Transport - protein sorting Savčí buňka > 10000 typů proteinů Kvasinková buňka - cca 5000 proteinů ⇒ přesná lokalisace (organely, membrány, atd.) ⇒ část proteinů syntetisována z DNA mitochondrií a chloroplastů ⇒ syntéza na ribosomech těchto organel X častěji syntéza cytosol ⇒ distribuce
mRNA
Nascentní protein - ER signální sekvence
ER
GA
Drsné ER - vstup proteinů do ER během translace ER- signální sekvence na N-konci (6-12 hydrofobních AK za 1-2 basickými AK) Buňky specialisované pro sekreci - velké množství ER a cisteren GA
SEKREČNÍ DRÁHY
EXOCYTOSA
Pouze, je-li signál (hormon), do té doby ve vesiklech
LYSOSOM
Nejdále od ER RETROGRÁDNÍ TRANSP.
Migrace cisteren Mnoho proteinů modifikováno (glykosylace) Nejblíž k ER
TRANSPORTNÍ VESIKLY - o 50 nm
Cis - Golgi reticulum RETROGRÁDNÍ TRANSP. GA-ER Regulovaná sekrece: (př. insulin, endorfiny, trypsin, casein..) Konstitutivní sekrece: (př. proteiny séra - albumin, proteiny extracel. matrix collagen, fibronectin…)
mRNA
MATURACE SEKRETOVANÝCH PROTEINU - 5 KROKU Kvasinkové sec mutanty - akumulace sekretovaných proteinů v místě bloku
Membránové glykoproteiny - podobná „cesta“ jako sekretované proteiny
1. Translokace proteinů přes membránu ER 16-30 AK signální sekvence ⇒ ER transport - N - konec 6-12 hydrofobních AK za 1-2 + nabitými AK - vlastní sekvence odlišné
⇒ SEKRETOVANÉ PROTEINY mohou „přejít“ přes ER membránu a signální sekvence je odstraněna POUZE BĚHEM PROTEINOVÉ SYNTÉZY Membrány ER
KO-TRANSLAČNÍ TRANSPORT SIGNÁLNÍ PEPTIDASA - lokalisovaná v lumen ER
X některé malé peptidy (např. a-mating faktor, cca 70 AK) - POST-TRANSLAČNÍ transport do ER (chaperony) Mikrosomy musí být přidány před tím, než je nasyntetizováno cca 70 AK
SEKRETORICKÉ PROTEINY - syntéza na ER membránách (ne na jiných membránách) - Signální sekvence - rozpoznání SRP („signal recognition Signální particle“) sekvence SRP receptor Signal recognition particle SRP - cytosolická partikule transientně se váže na ER-signální sekvenci na proteinu vazba k SRP receptoru na membráně ER 300 nukleotidů dlouhá RNA 6 proteinů (5 z nich vazba k RNA)
signal recognition particle
Disociace SRP hydrolysa GTP
odštěpení TRANSLOKON signální otevřený sekvence zavřený
chaperon
Signální sekvencevazba na translokon
Hsc70 chaperon (kvasinky, ne savčí buňky) - vazba spojená s hydrolysou ATP TRANSLOKON - nascentní protein Vazba signální TRAM (translocating chain sekvence (ATP se do ER dostává pomocí associated membrane protein) ATP/ADP antiporteru) - savčí - glykosylace - Asp, Ser, Thr Nutný pro proteinovou translokaci - 8 membránových domén (ER) -nezbytný pro translokaci zbytky SEC61 (savčí) - homolog kvasin- - dokončení syntézy - uvolnění kového SEC61 Interakce s ribosomem proteinu RIBONUKLEOPROTEINOVÝ KOMPLEX
- 10 transmembránových domén, vazba s dalšími proteiny (sec61β, sec61γ) - ? vazba ribosomu
Hydrolýza GTP - nutná pro proteinový transport do ER (energie)
V kvasinkách - translokace (fce Hsc70) vyžaduje ATP hydrolysu (x v savčích buňkách stačí GTP)
2. Inserce membránových proteinu do membrany ER CYTOSOL
LUMEN ER, GA nebo VNĚJŠÍ STRANA BUŇKY
Membránové proteiny - stejná sekreční dráha jako nemembránové topologie (N,C konec, nemembránové a transmembránové oblasti) - určena již v ER - zůstává zachována během transportu
Inserce do membrány ER závisí na specifických TOPOGENNÍCH SEKVENCÍCH (<24 AK)
Inserce insulinoveho receptoru (a podobných proteinu) - vnitřní “stop-transfer membrane-anchor” sekvence (α-helix) cca 22 AK - zůstane vázána v translokonu, protein se přestane translokovat do ER - přerušení těsné vazby mezi translokonem a ribosomem
Dokončení syntézy v cytosolu
Uvolnění sekvence z translokonu
Signální sekvence
Inserce asialoglykoproteinového receptoru (a podobných proteinů) - vnitřní “signal-anchor” sekvence (transferrinový receptor) obrácená orientace v membráně než insulinový receptor Funguje jako -ER signální sekvence -membránová kotva není štěpena, zůstává N konec v cytopl. Interní signální sekvence
uvolnění sekvence z translokonu závisí na konkrétních chemických vlastnostech sekvence
CYTOCHROM P450
také interní sekvence x obrácená orientace
Transmembránové proteiny s více transmembránovými doménami - “multiple topogenic” sekvence - iontové pumpy, kanály, transportery... ⇒ α helixy Na inserci neparticipují SRP a SRP receptor 2. signal 2. STOP- transfer anchor sekvence anchor sekvence
1. signal anchor 1.STOP-transfer sekvence (interní) anchor sekvence iniciuje inserci do ER „posun“ se zastaví
Některé proteiny po inserci do ER membrány - transport k GPI kotvě řada proteinů ⇒ ukotvena do fosfolipidové dvojvrstvy nikoli hydrof. AA, ale GPI kotvou (glycosyl fosfatidyl inositol)
Rozpoznání endoproteasou ⇒ štěpení
přenos na GPI kotvu
1. inserce do ER membrány jako insulinový receptor (štěpení N-koncové signál. sekvence) + internal stop-transfer membrane anchor sekv. 2. odštěpení a přenos na GPI kotvu odstranění cytoplasm. hydrofilní domény z proteinu
Proteiny s GPI kotvou mohou difundovat v membráně např. polarisované epiteliální b. ⇒ GPI kotva ⇒ lokalisace proteinů do apikální domény (x Proteiny s alfa-helixy často vázány cytosol. sekvencemi s cytoskeletem)
Post-translační modifikace a “kontrola” kvality proteinů v drsném ER 1. Tvorba disulfidických mustků 2. Správný “folding” 3. Připojeni a úprava carbohydrátů 4. Specifické proteolytické štěpení 5. “Assembly” multimerních proteinů
drsné ER drsné ER drsné ER + další drsné ER + další drsné ER
Pouze správně sbalené proteiny ⇒ transport z drsného ER do GA a dále Špatně upravené proteiny ⇒ zpět do cytoplasmy (přes translokon) ERAD dráha (ER associated protein degradation) rozpoznává špatně sbalené nebo poškozené proteiny (např. špatné a neopravitelné S-S můstky) Maturace proteinu
Transport nesbaleného proteinu
Správně sbalený protein Špatně sbalený protein – směrován na receptor membránově vázané ubiquitin ligasy, přenos do cytosolu (mechanismus?)
polyubiquitinace
Transport do proteasomu
1. Tvorba disulfidických mustků (-S-S-) ⇒ stabilisace terciární (kvart.) struktury proteinů nutný správný výběr (někdy během synthesy) x Někdy nutné přeměnit vazby -S-S- po synthese
1-2 3-4
1-3 2-4
⇒ Cys ⇒ thiolové skupiny (-SH) ⇒ oxidativní propojení ⇒ tvorba S-S můstků pouze v ER (nikoli v cytoplasmě)
PDI = protein disulfide isomerase intermediát
⇒ pouze v sekretovaných proteinech ⇒ ER lumen - vhodné redox prostředí pro oxidaci -SH skupin (x cytosol) Glutathion (tripeptid) ⇒ majoritní molekula obsahující thiolové skupiny v EB ⇒ prevence formace -S-S- můstků v cytosolu
PDI široké spektrum účinku Glutathion pomáhá proteinům zaujmout ⇒ přechod mezi reduk. a oxid. formou termodynamicky stabilní GSH GSSG konformace 50 : 1 (cytosol) Glutathion reduktase NADPH + H+ + GSSG NADP+ + 2GSH
PDI - vazba proteinu, který nejde “opravit” ⇒ PDI se z komplexu uvolní ⇒ tvorba vnitřního S-S můstku
2. Správný “folding” - zprostředkován řadou proteinů ER folding - velmi rychlý (min) ⇒ pomocné proteiny PDI (proteindisulfide isomerase) Hsc 70 ⇒ transientní vazba ⇒ 2 homologní lektiny (Calnexin, Calreticulin) ⇒ vazba k specifickým karbohydrátům
Tvorba trimeru Calnexin
Calreticulin + další proteiny Peptidyl prolyl isomerasy ⇒ rotace kolem peptid. vazby (např. Drosophila: Nina A protein)
Disulfidické vazby
Hematoglutinin (HA) trimer tvorba ⇒ trvá asi 7 min
Kontrola správně sbalených proteinů pro transport ER - GA špatný folding ⇒ blok transportu ⇒ např. permanentní vazba na Hsc 70 nebo Calnexin
štěpení endon. neštěpená HAC1 mRNA
štěpená HAC1mRNA
Endonuclease Kinase
Kvasinky + savčí buňky: přítomnost “nefoldovaných” nebo špatně sbalených proteinů v drsném ER ⇒ zvýšení transkripce genů kódujících chaperony (i Hsc 70) ⇒ unfolded protein response ⇒ IRE1 protein IRE1: ⇒ transmembr. protein vnitřní jaderné membrány ⇒ propojena s ER ⇒ doména otočená do jádra
IRE1 Unfolded proteins
Jaderný pór
⇒ kinasa (? fce) + endonukleasa RNA-specifická
HAC1 (transkripční faktor)
aktivace exprese CHAPERONŮ
Vazba nefold. proteinu ⇒ dimerisace receptoru IRE1 ⇒ aktivace endonukleasy ⇒ štěpení prekursoru mRNA pro transkripční faktor HAC1
Mnoho špatně assemblovaných proteinu je z ER transportováno do cytosolu a degradováno - “špatné” sekretorické i membranové proteiny - degradace za 1-2 hod- transport zpet do cytoplasmy přes “translokon” - degradace prostřednictvím ubiquitin/proteasomu - 2 ubiquitin konjugujici enzymy - lokalisace na cytosolickou stranu ER -? Mechanismus rozpoznání a transportu ven z ER
Proteiny ER se do ER vracejí zpět z Cis-Golgi cisteren - “residentní” proteiny ER (Hsc70, PDI …) - specifická C-koncová sekvence KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)nezbytná a dostačujici pro udržení proteinu v ER.
- KDEL receptor “záchytává” proteiny s KDEL sekvencí, lokalisace v membránách malých transportních vesiklu mezi cis-Golgi a ER + v cis-Golgi
+ ER proteiny - oligosach. řetězce s modifikacemi specifickými pro cis-Golgi
3. Glykosylace proteinů v ER a GA N a O glykosylace: velmi odlišné, různé cukerné zbytky O-glykosylace: oligosacharidy připojeny a) k hydroxylové skupině Ser neboThr prostřednictvím N-acetylgalactosaminu nebo b) k hydroxylové skupine hydroxylysinu přes galaktosu (kolageny). - oligosacharidy krátké (1-4 cukerné zbytky) - biosynthesa: pridávání cukru „po jednom“, různé GLYKOSYLTRANSFERASY N-glykosylace: N-acetylglukosamin je připojen k amidoskupině Asn - složité oligosacharidy (manosa, k.sialová, větvení) - biosynthesa: pripojování dlouhých “preformovaných” oligosacharidu (14 cukerných zbytku) Thr
Většina cytosolických a jaderných proteinu není glykosylována (vyjimka některé transkripční faktory + proteiny lokalisované v komplexu jaderného póru).
O-glykosylace Prekursory: nucleoside di-P nebo mono-P cukry
Glykosyltransferasy: integrální membránové proteiny, specifické - donor / akceptor Nucleotid-cukr: - syntéza v cytosolu z NTP a cukr-fostátu. - import do ER a GA - specifické antiporterové proteiny (nukleotidy ven, UMP, CMP, GMP)
UDP-Gal = UDP-galaktosa UDP-GalNAc = UDP- N-acetyl-galaktosamine
Dolicholfosfát: silně hydrofobní, 4-5 x přes membránu
1. vazba makroergní
N-glykosylace Biosynthesa N-oligosacharidu zacíná v drsném ER připojením dlouhého prekursoru - vázán na DOLICHOL= polyisoprenoid lipid (79-95 C) v membráně ER “přenašeč oligosacharidu”. Dolichol pyrophosphoryl oligosacharid - tvorba na ER membráne. Oligosacharid - orientován smerem do lumen ER.
Struktura prekursoru: stejná u rostlin, zivočichu, jednobuněčných eukaryot 3 x Glc, 9 x Man, 2 x N-acetyl- glucosamine
Přenos z dolicholu na Asn zbytek nascentního polypeptidu Hotový prekursorpřenos na proteiny
Konservované zbytky
Asn-X-Ser nebo Asn-X-Thr oligosacharide - protein transferase: - 3 podjednotky - 1 a 2 podjednotka - Ribophorins (integralní membránové proteiny ER, cytosolické domény se váží s velkou podjednotkou ribosomu) - 3. podjednotka - uvnitř ER - vlastní přenos
Drsné ER
oligosacharide - protein transferase
3 Glc + 1 Man jsou odstraněny Glc zbytky - ? signál, ze oligosacharid je pripraven k přenosu na protein Glucosyltransferasa - lumen ER - znovu přidává 1 Glc zbytek - glukosylace špatně sbalených proteinu (ne nativnich) Calnexin, Calreticulin: selektivní vazba na re-glukosylované oligosacharidy, zabrání “sbalení” sousedních AA segmentu, po uvolnění deglukosylace. Přechod do GA - další modifikace (ruzné enzymy v cis, medial a trans GA) - variabilita - nekteré modifikace proběhnou, jiné ne Oligosacharidy: - někdy nutné pro správný “folding”, x řada sekretorických proteinu se “sbalí” správně a je transportována i bez gykosylace. - rozdíly ve stabilitě - glykosylované obvykle stabilnější než neglykosylované
Některé N-oligosacharidy - směrování lysosomálních enzymu do lysosomu - přidání a počáteční processing oligosacharidových prekursoru v drsném ER je stejný pro membránové, sekretorické i lysosomální enzymy. - v cis-Golgi - manosové zbytky (1-více) FOSFORYLACE - 2 kroky: a) připojení N-acetyl-glucosamin fosfátu (GlcNAc phosphotransferasa) b) odstranení N-acetyl-glucosaminu fosfodiesterasou - zustává mannosa-6P
mannosa-6P
mannosa-6P - vazba mannosa 6-P receptory - v trans Golgi - VESIKLY obsahující M6P receptory - “pučení” z trans Golgi a fuse s organelami “late endosomy” (vnitřní pH 5.5). M6P váže M6P-receptory při pH > 6, M6P se uvolní v endosomech + fosfatasa uvnitř endosomu - defosforylace lysosomálních enzymu Z “late endosomu” - pučí 2 typy vesiklu. 1) obsahují lysosomální enzymy, ale nikoli M6P receptor - fusují následně s LYSOSOMY; 2) recyklují M6P-receptory (zpět do trans-Golgi nebo na buněčný povrch) M6P-receptor- přenáší neaktivní lysosomální proenzymy, aktivace v “late endosomu” nebo lysosomu
POZDNÍ ENDOSOM
Protein “sorting” a “processing” - Golgi a post-Golgi Golgi-enzymy: inserce do membrány drsného ER, pohyb transportními vesikly do GA. Ruzné GA lokalisované enzymy (napr. glykosylacní) - podobná struktura: N-terminální doména (cytosol), 1 x transmembránový alpha-helix (důležitý pro lokalisaci v Golgi, zabrání transportu dále, ? mechanismus), C-koncová doména (GA-lumen) s katalytickým místem
• Kontinuální versus regulovaná (reakce na stimul) sekrece proteinu
A) Konstitutivní sekrece Proalbumin
- Sorting do regulované dráhy - kontrola selektivní agregací proteinů. - Nematurované vesikly (pučící z trans-Golgi) - zabalené do CLATHRINU, obsahují core tvořené agregovaným sekretorickým proteinem (k Albumin agregaci zřejmě dochází před inkorporací do vesiklu). B) Regulovaná sekrece - Regulované sekretorické vesikly (savčí buňky) obsahují 2 proteiny Proinsulin CHROMOGRANIN B a SECRETOGRANIN II (agregují při inkubaci při pH 6.5 a Ca, i v trans-Golgi. Agregáty se netvoří při neutrálním pH (v ER) ? Selektivní agregace regulovaných proteinu - sorting do regulovaných vesiklů
• Proteolytický “processing” pro-proteinu - některé proteiny plasmatické membrány a vetšina sekretovaných proteinu-syntéza jako inaktivní prekursory (“proproteiny”) (albumin, insulin …) - většinou probíhá v sekretorických vesiklech odvozených z trans-Golgi Endoproteasy: Štěpí za sekvencemi Arg-Arg nebo Lys-Arg (kvasinkový homolog KEX2) savčí buňky : Furin, PC3, PC2
Insulin
• Sorting proteinu z GA do apikální nebo basolaterární membrány - Plasmatická membrána polarisovaných epitheliálních bunek - 2 domény - apikální a basolaterární - ruzné proteiny - specifický sorting (řada mechanismů) - sorting v trans-Golgi - proteiny, které finálně lokalisují na různých místech, v trans-Golgi nalezeny na stejné membráně. - 2 typy vesiklu “pučí” z trans-Golgi - 1 typ - fusuje s apikálni membránou, 2 typ fusuje s basolaterární membránou. Vesikly obsahují specifické Rab a V-SNARE proteiny - role v lokalisaci do správného místa. - např. proteiny s GPI (glycosylphosphatidyl inositol) kotvou - v různých typech buněk specifické lokalisace - kromě GPI kotvy nebyly identifikovány unikátní sekvence pro specifický targeting, ? Mnohonásobné sekvence - Hepatocyty: všechny proteiny nejprve z trans-Golgi do basolaterární membrány, poté jak basolaterární tak apikální proteiny - endocytosa do vesiklu - dráhy se odliší, basolaterární se vrátí zpět, apikální se prostřednictvím transportních vesiklu dostanou do apikální membrány TRANSCYTOSA - role cytoskeletu
BASOLATERÁRNÍ
APIKÁLNÍ Chřipkový HA glykoprotein
VSV
Infekce buněk VSV virem a chřipkovým virem
Receptorem zprostredkovaná endocytosa, sorting internalisovaných proteinů - Internalisace materiálu z okolí - fagocytosa (závislá na aktinu, pouze specialisované bunky) a endocytosa (tvorba membránových vesiklu o velikosti 0.05 - 0.1 μm; většina eukaryotických buněk) Endocytosa: -pinocytosa (nespecifická, příjem “kapek” z okolí) -receptor-mediated endocytosis: specifický receptor na bunecném povrchu - vazba na extracelulární makromolekulu (ligand) - endocytosa, receptor - ligand komplex - inkorporace do intracelulárního transportního vesiklu CAVEOLAE (invaginace plasmatické membrány) obsahují membránový protein caveolin, obsahují některé receptorové proteiny - specifický typ endocytosy X nejčastější receptor- endocytosa CLATHRINOVÉ VESIKLY (clathrin coated pits) - tvoří asi 2 % povrchu některých buněk (napr. hepatocyty a fibroblasty)
LDL particles (low-density-lipoprotein) - savcí bunky
Clathrin-coated pit
Ferritin
LDL (low-density lipoprotein) - PARTIKULE
ApoB protein
- přenásejí cholesterol v krvi - 20-25 nm v prumeru - vetsina savcich bunek produkuje povrchový receptor, který váze a internalisuje LDL partikule - po endocytose, LDL transport do lysosomu, hydrolasy štěpí ApoB na aminokyseliny a cholesterol, estery na cholesterol a mastné kyseliny - LDL receptor - glykoprotein 839 AK, transmembránový
“LATE ENDOSOMES” - acidické pH - fibroblasty - internalisace cca 50 % povrchových proteinu / hod. - vetsina povrchových receptoru - opakovane “umístí” ligand uvnitr bunky a vrátí se do membrány. - napr. LDL receptory - cyklus za 10-20 min X nekteré receptory (napr. insulin, rustové faktory) - cyklus jen 2-3 x a poté degradovány v lysosomech (- snízení citlivosti bunky k hormonální signalisaci) - disociace receptoru a ligandu - obvykle v “late endosomech” pozdní endosomy: obvykle blízko bunecného povrchu
LDL partikule
Clathrin
Coated pit Coated vesicle Clathrin triskelion Uncoated vesicle (early endosome)
Sorting vesicle (late endosome) Separace LDL partikule od receptoru při nízkém pH (pH 5.0) - recyklace receptoru na plasmatickou membránu
Transport vesicle
Lysosome - degradace LDL na AK, cholesterol, mastné kyseliny
Ferrotransferrin Transferrinový receptor
Apotransferrin se uvolní z transferrinovému receptoru při neutrálním pH
Transport Fe
Transferrin = majoritní glykoprotein krve, transportuje zelezo do bunek Apotransferrin - váže dva Fe3+ ionty a tvoří ferrotransferrin Transferrinový receptor - váže ferrotransferrin při neutrálním pH ⇒ endocytosa
Při pH < 6, Fe3+ disociují z ferrotransferrinu
Apotransferrin zustane vázán k transferrinovému receptoru při nízkém pH
Transcytosa: pohyb ligand buňkou Import extracellularního ligandu na jedné straně buňky, transport cytoplasmou a export z druhé strany
Polarizované epithelialni bunky
Při pH 7 uvolnění z receptoru
Fc receptor vazba Fc oblast IgG při pH 6
Molekulární mechanismy transportu pomocí vesiklu 3 typy obalených (“coated”) vesiklu (mají proteinový “obal” na cytosolickém povrchu) - transport proteinu ze “zdrojové” organely do “cílové” organely - během tvorby vesiklu - subjednotky “obalového” proteinu - polymerace okolo vznikajícího vesiklu - některé subjednotky “obalových” proteinu nebo s nimi asociovaných adapterových proteinu role v selekci prenasených proteinu (cargo proteiny) - cargo proteiny - mají specifické sekvence, které je směrují do specifického vesiklu - Role GTP-vazebného proteinu regulujícího úcinnost tvorby vesiklu membrána GTP-vazebný protein
Membránový receptorový protein solubilní cargo p.
membránový cargo protein
obalové a adapterové proteiny
VESIKLY: 1. Clathrinové - z plasmatické membrány a trans-Golgi; do pozdních endosomu 2. COPI - retrograde směr mezi GA cisternami a z cis-Golgi do drsného ER 3. COPII - z drsného ER do GA
1. CLATHRINOVE VESIKLY 50-100 nm průmer - obal tvořený clathrinem (težký a lehký řetězec)
Triskelion -assembly i bez membránového vesiklu
integralní proteiny “vyloucené” z transportního vesiklu
Triskelion - vazba k tzc. “assembly particle” - obsahuje adapterové proteiny “assembly particle” - vazba i k membránovým proteinům - určení, které budou zahrnuty do “pučiciho” transportního vesiklu 3 typy “assembly” partikulí - AP1, AP2, AP3 - různé adapterové proteiny DYNAMIN - nezbytný pro tvorbu “clathrin-coated pit” - vazba a hydrolysa GTP - ? regulace kontrakce a “odškrcení” vesiklu - inkubace b.extraktu s derivatem GTP, který nemůže být hydrolysován akumulace “clathrin-coated pits” s prodlouzenymi “krčky” s polymerovaným dynaminem - neuvolni se
Další dva proteiny - nezbytné pro tvorbu clathrinových vesiklu: AMPHYPHYSIN - vazba na dynamin a “assembly particle” SYNAPTOJANIN - vazba na amphyphysin a dynamin CLATHRIN-COATED VESICLE
Depolymerace clathrinových vesiklu: clathrinové vesikly - stabilní při pH a iontovém slození cytosolu X ztrací clathrinový obal rychle po vzniku - asi role cytosolického Hsc70 (a dalsich chaperonu) - clathrin - recirkulace na další vesikly
2. COPI VESIKLY COPI vesikly - tvořeny z cytosolických komplexů integralní “coatomers” obsahujících 7 proteiny polypeptidových podjednotek “vyloucené” z transp. - polymerace na povrchu “pučicích” vesiklu a disociují pryč vesiklu rychle po jejich uvolnení - některé podjednotky - spojka mezi membránovým proteinem a obalem - specificka inkorporace proteinu
Golgi cisterna
ARF receptor
ARF = malý GTP-vazebný protein hladina ARF-GTP - regulace podle potreby ARF-GTP - vazba na ARF-receptor COPI coatomer - vazba na ARF a další proteiny cytosolické strany GA
Fatty acyl CoA - nutný pro uvolnení a maturaci vesiklu - ? mechanismus
Depolymerace obalu - ? řídí hydrolysa GTP GTP analog - nedojde k hydrolyse ani k depolymeraci “Retrograde” transport - KDEL sekvence - vzba k COPα a β podjednotkam Kvasinkové sec mutanty
3. COPII VESIKLY (transport z ER do GA) - tvorba podobná jakoCOPI (analog Arf proteinu je Sar1 Cis-Golgi
Pohyb podél mikrotubulu
Fuse COPII vesiklu - tvorba ER-Golgi intermediárního kompartmentu
Drsné ER
Specifické fuse vesiklu
Rab protein
Fuse - poté co depolymerují obaly - vyzadují konservované skupiny proteinu nutné pro privedení vesiklu k cílovému “partnerovi” a poté pro fusi
Komplex T-SNARE a SNAP25
V-SNARE Akceptorová membrána
? NSF,α,β,γ-SNAPs
V-SNARE
Prefusion complex
Přidržení vesiklu u membrány
Depolymerace - odkryje specifické integrální membránové proteiny V-SNARE (inkorporované při “pučeni”) - pro každý typ vesiklu - privedou vesikly k cíli Membrány vsech typu obsahují protein pro fusi (SNAP25) a 1-více integrálních membránových proteinu T-SNARE kooperativní specifická vazba V-SNARE V-SNARE, T-SNARE a SNAP25 - dostatečné pro zprostředkování fuse (liposomy) - pomalu X v bunkách - fuse během sekund ⇒ další proteiny NSF - tetramer, váže a hydrolysuje ATP α, β a γ - SNAPs (soluble NSFattachment proteins) - vazba NSF k membráně vesiklu GTP-vazebné Rab proteiny - regulatory pohybu vesiklu -struktura podobná Ras - GTP hydrolysa - ? Regulace frekvence fuse - regulace pomeru Rab-GTP : Rab-GDP
Vesikly nesoucí V-SNARE - návrat k puvodní membráně
TARGETING SEKVENCE - ORGANELY
(SKL)
SYNTHESA A TARGETING DO MITOCHONDRIÍ A CHLOROPLASTU Mitochondrie a chloroplasty strukturně podobné - dvě membrány, chloroplasty navíc interní membránový kompartment - thylakoidy - vyuzívají proton-motivní sílu a F-ATPasy pro generování ATP - podobné elektron transportní proteiny - většina proteinu syntetisovana na cytosolických ribosomech, které nejsou vázány na drsné ER - “uptaketargeting sequences” - “příjem” proteinu větsinou vyžaduje energii a závisí na integrálních proteinech organel
Mitochondrie - prekursorové proteiny - syntéza v bezbuněčném systému, pak přidání mitochondrií -inkorporace prekursoru do organel + odstřižení (většinou)sekvence
Nascentní prekursorový protein
Chaperon - energie z ATP Hsc70 MSF (mitochondrial-import stimulating factor) - zabrání spatnému sbalení a agregaci prekursoru
A) Transport do mitochondriální matrix Hlavní charakteristiky importu do mitochondrií 1) informace pro targeting do matrix je v N-terminální targeting sekvenci (fusní proteiny experimenty) 2) Pouze “nesbalené” proteiny mohou být importovány 3) Translokace probíhá pouze v místech, kde jsou vnitrní a vnejsí membrána v blízkosti
Transport do mitochondrií vyzaduje energii
MSF
Matrix-targeting sequence
Transport přímo na Tom20/22
MSF se uvolní
Tom40 = kanál vnejší membrány
Contact site
Tim44 kanál vnitrní
Tom receptory membrány presun z 70/37 na 20/22
3 zdroje energie 1) ATP hydrolysa v cytosolu chaperony - udrzení proteinu v nesbaleném stavu 2) proton-motivní síla na Translokace do matrix vyzaduje vnitřní membráně - pro proton motivní sílu vnitrní membrány translokaci, ne pro vazbu na receptor, transmembránový potenciál (200 mV, matrix negativní) 3) ATP hydrolysa v Proteasa odstepí N-koncovou mitochondriální matrix matrix-targeting sekvenci
Matrix Hsc70 chaperon
Hsc60
Nekteré proteiny potrebují matrixový chaperonin Hsc60
Dlouhá sekvence hydrofobních AA na N konci, zastaví v Tom40, není odštěpena žádná z targetting sekvencí
B) Transport do vnitřní membrány Proteiny vnitrní a vnejsí membrány - inkorporace pomocí kotevních sekvencí
receptor
Zprostředkovávají přenos mezi vnějším a vnitřním kanálem (fce jako chaperony)
kanál
N-terminální matrix-targeting sekvence
C) Transport do dalších mitochondriálních kompartmentů Mezimembránový prostor - různé dráhy, často další sekvence
Intermembrane space-targeting sequence (2.sekvence)
Intermembrane space-targeting sequence (2.sekvence)
Odstepení 2.sekvence
Receptor + kanál
Transport do chloroplastu -N-koncová targeting sekvence, odštěpena při transportu do stroma - vyzaduje energii Prekursorvazba chaperonu
A) Transport do stroma chloroplastu
Stromal import sequence
GTP Toc komplex
Toc kanál - vazba GTP asi dulezitá pro otevrení kanálu
Tic komplex
Hsc70 stromal chaperon Odstepení sekvence - Proteiny pravdepodobne importovány nesbalené - není proton-motivní síla - asi role ATP pro translokaci
B) Transport do thylakoidu
2 ze 4 drah
- dalsí sekvence - 4 thylakoid import systémy - nekteré vyuzívají pH gradient na membráne
Protein zůstává nesbalen
SRP dependent pathway
ArgArg Protein folding
pH dependent pathway
SYNTHESA A TARGETING DO PEROXISOMU
SKL uptake targeting sequence Apo catalase Heme
Peroxisomy:
- malé organely 0.2 - 1 μm - jedna membrána - vsechny proteiny syntetizovány v cytoplasmě volné ribosomy, inkorporace do peroxisomu - proteiny se v cytoplasmě sbalí do maturované konformace před importem - import vyzaduje ATP hydrolysu, nevyžaduje elektrochemicky gradient - targeting sekvence SKL (Ser-Lys-Leu) na C-konci (katalasa), vyjimečně na N-konci
Catalase tetramer PTSIR = solubilní receptor v cytosolu
Komplex
Pex14 receptor
Jiné proteiny - signální sekvence na N-konci (thiolasa), po transportu je odstepena
SKL sekvence se neodstepí
TRANSPORT DO / Z JÁDRA
Transport proteinů a mRNA
Komplex jaderného póru - jaderný obal
cytoplasmatická strana
Vazba k jaderné lamině
jaderná strana
50 (kvasinky) – 100 (savčí buňky) proteinů (nukleoporiny) - více kopií Ionty, malé metabolity a globulární proteiny (do 60 kDal) ⇒ difuse kanálem (H20) X velké proteiny a ribonukleoproteinové komplexy neprojdou ⇒ selektivně transportovány dovnitř/ven jádra za pomoci solubilních transporterových proteinů – váží makromolekulu a interagují se specifickým nukleoporinem
TRANSPORT DO JÁDRA Jaderné proteiny – syntéza v cytoplasmě ⇒ transport do jádra, NLS („nuclear localisation signal“) – různá struktura např. basické AK Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val 4 cytosolické proteiny nutné pro import proteinů s basickou NLS sekvenci: Importin α, importin β Nuclear import receptor Importin α ⇒ vazba NLS Importin β – interakce s FG nukleoporiny (i na cytosolických filamentech), mají mnohonásobné repetice krátkých hydrofobních sekvencí bohatých na phenyl-alanine a glycine (FG – repeats) Homology importinu: interakce s jinými NLS Ran (GTPasa) ⇒ Ran-GTP a Ran-GDP
Importin
Interakce s importinem β cargo
Ran
disociace komplexu Ran
Importin
cargo NLS Ran FG – repetice - interakce s importinem
cargo
Importin NTF2 (nuclear transport factor 2) bez spotřeby ATP x jiné proteiny vyžadují ATP interakce s Ran-GDP ⇒ vrací ho do jádra ⇒Interakce s FG nukleoporiny
Translokace vyžaduje ATP hydrolysu GTPase-accelerating protein + NTF2 Ran Ran cargo NLS
Importin (α+β)
TRANSPORT Z JÁDRA DO CYTOSOLU Podobný mechanismus
Nuclear export signal (NES) - různé typy - stimulace exportu jaderným pórem, někdy v kombinaci s NLS leucine - rich NES
cargo
Nuclear export receptor = exportin - interakce s FG nukleoporiny a difuse pórem Importiny + exportiny ⇒
Ran
cargo NES
Ran
exportin Ran
exportin
skupina Karyopherins (14 v kvasinkách, 20 v savčích buňkách) Pouze u některých identifikovány NLS a NES na které se váží Některé fungují jako importiny i exportiny Některé exportiny – role v exportu tRNA + některé mRNA (asociované s některými hnRNP proteiny) role Ran X většina mRNA transportovaná nezávisle na Ran
+ NTF2 Ran
exportin
cargo Regulace transportu některých transkripčních faktorů - Vazba ligandu stimuluje translokaci (odkrytí NLS) - Odštěpení sekvence, která je udržuje jinde (např. na membráně) - Modifikace (např. fosforylace) zvyšuje afinitu k importinu/exportinu
cargo exportin Ran
TRANSPORT mRNA Z JÁDRA DO CYTOSOLU Heterodimerní mRNA-exporter protein (studium ts mutant kvasinek s defektem v exportu mRNA) ⇒ směruje většinu mRNA ven z jádra jaderným pórem ⇒ mutanty akumulují polyadenylovanou mRNA v jádře ⇒ homology u všech eukaryot ⇒ nevyžaduje Ran ⇒ malá podjednotka homologní s NTF2 – interakce s NTF2 homologní doménou vetší podjednotky ⇒ doména interagující s FG nukleoporiny větší podjednotka ⇒ RNA vazebná doména ⇒ vazba mRNA spolu s mRNP proteiny + další proteiny vazba mRNA - výběr mRNA
mRNP proteins
EXPORT mRNP (messenger ribonuclear protein complex) Slinné žlázy hmyzích larev Chironomous tentans – model pro studium transportu mRNA z jádra pomocí EM pre-mRNA ⇒ asociace s hnRNP proteiny ⇒ uspořádání do kruhové mRNPs s mRNA (75 kb) ⇒ kódují proteiny, které pomáhají larvám adherovat k listům
mRNPs (elektronová mikroskopie) ⇒ transport jaderným pórem ⇒ rozbalení během průchodu a vazba ribosomů po vstupu do cytosolu ⇒ 5´konec vstupuje první
Jaderný obal nukleoplasma
cytoplasma
