci a proteinové oxidaci, ochrana endoteliálních buněk proti γ-záření [118]
4.3.3. Struktura obsahových látek OMe O
O OMe
O
N Me
Obr.2 allokryptopin
Obr.3 berberin
Obr.4 bulbokapnin
Obr.5 dehydroapokavidin
Obr.6 glaucin
Obr.7 (+)-isoboldin
Obr.8 jatrorrhizin
Obr.9 (+)-kanadalin
Obr.10 (+)-kanadin
Obr.11 kolumbamin
O
O
O
N+ X-
O
Obr.12 koptisin
Obr.13 (+)-korydalin
Obr.14 (+)-korydin
Obr.15 (+)-korykavamin
Obr.16 (+)-korykavidin
Obr.17 (+)-korypalmin
Obr.18 korysamin
Obr.19 (+)-korytuberin
OMe MeO
MeO
HO
N H Me
Obr.20 (+)-N-methyllaurotetanin
Obr.21 palmatin
OH MeO
MeO
MeO
N H Me
Obr.22 predicentrin
Obr.23 protopin
Me N O
OMe
OH OMe
Obr.24 (-)-sinoakutin
Obr.25 (-)-skulerin
Obr.26 (-)-stylopin
Obr.27 (±)-tetrahydropalmatin
5. Metody stanovení cholinesterasové inhibice Bylo vyvinuto mnoho metod pro stanovení inhibiční aktivity ChE. Většina je založena na spektrofotometrických, fluorimetrických, hmotnostně-spektrometrických a elektrochemických principech. Vzhledem k vývoji nových materiálů a technik došlo k rozvoji různých testů pro stanovení inhibice ChE [119].
5.1. Metody založené na spektrofotometrické detekci Spektrofotometrické stanovení stále patří k převládajícím metodám pro stanovení ChE inhibice. Nepochybně nejrozšířeněji používaným testem pro stanovení ChE inhibice je Ellmanova metoda. Tento test je založen na hydrolýze thiocholinu [acetylthiocholinu (ATCh) a butyrylthiocholinu (BTCh)], AChE nebo BuChE hydrolyticky štěpí substrát ATCh nebo BTCh na thiocholin a příslušnou kyselinu. Thiocholin reaguje s 5,5´-dithio-2-bis-
nitrobenzoovou kyselinou (DTNB) a dochází k uvolnění 5-merkapto-2-nitrobenzoového aniontu (TNB-). Ten je poté spektrofotometricky stanoven při vlnové délce 412 nm. Nevýhodou Ellmanovy metody je interference s hemoglobinem při měření inhibice AChE. Tento problém se dá korigovat měřením absorbance při vlnové délce 436 nm [119, 120].
5.2. Metody založené na fluorimetrické detekci Fluorimetrické metody se vyznačují vyšší senzitivitou a nižším detekčním limitem. Obecně se jedná o několik řádů citlivější metody než odpovídající chromogenní testy. Fluorescenční činidla se vyznačují vysokým stupněm stability, dlouhou životností fluorescenční intenzity a širokým rozmezím excitační vlnové délky. Ke stanovení inhibice ChE lze použít dva nefluorescenční substráty, resorufin butyrát a indoxyl acetát, které se po hydrolýze ChE přeměňují na vysoce fluoreskující látky – resorufin, 3-hydroxyindol. Rychlost hydrolýzy indoxyl acetátu je mnohem rychlejší než resorfin butyrátu, má větší stabilitu vůči spontánní hydrolýze a větší rozdíl mezi excitační a emisní vlnovou délkou. Resorufin se vyznačuje výraznější fluorescencí a lze tedy použít menší množství substrátu pro reakci [119]. Parvari et al. vyvinul vysoce citlivou mikrofluoresceční metodu, kdy thiocholin, vycházející z enzymatické hydrolýzy ATCh, reaguje s fluorogenní látkou N-[4-(7diethylamino-4-methylkumarin-3-yl)]-fenylimidem kyseliny jablečné za vzniku intenzivní fluorescence. Výhodou tohoto testu je široká lineární přesnost a citlivost [119]. Další možností stanovení je použití Amplex Red Acetylcholin/AChE kitu, který je ultrasenzitivní metodou pro stanovené AChE aktivity. Tento test obsahuje činidlo 10-acetyl-3,7-dihydroxyfenoxazin (Amplex Red činidlo), který je velmi citlivý k peroxidu vodíku. Nejprve je acetylcholin hydrolyzován AChE za vzniku cholinu, který je oxidován cholinoxidasou na betain a peroxid vodíku. Peroxid vodíku v přítomnosti křenové peroxidasy reaguje s Amplex Red činidlem za vzniku vysoce fluoreskujícího produktu resorufinu [119].
5.3. Metody založené na hmotnostní spektrometrii Tyto metody využívají často tandemového spojení HPLC/MS. Činnost AChE je měřena pomocí post column testu, kdy se smíchá AChE s acetylcholinem a eluátem z HPLC kolony. Inhibitory AChE jsou detekovány měřením poklesu formace produktu pomocí ESI v hmotnostním spektrometru. Tandemové spojení HPLC/MS/MS se také využívá pro stanovení rivastigminu a jeho hlavního metabolitu NAP 226-90 ve farmakologických klinických studiích [119, 121].
6. Experimentální část 6.1. Obecné postupy 6.1.1 Příprava a čištění rozpouštědel Všechna používaná rozpouštědla, která jsou komerčně dostupná, byla před použitím přečištěna destilací. Destilace probíhala podle standardních postupů a hlavní frakce byly jímány podle tabulárních hodnot teploty varu [125]. 6.1.2. Odpařování extraktů a frakcí, jejich sušení a skladování Sumární ethanolový extrakt z hlíz dymnivky duté byl odpařen na vakuové odparce při 50 ºC a tlaku cca 1,33 kPa, frakce získané z chromatografických sloupců a preparativní TLC byly odpařeny na vakuové odparce při teplotě do 40 ºC [55]. Odparky sumárních ethanolových extraktů a alkaloidních bazí určené pro měření biologické aktivity byly rychle odpařovány v injekčních ampulkách o objemu 5 ml v proudu filtrovaného vzduchu na vodní lázni při teplotě do 60 °C. Po odpaření rozpouštědel byly ampulky se vzorky přeneseny do exsikátoru a sušeny ve vakuu při tlaku cca 1,33 kPa nad perlami silikagelu po dobu 24 hodin. Poté byl do ampulek napuštěn argon, ty byly zataveny a uchovány v chladu při 2 – 8 °C do doby analýzy. 6.1.3. Rostlinný materiál Sušené hlízy Corydalis cava (Fumariaceae) byly dodány firmou Megafyt s. r. o., (Vrané nad Vltavou, 04/2006). Droga pochází ze sběru firmy Jugodrvo (Chorvatsko), verifikace Prof. RNDr. Lubomír Opletal, CSc. [55]. 6.1.4. Tenkovrstvá chromatografie Tenkovrstvá chromatografie byla prováděna v chromatografických komorách a sycení komor mobilní fází probíhalo cca 30 minut. 6.1.5. Detekce alkaloidů po TLC Pro zjištění přítomnosti alkaloidů ve frakcích získaných sloupcovou chromatografií nebo čistoty izolovaných alkaloidů byla použita detekce v oblasti UV světla (λ = 254 a 366 nm ) následovaná postřikem detekčním Dragendorffovým činidlem [55]. 6.1.6. Příprava sloupcové chromatografie se silikagelem Chromatografický sloupec byl připraven postupným naléváním suspenze silikagelu v mobilní fázi při částečně otevřeném kohoutu. Chromatografovaná směs látek byla nanesena na kolonu na usazený adsorbent ve formě roztěru, který byl připraven rozpuštěním extraktu
v chloroformu a přidáním malého množství adsorbentu (poměr směs : adsorbent 1:3). Ze vzniklé suspenze bylo na vodní lázni odpařeno rozpouštědlo a roztěr byl dosušen v exsikátoru za sníženého tlaku po dobu 24 hodin před aplikací na kolonu [55]. 6.1.7. Příprava litých vrstev pro preparativní TLC Preparativní TLC lité vrstvy byly připraveny nalitím suspenze, obsahující komerční silikagel v množství 29 mg adsorbentu/cm2 a 0,18 ml vody/cm2 plochy chromatografické desky, na skleněné desky se zdrsněným povrchem, které se nechaly schnout 24 hodin před použitím. 6.1.8. Příprava alkaloidních koncentrátů pro izolaci Alkaloidní koncentráty byly připraveny z rostlinného materiálu vytřepáváním alkaloidů organickými rozpouštědly z vodných roztoků o rozdílném pH (nebazické alkaloidy; terciární baze střední bazicity (pH ~ 9); silně bazické alkaloidy (pH > 12) vytřepatelné diethyletherem a chloroformem; jodidy kvartérních bazí ze slabě kyselého prostředí, jodidy kvartérních bazí ze slabě alkalického prostředí [55].
6.2. Materiál 6.2.1. Chemikálie acetylthiocholin jodid p. a. (Sigma-Adrich) butyrylthiocholin jodid p. a. (Sigma-Adrich) chlorid sodný p. a. (Penta) (NaCl) dihydrogenfosforečnan sodný p. a. (Penta) (NaH2PO4) diethylamin p. a (LachNer) (Et2NH) dimethylsulfoxid p. a. (Sigma-Adrich) (DMSO) 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina ≥ 98% (Sigma-Aldrich) dusičnan bizmutitý zásaditý č. (LachNer) fysostigmin 99% (Sigma-Adrich) galanthamin hydrobromid ≥ 95% (Changsha Organic Herb Inc., China) huperzin A ≥ 95% (TAZHONGHUI – Tai'an Zhonghui Plant Biochemical Co., Ltd.)
hydrogenfosforečnan dvojsodný dodekahydrát p. a. (Penta) (Na2PO4.12 H2O) jodid draselný p. a. (Penta a.s., ing. Švec) (KI) L-vinná kyselina p. a. (Penta a.s., ing Švec) uhličitan sodný č. bezvodý (Penta) (Na2CO3) 6.2.2. Rozpouštědla aceton p. a. (Penta a. s., ing Švec) (CH3COCH3) benzen p. a. (LachNer) (C6H6) benzin lékařský lékopisné kvality ČL 2009 (Penta a.s., ing. Švec) chloroform p. a. (Penta a.s., ing. Švec) (CHCl3) cyklohexan p. a. (Penta a.s., ing. Švec) (C6H12) deuterizovaný chloroform pro NMR (Sigma-Adrich) (CDCl3) diethylether č. (LachNer) (Et2O) ethanol 95% (lihovar Chrudim) (EtOH) ethyl-acetát p. a. (Penta a.s., ing. Švec) (EtOAc) n-hexan p. a. (Penta a.s., ing. Švec) (C6H14) kyselina fosforečná 85% (Sigma-Aldrich) (H3PO4) kyselina octová 99% (Sigma-Aldrich) (AcOH) kyselina sírová 99% (Penta a.s., ing. Švec) (H2SO4) methanol p. a. (Sigma-Adrich) (MeOH) toluen p. a. (Penta a.s., ing. Švec) (C6H5CH3) 6.2.3. Pufry 6.2.3.1. 5mM Fosfátový pufr pH 7,4 Zásobní roztok A - 10 mM roztok NaH2PO4 (1 litr roztoku obsahuje 1,20 g NaH2PO4, nebo 1,38 g NaH2PO4.H2O, nebo 1,56 g NaH2PO4.2 H2O).
Zásobní roztok B - 10 mM roztok Na2HPO4 (1 litr roztoku obsahuje 1,42 g Na2HPO4, nebo 1,78 g Na2HPO4.2H2O, nebo 3,58 g Na2HPO4.12 H2O. Smíchá se 57 ml roztoku A s 283 ml roztoku B a 300 ml vody. 6.2.3.2. 5mM Fosfátový pufr pH 7,4 obsahující 150 mM NaCl 8,766 g NaCl p. a. se rozpustí v 5mM fosfátovém pufru pH 7,4 a doplní se jím do 1000 ml. 6.2.3.3. 100mM Fosfátový pufr, pH 7,4 Zásobní roztok A - 200 mM roztok NaH2PO4 /1 litr roztoku obsahuje 24,0 g NaH2PO4, nebo 27,6 g NaH2PO4.H2O, nebo 31,2 g NaH2PO4. 2 H2O). Zásobní roztok B - 200 mM roztok Na2HPO4 (1 litr roztoku obsahuje 28,4 g Na2HPO4, nebo 35,6 g Na2HPO4. 2 H2O, nebo 71,63 g Na2HPO4.12 H2O). Smíchá se 57 ml roztoku A s 243 ml roztoku B a 300 ml vody. 6.2.5. Chromatografické adsorbenty sloupcová chromatografie: silikagel (Sigma-Aldrich) Silikagel Fluka 0,063 – 0,20 mm byl před použitím přečištěn chloroformem a ethanolem a následně vysušen. Přečištěný silikagel byl aktivován v sušárně po dobu 4 hodin při teplotě 160 ºC (tloušťka vrstvy silikagelu nepřesáhla 20 mm). Aktivovaný vychladlý silikagel byl poté desaktivován mícháním s přídavkem vody po dobu 1 hodiny. Silikagel pro sloupcovou chromatografii obsahoval 10 % vody (w/w ) [55]. analytická TLC: Kieselgel 60 F254 fuer TLC desky 20×20 cm (Merck) preparativní TLC: (nalévané desky se silikagelem): Kieselgel 60 GF254 (Merck) 6.2.6. Vyvíjecí soustavy pro tenkovrstvou chromatografii (TLC) S1: C6H5CH3 + CHCl3 + EtOH + Et2NH (70:20:10:3) S2: C6H5CH3 + Et2NH (95:5) S3: C6H12 + Et2NH (9:1) S4: C6H6 + C6H5CH3 + Et2NH (8:2:1)
6.2.7. Pomocné materiály, roztoky a činidla křemelina Celite C 535 John´s Manville (Sigma-Aldrich) silikagel sušicí perly (Penta a.s., ing. Švec) síran sodný bezvodý č. (Penta) (Na2SO4) Dragendorffovo činidlo - byl připraven zásobní roztok, který vznikl smísením roztoků A (1,7 g bazického dusičnanu bizmutitého a 20 g kyseliny vinné bylo rozpuštěno v 80 ml vody) a B (16 g jodidu draselného bylo rozpuštěno ve 40 ml vody); oba roztoky byly smíchány v poměru 1:1 (v/v). Postřik pro detekci byl připraven smísením 5 ml zásobního roztoku s 50 ml vody obsahující 10 g kyseliny vinné. V přítomnosti alkaloidů bylo zaznamenáno oranžové zabarvení [55]. 6.2.8. Přístroje a software Centrifuga Avanti J-30I s rotorem JA-30.50 (Beckman Coulter, Brea, California, USA) Mikrovýhřevný stolek BOETIUS (Miw Wägetechnik Rapido, Dresden, Germany) Centrifuga Boeco U-32R (Boeco, Hamburg, Germany) s rotorem Hettich 1611 (Hettich, Tuttlingen, Germany) pH metr PHM 220 (Radiometer, Copenhagen, Denmark) polarimetr ADP 220 BS polarimeter (Bellingham + Stanley Ltd., Kent, UK) Reader Bios II (Biotech, CZ) Spektrometr ESI-MS Thermo Finnigan LCQDuo (GenTech Scientific, Inc., New York, USA) spektrometry Varian VNMRS500 a Varian VNMRS500 (Varian, Palo Alto, California, USA) ultrazvuková lázeň Sonorex Super 10P (Bandelin, Berlin, Germany) vakuová odparka Büchu Rotavapor R-114 (Büchi, Flawil, Switzerland) vakuová odparka pro poloprovozní použití Laborota 20 Heidolph (Heidolph, Germany) statistický program GraphPad Prism 6.0 2012 (GraphPaD Software, San Diego, CA, USA)
6.3 Izolace alkaloidů 6.3.1 Screening cholinesterasové inhibiční aktivity alkaloidů dymnivky duté: bioguided assay využívající Ellmanovu metodu Obsahové látky dymnivky duté byly vybrány pro bližší studium cholinesterasové inhibiční aktivity na základě rešerše a výsledků disertační práce PharmDr. Jakuba Chlebka Ph.D, ze které také tato diplomová práce vychází a navazuje na ni. Podle dosažených výsledků této disertační práce alkaloidní výtřepky z hlíz dymnivky duté vykazovaly významnou cholinesterasovou inhibiční aktivitu [55]. Tato část byla prováděna mimo rámec mé diplomové práce. 6.3.1.1 Příprava sumárního alkaloidního extraktu pro screening Ze sušených hlíz dymnivky duté byl připraven alkaloidní extrakt podle následujícího postupu: suché, rozdrobněné hlízy (velikost částic 1 – 2 mm o celkové hmotnosti 4,30 g) byly vsypány do Erlenmayerovy baňky a přelity 95% EtOH (w/v poměr 1:7) a droga byla extrahována varem pod zpětným chladičem na vodní lázni po dobu 15 minut. Poté byl extrakt ponechán vychladnout a sedimentovat a kapalina byla zfiltrována přes vliselin. Tento proces se byl proveden 2×. Sediment s drogou byl poté překryt vrstvou EtOH a sonikován po 10 minut při normální teplotě a stupni sonikace 10 na ultrazvukové lázni. Směs byla opět zfiltrována přes vliselin a spojené etanolové filtráty přefiltrovány přes křemelinu ve filtračním tubusu. Čirý filtrát byl zahuštěn do řídkého extraktu, bylo přidáno 10 ml vody a na vakuové odparce byl odpařen zbytek EtOH. Odparek extraktu byl zředěn 10 ml 2% H2SO4 a tato suspenze byla sonikována na ultrazvukové lázni po dobu 5 minut při normální teplotě při stupni sonikace 10. Zkalená tekutina byla zfiltrována přes vrstvu křemeliny a ta byla násladně promyta 10 ml vody. Čiré kyselé filtráty byly spojeny, objem byl doplněn vodou na 50 ml a 2× vytřepán 10 ml Et2O. Diethyletherová vrstva byla oddělena a odložena, vodná fáze byla zalkalizována 10% Na2CO3 na pH ~ 9 – 10 a vytřepána 3× 15 ml EtOAc. Ethyl-acetátová vrstva byla oddělena, organické výtřepky byly spojeny a bylo k nim přidáno 2,5 g bezvodého Na2SO4. Po vyčeření byla tato organická fáze zfiltrována ve filtračním tubusu přes vatu a čirý filtrát byl odpařen dosucha na vakuové odparce při 40 °C a odparek byl dosušen v exsikátoru po dobu 24 hodin. Celkové množství alkaloidního extraktu bylo 180,3 mg [55, 126]. 6.3.1.2 Cholinesterasová aktivita sumárního alkaloidního extraktu Ze sumárního alkaloidního extraktu bylo odebráno potřebné množství extraktu, které bylo zředěno DMSO na roztoky o koncentraci (20,0; 2,0; 0,2; 0,02; 0,002 mg/ml) použité při
měření pro zjištění hodnoty IC50 sumárního extraktu modifikovanou Ellmanovou metodou. Hodnoty IC50 byly vypočítány z naměřených hodnot poklesu aktivity AChE a BuChE nelineární regresí v programu GraphPad Prism. Vypočtené hodnoty IC50 byly porovnány s hodnotami
známých
inhibitorů
cholinesteras:
galanthaminem,
fysostigminem
a
huperzinem A [55]. 6.3.2 Izolace isochinolinových alkaloidů pro biologické testy 6.3.2.1 Příprava alkaloidních koncentrátů Alkaloidy z hlíz dymnivky duté byly rozděleny na alkaloidní koncentráty obsahující alkaloidy o rozdílné bazicitě, které byly získané vytřepáváním alkaloidního extraktu organickými rozpouštědly z vodných roztoků o rozdílném pH dle Slavíka [122]. 11,3 kg suchých hlíz dymnivky duté bylo perkolováno 95% EtOH (1:10), extrakt byl zahuštěn do řídkého sirupu, bylo přidáno 5 litrů 1,5% H2SO4, suspenze byla promíchána a zfiltrována přes křemelinu a po promytí vodou byl roztok doplněn vodou na objem 8,8 litrů. Roztok byl po částech 3× vytřepán 2,2 litry Et2O (nealkaloidní výtřepek L), poté byl zalkalizován 10% Na2CO3 na pH ~ 9 – 10 a vytřepán 4×2,9 litry Et2O (alkaloidní výtřepek A). Vodná fáze byla dekantována od nerozpustného pryskyřicového podílu, zalkalizována 50% NaOH na pH ~12 a roztok byl vytřepán 4×2,7 litry Et2O (alkaloidní výtřepek B-Et2O) a poté 4×2,7 litry CHCl3 (alkaloidní výtřepek B-CHCl3). Louhový zbytek byl zneutralizován HCl a pH ~ 2, zfiltrována bylo přidáno 2,1 litru 2% vodného roztku reineckátu amonného. Po 15 hodinách stání byla provedena dekantace, okrová sraženina byla oddělena na papírovém filtru promyta vodou a vysušena (alkaloidní koncentrát Q) [55].
Tabulka č. 4 Popis alkaloidních koncentrátů
extrakt
hmotnost (g)
vzhled
výtřepek L
3,3
černý, viskózní
výtřepek A
279,0
hnědozelený, hrubě krystalický
výtřepek B-Et2O
9,7
žlutohnědý
výtřepek B-CHCl3
80,0
hnědý, velmi viskózní
alkaloidní koncentrát Q
87,7
okrový prášek
Pro bližší studium inhibiční cholinesterasové aktivity byl pro izolaci alkaloidů vybrán alkaloidní výtřepek A s obsahem terciárních bazí, který vykazoval v předpokusu signifikantní inhibiční cholinesterasovou aktivitu. Alkaloidní výtřepek A byl před separací na chromatografickém sloupci přečištěn. Odparek byl rozpuštěn při ~ 40 °C ve 2,5 litrech 1,5% H2SO4, zfiltrován přes křemelinu a doplněn vodou na objem 3 litry, zalkalizován 10% Na2CO3 na pH ~ 9 – 10 a následně byl vytřepán 7×900 ml Et2O a organická fáze byla zahuštěna na ~ 1 litr. Po zchladnutí byly odfiltrovány šedavé pískovité krystaly, matečný louh byl odpařen dosucha. Celkově bylo z alkaloidního výtřepku A získáno 200 g přečištěného, silně viskózního, tmavého odparku [55]. 6.3.2.2 Separace alkaloidního výtřepku A na chromatografickém sloupci Přečištěný diethyletherový výtřepek A byl separován preparativní sloupcovou chromatografií obvyklým způsobem, jako stacionární fáze byl použit silikagel (Fluka, zrnitost 0,063 – 0,20 mm, 4,5 kg absorbentu desaktivovaného 10 % vody, dělící vrstva sloupce: Ø×výška = 10×115 cm), se stupňovitým způsobem eluce. Eluce byla provedena následující řadou směsí rozpouštědel: C6H14+CHCl3 (90:10, 40:60, 50:50) a pokračovala směsí CHCl3+EtOH (99:1, 97:3, 95:5, 90:10, 85:15, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 50:50). Každá frakce měla objem 500 ml; celkem bylo získáno 142 frakcí, které byly kontrolní TLC (vyvíjecí soustava S1) spojeny do 7 souhrných frakcí (A-G). Frakce B (65 g) byla získána sloupcovou chromatografií směsí rozpouštědel C6H14+CHCl3 v poměru 40:60 a dále zpracována sloupcovou chromatografií se silikagelem (absorbent 1,95 kg, dělící vrstva sloupce: Ø×výška = 8×78 cm) postupnou stupňovitou elucí směsí C6H12+CHCl3 (1:1, 2:3, 1:4, 1:9). Každá frakce měla objem 250 ml; celkem bylo získáno 94 frakcí, které byly kontrolní TLC (vyvíjecí soustava S2) spojeny na 3 podfrakce (B/1 – B/3). Z podfrakce B/2 (38 g) byl opakovanou krystalizací ze směsi CHCl3+EtOH vyizolován (+)-tetrahydropalmatin (29,3 g) a matečný louh (8,7 g) dále zpracován. 6.3.2.3. Izolace alkaloidů z matečného louhu podfrakce B/2 (vlastní práce) Z matečného louhu podfrakce B/2 (8,7 g) byly odebrány celkem 4 g hnědého sirupovitého odparku, který byl rozpuštěn ve směsi CHCl3+EtOH (1:1) a zpracován preparativní TLC:
Tabulka č. 5 Zpracování části matečného louhu podfrakce B/2 – parametry preparativní TLC Kieselgel 60 GF 254 Merck (0,29 mg/cm2)
adsorbent
rozměr: 9×15 cm
desky
počet: 132
soustava
S3: C6H12 + Et2NH (9:1)
vyvíjení
1,5×
dráha
8 cm
Dělení látek bylo sledováno po vysušení desek pod UV světlem (λ= 254 a 366 nm); byly zjištěny tři zóny: Tabulka č. 6 Výsledky preparativní TLC zóna
RF
1 (BK-1)
0,51
2 (BK-2)
0,42
3 (BK-3)
0,40
eluce CHCl3+EtOH (1:1), 250 ml CHCl3+EtOH (1:1), 250 ml CHCl3+EtOH (1:1), 250 ml
hmotnost odparku 0,715
0,805
0,072
vzhled
žlutý prášek žlutohnědý prášek žlutohnědý prášek
Protože nedošlo k dokonalému rozdělení látek BK-2 a BK-3 v zónách 2 a 3 vzhledem k blízkým hodnotám RF, byla proveden opakovaná preparativní TLC za následujících podmínek: Tabulka č. 7 Zpracování části matečného louhu podfrakce B/2 – parametry preparativní TLC adsorbent
Kieselgel 60 GF 254 Merck (0,29 mg/cm2 desky) rozměr: 12×15 cm
desky
počet: 40
soustava
S4: C6H6 + CH3COCH3 + Et2NH (8:2:1)
vyvíjení
1,5×
dráha
11cm
Směs se na deskách rozdělila na dvě zóny BK-2 (RF = 0,81) a BK-3 (RF = 0,66), Adsorbent z těchto zón byl separován, vsypán do chromatografických sloupců patřičného objemu a eluován směsí CHCl3+EtOH (1:1). Po odpaření vzniklo 664 mg látky BK-2 a 64 mg látky BK-3. Všechny tři látky byly přečištěny krystalizací za následujících podmínek: Tabulka č. 8 Výsledky krystalizace izolovaných látek
látka
výchozí
rozpouštědla
výtěžek (mg)
popis
množství (mg) BK-1
715
CHCl3+EtOH
284
BK-2
664
CHCl3+EtOH
308
BK-3
66
CHCl3+EtOH
29
žlutá krystalická látka nažloutlá, jemně krystalická látka žlutá krystalická látka
6.4. Stanovení inhibiční aktivity alkaloidů vůči acetylcholinesterase a butyrylcholinesterase 6.4.1. Příprava erytrocytárních pouzder Zdrojem AChE byla pouzdra lidských erytrocytů, jako zdroj BuChE byla použita lidská plazma. Z čerstvě odebrané krve zdravých dobrovolníků byla připravena erytrocytární pouzdra. Ke krvi byl přidán 1 ml citrátu sodného na 9 ml krve podle upravené metody Stecka a Kanta [123]. Plazma byla získána centrifugací plné krve při rychlosti 4000 ot.min-1 na centrifuze Boeco U-32R s rotorem Hettich 1611. Do 50 ml zkumavek byly napipetovány erytrocyty a byly 3× promyty 5mM fosfátovým pufrem (pH 7,4) obsahujícím 150 mM NaCl (12 000 ot.min-1, centrifuga Avanti J-301, rotor JA-30.50). Promyté erytrocyty byly míchány s 5mM fosfátového pufru (pH 7,4) po dobu 10 minut, což vedlo k jejich lýze. Poté byly centrifugovány při rychlosti 20 000 ot.min-1 a získaná pouzdra byla 3× promyta fosfátovým pufrem a dispergována v 5mM fosfátovém pufru pH 7,4, aby při referenčním měření se substrátem (ATChI) byla v tomto slepém vzorku A= 0,12 – 0,15.
6.4.2. Stanovení inhibiční aktivity AChE a BuChE Ke stanovení inhibiční cholinesterasové aktivity byla použita spektrofotometrická Ellmanova metoda, která využívá 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoovou kyselinu (DTNB) [127] a substráty acetylthiocholinjodid (ATChI) a butyrylthiocholinjodid (BuTChI) [119, 120]. Do jamek mikrotitrační destičky bylo přidáno 8,3 µl erytrocytárních pouzder (pro stanovení AChE) nebo plazmy (pro stanovení BuChE), 5mM 283 µl DTNB, 8,3 µl roztoku extraktů v DMSO o klesající koncentraci nebo jen DMSO v případě slepého vzorku. Směs byla promíchána na třepačce po dobu 1 minuty, 5 minut inkubována při 37 °C, poté byl do všech jamek napipetován příslušný substrát (10mM) o objemu 33,3 µl. Přidávané roztoky měřené látky měly koncentraci (40,0; 10,0; 4,0; 1,0; 0,4 mM, případně nižší). Měření absorbance bylo provedeno při 37 °C, vlnové délce 436 nm pro pouzdra a 412 nm pro plazmu v kinetickém modu po dobu 1 minuty. Každé měření bylo provedeno 3×. Výpočet hodnoty IC50 byl proveden za pomoci programu GraphPad Prism. Výsledná hodnota IC50 byla porovnána s referenčními látkami (huperzinem, galanthaminem, fysostigminem). Inhibice (% I) byla vypočtena podle vzorce: % I = 100 – (∆ABL/∆ASA) x 100 kde ∆ABL je nárůst absorbance slepého vzorku za 1 minutu a ∆ASA je nárůst absorbance měřeného vzorku.
7. Výsledky 7.1. Cholinesterasová inhibiční aktivita sumárního alkaloidního extraktu Tabulka č.9 Cholinesterasová inhibičí aktivita primárního alkaloidního extraktu Corydalis cava
IC50
testovaný vzorek
AChE
BuChE
alkaloidní extrakt
91,47 ± 4,57*
26,50 ± 1,35*
(-)-galanthamin
1,710 ± 0,065
42,30 ± 1,30
huperzin A
0,033 ± 0,001
>1000
fysostigmin
0,063±0,001
0,130±0,004
* hodnoty IC50 jsou v případě alkaloidního extraktu uvedeny v µg/ml, v případě referenčních látek v µM.
7.2. Struktura izolovaných alkaloidů Na základě výsledků GC/MS a H1 a C13 NMR analýzy a porovnání získaných údajů s literaturou byly izolované látky stanoveny jako (+)-kanadin, (+)-tetrahydropalmatin a domestin. 7.2.1. (+)-kanadin (BK-1)
Obr.10 (+)-kanadin
Tmavě žlutá, jemně krystalická látka bez zápachu, t.t. 130 – 132 °C 7.2.1.1. MS analýza ESI-MS m/z [M+H]+ 340,25 (100); 336,32 (4). MS/MS m/z 323,07 (7); 204,15 (4); 176,18 (100); 149,07 (9).
7.2.1.2. NMR analýza 1
H NMR (CDCl3, 25 °C): δ 6,86 (1H, d, J = 8,3 Hz); 6,79 (1H, d, J = 8,3 Hz); 6,72 (1H, s);
6,59 (1H,s); 5,91 (2H, s); 4,25 (1H, d, J = 15,8 Hz); 3,85 (3H, s); 3,84 (3H, s); 3,56 (2H, d, J = 14,1 Hz); 3,10-3,26 (3H, m); 2,80-2,89 (1H, m); 2,61-2,71 (2H, m). 13
C NMR (CDCl3, 25 °C): δ 150,3; 146,2; 146,0; 145,0; 130,5; 128,3; 127,6; 127,5; 123,9;
111,0; 108,4; 105,5; 100,8; 60,2; 59,6; 55,9; 53,8; 51,3; 36,2; 29,4. 7.2.1.3. Optická otáčivost [α]24 = +241° (c 0,0228, CHCl3). 7.2.2. (+)-tetrahydropalmatin (BK-2)
Obr.27 (+)-tetrahydropalmatin
Nažloutlá, jemně krystalická látka, t.t. 141 – 143 °C 7.2.2.1. MS analýza ESI-MS m/z [M+H]+ 326 (100); 295 (37). MS/MS m/z 295,1 (100); 263,1 (14); 235,1 (5). 7.2.2.2. NMR analýza 1
H NMR (CDCl3, 25 °C): δ 6,88 (1H, d, J = 8,4 Hz); 6,81 (1H, d, J = 8,4 Hz); 6,74 (1H, s);
6,63 (1H, s); 4,26 (1H, d, J = 15,6 Hz); 3,89 (3H, s); 3,87 (3H.s); 3,86 (3H, s); 3,85 (3H, s); 3,59 (1H, bs); 3,56 (1H, bs); 3,27 (1H, d, J = 15,8 Hz, J = 3,6 Hz); 3,22 (1H, bs); 3,17 (1H, bs); 2,86 (1H, bs); 2,69 (1H, bs); 2,66 (1H, bs). 13
C NMR (CDCl3, 25 °C): δ 150,5; 147,8; 147,7; 145,3; 129,8; 128,8; 127,9; 126,9; 124,1;
111,6; 111,3; 108,8; 60,4; 59,5; 56,3; 56,1; 54,2; 51,7; 36,5; 29,2. 7.2.2.3. Optická otáčivost 25
[α] = +264° (c 0,212, MeOH).
7.2.3. domestin (BK-3)
Obr.28 (+)-domestin
Žlutá krystalická látka, t.t. 137 – 138°C 7.2.3.1. MS analýza ESI-MS m/z [M+H]+ 338 (99), 339 (78). MS/MS m/z 324 (39); 308 (35); 296 (13,4); 265 (24,8). 7.2.3.2. NMR analýza 1
H NMR (500MHz, CDCl3): 7,92 (1H, s, H11); 6,75 (1H, s, H8); 6,59 (1H, s, H3); 5,92 (2H,
dd, J = 7,3; 1,5 Hz); 3,87 (3H, s, C2-O-CH3); 3,65 (3H, s, C1-O-CH3); 3,26-3,15 (1H, m, H4); 3,13-3,03 (2H, m, H5, H6a); 2,98 (1H, dd, J = 14,3; 4,0 Hz, H7); 2,69 (dd, 1H, J = 16,3; 3,0 Hz, H4); 2,65-2,58 (2H, m, H5, H7); 2,57 (3H, s, N-CH3). 13
C NMR (125MHz, CDCl3): 152,1; 146,6; 146,4; 144,6; 130,4; 128,2; 127,0; 126,4; 125,4;
110,6; 108,9; 108,2; 100,9; 62,4; 60,2; 55,8; 53,0; 43,5; 34,7; 28,7.
7.3. Cholinesterasová inhibiční aktivita izolovaných látek U izolovaných alkaloidů byla změřena inhibiční aktivita na lidskou erytrocytární AChE a plazmatickou BuChE. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. Tabulka č. 10 Cholinesterasová inhibiční aktivita izolovaných látek označení sloučenina IC50 (µM) AChE BuChE BK-1 (+)-kanadin 12,4 ± 0,9 483,0 ± 11,5 BK-2 (+)-tetrahydropalmatin 876,0 ± 15,3 >1000 BK-3 (?)-domestin 400,66 ± 13,92 264,7 ± 45,33 referenční látka (-)-galanthamin 1,710 ± 0,065 42,30 ± 1,30
8. Diskuze V rámci své diplomové práce jsem izolovala 3 látky (BK-1, BK-2 a BK-3) z podfrakce B/2 diethyletherového výtřepku, připraveného z upraveného primárního ethanolového extraktu z hlíz dymnivky duté. Byly určeny základní fyzikálně-chemické vlastnosti izolovaných látek a na základě výsledků GC/MS a 1H a 13C NMR analýzy byly identifikovány jako (+)-kanadin, (+)-tetrahydropalmatin a domestin. Absolutní konfiguraci domestinu se nepodařilo změřit, vzhledem k nízkému výtěžku, ale bude zjištěna optickou otáčivostí, až bude vyizolován další podíl látky. S vysokou pravděpodobností se jedná o (+)-domestin a z tohoto hlediska je dále diskutován. Všechny tři látky byly již dříve z hlíz dymnivky duté izolovány a popsány jinými autory. Jedná se o isochinolinové alkaloidy; (+)-kanadin a (+)-tetrahydropalmatin se strukturně řadí mezi protoberberinové alkaloidy, zatímco domestin je alkaloidem aporfinového typu. Tyto alkaloidy byly studovány z hlediska inhibiční aktivity na AChE a BuChE, protože toto studium je hlavní náplní výzkumné činnosti ADINACO Research Group pracující na katedře farmaceutické botaniky a ekologie. Bylo zjištěno, že nejaktivnějším alkaloidem z hlediska inhibice AChE je (+)-kanadin (HuAChE = 12,4 µM), avšak jeho aktivita vůči HuBuChE byla nízká (483,0 µM). Zbývající dva alkaloidy byly velmi málo aktivní jak vůči HuAChE (876,0 µM = (+)-tetrahydropalmatin, 400,6 µM = domestin), tak vůči HuBuChE (>1000 = (+)-tetrahydropalmatin, 264,7 = domestin). Tato skutečnost však není vůbec na závadu, protože všechny izolované alkaloidy jsou dále podrobeny testům na inhibici β-sekretasy, prolylendopeptidasy, anti-ROS aktivitě a následně vůči agregaci Abeta1-42 a inhibici GSK3-β. Při preparativním dělení směsi všech tří alkaloidů pomocí TLC (preparativní lité vrstvy, Merck, Kieselgel 60 GF254) jsem zjistila poměrně kuriózní záležitost. Při použití soustavy cyklohexan+diethylamin (9:1) došlo k velmi dobrému oddělení (+)-kanadinu a (+)-tetrahydropalmatinu, ačkoliv obě látky jsou protoberberiny velmi podobné struktury. Naopak nedošlo k oddělení (+)-tetrahydropalmatinu a domestinu, jakkoliv je struktura obou látek výrazně odlišná. Z literatury je známo, že všechny 3 alkaloidy vykazují účinky na CNS a z tohoto hlediska jsou také sledovány:
(+)-Kanadin vykazuje sedativní efekt na CNS, z důvodu inhibice na D1/D2 receptorech dopaminergního systému a vystupuje jako nekompetitivní inhibitor dopaminu [128]. Dále (+)-kanadin vykazuje inhibici AChE, což bylo potvrzeno i v mé práci a také inhibuje GABA-transaminasu, která má za úkol katabolismus GABA. Její inhibicí dochází ke zvýšení množství GABA pro neurotransmisi, což může mít pozitivní antikonvulzivní efekt při léčbě epilepsie [93, 129]. (+)-Kanadin vykazuje i neuroprotektivní efekt, ale mechanismy jeho účinku jsou do značné míry neobjasněné. Některé studie tvrdí, že draslíkové kanály závislé na ATP v substantia nigra pars compacta podněcují patogenezi Parkisonovy choroby, a že blokací těchto kanálů lze docílit ochrany neuronů proti jejich degeneraci. (+)-Kanadin (syn.tetrahydroberberin) vykazuje silnou blokaci těchto kanálů a zároveň excitaci dopaminergních neuronů v substantia nigra pars compacta. Tento farmakologický mechanismus může přispívat k neuroprotekci při Parkinsonově chorobě [130]. Vzhledem k tomu, že (+)-tetrahydropalmatin patří do stejné strukturní skupiny alkaloidů jako (+)-kanadin, vykazuje i podobné účinky na CNS. Taktéž inhibuje GABA-transaminasu a vyznačuje se anxiolytickým účinkem na D1/D2 a GABA1 receptorech, čehož by se mohlo využít při léčbě úzkostných poruch [93, 117, 129]. Můžeme u něj sledovat i antihypertenzivní účinky a snižování plasmatických koncentrací noradrenalinu, které jsou zprostředkovány účinkem (+)-tetrahydropalmatinu na CNS [131]. V neposlední řadě se vyznačuje i neuroprotektivním efektem na mozek při úžehu, který bývá spojován s neurologickými abnormalitami [132]. (+)-Domestin vykazuje ve studiích vazby na receptory afinitu k 5-HT2A receptorům, které jsou spřaženy s G-proteiny a mají vliv na učení paměť a neurogenezi [133]. V menší míře vykazuje (+)-domestin afinitu k α1-adrenergním receptorům a D2 dopaminergním receptorům [134]. Dalším účinkem je inhibiční aktivita vůči Na+, K+, Mg2+ a Ca2+ ATPasám synaptické membrány [135]. (+)-Domestin (syn.(+)-nantenin) je schopen antagonizovat chování a ovlivnění fyziologických procesů po podání MDMA (Extáze) – syntetického amfetaminového derivátu se stimulačními účinky navozujícími halucinogenní stavy u lidí. (+)-Domestin působí jako antagonista tohoto efektu [136]. Izolované látky jsou součástí knihovny strukturních typů alkaloidů, které spolu s výsledky biologických testů slouží jako základ pro chemický docking. Tento matematický model může vyjádřit vztah mezi strukturou a účinkem týkajícím se konkrétního enzymového
systému a naznačit tak metody dalšího studia za použití polosynteticky připravených derivátů alkaloidů ve spolupráci s Centrem pokročilých studií FVZ v Hradci Králové UO v Brně.
9. Seznam použité literatury
[1]
Koukolík F., Jirák R.: Alzheimerova nemoc a další demence. Grada Publishing, Praha 1998, ISBN 80-7169-615-3.
[2]
Martin J., Kršková Z, Dušek J.: Huperzin A a jiné přírodní látky v léčbě Alzheimerovy choroby, Praktické lékárenství, 2011, 1 (2), 103 – 105.
[3]
Jirák R.: Diagnostika a terapie Alzheimerovy choroby, Neurologie pro praxi, 2008, 4, 224 – 227.
[4]
Jirák R., Koukolík F.: Demence. Neurobiologie, klinický obraz, terapie, Galén, Praha 2004, ISBN 80-7262-268-4.
[5]
Obenberger J.: Využití zobrazovacích metod v diagnostice demencí a kognitivních poruch, Česká geriatrická revue, 2005, 3 (4), 24 – 35.
[6]
Koudelková M.: Praktické zkušenosti s laboratorní diagnostikou Alzheimerovy nemoci pomocí tau proteinu, fosfo-tau proteinu a beta amyloidu v likvoru, Neurologie pro praxi, 2009, 10(5), 290 – 293.
[7]
Strunecká A., Paleček J.: Patofyziologické změny cytoskeletu a jejich důsledky v psychiatrii, Psychiatrie, Suplementum 2, 1999.
[8]
Hugh A. Pearson H., Peers Ch.: Physiological roles for amyloid β peptides, The Journal of Physiology, 2006, 575 (1), 5 – 10.
[9]
Hort J., Glosová L., Vyhnálek M., Bojar M., Škoda D., Hladíková M.: Tau protein a beta amyloid v likvoru u Alzheimerovy choroby, Česká a slovenská neurologie a neurochirurgie, 2007, 70/103 (1), 30 – 36.
[10]
Avila J., Lucas J., Perez M., Hernandez F.: Role of tau protein in both physiological and pathological conditions, Physiological reviews, 2004, 84 (2), 361 – 384.
[11]
Novák M.: Neuroimunológia alzheimerovej choroby, Bratislavské lekárske listy, 1997, 98 (6), 303 – 314.
[12]
Kolářová M., García-Sierra F., Bartoš A., Říčný J., Řípová D.: Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease, International Journal of Alzheimer’s Disease, 2012, doi: 10.1155/2012/731526.
[13]
Koudelková M.: Diagnostika Alzheimerovy demence prostřednictvím proteinů tau, fosfo – tau a beta – amyloidu v mozkomíšním moku, Labor aktuell, 2010, 2, 8 – 11.
[14]
CAI Z., YAN Y.: Pathway and mechanism of oxidative stress in Alzheimer’s disease, Journal of Medical Colleges of PLA, 2007, 22 (5), 320 – 324.
[15]
Butterfield D., Perluigi M., Sultana R.: Oxidative stress in Alzheimer's disease brain: New insights from redox proteomics, European Journal of Pharmacology, 2006, 545 (1), 39 – 50.
[16]
Chauhan V., Chauhan A.: Oxidative stress in Alzheimer’s disease, Pathophysiology, 2006, 13 (3), 195 – 208.
[17]
Fuller S., Steele M., Münch G.: Activated astroglia during chronic inflammation in Alzheimer’s disease - Do they neglect their neurosupportive roles?, Mutation Research, 2010, 690 (1–2), 40 – 49.
[18]
Heneka M.: Inflammation in Alzheimer’s disease, Clinical Neuroscience Research, 2006, 6 (5), 247 – 260.
[19]
Bales K.: Brain lipid metabolism, apolipoprotein E and the pathophysiology of Alzheimer's disease, Neuropharmacology, 2010, 59 (4–5), 295 – 302.
[20]
Grösgen S., Grimm M., Frieß P., Hartmann T.: Role of amyloid beta in lipid homeostasis, Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1801 (8), 966 – 974.
[21]
Hooijmans C., Kiliaan A.: Fatty acids, lipid metabolism and Alzheimer pathology, European Journal of Pharmacology, 2008, 585 (1), 176 – 196.
[22]
Kandiah N., Feldman H.: Therapeutic potential of statins in Alzheimer's disease, Journal of the Neurological Sciences, 2009, 283 (1-2), 230–234.
[23]
Brunovský M.: Inhibitory cholinesteráz v léčbě Alzheimerovy nemoci, Neurolológia pre prax, 2007, 2, 107 – 111.
[24]
Ledvina M., Stoklasová A., Cerman J.: Biochemie pro studující medicíny II. díl, Nakladatelství Karolinum, 2005, ISBN 80-246-0850-2, 471 – 472.
[25]
Cokugras A.: Butyrylcholinesterase: Structure and physiological importance, Turkish Journal of Biochemistry, 2003, 28 (2), 54 – 61.
[26]
Jirák R., Vnoučková K.: Rivastigminum, Remedia, 2003, 13 (6), 372 – 378.
[27]
Johnson G., Moore S.: Why has butyrylcholinesterase been retained? Structural and functional diversification in a duplicated gene, Neurochemistry International, 2012, 61 (5), 783 – 797.
[28]
Lane R., He Y.: Butyrylcholinesterase genotype and gender influence Alzheimer’s disease phenotype, doi:10.1016/j.jalz.2010.12.005.
[29]
Sheardová K., Hort J., Rusina R., Bartoš A., Línek V., Ressner P., Rektorová I.: Doporučené postupy pro léčbu Alzheimerovy nemoci a dalších onemocnění spojených s demencí, Česká a slovenská neurologie a neurochirurgie, 2007, 70/103(5), 589 – 594.
[30]
Tayeb H., Yang H., Price B., Tarazi F.: Pharmacotherapies for Alzheimer's disease: Beyond cholinesterase inhibitors, Pharmacology & Therapeutics, 2012, 134 (1), 8 – 25.
[31]
Pidrman V.: Farmakoterapie demence, Psychiatrie pro praxi, 2007, 8 (5), 205 – 207.
[32]
Jirák R.: Farmakoterapie Alzheimerovy choroby, Remedia, 2009, 19, 342 – 345.
[33]
Williams B., Nazarians A., Giii M.: A review of rivastigmine: A reversible cholinesterase inhibitor, Clinical therapeutics, 2003, 25 (6), 1634 – 1653.
[34]
Marco L., Carreira M.: Galanthamine, a natural product for the treatment of
Alzheimer’s disease, Recent Patents on CNS Drug Discovery, 2006, 1 (1), 105 – 111. [35]
Berkov S., Georgieva L., Kondakova V., Atanassov A., Viladomat F., Bastida J., Codina C.: Plant sources of galanthamine: phytochemical and biotechnological aspects, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2009, 23 (2), 1170 – 1176.
[36]
Krejčová G., Ševelová L.: Současné poznatky o galantaminu, reverzibilním inhibitoru acetylcholinesterázy, Vojenské zdravotnické listy, 2003, 72 (1), 37 – 44.
[37]
Konrád J., Hányš R., Dvořák A., Rozehnalová E.: Memantin v léčbě střední a těžké demence u Alzheimerovy choroby, Česká a slovenská psychiatrie, 2011, 107 (5), 257 – 262.
[38]
Švestka J.: Memantin – necholinergní alternativa léčby alzheimerovy a vaskulární demence, Psychiatrie pro praxi, 2004, 3, 154 – 159.
[39]
Jirák R.: Nové postupy v biologické terapii demencí, Psychiatrie pro praxi, 2010, 11(4), 143 – 144.
[40]
Drtinová L., Pohanka M.: Možnosti využití huperzinu a v léčbě alzheimerovy nemoci, Chemické listy, 2013, 107, 12 – 15.
[41]
Zangara A.: The psychopharmacology of huperzine A: an alkaloid with cognitive enhancing and neuroprotective properties of interest in the treatment of Alzheimer’s disease, Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 2003, 75 (3), 675 – 686.
[42]
Canudas A.M., Pubill D., Sureda F.X., Verdaguer E., Camps P., MuñozTorrero D., Jiménez A., Camins A., Pallása M.: Neuroprotective effects of (±)huprine Y on in vitro and in vivo models of excitoxicity damage, Experimental neurology, (2003), 180 (2), 123 – 130.
[43]
Roman S., Badia A., Camps P., Clos M.V.: Potentiation effects of (±)huprine X, a new acetylcholinesterase inhibitor, on nicotinic receptors in rat cortical synaptosomes, Neuropharmacology, 2004, 46 (1), 95 – 102.
[44]
Ronco C., Sorin G., Nachon F., Foucault R., Jean L., Romieu A., Renard P.-Y.: Synthesis and structure–activity relationship of Huprine derivatives as human acetylcholinesterase inhibitors, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17 (13), 4523 – 4536.
[45]
Alcalá M.M., Maderuelo A., Vivas N.M., Camps P., Muñoz-Torrero D., Clos M.V., Badia A.: Effects of (±)-huprine Y and (±)-huprine Z, two new anticholinesterasic drugs, on muscarinic receptors, Neuroscience Letters, 2005, 379 (2), 106 – 109.
[46]
Alcalá M.M., Vivas N.M., Hospital S., Camps P., Muñoz-Torrero D., Badia A.: Characterisation of the anticholinesterase activity of two new tacrine-huperzine A hybrids, Neuropharmacology, 2003, 44 (6), 749 – 755.
[47]
Hejný S., Slavík B.: Květena ČSR. 1. díl. Academia, Praha 1988, ISBN 80-2000643-5.
[48]
BioLib, http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id19687/?taxonid=3475, staženo 18. února 2013.
[49]
Grycová L., Dostál J., Marek R.: Quaternary protoberberine alkaloids, Phytochemistry, 2007, 68 (2), 150 – 175.
[50]
Baloun J., Jahodář L., Leifertová I., Štípek S.: Rostliny způsobující otravy a alergie, Avicenum, Praha 1989, ISBN 08-083-89.
[51]
Chlebek J., Macáková K., Cáhlíková L., Opletal L.,Kurfürst M.: Isochinolinové terciární alkaloidy Corydalis cava a jejich inhibiční aktivita vůči acetylcholinesterase a butyrylcholinesterase, In 38. konference Syntéza a
analýza léčiv, Katedra farmaceutické botaniky a ekologie, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, 2009, str. 89. [52]
Brossi A.: The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology V29: Chemistry and Pharmacology, Academic press, Orlando 1986, ISBN 0-12-469529-9.
[53]
Preininger V., Thakur R., Santavý F.: Isolation and chemistry of alkaloids from plants of the family Papaveraceae LXVII: Corydalis cava (L.) Sch. et K. (C. tuberosa DC)., Journal of pharmaceutical science, 1976, 65 (2), 294 – 296.
[54]
Meyer A., Imming P.: R(−)-Canadaline as first secoberbine alkaloid from Corydalis cava, Phytochemistry Letters, 2008, 3 (1), 168 – 170.
[55]
Chlebek J.: Studium biologické aktivity alkaloidů izolovaných z Corydalis cava (Fumariaceae), 2012, disertační práce, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové.
[56]
Opletal L., Chlebek J., Cahlíková L, Macáková K.: Isochinolinové alkaloidy: 200 let zkušeností, In 38. konference Syntéza a analýza léčiv, Katedra farmaceutické botaniky a ekologie, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, 2009, str. 37.
[57]
Wright C., Marshall S., Russell P., Anderson M., Phillipson D., Kirby G., Warhurst D., Schiff P.: In vitro antiplasmodial, antiamoebic, and cytotoxic activities of some monomeric isoquinoline alkaloids, Journal of Natural Products, 2000, 63(12), 1638 – 1640.
[58]
Satou T., Koga M., Matsuhashi R., Koike K., Tada I., Nikaido T.: Assay of nematocidal activity of isoquinoline alkaloids using third-stage larvae of Strongyloides ratti and S. venezuelensis, Veterinary Parasitology, 2002, 104 (2), 131 – 138.
[59]
Kosina P., Gregorov8 J., Gruz J., Vacek J., Kolář M., Vogel M., Roos W., Naumann K., Simanek V., Ulrichová J.: Phytochemical and antimicrobial characterization of Macleaya cordata herb, Fitoterapia, 2010, 81 (8), 1006 – 1012.
[60]
Morteza-Semnani K., Amin G., Shidfar M., Hadizadeh H., Shafiee A.: Antifungal activity of the methanolic extract and alkaloids of Glaucium oxylobum, Fitoterapia, 2003, 74 (5), 493 – 496.
[61]
Vrba J., Vrublová E., Modriansky M., Ulrichová J.: Protopine and allocryptopine increase mRNA levels of cytochromes P450 1A in human
hepatocytes and HepG2 cells independently of AhR, Toxicology Letters, 2011, 203 (2), 135 – 141. [62]
Barnes J., Anderson L., Phillipson J.: Herbal medicines, 3.vydání, Pharmaceuticall press, Londýn 2007, ISBN 978-0-85369-623-0.
[63]
Vrzal R., Zdařilová A., Ulrichová J., Bláha L., Giesy J., Dvořák Z.: Activation of the aryl hydrocarbon receptor by berberine in HepG2 and H4IIE cells: Biphasic effect on CYP1A1, Biochemical Pharmacology, 2005, 70 (6), 925 – 936.
[64]
Tang J., Feng Y., Tsao S., Wang N., Curtain R., Wang Y.: Berberine and Coptidis Rhizoma as novel antineoplastic agents: A review of traditional use and biomedical investigations, Journal of Ethnopharmacology, 2009, 126 (1), 5 – 17.
[65]
Chung J., Wu L., Chu C., Jan J., Ho C., Tsou M.,Lu H., Chen G., Lin J., Wang T.: Effects of Berberine on Arylamine N-acetyltransferase Activity in Human Bladder Tumour Cells, Food and Chemical Toxicology, 1999, 37 (4), 319 – 326.
[66]
Yin J.,Ye J., Jia W.: Effects and mechanisms of berberine in diabetes treatment, Acta Pharmaceutica Sinica B, 2012, 2 (4), 327 – 334.
[67]
Kang D., Sohn E., Kwon E., Han J., Oh H., Lee H.: Effects of berberine on angiotensin-converting enzyme and NO/cGMP system in vessels, Vascular Pharmacology, 2003, 39 (6), 281 – 286.
[68]
Gu L., Li N., Li Q., Zhang Q., Wang Ch., Zhu W., Li J.: The effect of berberine in vitro on tight junctions in human Caco-2 intestinal epithelial cells, Fitoterapia, 2009, 80 (4), 241 – 248.
[69]
Shin J., Kim K., Lee M.: Inhibitory effects of bulbocapnine on dopamine biosynthesis in PC12 cells, Neuroscience Letters, 1998, 244 (3), 161 – 164.
[70]
Adsersen A., Kjølbye A., Dall O., Jäger A.: Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory compounds from Corydalis cava Schweigg. & Kort, Journal of Ethnopharmacology, 2007, 113 (1), 179 – 182.
[71]
Wet H., Heerden F., Wyk B.: Alkaloids of Antizoma miersiana (Menispermaceae), Biochemical Systematics and Ecology, 2005, 33 (8), 799 – 807.
[72]
Ubeda A., Montesinos C., Paya M., Alcaraz M.: Iron-reducing and freeradical-scavenging properties of apomorfine and some related
benzylisoquinolines, Free Radical Biology & Medicine, 1993, 15 (2), 159 – 167. [73]
Tanabe H., Suzuki H., Nagatsu A., Mizukami H., Ogihara Y., Inoue M.: Selective inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation by coptisine isolated from Coptis rhizoma, one of the crude drugs composing Kampo medicines Unsei-in, Phytomedicine, 2006, 13 (5), 334 – 342.
[74]
Li H.L., Han T., Liu R.H., Zhang Ch., Chen H.S., Zhang W.D.: Alkaloids from Corydalis saxicola and their anti-hepatitis B virus activity, Chemistry & Biodiversity, 2008, 5 (5), 777 – 783.
[75]
Zhang G.Q., Wang K.B.: Anticancer and phytochemical properties of alkaloids from Caragana microphylla, Yaoxue Shijian Zazhi, 2010, 28 (2), 105 – 106, 121.
[76]
Lei Y., Tan J., Wink M., Maa Y., Li N., Su G.: An isoquinoline alkaloid from the Chinese herbal plant Corydalis yanhusuo W.T. Wang inhibits Pglycoprotein and multidrug resistance-associate protein 1, Food Chemistry, 2013, 136 (3-4), 1117 – 1121.
[77]
Cortijo J., Villagrasa V., Pons R., Berto L.,Martí-Cabrera M., Martinez-Losa M., Domenech T., Beleta J., Morcillo E.J.: Bronchodilator and antiinflammatory activities of glaucine: In vitro studies in human airway smooth muscle and polymorphonuclear leukocytes, British Journal of Pharmacology, 1999, 127 (7), 1641 – 1651.
[78]
Hung T.M., Thuong P.T., Nhan N.T., Mai N.T.T., Quan T.L., Choi J.S., Woo M.H., Min B.S., Bae K.: Cholinesterase inhibitory activities of alkaloids from Corydalis tuber, Natural Product Sciences, 2011, 17(2), 108 – 112.
[79]
Asencio M., Delaquerrière B.,Cassels B.K., Speisky H., Comoy E., Protais P.: Biochemical and behavioral effects of boldine and glaucine on dopamine systems, Pharmacology Biochemistry and Behavior, 1999, 62 (1), 7 – 13.
[80]
Paulo M.Q., Barbosa-Filho J.M., Lima E.O., Maia R.F., Cassia R., Barbosa B.B.C., Kaplan M.A.C.: Antimicrobial activity of benzylisoquinoline alkaloids from Annona salzmanii D.C., Journal of Ethnopharmacology, 1992, 36 (1), 39 – 41.
[81]
Boustie J., Stigliani J.-L., Montanha J., Amoros M., Payard M., Girre L.: Antipoliovirus Structure-Activity Relationships of Some Aporphine Alkaloids, Journal of Natural Products, 1998, 61(4), 480 – 484.
[82]
Mollataghi A., Coudiere E., Hadi A.H.A., Mukhtar M.R., Awang K., Litaudon M., Ata A.: Anti-acetylcholinesterase, anti-α-glucosidase, anti-leishmanial and anti-fungal activities of chemical constituents of Beilschmiedia species, Fitoterapia, 2012, 83 (2), 298 – 302.
[83]
Chao J., Liao J.-W., Peng W.-H., Lee M.-S., Pao L.-H., Cheng H.-Y.: Antioxidant, analgesic, anti-inflammatory and hepatoprotective effects of the ethanol extract of Mahonia oiwakensis stem, International Journal of Molecular Scence, 2013, 14 (2), 2928 – 2945.
[84]
Račková L., Májeková M., Košťálová D., Štefek M.: Antiradical and antioxidant activities of alkaloids isolated from Mahonia aquifolium. Structural aspects, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, 12 (17), 4709 – 4715.
[85]
Zhao X., Nan Y, Xiao Ch., Zheng J., Zheng X., Wei Y., Zhang Y.: Screening the bioactive compounds in aqueous extract of Coptidis rhizoma which specifically bind to rabbit lung tissues β2-adrenoceptor using an affinity chromatographic selection method, Journal of Chromatography B, 2010, 878 (2), 2029 – 2034.
[86]
Patel M.B., Mishra S.: Hypoglycemic activity of alkaloidal fraction of Tinospora cordifolia, Phytomedicine, 2011, 18 (12), 1045 – 1052.
[87]
Deng Y., Zhang M., Luo H.: Identification and antimicrobial activity of two alkaloids from traditional Chinese medicinal plant Tinospora capillipes, Industrial Crops and Products, 2012, 37 (1), 298 – 302.
[88]
Yokozawa T., Satoh A., Cho E.J., Kashiwada Y., Ikeshiro Y.: Protective role of Coptidis Rhizoma alkaloids against peroxynitrite-induced damage to renal tubular epithelial cells, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2005, 57 (3), 367 – 374.
[89]
Parmar V.S., Bracke M.E., Philippe J., Wengel J., Jain S.C., Olsen C.E., Bisht K.S., Sharma N.K., Courtens A., Sharma S.K., Vennekens K., Marck V.V., Singh S.K., Kumar N., Kumar A., Malhotra S., Kumar R., Rajwanshi V.K., Jain R., Mareel M.M.: Anti-invasive Activity of Alkaloids and Polyphenolics in Vitro, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1997, 5 (8), 1609 – 1619.
[90]
Chlebek J., Macáková K., Cahliková L., Kurfurst M., Kunes J., Opletal L.: Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory compounds from Corydalis cava (Fumariaceae), Natural Product Communications, 2011, 6 (5), 607 – 610.
[91]
Scazzocchio F., Cometa M. F., Tomassini L., Palmery M.: Antibacterial activity of Hydrastis canadensis extract and its major isolated alkaloids, Planta Medica, 2001, 67 (6), 561 – 654.
[92]
Correché E.R., Andujar S.A., Kurdelas R.R., Lechón M.J.G., Freile M.L., Enriz R.D.: Antioxidant and cytotoxic activities of canadine: Biological effects and structural aspects, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16 (7), 3641 – 3651.
[93]
Choi S.Y., Bang M.-H., Lee E.J., Kwon O.-S., Kang T.-Ch., Lee Y.-H., Rho Y.-D., Baek N.-I.: Human brain GABA-T (γ-aminobutyric acid transaminase) inhibitory alkaloids from Corydalis tuber, Agricultural Chemistry and Biotechnology, 2003, 46 (2), 67 – 72.
[94]
Ulrichová J., Walterová D., Preininger V., Šimánek V.: Inhibition of butyrylcholinesterase activity by some isoquinoline alkaloids, Planta Medica, 1983, 48 (3), 174 – 177.
[95]
Liu X., Hu Z., Shi Q., Zeng H., Shen Y., Jin H., Zhang W.: Anti-inflammatory and Anti-nociceptive Activities of Compounds from Tinospora sagittata (Oliv.) Gagnep., Archives of Pharmacal Research, 2010, 33 (7), 981 – 987.
[96]
Bao M., Cao Z., Yua D., Fu S., Zhang G., Yang P., Pan Y., Yang B., Han H., Zhou Q.: Columbamine suppresses the proliferation and neovascularization of metastatic osteosarcoma U2OS cells with low cytotoxicity, Toxicology Letters, 2012, 215 (3), 174 – 180.
[97]
M.K. Lee, Lee K.S., Kim H.S., Hong S.S.; Ro J.S.: Inhibitory effects of coptisine on monoamine oxidase activity, Natural Product Sciences, 2000, 6 (2), 70 – 72.
[98]
Colombo M.L., Bugatti C., Mossa A., Pescalli N., Piazzoni L., Pezzoni G., Menta E.,Spinelli S., Johnson F., Gupta R.C., Dasaradhi L.: Cytotoxicity evaluation of natural coptisine and synthesis of coptisine from berberine, Il Farmaco, 2001, 56 (5–7), 403 – 409.
[99]
Tanabe H., Suzuki H., Mizukami H., Inoue M.: Double blockade of cell cycle progression by coptisine in vascular smooth muscle cells, Biochemical Pharmacology, 2005, 70 (8), 1176 – 1184.
[100] Gong L.-L., Fanga L.-H., Wang S.-B., Sun J.-L., Qin H.-L., Li X.-X., Wang S.B., Du G.-H.: Coptisine exert cardioprotective effect through anti-oxidative and inhibition of RhoA/Rho kinase pathway on isoproterenol-induced myocardial infarction in rats, Atherosclerosis, 2012, 222 (1), 50 – 58. [101] Salminen K.A., Meyer A., Jeřábková L., Korhonen L.E., Rahnasto M., Juvonen R.O., Imming P., Raunio H.: Inhibition of human drug metabolizing cytochrome P450 enzymes by plant isoquinoline alkaloids, Phytomedicine, 2011, 18 (6), 533 – 538. [102] Liu H., Li G., WangJ., Liu J.: Corydaline derivatives useful for reducing lipid levels, PCT Int. Appl. WO 2010075469 A1 20100701; Chem. Abstr. 153, 145700 (2010). [103] Iwasa K., Nishiyama Y., Ichimaru M., Moriyasu M., Kim H.-S.,Wataya Y.,Yamori T., Takashi T., Lee D.-U.: Structure-activity relationships of quaternary protoberberine alkaloids having an antimalarial activity, European Journal of Medicinal Chemistry,1999, 34 (12), 1077 – 1083. [104] Wangchuk P., Keller P.A., Pyne S.G., Willis A.C., Kamchonwongpaisan S.: Antimalarial alkaloids from a Bhutanese traditional medicinal plant Corydalis dubia, Journal of Ethnopharmacology, 2012, 143 (2), 310 – 313. [105] Liu W., Han C., Hu L., ChenK., Shen X., Jiang H.: Characterization and inhibitor discovery of one novel malonyl-CoA: Acyl carrier protein transacylase (MCAT) from Helicobacter pylori, FEBS Letters, 2006, 580 (2), 697 – 702. [106] Cordell G.A.: The alkaloids 53 volumes, Academic press, Londýn 2000, ISBN 0-12-469553-1. [107] Cassels B.K., Asencio M.: Monoaminergic, ion channel and enzyme inhibitory activities of natural aporphines, their analogues and derivatives, Natural Product Communications, 2008, 3 (4), 643 – 653. [108] Hsu Ch.-Y. H., Chen Ch.-L.: Antimicrobial activities of aporphine alkaloids isolated from heartwood and discolored sapwood of Liriodendron tulipifera, Holzforschung, 1991, 45 (5), 325 – 331.
[109] Arango O., Pérez E., Granados H., Rojano B., Sáez J.: Inhibition of the lipid peroxidation and free radical scavenging capacity of alkaloids isolated from two annonaceae, Xylopia amazonica cf. and Duguetia vallicola, Actualidades Biologicas, 2004, 26 (81), 105 – 110. [110] Jantan I., Rafi I.A.A., Jalil J.: Inhibition of platelet-activating factor receptor binding by aporphine and phenanthrenoid alkaloids from Aromadendron elegans, Planta Medica, 2001, 67 (5), 466 – 467. [111] Nguyen N.T., Pham V.C., Litaudon M., Guéitte F., Grellier P., Nguyen V.T., Nguyen V.H.: Antiplasmodial Alkaloids from Desmos rostrata, Journal of Natural Products, 2008, 71 (12), 2057 – 2059. [112] Saeedu S.A., Gilani A.H., Majoo R.U., Shah B.H.: Anti-thrombotic and antiinflammatory activities of protopine, Pharmacological Research, 1997, 36 (1), 1 – 7. [113] Rathi A., Srivastava A.K., Shirwaikar A., Rawat A.K.S., Mehrotra S.: Hepatoprotective potential of Fumaria indica Pugsley whole plant extracts, fractions and an isolated alkaloid protopine, Phytomedicine, 2008, 15 (6–7), 470 – 477. [114] Xu L.-F., Chu W.-J., Qing X.-Y., Li S., Wang X.-S., Qing G.-W., Fei J., Guo L.H., Protopine inhibits serotonin transporter and noradrenaline transporter and has the antidepressant-like effect in mice models, Neuropharmacology, 2006, 50 (8), 934 – 940. [115] Chen Ch.-H., Liao Ch.-H., Chang Y.-L., Guh J.-H., Pan S.-L., Teng Ch.-M.: Protopine, a novel microtubule-stabilizing agent, causes mitotic arrest and apoptotic cell death in human hormone-refractory prostate cancer cell lines, Cancer Letters, 2012, 315 (1), 1 – 11. [116] Cao F.-L., Shang G.-W., Wang Y., Yang F., Li Ch.-L., Chen J.: Antinociceptive effects of intragastric DL-tetrahydropalmatine on visceral and somatic persistent nociception and pain hypersensitivity in rats, Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 2011, 100 (1), 199 – 204. [117] Leung W.Ch., Zheng H., Huen M., Law S.L., Xue H.: Anxiolytic-like action of orally administered dl-tetrahydropalmatine in elevated plus-maze, Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 2003, 27 (5), 775 – 779.
[118] Yu J., Piao B.-K., Pei Y.-X., Qi X., Hua B.-J.: Protective effects of tetrahydropalmatine against γ-radiation induced damage to human endothelial cells, Life Sciences, 2010, 87 (1–2 ), 55 – 63. [119] Miao Y., He N., Zhu J.-J.: History and new developments of assays for cholinesterase activity and inhibition, Chemical Reviews, 2010, 110 (9), 5216 – 5234. [120] Žďárová Karasová J., Kuča K., Jun D., Bajgar J:Užití Ellmanovy metody pro stanovení aktivit cholinesteras při in vivo hodnocení účinků reaktivátorů, Chemické Listy, 2010, 104 (1), 46 - 50. [121] Jong C.F., Derks R.J.E., Bruyneel B., Niessen W., Irth H.: High-performance liquid chromatography–mass spectrometry-based acetylcholinesterase assay for the screening of inhibitors in natural extracts, Journal of Chromatography A, 2006, 1112 (1–2), 303 – 310. [122] Slavík J., Slavíková L.: Alkaloids from Corydalis cava (L.) SCHW. et KOERTE, Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 1979, 44 (7), 2261 – 2274. [123] Steck T. L., Kant J. A.: Preparation of impermeable ghosta and inside-out vesicles from human erythrocyte membranes. Methods in Enzymology, 1974, 31, 172 – 180. [124] Molyneux, P.: The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 2004, 26 (2), 211 – 219 [125] Keil, B.: Laboratorní technika organické chemie, Nakladatelství Akademie věd Československé republiky, Praha 1963. [126] Opletal, L.: osobní sdělení. [127] Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V. Jr, Feather-Stone R.M.: A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity, Biochemical Pharmacology, 1961, (7), 88 – 95. [128] Wu J., Jin G. Z.: Tetrahydroberberine suppresses dopamine-induced potassium current in acutely dissociated CA1 pyramidal neurons from rat hippocampus, Neuroscience letters, 1996, 207(3), 155 – 158. [129] Votava M., Agová V., Kršiak M.: Mechanismy účinku anxiolytik, Psychiatrie pro praxi, 2005, 6(3), 131 – 133.
[130] Wu Ch., Yang K., Liu Q., Wakui M., Jin G.-Z., Zhen X., Wu J.: Tetrahydroberberine blocks ATP-sensitive potassium channels in dopamine neurons acutely-dissociated from rat substantia nigra pars compacta, Neuropharmacology, 2010, 59(7–8) , 567 – 572. [131] Chu L.-H., Hsu F.-L., Chueh F.-Y., Niu Ch.-S., Cheng J.-T.: Antihypertensive activity of dl-tetrahydropalmatine, an active alkaloid isolated from the tubers of Corydalis racemosa, 1996, 43(6), 489 – 492. [132] Chang Ch.-K., Chueh F.-Y., Hsieh M.-T., Lin M.-T.: The neuroprotective effect of DL-tetrahydropalmatine in rat heatstroke, Neuroscience letters, 1999, 267(2), 109 – 112. [133] Raote I., Bhattacharya A., Panicker M.M.: Serotonin Receptors in Neurobiology, CRC press, Boca Raton (FL), 2007, ISBN: 0-8493-3977-4. [134] Indra B., Tadano T., Nakagawasai O., Arai Y., Yasuhara H., Ohizumi Y., Kisara K.: Suppressive effect of nantenine, isolated from Nandina domestica Thunberg on the 5-hydroxy-L-tryptophan plus clorgyline-induced head-twitch response in mice, Life sciences, 2002, 70(22), 2647 – 2656. [135] Ribeiro R.A., Arnaiz G.R.L.: Nantenine and papaverine differentially modify synaptosomal membrane enzymes, Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 2000, 7(4), 313 – 323. [136] Legendre O., Pecic S., Chaudhary S., Zimmerman S.M., Fantegrossi W.E., Harding W.W.: Synthetic studies and pharmacological evaluations on the MDMA ( Ecstasy') antagonist nantenine, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2010, 20(2), 628 – 631.
