Tkáňové inženýrství a testování biokompatibility
polymerů . B. Dvořánková
Historie transplantací
2. st. př.n.l. – Čína – transplantace orgánů a štěpů Indie – autologní kožní štěpy 3. st.n.l. – Kosmos a Damián – transplantace nohy V roce 1668 popsal holandský lékař Job van Meereken první úspěšnou transplantaci kosti - tkáňovým štěpem získaným z lebky psa. 1. klinický přenos autologní kosti - 1820 v Německu Alexis Carrel (1873 – 1951) - zakladatel cévní a transplantační chirurgie. Zásoby tkání pro chirurgické účely, vědecký základ metodám konzervací tkání.
Specializované tkáňové banky
30.léta 20.stol – Filatov - prvním transplantovaným kadaverózním štěpem byla rohovka. Začátek osmdesátých let - orgánové transplantace
Transplantace
Přenos živých buněk, tkáně nebo orgánu z jedné části těla na jinou nebo z jednoho jedince na jiného. Transplantát – s vlastním cévním zásobením Štěp – bez cévního zásobení Ledviny, srdce, játra, plíce, pankreas, střevo, Langerhansovy ostrůvky Kůže, krevní buňky, kostní dřeň
Transplantace Autotransplantace – v rámci jednoho organizmu Syngenní (izo)transplantace – jednovaječná dvojčata
U laboratorních zvířat imbrední kmeny
Alotransplantace – mezi geneticky odlišnými jedinci v rámci druhu Xenotransplantace – mezi jedinci dvou různých druhů
Transplantace
Imunitní reakce příjemce proti buňkám transplantátu
Hodně pacientů X málo orgánů
Imunita Schopnost organizmu bránit se proti antigenům – z vnějšího i vnitřního prostředí Spouští imunitní odpověď Řídí ji imunitní systém
Imunitní systém
Zajišťuje integritu organizmu Rozeznávání a odstraňování
nefunkčních složek organizmu – buňky staré, mrtvé, nádorové, nemocné nebo tělu cizí parazitujících mikroorganizmů cizorodých makromolekulárních látek (proteiny, polysacharidy)
Obranyschopnost X autotolerance
Antigen
Molekula, na kterou je organizmus schopen zareagovat specifickou imunitní reakcí Cizí Vlastní – autoantigen Většinou na ně nereaguje - imunotolerance Nadměrná reakce – poškození orgánů autoimunitní choroba
Prezentace antigenu - MHC
MHC I receptory – mají je všechny jaderné buňky
prezentace cytosolických proteinů (peptidy buňce vlastní + peptidy virů a bakterií žijících v cytosolu) 8-11 aminokyselin receptory na povrchu Tc lymfocytů – rozeznávají peptid i MHC receptor aktiv. CD8+ T lymf.
MHC II receptory– 1.antigen-prezentující buňky; 2. neprofesionální – epitelové, endotelové b.
prezentace peptidů z prostředí mimo buňku 12-25 aminokyselin, vyšší citlivost komplex antigenu s MHC II receptorem – aktiv.T CD4+ lymfocytů B-lymfocyty
T-lymfocyty rozpoznávají:
cizí antigeny v komplexu s vlastními molekulami MHC, což vede k imunitní reakci, vlastní antigeny v komplexu s vlastními molekulami MHC, což vede k toleranci, cizí molekuly MHC (transplantační reakce)
HLA typizace
HLA - Human Leukocyte Antigenes Shoda v HLA antigenech mezi dárcem a příjemcem i přes velký pokrok v imunosupresivní léčbě je životně důležitá pro transplantaci kmenových buněk a má (stále) význam pro dlouhodobé přežití transplantovaných orgánů (ledviny, srdce, pankreas)
Tkáňové kultury
Jako buněčné kultury jsou označovány rostlinné, živočišné nebo lidské buňky pěstované mimo organizmus v
laboratoři.
Tato technika je nazývána in vitro.
Tkáňové kultivace
Vědecké – biologický a lékařský výzkum Výroba vakcín, očkovacích látek; výroba biofarmak vakcína proti vzteklině, očkovací látka proti obrně
Testování léčiv či materiálů pro klinické využití možnost částečného nahrazení pokusů na zvířatech
Diagnostické kultivace lymfocytů při karyotypizaci krevních buněk
Terapeutické
Tkáňové inženýrství
Buňky
normální buňky nádorové buňky kmenové buňky multipotentní buňky primární kultury buněčné linie
Interakce buněk s okolím
2D kultivace
3D kultivace
tkáňový polystyren sklo potažený povrch proteinové sítě polymerní sítě ECM – matrigel, vyrobené buňkami
neadhezivní povrchy sféry
Vzájemné ovlivňování buněk
Přímá kokultura více buněčných typů Insertový systém Kondiciovaná média Migrační testy
Biokompatibilita materiálu
biokompatibilita – snášenlivost látek zejm. materiálů v biologickém prostředí; biokompatibilní materiál se posuzuje podle interakce s prostředím, zejm. podle cytotoxického působení, podle toxikologických a alergických reakcí, podle karcinogenních, teratogenních či mutagenních reakcí, podle vlivu na infekční procesy, podle rozsahu a kvality biodegradace. Důležité je, aby materiál neovlivňoval např. koagulace, nevyvolával zánětovou reakci, neuvolňoval potenciálně toxické látky apod. Velký lékařský slovník
Biokompatibilita materiálu
Biokompatibilita je schopnost materiálu fungovat ve specifické aplikaci a vyvolat přiměřenou odpověď hostitele
http://web.mit.edu/murj/www/v11/v11-Features/v11-f5.pdf
Testování biokompatibility
In vitro – testování cytotoxicity
– přímý – není bariéra mezi buňkami a materiálem - agarový difuzní test – netestuje strukturu a povrch - eluční test
Nezohledňuje interakci materiálu s ostatními buňkami v lidském těle
In vivo – materiál je implantován do
zvířecího těla - podle cílového využití u člověka volba zvířete Testování materiálu u člověka
Přímý test cytotoxicity
Výběr vhodných buněk Jejich kultivace v přítomnosti materiálu Hodnocení jejich růstu ve srovnání s kontrolou - MTT test
Studium adheze a proliferace vhodných buněk na povrchu polymerních materiálů Hydrofobní/hydrofilní Reliéf povrchu Povrchové napětí – kontaktní úhel Přítomnost určitých skupin PTFE, povrch ošetřený plazmovým výbojem, naroubován PEG 300
Kmenové buňky
embryonální kmenové buňky
dospělé kmenové buňky
v průběhu embryonálního vývoje cirkulující kmenové buňky – separace z krve kostní dřeň pupečníková krev tkáň amniového vaku tuková tkáň
indukované pluripotentní buňky
Kultivace buněk pro léčbu:
Náhrada epidermis Náhrada chrupavky Mezenchymové kmenové buňky
Kostní dřeň Periferní krev Pupečníková krev
Kůže
Největší orgán lidského těla Průměr 1,7 m2 Dvě hlavní vrstvy – epidermis a dermis Léčba rozsáhlých kožních ztrát představuje závažný lékařský problém Anatomia del corpo humano Juan Valverde de Amusco (Rome, 1560)
Funkce lidské epidermis
Ochranná funkce
Metabolická funkce
mechanický úraz ztráta tekutin invaze patogenů produkce vitaminu D, cytokinů a interleukinů termoregulace
Estetická funkce
Rozsáhlé popáleninové trauma Popáleniny I.stupeň II. stupeň III. stupeň Nutno hodnotit hloubku termického úrazu i jeho rozsah
Epidermis – není vaskularizovaná - buňky jsou vyživovány difuzí přes bazální membránu - pouze jeden buněčný typ – keratinocyty – dostačuje pro její rekonstrukci
In vitro kultivace keratinocytů - první lidský orgán připravený v laboratoři (Rheinwald and Green), v klinické praxi použit poprvé v r. 1981 - určeno pro rozsáhle popálené pacienty s nedostatkem odběrových míst
Kultivace keratinocytů I
autologní štěpy – jsou schopné vytvořit trvalý kryt léčba kožních ztrát v plné tloušťce odběr - dermo-epidermální štěp 2-5 cm2 minimální doba přípravy cca 3 týdny možno připravit tisíce cm2 epidermálních štěpů
Kultivace keratinocytů II
allogení štěpy – nejsou schopné vytvořit trvalý kryt využívá se jejich stimulační účinek na hojení:
popáleniny IIa stupně odběrové plochy trofické defekty
otestovaní dárci – zbytková kůže z plastických operací zásoba zmražených buněk v kapalném dusíku minimální doba přípravy 10-12 dní
Kultivované štěpy na textilním nosiči
velmi nízká úspěšnost přihojení vysychání transplantovaných buněk častá mikrobiální kontaminace štěpu z ranné plochy enzymatické odvolnění štěpu snižuje viabilitu transplantovaných buněk
Vyvinout nový způsob přípravy kultivovaných epidermálních štěpů
Nový způsob kultivace keratinocytů
kultivace buněk a jejich aplikace přímo na polymerním nosiči kultivační podložka (nosič) by měl tvořit optimální kryt pro transplantované buňky vyloučení feedrových buněk z kultivačního systému
Tkáňové inženýrství
Na přípravu nosiče pro kultivaci keratinocytů byl vybrán
polyHEMA hydrogel
poly(2-hydroxyetyl metakrylát)
-ve vodném prostředí tvoří hydrogel (35-40% vody) -dlouhodobé zkušenosti s využitím v medicíně - kontaktní čočky
Krok 1 – vytvořit podmínky pro adhezi a proliferaci buněk na povrchu hydrogelu
preinkubací hydrogelového nosiče v bovinním séru dojde k sorpci bílkovin na jeho povrchu
Integra - schema
popáleninová medicína rekonstrukční chirurgie traumatologie
Integra - aplikace
Tvorba neodermis
Transplantace plochy
Výhody Integry
rychlé překrytí velkých ploch nedochází k rejekci čas pro další transplantace DE štěpy 0,l - 0,2 mm kosmetický a funkční efekt Integra“roste“ s pacientem
Náhrada chrupavky
umělá chrupavka a kostní implantáty vypěstované na podložkách z buněk pacienta samotného nebo z buněk kostní dřeně
Autologní chondrocyty + Tissucol – náhrada patelly Contipro-group – lešení z kyseliny hyaluronové
průhledná kopulovitě zakřivená, dokonale čirá, lesklý povrch neprocházejí žádné cévy součást opt. prostředí láme paprsky, filtruje UV záření, +/- 43 dioptrií ochrana proti vnějším vlivům vyživa - výměškem slzného aparátu a komorovou vodou mnoho nervových zakončení, citlivá na dotyk, podráždění
Rohovka (cornea)
Rohovkový epitel - 5-6 vrstev buněk, stálá regenerace Endotel !!!
Zkalení rohovky, ztráta průhlednosti
Příčiny : poranění, poleptání, zánět (vrůstání cév), glaukom, zvýš. obsah vody (protržení Descemetské m. nebo endotelu) a další
Transplantace rohovky 1905 Olomouc Oční banky – skladování rohovek
Úspěšnost 90-95%
Keratoplastika – štěp z mrtvého dárce perforující – 7-8 mm, našití na mateřskou roh.
přední lamelární keratoplastika zadní lamelární keratoplastika
Laserové operace – jen určitá vrstva
Umělá rohovka
Komerčně dostupné rohovkové náhrady – keratoprotézy
AlphaClar – pHEMA - 2005 KeraKlar – rohovka není odstraněna v celé tloušťce riziko poop.komplikací
jednodušší provedení - ambulantně
Schopnost akomodace v rozsahu 10 – 17 D, věkem se snižuje (na 2D až 0,5D)
Zákal čočky
Šedý zákal - katarakta
Intraokulární čočka
Původně hydrofóbní, nyní hydrofilní polymerní materiály – hydrogely Přesná dioptrická hodnota Implantace do oka - náhrada čočky při šedém zákalu
